PT85032B

PT85032B - Metodo de tratamento da sida ou complexo relacionado com a sida (crs) mediante utilizacao de composicoes farmaceuticas contendo avarone e avarol

Info

Publication number: PT85032B
Application number: PT85032A
Authority: PT
Inventors: Werner E G Muller
Original assignee: Merz & Co
Priority date: 1986-06-07
Filing date: 1987-06-05
Publication date: 1991-02-08
Also published as: ZA874060B; CA1297032C; JPS62298525A; EP0252304A2; US5026732A; DK289987A; DE3619202A1; PT85032A; EP0252304A3; US4939177A; IL82702A0; DK289987D0

Description

A presente invenção descreve a utilização de avarol e avarone e seus derivados para o controlo da Sida ou do complexo relacionado com a Sida (CRS).

avarone e o seu derivado hidroquinónico (o avarol) são substâncias naturais que estão presentes na esponja marinha Dysidea avara\ A patente de invenção da República Federal Alemã OS 34 27 383, publicada em 30 de Janeiro de 1986, refere que o avarone e o avarol e seus derivados como possuem propriedades anti-tumorais, anti-bacterianas e anti-micóticas, que os tornam apropriados em particular para o tratamento do cancro e doenças infecciosas. Além disso, afirma-se ali que estes compostos têm uma certa acção virustâtica in vitro sobre as culturas do vírus do herpes simplex e, portanto, contra os vírus de DNA. Contudo ainda não foi, até ao presente, verificado a possível inibição de vírus de RNA.

Tetrahedron Letters 1974, 3401-3404; J. Chem. Soc. Perkin I, 1408-1414 (1976).

Mutation Research 144, 63-66 (1985).

Câncer, Res. 1985; 45 (10), 4822-4826.

Além disto, verificou-se que o avarone e os seus derivados possuem actividade antimutagénica . Finalmente descobriu-se que o avarone e os seus derivados também têm uma acção anti-leucémica^. A existência desta acção anti-leucémica foi derivada de estudo in vitro assim como estudos in vivo com células leucémicas de murganho L5178-Y. Até ao momento presente, contudo não existe qualquer ligação conhecida entre tais células tumorais e as células T de leucemia no adulto e os vírus que são causadores desta. Portanto, não é obvia a utilização do avarone, avarol ou seus derivados para 0 controlo de células Ϊ¹ de leucémia/linfoma no adulto.

objectivo da presente invenção, é fornecer um método que prometa controlar as células T de leucémia/linfoma no adulto.

A Sida é causada pelo vírus linfotrópico/leucémia de células T hu manas do tipo (HTLV-III)\ que também é conhecido por vírus associado à linfadenopatia (LAV)^.

Os vírus HTLV-III pertencem ao ciclo de vírus de ENA que diferem em pontos essenciais dos vírus DNA. 0 ataque virai é a causa prin cipal de um espectro de perturbações imunológicas cujas manifesta, ções de Sida clinicamente mais graves são a forma do sarcoma de Karposi ou 0 complexo relacionado com a Sida (CRS)^. Até ao momen to nenhum tratamento terapêutico eficaz da Sida ou do CES têm sido possível.

Science, 224-, 5θθ-5θ2 (1984).

Science, 225, 69-72 (1984).

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 5530-5554 (1985).

Surpreendentemente, verificou-se que o avarone ou o avarol e os seus derivados são apropriados de um modo excelente para o controlo da sindrome de imunodeficiência adquirida (Sida) ou para o complexo relacionado com a

Sida (CRS).

objectivo da presente invenção portanto é a utilização do avarone e seus derivados de forma geral/

(Ia) e avarol e os seus derivados de forma geral

(Tb)

2 e 3,4-dihidro derivados em que R e R representam cada um independentemente, um átomo de hidrogénio, ou um grupo alquil-ÍC^-C^) amino.

R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquil⁰ —(CpC^J-acilo C₂-C-₆ éter ou éster, facilmente hidrolisável sob o ponto de vista fisio lógico ou os dois símbolos R^ representa' considerados em conjunto um grupo diacilo C^-C^ , e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico ou uma mistura dos referidos compostos para o controlo da Sida ou CRS.

ν' p

Os compostos referidos antes, avarone (fórmula geral I a : R =R=H) e avarol (fórmula geral : Ib : R‘^L=R^=R^=H) são os preferivelmente utilizados. Nos compostos de fórmula geral (Ia), um dos radicais re presentados por R^ e R^ é de preferência um átomo de hidrogénio e nos compostos de fórmula geral (Ib) ambos os radicais representados por r! e R^ _sg₀ de preferência átomos de hidrogénio.

Os compostos de fórmula geral (Ia) e (Ib), que contêm grupos amínicos, podem ser utilizados sob a forma de sais de adição de ácidos. São aqui considerados os sais compatíveis do ponto de vista fisiológico correntes inorgânicos ou ácidos orgânicos, tais como o ácido clorídrico, o ácido sulfurico, o ácido fosfórico, o ácido tartárico, o ácido láctico, o ácido maleico e outros.

Os compostos de fórmula geral (Ib) em que o símbolo R* representa um átomo de hidrogénio também podem ser utilizados sob a forma dos seus sais correntes compatíveis do ponto de vista fisiológico de ba ses inorgânicas ou bases orgânicas tais como o hidróxido de sódio, alquilaminas, hidroxi-alquilaminas e outros.

Os ésteres e éteres facilmente hidrolisáveis do ponto de vista fisiológico do avarol e os compostos de fórmula geral (Ib) em que R^ representa um átomo de hidrogénio, podem ser facilmente hidrolisá. veis enzimática ou quimicamente no organismo para compostos hidroquinónicos correspondentes. São ésteres adequados, por exemplo, o éster do ácido ortoformato, ésteres dos ácidos alfa-cetooarbolíticos, por exemplo, o ácido pirúvico, ésteres do ácido tolueno sulfónico e outros. São éteres adequados por exemplo o éter metoximetílico, éter tetra-hidroxipiranílico e equivalentes.

A preparação de avarone e avarol está descrita na patente de invenção da República Eederal Alemã n2 34 27 383. Para esse efeito a esponja marinha Dysidea avara é sutme^ãda à extração ccm acetato de etilo.

avarone e o avarol são isolados a partir do extrato por meio de cromatografia em coluna de gel de sílica. 0 avarone também se pode preparar a partir do avarol por oxidação com óxido de prata.

Os derivados de fórmula geral (I a) são preparados por meio de reacção do avarone com cloridratos de alquil-(C^ - C^) aminas (por exemplo, cloridratcsmetil —, etil —, propil —, isopropil —, n-,butil —, isobutib-, e t-butilamina) e isolar-se os compostos obtidos deste modo, se apropriado, sob a forma de sais de ácidos compatíveis do ponto de vista fisiológico. Para esse efeito, opera-se na presença de piridina em etanol a 50% ; G. Cimino,

S. de Rosa, S. de Stefano, L. Cariei lo e L. Zanetti. Experiência 38, 896 (1982). As misturas de isómeros de 3'— e 4' — alquilaminoavarones obtidas deste modo podem ser separadas por meio de cromatografia em coluna de gel de sílica.

Os derivados de fórmula geral (I b) são preparados mediante reacção do avarol ou dos derivados alquilamínicos protegidos no grupo amino com cloreto de acilo (C^ - C^) ou con oanidrido carboxílico correspondente. Como cloretos de acilos poae-se utilizar por exemplo os cloretos de acilo de cadeia linear tais como o cloreto de acetilo, propionilo, n-butirilo, n-valeroílo e cloreto de capronoílo, assim como os cloretos de acilo de cadeia ramificada, tais como o cloreto de isobutírilo, ísovaleroílo, 2-metil-butirilo e cloreto de trimetilacetilo. São anidridos de ácido a considerar, por exem pio, os anidridos de ácido de cadeia linear tais como o anidrido acético, anidrido propiónico, anidrido butírico, anidrido valérico e outros anidridos de ácidos carboxílicos, assim como os anidridos de ácido de cadeia ramificada, tais como o anidrido isobutírico, o anidricb isovalérico, anidrido

2-metilbutírico e trimetilacetanidrido. Obtêm-se ésteres cíclicos de fórmula geral (I b) quando se utilizam cloretos de ácidos dicarboxílicos (C^-Cg) ou um anidrido de ácido dicarboxílico ( C₄ - 0θ ).

Os compostos de fórmula geral (I b) de preferência reagem com cloretos de acilo ou com anidridos de ácidos carboxílicos na presença da piridina (S.de

Rosa_? L. Minale, R.Riccio e G.Sodano, J. Chem. Soc. Perkin I. 1976, 1408-1414 Organikum, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, 13th edition,

Berlin 1974, pag. 441-446).

Os éteres de alquil (C^C^) do avarol e os compostos de fórmula geral (I b) podem preparar-se fazendo-se reagir o composto hidroquinónico, de preferência sob a forma do seu sal de sódio ou de potássio com o correspondente halogeneto de alquilo(C₁ -C₄) ou do sulfato de di-alquíl₀ (CpC^).

Os compostos que são utilizados de acordo com a presente invenção são geralmente utilizados sob a forma de composições farmacêuticas preparadas sob a forma de unidades de dose e podem ser administrados sistemicamente, isto é, oral, rectal ou parenteralmente (via intramuscular, intra-venosa e subcutânea).

As composições contêm, pelo menos um composto de fórmula geral (I a) ou de fórmula geral (I b)ou o seu sal aceitável sob o ponto de vista fisiológico numa quantidade eficaz para o tratamento, eliminação, alívio ou melhoramento da Sida ou CRS, em uma quantidade que elimine a dificiência imunológica possivelmente em conjunto com excipientes compatíveis aceitáveis em farmácia e/ou adjuvantes. Tais agentes farmacêuticos contêm por exemplo, 0,5 a 98 por cento em peso, de pelo menos um composto da presente invenção, em conjunto com excipiente aceitável em farmácia.

Se o agente está presente sob a forma de uma unidade de dose, contêm de preferência, 10 a 100 mg desse composto, utilizado de acordo com a presente invenção.

ί

Agentes farmacêuticos que podem estar presentes para a administrai^/ ção de formas sólidas orais, por exemplo, sob a forma de comprimidos, pastilhas, cápsulas ou pó, ou sob formas líquidas, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, xarope, elixir, solução ou cápsul is de líquido.

Agentes orais preferidos estão sob a forma de comprimidos ou cápsulas e podem conter vulgarmente excipientes, tais como, agentes ligantes (por exemplo xarope, acácia, gelatina,sorbitol, tragacanta ou polivinilpirrolidona), cargas (por exemplo, lactose, açúcar, amido de milho, amido de batata, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina), agentes lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, polietileno-glicol ou sílica), agentes de desagregação (por exemplo, amido) e agentes humidificantes (por exemplo, lauril-sulfato de sódio).

Agentes para a administração parentérica são, em geral, sob a for ma de soluções ou suspensões do composto utilizado de acordo com a presente invenção conjuntamente com excipientes correntes em farmácia, por exemplo, sob a forma de uma solução aquosa para injecção intra-venosa ou sob a forma de uma suspensão oleosa para injecção intramuscular. Agentes apropriados para a administração parentérica obtêm-se mediante dissolução de 0,1 a 10% em peso do composto da presente invenção na água ou em excipiente que consista num po. liálcool alifático tal como a glicerina, propileno-glicol ou poli, etileno-glicois ou suas misturas. Os polietileno-glicois consistem numa mistura de polietileno-glicois líquidos habituais, não voláteis, solúveis em água e em líquidos orgânicos com um peso molecular compreendido entre 200 a 1500.

Agentes farmacêuticos para a administração rectal estão sob a for ma de supositórios, em que 0 composto da presente invenção é incor porado numa base para supositórios adequada, tal como manteiga de cacau, gorduras hidrogenadas, policeras e polietileno-glicois, numa quantidade compreendida entre 1 e 10% em peso.

Os agentes farmacêuticos -são-. preparados por métodos habituais, por exemplo por conversão,que incorporam os compostos utilizados de acordo com a presente invenção numa base para supositórios, filtração estéril ou enchimento em ampolas ou frascos para gotas de uma solução dos compostos utilizados de acordo com a presente invenção, em água, para injecção em conjunto com aditivos correntes, tais como cloreto de sódio, di-hidrogenofosfato de sódio,edetato dissódico (sal dissódico do ácido diaminotetracético), álcool benzílico ou hidróxido de sódio para se ajustar o pH.

método para o tratamento da SidaouCRS consiste na administração de uma quantidade terapêutica activa (anti-viral ou anti-tumoral) de avarone ou avarol, ou de um derivado destes compostos ou suas misturas ou de um seu sal aceitável em farmácia a um paciente necessitado deste tratamento.

A dose depende principalmente da forma específica de administração ou do fim terapêutico a que se destina. A dimensão das doses individuais assim como o programa de administração pode ser determinado de preferência na base de uma avaliação individual,no caso específico,pelo médico, tendo em consideração a idade, peso e condição do doente, via de administração e natureza e gravidade da doença. Em geral uma dose diária compreendida entre 2 e 20 mg/kg , de preferência,entre 3 e 10 mg/kg e particularmente entre 6 e 7 mg.

A duração do tratamento depende da natureza e gravidade da doença. De uma maneira geral o tratamento prolonga-se por várias semanas, por exemplo, 4 a 8 semanas,

Os compostos para serem utilizados de acordo com a presente invenção actuam de maneira diversificada sobre os vírus do tipo III (HTLV III) de leucémia de celulcB T hunana e prodisen um;;. aoção estimulante no astana iminológLco de tal modo que, as forças de defesa endógenas, contra a Sida ou complexo relacionado (CRS) e doenças relacionadas, são reforçadas.

Estes compostos podem ser utilizados para a terapêutica e profilaxia de doenças causadas pelo vírus da Sida.

A actividade anti-viral e anti-tumoral dos compostos utilizados de acordo com a presente invenção, será examinada em seguida com base em sistemas de teste in vitro farmacológicos utilizando-se como exemplo o avarone e avarol.

Para isso, utilizam-se linhas de células H9 que consiste em uma linha clonada 0KT4 + uma linha de células T em que se propagam os vírus da Sida. (M. Popovic, M.G. Sarngadharan, E. Reed and R.C. Gallo; Science 224, 497-500 (1984) ).

Procedimento do teste:

Purificação de transcriptase inversa de HTLV-III e condições do ensaio: A transcriptase inversa HTLV-III,nas presentes experiências (preparada pelo método de P.S. Sarin, Y. Taguchi, D. Jun, A. Thornton, R.C. Gallo,

B. Oeberg, Biochem. Pharmacol, 34, 1985, pag»' 4075 e 4079) foi purificada por cromatografia sequencial em celulose - DEAE, fosfocelulose e hidroxiapatite. 0 enzima purificado foi guardado em tris-HCL 50 mM ( trishidroximetilaminometano ) (pH 7,5), 1 mM de ditiotreitol (DTT),

0,01% de Triton X-100 e 20% de glicerina. Os ensaios para a transcriptai se inversa foram realizados numa mistura reacional (50 _/il) que continha 50 mM de tris-HCL (pH 7,5), 5 mM DTT, 10 mM MgCl^ , 100 mM de cloreto de potássio, 0,Q1 %< de Triton X-100 (ΟθΗ^-ΟθΗ^ - (O^^) g - -jq-OH) ou NP40 (detergente não iónico Nonidet P40, nome de marca da companhia

Sigma, isto é, condensado de óxido de octilfenoletileno), 10/ig/ml (dT) ₁₅·. (A)_n (polímeros híbridos de oligo ou polinucleótidos, ácido oligodeoxitimidílico e ácido poliadenílico) como matriz inicial e ^Hj-desoxitimidina trifosfato ((j-l)- dTTP).

iu

A mistura reaccional foi incubada durante uma hora à temperatura de 37°C e a reacção foi detida por meio de adição de 50 ^ug de tRNA de levedura e ml de uma solução a 10% de ácido tricloroacético (TCA que continha 1 mM

de fosfáto de sódioj. As amostras foram filtradas através de um filtro millipore de 0,45 /jm e lavadas primeiro com uma. solução a 5% TCA (5x) e em seguida com 2 ml de etanol a 70%. Os filtros foram secos sob uma

Λ lampada de aquecimento, onde em seguida se adicionou líquido de cintilação e a radioactividade foi determinada num contador de beta-cintilação.

Infecção de células H9 por HTLV-III:

Trataram-se células—H9 (M. Popovic, M.G. Sarngadharan, E. Reed, R.C. Gallo, Science: 224, 497-500 , 1984) com Polibren ^R(brometo de hexadimetrin comercializado; 2 /ig/ml) durante 30 minutos à temperatura de37°C foram lavadas, isentas de Polibren e infectadas com 2x10⁸ particulas.de vírus HTLV-III (isolado a partir de culturas de células H9 pelo método de M. Popovic, referido antes) por 4 x 10 de células H9. Alguns ensaios,que não foram tratados com fármacos,foram utilizados como controlos positivos, enquanto que concentrações diferentes do composto a ser ensaiado (avarone ou avarol e seus derivados) foram adicionados às amostras em ensaio. A actividade da transcriptase inversa de HTLV-III destas culturas foi analisada de modo descrito antes.

Ensaio de imunofluorescência

Os ensaios ' da imunofluorescência foram realizados em iCélulas fixadas ‘com metanol ; acetona (1:1) utilizando-se anti-corpos monoclonais (de murganho) contra HTLV-III ρβ (núcleo proteico de PM=15000) e p?4 (núcleo proteico de PM=24000).

j

Ambas estas proteínas são proteínas marcadoras que indicam a presença das partículas virais nas células. As células infectadas por HTLV-III com/ou /

/ Λ isentas de tratamento com fármaco, foram fixadas em cortes de toxoplasmose. Após fixação com metanol-acetona (1:1) durante 30 minutos à temperatura ambiente, os cortes foram guardados em contentores de plástico selados à temperatura de 20°C até à sua utilização. Os anti-corpos monoclonais foram adicionados às células, incubados à temperatura ambiente numa câmara humificadora, durante uma hora e lavados durante duas horas com tampão salino de fosfato (PBS) que continha 0,25% de Triton X-100. As células foram tratadas durante uma hora com Liunoclobulina 6 anti-murganho de cabra marcada com fluoresceína (FITC, Capell Labs.) e lavadas durante a noite com tampão de fosfato PBS que continha 0,25% de Triton X-100. Adicionou-se glicerina a 50% aos cortes e a fluorescência das células foi determinada por meio de um microscópio de fluorescência Zeiss.

_1_. Desenvolvimento celular:

Utilizaram-se células H9 e células H9 infectadas com HTLV-III com uma concentração de 0,2 x 10 células/ml para inoculação do meio de cultura. Após incubação durante quatro dias, a densidade de células Η9 era de 1,3 x 10 células/ml, enquanto que a densidade de células H9 infectadas com HTLV-III era apenas de 0,5 x 10 células/ml, estes dois valores formam os valores de controlo.

Consequentemente, amostras de células H9-HTLV-III, a 0,2 x 10 células / /ml, foram tratadas durante quatro dias com concentrações diferentes de avaro1 e avarone.

Os resultados obtidos foram os seguintes:
	Concentração	Concentração
	de fármaco	celular/x
	(/ig/ml )	x 10⁶ / ml
Controlo-células infectadas	0	0,5
Avarol (células infectadas)	0,1	1,42
	1	1,0i>
Avarone (células infectadas)	0,1	1,36
	1	0,17
Controlo-não infectado	0	1,3

i

I

E evidente que o avarol e o avarone em concentrações de cêrca de 0,1 yjg/ml aumenta a taxa de desenvolvimento de células H9-HTLV-III para valores ligados com o nível do controlo, nomeadamente de células H-9 isentas de HTLV-III. A eficácia do avarone é comparável à do avarol. Podem notar-se os efeitos tóxicos com concentrações de avarone superiores a 1 yjg/ml.

2. Inibição da produção de Transcriptase inversa por células H9-HTLV-III tratadas com avarone ou avarol:

Foi verificado se a adição ao quarto dia de avarol ou avarone as células H9-HTLV-III detinha a produção de vírus HTLV-III. Escolheu-se a transcriptase inversa como uma medida para a quantidade de vírus no meio de cultura. Portanto, a inibição de transcriptase inversa indicava a inibição da produção do vírus. Os resultados estão descritos rio quadro seguinte.

Concentração Actividade da do composto Transcriptase-Inversa

Composto adicional	(/ig/ml)	(em %)
Nenhum		100
Avarol	0,1	36
	1	20
	5	18
Avarone	0,1	20
	1	14
	5	14

E evidente que na fracção sobrenadante das células H9-HTLV-III, que não foram tratadas com avarol ou avarone, se verificou uma considerável ac':'vidade de traidoriptase inversa. A adição de avarol e avarone conduz a uma redução,dependente da dose,da actividade da transcriptase inversa na fracção sobrenadante. Mesmo com uma dose muito pequena de 0,1 /ig/ml, verificou-se uma inibição considerável. Os compostos utilizados de acordo com a presente invenção são portanto capazes de inibir a replicação do vírus praticamente de um modo total, em doses tais que diversos parâmetros, por exemplo, desenvolvimento celular in vitro, não são praticamente prejudicados.

2· Inibição da expressão de plãe Ppzj, ITLV-III em H9 - HTLV-III pelo avarone e avarol.

Verificou-se que o avarol e o avarone possuem uma forte acção inibidora da expressão de p?4 HTLV-III e plãem células H9 infectadas. Quando células H9 alvejadas foram tratadas com HTLV-III isoladas e cultivadas na ausência de compostos a serem ensaiados, as células H9 foram infectadas e, tal como se determinou pelo ensaio da imunofluorescência de um modo indirecto, verificou-se a expressão da proteína pj4 e pi5 . Após incubação de células H9-HTLV-III, com os compostos a serem ensaiados, verificou-se um efeito protector praticamente total.

u

Os resultados obtidos foram os seguintes:

Composto adicionado	Concentração do composto ( xig/ml )	Expressão de
015 e plF	pP4(em %)
Nenhum		100	100
Avarol	0,1	37	28
	1	12	14
	5	12	14
Avarone	0,1	50	70
	1	37	70

E evidente que quer o avarol quer o avarone causam uma redução significativa na expressão das proteínas pl5 e poo cie HTLV-III.

Toxicidade

A toxicidade in vivo (mg de composto/kg) de avarone (avarol) em ratos NMRI machos é a seguinte:

Toxicidade aguda: 181.,2 (269,1),11^ 111,1 (156,4)

Toxicidade subaguda: ΒΙ^θ 172,1 (218,4), dLjq 109,7 (138^6) (Muller et al., Câncer Research 1985, 45, 4822-4826).

Identificação

Os ingredientes com actividade anti-viral e anti-tumoral ou agentes da presente invenção possuem as fórmulas:

Avarone

- f(1R) - 1,2,3,4,4a,7,8,8^-octahidro - 1J3, 2JB, 4 aJB, 5-tetrametil-1-naftilmetill- auinona

⁽21^28θ2 ’ ^ρ·^'θ^·θ *33-212θ

C 80,73%; Η 9,03%; Ο 10,24%

Avarol

-(j(1R) - 1,2,3,4,4a,7,8,8aâl-octahidro- 1 β,2β, 4 άβ, 5-tetrametil-1-naftilmetil] -1,4-benzenodiol

Fórmula molecular do avarol ^C21^H30°2 ’ ^PJ ^{ole! 314}

C 80,32% ; H 9,81% ; 0 9,87%

e seus 3,4-di-hidro derivados

L.Minale et al. Jetrahecten Letters 36 , 3401-3404 (1974) e Mtíller et al.,

Câncer Research 45, 4822-4826 (1985) descreve ali o composto 3_;4-di-hidro-avarol e a 3,4-di-hidroavarone, sintetizada facilmente da forma seguinte:

Síntese da 3,4-di-hidroavarone _a partir do 3,4-di-hidro-avarol Dissolveram-se 0,3 g de 3,4 di-hidroavarol em dez (10) ml de éter dietílico e adicionaram-se 0,25g de óxido de prata. Após agitação durante duas (2) horas a mistura reatrional foi filtrada e o filtrado suplementado com dois (2) g de sulfato de sódio. Após repouso durante a noite,eliminou-se o sulfato de sódio por meio de filtração. Por cristalização com n-hexano obteve-se o 3,4-di-hidroavarone sob a forma pura.

I

PrÓ-farmacos ou precursores e sua preparação

Os compostos avarone e avarol e os seus derivados 3,4-di-hidro também podem ser utilizados ou incorporados em composições farmacêuticas de acurdo com a presente invenção e administrado sob a forma de compostos que convertem ou metabolizam^em seguida, após a introdução num animal vivo. Estes compostos são vulgarmente referidos actualmente por profármacos ou precursores, e exemplos representativos deles incluem os seus ésteres e derivados equilamínicos. Como já foi indicado, alguns destes compostos são conhecidos na técnica enquanto que outros são preparados de forma conhecida. Tais profármacos e precursores representativos, assim como a sua preparação, são indicados nos exemplos que se seguem, que servem para explicitar a presente invenção, mas que não são construídos para a limitar.

Exemplo 1

Avarone e Avarol kg de esponja fresca (contendo água) são esmagados numa starmix e extraídos com 250 ml de acetato de etilo. 0 extracto obtido deste modo é seco sobre sulfato de magnésio e filtrado.

filtrado é concentrado até à secura. 0 resíduo obtido (cerca de 50 g) é k___r·retomado com 100 ml de benzeno e cromatografado numa coluna de gel de síli- ^zca (cerca de 200 g) com benzeno como eluente. 0 avarone aparece no eluato enquanto o avarol permanece na coluna. 0 avarol é eluido com uma mistura de benzeno e acetato de etil (a 90:10, v:v). 0 eluato é concentrado à secura e o avarol obtido deste modo sob a forma pura por meio de cristalização com diclorometano-acetona. 0 avarone é purificado por recristalização com benzeno. Obtiveram-se 0,7 g de avarone, 8,9 g de avarol; avarone-ponto de fusão : 62-64°C; avarol-ponto de fusão 148-150^0.

Exemplo 2^

3-etilamino-avarone e 4-etilamino-avarone

a) adicionaram-se 2,5 g de cloridrato de etilamina e 5 ml de piridina a uma solução de 500 mg de avarone em 1000 ml de etanol a 50% e após 20 horas destilou-se o etanol sob vácuo. 0 resíduo aquoso foi extraído com diclorometano e o extracto concentrado cromatografado sob uma coluna de gel de sílica (cerca de 30 g) com diclorometano como eluente. Deste modo foi possível separar o 3-etilamino—avarone e 4-etilamino-avarone: rendimento 480 mg e 420 mg respectivamente.

De um modo semelhante obteve-se:

b) 3-propilamino-avarone e 4“-propilamino-avarone

c) 3*-isopropilamino e 4-isopropilamino-avarone

d) 3-n-butilamino-avarone e 4'-n-butilamino-avarone

Exemplo 3.

Diacetato de avarol

a) Dissolveram-se 500 mg de avarc1- em 20 ml de piridina absoluta e adicionou-se 1 g de cloreto de acetil, em porções individuais à solução, sob agitação.

A solução foi trabalhada da maneira habitual, concentrada até à secura e o resíduo extraído com heptano em ebulição. Após arrefecimento cristali-

zou o éter que se recristalizou com hexano. Ponto de fusão: 62-64°C,rendimento cerca de 430 mg.

De um modo semelhante obteve-se:

b) dipropionato de avarol

c) divalerianato de avarol

d) ditrimetilacetato de avarol

Exemplo 4

Dicapronato de avarol

a) Dissolveram-se 300 mg de avarol em 25 ml de piridina absoluta e adicionaram-se 0,6 g de anidrido caproic^ em porções separadas,, à solução, enquanto se agitava. Trabalhou-se a solução da maneira habitual, concentrou-se à secura, e extraíu-se o resíduo com heptano em ebulição. Recristalizou-se com acetona e em seguida com hexano.

Rendimento : 210 mg

De um modo idêntico ao descrito obteve-se :

b) diisovalerianato de avarol

c) dietilmetilacetato de avarol

d) succinato de avarol

Exemplos de composições farmacêuticas

Nos exemplos de composições que se seguem, pode-se utilizar como ingrediente activo em cada caso um dos compostos utilizados de acordo com a presente invenção,isoladamente ou em mistura com outros compostos.

Exemplo a

Composição para comprimidos

Substância activa *	10	mg
Lactose	18	mg
Amido de batata	38	mg
Gelatina	2	mg
Talco	2	mg

Estearato de magnésio

0,1 mg * por exemplo avarone, avarol 3,4-di-hidro-avarone, 3,4-di-hidro-avarol, ou prófármacos ou precursores.

Exemplo b

Substância activa *

Amido de milho

Polivinilpirrolidona

Os comprimidos são revestidos

Exemplo c

Substância activa *

Amido de milho

Lactose

Talco

Esta mistura é introduzida

Composição para comprimidos mg mg mg uma camada de açúcar corado.

Composição para cápsulas mg mg mg mg cápsulas de gelatina.

Exemplo d

	Solução injectável
Substância activa *	12 mg
Sorbitol	40 mg
Agua estéril até	1 ml
Exemplo e
	Composição líquida oral
Substância activa *	2 g
Sacarose	250 g
Glucose	300 g
d-Sorbitol	150 g
Agar-Agar	0,15 g
Metilparabeno	0,5 g
Propilparabeno	0,05 g
Substância aromatizante	10 g
(aroma de laranja)
Amarelo de tartazina	-
Água purificada até	1000 ml
Exemplo f	Composição líquida oral
Substância activa	2 g
Tragacanta	7 g
Glicerina	50 g -
Sacarose	400 g
Metilparabeno	0,5 g
Propilparabeno	0,05 g
Substância aromatizante
(aroma de groselha)	10 g
Corante vermelho 2C.E. 184	0,02 g
✓ Agua purificada até	1000 ml
Exemplo g	Composição líquida oral
Substância activa*	2,4 g
Sacarose	400 g
Tintura de casca de laranja amarga	20 g
Tintura de casca de laranja doce	15 g
Agua purificada até	1000 ml

As secções seguintes evidenciam respectivamente que o avarol e o avarone são eficazes em associação com outros compostos ou princípios activos; que a sus utilização não tem efeitos adversos sobre a resposta de imunidade de um paciente tratado por esse meio e que, um regime de tratamento vantajoso pode ser designado devido â sua extensa semi-vida.

Aplicação de avarone / avarol em associação com outros compostos.

Ê também vantajosa a utilização de avarone e avarol em associação com outros compostos.

I

Exemplo

Estudos de associações foram realizados in vitro com avarol e ava rone em conjunto com ditiocarbamato de di-etilo (DDC). 0 ditiocar bamato de di-etilo demonstrou, anteriormente, possuir actividade imunomodulante (Lang et al., Lancet 2^: 1066, 1985) em doentes por tadores de Sida e que actuam por inibição de superóxido dismutase (SODase), quer in vitro quer in vivo (Heikkila et al., J. Biol. Ghem. 251! 2182-2185; 1976 e Heikkila et al., em Superóxido e Superóxido dismutase, (eds. A. M. Michelson, J. M. McCord e I. Friedovich), Academic Press, Nev? lork; pp. 367-373)·

Métodos

Células de linfoma de ratos 15178;/ desenvolveram-se num tubo de cultura em meio essencial mínimo de Eagle, suplementado com soro de cavalo a 10% (Muller et al., Câncer Bes. 39: 1102-1107, 1979 e Muller et al., Câncer Res. 45, 4822-4826, 1985). Para as experiências de resposta de dose, iniciaram-se culturas com 5 ml, por meio de inoculação de 5000 células/ml e incubaram-se â temperatura de 37°C, durante 72 horas; os controlos eram de gerações de 10,4 a 10,6 horas. 0 desenvolvimento celular foi determinado por contagem de células computorizada, por meio de um contador da célu. las (contador channel-128; Cytocomp, sistema Michaelis: Biotron-Medizinzlektronik, Mainz; Alemanha Ocidental).

Angewandte matemática dices FIC)

A DEçf, (+/- DS) foi avaliada por análise de regressão (L. Sachs, Statistik, Springer-Verlag, Berlim, 1984). a avaliação dos índices de concentração inibidora fraccionada (ín de avarol/avarone-DDC associados, foi realizada de a cordo com equações e condições experimentais publicadas (Mullèr et al., Câncer Lett. .1.,127-152, 1976 e Phillips et al., Antimicrob. Agents Chemother. 9, 756-740, 1976). 0 resultado de FIC> 1 é inter. pretado como antagonístico; FIC = 1 como efeito aditivo; FIC< 1 é sugestivo de sinergismo, e FIC<0,5 é considerado como sinergismo significativo.

Resultados

Neste conjunto de experiências, incubaram-se células L5178y com avarol na ausência ou na presença de ditiocarbamato de dietilo inibidor de superóxido dismutase. Na ausência de DDC a DE^q para o avarol foi determinada no valor de 0,94 +/- 0,14 jfM, como previamente descrito (Muller et al., Câncer Res. 45 : 4822-4826, 1985).

A coadição de ditiocarbamato de dietilo (DDC) em concentrações de 1,46 pVÍ ou 1,71 pM às culturas, diminuíram significativamente a DE^q para concentrações de 0,27 +/- 0,04 pM. e 0,108 +/- 0,015

As duas concentrações de DDC escolhidas, originam uma inibição do desenvolvimento das células de 26% e 58% respectivamente, na ausência de avarol.

Como mais uma prova do efeito aditivo do avarol/avarone em associação com DDC, foram determinados os índices FIC.

Foram escolhidos os ratios de concentração compreendidos entre 0,2 : 1 a 1,5 : 1,0 (avarol/avarone: DDC). Osmdices FIC calculados variaram entre 0,82 e 1,04 indicando uma interacção aditiva entre avarol/avarone e DDC (Quadro).

Conclusão

Estes estudos mostram

que o avarol ou avarone podem ser administrados in vitro em associação com outros agentes terapêuticos, resultando um efeito terapêutico benéfico.

Quadro índices da concentração inibidora fraccional (índices FIC) para avarol/avarone-DDC associados sobre as células L5178y

Escolheram-se condições de incubação padrão (5 ml e 72 horas). Os ratios de associação foram baseados em x jtiM avarol/avarone para Y >uM de DDC.

Associações de rármaco	Relação de concentrações	índices
Avarol : DDC	0,3 : 1,0	0,87
	0,5 : 1,0	0,82
	1,3 : 1,0	0,90
Avarone: DDC	0,2 : 1,0	0,92
	0,4 : 1,0	1,04
	0,7 : 1,0	0,97

Influência do avarol nas respostas de imunidade, escolhidas in vitro e in vivo

Estudos in vitro : Estudos prévios revelaram que células de leucémia derivadas de células T são inibidas de um modo mais sensível pelo avarol do que linfócitos T ou linfócitos B normais (Muller et al., Câncer Res. 45 : 4822-4826: 1985 e Muller et al., Eur. J. Câncer Clin. Oncol. 22:473-476 ; 1986). 0 desenvolvimento de células de linfoma é inibido em cerca de 50% em concentrações compreendidas entre 0,3 e 0,4 jug/ml (=0,9-1,1 ^uM) enquanto que a taxa£^H/em incorporação de dThd em linfócitos T normais é inibida cerca de 50% por valores compreendidos entre 0,5 - 1,3 jug/ml e, em linfócitos-B normais, entre 1,6 - 1,9 yig/ml. Portanto os estudos in vitro seguintes foram realizados com 0,5-3 ^ug/ml de avarol.

. >

Estudos in vivo : De experiências anteriores com ratos NMRI portadores de células L5178y, sabe-se que a dose quimioterapêutica de avarol está compreendida numa escala entre 1-50 mg/kg a uma dose letal de 50% de 269,1 mg/kg (Muiler et al., Câncer Res. 45 : 4822-4826, 1985). A dose letal 50% (tratamento durante 5 dias) para ratos machos Sprague-Dawley foi determinada no valor de 235,7 mg/kg. Portanto, doses de avarone diárias de 1-30 mg/kg por injecção foram escolhidas para os estudos in vivo seguintes:

Fundamento : Considerando uma aplicação de avarol e avarone no tratamento de doentes com a sindrome de imunodeficiência adquirida (SIDA). 0 efeito do avarol na resposta de imunidade, foi estudado in vitro e in vivo. Os resultados demonstraram que o avarol não causa influência em doses antileucémicas in vivo, na hipersensibilidade tipo retardada (DTH) e na hipersensibilidade mediada por anti-corpos (AMH) mas exibe um efeito estimulante na produção de anti-corpos in vitro e in vivo . Estas propriedades são muito vantajosas, especialmente para doentes de SIDA que mostram deficiências de células Be de cêluLas 1 (Ammann et al., J. Amer. Med. Ass. 251 : 1447-1449; 1984).

1· Produção de imunoglobulina (_Ig) in vitro

Método

Linfócitos de sangue humano periférico (6 x 10⁵ células/ml) foram cultivados na presença de 0 a 2 jug/ml de mitogéne de erva de cancro (PWM, Sigma n^e 9379) em meio essencial mínimo de Dulbeccos, suplementado com soro fetal de vitela a 20% durante seis (6) dias. Os resultados foram realizados com um volume final de 200 yil em placas microtituladoras (Dynatech; M129B) (Milller et al., Eur. J. Câncer Clin. Oncol. 22 : 473-476, 1986). Adicionou-se avarol numa concentração compreendida entre 0 a 3 yjg/ml, no tempo 0 (zero) ou 3 dias após o início da cultura. Foram recolhidos os sobrenadantes e doseados para se avaliar o conteúdo em imunoglobulina humana.

²⁵/

As culturas sobrenadantes foram doseadas pelo ensaio da imunoabsorção ligada ao enzima (Houtman et al., Clin. Exp. Immunol. 62 : 696-704; 1985) utilizando-se IgG anti-humana (Dakopatts, Hamburg; P214) e IgM anti-humana (Dakopatts P215). Estes anti-corpos foram conjugados com peroxidase.

A actividade ligada ao enzima foi medida utilizando-se o ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazoliiaBsuLfónico) (Sigma n^e A-1888) como substracto.

Resultados : Sob as condições do ensaio utilizadas, linfócitos de sangue humano periférico (não separados) produziram 1,3 yjg/ml de imunoglobulina G e 8,9 jug/ml de imunoglobulina M, durante uma cultura de seis dias.

(Quadro 1). A produção foi reforçada após a adição de PWM para 4,1 jig/ml de IgG e 12,3 jug/ml de IgM . Utilizou-se uma concentração de PWM apenas de 2 jjg/ml, previamente avaliada como sendo subóptima com a finalidade de se detectar mais sensivelmente uma possível produção de imunoglobulina após o tratamento com avarol. Os resultados revelaram um aumento significativo de ambas as imunoglobulinas G e M nas culturas tratadas com 0,3 ou 1 ^ug/ml de avarol, respectivamente na presença de PWM (Quadro 1) e durante o período da presença do avarol de 0 a 6 dias ou de 3 a 6 dias. A produção de imunoglobulina fez-se em valores normais com concentrações de avarol mais elevadas.

2. Produção de imunoglobulina (Ig) in vivo

Relativamente às consequências funcionais dos compostos sob células-B in vitro, verificou-se (previamente) que a secreção de imunoglobulina 3 e imunoglobulina M é estimulada em culturas de células de linfóses humanas (não separadas) que foram tratadas com concentrações não citõstáticas de avarol. Este dado é· confirmado pelos resultados do teste da placa de Jerne. As experiências revelaram que suspensões de células simples, preparadas a partir de baços de murganhos, imunizadas com células vermelhas de sangue de carneiro (SRBC, que tinham sido pré-tratadas com ²⁶A doses terapêuticas de avarol, continham um número mais elevado de células em formação de placa, do que os baços de animais não tratados.

Método teste da placa de Jerne e Nordin (Science 140 : 405-406, 1963) foi utilizado com a modificação de Cunningham e Szenberg (immunolog. 14: 599-601; 1968) . Rapidamente 8 murganhos machos NMRI por grupo (20-22 g) foram imuQ nizados rio dia 0 (zero) por meio de injecção intra-peritoneal de 5 x 10 SRBC em 0,5 ml de solução salina. 0 tratamento com avarol foi administrado quer por via intra-peritoneal a partir do diâ 0 (zero) até ao dia 4 ou a partir do dia -4 até ao dia 0 . Uma hora após a última administração do fármaco, os animais foram sacrificados e sangrados, retiraram-se os baços e uma suspensão de células simples foi preparada por meio de passagem dos baços reunidos através de um peneiro de 120 /im . Após a lise dos eritrócitos com NH^Cl (cloreto de amónio) 0,15 molar, as células foram lavadas duas vezes com solução salina balanceada de Hank contendo 29 ml de carbonato de hidrogénio e sódio (NaHCO,) a 7,5% e 10 ml de solução tampão de Hepes 1 molar para um litro. Fez-se de novo a suspensão das células em 2 ml por cada baço. Seis câmaras de Cunningham por grupo foram cheias com uma mistura de 0,5 ml de uma diluição apropriada de céQ lulas de baço (geralmente 1:100), 0,5 ml de uma suspensão de SRBC (10 /ml) e 125 yil de complemento de cobaia normal. Após um período de 90 a 120 minutos de incubação a 37°C, contaram-se o número de placas. Calcularam-se as placas por baço ou por 10 células de baço.

sangue reunido de oito dos murganhos foi centrifugado para se obter um soro. Os títulos de imunoglobulina M e imunogiobulina G foram medidos por meio de um método de mercaptoetanol (Hudson, L. e Hay. F.C. Praticai Imirunology, Blackwell Sei., Oxford; 1983).

Resultados

Por meio da aplicação do ensaio de Jerne_} modificado o número de células formando placa no baço de murganho, injectado com SRBC, foi determinado na ausência ou na presença do tratamento com avaro1 (Quadro 2). Os animais tratados com 30 mg/kg de avarol a partir do dia 0 (zero) até ao dia + 4, possuíam um número mais elevado de 28% de células formando placa-baço, e os animais tratados a partir do dia -4 até ao dia 0 (zero), um aumento de 21% .

2- Hipersensibilidade tipo retardada (DTH)

Método :

Reacção para as células vermelhas de sangue de carneiro (SRBC): Produziu-se DTH de acordo com o método de Lagranje et al., (J.Exp. Med. 139 : 528-542; 1974 e Liew (Eur. J.Immunol. !_> 714-718; 1977). Murganhos

Q machos NMRI (20 a 23 g, 10 animais por grupo) foram imunizados com 10 SRBC/40 jul, numa das almofadas do pé (dia 0). Quatro dias mais tarde Q injectaram-se 10 SRBC/40 /11 na almofada do outro pé. Após 24 horas mediu-se o tamanho da pata com um odi-test 00t de compasso calibrado (H.C. Kroeplin, Schlúchtern, Germany). Administrou-se avarol diariamente por via intra-peritoneal (0,15% p/v em metilcelulose) quer a partir do dia -2 até ao dia +1, quer a partir do dia +2 até ao dia +4. A taxa de DTH foi expressa relativamente ao aumento da almofada da pata, determinado após 24 horas e referido em mm. Os grupos não tratados foram injectados via intra-peritoneal apenas com metilcelulose. Os grupos tratados foram comparados com os controlos, utilizando-se o teste-U de Wilcoxon et al., (Sachs, L. Angewandte Statistk, Springer-Verlag,Berlin, 1984).

Alergia de contacto ao oxazolona :

A dermatite de combate alérgica proveniente da oxazolona foi produzida de acordo com o método de Asherson e Ptak (Immunol. 15 : 405-416; 1968)) assim, como de Bure e Degrand (Agents and Actions 9; 534; 1979). Murganhos machos NMRI (20 a 22g; 10/grupo) foram sensibilizados com 100 jul de oxazolona a 2% em acetona no abdómen depois de barbeado (dia 0). Os animais foram tratados com avarol via intra-peritoneal, diariamente a partir do dia -1 até ao dia +2 ou a partir do dia +F até ao dia +8 ; o grupo de controlo foi tratado com desoximetasona (Caseila-Hoechst) como padrão per os em dose diária de 30 mg/kg durante o mesmo período utilizado para o avarol. Sete dias após a sensibilização foi aplicada topicamente 10/1 de uma solução a 3% de oxazolona (esta concentração foi préviamente determinada para se obter uma reprodutividade de resultados melhor do que a obtida com a concentração de 2%),no lado mais interno de uma orelha, enquanto que na outra recebia apenas a acetona. Vinte e quatro horas mais tarde os animais foram sacrificados e foram perfuradas as orelhas para se retirarem duas peças de 8 mm de diâmetro de ambas. As diferenças de peso foram registadas. Os grupos tratados foram comparados com controlos, utilizando-se o teste-U .

Resultados :

efeito do avarol nas células mediadas ou hipersensibilidade tipo retardada; a reacção nos murganhos foi determinada por duas vias ; (í) reacção para as células vermelhas de sangue de carneiro e (ii) reacção para a sensioilização pela oxazolona.

A hipersensibilidade tipo retardada (DTH) para células vermelhas de sangue de carneiro (SRBC) : 0 avarol foi administrado em três doses diferentes e durante dois períodos diferentes como se descreveu na rúbrica Métodos .

Administrado durante o período do dia -2 para +1 (relativamente à última administração para SRBC), o avarol não causa influência imunossupressiva

X

significativa na DTH para células vermelhas de sangue de carneiro, em ratos NMRI depois de duas doses diárias de 30 mg/kg. Contudo quando administrado no dia +2 até ao dia +4 após a imunização, a administração de avarol em doses mais elevadas do que 10 mg/kg resuLta um efeito imunossupressivo fraco mas significativo.

Alergia de contacto à oxazolona : Numa segunda via, os murganhos foram sensibilizados topicamente com oxazolona e provocados ainda após 7 dias com o mesmo agente irritante. 0 avarol ou desoximetasona (igual a controlo negativo) foi administrado a partir do dia -1 até ao dia +2, ou a partir do dia +6 até ao dia +8 relativamente ao dia de sensibilização, como se descreveu sob a rúbrica Métodos . A desoximetasona provocou uma influência imunossupressiva significativa na reacção de DTH (24 horas aumenta a espessura da orelha (em mg) se tratado a partir do dia -1 até ao dia +2 :

10,2 + 6,0, ou 10,9 + 6,1 com um tratamento a partir do dia +6 até ao dia +8 ; os controlos correspondentes são 22,3 + 5,6 e 18,5 + 3,7 respectivamente). Por outro lado o avarol numa dose compreendida entre 3 e 30 mg/kg quer a partir do dia -1 até ao dia +2 ou quer a partir do dia +6 até ao dia +8 não influenciou significativamente a DTH à oxazolona (P > 0,05).

4. Hipersensibilidade mediada por anti-corpos (AMH)

Método

Realizou-se a reacção de Arthus activa modificada como descrito por (Titus et al., J. Immunol, Méthods 45: 65-78; 1981). Imunizaram-se ratos machos Sprague-Dawley (8/grupo) com peso de 120 g, por meio de injecção, . na parte da cauda, de 0,5 ml de uma suspensão de 4,4 ml de vacina pertussis (Behringwerke, Marburg) em 65,6 ml de cloreto de sódio a 0,9% mais 0,7 g de ovalbumina (3 x cristalizada) em 100 ml de parafina líquida.

Três semanas após a imunização, injeciou-se 0,1 ml de solução a 0,03% de ovalbumina numa pata traseira e mediu-se o volume da pata com um pletismómetro de água (Rhema) imediatamente e também 4 horas mais tarde. Os ani mais foram tratados por via intra—peritoneal com doses diárias de 3 a 50 mg/Kg de avarol (em 0,15% de metilcelulose p/v) de acordo com os seguintes esquemas: (i.) dia -1 até +2, (ii) dia +18 até +21 ou (iii) duas vezes em 24 horas e 3θ minutos depois estimulados (0 dia 0 representa 0 dia da imunização). Os controlos receberam apenas metilcelulose. Os valores foram comparados com um grupo de controlo utilizando-se 0 teste-T de Student (L. Sachs. Angewandte Statistik, Springer-Verlag, Berlin; 1984).

Resultados

Para se determinar a possível influência do avarol na AMH nos ratos, cau|sada pela ovalbumina, utilizou-se uma reacção de Arthus modificada. Os resultados revelaram uma supressão não significativa de reacção de Arthus pelo avarol independertemente dos esquemas escolhidos seguintes; (_i)dia -1 até até ao dia +2' ou (ii) dia +18 para o dia +21, sendo 0 dia 0 0 dia da imunização ou (iii) se aplicado imediatamente antes do desafio com a ovalbumina. A supressão ligeira da reacção observada quando os ratos foram tratados com avarol (3O mg/Kg) 24 horas e 3θ minutos antes do desafio, também se verificou não ser significativa (P?0,05).

Resumo efeito do avarol no sistema linfoide foi estudado in vitro e in vivò.

avarol aumentou significativamente a produção de imunoglobulina G e

M pelas culturas das células linfoides humanas (não separa.

das) in vitro e ligeiramente 0 numero de células formadas em placa in vivo no baço de murganhos. Além disso, um pré-tratamento dos murganhos com avarol resultou numa taxa de incorporação de/>H/-dThD mais elevada nas culturas in vitro de linfócitos desprovidos de macrófagos e nas culturas in vitro contendo macrofagos.

A influência estimuladora do avarol nas respostas de imunidade humorais

não é acompanhada por uma alteração da reacção de hipersensibilidade imediata por anti-corpos, como se avaliou pela reacção de Arthus. Não se detectou influência significativa do avarol no sistema imunológico celular in vivo (ratos ou murganhos) a partir dos estudos nas reacções de hipersensibilidade tipo retardada para células vermelhas de sangue de carneiro e para oxazolona. Os dados dos animais e in vitro indicam que o avarol reune propriedades úteis, por exemplo eficiência in vitro anti-HIV e aumento nas respostas de imunidade humoral.

Quadro _1_ : Produção de imunoglobulina média em culturas de linfócitos de sangue humano periférico dependentes do efeito mitogénico de PWM e no avarol.

Concentração Imunoglobulina sintética (jug/ml)

de avarol	PWM	IgG tempo (dias)	IgM tempo (dias)
(yig/ml )		0 a 6	3 a 6	0 a 6	3 a 6
0	-	1,3 + 0,3	1,4 + 0,3	8,9 + 2,0	8,5 + 1,8
	+	4,1 + 0,7	4,0 + 0,8	12,3 + 2,6	11,7 + 2,2
0,3		2,1 + 0,5⁺	2,0 + 0,5⁺	14,7 + 3,4⁺	14,2 + 3,3⁺
	+	6,7 + 1,5⁺	7,9 + 1,9⁺⁺	20,4 + 5,1⁺	24,7 + 5,6⁺⁺
1,0		2,3 + 0,6⁺	2,2 + 0,5⁺	15,6 + 4,0⁺	15,9 + 4,2⁺⁺
	+	7,0 + 1,6⁺	8,5 + 1,9⁺⁺	23,5 + 5,5⁺⁺	25,6 + 5,9⁺⁺
3,0	-	1,2 + 0,3	1,3 + 0,3	8,1 + 1,8	8,4 + 1,9
	+	3,9 + 1,0	4,9 + 1,0	10,5 + 2,6	11,7 + 2,9

+ P < 0,01 ; ++ P < 0,005

Ó</

Quadro 2 : Efeito do avarol no número de células em placa no baço do mur- -^z ganho .

Avarol (mg/kg)	Esquema dias	Células de baço (x 10⁷)	Células em placa por	Título
baço (x 10“⁵)	10⁶ células	IgM	IgG
0	de 0 a +4	11,3	3,13	2,782	256	4
	de -4 a 0	11,6	2,62	2j259	512	4
30	de 0 a +4	12,0	3,98	3₅316	256	2
	de -4 a 0	14,4	3,18	2.202	512	4

I

Determinação da semi-vida do avarol marcado com tritium e da distribuição orgânica nos ratos.

Animais : Ratos Sprague-Dawley (machos)

Semi-vida : Injectou-se avarol (por via intra-venosa) em doses terapêuticas em ratos. As concentrações seguintes de avarol foram as escolhidas: 2 mg/kg, 10 mg/kg e 20 mg/kg.

Obteve-se o avarol marcado com tritium por meio de conversão de avarol em di-hidro-avarol na presença de gás tritium.

Percentagem de radioactividade no sangue (100% é a quantidade marcada de radioactividade presente 10 minutos após a terminação da injecção intra-venosa)

Doses de Tempo de determinação (horas após a avarol terminação da injecção i.v.)

6 12 24 48

2	mg/kg	95	91	73	41	23
10	mg/kg	96	88	72	43	26
20	mg/kg	92	83	75	39	21

Destas determinações torna-se evidente que a semi-vida do avarol nos ratos é de aproximadamente 22 horas.

I

Distribuição orgânica

A distribuição orgânica foi determinada pelo mesmo método, utilizando-se o avarol marcado com tritium. As determinações foram realizadas 24 horas após a terminação da aplicação intra-venosa.

I

Orgão	Doses de avarol (mg/kg)	Concentração de avarol (microgramas de avarol por grama de tecido)
Sangue	2	4,3
	10	5,2
	20	5,8
Baço	2	1,7
	10	1,9
	20	2,2
Fígado	2	6,4
	10	6,9
	20	7,4
1 Rim	2	1,6
	10	2,2
	20	2,4
Coração	2	0,7
	10	0,9
	20	0,9
Testículos	2	0,48
	10	0,63
	20	0,67
Cérebro	2	0,45
	10	0,58
	20	0,64
. Pele	2	0,4
1	10	0,6
	20	0,6

Estas concentrações foram determinadas de acordo com a radioactividade. Além disso, a natureza química do produto radioactivo foi identificada por cromatografia líquida de alta resolução e verificou-se consistir em mais de 90% de avarol.

.

Adicionalmente a actividade biológica do composto no sangue foi determinada após extrrcção com acetato de etilo e avaliada in vitro num sistema de células L5178y (Milller, W.E.G. et al., Comp. Biochem. Physiol. 80C, 47-52 ; 1985). Utilizando este sistema, a actividade biológica do composto presente no sangue foi determinada e convertida em gramas. Quando se usou este método, a concentração no sangue determinada foi apenas entre 5 a 15% mais baixa do que quando se determinou por meio de radioactividade.

Conclusão :

1) 0 avarol sofre apenas uma ligeira modificação para uma forma biológicamente inactiva (não mais do que 15%) após circulação no corpo durante 22 horas.

2) 0 avarol possui uma semi-vida longa (aproximadamente 22 horas) após administração intra-venosa de concentrações anti-tumor.

3) 0 avarol penetra na barreira cerebral sanguínea.

Estas propriedades do avarol no corpo dos ratos apresentam-se grandemente favoráveis para uma aplicação ín vivo do avarol no homem. Com base nestes dados deduz-se que para a aplicação terapêutica do avarol no homem, 1 a 2 injecções apenas são necessárias por dia para assegurar doses terapêuticas benéficas, as quais estão compreendidas entre 0,3 e 5 microgramas/ml de sangue.

Fundamento: Estimulação da Produção de

Gama -Interferon

Game -Interferon é um mediador da imunidade dos linfócitos-T e é provavelmente a célula chave de onde deriva a linfoquina que Induz os macrófagos e outros hospedeiros potenciais de células de defesa para exercerem uma actividade anti-microbiana reforçada contra agentes patogénicos intra-celulares e extra-celulares.

r

Aceita-se que doentes com Sida ou com o complexo relacionado com a Sida, mostram uma produção de gama-interferon reduzida (H.W. Murray et al.,

The New England Journal of Medicine 313; 1504-1510, 1985). A razão molecular para esta manifestação é uma redução profunda da secreção de interleuquina-2 induzida por antiçenes (H.W. Murray; J.Clin. Invest.76: 1959-1964; 1985) . Sob condições normais in vivo, o gama-interferon é produzido pelos linfócitos-T, que são estimulados por interleuquina-2. Os antigénes provenientes de vírus, tais como da vacina ou do herpes simplex, podem iniciar a secreção de gama-interferon nos leucócitos de seres humanos imunizados.

Portanto é vantajoso que um agente quimioterápico anti-Sida seja fornecido com a possibilidade de induzir gama-interferon em linfócitos-T.

avarol éum composto tal que associa a actividade anti-Sida com a capacidade para induzir a produção de gama-interferon. As experiências foram realizadas ín vitro utilizando-se linfócitos humanos periféricos em cultura.

Material e_ Métodos

Efector celular: Linfócitos periféricos foram preparados por meio de centrifugação em gradiente Plaque-Ficoll e lavados duas vezes. Em seguida as células foram divididas e ajustadas suma concentração de 5 x 10⁶ células/ml.

Medição de interferon : Os níveis de interferon foram definidos por imunoenzimoensaio (EIA), gama-interferon, placas de fundo plano de 96 cavidades (Greiner, Nuertingen) foram revestidas com um anti-corpo monoclonalreconhecível por gama-interferon. Adicionaram-se 20G /11 de amostra do sobrenadante por cada cavidade, conjuntamente com peroxidase ligada a gama-interferon (50 /il), que consistia no mesmo anti-corpo utilizado para o revestimento. Após 24 horas de incubação, as placas foram lavadas com solução de tampão salina que continha 0,5% p/v de Tween 20 detergente.

3,

A reacção enzimática foi completada por uma preparação que continha substra- * to de peróxido de hidrogénio. A reacção foi detida após 15 minutos por meio de 100 jul de ácido sulfúrico por cada cavidade. A quantidade de ínterferon foi definida por comparação da extinção da amostra em ensaio com wcurva psdr~ o produzida por valores conhecidos de gama-interferon .

Interferon . 0 gama-interferon foi fornecido por Hoffmann-La Roche, Grenzach, Germany.

Resultados : Células revestidas foram incubadas com concentrações diferentes de avarol durante 0 a 96 horas.

Os resultados estão resumidos em seguida :

Concentração de avarol (>ig/ml )

Título de gama-interferon produzido por linfócitos (Unidades/ml de Sobrenadantes)

Período de incubação (horas)

	0	24	48	72	96
0	2	5	3	7	4
0,2	4	17	24	26	21
0,5	4	23	74	89	118
1,0	3	20	52	62	73

(Os resultados são as médias de quatro experiências paralelas;

os desvios padrão são inferiores a 10%).

A partir destes dados é evidente que o avarol induz de forma significativa e pronunciada o gama-interferon in vitro , numa dose óptima de 0,5/ig/ml.

Conclusão avarol possui um efeito terapêutico benéfico adicional: Os estudos apresentados aqui in vitro mostram que o avarol induz à produção de gama-interferon in vitro e sugerem que ele actua também in vivo do mesmo modo nos doentes com Sida.

Em conclusão, do exposto, é evidente que a presente invenção proporciona um novo método para o tratamento e controlo da Sida, e o complexo relacionado com a Sida (CRS), utilizando-se avarone ou avarol e seus derivados e/ou precursores e/ou seus prófármacos e composições farmacêuticas que ^p abrangem estes ingredientes activos para as utilizações referidas, possuindo todos as vantagens e características enumeradas anteriormente.

Compreende-se que a presente invenção não é limitada aos detalhes exactos de operação, ou às preparações exactas, métodos, processos, ou aspectos mostrados e descritos, como modificações óbvias ou equivalentes que serão aparentes aos técnicos nesta matéria, e a presente invenção é, portanto, apenas limitada pelo âmbito total que pode ser legalmente de acordo com as reivindicações apensas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Método de tratamento da SIDA ou complexo relacionado com a SIDA (CRS), caracterizado pelo facto de se administrar a um paciente necessitado desse tratamento uma quantidade efectiva compreendida entre 2 e 20 mg/Kg de peso do corpo e por dia de um composto escolhido entre avarol, avarone, um seu derivado 3,4-dihidro ou um prõ-fãrmaco dos compostos anteriores, como ingrediente activo, sob a forma de uma composição farmacêutica preparada mediante mistura do ingrediente activo com 99,5 a 2 % de um excipiente ou adjuvante aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadc pelo facto de se utilizar como ingrediente activo o composto avarone ou um seu derivado, eventualmente o 3,4-dihidro, de fórmula geral na qual

R^ e R₂ representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C^-C^) amino;

ou o composto avarol ou um seu derivado, eventualmente o 3,4-dihidro, de fórmula geral na qual

R^ e R₂ têm os significados definidos antes na fórmula geral Ia; e

R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo

C,-C., acilo C_-C_r, éter ou éster facilmente hidrolisável, 14 2 6 sob o ponto de vista fisiológico, ou

-41( / * os dois símbolos R^, considerados em conjunto, representam um grupo diacilo C^-C^;

ou um sal aceitável, sob o ponto de vista fisiológico ou uma mistura dos compostos citados antes,