PT85031B - Metodo de tratamento de celulas t de leucemia/linfoma no adulto mediante administracao de composicoes farmaceuticas contendo avarone e avarol e seus derivados - Google Patents

Description

Método de tratamento de células T de leucémia/linfoma no adulto mediante administração de composições farmacêuticas contendo avarone e avarol e seus derivados

A presente invenção descreve a utilização de avarone e avarol e seus derivados para o controlo de células T de leucémia/linfoma de adulto.

avarone e o seu derivado hidroquinónico (o avarol) são substâncias naturais presentes nas esponjas marinhas Dysidea avara\ A patente de invenção da Republica da Alemanha Federal OS 34 27 383, publicada em 30 de Janeiro de 1986, refere que o avarone e o avarol e seus derivados possuem propriedades antitumorais, antibacterianas e antimicóticas que os tornam apropriados em particular para o tratamento do cancro e doenças infecciosas. Além disso, afirma-se ali que estes compostos têm uma certa acção virustática in vitro sobre as culturas do vírus do herpes simplex e portanto contra vírus de DNA. Contudo, ainda não foi, até ao presente, verificado a possível inibição de vírus de RNA.

Além disto, verificou-se que o avarone e os seus derivados possuem - 2 actividade antimutagenica . Finalmente descobriu-se que o avarone _ ~ , 3 e os seus derivados também tem uma acçao anti-leucemica . A existência desta acção anti-leucémica foi derivada de estudo in vitro, assim como estudos in vivo com células leucémicas de murganho L5178-4. Até ao momento presente, contudo, não existe qualquer ligação conhecida entre tais células tumorais e as células T de leucémia do adulto e os vírus que são causadores desta. Portanto, não é óbvia a utilização do avarone, avarol ou seus derivados para o controlo de células T de leucémia/linfoma no adulto.

objectivo da presente invenção é fornecer um método que prometa controlar as células T de leucémia/linfcma no adulto.

-2A doença de células T de leucémia (ATL) / linfoma no adulto é provocada « através do ataque às células T por vírus linfotrópicos de células T humanas do tipo I (HTLV-I, RNA-vírus).

A ATL é endémica no SucoesteJaponês, nas Caraíbas e na África Central. Por exemplo, no Japão, 10% a 15% de adultos estão infectados com HTLV-I como resultado de cada ano uma centena a duas centenas de pessoas ficarem doentes por leucémia de células T adultas e mais de metade destas morrerem even tualmente no período de um ano. Um tratamento eficaz de leucémia de células T adultas ainda não foi encontrado até ao momento.

Surpreendentemente verificou-se agora que o avarone ou avarol e os seus derivados são excelentemente apropriados para o controlo de leucémia/linfoma de células T adultas.

objectivo da presente invenção portanto é a utilização do avarone e seus derivados de fórmula geral,

(Ia) e avarol e os seus derivados de forma geral

Tetrahedon Letters 1974, 3401-3404; J.Chem. Soc. Perkin I, 1408-1414 (1976).

Mutation Research 144, 63-66 (1985).

Câncer, Res. 1985; 45 (10), 4822-4826.

f i e derivados 3,4—di-hidro em que R e R representam cada um, ind_e t ' pendentemente, um átomo de hidrogénio, ou um grupo alquil-(G^-C^) amino.

R^ represente um átomo de hidrogéneo , um grupo alquilo-, ou um grupo acilo (C -G^) ou um éter ou éster, facilmente hidroli íS Ό _{z z} Z sável sob o ponto de vista fisiológico ou os dois símbolos R·² representam, considerados em conjunto, um grupo diacilo (Ο^-ϋθ), e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico ou uma mistura dos referidos compostos para o controlo de leucémia de células T/linfoma. --------------- ------12

Os compostos referidos antes, avarone (fórmula geral I a:R =R^c:=H) e avarol (fórmula geral I b:R =R -R -H) são os preferivelmente utilizados; nos compostos de fórmula geral (I a), um dos radicais representados por R e R^ é de preferência um átomo de hidrogénio e nos compostos de fórmula geral (I b) ambos os radicais represen tados por R e R^ são de preferência átomos de hidrogénio.

Os compostos de fórmula geral (I a) e (I b), que contém grupos amínicos, podem ser utilizados sob a forma de sais de adição de ácidos. São aqui considerados os sais usualmente compatíveis do ponto de vista fisiológico com ácidos inorgânicos ou ácidos orgâ nicos, tais como o ácido clorídrico, o ácido sulfúrico, o ácido fosfórico, o ácido tartárico, o ácido láctico, o ácido maleico e outros.

Os compostos de fórmula geral (I b) em que o símbolo R^ represen ta um átomo de hidrogénio também podem ser utilizados sob a forma dos seus sais usualmente compatíveis do ponto de vista fisiológico de bases inorgânicas ou bases orgânicas tais como o hidró xido de sódio, alquilaminas, hidroxi-alquilaminas e outros.

Os ésteres e éteres, facilmente hidrolisáveis do ponto de vista fisiológico, do avarol e os compostos de fórmula geral (I b) em que R-, representa um atomo de hidrogénio, podem ser facilmente hidrolisáveis enzimática ou quimicamente no organismo, para compos. tos hidroquinónicos correspondentes. São ésteres adequados, por exemplo, o éster do ácido ortoforraato, ésteres dos ácidos alfa-cetocarboxílicos, por exemplo, o ácido pirúvico, ésteres do ácido tolueno-sulfónico e outros.

4São éteres adequados, por exemplo, o éter metoximetílíco, éter tetra-hidróxipiranílíco, e equivalentes.

A preparação de avarone e avarol está descrita na patente de invenção da República Federal Alemã OS 34 27 383. Para esse efeito a esponja marinha Dysidea avara é submetida à extecção com acetato de étilo. 0 avarone e o avarol são isolados a partir do extrato por meio de cromatografia em coluna de gel de sílica. 0 avarone também se pode preparar a partir do Avarol por oxidação com óxido de prata.

Os derivados de fórmula geral (I a) são preparados por meio de reacção do avarone com cloridratos de alqui1-(C₁ - C₄)-aminas (por exemplo, cloridratas de metil-, etil— , propil— , isopropil—, n - butil —, isobutil—, e t-butilamina ) e isolar-se os compostos obtidos deste modo, se apropriado, sob a forma de sais de ácidos compatíveis do ponto de vista fisiológico. Para esse efeito, opera-se na presença de piridina em etanol a 50%; G. Cimino,

S. de Rosa, S. de Stefano, L. Cariello e L. Zanetti, Experiência 38, 896 (1982). As misturas de isómeros de 3¹— e 4'— alquilaminoavarones obtidas deste modo podem ser separadas por meio de cromatografia em coluna de gel de sílica.

Os derivados de formula geral (I b) são preparados mediante reacção do avarol ou dos derivados alquilamínicos protegidos no grupo amino com cloreto de acilo (C₂ - Cg) ou com anidrido carboxílico correspondente. Como cloretos de acilos pode-se utilizar por exemplo os cloretos de acilo de cadeia linear tais como o cloreto de acetilo, propionilo , n-butirilo, n-valeroílo e cloreto de caprchoílo, assim como os cloretos de acilo de cadeia ramificada tais como o cloreto de isobutirilo, isovaleroílo, 2-metil-butirilo e cloreto de trimetilacetilo. São anidridos de ácido a considerar, por exemplo, os anidridos de ácido de cadeia linear tais como o anidrido acético, anidrido propiónico, anidrido butírico, anidrido valérico e outros anidridos de ácidos carboxííicos, assim como os anidridos de ácido de cadeia ramificada, tais como o anidrido isobutírico, anidrido isovalérico , anidrido 2-metilbutírico, e trimetilacetanidrido. Obtêm-se ésteres cíclicos de fórmula geral (I b) quando se utilizam cloretos de ácidos dicarboxílicos (C^ - 0θ) ou um anidrido de ácido dicarboxílico (C^ - Cg).

Os compostos de fórmula geral (I b) de preferência reagem com cloretos de acilo ou com anidridos de ácidos carboxílicos na presença da piridina(S. de Rosa, L. Minale, R. Riccio and G. Sodano, J. Chem. Soc. Perkin I. 1976, 1408-1414 Organikum, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, 13th edition,

Berlin 1974, pag. 441-446).

-5·/*

Os éteres de alquilo(C^-C^) do avarol e os compostos de fórmula geral (Ib) i * pccem preparar-se fazendo-se reagir o composto hidroquinónico, de preferência sob a forma do seu sal de sódio ou de potássio com o correspondente halogeneto de alquilo (C₁ - C^) ou do sulfato de di-alquilo (C^C^).

Os compostos que são utilizados de acordo com a presente invenção são geralmente utilizados sob a forma de composições farmacêuticas preparadas sob a forma de unidades de dose e podem ser administrados sistémicamente, isto é, oral, rectal ou parenteralmente (via intramuscular, intra-venosa e subcutânea).

As composições contêm, pelo menos um composto de fórmula geral (Ia) ou de fórmula geral (Ib)ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista fisiológico numa quantidade eficaz para o tratamento, eliminação, alívio ou melhoramento de leucémia de células T adultas / linfoma, ou eventualmente em conjunto com excipientes compatíveis aceitáveis em farmácia e/ou adjuvantes. Tais agentes farmacêuticos contêm por exemplo, 0,5 a 98 por cento em peso, de pelo menos um composto da presente invenção, em conjunto com excipiente aceitáveFem farmácia.

Se o agente está presente sob a forma de uma unidade de dose, contêm de preferência, 10 a 100 mg desse composto, utilizado de acordo com a presente invenção.

Agentes farmacêuticos que podem estar presentes para a administração de formas sólidas orais, por exemplo, sob a forma de comprimidos, pastilhas,capsulas ou pó, ou sob formas líquidas, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, xarope, elixir, solução ou cápsulas de líquido.

Agentes orais preferidos estão sob a forma de comprimidos ou cápsulas, e podem conter vulgarmente excipientes, tais como, agentes ligantes (por exemplo xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanta, ou polivinilpirrrolidona), cargas (por exemplo, lactose, açúcar, amido de milho, amido de batata, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina), agentes lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, polietileno-glicol ou sílica), agentes de desagregação (por exemplo, amido) e agentes humidificantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio).

Agentes para a administração parentérica são, em geral, sob a forma de soluções Ou suspensões do canposto utilizado de acord) ccm a presmte iozenção ccnjuntsTente com excipientes correntes em farmácia, por exemplo sob a forma de uma solução aquosa para injecção intra-venosa ou sob a forma de uma suspensão oleosa para injecção intramuscular.

Agentes apropriados para a administração parentérica obtêm-se mediante dissolução de 0,1 a 10% em peso do composto da presente invenção na água ou em excipiente que consista num poliálcool alifãtico tal como a glicerina, pro

pileno-glicol ou polietileno-glicois ou suas misturas. Os polietileno-glicois consistem numa mistura de polietileno-glicois líquidos habituais, não voláteis, solúveis em água e em líquidos orgânicos com um peso molecular compreendidos entre 200 e 1500.

Agentes farmacêuticos para administração rectal estão sob a forma de supositórios, em que o composto da presente invenção é incorporado numa base para supositórios adequada, tal como manteiga de cacau, gorduras hidrogenadas, policeras ou polietileno-glicois, numa quantidade compreendida entre 1 e 10% em peso.

Os agentes farmacêuticos estão preparados por métodos habituais, por exemplo por conversão que incorporam os compostos utilizados de acordo com a presente invenção numa base para supositórios, filtração estéril ou enchimento em ampolas, ou frascos para gotas de uma solução dos compostos utilizados de acordo com a presente invenção, em água para injecção em conjunto com aditivos correntes, tais como cloreto de sódio, di-hidrogenofosfato de sódio _? edetato dissódico (sal dissódico do ácido diaminotetracético) álcool benzílico ou hidróxido de sódio para se ajustar o pH.

método para o tratamento de leucémia de células T/linfoma adulto consiste na administração de uma quantidade terapeuticamente activa (anti-viral ou anti-tumoral) de avarone ou avarol, ou de um derivado destes compostos ou suas misturas ou do seusal aceitável em farmácia a um paciente necessitado deste tratamento.

A dose depende principalmente da forma específica de administração ou do fim terapêutico a que se destina. A dimensão das doses individuais assim como o programa de administração pode ser determinado de preferência na base de uma avaliação individual no caso específico pelo médico, tendo em consideração a idade, peso e condição do doente via de administração e natureza e gravidade da doença. Em.geral, uma dose diária compreendida entre 1 e 1000 mg. de preferência entre 10 a 500 mg e particularmente entre 50 e 500 mg.

A duração do tratamento depende da natureza e gravidade da doença. Duma maneira geral o tratamento prolonga-se por várias semanas, por exemplo, 4 a 8 semanas.

-7Os compostos para serem utilizados de acordo com a presente invenção actuam de maneira diversificada sobre os virus do Tipo I (HTLV-I) de leucemia de células T humana e as células T atingidas pelo virus (que possuem activida-

( des anti-viral e anti-tumoral). Estes compostos podem portanto ser utilizados para o tratamento de doenças por virus HTLV.

A actividade anti-viral e anti-tumoral dos compostos utilizados de acordo com a presente invenção será examinada em seguida com base em sistemas de testes in vitro farmacológicos utilizando-se como exemplo o avarone.

Para isso, utilizaram-se linhas de células MT-2, ATL-3I e ATL-1K. Estas linhas de células estão descritas por Hashino H., et al., Proc. Nat. Academy Science USA 80, 6061-6065 (1983) e por Miyoshi, J., et al., Nature, 294, 770-771 (1981). Todas estas linhas de células contêm provirus HTLV e entre .estas linhas de células, principalmente as linhas de células MT-2 e ATL-3I 'exprimem também antigénios de retrovirus e produzem virus HTLV-I.

Procedimento do teste:

Purificação de transcriptase inversa deJITLV-I e condições do ensaio: A transcriptase inversa HTLV-I nas presentes experiências (preparada pelo método de P.S. Sarin, Y. Taguchi, D.Jun, A.Tnornton, R.C. Gallo, B.Oeberg, Biochem. Pharmacol. 34 , 1985, pag. 4075 a 4079) foi purificada por cro matografia sequencial em celulose - DEAE, rosfocelulose e hidroxiapatite. 0 enzima purificado foi guardado em tris-HCL. 50 mM (tris-hidroximetilaminometano) (pH 7.5), 1 mM de ditiotreitol (DTT,, 0,01 % de Triton X-100 e 20% de glicerina. Os ensaios para a transcriptase inversa foram realizados numa misturareaccional (50 jul) que continha 50 mM de tris-HCl (pH 7.5), 5 mM DTT, 10 mM MgClg , 100 mM de cloreto de potássio, 0,01%de Triton X-100 (CgH^-CgH^—(OCHgCHg) g - —0H) ou NP40 ( detergente não iónico Nonidet

P40, nome de marca da companhia Sigma, isto é, condensado de óxido de octilfenoletileno), 10 jug/ml (dT) (A)_n (oolímeros híbridos de oligo ou polinucleótidos, acido oligodeoxitimidílico e ácido poiiadenílico) como matriz inicial £ ^jH_7- desoxitimidina trifosfato (('ϋ)- dTTP). A mistura regccional foi incubada durante uma hora à temperatura de 37°C e a reacção foi detida por meio de adição de 50 jug de RNA de levedura e 2 ml de uma solução a 10% de ácido tricloroacético (TCA) que continha 1 mM de fosfato de sódio. As amostras foram filtradas através de um filtro millipore de 0,45 ^um e lavadas primeiro com uma solução a 5% TCA (5x) e em seguida com 2 ml de etanol a 70%. Os filtros foram secos sob uma lâmpada de aquecimento, onde em seguida se adicionou líquido de cintilação e a radioactividade foi determinada num contador de beta-cintilação.

Condições de cultura de células:

As condições da cultura de células estavam de acordo com a descri ção de H. Hoshino, et al., Proc.Uat.Acad.Sci. (USA) 80, 1985, 7557-7541.

Doseamento de imunoflurescência:

Os doseamentos de imunoflurescência realizaram-se em metanol: acetona (1:1) fixadas as células ATL-5-I com a utilização de um soro de um doente de ATL padronizado contra antigene de retrovíros (code 5 KI,H. Hoshino et al., ver citação na literatura referi da antes). As células ATL-5-I com ou sem tratamento foram fixadas em lâminas de toxoplasmose. Após a fixação de metanol-acetona (1:1) durante 50 minutos à temperatura amhiente, as 62 laminas fo ram conservadas em contentores de.plástico selados à temperatura de 20°C até à sua utilização. Soro de doente de ATL foi adicionado às células, incubadas à temperatura ambiente numa câmara húmida durante uma hora e lavadas durante duas horas com PBS (tampão de sais de fosfato) que continha 0,25 % de Triton Σ-100. As células foram em seguida tratadas durante uma hora com fluoresceína (FITC) marcada de coelho anti-imunoglohulina-G-humana (Laboratórios Cappel) e lavadas durante a noite com tampão PBS que continha 0,25 % Triton Σ-100. Adicionou-se às lâminas glicerina a 50 % e determinou-se a flurescência das células com o microscópio de flu rescência Zeiss.

1. Desenvolvimento celular:

Eizeram-se sementeiras de células de ATL-5-I, MT-2, e ATL-1K em pia cas de Petri numa concentração de 5 x 10^ células/cm^ em meio de cultura que continha 20 % de soro de vitela. Após incubação, durante dois dias, a densidade das células acumulada foi: ΑΉΤ-5-Ι: 15,2 x 10? de células/cm^; HT-2: 12,4 x 10^ células/cm^;

_z 2

ATL-1K: 15,7 x 10·^ células/cm . Estes valores formam os valores de controlo.

Em seguida amostras destas células foram tratadas durante dois dias com concentrações diferentes de avarol e avarone. Os resultados obtidos foram os seguintes:

	Concentração de fármaco (jug/ml)	3 2 Concentração celular x10 /cm
ATL-3-I	MT-2	ATL-1K
Controlo infectado	0	13,2	12,4	15,7
Avarol (células infectadas)	1,0	9,4	8,1	13,4
	5,0	8,7	7,9	10,3
Avarone (células infectadas)	0,5	8,1	7,8	7,2
	1,0	6,7	5,0	4,9
	5,0	3,1	1,7	0,2

É evidente que o avarol, e numa maior extensão o avarone, inibem o grau de desenvolvimento das células ATL. Relativamente ao avarone, os valores de concentração inibidora a 50% do desenvolvimento situa-se em 1,1 jug/ml para ATL-3-I, 0,8 ^ig/ml para MT-2, e 0,8 jug/ml para ATL-1k.

2. A inibição da produção da transcriptase inversa por células ATL-3-I tratadas com avarone ou avarol

Examinou-se a adição de dois dias de avarol ou avarone a células ATL-3-I _: pera e produção de. vírus HTLV-I.Escolheu-se como medida a transcriptase inversa para a quantidade de vírus no meio de cultura. Portanto a inibição da transcriptase inversa indica a inibição da produção de vírus. Os resultados estão indicados no quadro seguinte :

Composto adicionado	Concentração de composto ( jug/ml)	Actividade da transcriptase inversa (em %)
Zero	---—----	100
Avarol	1	83
	5	52
Avarone	0,5	54
	1	.41
	5	18

É evidente que uma actividade considerável de transcriptase inversa foi encontrada no sobrenadante de células ATL-3-I que não foram tratadas com avarol ou avarone. A adição de avarol e avarone conduz a uma redução dependente da dose da actividade da transcriptase inversa no sobrenadante.Mesmo com uma dose muito reduzida de 0,5 yjg/ml de avarone, verificou-se uma inibição de 50%.

0Os compostos utilizados de acordo com a presente invenção, em especial o í avarone, são portanto capazes de inibirem a replicação dos vírus praticamente, de uma forma total numa dose de 5 y<g/ml.

3. Inibição da expressão de antigenes de retrovírus (HTLV-I) em ATL-3-I por meio do avarone e avarol

Verificou-se que o avarone e avarol possuem uma acção inibitória forte na expressão de antigenes retrovírus em células ATL-3-I. Quando as células de ATL-3-I são cultivadas na ausência dos compostos a ensaiar, verifica-se a expressão de antigenes de retrovírus. Após a incubação das células de ATL-3-I na presença us conoostos a ensaiar, observou-se um efeito protetor forte. Os resultados obtidos representam-se em seguida :

Composto adicionado	Concentração do composto ( Aig/ml)	Expressão do antigénio retroviral (em %)
Zero	l	100
Avarol	1	82
	5	74
Avarone	0,5	63
	1,0	37
	5,0	14

E evidente que o avarol e, em especial o avarone, provocam uma redução significativa na expressão do antigéne retroviral.

Toxicidade

A toxicidade in vivo (mg de composto/kg) de avarone (avarol) em ratos NMRI machos é a seguinte:

Toxicidade aguda: 181,2 (269,1), 111,1 (156,4)

Toxicidade subaguda: Dli 172,1 (218,4), di^q 109,7 (138,6) (Mílller et al., Câncer Research 1985, 45, 4822-4826).

Identificação

Os ingredientes com actividade anti-viral e anti-tumoral ou agentes da presen te invenção possuem as fórmulas:

Avarone

-£(1R) - 1,2,3,4,4a,7,8,8ao(-octahidro - 1 p, 2 p, 4 a 5-tetrametil-1naftilmeti|-quinona

Fórmula molecular do avarone ^C21^H28°2; P.Mol.312,20

C 80,73%; H 9,03%; 0 10,24%

Avarol

2- 1R) - 1,2,3,4,4a,7,8,8a o(-octahidro— 1 £,2 £,4 a 5-tetrameti1-1-naftiImeti 1) -1,4-benzenodiol

2130 2’ ----C 80,32% ; H 9,81% ; 0 9,87% e seus 3,4-di-hidro derivados

-12L. Minale et al., Tetrahedron Letters 36, 3401-3404 (1974) e Muller et al., / Câncer Research 45, 4822-4826 (1985) descreve ali o composto 3,4-di-hidroava\_..^' rol e a 3,4-di-hidroavarona é sintetizada facilmente da forma seguinte:

Síntese de 3,4-di-hidroavarone a partir do 3,4-di-hidroavarol

Dissolveram-se 0,3 g de 3,4 di-hidroavarol em dez (10) ml de éter dietílico e adicionaram-se 0,25 g de óxido de prata. Após agitação durante duas (2) horas a mistura réacional foi filtrada e o filtrado suplementado com dois (2) g de sulfato de sódio. Após repouso durante a noite, eliminou-se o sulfato de sódio por meio de filtração. Por cristalização com n-hexano obteve-se o 3,4-di-hidroavarone sob a forma pura.

Prõ-fármacos ou precursores e sua preparação

Os compostos avarone e avarol e os seus derivados 3,4-di-hidro também podem ser utilizados ou incorporados em composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção e administrado sob a forma de compostos que convertem ou metabolizam em seguida após a introdução num animal vivo. Estes compostos são vulgarmente referidos actualmente por profármacos ou precursores, e exemplos representativos deles incluem os seus ésteres e derivados equilamínicos . Como já foi indicado, alguns destes compostos são conhecidos na técnica enquanto que outros são praparados de forma conhecida. Tais profarmacos e precursores representativos, assim como a sua preparação, são indicados nos exemplos que se seguem, que servem para explicitar a presente invenção, mas que não são construídos para a limitar.

Exemplo 1

Avarone e avarol kg de esponja fresca (contendo água) são esmagados numa starmix e extraídos com 250 ml de acetato de etilo. 0 extracto obtido deste modo é sêco sobre sulfato de magnésio e filtrado. 0 filtrado é concentrado até à secura. 0 resíduo obtido (cerca de 50 g) é retomado com 100 ml de benzeno e cromatografado numa coluna de gel de sílica (cerca de 200 g) com benzeno como eluente. 0 avarone aparece no eluato enquanto o avarol permanece na coluna. 0 avarol é eluído com uma mistura de benzeno e acetato de etilo ( 90:10 , v:v). 0 eluato é concentrado à secura e o avarol obtido deste modo sob a forma pura por meio de cristalização com diclorometano-acetona. 0 avarone é purificado por recristalização com benzeno. Obtiveram-se 0,7 g de avarone,

8,9 g de avarol; avarone-ponto de fusão : 62-64°C; avarol-ponto de fusão 148-150°C .

Exemplo 2

3’-eti lamino-avarone e 4-etilamino-avarone

a) adicionaram-se 2,5 g de cloridrato de etilamina e 5 ml de piridina a uma solução de 500 mg de avarone em 1000 ml de etanol a 50% e após 20 horas dèstilou-se o etanol sob o vácuo. 0 resíduo aquoso foi extraído com diclorometano e o extracto concentrado cromatografado sob uma coluna de gel de sílica (cerca de 30 g) com diclorometano como eluente. Deste modo foi possível separar o 3*-etilamino-avarone e 4'-etilamino-avarone; rendimento 480 mg e 420 mg respectivamente.

De um modo semelhante obteve-se:

b) 3’-propilamino-avarone e 4‘-propilamino-avarone

c) 3‘-isopropilamino e 4'-isopropilamino-avarone.

d) 3'-n-butilamino avarone e 4-n-butilamino-avarone

Exemplo 3

Diacetato de avarol

a) Dissolveram-se 500 mg de avarol em 20 ml de piridina absoluta e adicionou-se 1 g de cloreto de acetilo, em porções individuais à solução, sob agitação. A solução foi trabalhada da maneira habitual, concentrada até à secura e o resíduo extraído com heptano em ebulição. Após arre fecimento cristalizou o éter que se recristalizou com hexano . Ponto ae fusão: 62-64°C, rendimento cerca de 430 mg.

De um modo semelhante obteve-se:

b) dipropionato de avarol

c) divalerianato de avarol

d) ditrimetilacetato de avarol

Exemplo 4

Dicapronato de Avarol

a) Dissolveram-se 300 mg de avarol em 25 ml de piridina absoluta e adicionaram-se 0,6 g de anidrido caproico em porções separadas à solução enquanto se agitava. Trabalhou-se a solução da maneira habitual, concentrou-se à secura, e extraíu-se o resíduo com heptano em ebulição.

Recristalizou-se com acetona e em seguida com hexano.

Rendimento : 210 mg

-14De um modo idêntico ao descrito obteve-se:

b) diisovalerianato de avarol

c) dietilmetilacetato de avarol

d) succinato de avarol

Exemplos de composições farmacêuticas

Nos exemplos de composições que se seguem, pode-se utilizar como ingrediente activo em cada caso um dos compostos utilizados de acordo com a presente invenção isoladamente ou em mistura com outros compostos.

Exemplo a

Composição para comprimidos

Substância activa *	10	mg
Lactose	18	mg
Amido de batata	38	mg
Gelatina	2	mg
Talco	2	mg
Estearato de magnésio	0,1	mg

* por exemplo avarone, avarol 3,4-di-hidro-avarone, 3,4-di-hidro-avarol, ou profarmacos ou precursores.

Exemplo b

Composição para comprimidos

Substância activa *

Amido de milho

Polivinilpirrolidona mg mg mg

Os comprimidos são revestidos com uma camada de açúcar corado.

Exemplo c

Composição para cápsulas

Substância activa *	10	mg
Amido de milho	90	mg
Lactose	50	mg
Talco	2	mg

Esta mistura é introduzida em cápsulas de gelatina.

Exemplo d
Substância activa * Sorbitol Agua estéril até	Solução injectável 12 mg 40 mg 1 ml
Exemplo e
Substância activa	Composição líquida oral 2 g
Sacarose	250 g
Glicose	300 g
d-Sorbitol	150 g
Agar-Agar	0,15 g
Metilparabeno	0,5 g
Propilparabeno	0,05 g
Substância aromatizante	10 g
(aroma de laranja)
Amarelo de tartazina	-
Agua purificada até	1000 ml
Exemplo f	Composição líquida oral
Substância activa	2 g
Tragacanta	7 g
Glicerina	50 g
Sacarose	400 g
Metilparabeno	0,5 g
Propilparabeno	0,05 g
Substância aromatizante
(aroma de groselha)	10 g
Corante vermelho N9 2C.E. 184	0,02 g
Agua purificada até	1000 ml
Exemplo g	Composição líquida oral
Substância activa	2,4 g
Sacarose	400 g
Tintura de casca de laranja amarga	20 g
Tintura de casca de laranja doce	15 g
Agua purificada até	1000 ml

-16/ c As secções seguintes evidenciam respectivamente que o avarol e o f ' avrone são eficazes em associação com outros compostos ou princí pios activos; que a sua utilização não tem efeitos adversos sobre a resposta de imunidade de um paciente tratado por esse meio e que, um regime de tratamento vantajoso pode ser designado devi do à sua extensa semi-vida.

Aplicação de avaro1/avarone em associação com outros, compostos É também vantajosa a utilização de avarol e avarone em associação com outros compostos.

Exemplo

Estudos de associações foram realizados in vitro com avarol e avarone em conjunto com ditiocarbamato de di-etilo (DDC). 0 dietilditiocarbamato demonstrou,anteriormente, possuir actividade imunomodulante (Lang et al., Lancet 2’ 1066, 1985) em doentes por tadores de SIDA e que actua por inibição de superóxido dismutase (SODase), quer in vitro, quer in vivo (Heikkila et al.,J. Biol. Chem. 251? 2182-2185, 1976 e Heikkila et al., in Superóxido e Superóxido Dismutase, eds. A. M. Michelson, J. M. McCord e I. Eriedovich), Academic Press, Nova Iorque, pp. 367-373*

Métodos

Células de linfoma de ratos Ε5178Ϊ desenvolveram-se num tubo de cultura em meio essencial mínimo de Eagle, suplementado com soro de cavalo a 10 % (Muller et al., Câncer Res. 39? 1102-1107, 1979 e Muller et al., Câncer Res. 45, 4822-4826, 1985). Para as experiências de resposta de dose, iniciaram-se culturas com 5 ml, por meio de inoculação de 5000 células/ml e incubaram-se à temperatura de 37°C durante 72 horas; os controlos eram de gerações de 10,4 a

10,6 horas. 0 desenvolvimento celular foi determinado por contagens de células computorizada, por meio de um contador de células (con tador Channel-128;Cytocomp, sistema Michaelis: Biotron-Medizinelek tronik, Mainz; Alemanha Ocidental).

A DEj-q (+/- DS) foi avaliada por análise de regressão(L. Sachs, Angewandte Statistik, Sprlnger-Verlag, Berlim, 1984). A avaliação matemática dos índices de concentração inibidora fraccionada ( índices EIC ) de avarol/avarone-DDC associados, foi realizada de acordo cóm equações e condições experimentais publicadas ( Muller et al., Câncer Lett. 1 127 - 132, 1976 e , -17,·**

Phillips et al., Antimicrob. Agents Chemother. 9_: 736-740, 1976 )q imitado Js FIC>1 é interpretado como antagonístico; FIC=1 como efeito aditivo; FIC <1 é sugestivo de sinergismOj e FIC < 0,5 é considerado como sinergismo significativo.

Resultados:

Neste conjunto de experiências, incubaram-se células L5178Z com Avarol na ausência ou na presença de ditiocarbamato de dietilo inibidor de superóxido dismutase. Na ausência de DDC a DE50 para o avarol foi determinada no valor de 0,94 +/- 0,14 ^um, como previamente descrito (Muller et al., Câncer Res. 45: 4822-4826, 1985).

A coadição de ditio-carbamato de dietilo (DDC) em concentrações de 1,46 juM ou 1,71 juM às culturas, diminuíram significativamente a DE50 para concentrações de 0,27 +/- 0,04 juM e 0,108 +/- 0,015 jjM . As duas concentrações de DDC escolhidas originam uma inibição do desenvolvimento das células de 26% e 38% respectivamente na ausência de avarol.

Como mais uma prova do efeito aditivo do avarol/avarone em associação com DDC, foram determinados os índices FIC.

Foram escolhidos os rátios de concentração compreendidos entre 0,2 : 1 a

1,3 : 1,0 (âvarol/ávarone : DDC). Os índices FIC calculados variaram entre 0,82 e 1,04 indicando uma interseção aditiva entre avarol/avarone e DDC (Quadro).

Conclusão:

Estes estudos mostram que o avarol ou avarone podem ser administrados in vitro em associação com outros agentes terapêuticos resultando um efeito terapêutico benéfico.

Quadro índices da concentração iníbidora fraccional (índices FIC) para avarol/avarone-DDC associados sobre as células L5178y.

Escolheram-se condições de incubação padrão (5 ml e 72 horas).Os ratios de associação foram baseados em x yuM avarol/avarone para y jliM de DDC.

Associações de fármaco	Relação de concentrações	índices FIC
Avarol : DDC	0,3 : 1,0	0,87
	0,5 : 1,0	0,82
	1,3 : 1,0	0,90
Avarone : DDC	0,2 : 1,0	0,92
	0,4 : 1,0	1,04
	0,7 : 1,0	0,97

Influência do avarol nas respostas de imunidades escolhidas in vitro e ín vivo

Estudos in vitro: Estudos prévios revelaram que células de leucémia derivadas de células T são inibidas de um modo mais sensível pelo avarol do que linfócitos T ou linfócitos B normais (Miiller et al., Câncer Res. 45: 4822-4826: 1985 e Miiller et al., Eur. J. Câncer Clin. Oncol. 22:473-476; 1986). 0 desenvolvimento de células de Iinfoma é inibido em cerca de 50% em concentrações compreendidas entre 0,3 e 0,4 jug/ml (=0,9-1,1 juM) enquanto que a taxaZ*³H_7 em incorporação de dThd em linfócitos T normais é inibida cerca de 50% por valores compreendidos entre 0,5 - 1,3 jjg/ml e, em linfócitos-B normais, entre 1,6 - 1,9 jug/ml. Portanto os estudos in vitro seguintes foram realizados com 0,5-3 /ig/ml de avarol.

Estudos in vivo: De experiências anteriores com ratos NMRI portadores de células L5178f_: sabe-se que a dose quimioterapêutica de avarol está compreendida numa escala entre 1-50 mg/kg a uma dose letal de 50% de 269,1 mg/kg (Miiller et al., Câncer Res. 45: 4822-4826, 1985). A dose letal 50% (tratamento durante 5 dias) para ratos machos Sprague-Dawley foi determinada no valor de 235,7 mg/kg. Portanto, doses de avarone diárias de 1-30 mg/kg por injecção foram escolhidas para os estudos in vivo seguintes:

Fundamento: Considerando uma aplicação de avarol e avarone no tratamento de doentes com a sindrome de imunodeficiência adquirida (SIDA), e doentes de linfoma/leucémia de células-T adultas o efeito do avarol na resposta de imunidáde, foi estudado in vitro e in vivo . Os resultados demonstraram que o avarol não causa influência em doses anti-leucémicas in vivo , na hipersensibilidade tipo retardada (DTH) e na hipersensibilidade mediada por anti-corpos (AMH) mas exibe um efeito estimulante na produção de anti-corpos in vitro e in vivo .

-19Estas propriedades são muito vantajosas, especialmente para doentes de SIDA que mostram deficiências de células B e de células T (Ammann et al., J. ⁽

Amer. Med. Ass. 251: 1447-1449; 1984).

1. Produção de imunoglobulina (Ig) in vitro

Método

Linfócitos de sangue humano periférico (6 x 10⁵ células/ml)foram cultivados na presença de 0 a 2 yug/ml de mitogéne de erva do cancro (PWM, Sigma n^{* 2}9379) em meio essencial mínimo de Dulbeccos, suplementado com soro fetal de vitela a 20% durante seis (6) dias. Os resultados foram realizados com um volume final de 200 jul em placas microtituladoras (Dynatech; M129B) (Muller et al., Eur. J. Câncer Clin. Oncol. 22: 473-476, 1986). Adicionou-se avarol numa concentração compreendida entre 0 a 3 jug/ml, no tempo 0 (zero) ou 3 dias após o início da cultura. Foram recolhidos os sobrenadantes e doseados para se avaliar o conteúdo em imunoglobulina humana.

As culturas sobrenadantes foram doseadas pelo ensaio da imunoabsorção ligada ao enzima (Houtman et al., Clin. Exp. Immunol. 62: 696-704; 1985) utilizando-se IgG anti-humana (Dakopatts, Hamburg; P214) e IgM anti-humana (Dakopatts. P215). Estes anti-corpos foram conjugados com peroxidase. A actividãue ligada ao enzima foi medida utilizando-se o ácido 2,2'-azino-bis (3 - etilbenzotiazolinosulfónico) (Sigma η^θ A-1888) como substracto.

Resultados: Sob as condições do ensaio utilizadas, linfócitos de sangue humano periférico (não separados) produziram 1,3 jjg/ml de imunoglobulina G e 8,9 jug/ml de imunoglobulina M, durante uma cultura de seis dias. (Quadro 1). A produção foi reforçada após a adição de PWM para 4,1 yjg/ml de IgG e 12,3 jug/ml de IgM . Utilizou-se uma concentração de PWM apenas de yjg/ml, previamente avaliada como sendo subóptima com a finalidade de se detectar mais sensivelmente uma possível produção de imunoglobulina após o tratamento com avarol. Os resultados revelaram um aumento significativo de ambas as imunoglobulinas G e M nas culturas tratadas com 0,3 ou 1 jug/ml de avarol, respectivamente na presença de PWM (Quadro 1) e durante o período da presença do avarol de 0 a 6 dias ou de 3 a 6 dias. A produção de imunoglobulina fez-se em valores normais com concentrações de avarol mais elevadas.

2. Produção de imunoglobulina (Ig) ín vivo

Relativamente às consequências funcionais dos compostos sob células-B in vitro, verificou-se (previamente) que a secreção de imunoglobulina G e imunoglobulina M é estimulada em culturas de células de linfoses humanas (não separadas) que foram tratadas com concentrações não citcstáticas de avarol. Este dado é confirmado pelos resultados do teste da placa de Jerne. As experiências revelaram que suspensões de células simples, preparadas a partir de baços de murganhos, imunizadas com células vermelhas de sangue de carneiro (SRBC), que tinham sido pré-tratadas com doses terapêuticas de avarol, continham um número mais elevado de células em formação de placa, do que os baços de animais não tratados.

Método teste da placa de Jerne e Nordin (Science 140 : 405-406, 1963) foi utilizado com a modificação de Cunningham e Szenberg ( Immunolog. 14: 599-601 ; 1968) . Rapidamente 8 murganhos machos NMRI por grupo (20-22 g) foram imunizados no dia 0 (zero) por meio de injecção intra-peritoneal de

O x 10 SRBC em 0,5 ml de solução salina. 0 tratamento com avarol foi administrado quer por via intra-peritoneal a partir do dia 0 (zero) até ao dia 4 ou a partir do dia -4 até ao dia 0 . Uma hora após a última administração do fármaco, os animais foram sacrificados e sangrados, retiraram-se os baços e uma suspensão de células simples foi preparada por meio de passagem dos baços reunidos através de um peneiro de 120 jum. Após a lise dos eritrócitos com NH^Cl (cloreto de amónio) 0,15 molar, as células foram lavadas duas vezes com solução salina balanceada de Hank contendo 29 ml de carbonato de hidrogénio e sódio (NeHCO^) a 7,5% e 10 ml de solução tampão de Hepes 1 molar para um litro. Fez-se de novo a suspensão das células em 2ml por cada baço. Seis câmaras de Cunningham por grupo foram cheias com uma mistura de 0,5 ml de uma diluição apropriada de células de baço (geralmente 1:100), 0,5 ml de uma suspensão de SRBC (10 / ml) e 125 jul de complemento de cobaia normal. Após um período de 90 a 120 minutos de incubação a 37°C, contaram-se o número de placas. Calcularam-se as placas £

por baço ou por 10 células de baço.

-21/ •ν..... ;

Ο sangue reunido de oito dos murganhos foi centrifugado para se obter um 7 * soro. Os títulos de imunoglobulina M e imunoglobulina G foram medidos por meio de um método de mercaptoetanol (Hudson, L. e Hay, F.C. Praticai Immunology, Blackwell Sei., Oxford; 1983).

Resultados

Por meio da aplicação do ensaio de Jerne modificado o número de células formando placa no baço de murganho, injectado com SRBC, foi determinado na ausência ou na presença do tratamento com avarol (Quadro 2). Os animais tratados com 30 mg/kg de avarol a partir do dia 0 (zero) até ao dia + 4, possuíam um número mais elevado de 28% de células formando placa-baço, e os animais tratados a partir do dia -4 até ao dia 0 (zero), um aumento de 21% .

I

3. Hipersensibilidade tipo retardada (DTH)

Método :

Reacção para as células vermelhas de sangue de carneiro (SRBC): Produziu-se DTH de acordo com o método de Lagranje et al., (J. Exp. Med. 139 : 528-542; 1974) e Liew (Eur. J. Immunol. 7, 714-718; 1977). Murganhos maO chos NMRI (20 a 23 g, 10 animais por grupo) foram imunizados com 10 SRBC/ /40 ul numa das almofadas do pé (dia 0) . Quatro dias mais tarde injecta^z g ram-se 10 SRBC/40 jul na almofada do outro pé. Após 24 horas mediu-se o tamanho da pata com um odi-test 00T de compasso calibrado (H.C. Kroeplin, Schliichtern, Germany). Administrou-se avarol diariamente por via intra-peritoneal (0,15%/p/v/ em metilcelulose)quer a partir do dia -2 até ao dia | +1, quer a partir do dia +2 até ao dia +4. A taxa de DTH foi expressa relativamente ao aumento da almofada da pata, determinado após 24 horas e referido em mm . Os grupos não tratados foram injectados via intra-peritoneal apenas com metilcelulose. Os grupos tratados foram comparados com os controlos, utilizando-se o teste-U de Wilcoxon et al., (Sachs, L. Angewandte Statistk, Springer-Verlag, Berlin, 1984).

Alergia de contacto à oxazolona :

A dermatite de combate alérgica proveniente da oxazolona foi produzida de acordo com o método de Asherson e Ptak (Immunol. 15 :405-416; 1968) assim, como de Bure e Degrand (Agents and Actions 2: 534; 1979). Murganhos machos NMRI (20 a 22 g; 10/grupo) foram sensibilizados com 100 jul de oxazolona a 2% em acetona no abdómen depois de barbeado (diaO ) .

-22Os anilais foram tratados com avarol via intra-peritoneal, diariamente a ~y „ partir dodia -1 até ao dia +2 ou a partir do dia +6 até ao dia + 8; o grupo oe controlo foi tratado com desoximetasona (Caseila-Hoechst) como padrão per os em dose diária de 30 mg/kg durante o mesmo período utilizado para o avarol. Sete dias após a sensibilização foi aplicada tópicamente 10 ^ul de uma solução a 3% de oxazolona (esta concentração foi préviamente determinada para se obter uma reprodutividade de resultados melhor do que a obtida com a concentração de 2%) no lado mais interno de uma orelha, enquanto que na outra recebia apenas acetona. Vinte e quatro horas mais tarde os animais foram sacrificados e foram perfuradas as orelhas para se retirarem duas peças de 8 mm de diâmetro de ambas. As diferenças de pêso foram registadas. Os grupos tratados foram comparados com controlos, utilizando-se o teste-U.

Resultados efeito do avarol nas células mediadas ou hipersensibilidade tipo retardada; a reacção nos murganhos foi determinada por duas vias· (i_) reacção para os glóbulos vermelhos de sangue de carneiro e (jj) reacção para a sensibilização pela oxazolona.

A hipersensibilidade tipo retardada (DTH) para células vermelhas do sangue de carneiro (SRBC): o avarol foi administrado em três doses diferentes e durante dois períodos diferentes como se descreveu na rúbrica Métodos. Administrado durante o período do dia -2 para +1 (relativamente à última administração para SRBC), o avarol não causa influência imunossupressiva significativa na DTH para células vermelhas do sangue do carneiro, em ratos NMRI depois de duas doses diárias de 30 mg/kg. Concudo,quando administrado no dia +2 até ao dia +4 após a imunização a administração de avarol em doses mais elevadas do que 10 mg/kg resulta um efeito imunossupressivo fraco mas significativo.

Alergia de contacto à oxazolona: numa segunda via, os murganhos foram sensibilizados tópicamente com oxazolona e provocados ainda após 7 dias com o mesmo agente irritante. 0 avarol ou desoximetasona (igual a controlo negativo) foi administrado a partir do dia -1 até ao dia +2, ou a partir do dia +6 até ao dia +8 relativamente ao dia de sensibilização, como se descreveu sob a riíbrica Métodos . A desoximetasona provocou uma influência imunossupressiva significativa na reacção de DTH (24 horas aumenta a espessura da orelha (em mg) se tratado a partir do dia -1

-23- ,.

f até ao dia +2 : 10,2 + 6,0, ou 10,9 + 6,1 com um tratamento a partir do dia +6 até ao dia +8 ; os controlos correspondentes são 22,3 + 5,6 e

18,5 + 3,7 respectivamente). Por outro lado o avarol numa dose compreendida entre 3 e 30 mg/kg quer a partir do dia -1 até ao dia +2 ou quer a partir do dia +6 até ao dia +8 não influênciou significativamente a DTH à oxazo.lona (P > 0,05).

4. Hipersensibilidade mediada por, anti-corpos (AMH)

Métodos :

Realizou-se a reacção de Arthus activa modificada como descrito por (Pitus et al., J. Immunol, Methods 45: 65-78; 1981). Imunizaram-se ratos machos Sprague-Dawley (8/grupo) com o peso de 120 g , por meio de injecção^a parte da cauda.de 0,5 ml de uma suspensão de 4,4 ml de vacina pertussis (Behringwerke, Marburg) em 65,6 ml de cloreto de sódio a 0,9% mais 0,7 g de ovalbumina (3 x cristalizada) em 100 ml de parafina líquida. Três semanas após a imunização injectou-se 0,1 ml de solução a 0,03% de ovalbumina numa pata traseira e mediu-se o volume da pata com um plessímetro de água (Rhema) imediatamente e também 4 horas mais tarde.Os animais foram tratados por via intra-peritoneal com abseg diáass-de 3&30 mg/kg de avarol (em 0,15% de metilcelulose p/v) de acordo com os seguintes esquemas : (i) dia -1 até +2, (ii) dia +18 até +21 ou (iii) duas vezes em 24 horas e 30 minutos depois estimulados (o dia 0 representa o dia da imunização). Os controlos receberam apenas metilcelulose. Os valores foram comparados com um grupo de controlo utilizando-se o teste-T de Student (L. Sachs. Angewandte Statistik, Springer-Verlag, Berlin ; 1984).

Resultados

Para se determinar a possível influência do avarol na AMH nos ratos, causada pela ovalbumina, utilizou-se uma reacção de Arthus modificada. Os resultados revelaram uma supressão não significativa de reacção de Arthus pelo avarol independentemente dos esquemas escolhidos seguintes; (i) dia _i até so día+2QjCi.^dia +18 para o dia +21, sendo o dia 0 dia da imunização ou (iii) se aplicado imediatamente antes do desafio com a ovalbumina. A supressão ligeira da reacção observada quando os ratos foram tratados com avarol ( 30 mg/kg ) 24 horas e 30 minutos antes do desafio, também se verificou não ser significativa (P > 0,05).

-24Resumo efeito do avarol no sistema linfoide foi estudado in vitro e in vivo. 0 avarol aumentou significativamente a produção da imunoglobulina G e imunoglobulina M pelas culturas das células linfoides humanas (não separadas) in vitro e ligeiramente o número de células formadas em placa in vivo no baço de murganhos. Além disso, um pré-tratamento dos murganhos com avarol resultou numa taxa de incorporação de [ HJ - dThd mais elevada nas culturas in vitro de linfócitos desprovidos de macrófagos e nas culturas in vitro contendo macrófagos. A influência estimuladora do avarol nas respostas de imunidade humorais não é acompanhada por uma alteração da reacção de hipersensibilidade ne^iada por anti-corpos, como se avaliou pela reacção de Arthus. Não se cetectou influência significativa do avarol no sistema imunológico celular in vivo (ratos ou murganhos) a partir dos estudos nas reacções de hipersensibilidade tipo retardada para células vermelhas de sangue de carneiro e para oxazolona. Os dados dos animais e in vitro indicam que o avarol reune propriedades úteis, por exemplo eficiência in vitro anti-HIV e aumento nas respostas de imunidade humoral.

Quadro 1 : Produção de imunoglobulina média em culturas de linfócitos de sangue humano periférico dependentes do efeito mitogénico de PWM e no avarol.

Concentração Imunoglobulina sintética Çug/ml)

em avarol ( Jig/ml ) ·	PWM	IgG tempo (dias)	IgM tempo (dias)
0 a 6	3 a 6	0 a 6	3 a 6
0	-	1,3 + 0,3	1,4 + 0,3	8,9 + 2,0	8,5 + 1,8
	+	4,1 + 0,7	4,0 + 0,8	12,3 + 2,6	11,7 + 2,2
0,3	-	2,1 + 0,5+	2,0 + 0,5+	14,7 + 3,4+	14,2 + 3,3+
	+	6,7 + 1,5+	7,9 + 1,9++	20,4 + 5,1+	24,7 + 5,6++
1,0	-	2,3 + 0,6+	2,2 + 0,5+	15,6 + 4,0+	15,9 + 4,2++
	+	7,0 + 1,6+	8,5 + 1,9++	23,5 + 5,5++	25,6 + 5,9++
3,0	-	1,2 + 0,3	1,3 + 0,3	8,1 + 1,8	8,4 + 1,9
	+	3,9 + 1,0	4,9 + 1,0	10,5 + 2,6	11,7 + 2,9

+ P < 0,01 ; ++ P < 0,005

-25/ ^ί

Quadro 2 : Efeito do avarol no número de células em placa no baço do mur- , ganho .

Avarol (mg/kg)	Esquema (dias)	Células de baço (x 107)	Células em p baço (x IO’5)	aca por 106 células	Título
igM	igG
0	de 0 a +4	11,3	3,13	2.782 *	256	4
	de -4 a 0	11,6	2,62	2.259 »	512	4
30	de 0 a +4	12,0	3,98	3.316	256	2
	de -4 a 0	14,4	3,18	2.202	512	4

Determinação da semi-vida do avarol marcado com tritium e da distribuição orgânica nos ratos.

Animais : Ratos Sprague-Dawley (machos)

Semi-vida : Injectou-se avarol (por via intra-venosa) em doses terapêuticas em ratos. As concentrações seguintes de avarol foram as escolhidas: 2 mg/kg, 10 mg/kg e 20 mg/kg.

Obteve-se o avarol marcado com tritiiA cor meio de conversaode avarol em di-hidro-avarol na presença de gás dê tritium.

Percentagem de radioactividade no sangue (100% é a quantidade marcada de radioactividade presente 10 minutos após a terminação da injecção intra-venosa)

-26Doses de Tempo de determinação (horas após a avarol terminação da injecção i.v.)

	1	6	12	24	48
2	mg/kg	95	91	73	41	23
10	mg/kg	96	88	72	43	26
20	mg/kg	92	83	75	39	21

Destas determinações torna-se evidente que a semi-vida do avarol nos ratos é de aproximadamente 22 horas.

Distribuição orgânica

A distribuição orgânica foi determinada pelo mesmo método utilizando-se o.avarol marcado com tritium. As determinações foram realizadas 24 horas após a terminação da aplicação intra-venosa.

-27-.

Orgão

Doses de avarol (mg/kg)

Concentração de avarol (microgramas de avarol por grama de tecido)

Sangue	2	4,3
	10	5,2
	20	5,8
Baço	2	1,7
	10	1,9
	20	2,2
Fígado	2	6,4
	10	6,9
	20	7,4
Rim	2	1,6
	10	2,2
	20	2,4
Coração	2	0,7
	10	0,9
	20	0,9
Testículos	2	0,48
	10	0,63
	20	0,67
Cérebro	2	0,45
	10	0,58
	20	0,64
Pele	2	0,4
	10	0,6
	20	0,6

Estas concentrações foram determinadas de acordo com a radioactividade. Além disso, a natureza química do produto radioactivo foi idêntificada por cromatografia líquida de alta resolução e verificou-se consistir em mais de 90% de avarol. Adicionalmente a actividade biológica do composto no sangue foi determinada após extração com acetato de etilo e avaliada in vitro num sistema de células L5178y (Míiller, W.E.G. et al., Comp. Biochem. Physiol. 80C, 47-52; 1985). Utilizando este sistema, a actividade biológica do composto presente no sangue foi determinada e convertida em gramas.

Quando se usou este método a concentração no sangue determinada foi apenas entre 5 a 15% mais baixa do que quando se determinou por meio de radioactividade.

Conclusão:

1) 0 avarol sofre apenas uma ligeira modificação para uma forma biológicamente inactiva (não mais do que 15%) após circulação no corpo durante 22 horas. ’

2) 0 avarol possui uma semi-vida longa (aproximadamente 22 horas) após administração intra-venosa de concentrações anti-tumon

3) 0 avarol penetra na barreira cerebral sanguínea.

Estas propriedades do avarol no corpo dos ratos apresentam-se grandemente favoráveis para uma aplicação in vivo do avarol no homem. Com base nestes dados deduz-se que para a aplicação terapêutica do avarol no homem, 1 a 2 injecções apenas são necessárias por dia para assegurar doses terapêuticas benéficas as quais estão compreendidas entre 0,3 e 5 microgramas/ml de sangue.

Fundamento: Estimulação da produção de eama^interferon

Gamma-Interferon é um mediador da imunidade dos linfócitos-T e é provávelmente a célula chave de onde deriva a linfoquina que induz os macrófagos e outros hospedeiros potenciais de células de defesa para exercerem uma actividade anti-microbiana reforçada contra agentes patogénicos intracelulares e extra-celulares.

Aceita-se que doentes com Sida ou com o complexo relacionado com a Sida, mostram uma produção de gama-interferon reduzida (H.W. Murray et al., The New England dournal of Medicine 313; 1504-1510, 1985). A razão molécular para esta manisfestação é uma redução profunda, da secreção de interleuquina-2 induzida por antigenes ( H.W. Murray; J. Clin.Invest.76: 1959-1964; 1985).Sob condições normais in vivo, o gama-interferon é produzido pelos linfócitos-T, que são estimulados por interleuquina-2. Os antigenes provenientes de vírus tais como da vacina ou do herpes simplex podem iniciar a secreção de. gama -interferon nos leucócitos de seres humanos imunizados.

-29*

Portanto é vantajoso que um agente quimioterápicc de leuconis/liaforas de células T autiadulto ou anti-Sida seja fornecido com a possibilidade de induzir gama-interferon em linfócitos-T. 0 avarol é um composto tal que associa a actividade anti-linfoma/leucémia de células-T no adulto e anti-Sida com a capacidade para induzir a produção de gama-interferon. As experiências foram realizadas in vitro utilizando-se linfócitos humanos periféricos (células- de revestimento cor de couro)em cultura.

Material e métodos

Células efectoras : Linfócitos periféricos foram preparados por meio de centrifugação em gradiente Plaque-Ficoll e lavados duas vezes. Em seguida as células foram divididas e ajustadas numa concentração de 5 x 10θ células/ml.

Medição de interferon: Os níveis de interferon foram definidos por imunoenzimoensaio (EIA). Gama-interferon : placas de fundo plano de 96 cavidades (Greiner Nuertingen) foram revestidas com um anti-corpo monoclonal reconhecia P^or gama-interferon. Adicionaram-se 200 yul de amostra do sobrenadante para cada cavidade, conjuntamente com peroxidase ligada a gama-interferon (50 yul), que consistiã no mesmo anti-corpo utilizado para o revestimento. Após 24 horas de incubação, as placas foram lavadas com solução de tampão salina que continha 0,5% p/v de tween 20 detergente.

A reacção enzimática foi completada por uma preparação que continha substrato de peróxido de hidrogénio. A reacção foi detida após 15 minutos por meio de 100 jil de ácido sulfúrico por cada cavidade. A quantidade de interferon foi definida por comparação da extinção da amostra em ensaio ccmurtis curva pdrão produzida por valores conhecidos da gama-interferon.

Interferon . 0 gama-interferon foi fornecido por Hoffmann La Roche, Grenzach, Germany.

Resultados : Células revestidas foram incubadas com concentrações diferentes de avarol, durante 0 a 96 horas.

-30Os resultados estão resumidos em seguida :

Concentração de avarol (jug/ml)

Título de Interferon-gama produzido por linfócitos (Unidades/ml de Sobrenadantes)

Período de incubação (horas)

	0	24	48	72	96
0	2	5	3	7	4
0,2	4	17	24	26	21
0,5	4	23	74	89	118
1,0	3	20	52	62	73

(Os resultados são as médias de quatro experiências paralelas;

os desvios padrão são inferiores a 10%) .

A partir destes dados é evidente que o avarol induz de forma significativa e pronunciada o gama-interferon in vitro numa dose óptima de 0,5 jug/ml.

Conclusão avarol possui um efeito terapêutico benéfico adicional: Os estudos apresentados aqui in vitro mostram que o avarol induz à produção de gama-interferon in vitro e sugerem que ele actua também in vivo do mesmo modo nos doentes com linfoma/leucémia de células-T adultas.

Em conclusão, do exposto, é evidente que a presente invenção proporciona um novo método para o tratamento e controlo de um linfoma/leucémia de células-T no adulto, utilizípâo-se avarone ou avarol e seus derivados e/ou precurssores e/ou seus profármacos, e composições farmacêuticas que abrangem estes ingredientes activos para as utilizações referidas, possuindo todos as vantagens' e características enumeradas anteriormente.

_λ -³¹' / Λ

Compreende-se que a presente invenção não é limitada aos detalhes exactos de operação, ou às preparações exactas, métodos, processos, ou aspectos mostrados e descritos, como modificações óbvias ou equivalentes que serão aparentes aos técnicos nesta matéria, e a presente invenção é, portanto, apenas limitada pelo âmbito total que pode ser legalmente de acordo com as reivindicações apensas.

Claims (4)

1.- Método de tratamento de células T de leucemia/linfoma no adulto, caracterizado pelo facto de se administrar a um paciente necessitado desse tratamento uma quantidade efectiva compreendida entre 1 e 1000 mg por dia, de preferência entre 10 e 500 mg e com vantagem entre 50 e 500 mg, de um composto escolhido entre avarol, avarone, um seu derivado 3,4-dihidro ou um prõ-fãrmaco dos compostos anteriores, como ingrediente activo, sob a forma de uma composição farmacêutica preparada mediante mistura do ingrediente activo com 99,5 a 2% de um excipiente ou adjuvante aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

2.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como ingrediente activo o composto avarone ou um seu derivado, eventualmente o

3,4-dihidro, de fórmula geral na qual e R₂ representam, cada um, independentemente, um ãtomo de hidrogénio ou um grupo alquil (C^-C^) amino;

ou o composto avarol ou um seu derivado, eventualmente o 3,4-dihidro, de fórmula geral na qual

R^ e R₂ têm os significados definidos antes na fórmula geral Ia; e

R^ representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^-C^, acilo C₂~Cg, éter ou éster facilmente hidrolisãvel sob o ponto de vista fisiológico ou os dois símbolos

Rg representam, considerados em conjunto, um grupo dia-34- cilo C.-C_c

4 6 ou um sal aceitável sob o ponto de vista fisiológico ou uma mistura dos compostos citados antes,