PT79896B

PT79896B - Monoclonal antibody

Info

Publication number: PT79896B
Application number: PT79896A
Authority: PT
Original assignee: Smithkline Beckman Corp
Priority date: 1984-01-30
Filing date: 1985-01-29
Publication date: 1987-02-03
Also published as: PT79896A; ES539920A0; GR850234B; US4701408A; DK37785D0; AU581870B2; ZA85681B; JPS60190798A; ES8606662A1; EP0151561A2; AU3812485A; IE850207L; DK37785A; EP0151561A3

Description

DESCRIÇÃO DQ INVENTO

Esta invenção diz- respeito ao campo de imunologia e, mais especificamente, à preparação e uso de um anticorpo monoclonal e macrófagos activados.

Macrófagos são células efectoras importantes no reconhecimento e destruição de células neoplásticas e de microorganismos invasores. E conhecido muito pouco acerca dos acontecimentos celulares e bioquímicos envolvidos na acção macrofágica. Acredita-se que a activação envolve uma sequência complexa de mudanças fenotípicas que são adquiridas por etapas, resultando no desenvolvimento de actividade microbicida seguida do que pare ce ser a última etapa de activação, expressão de capacidade tumoricida. Veja-se por exemplo, Hibbs e col., Science 197:279-282 (1977)í Meltzer, Lymphokines 3:319-343 (l98l)j e Ruco e col., 3. Itnmunol. 121:2035-2042 (1978). Acredita-se ser o mecanismo primário de activação natural dos macrófagos, através da acção da linfoçpdna, Factor Activador do Macrofago (MAF), segregado por linfócitos estimulados por antigénios. Muitos agentes de origem biológica diversa e de estrutura química não relacionada, incluindo o Corynebacterium parvum, endotoxina, diptetido muramil e mediadõr.íes) solúvel(eis) (linfoquinas) libertados do antigênio ou dos linfócitos estimulados pelo azoto, têm sido usados sozinhos e em combinação para tornar os macrófagos tumoricidas em in vitro e em in vivo. Veja-se por exemplo Fidler em Fundamental Mechanisms in Human Câncer Immunology, edição Saunder e col., (Elsevier/North Holland, ftmsterdam), pp. 425-438 (1981); Schultz, Adv. Pharm. Chemotherapy 17:157-192 (1980); e Chirigos e col., Modulation of Cellular Immunity in Câncer by Immune Modifiers (Raven Press, Nem York) ρ. 1 (1981). Se bem que a activação ocorra por um mecanismo normal e se os macrófagos activados por agentes diferentes expressam qualitativamente e quantitativamente marcadores fenotípicos semelhantes, tais como o aparecimento ou desaparecimento de antigénios de superfície das células que ainda não foram determinados. A identificação de marcadores imunológicos cuja expressão acompanha o fenotipo activado, será de considerável valor para o estu

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do dos mecanismos de activação, para padronizar as relaçSes dose-resposta entre preparaçães diferentes do mesmo activador e/ /ou activadores diferentes e também para separação em grande ess cala dos novos egentes activadores de macrofagos· E também de valor potencial no diagnóstico de estados de doença e na distri buição de drogas específicas a alvos.

0 uso de anticorpos monoclonais para macrofagos tem sido dirigido através da identificação de antigénios de superfície de células, cuja presença (ou ausência) se correlaciona de perto com um estádio específico na diferenciação no monócito ma crofágico. Por exemplo, Ho e col.» J. Immunol. 128:1221-1228 (1902), caracterizou um antigênio fagócito mononuclear chamado Mac-2, cuja expressão ê provocada somente por um estímulo infla matério forte. Ezekou/itz e col,, 3. Exp. Med. 154:60-76 (1981) relatou que a expressão de um antigênio macrofágico reconhecido por outro anticorpo monoclonal, F4/80 é diminuída significativa mente em macrofagos activados.

Taniyama e col., 3. Exp, Hed. 156:1286-1291 (1982), e Taniyama e col,, 3, Immunol. 151:1032-1037 (1983), relataram a produção de um anticorpo monoclonal AcM. 1, específico para o pirano activado ou macrofago activados por Corynebacterium parvuro mas não extraídos por $ioglicolatos ou protease macrofagica extraída por peptonas. A reactividade do AcM. 1 contra os macrofagos activados pelo MAF não foi relatada.

Kaplan e col., 3. Immunol. 120:2080 (1978) refere um anticorpo policlonal específico para macrofagos activados.

Oldham, 3. Matl, Câncer Inst. 70:789-796 (1983) discute o uso de modificadores ds resposta biológica, isto é, agentes que estimulam ou mesmo regulam uma resposta biológica normal no tratamento de neoplasia, e específica para tais modificadores.

Os anticorpos monoclonais foram pela primeira vez referidos por Kohler e Milstein, Nature, 256:495-497 (1975). Desde então os anticorpos monoclonais têm sido objecto de pesquisa in tensiva. 0 interesse em anticorpos monoclonais provêm da sua capacidade para se ligarem a antigénios característicos, tornan do-os úteis, por ex: no diagnóstico de estados de doença e na

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-4distribuição de agentes farmacêuticos para células alvo específicas.

Um aspecto da invenção ê um anticorpo monoclonal da classe IgG produzido por um hibridoma formado pela fusão de células de uma linha de células de mieloma e células do baço previamente imunizadas contra macrofagos activados pelo MAE, sendo, o anticorpo preferencialmente reactivo com macrofagos activados.

Outro aspecto da invenção ê a linha de células do hibri doma que segrega o anticorpo monoclonal da invenção.

Outro aspecto da invenção ê um processo de produção do anticorpo que engloba a cultura in vivo ou in vitro, o hibridoma e recuperação do anticorpo do líquido ascítico ou sobrenadar) te de células, respectivamente.

Outro aspecto da invenção ê um processo de detecção de uma solução ou mistura, quanto à actividade macrofágica activadora, compreendendo o tratamento de uma cultura macrofágica com a solução ou mistura, por um período de tempo, ou em condiçães suficientes, que permitam que a activação ocorra, contactando o anticorpo monoclonal da invenção com células tratadas por um p,e ríodo e sob condiçães suficientes, que permitam a ligação do ar> ticorpo às células activadas aumentando as ligaçães do anticorpo às células.

0 anticorpo monoclonal de acordo com a invenção ê prepa rado por cultura, em cultura de tecidos (in vitro) ou em ascites (in vivo), formando .mv hibridoma por fusão de células de mieloma e células do baço de um mamífero previamente imunizado contra macrofagos activados pelo MAF. Um macrofago activado usado nesta invenção é o que manifesta actividq_jie microbicida e tumoricida.

Dado a manifestação instantânea de um hibridoma que segrega um anticorpo, específico para um antigênio de superfície de célula que é altamente expresso em macrofagos activados, tais hibridomas podem ser preparados por técnicas bem conhecidas Veja-se por exemplo, Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975). Na exemplificação desta invenção, um hibridoma murino-

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-murino manifesta-se segregando um anticorpo que apareceu como resposta a um macrofago de rato activado. Contudo fusões intra -específicas e outras inter-específicas podem ser usadas. Exem pios de linhas de células de mieloma úteis em preparação de hibridomas são SP2/0-Agl4, X63-Ag8, NSl-Ag4/l, MPC11-45.6TG1.7, X63-Ag8.653, FO e S194/5XX0.BU...1,todos de origem no ratoj 210. .RCY3.Agl.2.3 de origem na ratazana; e U-226AR^ e GM1500GTGAL₂, ambos de origem humana. Veia-se Res. Mono. Immunol. 3« “Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas”, 1981, ed. por Hammerling e col., Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam, pag. 563, Células do baço podem ser obtidas de qualquer espécie de mamífero. De modo semelhante, os macrofagos usados para estimu lar a produção de anticorpos não precisam de ser derivados de um rato. Podem ser tirados de qualquer mamífero incluindo o humano. De crítica importância contudo é o facto das células do baço serem imunizadas contra macrofagos activados pelo MAF, antes da fusão para preparar o hibridoma, .

‘Hibridomas preparados por fusão de uma linha de células de um mieloma com células do baço imunizadas contra macrofagos activados pelo MAF, podem ser separados para secreção de anticor pos activados específicos de macrofagos por comparação da sua actividade com macrofagos activados com a sua reactividade a ma crofagos inactivados. Gs hibridomas tendo a propriedade deseja, da são cultivados in vitro em cultura de tecidos ou in vivo, por exemplo, em ascites.

Uma preparação de linfoquinas contendo o Factor Activador de Macrofagos (MAF) pode ser preparada por técnicas conheci das. Por exemplo o MAF pode ser obtido a partir de linfécitos tal como foi descrito por Fidler e col., 3. Immunol. 117:666-673 (1976) ou a partir de uma linha de células de linfoblastoi des, tal como foi descrito por McEntire e col., Patente U.S.A.

MS. 4 405 601.

A incorporação esclarecedora do hibridoma da invenção descrita especificamente aqui, foi preparada por fusão de uma linha de células de um mieloma de rato com células do baço de ratazana. Mais especificamente, foi preparado por fusão de células do mieloma do rato SP2/0-Agl4 e células do baço de rataza

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nas previamente imunizadas contra o Factor Activador de Macrofa gos (MAF)-macrofagos do peritoneu do rato activado, como é descrito no exemplo 1 abaixo. 0 hibridoma designado 158.2, segrega o anticorpo monoclonal MA158.2. Foi depositado no ATCC (Colecção de Culturas Tipo Americanas), Rockville, Maryland, U.S.A., sob o número de aquisição HB-8466 de acordo com os termos do Tratado de Budapeste. SP2/0-Agl4 ê um mieloma do rato não segregador que é resistente ao 8-azaguanina (20 g/ml) e não sobre viva no meio contento HAT. Tem sido usado na preparação de vários anticorpos monoclonais produzindo hibridomas. Veja-se por exemplo, ,3. Immunol. 126:517-521 (1981).

0 Mal58.2 é da subclasse IgG2a. Contêm uma cadeia pesa da e uma cadeia leve. Mão absorve para a proteína de Staphylococcus aureus (Cou/an l). A expressão dstectável do antigénio reactivo ao MA158.2, é sensível à cicloheximida, mas ê impassível pelo tratamento das células com protease, neuraminidase e tunicamicina.

0 MA158.2 reage, em extensão variável com macrofagos (células do exudado peritoneal) obtidos com tioglicolatos, peptona de protease, Conconavalina A, Corynebacterium parvum e lipopolissacarído de membrana bacterial (LPS). Contudo a reactividade do MA158.2 com macrofagos extraídos com tioglicolatos, peptonas de protease, Conconavalina A e LPS, é significativame_n te aumentada por um pré-tratamento dos macrofagos de 24 horas com MAF. Os macrofagos extraídos com £. parvum falharam em ma nifestar o aumento de expressão do antigénio MA158.2, seguindo tratamento semelhante*

A citometria de fluxo foi usada para confirmar que a ex pressão do antigénio aumentada, Observada em células tratadas com MAF, foi atribuída a um aumento uniforme na expressão ,do aji tigênio, em vez da presença de uma sub-população de macrofagos altamente reactivos. Células em suspensão foram marcadas com isotiocinato fluorescente conjugada da cabra F(ab’)2 ^e anti-ratazana Fab (Cappel Laboratories, Cochranville, Pennsylvania, U.S.A.) e analizado num EPICS V sorteador de células (Coulter Electronics Inc., Hialeah, Florida, U.S.A») usando janelas apre

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-7priadas espalhadas como porta de salda de d-êsperdícios celulares e agregados de células e usando propidium como porta ds sajl da para células mortas. Houve aumento significativo (aproximadaments 4 vezes mais) na fluocescência de célula média do obtido com tioglicolato, macrofagos MAF-activados quando comparado com macrofagos extraídos com tioglicolato tratados com uma preparação control de linfoquina.

0 MA158.2 ê uma série de anticorpos monoclonais, caracterizados na literatura publicada, como tendo especificidade a determinantes encontrados em células mononucleares, que foram examinados por uma técnica de ligação radioimune indirecta (IBA), pelo seu padrão de reactividade contra macrofagos extraídos com tioglicolato e macrofagos aotivados pelo MAF, como é descrito no Exemplo Id, abaixo. Os resultados dessas experiências são descritas no Quadro 1, que se segue. 0 FCab’^ de cabra anti-ratazana Fab é designado GAR J macrofagos extraídos com tiogli colato -são designados TPM; macrofagos aotivados pelo MAF são designados AcM.

Quadro 1. Reactividade dos vários anticorpos monoclonais anti-macrofagos com macrofagos peritoneais obtidos e aotivados pelo MAF

i ¹²⁵1-GAR ligação

(cpm x 10“2)

Hibridoma Referência Designação Classe Ig TPM AcM

158.2		MA158.2	XgG2a	20	4*	2	74		2
M1/7QHL	(D	MACil	IgG2b	70	£	2	60	±	1
M3/38	(2)	MAC: 2	IgG2a	72	±	2	75		2
M3/84	(3)	MAC: 3	IgGl	20	JL	1	20		1
F4/80	(4)	(F4/8Q)	IgG2b	56	£	2	36	+.	2
2.4G2	(5)	Fc receptor	IgGl	46	£	2	40	+	2
Ml/42	(6)	H-2K	IgG2a	43		2	33		1
M1/69HL	(6)	Antigénio ea tável ao calor	IgG2b	49		2	43	_+	2
Ml/114	(7)	la	IgG2b	67		1	65	+.	3
M5/49	(θ)	Thy-1	IgG2a	6	+	1	3	+	1

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(1) Springer etal. , Eur. 3« Iromunol. 9301-306 (1979).

(2) Ho et al., 0, Iromunol. 128:1221-1228 (1982).

(3) Ho et al., 3. Biol, Cheia. 258:636-642 (1983).

(4) Ezekowitz et al., 3, Exp, Med. 154:60-76 (l98l).

(5) Unkeless, 3. Exp. Med. 150:580-596 (1979).

(ó) Springer et al. (1980) em "Monoclonal Antibodies”, ed. por

Kennett et al., Plenum Press, New York, pp. 185-217.

(7) Bhattacharya et al., 3. Immunol» 127:2488-2495 (1981).

(8) Davignon et al·, 3, Immunol. 127:590-595 (1981).

A expressão do antigénio reactivo MA158.2, foi aumentado três vezes mais, seguindo a activação in vitro dos macrofagos extraídos com tioglicolato com MAF, enquanto nenhum outro anticorpo monoclonal Bxaminado, manifestou qualquer aumento significativo na ligação concomitante com a activação. Em contraste com ο MA158.2, o anticorpo monoclonal F4/8Q manifestou ligação decrescente ac® macrofagos activados de acordo com resultados previamente publicados.

Vários relatórios descreveram que os macrofagos possuem receptores Fc sensíveis à tripsina para a subclasse IgG2a. Para excluir a possibilidade de que as ligações aumentadas do MA 158.2 ô devida a ligações não específicas a estes receptores Fc, macrofagos activados foram tratados com tripsina (l mg/ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco) por 30 minutos a 37SC antes do ensaio do ISA. 0 tratamento com tripsina não teve efeito no MA158»2 ligado aos macrofagos activados (resultados não apresentados). Uma falta de ligação do MA158.2 aos neutrófilos de rato ou aos macrofagos activados de ratazana, forneceram provas posteriores contra ligações não específicas aos receptores Fc (Quadro 2, abaixo). Além disso, anticorpos monoclonais ao Mac-2, H-2 monotópico e antigênios Thy-1, também do isótopo IgG2a de ratazana não manifesta ligações aumentadas aos macrofa gos activados pelo MAF (Quadro l).

Os sobrenadantes de cultura do hibridoma 158.2 e Ml/70, um hibridoma que segrega anticorpo monoclonal que liga ao receja tor iC3B no murino e nos gr.anulocitos humanos, foram usados para analisar a especificidade de cada anticorpo através de várias

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-9células linfoídes como s3o detectadas pelo IBA. Diluições usadas dos sobrenadantes do hibridoma tiveram em excesso o anticorpo, como previamente determinado, empregando macrofagos obtidos com tioglicolato activados eom MAF, como alvos. A especificidade das ligações do MA158.2, foram restritas a células de murino da série fagócita mononuclear. Veja-se, Quadro 2y abaixo, no qual % M significa a percentagem de células totais determinadas como sendo macrofagos? RPM significa macrofagos peritoneais; M significa macrofagos? TPM e AcM são definidos como no Quadro 1, acima. Isto foi confirmado em várias experiências nas quais p_o pulações de células replicadas, pré-tratadas com MAF, foram ana lizadas para a expressão do antigênio MA158.2 por imuno-fluores, cência (resultados não mostrados). A 13 de nylon purificou células T do baço, leucócitos do sangue e suspensões de células de nodo linfático e do timo falharam a ligação ao MA158.2 (resulta dos não apresentados).

Quadro 2. Expressão do antigênio reactivo MA158.2 nas células primárias

Células de rato	% MI	¹²⁵1-GAR ligado (cpm x 10“²)
MA158.2	Ml/70 HL
RPM	80-90	6+2	73+3
TPM	95-98	20+2	67+3
AcM	95-98	78+3	70+2
AcM (rato)	95-98	3+1	N.D.§
MI alveolar	95-98	10+1	30+3
MI do baço	60-70	9+1	N.D.
Meutrófilc	5-20	3+1	48+2

Uma lista de linhas de células estabelecidas no murino de origem biológica diversa, incluindo as linhas de células monocíticas WEH1-231, P388D^, RAW-264 e 3774.1, todos falharam li gar-se ao MA158.2. A falta de reactividade do MA158.2 com as linhas de células monocíticas pode reflectir a natureza transformada destas células e/ou a sua antiguidade em cultura. Veja -se Quadro 3, abaixo.

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Quadro 3. Linhas de células de rato que não se ligaram ao
	MA158.2
			¹²⁵I-GAR ligado	x 1CT²
Linha de célula	Tipo de célula	MA158.2	Ml/70
X63-Ag8		Plasmacitoma	2	2
SP2/0-Agl4		Plasmacitoma	2	2
YAC		Linfoma	2	2
WEH1-231		Monocítico	3	4G
P388D₁		Monocítico	3	65
RAW-264		Monocítico	3	64
3774.1		Monocítico	3	92
B16		Melanoma	2	2

Q antigênio detectado pelo MA158.2 não foi tipificado

ou especificado no sexo e foi encontrado no extracto; âò- tiogljL d

colato, macrofagos activados pelo MAF do rato transportando H-2 , K

H-2 e H-2 tipos haploides, respectivamente. Veja-se Quadro 4, abaixo, no qual o TPM e AcM são definidos como no quadro 1 acima.

Quadro 4. Especificidade do sexo e da estirpe do MA158.2

Estirpe do rato	Tipo haploide	Sexo	¹²⁵I-GAR ligado (cpm * 1G“²)
TPM	AcM
C57BL/6	H-2^b	ά»	20+1	79+3
		g	19^2	78+1
		+	M
OBA/2	H-2^d		19+2	72+2
		§	19+1	75+3
BALB/c	H-2^d		20+1	74+1
		S	20+2	75+1
C3H/HeN	H-2^k		17+1	71+3
		o	16+2	62+1
		4

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-110 anticorpo monoclonal da invenção pode ser usado na ser paração de modificadores com resposta biológica, tendo activida de activadora de macrofagos, tais como produtos naturais ou com postos sintéticos. Tais agentes têm utilidade potencial em tsrapia de neoplasia assim como na infecção microbiana. Numa ima gem típica, uma população de controlo de macrofagos é activada com MAF como ô descrito nos Exemplos que se seguem. Umasegunda população é tratada de um modo semelhante com uma solução ou uma mistura, tal como um caldo de fermentação, que tem estado a ser testado. A activação das duas populaçães é então ensaiada, tal como num ensaio (IBA) de ligação radioiraune indirecta, que compreende o contacto da sub-população com um excesso de MA158.2 seguido pela lavagem e pelo contacto de população com um anticorpo marcado ao MA158.2, tal como um anticorpo anti-ratazana. Tal ISA é descrito nos Exemplos a seguir. Qualquer intensifica ção da reactividade pode ser indicativo da actividade do macrofago activador, ainda que os materiais manifestando actividade aproximadamente equivalente a, ou maior que, ao do MAF, que ê, pelo menos cerca de 3 vezesnum IBA, seria de interesse.

A utilidade do MA158.2 como instrumento para a distinção entre populaçães de macrofagos extraídas com diferentes agentes ê ilustrado pelos dados supracitados, mostrando que os macrofagos obtidos com diferentes agentes manifestam níveis quantitati vos diferentes da expressão do antigênio reactivo ao MA158.2 a.n tes e depois do tratamento com MAF. Apesar dos macrofagos obti dos com £. parvum não mostrarem aumento de ligações do MA158.2, seguindo tratamentos com MAF, estes macrofagos expressaram propriedades tumoricidas contra células do melanoma B16 na ausência do tratamento com MAF. Além disso, macrofagos activados pelo jÇ. parvum são significativamente mais pequenos que os macrofagos obtidos com tioglicolato, peptona de protease, Concanavalina A e LPS, que pode contribuir para o nível mais baixo da expressão do antigênio reactivo do MA158.2. A determinação da densidade epitope do antigênio reactivo do MA158.2 nos macrofagos obtidos com agentes diferentes, tem sido assim, sem sucesso, devido a uma perca de propriedades de ligação do MA158.2

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• -12- — ' seguindo iodinização. A luz da heterogeneidade bem documentadas características bioquímicas morfológicas, e, mais importante , funcional os macrofagos extraídos por agentes diversos podem ser visualizados como subpopulaçães de células distintas que são capazes de responder diferentemente a estímulos de activação.

Exemplos

Exemplo 1, Produção e caracterização do MA158.2

A. Factor activador de macrofagos. Uma preparação de linfoqui na contendo MAF foi obtida de células livres do sobrenadante de culturas de linfócitos de ratazana F344 normais incubadas durari te 48 horas com Concôna/alina A imobilizada (Pharmacia Fine Chemicals Piscataiuay, New Jersey, U.S.A.) substancialmente como foi descrito por Fidler e col., 3, Immunol. 117:666-673 (1976).

B. Macrofagos. Células exudadas do peritoneu (PEC) foram obti das de fêmeas de rato consanguíneas libertas de patogenes específicos C57BL/6, seguindo-se de injecção intraperitoneal de 2,0 ml de meio de tioglicolato de Breuier’s (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A.). Esta estirpe é disponível na Charles River Inc., Fbrfcage, Michigan, U.S.A. 0 tempo de extracção foi de 5 dias*

0 PEC foi colhido com lavagem de solução salina equilibrada de Hank, livre de iães de cálcio e magnésio, à temperatura ambiente (2Q-252C). As células da suspensão recolhidas foram centrifugadas a 250 x g suspensas a uma densidade de células de 2 x 10⁶ PEC/ml no meio Eagle modificado por Dulbecco (OMEM) e colocado em pratos de cultura com tecido de plástico. Para se obter uma população aderente enriquecida com macrofagos, PEC foi incubado durante 2 horas a 372C numa atmosfera de ar humidifica do a 5% C0:95%. As culturas foram passadas pela solução três

vezes com DMEM para remover células mono-aderentes e tratadas com uma solução de Factor Activador de Macrofagos em DMEM a uma solução final de 1:5. Mais de 95% de células aderentes mostraram ser macrofagos pela sua Oapà.cidáá^a^my^Cpariiculas de

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- Kffjyowl

. < 1¾¾¾¾^ :Η«£

-15carbono xte^XJa^zoMtassB e pala tensão positiva aesterases nãp especificas como descrito por Tucker s col·, 3« Immunol. Methods 14:267-269 (1977).

C. Anticorpos monoclonais

0 PEG extraído por tioglicolato substancialmente como foi descrito, fora posto em cultura por 2 horas a 10 células/ /100 mm de tecido do prato de cultura. As células não aderentes foram removidas por lavagem com DMEM. As camadas aderentes foram tratadas com uma diluição do MAF a 1:5. Seguindo o tratamento por 24 horas, os macrofagos activados pelo MAF, foram lavados três vezes com DMEM e colhidos com uma borracha de polícia. A viabilidade das células como é determinada pela exclu são de tinta azul ”trypan·’ foi de 40 a 60%.

A ratazana de Lemis (Charles River) fora preparada por 7

injecção intraperitoneal e subcutânea de 2 x 10 macrofagos activados no adjuvante de Freund completo (volume total de 1 ml por ratazana). Duas semanas mais tarde, elas foram inoculadas de um modo semelhante mas com adjuvante incompleto. Cinco injecçães posteriores ds um número semelhante de células foram administradas intravenosamente durante as 15 semanas seguintes,

Gs baços foram removidos três dias depois da inoculação final.

As células do baço foram fundidas com as células do mieloma do rato SP2/0-Agl4 (ATCC CRL-1581, Russel e col., fíiature 255:461-465 (1979) substancialmente por procedimento oorren te, que é, o procedimento descrito por Kohler and Milstein, fílature 256:495-497 (1975) usando glicol de polietileno para pro mover a fusão e HAT para seleccionar hibridomas.

Mais de 1500 sobrenadantes de clones de hibridoma foram examinados, por um ensaio de ligação radioimune indirecta (IBA) como ê descrito abaixo, para anticorpos que preferencialmente se ligaram a macrofagos activados, quando comparados à ligação por macrofagos extraídos com tioglicolato, tratados com prepara ç3es de linfoquina de controlo que foram destituídas de actividade MAF.

Tais preparaçães controlo foram obtidas de sobrenadantes livres de células de linfócitos de ratazana F544 normais, colhi63 404

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dos como foi descrito acima, mas de culturas de linfocitos não expostas à Conconavalina A.

Um hibridoma designado por 158.2, segregando o anticorpo MA158.2, cora a especificidade apropriada foi clonado duas ve zes pelo método de diluição limitante. As células foram desenvolvidas em cultura de tecido em DMEM com 10^ de soro fetal de bezerro, ou como ascites em (pristane-primed), ratos descobertos BALB/C irradiados sub-letalraente, (Pristane, 2,6,10,14-tetrametilo pentadecano foi adquirido de Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, U.S.A.).

D. IBA. A ligação do anticorpo monoclonal da ratazana e células foi detectado por F(ab*)₂ de cabra marcado com I, Fab an

ti ratazana. 0 anticorpo anti-ratazana de cabra, livre de rea£

tividade cruzada com imunoglobulina de rato, foi obtido de Cappel Laboratories, Cochranville, Pennsylvania, U.S.A. 0 traço 125

marcador com Na I foi realizado pelo Neui England Nuclear, Bos. ton, Massachusetts, U.S.A.

Exemplo 2. Correlação da ligação do MA158.2 com a aquisição da actividade fcumoricida

Culturas de macrofagos replicados foram examinados para correlacionar a cinética da expressão induzida pelo MAF do anti gênio reactivo ao MA158.2 com desenvolvimento de actividade tumoricida.

Citotoxicidade mediada pormacrofagos foi avaliada num ensaio de 72 h in vitro, empregando células alvo B16 de melanoma, marcadas por 18 Ir com 5-£· iodo-2‘-decxiuridina. Células sfectoras (macrofagos obtidos pelo tioglicolato) foram tratadas por 24 horas in vitro com uma diluição final (l:5) de MAF ou de sobrenadante dos linfócitos de controlo. Activação seguinte, culturas de macrofagos (10 /fonte) fpram lavadas duas vezes com DMEM contendo 10^ de soro fetal de vitelo (COMEM) e células alvo de melanoma B16 radiomarcadas (5 x 10 /fonte) foram adicionadas num volume final de 0,2 ml de COMEM. Setenta e duas horas depois da laminação, as culturas foram lavadas com COMEM para remover células não aderentes s as células remanes-

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-15centes foram lisadas com 0,1 ml da NaOH Q,2N. Células alvo ds melanoma B16 sem macrófagos, foram laminadas com um controlo pa ra determinar lihertaçBes espontâneas. Os lisados foram absorvi dos com mechas de algodão, colocados directamente nos tubos 15 x 72 mm, e a reactividade foi medida num contador gama.

A aquisição de capacidade tumoricida seguinte ao tratamento com MAF, paralelamente aumentou a expressão do antigênio reconhecido por MA158.2. A expressão máxima de capacidade turno ricida e antigênio reactivo MA158.2 foi essencialmente completo seguindo o tratamento oom MAF por 24 horas. As experiências prévias demonstraram que a expressão máxima das propriedades tumoricidas neste ensaio necessitou de uma exposição ao MAF durante 24 horas.

A descoberta supra mencionada, incluindo os Exemplos, descreve completamente a invenção e as suas concretizaçBes preferidas. Contudo a invenção compreende todas as suas modificaçBes dentro do alcance das reivindicaçBes seguintes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de preparação de um anticorpo monoclonal da classe IgG produzido por um hibridoma formado por fusão das células de uma linha de células de um mieloma, e células do ba ço, de um mamífero imunizado, previamente, contra macrófagos ac tivados-MAF, sendo o anticorpo reactivo preferencialmente com macrófagos activados.
2 - Processo de preparação de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser reactivo com tioglicolato-, protease-peptone-, Conconavalina A-, e macro fagos eliciados-LPS, mas numa extensão menor qua com macrofagos activados-MAF.
3 - Processo de preparação de anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de ter uma cadeia leve e outra pesada, de não adsorvsr proteína (Cou/an l) S. aureus

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de ser da sub-classe IgG2a e reagir com macrofagos eliciados com Corynebacterium parvum.
4 - Processo de preparação de anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, produzido pelo hibridoma em que as cêlulss do baço são imunizadas previamente contra macrofagos de rato.
5 - Processo de preparação de anticorpos de acordo com a reivindicação 4, produzido pelo hibridoma em que e linha de células do mieloma é uma linha de células de mieloma murino e as células do baço são de um animal murino.
6 - Processo de preparação de anticorpo, de acordo com a reivindic-açãc""·?’; produzido pelo hibridoma em que a linha de células do misl _; $ SP2/0-Agl4.
7 - Processo de preparação de anticorpo, de acordo com

a reivindicação 6, produzido pelo hibridoma 158.2 (ATCC HB-8466).
8 - Processo de preparação de anticorpo caracterizado pc^.o facto deste reagir com o determinante antigênico reconheci do per MA158.2.
9 - Processo de preparação do hibridoma, compreendendo a fusão de uma linha de células do mieloma e células do baço de um mamífero imunizado previamente contra macrofagos activados, caracterizado pelo facto de segregar um anticorpo monoclonal da classe IgG que reage preferencialmente com macrofagos activados.
10 - Processo de preparação de hibridoma, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de segregar um anti corpo que é reactivo com o tioglicolato-, protease peptone, Cort conavalinaA-, e macrofagos eliciados-LPS, mas numa extensão menor que com macrofagos activados MAF.
11 - Processo de preparação de hibridoma, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de segregar um anticorpo que tem uma cadeia leve e uma pesada, de não adsorver proteína (Cowan l) S,· aureus, de ser da sub-olasse IgG2a e de reagir com macrofagos eliciados com Corynebacterium parvum.

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-1712 -Processo de preparação de hibridoma, de acordo com a reivindicação 11, em que as células do baço são previamente imunizadas contra macrofagos activados-MAF.
13 - Processo de preparação do hibridoma, de acordo com a reivindicação 12, em que a linha de células do mieloma é uma linha de células do mieloma murino e as células do baço são de um anima^murino.
14 - Processo de preparação de hibridoma, de acordo com a reivindicação 13, em que a linha de células do mieloma é SP2/ /0-Agl4.
15 - Processo de preparação de hibridoma, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de ser o 158*2 (ATCC HB 8466,),
16 - Processo de preparação de hibridoma caracterizado pelo facto de produzir um anticorpo que reage com o determinante antigênico reconhecido pelo MA158.2.
17 - Processo ds examinar uma solução ou mistura, para activar a actividade do macrofago caracterizado pelo facto de compreender o tratamento de uma cultura de macrofago com a solu ção ou mistura por um tempo e sob condições suficientes para pejç mitir ocorrer a activaçãoj contactar a cultura tratada com um anticorpo da classe IgG produzido por um hibridoma formado pela fusão de células de uma linha de células do mieloma e células

do baço de um mamífero imunizado previamente contra o macrofago activado MAF, sendo o anticorpo preferencialmante reactivo com macrofagos reactivos, por um tempo e sob condições suficientes para permitir a ligação do anticorpo às células activadas; e ensaiar quanto à ligação intensificada do anticorpo ãs células.
18 - Processo de acordo com a reivindicação 17 em que o anticorpo é reactivo com tioglicolato-, protease-peptone-, ConconavalinaA-, e macrofagos eliciados LPS, mas numa extensão menor que nos macrofagos activados MAF.

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-1819 - Processo de acordo com a reivindicação 18 em que o anticorpo tem uma cadeia pesada e uma leve, não adsorve a proteína (Cotuan l) S. aureus, é da sub-classe IgG2a e reage com ma crofagos aliciados com Corynebacterium parvum»
20 - Processo de acordo com a reivindicação 19 em que as células do baço são previamente imunizadas contra os macrofagos do rato.
21 - Processo de acordo com a reivindicação 20 em que a linha de células d.o mieloma ê uma linha de células do mieloma murino e as células do baço são de um animal murino.
22 - Processo de acordo com a reivindicação 21 em que a linha de células do mieloma é SP2/0-Agl4*
23 - Processo de acordo com a reivindicação 22 em que o anticorpo reage com o determinante antigênico reconhecido pelo MA158.2.
24 - Processo de acordo com a reivindicação 22 em que a cultura do macrofago ê derivada de um rato.
25 - Processo de acordo com a reivindicação 23 em que o hibridoma é o 158.2 (ATCC HB-8466).

Ressalvo a entrelinha na folha 12 e a eliminação da folha 13.