PT789777E

PT789777E - Polissacaridos que possuem um elevado teor de acido iduronico

Info

Publication number: PT789777E
Application number: PT95937026T
Authority: PT
Inventors: Giorgio Zoppetti; Pasqua Oreste; Giovanni Cipolletti
Original assignee: Inalco Spa
Priority date: 1994-11-04
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 2001-01-31
Also published as: IT1271057B; CA2204366A1; DE69518333T2; AU3926195A; DK0789777T3; WO1996014425A1; ATE195348T1; ITMI942240A1; EP0789777B1; JP3640259B2; DE69518333D1; ITMI942240A0; EP0789777A1; ES2150589T3; US5958899A; CN1162339A; JPH10508204A; CN1094977C

Description

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DESCRICÃO “Polissacáridos que possuem um elevado teor de ácido idurónico”

Arte anterior

Os glicosaminoglicanos são substâncias obtidas por extracção de tecidos animais de várias origens, como por exemplo mucosa intestinal, pulmão, etc., pertencendo especialmente à classe de polissacáridos que contêm ácido glucurónico e/ou ácido idurónico. A heparina, o sulfato de heparano, os sulfatos de condroitina e o ácido hialurónico pertencem à família dos glicosaminoglicanos.

Os vários glicosaminoglicanos têm estruturas químicas diferentes e são formados por cadeias de polissacárido constituídas pela repetição de um ácido urónico e uma hexosamina. Em particular, na heparina e no sulfato de heparano, o ácido urónico é constituído por ácido glucurónico ou idurónico e a hexosamina por glucosamina. A glucosamina pode estar, de preferência, acetilada em N (sulfato de heparano) ou, de preferência, sulfatada em N (heparina) e sulfatada em 6-0. Além disso, pode-se encontrar também um grupo sulfato na posição 3 da glucosamina. O ácido urónico pode estar sulfatado em 2-0. A heparina tem grande importância na prática clínica como anticoagulante e antitrombótico.

Para além desta utilização terapêutica, espera-se uma utilização útil para a heparina e o sulfato de heparano em várias outras patologias, como por exemplo com função antilipémica, antiproliferativa, antiviral, antitumoral e antiangiogénica. A utilização da heparina e sulfato de heparano nestas novas aplicações terapêuticas envolve a necessidade de obter estes produtos, ou produtos semelhantes, por processos diferentes do processo extractivo, particularmente por processos mais flexíveis, que permitam a preparação de estruturas diferentes.

Além disso, o processo extractivo a partir de tecidos animais não garante a obtenção de produtos isentos de prion e vírus.

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No pedido de patente Ν° WO 92/17507 está descrito um processo para a preparação de glicosaminoglicanos anticoagulantes por biossíntese. Nesse processo, é usado como composto inicial o polissacárido K5 de E. coli, que é submetido à seguinte sequência de reacções: desacetilação em N; sulfatação em N; epimerização para transformar pelo menos alguns resíduos de ácido D-glucurónico em resíduos de ácido L-idurónico; e sulfatação de pelo menos alguns grupos hidroxi livres.

Neste processo, a fase crítica é constituída pela epimerização que se limita a um máximo de 20%. A epimerização é efectuada à temperatura ambiente com a duração de dois dias, em presença da enzima D-glucuronil-L-iduronil-C5-epimerase, num meio reaccional clássico a pH 7,4 constituído por HEPES, cloreto de potássio, EDTA e TRITON X-100. Uma epimerização limitada a um terço dos ácidos urónicos foi anteriormente descrita (M. Hõõk et al., TheJ. ofBiol. Chem., 249, 12, 3908-3915, 25 de Junho de 1974). E este grau de epimerização parecia até agora insuperável. Além disso, deve-se ter em consideração que neste documento a epimerização em meio celular é descrita na mastocitoma de murino, em condições nas quais estão presentes todos os factores que dizem respeito ao processo de biossíntese.

No entanto, um grau de epimerização como o obtido da arte anterior não permite obter um produto com as características exigidas pelos vários tratamentos terapêuticos.

De facto, o ácido idurónico confere ao produto uma flexibilidade superior, comparativamente ao ácido glucurónico (Casu B., Petitou M., Provasoli M., and Sinay P. (1988) “Conformational flexibility: a new concept for explaining binding and biological properties of iduronic acid containing glvcosaminoglycans”. Trends Biochem. Sei., 13, 221-225). Sucede que os produtos contendo elevadas percentagens de ácido idurónico são mais activos comparativamente aos que contêm ácido glucurónico, tal como é evidenciado pela maior actividade anticoagulante e antitrombótica da heparina relativamente ao sulfato de heparano, e por outras actividades tal como a actividade no factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), na qual se reconhece que o ácido idurónico é uma parte essencial do local activo (Maccarana M., Casu B., and Lindhal U. (1993). “Minimal Sequence in Heparin/ Fleparan Sulfate Required for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor”, J. Biol. Chem., 268, 23898-23905).

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Em Chem. Abstr., vol. 115, n° 17, 1991, resumo n° 180062w, descrevem-se experiências sobre a incubação de fibroblastos em cultura com /?-nitrofenil^-D-xilosido, que resultam num aumento na síntese de galactosaminoglicano dependente da concentração. Em particular, a baixa concentração de xilosido adicionado, o galactosaminoglicano formado no xilosido é composto principalmente por ácido L-idurónico.

Obviamente, as ditas experiências não ensinam um processo industrial. Deste modo, existe o problema de encontrar um processo que permita obter um produto possuindo um elevado grau de epimerização, com rendimento e tempo aceitáveis de acordo com o ponto de vista industrial.

Resumo

Verificámos que os polissacáridos que possuem um teor elevado de ácido idurónico podem ser obtidos a partir do polissacárido K5 de E. coli ou a partir de heparina ou de sulfato de heparano, por meio de um processo que compreende: a) a desacetilação em N do dito polissacárido K5 ou do sulfato de heparano, ou a dessulfatação em O de heparina ou de sulfato de heparano; b) sulfatação em N do produto obtido pelo passo a); c) um ou mais tratamentos de epimerização em presença da enzima D-glucuronil-L-iduronil-C5-epimerase; d) sulfatação de pelo menos alguns grupos hidroxi livres, caracterizada por o passo de epimerização ser efectuado num meio reaccional constituído por uma solução tampão clássica a pH 7,4 formada por HEPES, cloreto de potássio e EDTA, à qual se adicionam TRITON X-100 e um aditivo, ou mais aditivos, seleccionados a partir do grupo formado por etilenoglicol, glicerol, polivinilpirrolidona, polietilenoglicol e fosfatidilcolina.

Polissacáridos que possuem teor de ácido idurónico superior a 50% relativamente ao teor total de ácidos urónicos são obtidos pelo processo em conformidade com o presente invento.

Descricão detalhada do invento

As características e as vantagens do processo em conformidade com o presente invento e dos polissacáridos obtidos serão apontados, na sua generalidade, durante a descrição detalhada que se segue.

85 613 ΕΡ Ο 789 777 / ΡΤ 4 Ο polissacárido Κ5 de Ε. coli descrito por Manzoni M., Bergomi S., Cavazzoni V. (Journal of Bioactive and Compatible Polymers, vol. VIII, Julho de 1993, 251-257) é uma substância particularmente adequada à utilização como material de partida para o processo em conformidade com o presente invento. A heparina e o sulfato de heparano também podem ser utilizados como materiais iniciais com algumas variações das condições.operatórias dos primeiros passos do processo.

As substâncias iniciais podem ter um peso molecular que varia de 2.000 a mais de 50.000 D.

Quando o polissacárido K5 é utilizado, a sua estrutura é primeiro modificada por desacetilação em N, que é efectuada por tratamento com uma mistura de hidrazina e sulfato de hidrazina ou num meio básico com hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio.

Depois prossegue-se com a sulfatação em N, tratando com trietilamina-trióxido de enxofre ou com trimetilamina-trióxido de enxofre. Pode-se obter, com estas operações, um produto sulfatado em N de várias maneiras, por exemplo de 25 % a 100 %.

As reacções de desacetilação em N e sulfatação em N são efectuadas em conformidade com técnicas conhecidas, por exemplo em conformidade com o pedido de patente N° WO 92/17507.

Quando se usa heparina como substância inicial, efectua-se primeiro a dessulfatização em O e depois a sulfatação em N, para voltar a sulfatar as posições amino que perderam os grupos sulfato durante a dessulfatação em O.

Quando se usa sulfato de heparano como substância inicial, efectua-se a desacetilação em N e a dessulfatação em O e a resultante ressulfatação em N. O produto sulfatado em N obtido a partir de polissacárido K5 ou do sulfato de heparano da forma descrita acima, é submetido ao processo de epimerização para converter o ácido glucurónico em ácido idurónico, enquanto que o produto obtido a partir de heparina é tratado com a enzima de modo a obter ácido glucurónico a partir de ácido idurónico. A epimerização é efectuada em presença da enzima D-glucuronil-L-iduronil-C5-epimerase (adiante referida simplesmente como C5-epimerase) extraída de fígado de gado e purificada com o método descrito por A. Malmstrõm em J. B. C. 255, 3878-3883 (1980).

85 613 ΕΡ Ο 789 777 / ΡΤ Ο requerente verificou, surpreendentemente, que modificando o meio de reacção clássico com aditivos adequados, se obtém um grau de epimerização muito elevado. O meio de reacção em conformidade com o presente invento é uma solução tampão a pH 7,4 constituída por HEPES, cloreto de potássio, EDTA e TRITON X-100 e adicionada com um ou mais aditivos seleccionados a partir do grupo formado por etilenoglicol, glicerol, polivinilpirrolidona, em particular polivinilpirrolidona com peso molecular de 15.000 a 90.000, polietilenoglicol, e fosfatidilcolina em quantidades adequadas para aumentar a viscosidade da solução tampão para valores variando de 1,1 a 3 mm2/s (1,1 a 3 centistokes). O meio de reacção é preparado, em particular, partindo da seguinte solução tampão com pH 7,4: HEPES 0,04M, KC1 0,4M e EDTA 0,06M, e adicionando a 25 ml desta solução tampão de 100 a 1.000 μΐ de TRITON X-100, de 0,5 ml a 60 ml de aditivo e água destilada para 100 ml.

Adiciona-se o polissacárido a submeter a epimerização ao dito meio reaccional, numa quantidade de 5 a 1.000 mg por 100 ml, obtendo-se a solução A. A C5-epimerase é dissolvida separadamente no mesmo meio reaccional supramencionado, em quantidades de 21 a 2.000 pg por 100 ml, obtendo-se a solução B.

Adiciona-se a solução B à solução A numa proporção certa para obter um teor de 1,5 a 15000 pg de C5-epimerase por 100 ml de mistura a submeter a epimerização. Agita-se a mistura para homogeneizar e aquece-se a uma temperatura variando de 30 a 40°C numa câmara de temperatura constante durante um tempo que varia de 90 minutos a 15 horas.

Extingue-se a reacção aquecendo a mistura a 100°C durante 5 minutos. Purifica-se o produto através de uma coluna DEAE-Sephacel usando (NH4)HC03 0,05M como tampão e eluindo o produto com tampão (NH4)HC03 2M. Dessalinizam-se as fracçòes recolhidas, contendo o produto, numa coluna Sephadex G-15, liofiliza-se e analisa-se o produto por 'H-RMN.

Calcula-se o teor de ácido D-glucurónico e de ácido L-idurónico pelo espectro de 'H-RMN. Pode-se dissolver novamente o produto obtido em solução A e tratá-lo outra vez com solução B obtendo, com mais tratamentos de epimerização, um aumento do teor de ácido L-idurónico.

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Para estimar a actividade anticoagulante e antitrombótica, o produto epimerizado é sulfatado em O usando como agente sulfatante piridina-trióxido de enxofre, por exemplo com o método descrito por Ogamo et al. nos resumos do XIV International Carbohidrate Symposium (14-19 de Agosto, 1988), Estocolmo. Os produtos dos Exemplos 1, 3, 4, 5, 6, 7 e 9, obtidos com o processo em conformidade com o presente invento, como se descreve mais tarde, e submetidos a sulfatação em O, apresentaram uma excelente actividade anticoagulante e antitrombótica, ao passo que os produtos dos Exemplos 2 e 8, obtidos em conformidade com a técnica conhecida, apresentaram actividade muito menor.

Os resultados obtidos mostram que os produtos em conformidade com o presente invento têm características adequadas à utilização clínica com função anticoagulante e antitrombótica, e por isso podem ser utilizados na preparação das próprias composições farmacêuticas, misturados com substâncias adjuvantes e excipientes.

Para explicar o processo em conformidade com o presente invento, apresentam-se os seguintes exemplos.

Exemplo 1

Preparou-se uma solução tampão contendo 0,04M de HEPES, 0,06M de EDTA, 0,4M de KC1 de pH 7,4 e adicionaram-se a 4,5 ml desta solução 27 μΐ de TRITON X-100, 9 ml de polivinilpirrolidona K15 a 10% em água, 1,62 ml de etilenoglicol e água para um volume total de 18 ml. A solução apresentou uma viscosidade de 1,41 mm2/s (1,41 centistokes). Dissolveu-se nesta solução 1 mg de K5, desacetilado em N e sulfatado em N a 100%, obtendo-se a solução A.

Adicionou-se 1,6 ml de polivinilpirrolidona Kl5 a 10% em água, 288 μΐ de etilenoglicol e água, para um volume total de 3,2 ml, a 0,8 ml da mesma solução tampão de pH 7,4 inicial, contendo 8,9 pg de C5-epimerase, obtendo-se a solução B.

Misturou-se a solução A com 1,6 ml de solução B, e manteve-se a mistura a 37°C durante 4 horas numa sala aquecida. Após 4 horas, adicionaram-se 1,6 ml de solução B e manteve-se a reacção a 37°C durante a noite. Parou-se a reacção aquecendo a 100°C durante 5 minutos. 85 613 ΕΡ Ο 789 777 / ΡΤ 7

Purificou-se ο produto por meio de uma coluna DEAE-Sephacel (2 x 1,5 cm) usando como tampão (NH4)HC03 0,05M, e eluiu-se o produto com (NKDHCCh 2M.

Dessalinizaram-se as fracções que continham o produto numa coluna Sephadex G-15 (0,3 x 5 cm) e secaram-se por congelação.

Analisou-se o produto por 'H-RMN e apresenta-se o espectro na Figura 1. A percentagem de ácido L-idurónico sobre o total de ácidos urónicos foi de 55. Exemplo 2 (Comparação)

Repetiu-se o Exemplo 1, com a diferença de não se adicionar a polivinilpirrolidona e o etilenoglicol. A solução tampão usada tinha uma viscosidade aproximadamente igual à da água, nomeadamente cerca de zero. O espectro de 'H-RMN relativo ao produto obtido está apresentado na Figura 2. O teor de ácido L-idurónico relativamente à soma de ácido idurónico e de ácido glucurónico resultou ser igual a 18%.

Exemplo 3

Repetiu-se o Exemplo 1, com a diferença de se ter usado como substância inicial o polissacárido K5 desacetilado em N e sulfatado em N a 50%.

Analisou-se o produto resultante por 'Fl-RMN e apresenta-se o respectivo espectro na

Figura 3. O teor de ácido L-idurónico resultou ser igual a 51% relativamente ao total de ácidos urónicos adjacentes a uma glucosamina sulfatada em N.

Exemplo 4

Adicionou-se EDTA 0.06M, KC1 0,4M de pH 7,4, 30 μΐ de TRITON X-100, 10,6 ml de polivinilpirrolidona Kl5 a 10% em água, 0,85 ml de etilenoglicol e 4,42 ml de água, a 5,3 ml de uma solução tampão contendo HEPES 0,04M.

85 613 ΕΡ Ο 789 777 / ΡΤ 8 A soluçào apresentou uma viscosidade <

Dissolveram-se 2 mg de K5, desacetilado em N a 100 %. sulfatado em N, em 9 ml desta solução, obtendo-se a solução A.

Dissolveram-se 1,7 pg de C5-epimerase em 8 ml da mesma solução, obtendo-se a solução B.

Misturaram-se as soluções A e B, e manteve-se a mistura a 37°C durante 4 horas numa sala quente. Parou-se a reacção aquecendo-se a 100°C durante 5 minutos.

Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1.

Após secagem por congelação, dissolveu-se o produto purificado em 1 ml de solução A e misturou-se com 3,2 ml de solução B contendo 8,9 pg de C5-epimerase.

Manteve-se a mistura a 37°C durante a noite e inactivou-se a enzima aquecendo a 100°C durante 5 minutos. Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1 e analisou-se por 'H-RMN como se apresenta na Figura 4. A percentagem de ácido L-idurónico sobre os ácidos urónicos totais foi de 53.

Exemplo 5

Preparou-se uma solução tampão contendo HEPES 0,04M, EDTA 0,06M, KC1 0,4M de pH 7,4 e, a 2 ml desta soluçào, adicionaram-se 22,8 μΐ de TRITON X-100, 1 mg de K5 desacetilado em N e sulfatado em N a 100%, 4 ml de uma solução de polivinilpirrolidona Kl 5 a 20% contendo etilenoglicol a 40% e água, para um volume total de 8 ml. Adicionaram-se 6 ml de uma solução contendo HEPES 0,01M, EDTA 0,015M, KC1 0,01M, TRITON X-100 a 0,015% e 134,4 pg de C5-epimerase a 6 ml desta solução. A solução obtida apresentou uma viscosidade de 1,36 mm2/s (1,36 centistokes).

Manteve-se a mistura a 37°C durante 1 hora. Parou-se a reacção ebulindo a 100°C durante 15 minutos.

Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1.

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Após secagem por congelação, dissolveu-se o produto em solução tampão contendo 6,25 ml de HEPES 0,04M, EDTA 0,06M, KC1 0,4M de pH 7,4, 2,5 g de polivinilpirrolidona Kl5, 2,5 ml de etilenoglicol, 71,2 μΐ de TRITON X-100 e água para um volume total de 25 ml.

Adicionaram-se, a 12 ml da mistura obtida, 1,9 Lig de C5-epimerase dissolvida em 12 ml de HEPES 0,01M, EDTA 0,015M, KC1 pH 7,4 0,1M, contendo TRITON X-100 a 0.015%. A mistura apresentou uma viscosidade de 1,4 mm2/s (1,4 centistokes).

Manteve-se a reacção a 37°C durante a noite. No final da reacção inactivou-se a enzima aquecendo a solução a 100°C durante 5 minutos. Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1 e efectuou-se o espectro de ’Η-RMN (Figura 5). A percentagem de ácido L-idurónico sobre os ácidos urónicos totais foi de 52.

Exemplo 6

Repetiu-se o Exemplo 5 exceptuando o facto de. no primeiro passo, se ter mantido a reacção a 37°C durante 4 horas.

Após a purificação nas mesmas condições do Exemplo 1 e após a secagem por congelação, dissolveu-se o produto em 1 ml de água e adicionou-se a uma solução tampão contendo 50 ml de HEPES 0,04M, EDTA 0,06M, KC1 0,4M de pH 7,4, 283,5 μΐ de TRITON X-100, 100 ml de polivinilpirrolidona K15 a 10%, 20 ml de etilenoglicol, 2 ml de glicerol a 90%, 1,9 pg de C5-epimerase e água, para um volume total de 200 ml. A mistura apresentou uma viscosidade de 1,41 mm2/s (1,41 centistokes).

Manteve-se a reacção a 37°C durante 4 horas e inactivou-se a enzima a 100°C durante 5 minutos.

Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1 e realizou-se o espectro de 'H-RMN (Figura 6). A percentagem de ácido L-idurónico sobre os ácidos urónicos totais foi de 55.

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Exemplo 7

Dissolveram-se 1,5 mg de K5 desacetilada em N e sulfatada em N a 100%, numa solução tampão contendo 7 ml de HEPES 0,04M, EDTA 0,06M, KC1 0,4M de pH 7,4, 210 μΐ de TRITON X-100, 1,4 g de polivinilpirrolidona Kl5, 2,8 ml de etilenoglicol, 1,5 mg de C5-epimerase e água, para um volume total de 28 ml. A mistura apresentou uma viscosidade de 1,36 mm2/s (1,36 centistokes).

Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1 e secou-se por congelação.

Depois, dissolveu-se o produto em 24 ml da mesma solução contendo 1,3 mg de C5-epimerase, e manteve-se a reacção a 37°C durante 4 horas e inactivou-se a enzima a 100°C durante 5 minutos.

Depois, dissolveu-se o produto em 8,4 ml da mesma solução contendo 1 mg de C5-epimerase, e manteve-se a reacção a 37°C durante 4 horas.

Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1 e efectuou-se o espectro de 'H-RMN (Figura 7). A percentagem de ácido L-idurónico sobre os ácidos urónicos totais foi de 80.

Exemplo 8 (Comparação)

Dissolveu-se 1 mg de K5 desacetilada em N e sulfatada em N a 100%, numa solução tampão contendo 3 ml de HEPES 0,04M, EDTA 0,06M, KC1 0,4M de pH 7,4, 18 μΐ de TRITON X-100, 1,2 ml de acetona, 1,9 pg de C5-epimerase e água, para um volume total de 12 ml. A mistura apresentou uma viscosidade de 0,09 mm2/s (0,09 centistokes). 85 613 ΕΡ Ο 789 777 / ΡΤ Π

Manteve-se a reacção a 37°C durante 4 horas.

Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1 e realizou-se o espectro de 'H-RMN (Figura 8). A percentagem de ácido L-idurónico sobre os ácidos urónicos totais foi de 0.

Exemplo 9

Dissolveu-se 1 mg de K5 desacetilada em N e sulfatada em N a 100%, numa solução tampão contendo 2 ml de HEPES 0,04M, EDTA 0,06M, KC1 0,4M de pH 7,4, 12 μΐ de TRITON X-100, 1,336 ml de polivinilpirrolidona K90 a 2,4%, 304 pg de C5-epimerase e água, para um volume total de 8 ml. A mistura apresentou uma viscosidade de 1,29 mmVs (1,29 centistokes).

Manteve-se a reacção a 37°C durante 4 horas, inactivou-se a enzima a 100°C durante 5 minutos e filtrou-se a solução num dispositivo de 0,22 pm. Adicionou-se 8 ml da mesma solução contendo 304 pg de C5-epimerase à solução filtrada, e manteve-se a reacção a 37°C durante 4 horas, inactivou-se a enzima a 100°C durante 5 minutos, e filtrou-se a solução num dispositivo de 0,22 pm.

Purificou-se o produto como se descreveu no Exemplo 1 e efectuou-se o espectro de 'H-RMN (Figura 9). A percentagem de ácido L-idurónico sobre os ácidos urónicos totais foi de 59.

Lisboa, 3 ηι,ιτ ?grio

Por INALCO S.p.A. - O AGENTE OFICIAL -

EMG.e ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERRE1RA Ag. Of. Pr. Ind. Suo das Flores, 74 - 4.' 1600 LISBOA

Claims

V "V 85 613 ΕΡ Ο 789 777 / ΡΤ ί .1/2

1 /REIVINDICAÇÕES | 1 r 1 i I I 1 i ' I ι I j ' 1 1. Processo para a preparação de polissacáridos^om um teor de ácido L-idurónico superior a 50% relativamente ao teor total de ácidos urónicos,1 partindo do polissacárido K5 da E. coli ou da heparina ou do sulfato de heparanò, compreendendo: a) a desacetilação em N do dito polissacárido K5 ou do sulfato de heparanò, ou a dessulfatação em O da dita heparina ou sulfato de heparanò; b) sulfatação em N do produto obtido pelo passo a); c) um ou mais tratamentos de epimerização em presença da enzima C5-epimerase; d) sulfatação de pelo menos alguns grupos hidroxi livres, caracterizada por o passo de epimerização ser efectuado num meio de reacção que consiste numa solução tampão clássica a pH 7,4 constituída por HEPES, cloreto de potássio e EDTA, à qual se adicionam TRITON X-100 e um aditivo, ou mais aditivos, numa quantidade adequada para aumentar a viscosidade da dita solução tampão para valores variando de 1,1 a 3 mm"/s (1,1 a 3 centistokes), sendo o dito aditivo ou aditivos seleccionados a partir do grupo que consiste em etilenoglicol, glicerol, polivinilpirrolidona, polietilenoglicol e fosfatidilcolina.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito aditivo ser polivinilpirrolidona com peso molecular de 15.000 a 90.000.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se adicionar o dito aditivo, ou aditivos, à dita solução tampão numa quantidade de 0,5 a 60 ml relativamente a 25 ml da dita solução tampão.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se dissolver o dito composto inicial no dito meio reaccional, numa quantidade de 5 a 1.000 mg por 100 ml.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se dissolver a dita C5-epimerase no dito meio reaccional, numa quantidade de 21 a 2.000 pg por 100 ml.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura para a epimerização conter de 1,5 a 15.000 pg de C5-epimerase por 100 ml da mistura.

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7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita reacção de epimerização ser efectuada numa câmara de temperatura constante, a uma temperatura variando de 30 a 40°C.