PT714911E - Analogos da somatostatina contendo grupos quelantes e suas composicoes marcadas radioactivamente - Google Patents

Description

-1 - fa.yt'* £—***-——4-í ‘-i DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DA SOMATOSTATINA CONTENDO GRUPOS QUELANTES E SUAS COMPOSIÇÕES MARCADAS RADIO ACTIVAMENTE " A presente invenção diz respeito a péptidos somatostatina, a processos para a sua produção, às preparações farmacêuticas que os contenham e ao seu uso como radiofármaco, e.g. para radioterapia de tumores positivos ao receptor da somatostatina. A radioterapia de tumores com compostos radioactivos tem vantagens de localizar selectivamente os tumores e suas metástases, limitando assim a dose de radiação nos tecidos normais. Um agente radioterapêutico deverá ter uma acumulação rápida e elevada retenção nos órgãos objectivo, e.g. tumor, e um desaparecimento rápido da circulação para limitar a dose de radiação por todo o corpo. Um agente radioterapêutico baseado num metal radioactivo quelado deverá também ser termodinamicamente e/ou cineticamente estável contra a perda do metal radioactivo. Um agente radioterapêutico administrado repetida-mente não deverá ser imunogénico. GB-A-2.225.579 divulga péptidos somatostatina com pelo menos um grupo quelante, o qual pode ser marcado radioactivamente para diagnóstico in vivo e aplicações terapêuticas. Estes compostos são capazes de se ligarem aos receptores da somatostatina, e.g., expressos ou sobre-expressos por tumores ou metástases. O composto do Exemplo 1 de EP-A-515.313 compreende um grupo quelante DOTA ligado por um dos seus -CH2- via um grupo espaçador p-isotiocianatobenzilo ao grupo amino terminal do octreotido (octapéptido somatostatina). EP-A2-607.103 dcscrcvc péptídos somatostatina compreendendo um grupo quelante bifuncional de ácido poliaminopolicarboxílico ligado ao seu grupo terminal através de um grupo espaçador. No entanto, embora a presença de um grupo quelante bifuncional (octadentado) e de um grupo espaçador conduza à melhoria de determinadas propriedades do conjugado resultante, existe ainda uma forte necessidade para a obtenção de um radiofármaco com propriedades melhoradas, particularmente um elevado rácio alvo/rim para minimizar a dose de radiação nos rins.

Verificou-se que os péptídos somatostatina como os aqui divulgados, compreendendo um grupo DOTA monofuncional (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-l,4,7,10-tetraacético) conjugado directamente, i.e., na ausência de um grupo espaçador, com o grupo amino terminal dos péptídos somatostatina, tem propriedades melhoradas. Especificamente, revelam um melhor rácio tumor/rim e deste modo uma menor dose de radiação exposta aos rins.

De acordo com a invenção, é fornecido um composto de fórmula I

OM r° ^r- Γ U-η C 1 lá yN N-J MO—C-CH. II CH, 1 II O r° OM em que M é um catião e A é Tyr, na forma livre, forma de sal ou complexado com um radionuclido. -3-

Af- h*-rh (d

Conforme será verificado, cada ligaçao I I que liga 2 átomos de azoto na fórmula DOTA acima, representa etileno.

Quando A é Phe, a fracção peptídica do composto de fórmula I corresponde a octreotido. Quando A é Tyr, a fracção peptídica corresponde a [Tyr3]-octreotido. M pode ser H+ ou qualquer catião que forme um sal com um grupo carboxilo, e.g., um catião monovalente ou um equivalente de um catião polivalente, por exemplo um ião de metal alcalino tal como sódio, potássio ou um ião amónio substituído ou não substituído.

Os compostos de fórmula I podem também existir, e.g., na forma de um sal interno quando M é H*, ou na forma de sais de adição de ácido. Os sais de adição de ácido incluem por exemplo sais obtidos pela adição de um ácido orgânico, polimérico ou inorgânico, por exemplo cloridrato, acetato, trifluoracetato ou lactato.

Por radionuclido quer denominar-se um nuclido com emissão cc ou β ou um nuclido com cascatas de Auger-e'. Nuclidos adequados incluem, e.g., ^Cu, 67Cu ou um radiolantanídeo, particularmente 90Y, 140La, 161Tb, 169Er, 153Sm, 177Lu, l66Dy, 166Ho ou 175Yb, mais preferivelmente 161Tb e 90Y, mais preferivelmente 90Y. A presente invenção também inclui um processo para a produção de compostos de fórmula I. Podem ser produzidos por analogia com métodos conhecidos. Os compostos de fórmula I podem ser produzidos, por exemplo, como se segue:

-4- a) removendo pelo menos um grupo protector que esleja presente num composto de fórmula I na forma protegida, ou b) ligando duas unidades peptídicas através de uma ligação amida, uma das quais contendo pelo menos um amino álcool na forma protegida ou não protegida e a outra contendo o grupo DOTA, em que a ligação amida é de tal forma que se obtém a sequência desejada de aminoácidos de fórmula I, e a etapa a) do processo.é. então optimamente efectuada, ou f ,V| c) ligando DOTA e [Tyr3]-octreotido na forma protegida ou não protegida, de modo a que o grupo derivado de DOTA esteja fixado ao grupo amino terminal do péptido, e a etapa a) é então optimamente efectuada, ou

d) oxidando um DOTA-péptido que tenha uma sequência de aminoácidos conforme indicada na fórmula I, em que os grupos mercapto dos radicais Cys existem na forma livre de modo a produzir um composto de fórmula I no qual os dois radicais Cys esteja ligados por uma ponte S-S e recuperando os compostos de fórmula I assim obtidos na forma livre, na forma de sal ou na forma de um complexo com um radionuclido.

As reacções anteriores podem ser efectuadas por analogia com métodos conhecidos, por exemplo, conforme descrito nos exemplos seguintes. Quando pretendido, nessas reacções, podem ser usados grupos protectores de grupos funcionais que não participem na reacção e que seja adequados para utilização em péptidos ou com o grupo quelante DOTA. O termo grupo protector pode também incluir uma resina polimérica com grupos funcionais. Pode ser utilizado DOTA no etapa (c) do processo na forma de ácido livre, como um anidrido ou como um éster activado, e.g., com N-hidroxisuccinimida. η -5- A complexação com o radiouuclido pode ser efectuada à temperatura ambiente de acordo com métodos conhecidos na técnica, e.g., fazendo reagir um composto não complexado de fórmula I com um sal, obtendo-se o radionuclido pretendido.

Preferencialmente, a complexação do composto de fórmula I não complexado com o sal que origina o radionuclido é efectuada a uma temperatura desde 60 °C a 120 °C, mais preferivelmente desde 80 a 100 °C. Quando a complexação é efectuada a uma temperatura >l(i>Ô °C a reacção pode ser efectuada num autoclave. A complexação com aquecimento e'convenientemente efectuada durante um curto período de tempo, e.g. de 10 a 20 minutos. Quando o radionuclido é 90Y, o sal que origina o radionuclido 90Y é 90YCl3.

As reacções acima referidas podem ser convenientemente efectuadas sob condições que evitem a contaminação com metais vestigiários Preferencialmente são utilizados água destilada desionizada, reagentes ultra-puros, sem veículos que adicionem radioactividade, etc., de modo a reduzir os efeitos do metal vestigial.

Os compostos de fórmula I, quando complexados com unx radionuclido, exibem actividade farmacêutica e são deste modo úteis como radiofármacos para tratamento in vivo de tumores e metástases positivos ao receptor da somatostatina conforme indicado por testes padrão.

Em particular, os compostos de fórmula I possuem afinidade pelos receptores da somatostatina, o qual pode ser avaliado in vitro por ensaios de ligação efectuados conforme descrito por J.C. Reubi, Life Sc., 1985, 36, 1829 e C. Bruns et al., Biochem. J„ 1990, 265, 39. -6-

Verifica-se que os compostos de fórmula I, eg-, mn composto de fórmula I complexado com ou 161 Tb, ligam-se com uma boa afinidade e especificidade aos receptores da somatostatina a valores de pKa de cerca de 8,0 a 10,0. O composto do Exemplo 1 liga-se com elevada afinidade aos receptores da somatostaina expressos em córtex de ratos ou células tumorais pancreáticas AR42J: tem um.pKi de 8,9 ±0,1 usando [125I][Tyr3]-octreotido como ligando específico. O'composto do Exemplo 2 é um ligando específico do receptor da somatostatina que pode ser substituído nos receptores da somatostatina pelo octreotido: pIC50 = 9,0 ± 0,3. A afinidade dos compostos de fórmula I complexados em relação aos receptores da somatostatina pode também ser demonstrada por teste in vivo, de acordo com métodos de teste padrão, e.g., como os divulgados em GB-A-2.225.579. Por exemplo, numa das experiências, o composto do Exemplo dá origem a uma acumulação no tumor significativa 2 horas após a injecção i.p. numa dose de 5 pCi em ratos com tumor pancreático exócrino: 9,53 ± 0,70 %ID/g presente no tumor positivo ao receptor da somatostatina, enquanto que é acumulada significativamente menos radioactividade nos tecidos normais positivos ao receptor da somatostatina, e.g., no pâncreas é 1,52 ± 0,08 %ID/g. Por %ID/g quer denominar-se a percentagem de dose de radioactividade injectada por g de tecido. O composto do Exemplo 2 proporciona 24 horas após injecção não apenas um elevado rácio tumor/rim mas também um elevado rácio tumor/fígado e tumor/fémur. Sendo a medula óssea considerada como o órgão mais sensível à radioactividade, a baixa radioactividade acumulada nos ossos é particularmente vantajosa.

Os compostos de fórmula I complexados com radionuclido têm um -7-efeito anli-proliferalivo nas células lumorais com receplores da somaloslatina, e.g., conforme indicado em testes com ratos nus.

As células tumorais pancreáticas de ratos AR42J são tripsinizadas e são injectadas lxlO7 células tumorais (em 0,2 ml) subcutaneamente em ambos os flancos de ratos nus. Após os tumores terem alcançado um volume significativo de 0,1 a 2 ml, os animais foram divididos aleatoriamente em grupos de controlo e de tratamento. Os animais de controlo receberam um composto não complexado de, fórmula I ou o correspondente composto complexado de fórmpla I frio por injecção i.p. com doses correspondentes à dose mais elevada dos grupos de tratamento. São dadas doses de 0,8 mCi até 40 mCi/kg/100 μΐ por rato. O tamanho dos tumores é determinado com um compasso de calibre. Para calcular o volume do tumor em ml é utilizada a equação "volume (elipsóide) = comprimento x profundidade x altura x 0,52". Para cálculos estatísticos é aplicado o teste do t de Student. Neste teste, é observada a diminuição do tumor transiente após uma semana e o crescimento do tumor é retardado duas semanas após uma aplicação simples do composto do Exemplo 2. Em contraste, os grupos de controlo apresentaram um crescimento contínuo do tumor com o volume a duplicar cada sete dias. A taxa de sobrevivência dos grupos tratados é significativamente aumentada São obtidos resultados similares quando se tratam ratos ou ratazanas com outros tipos de tumores, e.g., carcinomas mamário ou carcinoma pulmonar das células pequenas, com composto do Exemplo 2.

Deste modo, a presente invenção também fornece, numa série de incorporações específicas ou alternativas, o uso de um composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável na preparação de uma composição farmacêutica radioactiva.

As dosagens utilizadas na utilização da radioterapia da presente invenção dependem obviamente e.g. no estado particular a ser tratado, por exemplo da radiosensibilidade do tipo de tumor, do volume do tumor e da terapia pretendida. Em geral, a dose é calculada com base da distribuição de radioactividade em cada órgão e na absorção observada no alvo. Um complexo com emissão β de fórmula I pode ser administrado em determinados períodos de tempo, e.g., ao longo de um período de 1 a 3 semanas ou mais. Uma gama de dosagem indicada é desde 5 a 100 pg de composto de fórmula I complexado com e.g. 10 a 100 mCi de radionuclido, e.g., 90Y ou 16lTb, sendo a gama de radioactividade mais elevada preferida para 161Tb.

Os compostos de fórmula I complexados com um radionuclido podem ser administrados por qualquer via convencional, em particular intravenosamente, e.g., na forma de suspensões ou soluções injectáveis. Também podem ser vantajosamente administrados por infusão, e.g., uma infusão de 30 a 60 min. Dependendo da localização do tumor, podem ser administrados o mais proximamente possível do local do tumor, e.g., através de um cateter. Podem também ser administrados repetidamente em doses divididas.

Os tumores que podem ser tratados com compostos de fórmula I complexados com um radionuclido são e.g., tumores da pituitária, gastro-entero-pancreático, carcinóides, sistema nervoso central, mama, prostático, ovários ou coloónicos, carcinoma pulmonar das células pequenas, paragangliomas, cancro dos rins, cancro da pele, neuroblastomas, feocromocitomas, carcinomas medular da tiróide, mielomas, linfomas, doença de Hodgkin e não-Hodgkins, tumores ósseos e suas mestástases. A excreção dos compostos radioactivos ocorre essencialmente através dos rins. Pode ser conseguida uma protrecção adicional dos rins face à -9-

acumulação de radioactividade através da administração de lisina ou arginina ou uma solução de aminoácido com um elevado teor de lisina e/ou arginina, e.g., uma solução de aminoácido comercialmente disponível tal como Vamina® 18EF ou Synthamin®-14 ou -10, antes da injecção de, ou em conjunto com o composto complexado de fórmula I.

Os compostos de fórmula I complexados com um radionuclido podem existir nã 'forma de ácido livre ou como um sal farmaceuticamente aceitável que exiba o mesmo grau de actividade que os complexos na forma de ácido livre. O composto do Exemplo 1 complexado com 90Y é preferido.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula I ou um composto de fórmula I complexado com um radionuclido, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em conjunto com um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições podem ser preparadas de modo convencional.

De acordo com uma incorporação preferida da invenção, as composições farmacêuticas baseadas num composto de fórmula I complexado com um radionuclido contêm ainda um estabilizante, e.g., um eliminador de radicais livres, o qual inibe a auto-radíólise da fracçáo peptídica. Estabilizantes adequados incluem, e.g., albumina de soro, ácido ascórbico, retinol, ácido gentísico ou um seu derivado, ou uma solução de infusão de aminoácido, e.g., conforme utilizada para alimentação parentérica de proteínas, preferivelmente sem electrólito e glicose, por exemplo uma infusão de aminoácido - 10-

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comercialmente disponível tal como Proteinsteril® KE Nephro. O ácido ascórbico é preferido. O estabilizante pode ser convenientemente utilizado num rácio ponderai de 1.000-10.000 : 1, preferivelmente 4.000 - 7.000 : 1 em relação ao composto de fórmula I não complexado. As composições farmacêuticas podem compreender outros aditivos, e.g., um agente para ajustar o pH entre 7,2 e 7,4, e.g., acetato de sódio ou amónio ou Na2HP04. Preferivelmente, o estabilizante é adicionado ao composto não complexado de fórmula I e a complexação com o radionuclido é efectuada na ausência de um estabilizador, à temperatura ambiente ou, preferivelmente, a uma temperatura de 60 a 120 °C. A complexação pode ser convenientemente executada em condições de ausência de ar, e.g., sob atmosfera de N2 ou Ar. Pode ser adicionado mais estabilizante à composição após a compelxação.

Os compostos de fórmula I complexados com um radionuclido podem também ser usados no tratamento de distúrbios auto-imunes ou inflamatórios que exibam os receptores da somatostatina, e.g., artrite reumatóide.

Os compostos de fórmula I complexados com um radionuclido podem ser utilizados como auxiliar ou adjuvante na terapia citostática, e.g., em combinação com um agente citostático, preferivelmente um agente cistostático que amplie os efeitos da radioterapia actuando como um agente radio-sensibilizador. Exemplos de agentes citostáticos ou radio-sensibilizadores adequados incluem e.g. cisplatina, 5-fluoruracilo, ciclofosfamida e doxorubicina.

De acordo com o anteriormente referido, a presente invenção fornece ainda um outro aspecto, um estojo ("kit"), para utilização no tratamento da invasividade do tumor ou sintomas associados com o desenvolvimento de tumores, cujo estojo ("kit") inclui uma composição farmacêutica compreendendo -11 -

um compus lo de fórmula I complexado curn uru radiouuclido ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e incluindo ainda pelo menos uma composição farmacêutica compreendendo um agente citostático. O agente citostático pode ser utilizado em qualquer quantidade que se saiba ser uma quantidade eficaz citostática ou radio-sensibilizadora. O agente citostático pode ser concomitantemente adicionado ou num regime sequenciado com o radiofármaco de fórmula I. . ,

Os exemplos seguintes são ilustrativos da invenção. Todas as temperaturas são em °C. São utilizadas as seguintes abreviaturas:

Fmoc Boc DOTA DMF Octeotrido 9-fluorenilmetoxicarbonilo terc-butoxicarbonilo ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclodecano-1,4,7,10-tetraacético dimetilformamida I--1 H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

Exemplo 1: Γ f=0

OH ç_PPhe-Cya-Tyr-DTrp-Lys-Thr-C^e-Thr-ol (βΑ. V ^ V5

-12- São dissolvidos 6 g de D0TAx2H20 (ácido livre) em 50 ml de água (pH ~ 3,7). Após diluir com 60 ml de DMF, são imediatamente adicionados 1 g de N-hidroxisuccinimida, 2,7 g de Ν,Ν-diciclo-hexilcarbodiimida (DCCI) e 3 g de [Tyr33, E-Boc-Lys5]-octreotido. A reacção é mantida à temperatura ambiente durante 72 horas sob agitação contínua. O composto ε-Lys5 protegido é isolado por purificação numa coluna de sílica gel 60 usando5 cloreto de metileno / metanol / ácido acético 50% (9/1/0,125) como fase móvel. . - A cisão subsequente do grupo protector Lys5 com ácido trifluoracé-tico (TFA, 100%) ao longo de um período de 10 minutos à temperatura ambiente e purificação numa coluna de sílica gel 60 (fase móvel: cloreto de metileno / metanol / ácido acético 50% (7/3/1 a 7/5/2)) e numa coluna RP18-HPLC, usando água / acetonitrilo / ácido acético 1% como sistema tampão, origina o composto em título puro e homogéneo na sua forma de sal de acetato. FAB-MH+: 1421 [ot]D22 = -14,75° (AcOH 95%; c=0,52)

Exemplo 2: Composto do Exemplo 1 marcado com 90Y O quelato marcado com 90Y é preparado por adição de 20 μΐ de 90Y (1,2 mCi, 0,04M HC1) a 20 μΐ de composto do Exemplo 1 50 μΜ (0,15M NH4OAC, 0,3% BSA, pH 4,5). Esta solução é incubada a 100 °C durante 15 minutos. É retirada uma alíquota e diluída com DTPA 4 mM (pH 4,5) antes de ser analisada por HPLC numa coluna Cl8 de fase reversa para verificar a quantidade de 90Y não incorporado no quelato na mistura reaccional (conforme indicado pela presença de [90YDTPA]2']. A pureza radioquímica é tipicamente >99,5% e o quelato produzido é cineticamente estável em DTPA 4mM (composto do Exemplo 1 4nM, pH 4,5) ao longo de um período de sete dias. -13-

-13- -4.C *-JL Aí C.

Exemplo 3: Composto do Exemplo 1 marcado com 90Y São aquecidos 120 μΐ de ácido ascórbico 0,23M, acetato de amónio 0,15M (pH 4,8), 6 μΐ de composto do Exemplo 1 1 mM e 120 μΐ de 90Y (85 mCi/ml, 0,04 M HC1) numa ampola durante 15 minutos num banho de água a ferver. A solução resultante é diluída para 1 ml com ácido ascórbico 0,23M e NHjOAc 0,15M ou solução de infusão de aminoácido Proteinsteril® KE Nephro e é guardada à temperatura ambiente durante um longo_período. A solução de aminoácido Proteinsteril® KE Nephro compreende: 11,4 g/1 Leu, 9,63 g/1, Lys, 9,53 g/1 Vai, 7,76 g/1 Phe, 7,52 g/1 Ile, 6,78 g/1 Thr, 6,59 g/1 Met, 4,9 g/1 His e 2,91 g/1 Trp.

Exemplo 4: Composto do Exemplo 1 marcado com ,61Tb É repetido o procedimento de marcação do Exemplo 2 usando um sal que origine 161Tb em vez de 90Y, obtendo-se assim o quelato 161Tb.

Lisboa, 4 de Junho de 2001

AtwK 1U

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (11)

1. -1 - REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de fórmula I OM I r° ÇH»_i- f Ί .N N-1 XI ç_DPhe-Cys-A-DTrp-LyE'Thr-Cy*-Thr-ol // O CH, I c=o I OM MO—C-CH, II o em que M é um catião, A é Tyr, na forma livre, forma de sal ou complexado com um radionuclido.
2. 2. Um composto de acordo coma reivindicação 1, em que o composto é complexado com 90Y.
3. 3. Um composto de acordo coma reivindicação 1, em que o composto é complexado com 161Tb.
4. 4. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes em que M é H\
5. 5. O uso de um composto de fórmula I de acordo com a reivindicação 1 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável na preparação de uma composição de radiofarmacêutica.
6. 6. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula I opcionalmente complexado com um radionuclido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em conjunto com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
7. 7. Uma composição de acordo com a reivindicação 6 compreendendo adicionalmente um estabilizante. J -··
8. 8. Uma composição de acordo com a reivindicação 7, em que o estabilizante é escolhido a partir do grupo consistindo em albumina do soro, ácido ascórbico, retinol, ácido gentísico ou um seu derivado, e uma solução de aminoácido.
9. 9. Um estojo ("kit") para utilização no tratamento da invasão de tumores ou sintomas associados com o desenvolvimento de tumores, positivos ao receptor da somatostatina, cujo estojo ("kit") inclui uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula I de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, complexado com um radionuclido ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e incluindo ainda pelo menos uma composição farmacêutica compreendendo um agente citostático.
10. 10. Uma composição farmacêutica para utilização no tratamento da invasão de tumores ou sintomas associados com o desenvolvimento de tumores, positivos ao receptor da somatostatina, incluindo um composto de fórmula I de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, complexado com um radionuclido ou um seu sal farmaceuticamente aceitável a ser administrado -3- em conjunto ou subsequentemente a uma solução de aminoácido com um elevado teor de lisina e/ou arginina.
11. 11. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10 a ser administrada em conjunto ou subsequentemente a uma solução de aminoácido com elevado teor de lisina. Lisboa, 4 de Junho de 2001 Atv»,, is c—.Lj ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA