PT707481E

PT707481E - Analogos de l-2',3'-didesoxinucleosido como agentes anti-hepatite b (hbv) e anti-hiv

Info

Publication number: PT707481E
Application number: PT94919207T
Authority: PT
Inventors: Tai-Shun Lin; Yung-Chi Cheng
Original assignee: Univ Yale
Priority date: 1993-05-25
Filing date: 1994-05-23
Publication date: 2001-02-28
Also published as: DE69425574D1; US5627160A; CN1100303A; EP0707481B1; CA2163520C; EP0707481A1; JP2004244422A; AU693795B2; ES2150993T3; JPH08510747A; GR3034379T3; WO1994027616A1; CA2163520A1; AU7043094A; ATE195423T1; KR100279953B1; DE69425574T2; EP0707481A4; DK0707481T3; HK1013257A1

Description

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DESCRIÇÃO

"Análogos de L-2',3'-Didesoxinucleósido como agentes Anti-Hepatite B (HBV) e

Anti-HIV" 0 presente invento refere-se a análogos de didesoxinucleósidos. Estes compostos exibem uma actividade significativa contra retrovírus e, em particular, contra o vírus da Hepatite B. O presente invento refere-se também a composições farmacêuticas contendo estes compostos e à sua utilização na preparação de medicamentos para utilização em métodos para inibir o crescimento ou a replicação do vírus da Hepatite B, bem como para o tratamento de infecções virais de Hepatite B em animais, em particular, em humanos.

Antecedentes do Invento A infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV) é um problema de saúde importante em todo o mundo. O HBV é um agente causador da hepatite, tanto na forma aguda como na forma crónica. Estima-se que mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo sejam portadores crónicos do HBV. O HBV pertence à família Hepadnaviridae, que inclui vários vírus relacionados que infectam principalmente pequenos roedores. Todos os membros da família dos hepadnavírus possuem um número de características em comum, tais como o aspecto morfológico, a constituição antigénica e a dimensão e estrutura do ADN. As constatações patológicas, após infecção com membros desta família, são bastante similares. Estudos mostram que a replicação e disseminação dos vírus desta família dependem da transcriptase inversa de um intermediário de ARN. O HBV é, ele próprio, um vírus de ADN de cadeia dupla. A sua ADN-polimerase catalisa ambas as sínteses de ARN dependente de ADN e dependente de ARN. O ciclo de vida do HBV envolve a enzima transcriptase inversa na replicação do seu ADN. Não existe actualmente nenhuma droga eficaz para o tratamento de uma infecção pelo HBV.

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ΕΡ 0 707 481/PT 2 A melhor defesa contra a infecção virai da Hepatite B é a vacinação. Contudo, mesmo com o advento de programas de imunização, a doença continua a ser um grave problema de saúde em todo o mundo. Ainda que as infecções virais agudas da Hepatite B sejam geralmente auto-limitantes, em muitos casos, a doença pode progredir para o estado crónico. Uma infecção virai de Hepatite B pode também criar um risco de hepatite fulminante. Adicionalmente, as infecções virais de Hepatite B estão intimamente associadas ao carcinoma hepatocelular. A presente terapia para o tratamento de infecções virais crónicas de Hepatite B inclui a administração do alfa-interferão e de vários análogos de nucleósido, tais como o adenina-arabinósido ou o seu monofosfato (ara-AMP). Estas abordagens terapêuticas têm tido um sucesso limitado. A utilização do AZT, do acilovir e do foscarnet (no caso da hepatite fulminante) para tratar a hepatite, tem também sido tentado com pouco, ou nenhum, sucesso. Têm sido noticiados na literatura vários análogos de 2',3'-didesoxinucleósido como exibindo uma potente actividade contra o vírus da Hepatite B em cultura. Em particular, os análogos de nucleósidos ( + ) e (-)-2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina ((+ SddC) têm mostrado ser potentes inibidores do vírus da Hepatite B e o isómero (-) é particularmente interessante na medida em que exibe uma toxicidade relativamente baixa conjuntamente com a sua potente actividade. 0 análogo 5-fluoro ((+ 5-FSddC) mostrou também exibir uma actividade potente. (Chang, et a/., Jour. Biol. Chem., 267, 222414, 1992 e Chang, et al., Jour. Biol. Chem.. 267, 1 3938, 1 992).

Outra doença virai que, recentemente, tem sido grandemente estudada e tratada com um sucesso apenas limitado é a SIDA. A SIDA é uma doença geralmente fatal causada por um retrovírus patogénico para humanos conhecido por vírus T-linfotrópico humano do tipo III (HTLV III), vírus associado à linfadenopatia (LAV) ou vírus da imunodeficiência humana (HIV).

Em comparação com os outros retrovírus T-linfotrópicos, HTLV I e II, o HTLV III (HIV) e os vírus da linfoadenopatia são vírus citopáticos não transformantes sem actividade imortalizante. Crê-se que o processo de replicação virai é um acontecimento importante no progresso da SIDA. Crê-se ainda que a enzima transcriptase inversa desempenha um papel essencial na

elaboração e no ciclo de vida do HIV e, consequentemente, no progresso da doença. Deste modo, crê-se que esta enzima pode ser um alvo particularmentè apropriado para o desenvolvimento de drogas potenciais contra a SIDA, devido à ausência de uma tal enzima numa célula hospedeira não infectada. Recentemente, investigadores têm estudado vários agentes antivirais como potenciais agentes anti-SIDA, incluindo a ribavirina e a suramina, entre outros. Vários nucleósidos têm desempenhado papéis importantes no tratamento de infecções por HIV. A 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT) é um exemplo importante, ainda que estudos recentes levantem algumas dúvidas quanto à sua eficácia. Vários análogos de 2',3'-didesoxinucleósido também exibiram uma actividade significativa contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV), incluindo a 3'-desoxi-2',3'-didesidrotimidina (D4T), o análogo carbocíclico da 2',3'-didesoxi-2\3,-didesidroguanosina (Carbovir), a 2',3'-didesoxicitidina (DDC), a 3'-azido-2',3'-didesoxiguanosina (AZG), a 2',3'-didesoxi-inosina (DDI), a 2,,3'-didesoxi-2',3'-didesidrocitidina (D4C), a S^fluoro-Z'^'-didesoxiadenosina, a 3'-fluoro-3'-desoxitimidina e a S^azido-Z'^'-didesoxiuridina. Ver Larder et ai, Antimicrob. Aaents Chemother., 34, 436 (1990). Alguns destes análogos, incluindo a ddC, são actualmente usados como agentes anti-HIV. Entre os didesoxinucleósidos, a ddC tem mostrado estar entre os inibidores mais potentes do HIV.

Ainda que os investigadores se tenham concentrado na determinação de um protocolo de tratamento eficaz contra o HBV e contra o HIV e já tenham sido sintetizados e caracterizados certos análogos de nucleósido potentes anti-HBV e anti-HIV, não foi ainda encontrada uma droga ideal.

Um principal problema na optimização de um protocolo de tratamento contra infecções retrovirais, incluindo as do HBV e do HIV, é proporcionar uma actividade antiviral aceitável, minimizando ao mesmo tempo a toxicidade para a célula hospedeira, bem como os efeitos anti-ADN mitocondrial que muitos dos presentes nucleósidos antivirais exibem. O presente invento refere-se a nucleósidos sintéticos que exibem uma potente actividade antiviral (em particular, actividade anti-HBV e anti-HIV) com uma toxicidade significativamente reduzida para a célula hospedeira. Em contraste com os compostos da arte anterior, os análogos do presente invento

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ΕΡ 0 707 481/PT 4 representam uma abordagem de terapêutica médica viável às infecções por HBV e uma abordagem melhorada à inibição do HIV e ao tratamento da SIDA.

Breve Descricão do Invento O presente invento refere-se à surpreendente verificação de que certos análogos de didesoxinucleósidos, que contêm uma porção didesoxirribofuranosilo possuindo uma configuração L (em oposição à configuração D de ocorrência natural), exibem uma actividade inesperada contra o vírus da Hepatite B (HBV). Em particular, os compostos do presente invento exibem uma inibição potente da replicação do vírus em combinação com uma toxicidade muito baixa para as células hospedeiras (isto é, de tecido animal ou humano). Este é um resultado inesperado.

Os compostos de acordo com o presente invento exibem uma utilidade principal como agentes para a inibição do crescimento ou da replicação do HBV, do HIV e de outros retrovírus, muito preferivelmente, do HBV. Alguns destes agentes podem também ser úteis para a inibição do crescimento ou da replicação de outros vírus ou para o tratamento de outras infecções virais, de certos tipos de infecções fúngicas, infecções microbianas e/ou estados de doença relacionados. Adicionalmente, alguns destes agentes podem ser úteis como intermediários para a produção ou síntese de espécies químicas relacionadas.

Os compostos do presente invento encontram utilização particular no combate a infecções virais que afectam animais e, em particular, humanos sofrendo de infecções pelo vírus da Hepatite B. Os compostos de acordo com o presente invento oferecem um grande potencial como agentes terapêuticos contra um estado de doença (infecção crónica por HBV) para o qual existem presentemente poucas opções terapêuticas reais. Os compostos de acordo com o presente invento podem ser usados sozinhos ou em combinação com agentes ou com outros tratamentos terapêuticos.

Os compostos do presente invento são análogos de didesoxinucleósidos que contêm uma porção didesoxirribofuranosilo possuindo uma configuração L (em contraste com a configuração D natural da porção açúcar). São revelados compostos de acordo com o presente invento que contêm bases de ácido

85 032 ΕΡ Ο 707 481/ΡΤ 5 nucleico naturais e sintéticas, incluindo adenina, guanina, citosina, timina e uracilo e derivados substituídos destas bases. Os compostos do presente invento podem também conter certas modificações da porção ribofuranosilo. O presente invento refere-se também a composições para utilização na inibição do crescimento ou da replicação do HBV compreendendo uma quantidade ou concentração inibidora eficaz de pelo menos um dos análogos de L-2',3'-didesoxinucleósido revelados. Estas composições podem ser usadas em testes comparativos, tais como em ensaios para determinação das actividades de compostos anti-HBV relacionados, bem como para a determinação da susceptibilidade de uma infecção por HBV de um paciente em relação a um dos compostos de acordo com o presente invento. As composições do presente invento podem também ser usadas no tratamento de infecções virais. O presente invento refere-se também a composições para utilização na inibição do crescimento ou da replicação do HIV, compreendendo uma quantidade ou concentração inibidora eficaz de 1-(2,3-didesidro-2,3-didesoxi-beta-L-ribofuranosil)-5-fluorocitosina. Estas composições podem ser usadas em testes comparativos, tais como em ensaios para determinação das actividades de compostos anti-HIV relacionados, bem como para a determinação da susceptibilidade de uma infecção por HIV de um paciente em relação ao composto. As composições do presente invento podem também ser usadas no tratamento de infecções virais.

As composições farmacêuticas baseadas nestes novos compostos químicos compreendem os compostos anteriormente descritos numa quantidade terapeuticamente eficaz para o tratamento de uma infecção virai, preferivelmente de uma infecção pelo vírus da Hepatite B e, em certos casos, de uma infecção pelo HIV, opcionalmente em combinação com um aditivo, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Alguns dos compostos, na forma de uma dosagem farmacêutica, podem ser usados como agentes profilácticos para inibição do crescimento ou da replicação da infecção virai. Estes podem ser particularmente apropriados como agentes anti-HBV ou anti-HIV. Em certas formas de dosagem farmacêutica, preferem-se as formas de prodroga dos compostos de acordo com o presente invento.

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Sem querer estar limitado pela teoria, crê-se que os compostos de acordo com o presente invento induzem o seu efeito inibidor no crescimento ou na replicação do HBV ou do HIV, funcionando como antimetabolitos da enzima transcriptase inversa do HBV ou do HIV.

Os compostos de acordo com o presente invento são produzidos por métodos sintéticos que são facilmente conhecidos dos vulgares peritos na arte e incluem vários métodos de síntese química.

Breve Descrição das Figuras

As Figuras 4-11 (Esquemas 4-11) ilustram os passos de síntese química que são usados para sintetizar os compostos de acordo com o presente invento. Os esquemas relativos à síntese de uma composição particular são referenciados nos exemplos aqui apresentados.

Descricão Detalhada do Presente Invento

As definições seguintes serão usadas ao longo de todo o fascículo para descrever o presente invento. O termo "didesoxi" é usado ao longo de todo o fascículo para descrever porções ribofuranosilo que contêm hidrogénios em vez de hidroxilos nas posições 2' e 3' do açúcar nos presentes compostos. O termo "didesidro" é usado ao longo de todo o fascículo para descrever porções ribofuranosilo que contêm uma ligação dupla. Por exemplo, 2',3'-desidro refere-se a uma porção ribofuranosilo contendo uma ligação dupla entre os carbonos 2' e 3' do açúcar. A expressão "concentração inibidora eficaz" ou "quantidade inibidora eficaz" é usada ao longo de todo o fascículo para descrever concentrações ou quantidades de compostos de acordo com o presente invento que inibem substancialmente ou apreciavelmente o crescimento ou a replicação de vírus susceptíveis, incluindo especialmente o HBV ou o HIV.

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ΕΡ 0 707 481/PT 7 A expressão "quantidade terapêutica eficaz" é usada ao longo de todo o fascículo para descrever concentrações ou quantidades de compostos de acordo com o presente invento que são terapeuticamente eficazes no tratamento de infecções retrovirais e, em particular, de infecções por HBV ou por HIV em humanos. A expressão "configuração L" é usada ao longo de todo o fascículo para descrever a configuração química da porção didesoxirribofuranosilo dos compostos de acordo com o presente invento. A configuração L da porção açúcar dos compostos do presente invento contrasta com a configuração D das porções de açúcar ribose dos nucleósidos de ocorrência natural citidina, adenosina, timidina, guanosina e uridina. O presente invento refere-se à surpreendente verificação de que certos análogos de didesoxinucleósidos que contêm uma porção didesoxirribofuranosilo possuindo uma configuração L (em oposição à configuração D de ocorrência natural) exibem uma actividade inesperada contra o vírus da Hepatite B (HBV). Em particular, os compostos de acordo com o presente invento exibem uma potente inibição da replicação do vírus em combinação com uma toxicidade muito baixa em relação às células hospedeiras (isto é, de tecido animal ou humano). 0 presente invento refere-se também à verificação inesperada de que o composto 1-(2,3-didesoxi-beta-L-ribofuranosil)-5-fluorocitosina (β-L-FddC) é um agente anti-HIV extremamente eficaz, exibindo uma toxicidade relativamente baixa, especialmente quando comparado com a 1-(2,3-didesoxi-beta-D-ribofuranosil)citosina (didesoxicitidina ou ddC) que é presentemente usada como um dos compostos anti-HIV mais eficazes presentemente disponíveis. O facto de a (β-L-FddC) exibir esta actividade excepcional anti-HIV e uma toxicidade relativamente limitada em relação ao hospedeiro é um resultado inesperado, especialmente quando comparada com a actividade anti-HIV de compostos similares. O presente invento refere-se a uma composição para utilização na inibição do crescimento ou da replicação do vírus da Hepatite B compreendendo uma

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ΕΡ 0 707 481/PT 8 concentração inibidora eficaz de um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura: nh2

0

OH O presente invento refere-se também a uma composição para utilização no tratamento de um paciente sofrendo de uma infecção causada pelo vírus da imunodeficiência humana compreendendo uma concentração terapeuticamente eficaz de um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura: NHcí N:

cl r0H 0 presente invento refere-se também a um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura: onde X é H, F, Cl, Br, I, CH3í 0

-C=CH, -HC = CH2 ou 'C = C

Br /

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Neste composto, X é preferivelmente H, F ou CH3, muito preferivelmente, ch3. 0 presente invento refere-se também a um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura:

onde B é

R' é H ou CH3; R" é H ou CH3; Y" é H, F, Br, Cl ou NHZ quando R' e R" são H e Y" é H quando pelo menos um de R' e R" é CH3; e Z é H ou NH2.

Neste composto, R' e R" são preferivelmente H e Y" é preferivelmente H ou F, muito preferivelmente Η. Z é preferivelmente NH2. O presente invento refere-se também a um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura:

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ΝΗ2 Τ Ν

Ν Ν Ν > ( Ο Γ0Η ΝΙ / onde Τ é F, Cl, Br ou NH2. 0 presente invento refere-se também a um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura: 0

onde W é H ou NH2. O presente invento refere-se também a uma composição para utilização na inibição do crescimento ou da replicação do vírus da Hepatite B compreendendo uma concentração inibidora eficaz de um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura:

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ΝΗ2

onde Τ é Η, F, Cl, Br ou NH2.

Preferivelmente, T é H.

Os compostos de acordo com o presente invento são principaimente úteis pela sua actividade anti-retroviral e, em particular, pela sua actividade anti-HBV ou anti-HIV. Os presentes compostos podem também ser úteis pela sua actividade biológica como agentes anti-fúngicos ou anti-microbianos. Adicionalmente, estas composições podem também encontrar utilização como intermediários na síntese química de outros nucleósidos ou análogos de nucleósidos que, por sua vez, são úteis como agentes terapêuticos ou para outros propósitos. Preferivelmente, estas composições encontram utilização como novos agentes anti-HBV e, adicionalmente, no caso do β-L-FddC, também como um novo agente anti-HIV.

De um modo geral, os compostos antivirais, especialmente anti-HBV ou anti-HIV, mais preferidos, de acordo com o presente invento, incluem aqueles que são menos citotóxicos para as células hospedeiras e mais activos para o vírus alvo. Alguns dos compostos, numa forma de dosagem farmacêutica, podem ser usados como agentes profilácticos. Estes podem ser particularmente apropriados como agentes antivirais e, em particular, como agentes anti-HBV ou como agentes anti-HIV. Devido à sua muito baixa toxicidade para o paciente, a β-L-FddC é um composto anti-profiláctico especialmente eficaz para a inibição do HIV e para a prevenção da SIDA.

Os compostos de acordo com o presente invento são produzidos por métodos de síntese que são facilmente conhecidos dos vulgares peritos na arte

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e incluem vários métodos de síntese química, conforme de descreve de um modo significativamente mais detalhado nos Exemplos que se seguem. De um modo geral, os compostos de acordo com o presente invento são sintetizados por condensação de uma base de nucleósidos, previamente sintetizada, no "sintão" de açúcares apropriado que, finalmente, dará origem a um análogo de nucleósido possuindo a porção didesoxirribofuranosilo desejada de configuração L. Em certos casos, o percurso sintético pode-se desviar do percurso sintético geral para um análogo de nucleósido específico (por exemplo, no caso da 1-(2,3-didesoxi-beta-L-ribofuranosil)citosina e 1 -(2,3-didesoxi-beta-L- ribofuranosiburacilo, tal como se descreve no Exemplo 1 e no Esquema 3.

Durante a síntese química das várias composições de acordo com o presente invento, um vulgar perito na arte será capaz de praticar o presente invento sem experimentação indevida. Em particular, um vulgar perito na arte reconhecerá os vários passos que devem ser realizados para introduzir um substituinte particular na posição desejada da base ou um substituinte na posição desejada da porção açúcar. Adicionalmente, os passos químicos que são realizados para "proteger" grupos funcionais, tais como grupos hidroxilo ou amino, entre outros, bem como para "desproteger" estes mesmos grupos funcionais, serão reconhecidos como apropriados nas circunstâncias das sínteses. O presente invento pode ser usado em métodos para o tratamento de infecções retrovírais em pacientes animais ou humanos, em particular, de infecções por HBV e por HIV em humanos, por administração de quantidades antivirais eficazes dos compostos para inibir o crescimento ou a replicação dos vírus no paciente animal ou humano que está a ser tratado.

As composições farmacêuticas baseadas nestes novos compostos químicos compreendem os compostos anteriormente descritos numa quantidade terapeuticamente eficaz para o tratamento de uma infecção virai, preferivelmente, de uma infecção pelo vírus da Hepatite B ou pelo HIV, opcionalmente, em combinação com um aditivo, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um vulgar perito na arte reconhecerá que uma quantidade terapeuticamente eficaz variará com a infecção ou com a condição que está a ser tratada, com a sua gravidade, com o regime de tratamento a ser

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ΕΡ 0 707 481/PT 13 utilizado, com a farmacocinética do agente usado, bem como com o paciente (animal ou humano) que está a ser tratado.

No aspecto farmacêutico de acordo com o presente invento, o composto de acordo com o presente invento é formulado, preferivelmente, em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável. De um modo geral, é preferível administrar a composição farmacêutica numa forma administrável oralmente, mas certas formulações podem ser administradas através da via parentérica, intravenosa, intramuscular, transdérmica, bucal, subcutânea, supositório ou outra. As formulações intravenosas ou intramusculares são preferivelmente administradas numa solução salina esterilizada. Claro que um vulgar perito na arte pode modificar as formulações, dentro dos ensinamentos do fascículo, para proporcionar numerosas formulações para uma via de administração particular, sem tornar as composições do presente invento instáveis ou sem comprometer a sua actividade terapêutica. Em particular, a modificação dos presentes compostos para os tornar mais solúveis em água ou noutro veículo, por exemplo, pode ser facilmente conseguida por modificações menores (formulação em sal, esterificação, etc.) que são bem conhecidas de um vulgar perito na arte. É também conhecido na prática de rotina modificar a via de administração e o regime de dosagem de um composto particular de modo a gerir a farmacocinética dos presentes compostos para um efeito benéfico máximo nos pacientes.

Em certas formas de dosagem farmacêutica, prefere-se a forma de prodroga dos compostos, especialmente incluindo derivados acilados (acetilados ou outros), ésteres de piridina e várias formas de sal dos presentes compostos. Um vulgar perito na arte reconhecerá como modificar facilmente os presentes compostos em formas de prodroga, para facilitar a entrega dos compostos activos a um sítio alvo no organismo hospedeiro ou paciente. O utilizador de rotina tirará também vantagem dos parâmetros farmacocinéticos favoráveis das formas de prodroga, conforme aplicável, na entrega dos presentes compostos a um sítio alvo no organismo hospedeiro ou no paciente para maximizar o efeito pretendido do composto. A quantidade de composto incluído nas formulações terapeuticamente activas, de acordo com o presente invento, é uma quantidade eficaz para o tratamento da infecção ou da condição, na sua concretização mais preferida, de 14 85 032 ΕΡ 0 707 481/PT uma infecção por HBV ou, no caso da β-L-FddC, de uma infecção por HIV. De um modo geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz do presente composto numa forma de dosagem está, usualmente, na gama desde ligeiramente menos do que cerca de 1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg do paciente ou consideravelmente mais, dependendo do composto usado, da condição ou infecção tratada e da via de administração. No caso das infecções por HBV, o composto é administrado preferivelmente em quantidades na gama de cerca de 1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg. No caso da utilização da β-L-FddC como agente anti-HIV, o composto é administrado preferivelmente numa quantidade na gama de cerca de 1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, dependendo da farmacocinética do agente no paciente. Esta gama de dosagem produz geralmente concentrações eficazes do composto activo no fluxo sanguíneo de cerca de 0,04 a cerca de 100 microgramas/cm3 de sangue no paciente. A administração do composto activo pode variar desde a administração contínua (gotejamento intravenoso) até várias administrações orais por dia (por exemplo, Q.I.D.) e pode incluir a administração oral, tópica, parentérica, intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica (que pode incluir um agente de melhoria da penetração), bucal e por supositório, entre outras vias de administração.

Para preparar as composições farmacêuticas de acordo com o presente invento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos compostos, de acordo com o presente invento, é preferivelmente intimamente misturada com um transportador farmaceuticamente aceitável, de acordo com as técnicas farmacêuticas de formulação convencionais, para produzir uma dose. Um transportador pode tomar uma vasta variedade de formas dependendo da forma de preparação pretendida para administração, por exemplo, oral ou parentérica. Na preparação de composições farmacêuticas numa forma de dosagem oral, podem-se usar quaisquer dos meios farmacêuticos usuais. Assim, para preparações orais líquidas, tais como suspensões, elixires e soluções, podem-se usar transportadores e aditivos adequados incluindo água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes e similares. Para preparações orais sólidas, tais como pós, comprimidos, cápsulas, e para preparações sólidas, tais como supositórios, podem-se usar transportadores e aditivos adequados incluindo amidos, açúcares transportadores, tais como dextrose, manitol, lactose e transportadores

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ΕΡ 0 707 481 /PT 15 relacionados, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, agentes de desintegração e outros. Se desejado, os comprimidos ou cápsulas podem ter revestimentos entéricos ou ser de libertação sustentada, conforme as técnicas convencionais.

Para formulações parentéricas, o transportador compreenderá usualmente água ou solução aquosa de cloreto de sódio esterilizadas, ainda que possam também ser incluídos outros ingredientes, incluindo auxiliares de dispersão. Claro que, quando se usa água esterilizada e se pretende manter a esterilidade, as composições e transportadores têm também de ser esterilizados. Podem-se também preparar suspensões injectáveis, caso em que se podem utilizar os apropriados transportadores líquidos, agentes de suspensão e similares.

Em concretizações particularmente preferidas de acordo com o presente invento, os compostos e composições são utilizados na preparação de medicamentos para utilização no tratamento de infecções retrovirais de mamíferos e, em particular, de humanos. Na sua concretização mais preferida, os compostos são utilizados para tratar infecções pelo HBV, incluindo a infecção crónica pelo HBV. O composto β-L-FddC é utilizado eficazmente na preparação de medicamentos para utilização no tratamento de infecções pelo HIV, incluindo a SIDA. Geralmente, para tratar infecções pelo HBV e pelo HIV, as composições serão administradas preferivelmente numa forma de dosagem oral em quantidades na gama de cerca de 250 microgramas até cerca de 500 mg ou mais, até quatro vezes ao dia. Os presentes compostos são administrados preferivelmente por via oral, mas podem ser administrados parentericamente, topicamente ou na forma de supositório.

Devido à sua toxicidade inesperadamente baixa para as células hospedeiras, os compostos de acordo com o presente invento podem ser vantajosamente utilizados profilacticamente para prevenir a infecção ou para prevenir a ocorrência de sintomas clínicos associados à infecção virai. Assim, o presente invento abrange também a utilização destes compostos na preparação de medicamentos para utilização no tratamento terapêutico ou profiláctico de infecções virais e, em particular, de infecções pelo HBV ou pelo HIV. Este método profiláctico compreende a administração a um paciente, que necessite de um tal tratamento, de uma quantidade de um composto de acordo com o presente invento eficaz para o alívio e/ou prevenção da infecção virai. No 16 85 032 ΕΡ 0 707 481/PT tratamento profiláctico, prefere-se que o composto antiviral utilizado seja de baixa toxicidade e, preferivelmente, não tóxico para o paciente. Neste aspecto do presente invento, é particularmente preferido que o composto que é usado seja maximamente eficaz contra o vírus e exiba um mínimo de toxicidade para o paciente. No caso do β-L-FddC, este composto pode ser administrado dentro da mesma gama de dosagem que para o tratamento terapêutico (isto é, de cerca de 250 microgramas até cerca de 500 mg, de uma a quatro vezes ao dia para uma forma de dosagem oral) como agente profiláctico para prevenir a rápida proliferação do HIV ou, alternativamente, para adiar o início da SIDA num paciente.

Adicionalmente, os compostos de acordo com o presente invento podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes, especialmente incluindo outros compostos do presente invento. Certos compostos de acordo com o presente invento podem ser eficazes na melhoria da actividade biológica de certos agentes de acordo com o presente invento, por redução do metabolismo ou inactivação de outros compostos e, como tal, são co-administrados para este efeito pretendido. No caso do β-L-FddC, este composto pode ser eficazmente combinado com qualquer um ou mais dos agentes anti-HIV convencionais que são presentemente utilizados, incluindo o AZT, o DDC e o DDI, entre outros.

Numa composição farmacêutica particularmente preferida e num método para utilização no tratamento de infecções por HBV, é proporcionada uma quantidade inibidora eficaz de 1 -(2,3-didesidro-2,3-didesoxi-beta-L-ribofuranosil)-5-fluorocitosina para administração a um paciente sofrendo de uma infecção por HBV para aliviar os sintomas de uma tal infecção.

Numa composição farmacêutica particularmente preferida e num método para utilização no tratamento de infecções por HIV, é proporcionada uma quantidade inibidora eficaz de 1 -(2,3-didesidro-2,3-didesoxi-beta-L-ribofuranosil)-5-fluorocitosina para administração a um paciente sofrendo de uma infecção por HIV e/ou de SIDA, para aliviar os sintomas de uma tal infecção.

Sem querer estar limitado pela teoria, crê-se que os compostos de acordo com o presente invento induzem principalmente o seu efeito inibidor no

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ΕΡ 0 707 481/PT 17 crescimento ou na replicação do HBV ou do HIV funcionando com antimetabolitos da enzima transcriptase inversa do vírus. O presente invento será agora descrito, apenas a título de ilustração, nos exemplos seguintes.

EXEMPLOS I. Síntese Química de Análogos de L-2',3'-didesoxinucleósido Exemplos 1-8

De um modo geral, os compostos do presente invento são sintetizados de acordo com o método de síntese química aqui a seguir descrito. A metodologia de síntese química utilizada para sintetizar os presentes compostos representa modificações de procedimentos da literatura. Nos exemplos seguintes indicam-se as referências a partir das quais uma reacção química relacionada foi modificada para produzir os presentes compostos.

Os pontos de fusão foram determinados usando um equipamento MelTemp e não estão corrigidos. Os espectros de RMN de protão foram registados num instrumento Varian EM390 ou Bruker WM 250 e são apresentados em ppm (delta) no sentido de campo descendente em relação ao (CH3)4Si. Os espectros de ultravioleta foram registados num espectrofotómetro Beckman 25. A cromatografia em camada fina (TLC) analítica foi realizada usando placas pré-revestidas Silica Gel Merck EM 60 F254. A cromatografia em coluna utilizou sílica gel Merck EM usando solventes orgânicos convencionais (CH2CI2/MeOH ou CH2CI2/EtOAc com relações volume/volume variáveis), a não ser onde se indique de outro modo, principalmente para separar as misturas anoméricas alfa e beta. 18 85 032 ΕΡ 0 707 481/PT EXEMPLO 1 2',3'-didesoxi-, 2\3'-didesoxi-N-metil- e 2',3'-didesoxi-N,N-dimetil-beta-L-adenosina, e 2',3'-didesoxi-L-inosina e 2',3'-didesoxi-beta-L-guanosina A síntese de 2',3'-didesoxi-, 2'r3'-didesoxi-6-N-metil- e 2',3'-didesoxi-N,N-dimetil-beta-L-adenosina, e de 2',3'-didesoxi-beta-L-inosina e 2',3'-didesoxi-beta-L-guanosina (ver Esquema 4) foi baseada na metodologia noticiada por Fujimori et a/. (Nucleoside & Nucleotides. 11, 341, 1992) para a síntese de 2'-desoxinucleósidos de purina. O tratamento de 6-cloropurina com NaH (60% em óleo, lavado com n-hexano) e com o acetato 7 em acetonitrilo anidro sob árgon produziu a 6-cloro-9-[(5-0-terc-butildimetilsilil)-2,3-didesoxi-beta-L-eritropentofuranosiljpurina (26) conjuntamente com o isómero N-7 glicosilo correspondente, que foi separado por cromatografia em sílica gel. Por tratamento subsequente do composto 26 com NH3/CH3OH, CH3NH2/CH3OH ou (CH3)2NH/CH3OH a temperatura elevada, seguido por desprotecção com fluoreto de tetra-n-butilamónio em THF, obtiveram-se a 2',3'-didesoxi-L-adenosina (27, R = R' = H), a 2',3'-didesoxi-N-metil-beta-L-adenosina (27, R = H, R' = CH3) e a 2\3'-didesoxi-N,N-dimetil-beta-L-adenosina (27, R = R' = CH3), respectivamente. Por tratamento do composto 26 com fluoreto de tetra-n-butilamónio em THF, seguido de hidrólise alcalina do nucleósido desbloqueante (28) com KOH 2N/dioxano (1:1, v/v), obteve-se a 2',3'-didesoxi-L-inosina (29). Similarmente, por tratamento da 2-amino-6-cloropurina com NaH (60% em óleo, lavado com n-hexano) e com o acetato 7 em acetonitrilo anidro sob árgon, obteve-se a 2-amino-6-cloro-9-[(5-0-terc-butildimetilsilil)-2,3-didesoxi-beta-L-eritropentofuranosil] purina (30). A conversão do composto 30 no produto final, 2',3'-didesoxi-beta-L-guanosina (32), foi conseguida através do intermediário 31, por desbloqueamento com fluoreto de tetra-n-butilamónio em THF e hidrólise alcalina com KOH 2N/ dioxano (1:1, v/v). EXEMPLO 2 2-cloro-, 2-bromo-, 2-amino- e 2-fluoro-2',3'-didesoxi-beta-L-adenosina

Estes compostos foram sintetizados conforme se descreve no Esquema 5 pela metodologia utilizada no Exemplo 1. A 2,6-dicloropurina, preparada pelo método descrito por Elion e Hitching (J. Am. Chem. Soe., 78, 3508, 1956) foi

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ΕΡ 0 707 481/PT 19 tratada com NaH (60% em óleo, lavado com n-hexano) e com o acetato 7 em acetonitrilo anidro sob árgon, obtendo-se a 2,6-dÍcloro-9-[(5-0-terc-butildimetilsilil)-2,3-didesoxi-beta-L-eritropentofuranosil]purina (33) e o isómero N-7 glicosilo correspondente, que foi separado por cromatografia em sílica gel. Por tratamento do composto (33) com NH3/CH3OH a temperatura elevada, seguido por desprotecção com fluoreto de tetra-n-butilamónio em THF, obteve-se a 2-cloro-2',3'-didesoxi-L-adenosina (34). O tratamento da dibromopurina com NaH (60% em óleo, lavado com n-hexano) e com o acetato 7, em acetonitrilo anidro sob árgon, produziu a 6-bromo-9-[(5-0-terc-butildimetilsilil)-2,3-didesoxi-beta-L-eritropentofuranosil]purina (31) conjuntamente com o isómero N-7 glicosilo correspondente, que foi separado por cromatografia em sílica gel. Por tratamento subsequente do composto 31 com NH3/CH3OH a temperatura elevada, seguido por desprotecção com fluoreto de tetra-n-butilamónio em THF, obteve-se a 6-bromo-(2,3-didesoxi-beta-L-eritropentofuranosiDpurina (41). Tratou-se 2,6-bis(benzamido)purina, preparada pelo método descrito por Davoll e Lowy (J. Am. Chem. Soc., 73, 1650, 1951), com NaH (60% em óleo, lavado com n-hexano) e com o acetato 7, em acetonitrilo anidro sob árgon, produzindo-se a 2,6-bis(benzamido)-9-[(5-0-terc-butildimetilsilil)-2,3-didesoxi-beta-L-eritropentofuranosil]purina (37), que foi subsequentemente desbloqueada por reacção com fluoreto de tetra-n-butilamónio em THF e com etóxido de sódio em etanol obtendo-se a 2-amino-2',3'-didesoxi-beta-L-adenosina (38). Por tratamento do composto 38 com nitrito de sódio e com ácido fluorobórico a 48-50% abaixo de -10°C, obteve-se a 2-fluoro-2',3'-didesoxi-beta-L-adenosina (39). EXEMPLO 3 (1 -(2,3-didesidrodidesoxi-beta-L-ribofuranosil)citosina, -(2,3-didesidrodidesoxi-beta-L-ribofuranosil)-5-fluoro-, -5-bromo-, -5-cloro-, -5-iodo- e -5-metilcitosina

Estes compostos foram sintetizados como se descreve no Esquema 6 por uma metodologia desenvolvida para as sínteses dos isómeros D relacionados (Lin et al.f Biochem. Pharmacol., 36, 311,1987; Lin et ai, Oraanic Preparations and Procedures Intl., 22, 265, 1990). Por tratamento da 2'-desoxi-L-uridina (40, R = H), que foi preparada pelo procedimento de Holy (Collection Czechoslov. Chem. Commun., 37, 4072, 1972), com 2 equivalentes de cloreto de metanossulfonilo em piridina seca a -5-0°C, obteve-se o derivado 3',5'-di-0- 20 85 032 ΕΡ 0 707 481/PT mesilo (41, R = Η). A conversão do composto 41 (R= H) na 2,-desoxi-3’,5’-epoxi-beta-L-uridina (43, R = H) através do intermediário anidronucleósido 42 (R = H) foi realizada por tratamento com NaOH 1 N de acordo com o procedimento de Horwitz et al. (J. Oro. Chem.. 32, 817, 1967), Por tratamento do composto 43 (R = H) com 1,2,4-triazolo e com fosforodicloridrato de 4-clorofenilo em piridina seca, obteve-se a 4-triazolilpirimidinona 44 (R = H), que se fez depois reagir com NH4OH/dioxano para dar o derivado de citidina 45 (R = H). Por tratamento do composto 45 (R = H) com t-butóxido de potássio em DMSO, obteve-se o produto final 1 -(2,3-didesidro-2,3-didesoxi-beta-L-ribofuranosibcitosina (46, R = H): RMN-1H (DMSO-d6) delta 3,50 (m, 2H, 5'-H), 4,72 (m, 1 H, 4’-H), 4,92 (s largo, 1H, 5’-0H, D20 permutável), 5,64 (d, 1H, 5-H), 5,83 (m, 1H, 3'-H), 6,30 (m, 1 H, 2'-H), 6,85 (m, 1H, 1’-H), 7,09-7,15 (d largo, 2H, 4-NH2, D20 permutável), 7,64 (d, 1H, 6-H). EXEMPLO 4 2',3'-didesidro-2',3'-didesoxi-beta-L-adenosina A 2',3'-didesidro-2',3'-didesoxi-beta-L-adenosina (51) foi sintetizada como se mostra no Esquema 7 pela metodologia de Barton et al. (Tetrahedron, 49, 2793, 1993) e de Chu et al. (J, Orq. Chem., 54, 2217, 1989) para a preparação do isómero D. Por tratamento da L-adenosina (47) com cloreto de terc-butildimetilsililo e imidazole em DMF seca, com remoção de humidade, durante 20 h, obteve-se a 5'-0-(terc-butildimetilsilil)-beta-L-adenosina (48), que se fez depois reagir com CS2, solução de NaOH 5 N, e com CH3I em DMSO para dar o derivado de 2',3'-0-bis(ditiocarbonato) 49. Por desoxigenação de 49 com trietilsilano e com peróxido de benzoilo sob árgon, seguida por desprotecção do derivado de olefina 50 com fluoreto de tetra-n-butilamónio em THF, obteve-se o produto final 51. A síntese dos análogos correspondentes 2’,3'-didesidro-2',3,-didesoxi-beta-L-guanosina e 2',3,-didesidro-2',3’-didesoxi-beta-L-inosina seguiu o mesmo procedimento que anteriormente, a partir da L-guanosina e da L-inosina, respectivamente.

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ΕΡ 0 707 481/PT EXEMPLO 5 1 -(2,3-didesoxi-4-tio-beta-L-ribofuranosil)citosina, 1 -(2,3-didesoxi-4-tio-beta-L- \ ribofuranosil)-5-fluoro-, -5-cloro-, -5-bromo-, -5-iodo- e -5-metilcitosina A metodologia de Secrist et al. (J. Med. Chem., 35, 533, 1 992) para a síntese de 2',3'-didesoxi-4'-tio-D-nucleósidos proporcionou um exemplo útil para a nossa abordagem sintética à síntese de análogos de 1-2',3,-didesoxi-4'-tio-beta-L-nucleósidos (ver Esquema 8).

Tratou-se o ácido D-glutâmico (1) com nitrito de sódio em ácido clorídrico para produzir o ácido (R)-1,4-butirolactona-4-carboxílico (2). O composto 2 foi depois reduzido pelo complexo borano-sulfureto de dimetilo em THF, para dar a (R)-4-(hidroximetil)-4-butirolactona (4) correspondente, que foi subsequentemente tratada com cloreto de terc-butildifenilsililo em diclorometano, usando imidazolo como catalisador, para dar a (R)-5-0-terc-butildifenilsilil-4-(hidroximetil)-1,4-butirolactona (53). A lactona protegida 53 foi aberta com hidróxido de sódio em etanol e depois convertida no éster de metilo do ácido 5-[(terc-butildifenilsilil)oxi]-4-(R)-hidroxipentanóico (54) por reacção com sulfato de dimetilo em dimetilsuifóxido. O composto 54 foi transformado no éster de metilo do ácido 5-[(terc-butildifenilsilil)oxi]-4-(S)-iodopentanóico (55) por tratamento com trifenilfosfina, imidazolo e iodo. A substituição do grupo iodo no composto 55 por tioacetato em tolueno ocorreu facilmente para dar o éster de metilo do ácido 4-(R)-(acetiltio)-5-[(terc-butildifenilsilil)oxi]pentanóico (56) . O composto 56 foi depois tratado com 2 equivalentes de hidreto de di-isobutilalumínio (DIBAL) em tolueno para desproteger redutivamente o enxofre e reduzir o éster de metilo a um aldeído, produzindo-se desse modo o tiolactol por ciclização espontânea. O tiolactol foi acetilado com anidrido acético em piridina para dar a 1-0-acetil-5-0-(terc-butildifenilsilil)-2,3-didesoxi-4-tio-L-ribofuranose (57) : ΒΜΝ-'Η (CDCI3) delta 7,67 (m, 4H, ArH), 7,40 (m, 6H, ArH), 6,10 (m, 1 Η, 1-H), 3,70 (m, 1H, 4-H), 3,52 (m, 2H, 5-H), 2,20 (m, 2H, CH2), 2,00 (2 s, 3H, CH33CO-), 1,92 (m, 2H, CH2), 1,08 (s, 9H, terc-butilo). A citosina, a 5-fluorocitosina e os outros derivados de citosina substituídos em 5 foram acoplados com o acetato 57 pela metodologia de Vorbruggen e Bennua (J. Ora. Chem., 39, 3654, 1974) com modificações. Agitou-se uma mistura de citosina (0,42 g, 3,80 mmol), hexametildi-silazano

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ΕΡ 0 707 481/PT 22 (HMDS, 0,54 ml, 2,52 mmol), clorotrirpetiisilano (TMSCI), 1,48 ml, 11,6 mmol), nonafluorobutanossulfonato de potássio (3,08 g, 8,9 mmol) e o acetato 57 (1,04 g, 2,52 mmol) em acetonitrilo seco, à temperatura ambiente, de um dia para o outro, obtendo-se 0,65 g (55%) de 1 -[5-0-(terc-butildifenilsilil)-2,3-didesoxi-4-tio-alfa,beta-L-ribofuranosil]citosina (58, X = H) na forma de uma mistura alfa/beta 4:3. Os anómeros alfa e beta foram separados por cromatografia em coluna de sílica gel. Por desprotecção de 58 (anómero beta) obteve-se a 1-(2,3-didesoxi-4-tio-beta-L-ribofuranosil)citosina (59, X = H) com um rendimento de 60%. EM m/e 228 (M + +1); RMN-1H (DMSO-d6) delta 8,05 (d, 1H, H-6), 7,08 (d largo, 2H, NH2, D20 permutável), 6,10 (m, 1H, 1'-H), 5,70 (d, 1H, H-5), 5,20 (d largo, 1H, 5’-OH, D20 permutável), 3,58 (m, 1H, 5'-H), 3,52 (m, 2H, 4’-H e 5’-H), 2,20 (m, 1H, 2'-H), 2,04 (m, 2H, 2'-H e 3'-H), 1,88 (m, 1 H, 3'-H). EXEMPLO 6 1-(2,3-didesoxi-4-tio-beta-L-ribofuranosil)-5-metil-, -5-etil-, -5-vinil-, -5-bromovinil-, -5-etinil-, -5-fluoro-, -5-cloro-, -5-bromo-, -5-iodouracilo e 1-(2,3-didesoxi-4-tio-beta-L-ribofuranosil)uracilo A timina, o uracilo, o -5-etil-, -5-vinil-, -5-bromovinil-, -5-etinil-, -5-fluoro-, -5-cloro-, -5-bromo-, -5-iodouracilo, e os outros derivados de uracilo substituídos em 5 foram acoplados com 1-0-acetil-5-0-(terc-butildifenilsilil)-2,3-didesoxi-4-tio-L-ribofuranose (57), usando o mesmo procedimento conforme se descreveu no Exemplo 6, para dar os respectivos nucleósidos de pirimidina substituídos em 5.

Agitou-se uma mistura do acetato 57 (1,40 g, 3,32 mmol), timina (0,52 g, 4,20 mmol), HDMS (0,70 ml, 3,32 mmol), TMSCI (1,60 ml, 12,8 mmol) e nonafluorobutanossulfonato de potássio (3,50 g, 10,16 mmol) em acetonitrilo seco, a 25°C, de um dia para o outro, sob azoto, para dar a 1-[5-0-(terc-butildifenilsilil)-2,3-didesoxi-4-tio-alfa,beta-L-ribofuranosil]timina (60, X = CH3), 1,18 g (74%), na forma de uma mistura anomérica alfa/beta 4:3. Os anómeros alfa/beta foram separados por cromatografia em coluna de sílica gel. Por desprotecção do anómero beta 60 obteve-se a 1-(2,3-didesoxi-4-tio-beta-L-ribofuranosil)timina (61, X = CH3) com um rendimento de 55%. EM m/e 243 (M+ + 1); ΒΜΝ-'Η (DMSO-d6) delta 11,5 (s largo, 1H, NH), 7,74 (s, 1H, 6-H),

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ΕΡ 0 707 481/PT 23 6,11 (m, 1 Η, r-H), 5,00 (t, 1-H, 5'-OH, D20 permutável), 3,70 (m, 1-H, 4’-H), 3,65 (m, 2H, 5'-CH2), 2,20-1,80 (m, 4H, 2'-CH2 e 3'-CH2), 1,79 (s, 3H, 5-CH3). EXEMPLO 7 2’,3'-didesoxi-4'-tio-beta-L-adenosina, 2',3'-didesoxi-4'-tio-N-metil-beta-L-, -N,N-dimetil-beta-L-adenosina, 2',3'-didesoxi-4'-tio-beta-L-inosina e 2',3'-didesoxi-4'-tio-beta-L-guanosina A 2,,3'-didesoxi-4'-tio-beta-L-adenosina, a 2',3'-didesoxi-4'-tio-N-metil-beta-L-adenosina, a 2,,3'-didesoxi-4’-tio-N,N-dimetil-beta-L-adenosina, a 2',3'-didesoxi-4'-tio-beta-L-inosina e a 2’,3'-didesoxi-4,-tio-beta-L-guanosina foram sintetizadas pela metodologia similar de Secrist et al. (J. Med. Chem., 35, 533, 1992) para a síntese de 2',3'-didesoxi-4'-tio-D-nucleósidos. O açúcar 57 (4,3 g, 10,4 mmol) foi acoplado com 6-cloropurina (2,4 g, 15,6 mmol) na presença de cloreto de dietilalumínio (5,9 ml, 10,6 mmol) em acetonitrilo (150 ml), a 0-5°C, durante 2 h, pelo procedimento de Niedballa e Vobruggen (J. Orq. Chem., 39, 3654, 1974), para dar 2,81 g (53%) de 9-[5-0-(terc-butildifenilsilil)-2,3-didesoxi-4-tio-alfa,beta-L-ribofuranosil]-6-cloropurina na forma de uma mistura anomérica alfa/beta 1:1. Os anómeros alfa e beta foram separados por cromatografia em coluna de sílica gel. O anómero beta 62 foi tratado com amónia saturada/metanol e depois desprotegido com fluoreto de tetrabutilamónio 1 M em THF, obtendo-se a 2',3'-didesoxi-4'-tio-beta-L-adenosina (63, R' = R" = H): RMN-Ή (DMS0-d6) delta 8,30 (s, 1H, 2-H), 8,10 (s, 1H, 8-H), 7,30 (s, 2H, NH2, D20 permutável), 6,12 (m, 1H, 1'-H), 5,11 (s largo, 1H, 5'-OH, D20 permutável), 3,70 (m, 3H, 5'-CH2, 4'-H), 2,42 (m, 2H, 2'-CH2), 2,13 (m, 1H, 3'-H), 2,00 (m, 1H, 3'-H). O composto 62 foi desprotegido com fluoreto de tetrabutilamónio 1 M em THF para dar a 9-(2,3-didesoxi-4'-tio-beta-L-ribofuranosil]-6-cloropurina (64). Por hidrólise alcalina (Fujimori et al., Nucleosides & Nucleotides, 11, 341, 1 992) da porção 6-cloro no composto 64, obteve-se a 2',3'-didesoxi-4'-tio-beta-L-inosina 65, com um rendimento de 45%: EM m/e 253 (M + +1); ΡΜΝ^Η (D20) delta 8,52 (s, 1H, 2-H), 8,19 (s, 1H, 8-H), 6,10 (m, 1H, 1'-H), 3,94 (m, 1H, 5'-H), 3,75 (m, 2H, 5'-H, 4'-H), 2,52 (m, 2H, 2'-CH2), 2,30 (m, 1H, 3'-H), 1,92 (m, 1 H, 3'-H). 85 032

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acetato (57), por uma metodologia similar à descrita para a síntese do composto 65: EM m/e 268 (M+ + 1); ΠΜΝ-'Η (DMSO-d6) delta 10,7 (s largo, 1H, NH, D20 permutável), 8,01 (s, 1H, 8-H), 6,55 (s, 2H, NH2, D20 permutável), 5,90 (m, 1H, 1'-H), 5,09 (s largo, 1-H, 5'-OH, D20 permutável), 3,70 (m, 1H, 4'-H), 3,50 (m, 2H, 5'-H), 2,36 (m, 2H, 2'-H), 2,17 (m, 1H, 3'-H), 1,93 (m, 1H, 3'-H). EXEMPLO 8 -2-amino-beta-L-adenosina, 2,,3,-didesoxi-4,-tio-2-cloro-beta-L-adenosina, -2-ffuoro-beta-L-adenosina, -2-cloro-N-metil-beta-L-adenosina, -2-cloro-N,N-dimetil-beta-L-adenosina, -2-bromo-beta-L-adenosina, -2-bromo-N-metil-beta-L-adenosina e -2-bromo-N,N-dimetil-beta-L-adenosina A 2',3'-didesoxi-4'-tio-2-cloro-beta-L-adenosina, a -2-amino-beta-L-adenosina, a -2-fluoro-beta-L-adenosina, a -2-cloro-N-metil-beta-L-adenosina, a -2-cloro-N,N-dimetil-beta-L-adenosina, a -2-bromo-beta-L-adenosina, a -2-bromo-N-metil-beta-L-adenosina e a -2-bromo-N,N-dimetil-beta-L-adenosina, e outros derivados de beta-L-adenosina foram sintetizados como se apresenta no Esquema 11. A 9-[5-0-(terc-butildifenilsilil)-2,3-didesoxi-4-tio-alfa,beta-L-ribofuranosil]-2,6-dicloropurina (69) foi sintetizada a partir do acetato 57 e 2,6-dicloropurina, por uma metodologia similar à descrita para a síntese do composto 62, numa relação aproximada de anómero alfa/beta de 2:3, com um rendimento de 60%. Os anómeros alfa e beta foram separados por cromatografia em coluna de sílica gel. O composto 69 foi tratado com amónia saturada/metanol e depois desprotegido com fluoreto de tetrabutilamónio 1 M em THF, obtendo-se a 2',3'-didesoxi-4'-tio-2-cloro-beta-L-adenosina (70, R' = R" = H) com um rendimento de 52%: EM m/e 286 (M++1); RMN-1H (DMSO-d6) delta 8,46 (s, 1H, 2-H), 7,82 (s largo, 2H, NH2, D20 permutável), 6,10 (m, 1H, 1'-H), 5,10 (m, 1H, 5’-OH, D20 permutável), 3,74 (m, 1H, 4'-H), 3,60 (m, 2H, 5'-H), 2,42 (m, 2H, 2'- H), 2,13 (m, 1 H, 3'-H), 2,02 (m, 1H, 3’-H).

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ΕΡ 0 707 481/PT 25 A 2\3'-didesoxi-4'-tio-2-bromo-alfa,beta-L-adenosina (72, FT = R" = H) foi sintetizada por acoplamento do acetato 57 e de 2,6-dibromopurina, seguido por tratamento da amina respectiva pela1 mesma metodologia que se descreveu para a síntese do composto 70. \ O composto 69 foi tratado como azida de lítio para dar o diazidonucleósido 73, que foi depois reduzido com hidreto de alumínio e lítio (LAH) para produzir a 9-[5-0-(terc-butildifenilsilil)-2,3-didesoxi-4-tio-alfa,beta-L-ribofuranosil]-2,6-diaminopurina (74). O composto 74 foi desprotegido com fluoreto de tetrabutilamónio em THF, obtendo-se a 2’,3'-didesoxi-4’-tio-2-amino-alfa,beta-L-adenosina (75), que foi depois convertida na 2',3'-didesoxi-4'-tio-2-fluoro-alfa,beta-L-adenosina (76) por reacção com nitrito de sódio e HBF4. II. Actividade Biológica

A. Efeitos anti-HBV A actividade biológica dos presentes compostos foi avaliada conforme descrito por Doong, S-L, et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 88, 8495-8499 (1991). No estudo, usou-se a linha de células de hepatoma humano portadora do HBV (designada por 2.2.15) gentilmente cedida pelo Dr. G. Acs. Price et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86, 8541 (1989). Resumidamente, trataram-se culturas com seis dias com concentrações variáveis da droga no meio de cultura (Meio Essencial Mínimo com sais de Earl e 10% de soro de bovino fetal). Deixou-se a droga no meio de cultura durante um período de 3 dias, período após o qual se aspirou o meio e se adicionou meio fresco contendo a(s) mesma(s) concentração(ções) da droga. No final do período de 3 dias subsequente, colheu-se o meio de cultura. O meio de cultura foi processado para a obtenção de viriões pelo método da precipitação com polietilenoglicol (Doong, et a/., supra). O ADN virai assim recuperado a partir das partículas segregadas foi submetido a análise Southern. A inibição da replicação virai foi determinada por comparação do ADN virai de culturas tratadas com droga versus culturas de controlo não tratadas com droga.

Para determinar a toxicidade celular dos presentes compostos, usou-se a linha de células T-linfoblastóicas (CEM). As células foram submetidas a concentrações variáveis da(s) droga(s) e os números de células foram

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ΕΡ 0 707 481/PT 26 determinados 3 dias após o tratamento peloymétodo descrito por Chen, C-H e Cheng, Y-C, J. Biol. Chem.. 264, 11934 (1989). As concentrações de droga que resultaram na morte de 50% das populações de células foram determinadas a partir do gráfico gerado por repjesentação dos números de células correspondentes às concentrações de droga individuais. Os efeitos das várias concentrações de droga no ADN mitocondrial (ADN-mt) foram avaliados pelo método descrito por Chen e Cheng, supra. Recolheram-se por centrifugação as células CEM tratadas com várias concentrações da droga. Após lavagem das células com solução salina tamponada com fosfato, as células foram lisadas por suspensão das células em Tris-HCI 10 mM (pH 7,0) e repetidos ciclos de congelação-descongelação. As células resultantes foram depois submetidas a tratamento com RNase A, com uma concentração final da enzima de 10 pg/ml, seguido por tratamento com proteinase K (100 ,ug/ml) durante 1 hora. O ADN assim obtido por este procedimento foi depois imobilizado sobre uma membrana de nylon após a adição de 0,8 vol. de Nal e ebulição durante 10 minutos. A hibridação do ADN resultante com uma sonda específica de ADN-mt foi realizada seguindo o método de Doong, S-L, supra e realizou-se também a autorradiografia. As estimativas quantitativas foram obtidas com um densitómetro de varrimento. Removeu-se a sonda de ADN-mt das manchas que se hibridaram de novo com sonda de sequência Alu humana para determinar as quantidades de ADN para normalização e estimativa das quantidades absolutas do ADN-mt.

B. Efeitos anti-HIV O ensaio de susceptibilidade a drogas para determinação da eficácia dos compostos do presente invento contra o HIV em células MT-2, é uma modificação do ensaio descrito em Mellors et a!., Molecular Pharmacoloav. 41, 446 (1992). A inibição mediada pela droga da toxicidade celular induzida pelo vírus foi medida pela A595 do MTT ([3-I brometo de 4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,3-difeniltetrazólio) (Sigma M-2128). Infectaram-se em triplicado poços de uma placa de 96 poços que contêm células 1 X 104 MT2 (repositório-SIDA) com HIV-1 (HTLV-IIIB Estirpe-R.C. Gallo) com uma multiplicidade de 0,01 TCID50/célula. As células MT-2, em meios RPMI 1640 suplementados com 10% de soro de bovino fetal dialisado e com 100pg/ml de canamicina, foram infectadas com o vírus e imediatamente adicionadas a uma série de

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ΕΡ 0 707 481/PT 27 diluições da droga. Após 5 dias, adicionaram-se 20 μΙ de corante MTT (2,5 mg/ml em PBS) por poço. No final ^de um período de incubação de quatro horas, adicionaram-se 150 I de 2-propánol acidificado com detergente não iónico NP-40. Após os cristais do corante se dissolverem (usualmente 1-2 dias), as placas são lidas num leitor de microplacas. Usando este método de redução com corante MTT (conforme descrito por Larder et aí., Antimicrobial Aqents and Chemoterapy. 34, 436, 1990), a percentagem de protecção pode ser calculada usando a fórmula [(a-b/c-b) χ 100] onde a = A595 das células tratadas com droga, b é o número de células infectadas sem droga e c é a A595 das células infectadas sem droga.

Na Tabela 1 seguinte apresentam-se os valores de ID50 para a actividade anti-HIV do composto β-L-FddC e de outros compostos.

Tabela 1

Actividades anti-HBV e anti-HIV de análogos de L-2',3'-didesoxinucleósido

Citotoxicidade ID50 (μΜ) em células anti-ADN Comoosto CEM mitocondrial Anti-HBV Anti-HIV ddC 28 0,022 2,8 0,028 β-L-ddC 70 >100 0,01 0,35 β-L-FddC 67 >100 0,01 0,007 alfa-L-FddC >100 ND 0,5 0,3 β-L-ddSC >100 ND >0,5 70 alfa-L-ddSC >100 ND >0,5 > >100 ND - Não determinada ddC - 1-(2,3-didesoxi-beta-D-ribofuranosil)citosina β-L-ddC - 1 -(2,3-didesoxi-beta-L-ribofuranosil)citosina β-L-FddC - 1 -(2,3-didesoxi-beta-L-ribofuranosil)-5-fiuorocitosina alfa-L-FddC - 1 -(2,3-didesoxi-alfa-L-ribofuranosil)-5-fluorocitosina β-L-ddSC - 1-(2,3-didesoxi-4-tio-beta-L-ribofuranosil)citosina alfa-L-ddSC - 1 -(2,3-didesoxi-4-tio-alfa-L-ribofuranosil)citosina 28 85 032

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Deve ser entendido pelos peritos na arte que a descrição e os exemplos anteriores são ilustrativos da prática do presente invento, mas não devem dè modo algum ser considerados limitativos.

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Claims

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REIVINDICAÇÕES 1. Composição para utilização na inibição do crescimento ou da replicação do vírus da Hepatite B, compreendendo uma concentração inibidora eficaz de um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura: n2

N /V0K \_/
2. Composição para utilização no tratamento de um paciente sofrendo de uma infecção causada pelo vírus da imunodeficiência humana compreendendo uma concentração terapeuticamente eficaz de um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura:

85 032 ΕΡ 0 707 481/PT 2/4 Η Br onde X é H, F, Cl, Br, I, CH3, -C=CH, -HC = CH2 ou 'b = C ^
4. Composto de acordo com a reivindicação 3 onde X é CH3ou F
5. Composto de acordo com a reivindicação 3 onde X é CH3.
6. Composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura: •OH /SN onde B é

R' é H ou CH3; R" é H ou CH3; " são H e R" é CH3; Y" é H, F, Br, Cl ou NH2 quando R' e R Y" é H quando pelo menos um de R' e e Z é H ou NH2. r 85 032 EP 0 707 481/PT 3/4
7. Composto de acordo com a reivindicação 6 onde R' é H.
8. Composto de acordo com a reivindicação 7 onde R" é H.
9. Composto de acordo com a reivindicação 6 onde R' é H, H.
10. Composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura: NHg

R" é H e Z é

onde T é F, Cl, Br ou NH2.
11. Composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura: 0

w onde W é H ou NH2. 85 032 ΕΡ 0 707 481/PT 4/4
12. Composição para utilização na inibição do crescimento ou da replicação do vírus da Hepatite B compreendendo uma concentração inibidora eficaz de um composto β-L-nucleósido de acordo com a estrutura:

onde T é H, F, Cl, Br ou NH2. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 2 onde T é H.
14. Utilização da composição de acordo com a reivindicação 1 para o fabrico de um medicamento para inibição do crescimento ou da replicação do vírus da Hepatite B.
15. Utilização da composição de acordo com a reivindicação 2 para o fabrico de um medicamento para tratamento de um paciente, sofrendo de uma infecção causada pelo vírus da imunodeficiência humana.

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