PT698668E

PT698668E - Processo para a producao de l-leucina

Info

Publication number: PT698668E
Application number: PT95110188T
Authority: PT
Inventors: Kuniki Kino; Tetsuo Nakano; Masato Ikeda; Satoru Furukawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1994-06-30
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 2002-02-28
Also published as: CN1127787A; DE69522876D1; EP0698668A1; CN1246469C; EP0698668B1; DK0698668T3; CA2152885A1; CA2152885C; DE69522876T2; ATE206165T1; CN1448512A; US5744331A; HK1000715A1; CN1100146C; ES2164125T3

Description

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Descrição “Processo para a produção de L-Ieucina” A presente invenção diz respeito a um processo para a produção de L-Ieucina por fermentação. A L-leucina é um aminoácido que desempenha um papel importante, sob o ponto de vista nutricional, para os seres humanos e para os animais e que é utilizado para fins medicinais, em alimentos, em aditivos para alimentos, etc..

Para a produção de L-leucina por fermentação directa há um processo conhecido em que são utilizados microrganismos pertencentes aos géneros Escherichia, Serratia, Corynebactermm ou Arthrobacter. Por exemplo, no que diz respeito ao processo para a produção de L-leucina criando em cultura microrganismos pertencentes ao género Escherichia, é conhecido um processo que consiste em criar em cultura microrganismos pertencentes ao género Escherichia que são resistentes à substância β -2-tienil-alanína, JP-A-72695/81.

No que diz respeito ao processo para a produção de L-leucina criando em cultura microrganismos que possuam resistência a um análogo da leucina, é conhecido um processo que consiste em criar em cultura um microrganismo pertencente aos géneros Salmonella (Science 156, 1107 (1967)), Arthrobacter (JP-A-125086/75 e JP-A-220692/83), Corynebacterium ou

Brevibacterium (patente de invenção norte-americana n° 3 865 690).

Sob o ponto de vista industrial é sempre necessário um processo eficiente para a produção de L-leucina.

Na publicação Abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol. 77, (1977) e 76 (1976) está descrita uma estirpe de Escherichia coli mutante, resistente à azaleucina, que realiza a síntese não repressível de leucina e que possui uma forma alterada de ARNt.

No documento Fed. Proc. 33 (5 parte 2) (1974) Conference Abstr. está descrita uma estirpe de Escherichia coli mutante, de transporte reduzido de leucina, que possui resistência aos análogos da leucina.

De acordo com a presente invenção, esta proporciona um processo para a produção de L-leucina, o qual consiste em criar em cultura num meio um microrganismo pertencente ao género Escherichia, que possui resistência a um análogo da leucina e que possui capacidade para produzir L-leucina, permitindo que a L-leucina se acumule na cultura-para depois, a partir daí, se recuperar a L-leucina. O assunto fundamental da presente invenção está definido nas reivindicações anexas.

Na presente invenção é possível utilizar qualquer organismo desde que pertença ao género Escherichia e possua resistência a um análogo de leucina e tenha capacidade para produzir L-leucina. O análogo de leucina utilizável na presente invenção é seleccionado entre 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoroleucina, etc..

Os microrganismos convenientes, utilizados na presente invenção, podem ser obtidos submetendo microrganismos produtores de L-leucina, pertencentes ao género Escherichia, a uma mutagénese convencional, por exemplo, por tratamento com N-metil-N’-nitro-N-nitroso-guanidina e por irradiação com raios X, disseminando os microrganismos resultantes sobre um meio mínimo em placa de gelose contendo um análogo de leucina e retirando colónias que irão crescer em meio mínimo na placa de gelose.

Em alternativa, os microrganismos convenientes podem ser obtidos submetendo um mutante com resistência a um análogo de leucina, obtido a partir de uma estirpe natural genuína, a uma mutagénese para melhorar a produtividade na obtenção de L-leucina.

Além do mais, os microrganismos convenientes podem ser obtidos dotando com resistência a um análogo da leucina os microrganismos produtores de L-valina pertencentes ao

7^ género Escherichia, por mutagénese conforme referido supra. A propósito de microrganismos de Escherichia coli produtores de L-valina refere-se a estirpe de H-9068 de Escherichia coli.

Como exemplos preferidos de microrganismos convenientes utilizáveis na presente invenção refere-se a estirpe H-9070 de Escherichia coli com resistência à 4-azaleucina e a estirpe H-9072 de Escherichia coli com resistência à 5,5,5-trifluoroleucina.

De acordo com a presente invenção, é possível efectuar a produção de L-leucina criando em cultura microrganismos convenientes por um processo convencional. Como meio de cultura é possível utilizar todos os meios sintéticos e naturais desde que contenham convenientemente fontes de carbono, fontes de azoto, substâncias inorgânicas e quantidades residuais de outros nutrientes solicitados pelas estirpes em causa.

Como fontes de carbono é possível utilizar hidratos de carbono, tais como os se-leccionados entre glicose, frutose, lactose, melaços, hidrolizados de celulose, hidrolizados de açúcar não refinado e hidrolizados de amido; e ácidos orgânicos seleccionados entre ácido pirúvico, ácido acético, ácido fumárico, ácido málico e ácido láctico. Além disso, também é possível utilizar glicerol, álcoois como o etanol, etc., desde que possam ser assimilados pela estirpe utilizada.

Como fontes de azoto é possível utilizar amónia, diversos sais de amónio inorgânicos ou orgânicos, tais como o cloreto de amónio, o sulfato de amónio, o acetato de amónio e o fosfato de amónio, aminas, peptona, caldo de carne, licor de infusão de cereais, hidrolizados de caseína, hidrolizados de massa de feijão, diversas células criadas em cultura e seus produtos digeridos, etc..

Como substâncias inorgânicas é possível utilizar as seleccionadas entre di-hidrogeno--fosfato de potássio, di-hidrogeno-fosfato de dipotássio, fosfato de magnésio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, sulfato de cobre, carbonato de cálcio, etc..

As culturas são desenvolvidas em condições aeróbias, v.g., remexendo o meio de cultura e agitando a cultura com arejamento a uma temperatura de incubação entre 20°C e 40°C e de preferência entre 28°C e 37°C. Deve manter-se o valor do pH do meio no intervalo entre 5 e 9 e de preferência em valores próximos da neutralidade. Ajusta-se o valor do pH com carbonato de cálcio, ácidos orgânicos ou inorgânicos, soluções alcalinas, amónia, agentes de tamponamento do pH e outros que tais.

Normalmente, depois de se realizar a cultura durante 1 a 7 dias, a L-leucina acumula-se na cultura.

Depois de completado o processo de cultura efectua-se a remoção dos precipitados, tais como células, retirando-os da cultura por centrifugação, etc., podendo a L-leucina ser recuperada a partir do sobrenadante por tratamento de permuta tónica, concentração, substituição de um sal por outro, etc., em combinação.

Nos exemplos seguintes são ilustrados determinados casos da invenção.

Exemplo 1

Preparação de um mutante com resistência à 4-azaleucina ou à 5,5,5-trifluoroleucina

Utilizou-se uma estirpe protrófica H-9068 de Escherichia coli, resultante espontaneamente de uma estirpe que exige os ácidos metionina-pimélico e diaminopimélico, a estirpe de Escherichia coli ATCC 21530, por mutação reversa, a qual foi submetida a um tratamento convencional de mutação com N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (0,5 mg/mL, 33°C, 30 minutos), e depois disseminou-se sobre um meio mínimo em placa de gelose (0,5% de glicose, 0,2% de cloreto de amónio, 0,3% de di-hidrogeno-fosfato de potássio, 0,6% de fosfato de

dissódio, 0,01% de sulfato de magnésio, cloreto de cálcio na concentração de 20 mg/L e 2% de gelose a pH 7,2) contendo 4-azaleucina na concentração de 1 g/L. Depois de se realizar a cultura a 33°C durante 2 a 5 dias efectuou-se a remoção das colónias grandes que haviam crescido no meio e que eram já da estirpe mutante com resistência a 4-azaleucina, tendo sido submetidas a um teste de produção de L-leucina para se efectuar a selecção das estirpes com uma capacidade para produzir L-leucina superior à da estirpe original, com uma frequência de cerca de 10%. Entre tais mutantes, a estirpe que mais L-leucina produziu recebeu a designação de estirpe H-9070 de Escherichia coli.

Depositou-se a estirpe H-9070 em 21 de Junho de 1994 no Instituto Nacional de Biociência e na Agência de Tecnologia Humana de Ciência Industrial e Tecnologia no Japão, ao abrigo do Tratado de Budapeste, com o número de admissão FERM BP-4704.

Repetiu-se o processo descrito supra com a excepção de se ter utilizado 5,5,5-trifhioro-leucina na concentração de 0,3 g/L em vez de 4-azaleucina na concentração de 1 g/L, tendo sido removidas as colónias grandes que eram as estirpes mutantes com resistência à 5,5,5--trifluoroleuciiia. Entre tais mutantes foram obtidas, com uma frequência de cerca de 10%, as estirpes com uma capacidade para produzirem L-leucina superior à da estirpe original. Entre os mutantes, a estirpe que mais L-leucina produziu recebeu a designação de estirpe H-9072 de Escherichia coli.

Depositou-se a estirpe H-9072 em 21 de Junho de 1994 no Instituto Nacional de Biociência e na Agência de Tecnologia Humana de Ciência Industrial e Tecnologia no Japão, ao abrigo do Tratado de Budapeste, com o numero de admissão FERM BP-4706.

Efectuou-se uma comparação entre as estirpes mutantes e a estirpe original para se avaliar o grau de resistência à 4-azaleucina ou à 5,5,5-trifluoroleucina, conforme a seguir se descreve.

Criou-se em cultura as estirpes mutantes e a estirpe original em meio natural em placa de gelose (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 1% de cloreto de sódio e 2% de gelose a pH 7,2) durante 24 horas. Com as células criadas em cultura preparou-se uma suspensão em água esterilizada e espalhou-se a suspensão de células para se conseguir obter uma densidade de cerca de 1 x 103 células/cm2 sobre o meio mínimo em placa de gelose ante-riormente referido contendo 4-azaleucina ou 5,5,5-trifluoroleucina nas quantidades indicadas nos quadros 1 e 2. A produção das culturas teve lugar a 33°C durante 72 horas, tendo sido observado o grau de desenvolvimento. Exprimiu-se o grau de resistência à 4-azaleucina ou à 5,5,5-trifluoroleucina em termos do grau de desenvolvimento. Os resultados estão indicados nos quadros 1 e 2. As estirpes H-9070 e H-9072 possuem graus de resistência à 4-azaleucina e à 5,5,5--trifluoroleucina superiores ao da estirpe original H-9068.

Quadro 1

Estirpe Quantidade de 4-azaleucina (g/L) 0 0,5 1,0 H-9068 + - - H-9070 + + + +: desenvolvimento suJ iciente -:sem desenvolvimento

Quadro 2

Estirpe Quantidade de 5,5,5-trifluoroleucina (g/L) 0 0,5 1,0 H-9068 + - - H-9072 + + + +: desenvolvimento sul iciente -:sem desenvolvimento

Exemplo 2

Teste de produção de L-leucina

Utilizou-se as estirpes H-9070 de Escherichia coli e H-9072 de Escherichia coli obtidas no exemplo 1 e a estirpe original H-9068 de Escherichia coli com as quais se contaminou 20 mL de um meio inoeulante (2% de glicose, 1% dc pcptona, 1% de extracto de levedura, 0,25% de cloreto de sódio a pH 7,0) num balão de Erlenmeyer de 300 mL e efectuou-se a sua criação em cultura com agitação permanente a 30°C durante 16 horas. Com a cultura de inoculo resultante (2 mL) inoculou-se uma quantidade de 250 mL de um meio de fermentação (6% de glicose, 0,2% de licor de infusão de cereais, 1,6% de sulfato de amónio, 0,1% de di--hidrogeno-fosfato de potássio, 4% de fosfato de magnésio e 1% de carbonato de cálcio a pH 7,0) num balão de Erlenmeyer de 2 L e manteve-se em cultura com agitação permanente a 30°C durante 72 horas.

Depois de completada a cultura determinou-se por cromatografia em líquido de elevado rendimento a quantidade acumulada de L-leucina. -»

Os resultados estão ilustrados no quadro 3.

Quadro 3

Estirpe Quantidade de L-leucina (g/L) H-9068 0,0 H-9070 3,4 H-9072 3,9

Efectuou-se a centrifugação de 1 L de cada caldo de fermentação obtido ao criar em cultura as estirpes H-90790 e H-9072, trabalhando a 3000 r.p.m. durante 10 minutos para se remover do caldo as células e outras impurezas. Fez-se passar cada um dos sobrenadantes 8 assim obtidos através de uma coluna carregada com uma resina de permuta catiónica fortemente acídica ‘DIAION’ (tipo H*; produto da “Mitsubishi Chemical Corporation”, Japão) para aí se fazer a absorção da L-leucina. Lavou-se a coluna com água e efectuou-se a eluição com uma solução aquosa de amónia 0,5N para se recolher as fiacções de L-leucina. Efectuou-se α concentração das fracções recolhidas e acrescentou-se etanol ao concentrado. Ao deixar em repouso a mistura, sob arrefecimento, obteve-se as quantidades de 2,6 g e de 3,0 g de cristais de L-leucina com uma pureza igual a 98% ou superior a partir dos caldos de cultura, respectivamente das estirpes H-9070 e H-9072.

Lisboa, 23 de Novembro de 2001 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

JOSÉ DÉ S/yMPAIO A.O.P.I. Rua do Salitre, 195. r./c-Drí. !269-063 LiSBOA

Claims

7% Reivindicações Processo para a produção de L-leucina, o qual consiste em criar em cultura um microrganismo mutante num meio até ser produzida e acumulada L-leucina na cultura, removendo-se desse meio a L-leucina, em que o microrganismo mutante possui resistência à 5,5,5--trifluoroleucina e tem capacidade para produzir L-leucina e é proveniente de um microrganismo pertencente aò género Escherichia produtor de L-valina. Cultura biologicamente pura da estirpe H-9070 de Escherichia coli (FERM BP-4704). Cultura biologicamente pura da estirpe H-9072 de Escherichia coli (FERM BP-4706). Processo para a produção de L-leucina, o qual consiste em criar em cultura um microrganismo mutante seleccionado entre as estirpes H-9070 de Escherichia coli (FERM BP--4704) e H-9072 de Escherichia coli (FERM BP-4706) num meio até ser produzida e acumulada L-leucina na cultura, recuperando-se a L-leucina a partir desse meio. Método para se obter um microrganismo produtor de L-leucina, pertencente ao género Escherichia, o qual compreende os passos seguintes: (a) mutagenizar um microrganismo pertencente ao género Escherichia produtor de L--valina, (b) seleccionar um microrganismo mutante resistente a um análogo da leucina a partir do referido microrganismo mutagenizado produtor de L-valina e 2 f (c) seleccionar um microrganismo produtor de L-leucina a partir do referido microiganiano mutante resistente. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o análogo da leucina é a 4-azaleucina ou a 5,5,5-trifluoroleucina. 7. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o referido microrganismo pertence à espécie Escherichia coli. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido microrganismo é a estirpe H-9070 de Escherichia coli (FERM BP-4704) ou a estirpe H-9072 de Escherichia coli (FERM BP-4706). Microrganismo produtor de L-leucina, caracterizado pelo facto de ser obtido pelo método de acordo com a reivindicação 5. oa, 23 de Novembro de 2001

O Agaote Oficia! da Propriedade Industrial