CN109504624A - 一种亮氨酸生产菌株的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亮氨酸生产菌株的筛选方法，步骤为：1将待筛选的亮氨酸生产菌接入含有培养基①的三角瓶中，振荡培养；2用接种针取培养液在平板培养基②中梯度划线分纯，得出单株；3将单株接入含有培养基③的三角瓶中，振荡培养；4用接种针取培养液在平板培养基④中梯度划线分纯，得出单株，所得单株扩大培养，利用摇瓶发酵筛选出亮氨酸高产稳定的生产菌株。本方法主要突出两个方面：一是在培养温度上采用33‑37℃培养，使菌株适应33‑37℃的生长环境，对大生产降低动力成本非常有利；二是驯化本菌种利用低价的糖蜜代替葡萄糖作为碳源，大大降低原材料成本。

Description

一种亮氨酸生产菌株的筛选方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种产亮氨酸(Guanosine)的微生物菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的选育方法。
背景技术
L-亮氨酸(L-leucine)，又名白氨酸，是人体与动物不能合成的8种必须氨基酸之一。L-亮氨酸相对分子质量为131.18，纯品为白色结晶或结晶性粉末，微苦，易溶于乙酸、稀盐酸、碱溶液及碳酸盐溶液，不溶于氯仿和甲醇，微溶于乙醇，为非极性氨基酸。20℃时溶解度为2.37g，可从水中结晶，等电点5.98。
L-亮氨酸在各个领域的应用主要有以下几个方面：(1)在医药领域，L-亮氨酸是临床上复合结晶氨基酸静脉注射液的重要原料。(2)在营养学方向上，研究表明氨基酸与钙离子结合后更容易被人体吸收，所以L-亮氨酸螯合钙可以作为一种新型的补钙制剂。(3)其它方面，L-亮氨酸可作为食品添加剂、与稀土的配合物是氨基酸肥料与农药，用于增产与防病虫害，是植物生长促进剂等。
国内生产方法有蛋白水解提取法、化学合成法、酶法、发酵法等。目前L-亮氨酸多用毛发水解法，这种方法得到的产品纯度不高，不能用于药品，环境污染严重，收率低。化学合成法虽然原理简单，价格低廉，但操作复杂，反应条件苛刻，副产物多，产率不高，并且有的方法涉及到有毒物质。酶法生产氨基酸的优点是转化能力强，产物组分相对单一，易进行后工序加工处理，可以提高产品质量。但酶法生产中所用到的酶需通过微生物发酵生成并提取精制，工艺过程比较复杂，且成本较高，因此目前尚未得到广泛的应用。微生物转化法利用葡萄糖为发酵碳源、添加前体物，经微生物的代谢转化作用生产亮氨酸，但葡萄糖的成本高。
发明内容
针对上述理论，本发明要解决的技术问题是为工业化大生产提供一种能降低生产成本、操作方便快捷，能定向有效筛选的亮氨酸生产菌株的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种亮氨酸生产菌株的筛选方法，步骤为：
I.将待筛选的亮氨酸生产菌接入含有培养基①的三角瓶中，振荡形成培养液；
II.用接种针取步骤I培养液在平板培养基②中梯度划线分纯，培养得出单株；
III.将步骤II单株接入含有培养基③的三角瓶中，振荡形成培养液；
IV.用接种针取步骤III培养液在平板培养基④中梯度划线分纯，得出二次分纯单株，所得二次分纯单株扩大培养，利用摇瓶发酵筛选出亮氨酸生产菌株；
上述各步骤的培养温度均为33-37℃，所述培养基的碳源是糖蜜。
进一步：在上述亮氨酸生产菌株的筛选方法中，步骤I中所述的振荡条件为：35±2℃，转速100±10rpm，振荡培养16～24h；培养基①为糖蜜3.0±0.2％、酵母膏0.5±0.1％、蛋白胨0.2±0.05％、氯化钠0.5±0.05％，余量是水。
步骤II的培养条件为：35±2℃，培养24-48小时；培养基②为糖蜜3.0±0.2％、酵母膏0.1±0.05％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.02％、琼脂1.8±0.2％，余量是水。
步骤III中所述的振荡条件为：35±2℃，转速100±10rpm，振荡培养16～24h。培养基③为糖蜜5.0±0.2％、酵母膏0.1±0.02％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.01％、余量是水。
步骤IV的培养条件为：35±2℃，培养24-48小时，培养基④为糖蜜5.0±0.2％、酵母膏0.5±0.02％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.02％、琼脂1.8±0.2％，余量是水。
所述步骤IV中二次分纯单株扩大培养是指将二次分纯单株转接到试管斜面中扩大培养的过程。在二次分纯的过程中，糖蜜的用量呈递增，目的是驯化本菌种利用糖蜜的能力。
与现有技术相比，本发明亮氨酸生产菌株的筛选方法，综合结了菌株的生产特性与代谢途径，从生产发酵成本作为考虑，在筛选菌株的方法上利用价格低的原材料，使菌种的特性从源头就得到驯化，在发酵大生产中更能体现降成本的优势，提高产品的市场竞争力，为亮氨酸大生产菌株的筛选提供了简便、高效、定向的筛选方法。本方法主要突出两个方面：一是在培养温度上采用33-37℃培养，使菌株适应33-37℃的生长环境，对大生产降低动力成本非常有利；二是驯化本菌种利用低价的糖蜜代替葡萄糖作为碳源，大大降低原材料成本。以上两点的改变使本产品在市场上取得低成本高质量的优势。所以本发有益的技术效果是：通过驯化菌株适应大生产的培养基条件，提高培养温度及对糖蜜的利用率，让符合高产特性的菌株优先生长，通过筛选得出稳定性好的高产菌株入库保存，供工业大生产使用，有效地降低发酵过程中能耗与碳源的成本，保障工业生产亮氨酸产量的稳定，大大提高企业的产品竞争力。且微生物发酵法主要经过微生物直接发酵生产L-亮氨酸、通过提取分离及结晶精制等过程，最后得到成品。生产过程中无有机溶剂，纯度高，天然发酵，符合健康食品要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步详述，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定，制备过程中各个原材料的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。
实施例1
I.将待筛选的亮氨酸甘油种液在接入含有培养基①的三角瓶中，振荡培养，温度为35℃，转速100rpm，振荡培养18h，至对数生长期停止培养。
II.在无菌操作台上，用接种针取上述培养液在平板培养基②中梯度划线分纯，培养温度36℃，培养40小时，得出单菌落。
III.无菌条件下挑选生长饱满的3个单株接入含有培养基③的三角瓶中，振荡培养，温度36℃，转速100rpm，振荡培养20h。
IV.在无菌操作台上，用接种针各取培养液在平板培养基④中梯度划线分纯，得出单株菌落，培养温度37℃，培养24小时，各平板中选择6个生长饱满的单株株扩大培养待用。
再将由上述筛选方法得出的18株亮氨酸生产菌株放在摇瓶培养，36℃，摇床振荡培养48h，发酵液离心得上清液，经纸层析分离杂质后，剪下色斑，洗脱出亮氨酸后，在560nm处测吸收值，计算摇瓶发酵液亮氨酸含量，结合糖耗分析，得到最优良的亮氨酸生产菌株3株，此菌株制成甘油种液或冻干种长期保存。
上述整个工艺流程共计9天。
实施例2
I.将待筛选的亮氨酸甘油种液在接入含有培养基①的三角瓶中，振荡培养，温度为36℃，转速100rpm，振荡培养18h，至对数生长期停止培养。
II.在无菌操作台上，用接种针取上述培养液在平板培养基②中梯度划线分纯，培养温度37℃，培养40小时，得出单菌落。
III.无菌条件下挑选生长饱满的3个单株接入含有培养基③的三角瓶中，振荡培养，温度37℃，转速100rpm，振荡培养20h。
IV.在无菌操作台上，用接种针各取培养液在平板培养基④中梯度划线分纯，得出单株菌落，培养温度35℃，培养24小时，各平板中选择6个生长饱满的单株株扩大培养待用。
再将由上述筛选方法得出的18株亮氨酸生产菌株放在摇瓶培养，37℃，摇床振荡培养48h，发酵液离心得上清液，经纸层析分离杂质后，剪下色斑，洗脱出亮氨酸后，在560nm处测吸收值，计算摇瓶发酵液亮氨酸含量，结合糖耗分析，得到最优良的亮氨酸生产菌株3株，此菌株制成甘油种液或冻干种长期保存。
上述整个工艺流程共计10天。
实施例3
I.将待筛选的亮氨酸甘油种液在接入含有培养基①的三角瓶中，振荡培养，温度为37℃，转速100rpm，振荡培养18h，至对数生长期停止培养。
II.在无菌操作台上，用接种针取上述培养液在平板培养基②中梯度划线分纯，培养温度35℃，培养40小时，得出单菌落。
III.无菌条件下挑选生长饱满的3个单株接入含有培养基③的三角瓶中，振荡培养，温度35℃，转速100rpm，振荡培养20h。
IV.在无菌操作台上，用接种针各取培养液在平板培养基④中梯度划线分纯，得出单株菌落，培养温度36℃，培养24小时，各平板中选择6个生长饱满的单株株扩大培养待用。
再将由上述筛选方法得出的18株亮氨酸生产菌株放在摇瓶培养，35℃，摇床振荡培养48h，发酵液离心得上清液，经纸层析分离杂质后，剪下色斑，洗脱出亮氨酸后，在560nm处测吸收值，计算摇瓶发酵液亮氨酸含量，结合糖耗分析，得到最优良的亮氨酸生产菌株3株，此菌株制成甘油种液或冻干种长期保存。
上述整个工艺流程共计9天。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或者等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种亮氨酸生产菌株的筛选方法，步骤为：
I.将待筛选的亮氨酸生产菌接入含有培养基①的三角瓶中，振荡形成培养液；
II.用接种针取步骤I培养液在平板培养基②中梯度划线分纯，培养得出单株；
III.将步骤II单株接入含有培养基③的三角瓶中，振荡形成培养液；
IV.用接种针取步骤III培养液在平板培养基④中梯度划线分纯，得出二次分纯单株，所得二次分纯单株扩大培养，利用摇瓶发酵筛选出亮氨酸生产菌株；
上述各步骤的培养温度均为33-37℃，所述培养基的碳源是糖蜜。
2.根据权利要求1所述的亮氨酸生产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤I中所述的振荡条件为：35±2℃，转速100±10rpm，振荡培养16～24h；培养基①为糖蜜3.0±0.2％、酵母膏0.5±0.1％、蛋白胨0.2±0.05％、氯化钠0.5±0.05％，余量是水。
3.根据权利要求2所述的亮氨酸生产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤II的培养条件为：35±2℃，培养24-48小时；培养基②为糖蜜3.0±0.2％、酵母膏0.1±0.05％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.02％、琼脂1.8±0.2％，余量是水。
4.根据权利要求3所述的亮氨酸生产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤III中所述的振荡条件为：35±2℃，转速100±10rpm，振荡培养16～24h。培养基③为糖蜜5.0±0.2％、酵母膏0.1±0.02％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.01％、余量是水。
5.根据权利要求4所述的亮氨酸生产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤IV的培养条件为：35±2℃，培养24-48小时，培养基④为糖蜜5.0±0.2％、酵母膏0.5±0.02％、蛋白胨0.1±0.02％、氯化钠0.5±0.02％、琼脂1.8±0.2％，余量是水。
6.根据权利要求5所述的亮氨酸生产菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤IV中二次分纯单株扩大培养是指将二次分纯单株转接到试管斜面中扩大培养的过程。
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