PT692982E - Antagonistas do receptor gpiib/iiia de plaquetas marcados radioactividade como agentes de formacao de imagens para o diagnostico de desordens tromboembolicas - Google Patents

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William Frank Degrado
Shaker Ahmed Mousa
Michael Sworin
Milind Rajopadhye
Thomas David Harris
David Scott Edwards
Shuang Liu
John Andrew Barrett
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Du Pont Pharm Co
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Description

DESCRIÇÃO "ANTAGONISTAS DO RECEPTOR GPIIb/IIIa DE PLAQUETAS MARCADOS RADIOACTIVAMENTE COMO AGENTES DE FORMAÇÃO DE IMAGENS PARA O DIAGNÓSTICO DE DESORDENS TROMBOEMBÓLICAS"
Campo da Invenção
Esta invenção diz respeito a reagentes para a preparação de produtos radiofarmacêuticos que são compostos cíclicos marcados radioactiva-mente que contêm sistemas em anel carbocíclico ou heterocíclico; a estojos que compreendem os referidos reagentes; a produtos radiofarmacêuticos obteníveis através dos referidos reagentes; e ao uso dos referidos reagentes para a preparação de produtos radiofarmacêuticos adequados como agentes de formação de imagens para a diagnose de trombos arteriais e venosos.
Antecedentes da Invenção O reconhecimento clínico de desordens tromboembólicas venosas e arteriais não é de confiança, carecendo não só de sensibilidade mas também de especificidade. À luz da situação que ameaça potencialmente a vida, a necessidade de diagnosticar rapidamente desordens tromboembólicas usando um método não invasivo é uma necessidade clínica não atingida. A activação das plaquetas e a agregação resultante tem sido mostrado como estando associadas com várias condições patofisiológicas que incluem desordens tromboembólicas cardiovasculares e cerebrovasculares tais como angina instável, enfarte do miocárdio, ataque isquémico transiente, derrame cerebral, aterosclerose e diabetes. A contribuição das plaquetas para estes processos de doença tem origem na sua capacidade de formar agregados, ou trombos de plaquetas, especialmente na parede arterial depois de lesão. Ver, em geral: Fuster et al, J. A. C. C. 5 (N° 6) (1985) 175B-183B; Rubenstein et al, Am. Heart J. 102 (1981) 363-367; Hamm et al., J. Am. Coll. Cardiol. 10 (1987) 998-1006; e Davies et al, Circulation 73 (1986) 418-427. Recentemente, o complexo plaqueta glicoproteína Ilb/IIIa (GPIIb/IIIa) tem sido identificado como a proteína de membrana que medeia a agregação de plaquetas proporcionando um caminho comum para os agonistas de plaqueta conhecidos. Ver Philips et al, Cell 65 (1991) 359-362. A activação e agregação de plaquetas tem também ao que se pensa um papel significativo nas desordens tromboembólicas venosas tais como r tromboflebites venosas e embolia pulmonar subsequente. E também conhecido que pacientes cujo sangue flui ao longo de superfícies artificiais, tais como válvulas cardíacas sintéticas prostéticas, estão em risco de desenvolvimento de tampões, trombos e êmbolos de plaquetas. Ver, em geral: Fuster et al, J. A. C. C. 5 (N° 6) (1985) 175B-183B; Rubenstein et al, Am. Heart J. 102 (1981) 363-367; Hamm et al., J. Am. Coll. Cardiol 10 (1987) 998-1006; e Davies et al, Circulation 73 (1986) 418-427.
Um meio adequado para a diagnose não invasiva e monitorização de pacientes com tais desordens tromboembólicas potenciais seria altamente útil e têm sido feitas várias tentativas para desenvolver agentes marcados radioactivamente dirigidos a plaquetas para a formação não invasiva de imagens de radionuclido. Por exemplo, estudos experimentais têm sido realizados com anticorpo de antifíbrina monoclonal de 99niTc para a formação de imagens de diagnóstico de trombo arterial. Ver Cerqueira et al, Circulation 85 (1992) 298-304. Os autores reportam a utilidade potencial de tais agentes na formação de imagens de trombo arterial formado recentemente. Anticorpos monoclonais marcados com 131I e específicos para plaquetas humanas activadas têm também sido reportados como tendo aplicação potencial na diagnose de trombos arteriais e venosos. Contudo, uma proporção razoável de trombos para sangue (alvo/fundo) foi apenas atingível às 4 horas após a administração do anticorpo marcado radioactivamente. Ver Wu et al, Clin. Med. J. 105 (1992) 533-559. O uso de anticorpo de antiplaqueta monoclonal 7E3 marcado radioactivamente com 125I, 131I, 99mTc e U1ln na formação de imagens de trombos tem também sido recentemente discutido. Coller et al., Publicação do Pedido de Patente PCT N° WO 89/11538 (1989). O anticorpo 7E3 marcado radioactivamente tem contudo a desvantagem de ser uma molécula de massa molecular muito grande. Outros investigadores têm empregado t-Pa enzimaticamente inactivado radioiodado com 123I, 125I e 13,I para a detecção e a localização de trombos. Ver Ordm et al., Circulation 85 (1992) 288-297. Ainda outras aproximações na detecção de tromboembolismos são descritos, por exemplo, em Koblik et al, Semin. Nucl. Med. 19(1989) 221-237. A detecção e localização de trombos arteriais e venosos é de importância crítica na diagnose exacta de desordens tromboembólicas e na determinação da terapia apropriada. São necessários novos e melhores agentes marcados radioactivamente para a formação não invasiva de imagens de radionuclidos para detectar trombos. A presente invenção está dirigida a esta importante finalidade.
[1] -4-
Sumário da Invenção Esta invenção proporciona: fórmulas:
Um reagente para a preparação de um produto radiofarmacêutico de (QLn)a Ch; (Q)d1 Ln-Ch, em que: d é 1-3; d’ é 2-20;
Ln é um grupo de ligação sendo uma ligação entre Q e Ch; ou, um composto da fórmula: Μ1- [Y1 (CR55R56)h (Z')h·. Y2]h. - M2 em que: M'é - [(CH2)gz']g· - (CR55R56)g» -; M2 é - (CR5SR56)8- - [Ζ'ίΟΗ^ -; g é independentemente 0-10; g' é independentemente 0-1; g"é 0-10; h é 0-10; h' é 0-10; h" é 0-1; Y1 e Y2, em cada ocorrência, são independentemente seleccionados de entre: uma ligação, O, NR56, C=0, C(=0)0, 0C(=0)0, C(=0)NH-, C=NR56, S, SO, S02, S03, NHC(=0), (NH)2C(=0), (NH)2C=S; -5- -5- Ζ1
é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre um sistema em anel C^-Cu saturado, parcialmente saturado ou carbocíclico aromático, substituído com 0-4 R ; um sistema em anel heterocíclico, facultativamente substituído com 0-4 R57; e R36 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: hidrogénio, alquilo CrCio substituído com 0-5 R57; (alquil Ci-C10)arilo em que o arilo é substituído com 0-5 R ; R57 é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: hidrogénio, OH, NHR58, C(=0)R58, 0C(=0)R58, 0C(=0)0R58, C(=0)0R58, C(=0)NR58-, C^N, SR58, SOR58, S02R58, NHC(=0)R58, NHC(=0)NHR58, NHC(=S)NHR58; ou, altemativamente, quando ligado a uma molécula adicional Q, R57 é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: O, NR58, OO; 0(=0)0, 0C(=0)0, C(=0)N-, C=NR58, S, SO, S02, S03, NHC(=0), (NH)2C(=0), (NH)2C=S; R58 é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: hidrogénio, alquilo CpC6, benzilo e fenilo.
Ch é um quelante de metal seleccionado de entre:
xw-a2-vv A’ V
A W3 A3
aV vT ‘w I A2
A1 / W
A 2"W A2
W. Ά4 \ W-
-6- çgacss»
w w. 1 A 2' ^A4 il'
.2-W-A\ WA A'W AÍ W I A3 W \ Àl.vfA\TAVA s A3 A5 A1
A2—W-A3-W-A4—W—ASSX vr
A2_W_A3_W_A4_W-A w v^r,A2_W-A3-W—A5-W-~A6 A,—W. W J A4 ^a3-w-a4-w-A6 w I A5 ,^w wx A1 A2 Wa A5 A6
A3' I xW ,w I v^AXv v^AVAVAÍ A5 / w A1—Wv A4A\ / w w—A3^ / r Ai / W I a1—
A2-W \
W \ / W—A3
W / w' a2—W—a3—W—A4—W—A5—W—A6
W \7 w^A2—W—a3—W—A4— w— A^-W-A7 / w\, ; -7- Α1 / w
A2_W_A3_W_A4_W__A6_W-A7 W W' ,A2—W—a3—w—Αε_ w—a7 w i. 1 ^a2_W-A<-W_a5-W-A7 S W l?
W \ A6 W^A2“W—A4—w-a6—W-a7 A,X W W a'3 A3 A5 w / w / -w
Yv'v w A5 / w\,/ w\ \ ,/ W-A3 \ w / A7 w i8 rN. \ ^.Al\ / W-A3\ w / A7 em que: A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 e A8 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: NR40R41, S, SH, S(Pg), O, OH, PR42R43, P(0)R42R43, P(S)R42R43, P(NR44)R42R43; W é uma ligação, CH ou um grupo espaçador seleccionado de entre: alquilo Ci-Cio substituído com 0-3 R52, arilo substituído com 0-3 R52, -8-
cicloalquilo substituído com 0-3 R52, heterocicloalquilo substituído com 0-3 R , aralquilo substituído com 0-3 R e alquilarilo substituído com 0-3 R52;
Wa é um grupo alquilo Q-Cio ou um carbociclo C3-Q4; R40, R41, R42, R43 e R44 são cada um independentemente seleccionados de entre: uma ligação a Ln, hidrogénio, alquilo Ci-C10 substituído com 0-3 R , arilo substituído com 0-3 R , cicloalquilo substituído com 0-3 R , heterocicloalquilo substituído com 0-3 R52, aralquilo substituído com 0-3 R52, alquilarilo substituído com 0-3 R52, heterociclo substituído com 0-3 R52 e um electrão, com a condição de que quando um dos R40 ouR41 é um electrão, então o outro é também um electrão, e com a condição de que quando um dos R42 ou R43 é um electrão, então o outro é também um electrão; adicionalmente, R40 e R41 podem combinar-se para formarem =C(alquil C]-C3)(alquilo CrC3); R é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: uma ligação a Ln, =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R53, -C(=0)R53, -C(=0)N(R53)2, -CHO, -CH2OR53, -0C(=0)R53, -0C(=0)0R53a, -OR53, -0C(=0)N(R53)2, -NR53C(=0)R53, ,53a .53, 53\ .54c -NR54C(=0)0R"a, -NR^C(=O)N(Rj02, -NR34S02N(R3')2, .53% -NR54S02R"a, -SO3H, -S02R3Ja, -SR3', -S(=0)R3Ja, -S02N(R53)2, -N(R53)2, -NHC(=NH)NHR53, -C(=NH)NHR53, =NOR53, N02, -C(=0)NH0R53, -C(=0)NHNR53R53a, -OCH2-C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo C1-C5, alcenilo C2-C4, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, alcoxialquilo C2-Cô, arilo substituído com 0-2 R53, um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O; ,53a 53a .53 ,53a -9- R53, R53a e R54 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: uma ligação a Ln, alquilo Cj-Cé, fenilo, benzilo, alcoxi CrC6, haleto, nitro, ciano e trifluorometilo;
Pg é um grupo de protecção de tiol capaz de ser deslocado por uma reacção com um radionuclido; Q é um composto de fórmula (I):
ou uma sua forma de sal ou pró-droga farmaceuticamente aceitável, em que: R31 é um sistema em anel carbocíclico C6-Ci4 saturado, parcialmente saturado ou aromático, substituído com 0-4 R10 ou Rl0a, e suportando facultativamente uma ligação a Ln; um sistema em anel heterocíclico, facultativamente substituído com 0-4 R10 ou R10a, e suportando facultativamente uma ligação a Ln; R32 é seleccionado de entre: -C(=0)-, -C(=S)-, -S(=0)2-, -S(=0)-, -P(=Z)(ZR13)-; Z é S ou O; n" e n' são independentemente 0-2; R1 e R22 são independentemente seleccionados de entre: hidrogénio; alquilo C]-C8 substituído com 0-2 R11; alcenilo C2-C8 substituído com 0-2 R11; alcinilo C2-C8 substituído com 0-2 Rn; cicloalquilo C3-C10 substituído com 0-2 R11; bicicloalquilo C6-Ci0 substituído com 0-2 R ; uma ligação a Ln; arilo substituído com 0-2 R ; um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R12; =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R13)2, -CHO, -CH2OR13, -OC(=0)R13, -OC(=0)OR13a, -OR13, -OC(=0)N(Rl3)2, -NRi3C(=0)R13, -NR14C-(=0)ORl3a, -NR13C(=0)N(R13)2, NRl4S02N(R13)2, -NR14S02R13a, -SO3H, -S02R13a, -SR13, -S(=0)Rl3a, -S02N(R,3)2, -N(R13)2, -NHC(=NH)NHR13, -C(=NH)NHR13, =NOR13, N02, -C(=0)NHOR13, -C(=0)NHNR13R13a, -0CH2C02H, 2-(l-morfolino)etoxi; R1 e R21 podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 3-7 membros substituído com 0-2 R12; quando n' é 2, R1 ou R21 podem altemativamente ser considerados em conjunto com R1 ou R21 sobre um átomo de carbono adjacente para formarem uma ligação directa, formando por esse meio uma ligação dupla ou tripla entre os referidos átomos de carbono; yy λι R e RiJ são independentemente seleccionados de entre: hidrogénio; alquilo C1-C4 facultativamente substituído com 1-6 halogéneos; benzilo; 22 23 R e R podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 3-7 membros substituído com 0-2 R ; 99 91 quando n" é 2, R ou R podem altemativamente ser considerados em 4 22 93 conjunto com R ou R sobre um átomo de carbono adjacente para formarem uma ligação directa, formando por esse meio uma ligação dupla ou tripla entre os átomos de carbono adjacentes; 1 2 21 R e R , onde R é H, podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 5-8 membros substituído com 0-2 R12; R11 é seleccionado de entre um ou mais dos seguintes: =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R13)2, -CHO, -CH2OR13, -0C(=0)R13, -0C(=0)0R13a, -OR13, -0C(=0)N-(R13)2, -NR13C(=0)R13, -NR14C(=0)0R13a, -NR13C(=0)N(R13)2, NR,4S02N(R13)2s -NR14S02R13a, -S03H, -S02R,3a, -SR13, -S(=0)R13a, -S02N(R13)2, -N(R,3)2j -NHC(=NH)NHR13, -C(=NH)NHR13, =NOR13, N02, -C(=0)NH0R13, -C(=0)NHN‘ R13R13a, -0CH2C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo Q-C5, alcenilo C2-C4, cicloalquilo Q-Cô, (cicloalquil C3-C6)metilo, alcoxialquilo Q-Cõ, cicloalcoxi C3-Cô, alquilo C1-C4 (sendo alquilo substituído com 1-5 grupos seleccionados independentemente de entre: -NR13R14, -CF3, N02j -S02R13a ou -S(=0)R13a), arilo substituído com 0-2 R12, um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R12; R12 é seleccionado de entre um ou mais dos seguintes: fenilo, benzilo, fenetilo, fenoxi, benziloxi, halogéneo, hidroxi, nitro, ciano, alquilo C1-C5, cicloalquilo C3-C6, cicloalquilmetilo C3-C6, arilalquilo C7-C10, alcoxi C,-C5, -C02R13, -C(=0)NH0R13a, -C(=0)NHN(R13)2, =NOR13, -B(R34)(R35), cicloalcoxi C3-C6, -0C(=0)R13, -C(=0)R13, -0C(=0)0R13a, -OR13, -(alquil
Ci-C4)OR13, N(R13)2s -0C(=0)N(R13)2s -NR13C(=0)R13, -NR13C(=0)0R13a, -NR13C(=0)N(R13)2, -NR13S02N(R13)2s -NR13S02R13a, -S03H, -S02R13a, -S(=0)R13a, -SR13, -S02N(R )2, alcoxialquilo C2-C6, metilenodioxi, etilenodioxi, haloalquilo CrC4, haloalcoxi CrC4, (alquil Ci-C4)carboniloxi, (alquil Ci-C4)carbonilo, (alquil Ci-C4)carbonilamino, -OCH2-C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo C1-C4 (sendo o alquilo
substituído com -N(R13)2, -CF3, N02 ou -S(=0)R13a); R13 é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo CpCio, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-C12, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-Ci0;
Rl3a é alquilo CpCio, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo CpC^, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-Ci0; quando dois grupos R13 estão ligados a um N isolado, os referidos grupos R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)2-5 ou -(CH2)0(CH2)-; R14 é OH, H, alquilo C1-C4 ou benzilo; R2 é H ou alquilo Cj-Cg;
Rl° e R10a são independentemente seleccionados de entre um ou mais dos seguintes: fenilo, benzilo, fenetilo, fenoxi, benziloxi, halogéneo, hidroxi, nitro, ciano, alquilo C1-C5, cicloalquilo C3-C6, cicloalquilmetilo C3-C6, arilalquilo C7-C10, alcoxi C1-C5, -C02R13, -C(=0)N(R13)2, -C(=0)NH0R13a, -C(=0)NHN(R13)2, =NOR13, -B(R34)(R35), cicloalcoxi C3-C6, -0C0(=0)R13, -C(=0)R13, -0C(=0)0R13a, -OR13, -(alquil CrC4)OR13, N(R13)2, -0C(=0)N(R13)2, -NRi3C(=0)R13, -NR13C(=0)0R13a, -NR13C(=0)N(R13)2, -NR13S02N(R13)2, -NR13S02Rl3a, -S03H, -S02R13a, -S(=0)Rl3a, -SR13, -S02N(R13)2, alcoxialquilo C2-C6, metilenodioxi, etilenodioxi, haloalquilo CrC4 (incluindo -CVFW onde v= 1 até 3 e w= 1 até(2v+l)), haloalcoxi Q-C4, (alquil Ci-C4)carboniloxi, (alquil C]-C4)carbonilo, (alquil CrC4)car-bonilamino, -0CH2C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo C1-C4 (sendo o alquilo substituído com -N(R13)2, -CF3, N02 ou -S(=0)R13a); J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de estrutura -N(R3)C(R4)(R5)C(=0)-, em que: - 13- R3 é H ou alquilo CrCg; R4 é H ou alquilo C1-C3; R5 é seleccionado de entre: hidrogénio; alquilo CrC8 substituído com 0-2 Ru; alcenilo C2-C8 substituído com 0-2 R11; alcinilo C2-Cg substituído com 0-2 R11; cicloalquilo C3-C]0 substituído com 0-2 R11; uma ligação a Ln; arilo substituído com 0-2 R12; um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R ; =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R13)2, -CHO, -CH2OR13, -OC(=0)R13, -OC(=0)OR13a, -OR13, -0C(=0)N(R,3)2, -NR13C(=0)R13, -NR14C(=0)OR13a, -NR13C(=0)N(R13)2, NR14S02N(R13)2, -NR14S02R13a, -S03H, -S02R13a, -SR13, -S(=0)Rl3a, -S02N(R13)2, -N(R13)2, -NHC(=NH)NHR13, -C(=NH)NHR13, =NOR13, N02, -C(=0)NHOR13, -C(=0)NHNR,3R13a, =NOR13, -B(R34)(R35), -0CH2C02H, 2-( 1 -morfolino)etoxi, -SC(=NH)NHR13, N3, -Si(CH3)3, (alquil C,-C5)NHR16; -(alquil C0-C6)X;
onde q é independente- mente 0-1; - CH2
ch2x /
-(CH2)mS(0)P'(CH2)2X onde m = 1-2 e p' = 0-2, em que X é definido abaixo; e R3 e R4 podem também ser considerados em conjunto para
(CH2)nX formarem -CH2 CHCH2-, onde - 14-
//
NR 13
η = 0-1 e Xé -NH- C \ N(R,3)R13 ; R3 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem-(CH2)r ou-CH2S(0)p€(CH3)2-, onde t = 2-4 e p' = 0-2; ou R4 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)U-, onde u = 2-5; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura -N(R6)CH(R7)C(=0)-, em que: R6 é H ou alquilo CrC8; R7 é seleccionado de entre: -(alquil Ci-C7)X;
A em que cada q é indepen- -(ÇH2)q- x(CH2)q-X/ dentemente 0-2 e a substituição no fenilo é na posição 3 ou 4;
(CH
*Q
em que cada q é independen- (CH2)q—X temente 0-2 e a substituição no ciclo-hexilo é na posição 3 ou 4;
-(CH2)mO-(alquil Ci-C4)-X, onde m = 1 ou 2; -(CH2)mS(0)p-(alquil CrC4)-X, onde m=l ou 2 e p-0-2; e X é seleccionado de entre: - 15 - NR13 //
-NH-C \ N(R,3)R13 ; -N(NR,3)R13; -C(=NH)(NH2); -SC-(=NH)-NH2; -NH-C(=NH)(NHCN); -NH-C(=NCN)(NH2); -NH-C(=N-ORi3)(NH2); R6 e R7 podem altemativamente ser considerados em conjunto para
(CH2)nX formarem -(CH2)q CH(CH2)q-, em que cada q é independentemente 1 ou 2 e em que n = 0 ou 1 e X é NH2 ou //
NR 13
-NH-C \ N(R,3)R13 ; L é -Y(CH2)vC(=0)-, em que: Y é NH, N(alquilo C,-C3), O ou S; e v = 1 ou 2; M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura , 17 - NR1ÇH-C(=0)- (CjH(R^
R em que q' é 0-2; R17 é H, alquilo C1-C3; R8 é seleccionado de entre: -C02R13, -S03R13, -S02NHR14, -B(R34)(R35), -NHS02CF3j -C0NHNHS02CF3, -PO(OR13)2, -PO(OR13)R13, -S02NH-heteroarílo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O), -S02NHC0R13, -C0NHS02R13a, -CH2C0NHS02R13a, -NHS02NHC0R,3a, -NHCONHS02R13a, -S02NHC0NHR13; R34 e R35 são independentemente seleccionados de entre: -OH, -F, -N(R13)2 ou alcoxi CpCs; R34 e R35 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem: um éster de boro cíclico onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida de boro cíclica divalente onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida-éster de boro cíclica onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O. A invenção também proporciona kits, ou estojos, que compreendem os referidos reagentes, produtos radiofarmacêuticos obteníveis através dos referidos reagentes e o uso dos referidos reagentes para a preparação de produtos radiofarmacêuticos adequados como agentes para a formação de imagens para a diagnose de trombos arteriais e venosos.
Breve Descrição das Figuras
Figura la. Estão ilustradas imagens típicas do composto radiofarmacêutico do Exemplo 12 administrado a 1 mCi/kg, i.v. num modelo de trombose na veia profunda canina. Neste modelo, os trombos foram formados nas veias jugulares durante um período de estase que foi seguido por refluxo. Os compostos foram administrados começando no refluxo. Está delineada a captação num trombo venoso que cresce rapidamente aos 15, 60 e 120 min pós-administração. - 17-
Figura lb. Estão ilustradas imagens típicas do composto radiofarmacêutico do Exemplo 19 administrado a 1 mCi/kg, i.v. num modelo de trombose na veia profunda canina. Neste modelo, os trombos foram formados nas veias jugulares durante um período de estase que foi seguido por refluxo. Os compostos foram administrados começando no refluxo. Está delineada a captação num trombo venoso que cresce rapidamente aos 15, 60 e 120 min pós-administração.
Descrição Detalhada da Invenção As encorporações preferidas da invenção são indicadas abaixo: [2]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: R31 está ligado a (C(R23)R22)n·’ e (C(R21)R1)n· em 2 átomos diferentes no referido anel carbocíclico.
[3]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: n" é 0 e n’ é 0 n" é 0 e n' é 1 n" é 0 e n' é 2 n" é 1 e n' é 0 n" é 1 e n' é 1 n" é 1 e n’ é 2 n" é 2 e n' é 0 [4] - 18- n" é 2 e n' é 1; ou n" é 2 e n' é 2.
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: R6 é metilo, etilo ou propilo.
[5]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: R32 é seleccionado de entre: -C(=0)-, -C(=S)-, -S(=0)2-; R1 e R22 são independentemente seleccionados de entre: hidrogénio; alquilo CpCs substituído com 0-2 R11; alcenilo C2-C8 substituído com 0-2 Rn; alcinilo C2-Cs substituído com 0-2 R11; cicloalquilo C3-C8 substituído com 0-2 R11; bicicloalquilo C6-C10 substituído com 0-2 R ; uma ligação a Ln; arilo substituído com 0-2 R ; um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R12; =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R13)2, -CHO, -CH2OR13, -OC(=0)R13, -OC(=0)OR13a, -OR13, -0C(=0)N(R13)2, -NR13C(=0)R13, -NR14C-(=0)OR13a, -NR13C(=0)N(R13)2, NR14S02N(R13)2, -NR14S02R13a, -SO3H, -S02R13a, -SR13, -S(=0)R13a, -S02N(R13)2, -CH2N(R13)2, -N(R13)2, -NHC(=NH)NHR13, -C(=NH)NHR13, N02; R1 e R21 podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 5-7 membros substituído com 0-2 R12; quando n' é 2, R1 ou R21 podem altemativamente ser considerados em 1 91 conjunto com R ou R sobre um átomo de carbono adjacente para formarem uma ligação directa, formando por esse meio uma ligação dupla ou tripla entre os referidos átomos de carbono; R22 e R23 podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 3-7 membros substituído com 0-2 R ; quando n" é 2, R22 ou R23 podem altemativamente ser considerados em 99 91 conjunto com R ou R sobre um átomo de carbono adjacente para formarem uma ligação directa, para formar por esse meio uma ligação dupla ou tripla entre os referidos átomos de carbono; R1 e R2, onde R21 é H, podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 5-8 membros substituído com 0-2 R ; R11 é seleccionado de entre um ou mais dos seguintes: =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R,3)2, -CHO, -CH2OR13, -0C(=0)R13, -0C(=0)0R13a, -OR13, -0C(=0)N- (R13)2, -NR13C(=0)R13, -NR14C(=0)0R13a, -NR13C(=0)N(R13)2, -NR14S02N(R13)2, -NR14S02R13a, -S03H, -S02R13a, -SR13, -S(=0)R13a, -S02N(R,3)2, -CH2N(R13)2, -N(R13)2, -NHC(=NH)-NHR13, -C(=NH)NHR13, =NOR13, N02, alquilo C,-C5, alcenilo C2-C4, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, alcoxialquilo C2-Cô, alquilo C1-C4 (substituído com -NRI3R14, -CF3, N02, -S02R13 ou -S(=0)R13a), arilo substituído com 0-2 R , um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R12; R3 é H ou CH3; R5 é H, alquilo CrC8, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil Ci-Côjmetilo, (cicloalquil Ci-C6)etilo, fenilo, fenilmetilo, CH2OH, CH2SH, CH2OCH3, CH2SCH3, CH2CH2SCH3, (CH2)sNH2, (CH2)sNHC-(=NH)(NH2), (CH2)sNHR16, onde s = 3-5; uma ligação a L„; R3 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)t- (t = 2-4) ou -CH2SC(CH3)2-; ou R7 é seleccionado de entre: -(alquil Cj-C7)X; / \ em que cada q é indepen- -(CH2)
-(CH2) -X n r dentemente 0-2 e a substituição no fenilo é na posição 3 ou 4; —(CH2) (CH2) -X em ^ue cac^a 9 é independen temente 0-2 e a substituição no ciclo-hexilo é na posição 3 ou 4;
-(CH2)mO-(alquil CpC^-X, onde m = 1 ou 2; -(CH2)mS-(alquil C|-C4)-X, ondem=lou2; e X é seleccionado de entre: -NH-C(=NH)(NH2), -NHR13, -C(=NH)(NH2), -SC(NH)-NH2; R6 e R7 podem altemativamente ser considerados em conjunto para
(ÇH2)nX formarem -CH2 CHCH2-, onde n = 0 ou 1 e X é NH2 ou -NH-C(=NH)(NH2); -Y(CH2)vC(=0)-, em que: Y é NH, N(alquilo CrC3), O ou S; e v = 1 ou 2; M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura
(ÇH(R4))„. R8 , em que q' é 0-2; R17.é H, alquilo CrC3; R8 é seleccionado de entre: -C02R13, -S03R13, -S02NHR14, -B(R34)(R35), -NHS02CF3, -C0NHNHS02CF3, -PO(OR13)2, -PO(OR13)R13, -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O), -S02NHC0R13, -C0NHS02R13a, -CH2C0NHS02R13a, -NHS02NHC0R13a, -NHC0NHS02R13a, -S02NHC0NHR13; R34 e R35 são independentemente seleccionados de entre: -OH, -F, -NRI3R14 ou alcoxi C,-C8; R34 e R35 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem: um éster de boro cíclico onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida de boro cíclica divalente onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida-éster de boro cíclica onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O.
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: R31 é seleccionado de entre: (a) um anel carbocíclico de 6 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, substituído com 0-3 R10 ou R10a, e suportando facultativamente uma ligação a Ln; (b) um anel carbocíclico bicíclico condensado de 8-11 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, substituído com 0-3 R10 ou R10a, e suportando facultativamente uma ligação a Ln; e (c) um anel carbocíclico tricíclico condensado de 14 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, substituído com 0-3 R10 ou R10a, e suportando facultativamente uma ligação a Ln.
[7]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: R31 é seleccionado de entre: (a) um anel carbocíclico de 6 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, de fórmulas:
em que qualquer das ligações que formam o anel carbocíclico pode ser
uma ligação simples ou dupla, em que o referido anel carbocíclico é substituído com 0-3 R10, e suporta facultativamente uma ligação a Ln; (b) um anel carbocíclico bicíclico de 10 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, de fórmula: w-/- em que qualquer das ligações que formam o anel carbocíclico pode ser uma ligação simples ou dupla, em que o referido anel carbocíclico é independentemente substituído com 0-4 R10, e suporta facultativamente uma ligação a Ln; e (c) um anel carbocíclico bicíclico de 9 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, de fórmula: to / em que qualquer das ligações que formam o anel carbocíclico pode ser uma ligação simples ou dupla, em que o referido anel carbocíclico é independentemente substituído com 0-4 R10, e suporta facultativamente uma ligação a Ln.
[8]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: -24- RJ é seleccionado de entre (a linha a tracejado pode ser uma ligação simples ou dupla):
em que R31 pode ser independentemente substituído com 0-3 R10 ou R10a, e suporta facultativamente uma ligação a Ln; n" é 0 ou 1; e n' é 0-2. -25- -NR13S02N(R13)2, NRl3S02R13a, -S03H, -S02R13a, -S(=0)R13a, -SR13, -S02N(R13)2, alcoxialquilo C2-C6, metilenodioxi, etilenodioxi, haloalquilo C1-C4, haloalcoxi C1-C4, (alquil Ci-C4)carboniloxi, (alquil Ci-C4)carbonilo, (alquil Ci-C4)carbonilamino, -0CH2C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo CrC4 (sendo o alquilo substituído com -N(R,3)2, -CF3, N02 ou -S(=0)Rl3a).
[10]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: R31 é seleccionado de entre:
em que R31 pode ser independentemente substituído com 0-3 R10 ou R10a, e pode facultativamente suportar uma ligação a Ln; R32 é -C(=0)-; n" é 0 ou 1; n’ é 0-2; ] 22 · R e R são independentemente seleccionados de entre: H, alquilo C1-C4, fenilo, benzilo, fenil-(alquilo C2-C4), alcoxi C]-C4; e uma ligação a Ln; 21 23 R e R são independentemente H ou alquilo CrC4; R2 é H ou alquilo C]-C8; R10 e R10a são independentemente seleccionados de entre: H, alquilo Ci-C8, fenilo, halogéneo ou alcoxi CrC4; J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de estrutura -N(R3)C(R4)(R5)C(=0>, em que: R3 é H ou CH3; R4 é H ou alquilo CrC3; R5 é H, alquilo CrC8, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, (cicloalquil C3-Có)etilo, fenilo, fenilmetilo, CH2OH, CH2SH, CH2OCH3, CH2SCH3, CH2CH2SCH3, (CH2)sNH2, (CH2)sNHC-(=NH)(NH2), (CH2)sNHR16, onde s = 3-5; e uma ligação a Ln; ou R3 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)t- (t = 2-4) ou -CH2SC(CH3)2-; ou R4 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)U-, onde u = 2-5; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; ou 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero L de aminoácido de estrutura -N(R6)CH(R7)C(=0)-, em que: R6 é H ou alquilo Q-Cg; -27-
-(CH2)rX, onde r = 3-6;
-(CH2)mS(CH2)2X, onde m = 1 ou 2; -(alquil C3-C7)-NH-(alquilo CrC6); - (Cj-C^ alquilo)
-(CH2)m-0-(alquil CrC4)-NH-(alquilo CrC6), onde m = 1 ou 2; -(CH2)m-S-(alquil CrC4)-NH-(alquilo CrC6), onde m=l ou 2; e X é -NH2 ou -NHC(=NH)(NH2); ou R6 e R7 podem altemativamente ser considerados em conjunto para
(CH2)nX formarem -CH2 CHCH2-, onde n = 0 ou 1 e X é NH2 ou -NHC(=NH)(NH2); L é -Y(CH2)vC(=0)-, em que: Y é NH, O ou S; e v = 1 ou 2; M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura - NR17- CH-C(=0)- -28- -28- [11] (CjH(R4))q. R8 , em que q' é 0-2; R17 é H, alquilo CrC3; R8 é seleccionado de entre: -C02R13, -S03R13, -S02NHR14, -B(R34)(R35), -nhso2cf3, -C0NHNHS02CF3, -PO(OR,3)2j -PO(OR13)R13, -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O), -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos seleccionados independentemente de entre N, S ou O), -S02NHC0R13, -C0NHS02R,3\ -CH2C0NHS02R13a, -NHS02NHC0R13a, -NHC0NHS02R13a, -S02NHC0NHR13; 13 R é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo CpCio, cicloalquilo C3-C)0, alquilcicloalquilo C4-Cí2, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-Ci0; R13a é alquilo C]-C10, cicloalquilo C3-Cio, alquilcicloalquilo C4-Ci2, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-C]0; quando dois grupos R estão ligados a um N isolado, os referidos 1 grupos R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)2.s- ou -(CH2)0(CH2)-; R14 é OH, H, alquilo Ci-C4 ou benzilo.
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: Q é um composto de fenilo 1,3-dissubstituído da fórmula (II):
UI) em que: o anel fenilo mostrado na fórmula (II) pode ser substituído com 0-3 R10 e pode facultativamente suportar uma ligação a Ln; R10 é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo CrCg, fenilo, halogéneo ou alcoxi CrC4; R1 é H, alquilo CrC4, fenilo, benzilo, fenil(alquilo C2-C4), ou uma ligação a
Ln? Λ R é H ou metilo; J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de estrutura -N(R3)C(R4)(R5)C(=0)-, em que: R3 é H ou CH3; R4 é H ou alquilo Ci-C3; R5 é H, alquilo Q-Cg, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, (cicloalquil Ci-C6)etilo, fenilo, fenilmetilo, CH2OH, CH2SH, CH2OCH3, CH2SCH3, CH2CH2SCH3, (CH2)sNH2, -(CH2)sNHC-(=NH)(NH2), -(CH2)sNHR16, onde s = 3-5, ou uma ligação a Ln; R e R podem altemativamente ser considerados em conjunto para -30- formarem-CH2CH2CH2-; ou R4 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)U-, onde u = 2-5; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero L de aminoácido de estrutura -N(R6)CH(R7)C(=0)-, em que: R6 é H ou alquilo CrC8;
onde q = 0 ou 1; -(CH2)rX, onde r = 3-6;
-(CH2)mS(CH2)2X, onde m = 1 ou 2; -(alquil C3-C7)-NH-(alquilo CrC6); -(Cj-C* alquilo )v
C .NH 0-3 -(CH2)m-0-(alquil C]-C4)-NH-(alquilo Cj-C6), onde m = 1 ou 2; -(CH2)m-S-(alquil C]-C4)-NH-(alquilo Ci-Cô), onde m=l ou 2; e X é -NH2 ou -NHC(=NH)(NH2), com a condição de que X não é -NH2 quando r = 4; ou R6 e R7 podem altemativamente ser considerados em conjunto para
(CH2)nX formarem -CH2CHCH2-, onde n = 0-1 e X é -NH2 ou -NHC(=NH)(NH2); L é -Y(CH2)vC(=0)-, em que: Y é NH, O ou S; e v = 1-2;
R' M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura - NR17· ))- , em que q' é 0-2; R17 é H, alquilo C1-C3; R8 é seleccionado de entre: -C02R13, -SO3R13, -S02NHR14, -B(R34)(R35), -nhso2cf3, -C0NHNHS02CF3, -PO(OR13)2, -PO(OR13)R13, -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos seleccionados independentemente de entre N, S ou O), -S02NHC0R13, -C0NHS02R13a, -CH2C0NHS02R13a, -NHS02NHC0R13a, -NHC0NHS02R13a, -S02NHC0NHR13; R13 é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo CrCio, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-Ci2, arilo, -(alquil C]-Ci0)arilo ou alcoxialquilo C3-C10;
Rl3a é alquilo CrCio, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-Ci2, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-C10; -32- quando dois grupos R13 estão ligados a um N isolado, os referidos 1 3 grupos R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)2_5- ou -(CH2)0(CH2)-; R14 é OH, H, alquilo CrC4 ou benzilo.
[12]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: Q é um composto de fenilo 1,3-dissubstituído da fórmula (II):
(II) em que: o anel fenilo mostrado na fórmula (II) pode ser substituído com 0-3 R10 ou 10a.
R R10 ou RIOa são independentemente seleccionados de entre: H, alquilo Q-Cg, fenilo, halogéneo ou alcoxi CrC4; R1 é H, alquilo CrC4, fenilo, benzilo ou fenil(alquilo C2-C4); R2 é H ou metilo; J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de estrutura -N(R3)C(R4)(R5)C(=0)-, em que: R3 é H ou CH3; -33 - R4éH; R5 é H, alquilo Ci-Cg, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, (cicloalquil C3-C6)etilo, fenilo, fenilmetilo, CH2OH, CH2SH, CH2OCH3, CH2SCH3, CH2CH2SCH3j (CH2)sNH2, (CH2)sNHC-(=NH)(NH2), (CH2)sNHR16, onde s = 3-5; ou uma ligação a Ln; R3 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -CH2CH2CH2-; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero L de aminoácido de estrutura -N(R6)CH(R7)C(=0)-, em que: R6 é H ou alquilo C3-Cg;
onde q = 0 ou 1;
-(CH2)rX, onde r = 3-6; - CH -ζ~^-ΟΗ2Χ ch2x -(CH2)„,S(CH2)2X, onde m = 1 ou 2; -(alquil C4-C7)-NH-(alquilo Ci-C6); “ alquilo NH 0-3 -34- -(CH2)m-0-(alquil Ci-C4)-NH-(alquilo CrC6), onde m = 1 ou 2; -(CH2)m-S-(alquil Ci-C4)-NH-(alquilo Ci-C6), onde m=l ou 2; e X é -NH2 ou -NHC(=NH)(NH2), com a condição de que X não é -NH2 quando r = 4; ou L é -YCH2C(=0)-, em que: Y é NH, O; M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura
(CjH(R4)),' R8 , em que q' é 1; R17 é H, alquilo C1-C3; R é seleccionado de entre: -C02H ou -S03R ; R13 é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo CpCio, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-Ci2, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-C10· [13]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [12], acima, em que: o anel fenilo mostrado na fórmula (II) suporta uma ligação a Ln e pode ainda ser substituído com 0-2 R10 ou R10a; R10 ou R10a são independentemente seleccionados de entre: H, alquilo CpCg, fenilo, halogéneo ou alcoxi CrC4; R1 éH; J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de fórmula -N(R3)CH(R5)C(=0)-, em que: R3 é H e R5 é H, CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, CH(CH3)CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, CH2CH2SCH3, CH2CH(CH3)2, (CH2)4NH2, (alquil C3-C5)NHR16; ou R3éCH3eR5éH; ou Λ c RJ e R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -CH2CH2CH2-; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero L de aminoácido de fórmula -N(CH3)CH(R7)C(=0)-, em que: R7 é -(CH2)3NHC(=NH)(NH2); L é -NHCH2C(=0)-; e M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura - NR17- <pH-C(=0)-((jH(R4))q· R8 , em que q'él; R4 é H ou CH3; R,7éH; R8 é -C02H; -S03H.
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [12] ou [13], acima, em que: o anel fenilo na fórmula (II) suporta uma ligação a Ln; R1 e R2 são independentemente seleccionados de entre H, metilo; J é seleccionado de entre D-Val, ácido D-2-aminobutírico, D-Leu, D-Ala, Gly, D-Pro, D-Ser, D-Lys, β-Ala, Pro, Phe, NMeGly, D-Nle, D-Phg, D-Ile, D-Phe, D-Tyr, Ala, NE-/?-azidobenzoil-D-Lys, NE-/?-benzoilben-zoil-D-Lys, NE-triptofanil-D-Lys, NE-o-benzilbenzoil-D-Lys, NE-p-ace-tilbenzoil-D-Lys, NE-dansil-D-Lys, NE-glicil-D-Lys, NE-glicil-p-ben-zoilbenzoil-D-Lys, NE-/?-fenilbenzoil-D-Lys, NE-m-benzoilbenzoil-D--Lys, NE-o-benzoilbenzoil-D-Lys; K é seleccionado de entre NMeArg, Arg; L é seleccionado de entre Gly, β-Ala, Ala; M é seleccionado de entre: Asp, aMeAsp, βΜεΑβρ, NMeAsp, D-Asp.
[15]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, em que: R31 é um anel fenilo que suporta uma ligação a Ln; R'eR2 são independentemente seleccionados de entre H, metilo; J é seleccionado de entre D-Vai, ácido D-2-aminobutírico, D-Leu, D-Ala, Gly, D-Pro, D-Ser, D-Lys, β-Ala, Pro, Phe, NMeGly, D-Nle, D-Phg, D-Ile, D-Phe, D-Tyr, Ala; K é seleccionado de entre NMeArg; -37- L é Gly; M é seleccionado de entre: Asp, aMeAsp, βΜεΑβρ, NMeAsp, D-Asp.
[16]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1]-[15], acima, em que:
Ch é seleccionado de entre:
W-a2“W 1' Λ N ,W-A2
wa I w a' w \ A2 w" A3-W—A4-W-"A6w X' i AI W 4 A3 »2_W—A4—w~ A^—W—A7 \ w' ,A2“"w—A4—w—A6—W A7 w \
W I w A5 /
W
A1-W w a2 ^*6 A5 / w —w W A2 Xa6 Αχ w A4 w \ / w—A3^ w / w^n\ / w-Ay w / em que: A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 e A8 são independentemente seleccionados em -38- cada ocorrência de entre: NR40R41, S, SH, S(Pg), OH; W é uma ligação, CH ou um grupo espaçador seleccionado de entre: alquilo CrC3 substituído com 0-3 R52;
Wa é um grupo metileno ou um carbociclo C3-C14; R40, R41, R42, R43 e R44 são cada um independentemente seleccionados de entre: uma ligação a Ln, hidrogénio, alquilo Ci-C]0 substituído com 0-3 R52, e um electrão, com a condição de que quando um ^ dos R40 ou R41 é um electrão, então o outro é também um electrão, e com a condição de que quando um dos R42 ou R43 é um electrão, então o outro é também um electrão; adicionalmente, R40 e R41 podem combinar-se para formarem =C(alquil Ci-C3)(alquilo CrC3); R é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: uma ligação a Ln, =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R53, -C(=0)R53, -C(=0)N(R53)2, -CHO, -CH2OR53, -0C(=0)R53, -0C(=0)0R53a, -OR53, -0C(=0)N(R53)2, -NR53C(=0)R53, -NR54C(=0)0R53a, -NR53C(=0)N(R53)2, -NR54S02N(R53)2, • -NR54S02R53a, -SO3H, -S02R53a, -SR53, -S(=0)R53a, -S02N(R53)2, -N(R53)2, -NHC(=NH)NHR53, -C(=NH)NHR53, =NOR53, N02, -C(=0)NH0R53, -C(=0)NHNR53R53a, -OCH2-C02H, 2-(l-morfolino)etoxi; R53, R53a e R54 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: uma ligação a Ln, alquilo Ci-Cô· [17]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1]-[15], acima, de fórmula: -39-(QLn)dCh » em que d é 1; e Q é seleccionado de entre:
A
/ em que: A1 e A4 são SH ou SPg; A2 e A3 são NR41; W é independentemente seleccionado de entre: CHR52, CH2CHR52, CH2CH2CHR52 e CHR52C=0; e R41 e R52 são independentemente seleccionados de entre hidrogénio e uma ligação a Ln, e .W—a2 A1 * em que: A1 é NH2 ou N=C(alqui1 Ci-C3)(alquilo C1-C3); W é uma ligação; A2 é NHR40, em que R40 é um heterociclo substituído com R52, em que o heterociclo é seleccionado de entre: piridina, pirazina, prolina, furano, tiofurano, tiazole e diazina, e R é uma ligação a Ln.
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1]-[15], [181 -40- acima, de fórmula: (QLn)dCh , em que d é 1; e em que Ch é: .W—A2 A* Í em que: A1 NH2 ou N=C(alquil C|-C3)(alquilo C1-C3); W é uma ligação; A2 é NHR40, em que R40 é um heterociclo substituído com R52, em que o heterociclo é seleccionado de entre piridina e tiazole e R é uma ligação a Ln.
[19]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1]-[15], acima, em que Ln é um composto de fórmula: Μ1- [Y1 (CR55R56)h (Z V Y2]h. - M2 em que todas as variáveis são como definidas em [1], acima.
[20]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [16], acima, em que Ln é: -(CR55R56)g.-[Y1(CR55R56)hY2]h. - (CR55R56)g·-, em que todas as variáveis são como definidas em [1], acima.
[21] -41 -
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [17], acima, em que Ln é: -(CR55R56)g..-[Y1(CR55R56)hY2]h. - (CR55R56)g"-, em que: g" é 1-5; h é 0-5; h' é 1-5; 1 Y e Y , em cada ocorrência, são independentemente seleccionados de entre: O, NR56, C=0, C(=0)0, 0C(=0)0, C(=0)NH-, C=NR56, S, SO, S02, S03, NHC(=0), (NH)2C(=0), (NH)2C=S; R55 e R56 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: hidrogénio, alquilo CpCio; (alquil C[-Cio)ari1o.
[22]
Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [18], acima, em que Ln é: -(CR55R56)g"-[Y1(CR55R56)hY2]h' - (CR55R56)g'-, em que: g" é 1-5; h é 0-5; h' é 1-5; Y1 e Y2, em cada ocorrência, são independentemente seleccionados de entre: O, NR56, C=0, C(=0)0, 0C(=0)0, C(=0)NH-, C=NR56, S, NHC(=0), (NH)2C(=0), (NH)2C=S; R55 e R56 são hidrogénio.
[23] -42- Estão incluídos na presente invenção aqueles reagentes em [1], acima, que são:
.43' .43'
[24]
Está também incluído na presente invenção um kit para a preparação de um composto radiofarmacêutico que compreende uma quantidade predeterminada de um reagente estéril, farmaceuticamente aceitável, de [21]-[23], acima. -44- [25]
Está também incluído na presente invenção um composto radiofarmacêutico que compreende um complexo de um reagente de [1]-[18], acima, e um radionuclido seleccionado de entre 99mTc, 94mTc, 95Tc, inIn, 62Cu, 43Sc, 45Ti, 67Ga, 68Ga, 97Ru, 72As, 82Rb e 20,T1.
[26]
Está também incluído na presente invenção um composto radiofarmacêutico que compreende um complexo de um reagente de [19]-[21], acima, e um radionuclido seleccionado de entre 99mTc, mIn e 62Cu.
[27]
Está também incluído na presente invenção um composto radiofarmacêutico que compreende um complexo de um reagente de [22], acima, e um radionuclido seleccionado de entre 99mTc e luIn.
[28] compostos
Estão incluídos na presente invenção os radiofarmacêuticos de [25], acima, os quais são: nh Λ h2n
s'x''>Atí^Y0 - hn_, .,H HN^O ° nO"1 -45 -
ΝΗ Ρ ΟγΝχ Η V^fH W^O° °ν Ο ,—. ο τ 0^Η5 ΝΗ Λ Ο
S^"VW
HjN Ο /”\ Ο cX;" 0*_Ν^ ΗΝ^^,ΟΗ ΝΗ ΗΝ*^0 ° Ν,Η-^ ΝΗ ϊΡ-ΝΧ-γΟ
Ο ΟΗ π HNy^OH Υ>Η ΗΝ^Ο°
,ΝΗ Ρν Ν „ΐ£τΦ\ Η0 OH ΗΟ
-46- HO
Ν,Η
Ν2Η
ΝΗ cr>*
OH
o-f° ^1^ OH HO OH H0‘
-47-
-49-
OH - 50- ν>
OH
[29]
Está também incluído na presente invenção o uso de um reagente de [l]-[23], acima, para a preparação de um composto radiofarmacêutico para a visualização de locais de deposição de plaquetas num mamífero por formação de radioimagens.
Conforme acima sublinhado, os compostos cíclicos da presente invenção são marcados radioactivamente. Por "marcado radioactivamente" deve entender-se que os compostos plaqueta glicoproteína Ilb/IIIa cíclicos sujeitos contêm um radioisótopo que é adequado para administração a um paciente mamífero. Os radioisótopos adequados são conhecidos dos peritos na técnica e incluem, por exemplo, isótopos de halogéneos (tais como cloro, flúor, bromo e iodo) e metais que incluem tecnécio e índio. Os radioisótopos preferidos incluem, nC, 18F, ,23I, ]25I, ,3,I, 99mTc, 94mTc, 95Tc, U1ln, 62Cu, 43Sc, 45Ti, 67Ga, 68Ga, 97Ru, 72As, 82Rb e 201T1. Os mais preferidos são os isótopos 123I, U1ln e 99mTc. Os compostos marcados radioactivamente da invenção podem ser preparados usando procedimentos de marcação radioactiva padrão bem conhecidos dos peritos na técnica. A metodologia de síntese adequada está descrita em detalhe abaixo. Conforme discutido abaixo, os compostos plaqueta glicoproteína Ilb/IIIa cíclicos da invenção podem ser marcados radioactivamente quer directamente (quer dizer, por incorporação directa da radiomarcação nos compostos) quer indirectamente (isto é, por incorporação da radiomarcação nos compostos através de um agente quelante, onde o agente quelante tenha sido incorporado nos compostos). Com marcação radioactiva isotópica, um grupo já presente nos compostos cíclicos descritos acima é substituído (trocado) pelo radioisótopo. Com radiomarcação não isotópica, o radioisótopo é adicionado aos compostos cíclicos sem substituição (troca) por um grupo já existente. Os compostos directa ou indirectamente marcados radioactivamente, bem como os compostos com marcação radioactiva isotópica e não isotópica, estão incluídos dentro da frase "compostos marcados radioactivamente" conforme usada em conexão com a presente invenção. Tal radiomarcação deverá ser razoavelmente estável, não só química mas também metabolicamente, aplicando padrões reconhecidos na técnica. Também, ainda que os compostos da invenção possam ser marcados de uma variedade de maneiras com uma variedade de radioisótopos diferentes, como os peritos na técnica reconhecerão, tal radiomarcação deverá ser realizada de uma maneira tal que a alta afinidade de ligação e especificidade dos compostos plaqueta GP Ilb/IIIa cíclicos não marcados da invenção para o receptor de GP Ilb/IIIa não seja significativamente afectada. Por não significativamente afectada deve entender-se que a afinidade e especificidade da ligação não são afectadas mais do que cerca de 2 unidades log, mais preferivelmente não mais do que 1 unidade log, mesmo mais preferivelmente não mais do que cerca de 500% e ainda mesmo mais preferivelmente não mais do que 250%, e o mais preferível é que a afinidade e especificidade da ligação não seja nada afectada. -53-
Para compostos marcados radioactivamente, a marcação pode aparecer em qualquer posição sobre Q. Os compostos marcados radioactivamente da invenção preferidos são compostos marcados radioactivamente em que a marcação radioactiva está localizada sobre o sistema em anel carbocíclico de R , o substituinte R em J e em R ou R . Os compostos marcados radioactivamente mesmo mais preferidos da invenção são os de fórmula (II), em que a radiomarcação está localizada sobre o sistema em anel carbocíclico de R31, ou substituinte R5 sobre J. Em relação aos compostos marcados radioactivamente directamente preferidos e mais preferidos, a radiomarcação preferida é uma marcação de halogéneo, especialmente uma radiomarcação de iodo. Para compostos marcados radioactivamente indirectamente, os nuclidos de metal preferidos são 99mTc e 111 In. Os grupos de ligação preferidos, Ln e quelantes de metal, Ch, são descritos abaixo.
Foi descoberto que os compostos marcados radioactivamente da invenção são úteis como compostos radiofarmacêuticos para a formação não invasiva de imagens para a diagnose de desordens tromboembólicas presentes ou potenciais, tais como trombose arterial ou venosa, incluindo, por exemplo, angina instável, enfarte do miocárdio, ataque isquémico transiente, derrame cerebral, aterosclerose, diabetes, tromboflebite, embolia pulmonar, ou tampões, trombos e êmbolos de plaquetas causados por dispositivos cardíacos prostéticos tais como válvulas do coração. Os compostos marcados radioactivamente da invenção também podem ser usados para a diagnose de outras condições presentes ou potenciais onde há sobreexpressão dos receptores GP Ilb/IIIa, tal como com células de cancro metastáticas. Os compostos sujeitos podem ser efectivamente empregues em doses baixas, minimizando-se por este meio qualquer risco de toxicidade. Também, os compostos sujeitos são de um tamanho muito mais pequeno do que, por exemplo, os anticorpos 7E3 radiomarcados conhecidos na técnica, permitindo o alcance mais fácil da adequada proporção alvo/fundo (T/B) para a detecção de trombos. O uso dos compostos marcados radioactivamente da invenção é ainda descrito na secção utilidade, abaixo.
Na invenção presente foi também descoberto que os compostos marcados radioactivamente anteriores são úteis como inibidores de glicoproteína Ilb/IIIa (GP Ilb/IIIa) e por conseguinte os compostos marcados radioactivamente da invenção também podem ser empregues para propósitos terapêuticos, em adição à utilização para diagnóstico descrita acima. Conforme discutido acima, a GPIIb/IIIa medeia o processo de activação e agregação de plaquetas. Os compostos marcados radioactivamente da presente invenção inibem a activação e agregação de plaquetas induzidas por todos os agonistas de plaquetas endógenos conhecidos.
Os compostos aqui descritos podem ter centros assimétricos. A menos que indicado de maneira diferente, todas as formas quirais, diastereoméricas e racémicas estão incluídas na presente invenção. Muitos isómeros geométricos de olefmas, ligações duplas C=N podem também estar presentes nos compostos aqui descritos e todos estes isómeros estáveis estão contemplados na presente invenção. Será apreciado que os compostos da presente invenção contêm átomos de carbono assimetricamente substituídos e podem ser isolados em formas opticamente activas ou racémicas. É bem conhecido na técnica como preparar formas opticamente activas, tal como por resolução de formas racémicas ou por síntese, a partir de materiais de partida r opticamente activos. E conhecido que ocorrem dois isómeros distintos (cis e trans) na ligação péptida; ambos podem também estar presentes nos compostos aqui descritos e todos estes isómeros estáveis estão contemplados na presente invenção. A menos que especificamente notado de maneira diferente, o isómero L do aminoácido é usado nas posições J, K, L e M dos compostos da presente invenção. Excepto conforme proporcionado na frase precedente, todas as formas - 55 - quirais, diastereoméricas e racémicas e todas as formas isoméricas geométricas de uma estrutura são pretendidas, a menos que a estereoquímica específica ou a forma de isómero seja especificamente indicada. Os isómeros D e L de um aminoácido particular são aqui designados usando a abreviatura de 3 letras do aminoácido, conforme indicado pelos seguintes exemplos: D-Leu, D-Leu, L-Leu ou L-Leu. 1 8
Quando qualquer variável (por exemplo, R até R , m, η, p, X e Y) ocorre mais do que uma vez em qualquer constituinte ou em qualquer fórmula, a sua definição em cada ocorrência está dependente da sua definição em qualquer outra ocorrência. Por conseguinte, por exemplo, se um grupo é mostrado ser substituído com 0-2 R11, então o referido grupo pode facultativamente ser substituído com até dois Rn e Rn em cada ocorrência é independentemente seleccionado de entre a lista definida de possíveis R11. Também, para servir de exemplo, para o grupo -N(R )2, cada um dos dois substituintes R sobre N é independentemente seleccionado de entre a lista definida de possíveis R13.
Quando uma ligação a um substituinte é mostrada a atravessar a ligação que une dois átomos num anel, então tal substituinte pode estar ligado a qualquer átomo no anel.
Combinações de substituintes e/ou variáveis são permitidas apenas se tais combinações resultam em compostos estáveis.
Por "composto estável" ou "estrutura estável" tem aqui o significado de um composto que é suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento a um grau útil de pureza a partir de uma mistura reaccional, e formulação num agente terapêutico eficaz. O termo "substituído", conforme aqui usado, significa que um ou mais hidrogénios no átomo designado é trocado por uma selecção a partir do grupo indicado, com a condição de que a valência normal do átomo designado não seja excedida e que a substituição resulte num composto estável. Quando um substituinte é ceto (isto é, =0), então dois hidrogénios sobre o átomo são trocados.
Conforme aqui usado, "alquilo" tem a intenção de incluir grupos hidrocarbonetos alifáticos saturados de cadeia não só ramificada mas também linear tendo um número específico de átomos de carbono; "haloalquilo" tem a intenção de incluir grupos hidrocarbonetos alifáticos saturados de cadeia não só ramificada mas também linear tendo um número específico de átomos de carbono, substituídos com 1 ou mais halogéneos (por exemplo, -CVFW onde v = 1 até 3 e w = 1 até (2v+l)); "alcoxi" representa um grupo alquilo de número de átomos de carbono indicado ligado através de uma ponte de oxigénio; "cicloalquilo" tem a intenção de incluir grupos em anel saturado, incluindo sistemas em anel mono, bi e policíclicos, tais como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, ciclooctilo e adamantilo; e "biciclo-alquilo" tem a intenção de incluir grupos em anel bicíclico saturado, tais como [3.3.0]biciclooctano, [4.3.0]biciclononano, [4.4.0]biciclodecano (decalina), [2.2.2]biciclooctano, e assim por diante. "Alcenilo" tem a intenção de incluir cadeias de hidrocarbonetos de configuração quer linear quer ramificada e uma ou mais ligações carbono-carbono não saturadas, as quais podem ocorrer em qualquer ponto estável ao longo da cadeia, tais como etenilo e propenilo; e "alcinilo" tem a intenção de incluir cadeias de hidrocarbonetos de configuração quer linear quer ramificada e uma ou mais ligações triplas carbono-carbono, as quais podem ocorrer em qualquer ponto estável ao longo da cadeia, tais como etinilo e propinilo. 1 - 57- A frase "ácido borónico", conforme aqui usada, significa um grupo da fórmula -B(R34)(R35), em que R34 e R35 são independentemente seleccionados de entre: -OH, -F, -NRI3R14 ou alcoxi Cj-Cg; ou R34 e R35 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem: um éster de boro cíclico onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 até 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida de boro cíclica divalente onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 até 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida-éster de boro cíclica onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 até 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O. Tais ésteres de boro, amidas de boro ou amidas-ésteres de boro cíclicos podem também ser facultativamente substituídos com 1-5 grupos independentemente seleccionados a partir de Rn.
Os ésteres de boro incluem grupos de protecção de ácido borónico, incluindo porções derivadas de diois, por exemplo pinanodiol e pinacol para formarem ésteres de ácido pinanodiol-borónico e o ácido pinacolborónico, respectivamente. Outras ilustrações de diois úteis para a derivação de ésteres de ácido borónico são perfluoropinacol, etilenoglicol, dietilenoglicol, 1,2-etanodiol, 1.3- propanodiol, 1,2-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,4-butanodiol, 2,3-butanodiol, 2.3- hexanodiol, 1,2-hexanodiol, catecol, 1,2-diisopropilrtanodiol, 5,6-decanodiol, 1,2-diciclo-hexiletanodiol. "Halo" ou "halogéneo" conforme aqui usados dizem respeito a flúor, cloro, bromo e iodo; e "contra-ião" é usado para representar uma espécie pequena carregada negativamente tal como cloreto, brometo, hidróxido, acetato e sulfato. -58-
Conforme aqui usado, "arilo" ou "resíduo aromático" tem a intenção de significar fenilo ou naftilo. Conforme aqui usado, "carbociclo" ou "resíduo carbocíclico" tem a intenção de significar qualquer anel de carbono monocíclico ou bicíclico de 3 a 7 membros, ou bicíclico ou tricíclico de 4 a 14 membros, ou policíclico de até 26 membros estável, qualquer dos quais pode ser saturado, parcialmente insaturado ou aromático, exemplos de tais carbociclos incluem ciclopropilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, fenilo, bifenilo, naftilo, indanilo, adamantilo e tetra-hidronaftilo (tetralina).
Conforme aqui usado, o termo "heterociclo" ou "sistema em anel heterocíclico" tem a intenção de significar um anel heterocíclico estável monocíclico ou bicíclico de 5 a 7 membros, ou bicíclico de 7 a 10 membros, o qual pode ser saturado, parcialmente insaturado ou aromático, e o qual consiste de átomos de carbono e desde 1 a 4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, O e S e em que os heteroátomos de azoto e enxofre podem facultativamente ser quatemizados, e que inclui qualquer grupo bicíclico no qual qualquer dos anéis heterocíclicos acima definidos está condensado a um anel benzeno. O anel heterocíclico pode ser ligado ao seu grupo pendente em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono o que resulta numa estrutura estável. Os anéis heterocíclicos aqui descritos podem ser substituídos num átomo de carbono ou num de azoto se o composto resultante for estável. Exemplos de tais heterociclos incluem benzopiranilo, tiadiazina, tetrazolilo, benzofuranilo, benzo-tiofenilo, indoleno, quinolina, isoquinolinilo ou benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidona, 2-pirrolidona, tetra-hidrofurano, tetra-hidroquinolina, tetra-hidro-isoquinolina, deca-hidroquinolina, octa-hidroisoquinolina, azocina, triazina (incluindo 1,2,3-, 1,2,4- e 1,3,5-triazina), 6/7-1,2,5-tiadiazina, 2/7,677-1,5,2-ditia-zina, tiofeno, tetra-hidrotiofeno, tiantreno, furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxitiina, 2/7-pirrole, pirrole, imidazole, pirazole, tiazole, isotiazole, oxazole (incluindo 1,2,4- e 1,3,4-oxazole), isoxazole, triazole, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindole, 3//-indole, indole, l//-indazole, purina, 4/í-quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiri-dina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, 4a//-carbazole, carbazole, β-carbolina, fenantridina, acridina, perimidina, fenantrolina, fenazina, fenar-sazina, fenotiazina, furazano, fenoxazina, isocromano, cromano, pirrolidina, pirrolina, imidazolidina, imidazolina, pirazolidina, pirazolina, piperazina, indoli-na, isoindolina, quinuclidina e morfolina. Também incluídos estão os compostos espiro e de anel condensado contendo, por exemplo, os heterociclos anteriores.
Conforme aqui usado, o termo "qualquer grupo que, quando administrado a um indivíduo mamífero, se separa para formar um hidroxilo, amino ou sulfídrilo livre" significa qualquer grupo ligado a um átomo O, N ou S, respectivamente, o qual é separado do átomo O, N ou S quando o composto é administrado a um indivíduo mamífero para produzir um composto que tem um grupo hidroxilo, amino ou sulfídrilo livre, respectivamente, que permanece. Exemplos de grupos que, quando administrados a um indivíduo mamífero, são separados para se formar um hidroxilo, amino ou sulfídrilo livre, incluem, mas sem constituir limitação, alquilo Ci-C6 substituído com 0-3 R11, alcoxialquilo C3-C6 substituído com 0-3 R11, (alquil CrC6)carbonilo substituído com 0-3 R11, (alcoxi Ci-Cô)carbonilo substituído com 0-3 Ru, (alquil Ci-C6)aminocarbonilo substituído com 0-3 R11, benzoílo substituído com 0-3 R12, fenoxicarbonilo substituído com 0-3 R , fenilaminocarbonilo substituído com 0-3 R . Exemplos de grupos que, quando administrados a um indivíduo mamífero, são separados para se formar um hidroxilo, amino ou sulfídrilo livre, incluem grupos de protecção de hidroxilo, amino ou sulfídrilo, respectivamente.
Conforme aqui usado, o termo "grupo de protecção de amina" significa qualquer grupo conhecido na técnica de síntese orgânica para a protecção de grupos amina. Tais grupos de protecção de amina incluem os listados em Green, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Nova Iorque (1981) e "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol 3, Academic Press, Nova Iorque (1981).
Qualquer grupo de protecção de amina conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de grupos de protecção de amina incluem os seguintes: 1) tipo acilo, tais como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo e p-toluenossulfonilo; 2) tipo carbamato aromático, tais como benziloxicarbonilo (Cbz ou Z) e benziloxi-carbonilos substituídos, 1 -(/7-bifenil)-1 -metiletoxicarbonilo e 9-fluorenilmetiloxi-carbonilo (Fmoc); 3) tipo carbamato alifático, tais como terc-butiloxicarbonilo (Boc), etoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo e aliloxicarbonilo; 4) tipo carbamato de alquilo cíclico, tais como ciclopentiloxicarbonilo e adamantiloxicarbonilo; 5) tipo alquilo, tais como trifenilmetilo e benzilo; 6) trialquilsilano e trimetilsilano; e 7) tipos contendo tiol tais como feniltiocarbonilo e ditiassuccinoílo. Também incluídos no termo "grupo de protecção de amina" são grupos acilo tais como azidobenzoílo, p-benzoilbenzoílo, o-benzilbenzoílo, p-acetilbenzoílo, dansilo, glicil-p-benzoilbenzoílo, benzoilbenzoílo.
Conforme aqui usado, "sais farmaceuticamente aceitáveis" diz respeito a derivados dos compostos revelados em que o composto progenitor de fórmula (I) é modificado fazendo sais de ácido ou de base dos compostos de fórmula (I). Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de ácido mineral ou orgânico de resíduos básicos tais como aminas; e sais alcalinos ou orgânicos de resíduos acídicos tais como ácidos carboxílicos.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção podem ser preparados por reacção das formas ácido ou base livres de tais compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriados em água ou num solvente orgânico ou numa mistura dos dois; geralmente, meios não aquosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol ou acetonitrilo são preferidos. Listas de sais adequados são encontradas em "Remingtoris Pharma-ceutical Sciences", 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418. O termo "aminoácido", conforme aqui usado, significa um composto orgânico contendo não só um grupo amino básico mas também um grupo carboxilo acídico. Incluídos dentro deste termo estão aminoácidos modificados e não usuais, tais como os revelados em, por exemplo, Roberts e Vellaccio, The Peptides, 5 (1983) 342-429. Os aminoácidos modificados ou não usuais que podem ser usados para a prática da invenção incluem D-aminoácidos, hidroxilisina, 4-hidroxiprolina, omitina, ácido 2,4-diaminobutírico, homoar-ginina, norleucina, ácido A-metilaminobutírico, naftilalanina, fenilglicina, β-fenilprolina, terc-leucina, 4-aminociclo-hexilalanina, A-metil-norleucina, 3,4-desidroprolina, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico, ácido 6-aminocaprói-co, ácido írans-4-(aminometil)-ciclo-hexanocarboxílico, ácido 2-, 3- e 4-(amino-metil)-benzóico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclo-propanocarboxílico e ácido 2-benzil-5-aminopentanóico. O termo "resíduo aminoácido", conforme aqui usado, significa aquela porção de um aminoácido (conforme aqui definido) que está presente num péptido. O termo "péptido", conforme aqui usado, significa um composto linear que consiste de dois ou mais aminoácidos (conforme aqui definidos) que estão ligados por meio de uma ligação péptida. O termo "péptido" também inclui compostos que contêm ambos os componentes péptido e não péptido, tais como resíduos pseudopéptidos ou miméticos de péptido ou outros componentes de não aminoácido. Um tal composto que contém ambos os componentes péptido e não péptido também podem ser referidos como um "análogo de péptido".
Um "pseudopéptido" ou "mimético de péptido" é um composto que mima a estrutura de um resíduo aminoácido ou um péptido, por exemplo, usando grupos de ligação diferentes de encadeamentos de amida entre o mimético de péptido e um resíduo aminoácido (ligações pseudopéptidas) e/ou usando substituintes não aminoácidos e/ou um resíduo aminoácido modificado.
Um "resíduo pseudopéptido" significa aquela porção de um pseudopéptido ou mimético de péptido (conforme aqui definido) que está presente num péptido. O termo "ligação péptida" significa um encadeamento de amida covalente formado por perda de uma molécula de água entre o grupo carboxilo de um aminoácido e o grupo amino de um segundo aminoácido. O termo "ligações pseudopéptidas" inclui isósteros de ligação péptida os quais podem ser usados em vez de ou como substitutos para o encadeamento amida normal. Estes encadeamentos "equivalentes substitutos ou de amida são formados a partir de combinações de átomos não normalmente encontradas em péptidos ou proteínas que mimam os requisitos espaciais da ligação amida e que deverão estabilizar a molécula em relação à degradação enzimática.
Os termos "Ln", "grupo de encadeamento" e "ligante" ou "encadeador", usados em qualquer parte intermutavelmente, designam o grupo de átomos que separa Q do quelante de metal, Ο,.
Os termos "grupo Ln activado", "Ln activado", "grupo de -63- encadeamento activado", "ligante activado" e "encadeador activado", usados em qualquer parte intermutavelmente, referem-se a um grupo de encadeamento que suporta um ou mais grupos reactivos capazes de reagir, e formar uma ligação, com um quelante ou um Q.
Os termos "Ch", "quelante de metal" e "quelante" são usados em qualquer parte intermutavelmente para designar uma porção química capaz de se ligar ou complexar com um nuclido de metal. O termo "porção ciclizadora" significa o composto intermediário que serve como percursor para o grupo R31 de Q. O termo "porção ciclizadora substituída no anel" é uma porção ciclizadora que suporta um grupo substituinte em um ou mais dos seus anéis carbocíclicos ou heterocíclicos. O termo "porção ciclizadora modificada por encadeador" refere-se a uma porção ciclizadora que carrega um grupo Ln activado. O termo "intermediário de composto cíclico" significa o composto intermediário que serve como precursor para o grupo Q nos compostos reivindicados. O termo "intermediário de composto cíclico modificado por encadeador" significa um intermediário de composto cíclico que carrega um grupo Ln activado.
Os compostos da presente invenção podem ser preparados por numerosas vias bem conhecidas de um perito na técnica da síntese orgânica. Os métodos preferidos incluem os métodos descritos abaixo. São aqui usadas as abreviaturas seguintes
Acm acetamidometilo D-Abu ácido D-2-aminobutírico 5-Aca 5-aminocapramida (5-amino-hexanamida) β-Ala, β-Ala ou βΑΐ8 ácido 3-aminopropiónico Boc í-butiloxicarbonilo Bob-iodo-Mamb ácido í-buti1oxicarbonil-3-aminometil-4-iodobenzóico Boc-Mamb ácido /-butiloxicarbonil-3-aminometilbenzóico Boc-ON [2-(férc-butiloxicarboniloxilimino)-2-fenilacetonitrilo Cl2Bzl diclorobenzilo CBZ, Cbz ou Z carbobenziloxi DCC diciclo-hexilcarbodiimida DIEA diisopropiletilamina di-NMeOm N-oc-Me-N-y-Me-omitina DMAP 4-dimetilaminopiridina HBTU hexafluorofosfato de 2-( 1 H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3 -tetrametilurónio NMeArg ou MeArg a-N-metil-arginina NMeAmf N-metilaminometil-fenilalanina NMeAsp ácido a-N-metil-aspártico NMeGly ou MeGly N-metil-glicina NMe-Mamb ácido N-metil-3-aminometilbenzóico NMM N-metilmorfolina OcHex O-ciclo-hexilo OBzl O-benzilo OSu O-succinimidilo pNP p-nitrofenilo TBTU tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3- -tetrametilurónio
Teoc 2-(trimetilsilil)etiloxicarbonilo
Tos tosilo
Tr tritilo São aqui usadas as seguintes abreviaturas de aminoácido de três letras convencionais; as abreviaturas de aminoácido de uma letra convencionais não são aqui usadas:
Ala = alanina Lys = lisina Arg = arginina Met - metionina Asn = asparagina Nle = norleucina Asp = ácido aspártico Phe = fenilalanina Cys = cisteína Phg = fenilglicina Gin = glutamina Pro = prolina Glu = ácido glutâmico Ser = serina Gly = glicina Thr = treonina His = histidina Trp = triptofano Ile = isoleucina Tyr = tirosina Leu — leucina Yal = valina
Os compostos da presente invenção podem ser sintetizados usando métodos de síntese padrão conhecidos dos peritos na técnica. Os métodos preferidos incluem os métodos descritos abaixo.
Geralmente, os péptidos são alongados por desprotecção da α-amina do resíduo C-terminal e acoplamento do aminoácido adequadamente -66- protegido seguinte através de um encadeamento péptido usando os métodos descritos. Este procedimento de desprotecção e acoplamento é repetido até a sequência desejada ser obtida. Este acoplamento pode ser realizado com os aminoácidos constituintes de um modo passo a passo, ou condensação de fragmentos (dois a vários aminoácidos), ou combinação de ambos os processos, ou por síntese de péptido de fase sólida de acordo com o método originalmente descrito por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) 2149-2154, cuja revelação é aqui incorporada por referência.
Os compostos da invenção podem também ser sintetizados usando equipamento de sintetização péptida. Em aditamento ao precedente, procedimentos para a síntese péptida são descritos em Stewart e Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2a ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, Eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1, 2, 3, 5 e 9, Academic Press, Nova Iorque, 1980-1987; Bodansky, "Peptide Chemistry: A Practical Textbook", Springer-Verlag, Nova Iorque (1988); e Bodansky et al., "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Nova Iorque (1984). O acoplamento entre dois derivados de aminoácido, um aminoácido e um péptido, dois fragmentos de péptido, ou a ciclização de um péptido podem ser levados a cabo usando procedimentos de acoplamento padrão tais como o método de azida, o método de anidrido de ácido carbónico misto (cloroformato de isobutilo), o método de carbodiimida (diciclo-hexilcarbodiimida, diisopropil-carbodiimida ou carbodiimidas solúveis em água), o método do éster activo (éster de p-nitrofenilo, imido éster N-hidroxissuccínico), método K do reagente de Woodward, método do carbonildiimidazole, reagentes de fósforo tais como BOP-C1, ou método de oxidação-redução. Alguns de tais métodos (especialmente carbodiimida) podem ser melhorados pela adição de 1-hidroxibenzotriazole. Tais reacções de acoplamento podem ser realizadas quer em solução (fase líquida) quer em fase sólida.
Os grupos funcionais dos aminoácidos constituintes devem ser protegidos durante as reacções de acoplamento para evitar ligações indesejadas que se possam formar. Os grupos de protecção que podem ser usados são listados em Green, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Nova Iorque (1981) e "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol 3, Academic Press, Nova Iorque (1981). O grupo α-carboxilo do resíduo C-terminal é usualmente protegido por um éster que pode ser separado para dar o ácido carboxílico. Estes grupos de protecção incluem: 1) ésteres de alquilo tais como metilo e f-butilo; ésteres de arilo tais como benzilo e benzilo substituído; ou 3) ésteres que podem ser separados por tratamento com base suave ou meio redutor suave tais como ésteres de tricloroetilo e fenacilo. No caso de fase sólida, o aminoácido de C-terminal está ligado a um agente de suporte insolúvel (usualmente polistireno). Tais agentes de suporte insolúveis contêm um grupo que reagirá com o grupo carboxilo para formar uma ligação que é estável às condições de alongamento mas prontamente separado mais tarde. Exemplos dos quais são: resina de oxima (DeGrado e Kaiser, J. Org. Chem. 45 (1980) 1295-1300), resina de cloro ou bromometilo, resina de hidroximetilo e resina de aminometilo. Muitas destas resinas estão comercialmente disponíveis com o aminoácido de C-terminal desejado já incorporado. O grupo α-aminoácido de cada aminoácido deve ser protegido. Qualquer grupo de protecção conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos destes são: 1) tipo acilo, tais como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo e p-toluenos-sulfonilo; 2) tipo carbamato aromático, tais como benziloxicarbonilo (Cbz) e benziloxicarbonilos substituídos, 1 -(/?-bifenil)-1 -metiletoxicarbonilo e 9-fluore-nilmetiloxicarbonilo (Fmoc); 3) tipo carbamato alifático, tais como ferc-butilo-xicarbonilo (Boc), etoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo e aliloxicarbonilo; 4) tipo carbamato de alquilo cíclico, tais como ciclopentiloxicarbonilo e adamantiloxicarbonilo; 5) tipo alquilo, tais como trifenilmetilo e benzilo; 6) trialquilsilano e trimetilsilano; e 7) tipos contendo tiol tais como feniltiocarbonilo e ditiassuccinoílo. O grupo de protecção de α-amino é ou Boc ou Fmoc. Muitos derivados aminoácidos adequadamente protegidos para a síntese de péptidos estão comercialmente disponíveis. O grupo de protecção de α-amino é separado antes do acoplamento do aminoácido seguinte. Quando o grupo Boc é usado, os métodos de escolha são ácido trifluoroacético, puro ou em diclorometano, ou HC1 em dioxano. O sal de amónio resultante é em seguida neutralizado ou antes do acoplamento ou in situ com soluções básicas tais como tampões aquosos, ou aminas terciárias em diclorometano ou dimetilformamida. Quando o grupo Fmoc é usado, os reagentes de escolha são piperidina ou piperidinas substituídas em dimetilformamida, mas qualquer amina secundária ou solução básica aquosa pode ser usada. A desprotecção é realizada a uma temperatura entre 0 °C e a temperatura ambiente.
Quaisquer dos aminoácidos que suportam funcionalidades de cadeia lateral devem ser protegidos durante a precipitação do péptido usando quaisquer dos grupos acima identificados. Os peritos na técnica apreciarão que a selecção e uso de grupos de protecção apropriados para tais funcionalidades de cadeia lateral dependerão do aminoácido e presença de outros grupos de protecção no péptido. A selecção de um tal grupo de protecção é importante visto que não deve ser removido durante a desprotecção e acoplamento do grupo a-amino.
Por exemplo, quando é escolhido Boc para a protecção de a-amina são aceitáveis os seguintes grupos de protecção: porções p-toluenossulfonilo (tosilo) e nitro para arginina; benziloxicarbonilo, benziloxicarbonilos substituídos, tosilo ou trifluoroacetilo para lisina; ésteres de benzilo ou de alquilo tais como ciclopentilo para ácidos glutâmico e aspártico; ésteres de benzilo para serina e treonina; éteres benzílicos, éteres benzílicos substituídos ou 2-bromobenziloxicarbonilo para tirosina; p-metilbenzilo, p-metoxibenzilo, acetamidometilo, benzilo ou í-butilsulfonilo para cisteína; e o indole de triptofano pode ou ser deixado não protegido ou ser protegido com um grupo formilo.
Quando Fmoc é escolhido para a protecção de α-amina usualmente são aceitáveis grupos de protecção baseados em terc-butilo. Por exemplo, Boc pode ser usado para lisina, éter íerobutílico para serina, treonina e tirosina e éster terc-butílico para ácidos glutâmico e aspártico.
Uma vez a elongação e ciclização do péptido completa, todos os grupos de protecção são removidos. Para a síntese em fase líquida, os grupos de protecção são removidos de uma qualquer maneira de acordo com a escolha dos grupos de protecção. Tais procedimentos são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Quando é usada uma síntese em fase sólida, o péptido deverá ser removido da resina sem a simultânea remoção de grupos de protecção dos grupos funcionais que podem interferir com o processo de ciclização. Por conseguinte, se o péptido deve ser ciclizado em solução, as condições de separação necessitam de ser escolhidas de maneira a que um grupo α-carboxilato livre e α-amino livre são originados sem a remoção simultânea de outros grupos de protecção. Altemativamente, o péptido pode ser removido da resina por hidrogenólise e em seguida acoplado pelo método de azida. Um outro método muito conveniente envolve a síntese de péptidos sobre uma resina de oxima, seguido por deslocamento nucleofilico a partir da resina, o que origina um péptido cíclico (Osapay, Profit e Taylor, Tetrahedron Letters 43 (1990) 6121-6124). Quando a resina de oxima é empregue, o esquema de protecção por Boc é geralmente escolhido. Então, o método preferido para a remoção de grupos de protecção da cadeia lateral envolve geralmente o tratamento com HF anidro contendo aditivos tais como sulfureto de dimetilo, anisole, tioanisole ou p-cresol a 0 °C. A separação do péptido pode também ser realizado por outros reagentes ácidos tais como misturas ácido trifluorometanossulfónico/ácido trifluoroacético.
Aminoácidos não usuais usados nesta invenção podem ser sintetizados por métodos padrão familiares dos peritos na técnica ("The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 5, Academic Press, Nova Iorque (1981), pp. 342-449). Os N-alquilaminoácidos podem ser preparados usando procedimentos descritos previamente (Cheung et al., Can. J. Chem. 55 (1977) 906; Freidinger et al., J. Org. Chem. 48 (1982) 77).
Os compostos da presente invenção podem ser preparados usando os procedimentos descritos abaixo com mais detalhe. A síntese de péptido em fase sólida manual foi realizada em tubos de filtração de polipropileno de 25 mL comprados em BioRad Inc., ou em vasos de reacção de vidro de 60 mL hora comprados em Peptides International. A resina de oxima (nível de substituição = 0,96 mmol/g) foi preparada de acordo com procedimentos publicados (DeGrado e Kaiser, J. Org. Chem. 45 (1980) 1295), ou foi comprada em Novabiochem (nível de substituição = 0,62 mmol/g). Todos os químicos e solventes (grau de reagente) foram usados conforme fornecidos pelos vendedores citados sem mais purificação. Os aminoácidos de í-butoxicarbonilo (Boc) e outros aminoácidos de partida podem ser obtidos comercialmente em Bachem Inc., Bachem Biosciences Inc. (Philadelphia, PA), Advanced ChemTech (Louisville, KY), Península Laboratories (Belmont, CA) ou Sigma (St. Louis, MO). Hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3--tetrametilurónio (HBTU) e TBTU foram comprados em Advanced ChemTech. N-Metilmorfolina (NMM), m-cresol, ácido D-2-aminobutírico (Abu), cloreto de trimetilacetilo, diisopropiletilamina (DIEA), ácido 3-cianobenzóico e [2-(ferc-butiloxicarboniloxilimino)-2-fenilacetonitrilo (Boc-ON) foram comprados em Aldrich Chemical Company. Dimetilformamida (DMF), acetato de etilo, clorofórmio (CHCI3), metanol (MeOH), piridina e ácido clorídrico (HC1) foram obtidos em Baker. Acetonitrilo, diclorometano (DCM), ácido acético (HOAc), ácido trifluoroacético (TFA), éter etílico, trietilamina, acetona e sulfato de magnésio foram comprados em EM Science. Catalisador de paládio em carbono (10% de Pa) foi comprado em Fluka Chemical Company. Etanol absoluto foi obtido em Quantum Chemical Corporation. A cromatografía em camada fina (TLC) foi realizada sobre placas para TLC de Silica Gel 60 F254 (espessura da camada 0,2 mm) que foram compradas em EM Separations. A visualização da TLC foi conseguida usando luz UV, iodo, vaporização de ninidrina e/ou vaporização de Sakaguchi. Os pontos de fusão foram determinados usando um aparelho de ponto de fusão Thomas Hoover ou Electrothermal 9200 e não são corrigidos. As análises por HPLC foram realizadas quer num sistema Hewlett Packard 1090, Waters Delta Prep 3000, Rainin, quer num sistema DuPont 8800. Os espectros de NMR foram registados num espectrómetro a 300 MHz General Electric QE-300, Varian 300 ou Varian 400. A espectrometria de massa de bombardeamento com átomos rápidos (FAB-MS) foi realizada num espectrómetro de massa de dupla focagem VG Zab-E usando um disparador Xenon FAB como fonte de ião ou um Finnigan MAT 8230. O ácido Boc-2-aminobutírico (Boc-D-Abu) foi preparado por uma -72- modifí cação de procedimentos previamente relatados na literatura (Itoh, Hagiwara e Kamiya, Tett. Lett. (1975) 4393), conforme mostrado no esquema abaixo. -72-
ácido D-2-aminobutírico
Ácido D-2-aminobutírico (1,0 g; 9,70 mmol) foi dissolvido em 20 mL de H20 e uma solução de Boc-ON (2,62 g; 10,6 mmol) em 20 mL de acetona foi adicionada. Formou-se um precipitado branco que se dissolveu na adição de trietilamina (3,37 mL; 24,2 mmol) para dar uma solução amarela pálida (pH 9; papel de pH molhado). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante a noite sendo a acetona removida sob pressão reduzida. A camada aquosa restante foi extraída com éter por três vezes, acidificada até pH 2 com HC1 concentrado e em seguida extraída com acetato de etilo três vezes. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas sob pressão reduzida para darem ácido /-butiloxicarbonil-D-2--aminobutírico na forma de um óleo (2,05 g; maior do que rendimento quantitativo; contém solvente), o qual foi usado sem mais purificação. 'H-NMR (CDCI3) 0,98 (t, 3H), 1,45 (s, 9H), 1,73 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 4,29 (m, 1H), 5,05 (m, 1H). Síntese de Porções Ciclizantes R31 Esta secção ensina a síntese de certas porções ciclizantes que 31 servem como intermediários para os grupos R em Q. Secções posteriores ensinam a síntese de outras porções ciclizantes.
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-73- Síntese de Derivados de ácido Boc-aminometilbenzóico, ácido Boc-aminofenilacético e ácido Boc-aminometilfenilacético
Derivados de ácido boc-aminometilbenzóico úteis como porções ciclizantes na síntese dos compostos da invenção são preparados usando procedimentos padrão, por exemplo, conforme descrito em Tett. Lett. (1975) 4393; "Modern Synthetic Reactions", Η. O. House, 1972; ou Harting et al., J. Am. Chem. Soc. 50 (1928) 3370; e conforme descrito abaixo esquematicamente.
Ácido 3-aminometilbenzóico · HC1 Ácido 3-cianobenzóico (10,0 g; 68 mmol) foi dissolvido em 200 mL de etanol por aquecimento num banho de água a 35-50 °C. HC1 concentrado (6,12 mL; 73 mmol) foi adicionado e a solução foi transferida para um balão de fundo redondo sujeito a jacto de azoto de 500 mL contendo catalisador de paládio em carbono (1,05 g; 10% de Pd/C). A suspensão foi agitada sob uma atmosfera de hidrogénio durante 38 horas, filtrada através de um funil de vidro sinterizado e profundamente lavada com H20. O etanol foi removido sob pressão reduzida e a camada aquosa restante, que continha um sólido branco, foi diluída até 250 mL com H20 adicional. Foi adicionado éter etílico (250 mL) e a suspensão foi transferida para um funil de separação. Na agitação vigorosa, todos os sólidos foram dissolvidos e a camada aquosa foi em seguida lavada duas vezes com éter, evaporada sob pressão reduzida até um volume de 150 mL e liofilizada para dar o composto mencionado em título (ácido 3-aminometilbenzóico. HC1) (8,10 g; 64%) na forma de um sólido bege. *H-NMR (D20) 4,27 (s, 2H), 7,60 (t, 1H), 7,72 (d, 1H), 8,06 (d, 2H). -74- Ácido f-butiloxicarbonil-3-aminometilbenzóico (Boc-Mamb) O composto mencionado em título foi preparado de acordo com uma modificação de procedimentos padrão previamente relatados na literatura (Itoh, Hagiwara e Kamiya, Tett. Lett. (1975) 4393). Ácido 3-aminometilbenzóico (sal hidrocloreto) (3,0 g; 16,0 mmol) foi dissolvido em 60 mL de H20. A isto foi adicionada uma solução de Boc-ON (4,33 g; 17,6 mmol) em 60 mL de acetona seguido por trietilamina (5,56 mL; 39,9 mmol). A solução virou para amarelo e o pH foi ajustado para 9 (papel de pH molhado) por adição de mais 1,0 mL (7,2 mmol) de trietilamina. A solução foi agitada ao longo da noite à temperatura ambiente momento em que a acetona foi removida sob pressão reduzida e a camada aquosa restante foi lavada três vezes com éter. A camada aquosa foi em seguida acidificada até pH 2 com HC1 2 N e em seguida extraída três vezes com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas três vezes com H20, secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas até à secura sob pressão reduzida. O material foi recristalizado a partir de acetato de etilo/hexano para dar duas recolhas do composto mencionado em título (2,58 g; 64%) na forma de um sólido esbranquiçado, p.f. 123-125 °C; !H-NMR (CDCI3) 1,47 (s, 9H), 4,38 (br s, 2 H), 4,95 (br s, 1H), 7,45 (t, 1H), 7,55 (d, 1H), 8,02 (d, 2H). Síntese de ácido í-butiloxicarbonil-3-aminofenilacético O ácido í-butiloxicarbonil-3-aminofenilacético útil como intermediário na síntese dos compostos da invenção é preparado usando procedimentos padrão, por exemplo, conforme descrito em Collman e Groh, J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 1391 e conforme mostrado abaixo esquematicamente.
Ácido í-butiIoxicarbonil-3-aminofenilacético
Uma solução de ácido 3-aminofenilacético (Aldrich; 10 g; 66 mmol), dicarbonato de di-íerc-butilo (15,8 g; 72 mmol) e DIEA (8,6 g; 66 mmol) em 50 mL de diclorometano foi agitado à temperatura ambiente durante a noite. A mistura reaccional foi concentrada, repartida entre diclorometano e H20, a camada de água foi separada, acidificada até pH 3 com HC1 1 N e extraída com diclorometano. Os extractos foram lavados com H20, água salgada, secos sobre sulfato de sódio anidro, e evaporados até à secura sob pressão reduzida. Este material foi purificado por recristalização a partir de heptano para produzir o mencionado em título (3,7 g; 22%) na forma de um sólido branco, p.f. 105 °C; ‘H-NMR (CDC13) 7,35 (s, 1H), 7,25 (m, 3H), 6,95 (m, 1H), 6,60 (br s, 1H), 3,65 (s, 2H), 1,50 (s, 9H). Síntese de ácido 2-Aminometilbenzóico*hci e ácido 2-aminometilfenilacético*hci Ácido 2-aminometilbenzóico*HCl e ácido 2-aminometilfenilacético •HC1 úteis como intermediários na síntese dos compostos da invenção são preparados usando procedimentos padrão, por exemplo, conforme descrito em Naito et al, J. Antibiotics 30 (1977) 698; ou Young e Sweet, J. Am. Chem. Soc. 80 (1958) 800 e conforme mostrado abaixo esquematicamente.
-76- δ-Lactama do ácido 2-aminometilfenilacético O composto mencionado em título foi preparado por modificação de procedimentos previamente relatados na literatura (Naito et al., J. Antibiotics 30 (1977) 698. A uma suspensão arrefecida em gelo de 2-indanona (10,8 g; 82 mmol) e azidotrimetilsilano (9,4 g; 82 mmol) em 115 mL de clorofórmio foram adicionados 25 mL de ácido sulfurico concentrado a uma velocidade para manter a temperatura entre 30-40 °C. Depois de mais 3 horas, a mistura reaccional foi vertida em gelo e a camada aquosa foi tomada básica com hidróxido de amónio concentrado. A camada de clorofórmio foi separada, lavada com H2O, água salgada, seca sobre sulfato de magnésio anidro e evaporada até à secura sob pressão reduzida. Este material foi purificado por sublimação (145 °C ; <133 Pa ( < 1 mm)), seguido por recristalização a partir de benzeno para dar 0 composto mencionado em título (5,4 g; 45%) na forma de cristais amarelos pálidos, p.f. 149-150 °C; ’Η-NMR (CDC13) 7,20 (m, 5H), 4,50 (s, 2H), 3,60 (s, 2H). Ácido 2-aminometilfenilacético*HCl O composto mencionado em título foi preparado por modificação de procedimentos previamente relatados na literatura (Naito et al., J. Antibiotics 30 (1977) 698. Uma mistura de δ-lactama do ácido 2-aminometilfenilacético (6,4 g; 44 mmol) e 21 mL de HC1 6 N foi aquecida até ao refluxo durante 4 horas. A mistura reaccional foi tratada com carbono activado (Norit A), filtrada, evaporada até à secura e o óleo residual foi triturado com acetona, a filtração proporcionou o composto mencionado em título (5,5 g; 62%) na forma de cristais incolores, p.f. 168 °C (dec); 'H-NMR (D6-DMSO) 12,65 (br s, 1H), 8,35 (br s, 3H), 7,50 (m, 1H), 7,35 (m, 3H), 4,05 (ABq, 2H), 3,80 (s, 2H). -77- γ-Lactama do Ácido 2-Aminometilbenzóico O composto mencionado em título foi preparado por modificação de procedimentos previamente relatados na literatura (Danishefsky et al., J. Org. Chem. 40 (1975) 796. Uma mistura de o-toluato de metilo (45 g; 33 mol), N-bromossuccinimida (57 g; 32 mol) e peróxido de dibenzoílo (0,64 g) em 175 mL de tetracloreto de carbono foi aquecida em refluxo durante 14 horas. A mistura reaccional arrefecida foi filtrada, evaporada até à secura sob pressão reduzida, dissolvida em 250 mL de metanol e foi adicionado hidróxido de amónio concentrado (75 mL; 1,11 mol). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 5 horas, concentrada, filtrada e o sólido foi lavado com H20 seguido por éter. Este material foi purificado por recristalização a partir de H20 para dar o composto mencionado em título (11,0 g; 26%) na forma de um sólido branco, p.f. 150 °C; 'H-NMR (CDC13) 7,90 (d, 1H), 7,60 (t, 1H), 7,50 (t, 2H), 7,00 (br s, 1H), 4,50 (s, 2H).
Ácido 2-aminometilbenzóico*HCI O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para o ácido 2-aminometilfenilacético*HCl. A lactama (3,5 g; 26 mmol) foi convertida ao composto mencionado em título (2,4 g; 50%) na forma de cristais incolores, p.f. 233 °C (dec); 'H-NMR (D6-DMSO) 13,40 (br s, 1H), 5,35 (br s, 3H), 8, 05 (d, 1H), 7, 60 (m, 3H), 4,35 (br s, 2H). Síntese de Intermediários de Composto Cíclico
Esta secção ensina a síntese de certos intermediários de composto cíclico. Estes são os compostos intermediários que servem como precursores para o grupo Q nos compostos reivindicados, (QLn)dCh; (Q)d'Ln-Ch. Estes compostos podem ser directamente marcados com radioisótopos ou podem ser modificados por ligação de grupo(s) encadeador(es) e quelante(s). O ácido /-butiloxicarbonil-3-aminometilbenzóico (Boc-Mamb) é acoplado a resina de oxima por uma modificação do método descrito por DeGrado e Kaiser, J. Org. Chem. 45 (1980) 1295, usando 1 equivalente do ácido 3-aminometilbenzóico (em relação ao nível de substituição da resina), 1 equivalente de HBTU e 3 equivalentes de NMM. Altemativamente, Boc-Mamb (1 equivalente) pode ser acoplado à resina de oxima usando 1 equivalente de DCC e 1 equivalente de DMAP em cloreto de metileno. Os tempos de acoplamento variam desde 15 a 96 horas. O nível de substituição é em seguida determinado usando ou o teste de ácido pícrico (Sarin, Kent, Tam e Merrifield, Anal. Biochem. 117 (1981) 145-157) ou o ensaio de ninidrina quantitativa (Gisin, Anal. Chim. Acta 58 (1972) 248-249). Os grupos de oxima que não reagiram são bloqueados usando cloreto de trimetilacetilo 0,5 M / diisopropiletilamina 0,5 M em DMF durante 2 horas. A desprotecção pelo grupo de protecção Boc é conseguida usando 25% de TFA em DCM durante 30 minutos. Os aminoácidos ou derivados de aminoácidos restantes são acoplados usando entre duas e dez vezes excesso (com base na carga do primeiro aminoácido ou derivado aminoácido) do aminoácido ou derivado de aminoácidos apropriados e HBTU em 8 mL de DMF. A resina é em seguida neutralizada in situ usando 3 eq. de NMM (com base na quantidade de aminoácido usado) e os tempos de acoplamento variam desde 1 hora até vários dias. O completamento do acoplamento é monitorizado por ensaio de ninidrina quantitativa ou ensaio de ácido pícrico em casos onde o aminoácido foi acoplado a uma amina secundária. Os aminoácidos são reacoplados se necessário com base nestes resultados.
Após o péptido linear ter sido formado por reunião dos constituintes, o grupo Boc N-terminal é removido por tratamento com 25% de TFA em DCM durante 30 minutos. A resina é em seguida neutralizada por tratamento com 10% de DIEA em DCM. A ciclização com clivagem concomitante do péptido é conseguida usando o método de Osapay e Taylor, J. Am. Chem. Soc. 112 (1990) 6046, por suspensão da resina em lOmL/mg de DMF, adicionando um equivalente de HOAc (com base na carga do primeiro aminoácido) e agitando a 50-60 °C durante 60 a 72 horas. Depois de filtração através de um funil de vidro sinterizado, o filtrado de DMF é evaporado, redissolvido em HOAc ou acetonitrilo:H20 1:1 e liofilizado para se obter material ciclizado protegido. Altemativamente, o material pode ser dissolvido em metanol e precipitado com éter para se obter o material ciclizado protegido. Este é em seguida tratado usando procedimentos padrão com fluoreto de hidrogénio anidro (Stewart e Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Co., 2a edição, 1984, p. 85) contendo 1 mL/g de m-cresol ou anisole como eliminador a 0 °C durante 20 a 60 minutos para remover grupos de protecção da cadeia lateral. O produto cru pode ser purificado por HPLC de inversão de fases usando uma coluna Vydac Cl8 preparativa de 2,5 cm com um gradiente de acetonitrilo linear contendo 0,1% de TFA para produzir material ciclizado puro. Os seguintes aminoácidos protegidos por Ν-α-Boc podem ser usados para a síntese: Boc-Arg(Tos), Boc-N-a-MeArg(Tos), Boc-Gly, Boc-Asp(OcHex), ácido Boc-3--aminometil-4-iodo-benzóico, Boc-D-Ile, Boc-NMeAsp(OcHex), Boc-NMe--Mamb, Boc-D-Phg, Boc-D-Asp(OBzl), Boc-L-Asp(OcHex), Boc-a-MeAsp-(OcHex), Boc-P-Me-Asp(OcHex), Boc-L-Ala, Boc-L-Pro, Boc-D-Nle, Boc-D-Leu, Boc-D-Val, ácido Boc-D-2-aminobutírico (Boc-D-Abu), Boc-Phe, Boc-D-Ser(Bzl), Boc-D-Ala, ácido Boc-3-aminometilbenzóico (Boc-Mamb), Boc-D-Lys(2-Clz), Boc-P-Ala, Boc-D-Pro, Boc-D-Phe, Boc-D-Tyr(Cl2Bzl), Boc-NMe-Amf(CBZ), ácido Boc-aminotetralinacarboxílico, ácido Boc-amino-metilnaftóico, ácido Boc-4-aminometilbenzóico ou Boc-NMeGly.
Os aminoácidos protegidos por Ν-α-Boc preferidos úteis nesta síntese são Boc-Arg(Tos), Boc-N-a-MeArg(Tos), Boc-Gly, Boc-Asp(OcHex), -80-
Boc-D-Leu, Boc-D-Val, ácido Boc-D-2-aminobutírico (Boc-D-Abu), Boc-Phe, Boc-D-Ser(Bzl), Boc-D-Ala, ácido Boc-3-aminometilbenzóico (Boc-Mamb), Boc-D-Lys(2-Clz), Boc-Ala, Boc-D-Pro ou Boc-NMeGly. A síntese dos compostos da invenção é mais exemplificada abaixo. Os quadros abaixo indicam compostos representativos da presente invenção.
Intermediário 1 do Composto Cíclico
Ciclo-(Gly-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = Gly, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito abaixo para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,336 mmol para dar o péptido cíclico protegido (218 mg; 84%). O péptido (200 mg) e 200 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (158 mg; maior do que rendimento quantitativo; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 2 até 11% de acetonitrilo contendo 0,1% de TF A e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 21%; rendimento global de 16,3%). Espectro de massa: [M+H] = 533,26.
Intermediário 2 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Ala-NMeArg-GIy-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Ala, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, RI = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito abaixo para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Verificou-se ser necessário o reacoplamento do resíduo Boc-N-MeArg(Tos). O péptido foi preparado numa escala de 0,244 mmol para dar o péptido cíclico protegido (117 mg; 61%). O péptido (110 mg) e llOmL de w-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,25%/min de 2 até 11% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo. Espectro de massa: [M+H] = 547,23.
Intermediário 3 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Abu, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito abaixo para o Intermediário 4 do Composto Cíclico. O péptido foi preparado numa escala de 0,101 mmol para dar o péptido cíclico protegido (51 mg; 63%). O péptido (43 mg) e 50 pL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (23 mg; 68,7%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7 até 14% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto -82- mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 31%; rendimento global de 12,4%). Espectro de massa: M+H = 561,46.
Intermediário 3a do Composto Cíclico
Ciclo-(Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = Abu, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito abaixo para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb à resina de oxima. TBTU foi usado como reagente de acoplamento. O péptido foi preparado numa escala de 0,596 mmol para dar o péptido cíclico protegido (182 mg; 38,4%). O péptido (176 mg) e 0,176 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0°C durante 20 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (116 mg; 90,4%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,45%/min de 9 até 27% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 1,92%, rendimento global de 0,574%). FAB-MS: [M+H] = 561,39.
Intermediário 4 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H
A um tubo de polipropileno equipado com uma frita foi adicionado Boc-Mamb (0,126 g; 0,5 mmol) e 6 mL de DMF. A isto foi adicionado HBTH (0,194 g; 0,5mmol), resina de oxima (0,52 g, nível de substituição = 0,96mmol/g) e N-metilmorfolina (0,165 mL; 1,50 mmol). A suspensão foi misturada à temperatura ambiente durante 24 horas. A resina foi em seguida profundamente lavada (volumes de 10-12 mL) com DMF (3x), MeOH (lx), DCM (3x), MeOH (2x) e DCM (3x). O nível de substituição foi determinado como sendo 0,389 mmol/g por ensaio de ninidrina quantitativa. Os grupos de oxima que não reagiram foram bloqueados por tratamento com cloreto de trimetilacetilo 0,5 M / DIEA 0,5 M em DMF durante 2 horas.
Os passos seguintes foram em seguida realizados: (Passo 1) A resina foi lavada com DMF (3x), MeOH (lx), DCM (3x), MeOH (2x) e DCM (3x). (Passo 2) O grupo de í-Boc foi desprotegido usando 25% de TFA em DCM durante 30 minutos. (Passo 3) A resina foi lavada com DCM (3x), MeOH (lx), DCM (2x), MeOH (3x) e DMF (3x). (Passo 4) Boc-Asp(OcHex) (0,613 g; 1,94 mmol), HBTU (0,753 g; 1,99 mmol), 8 mL de DMF e N-metilmorfolina (0,642 mL; 5,84 mmol) foram adicionados à resina e a reacção foi deixada a prosseguir durante 2,5 horas. (Passo 5) A reacção de acoplamento foi tida por completa por avaliação pelo ensaio de ninidrina qualitativo. Os Passos 1-5 foram repetidos até a sequência desejada ter sido atingida. O acoplamento de Boc-D-Val a NMeArg foi monitorizado pelo teste de ácido pícrico.
Após o péptido linear ter sido formado por reunião dos constituintes, o grupo Boc N-terminal é removido por tratamento com 25% de TFA em DCM (30 min). A resina foi profundamente lavada com DCM (3x), MeOH (2x) e DCM (3x) e em seguida neutralizada com 10% de DIEA em DCM (2x1 min). A resina foi profundamente lavada com DCM (3x) e MeOH (3x) e em seguida seca. Metade da resina (0,101 mmol) foi ciclizada por tratamento com 6 mL de DMF contendo HOAc (5,8 mL; 0,101 mmol) e aquecendo a 50 °C durante 72 horas. A resina foi em seguida filtrada através de um funil de vidro -84- sinterizado e profundamente lavado com DMF. O filtrado de DMF foi evaporado até um óleo, redissolvido em acetonitrilo:H20 1:1 e liofilizado para dar o péptido cíclico protegido (49 mg; 60%). O péptido (42 mg) foi tratado com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C, na presença de 50 mL de m-cresol como eliminador, durante 30 minutos para remover grupos de protecção da cadeia lateral. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (23 mg; 70%); calculado como sal acetato). A purificação foi realizada usando HPLC de inversão de fases com uma coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) e um gradiente a 0,23%/minuto de 7 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 24%, rendimento global de 9,4%). FAB-MS: [M+H] = 575,45. Síntese em Fase de Solução do Intermediário 4 do Composto Cíclico
As seguintes abreviaturas são usadas a seguir para sistemas de solvente de TLC: clorofórmio/metanol 95:5 = CM; clorofórmio/ácido acético 95:5 = CA; clorofórmio/metanol/ácido acético 95:5 = CM A.
BocNMeArg(Tos)-Gly-OBzl — 25 mmol de BocNMeArg(Tos) (11,07 g; Bachem), 30 mmol de tosilato de Gly-OBzl (10,10 g; Bachem), 25 mmol de HBTU (hexafluorofosfato de 0-benzotriazole-N,N,N',N'-tetrametil--urónio; 9,48 g; Advanced Chemtech) e 75 mmol de DIEA (diisopropiletilamina; Aldrich) foram dissolvidos em 25 mL de CH2CI2. A reacção foi deixada a prosseguir 1 h, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida a 50 °C até um xarope, o qual foi dissolvido em 400 mL de acetato de etilo. Esta solução foi extraída com (150 mL de cada) 2 x 5% de ácido cítrico, 1 x água, 2 x NaHCC>3 sat., 1 x NaCl sat. A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e o solvente evaporado sob pressão reduzida. O óleo resultante foi triturado com éter de petróleo e seco sob alto vácuo durante um mínimo de 1 h. Rendimento de 14,7 g (99,5%); TLC: Rf(CM) = 0,18, Rf(CA) = 0,10; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 590,43 (esperado 590,26). NMeArg(Tos)-Gly-OBzl — 14,5 g de BocNMeArg(Tos)-Gly-OBzl (24,5 mmol) foi dissolvido em 30 mL de TFA, deixado a reagir durante 5 min e o solvente foi evaporado a 133 Pa (pressão de 1 mm de mercúrio) à temperatura ambiente. O xarope resultante foi dissolvido em 400 mL de acetato de etilo arrefecido em gelo e extraído com 100 mL de NaHCC^ sat. arrefecido em gelo, a fase aquosa foi extraída duas vezes com 200 mL de acetato de etilo e as fases orgânicas combinadas foram extraídas uma vez com 25 mL de NaCl sat. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida dando um óleo viscoso que foi triturado com 300 mL de éter. O sólido resultante foi filtrado e lavado com éter dando um composto higroscópico que foi seco num dessecador a vácuo: rendimento de 10,33 g (86,2%); TLC: Rf(CM) = 0,03, Rf(Cma> = 0,20; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 490,21 (esperado 490,20).
Boc-D-Val~NMeArg(Tos)-Gly-OBzl — 9,80 mmol de NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (4,80 g), 9,82 mmol de Boc-D-Val (2,13 g; Bachem) e 10,0 mmol de HBTU (3,79 g) foram dissolvidos em 10 mL de cloreto de metileno. O balão foi colocado num banho de gelo e foram adicionados 20 mmol de DIEA (3,48 mL). A reacção foi deixada prosseguir a 0 °C durante 15 min e à temperatura ambiente durante 2 dias. A mistura reaccional foi diluída com 400 mL de acetato de etilo, extraída (200 mL de cada) com 2 x ácido cítrico a 5%, 1 x NaCl sat., seca sobre MgS04 e evaporada sob pressão reduzida. O óleo resultante foi triturado com 50 e depois com 30 mL de éter durante 30 min com mistura eficiente: rendimento de 4,58 g (69%); TLC: Rf(CM)= 0,27 (também contém uma mancha próximo da origem, a qual é uma impureza aromática que é removida durante a trituração do produto no passo seguinte); o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 689,59 (esperado 689,43).
Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly — 4,50 g de Boc-D-Val-NMeArg-(Tos)-Gly-OBzl (4,44 mmol) dissolvidos em 80 mL de metanol foram purgados com N2 durante lOmin. 1,30 g de catalisador de Pd/C (10% Fluka lote n° 273890) foram adicionados em seguida e em seguida H2 foi directamente passado sobre a superfície da reacção. A TLC mostrou que a reacção estava completa dentro de 0,5 h. Após 1 h, o catalisador foi removido por filtração através de um leito de Celite® e o solvente foi removido a 40 °C sob pressão reduzida. O sólido resultante foi bem triturado com 50 mL de éter refluxante, filtrado e lavado com éter de petróleo: rendimento de 3,05 g (78%); TLC: Rf(CM)= 0,03, Rf(cma) = 0,37; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 599,45 (esperado 599,29).
Oxima de 4-nitrobenzofenona (Ox) — 50 g de 4-nitrobenzofenona (220 mmol; Aldrich) e 30,6 g de hidrocloreto de hidroxilamina (Aldrich; 440 mmol) foram aquecidos em refluxo em 0,5 L de metanol/piridina (9:1) durante 1 h. A mistura reaccional foi evaporada sob pressão reduzida, dissolvida em 500 mL de éter e extraída com (200 mL de cada) ácido cítrico a 5% (2 vezes) e NaCl sat. (1 vez), seca sobre MgSC>4, evaporada sob pressão reduzida e triturada com éter dando 44,35 g (83%) da oxima na forma de uma mistura dos isómeros cis e trans\ TLC: Rf(CM) = 0,50, Rf (cma) = 0,82; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 242,07 (esperado 242,07).
BocMamb-Ox — 22 mmol de BocMamb (5,522 g), 20 mmol de oxima de 4-nitrobenzofenona (4,84 g) e 20 mmol de DMAP (4-dimetilaminopiri-dina; Aldrich) foram dissolvidos em 40 mL de CH2C12. O balão foi colocado num banho de gelo e foram adicionados 21 mmol de DCC (diciclo-hexilcarbodi- imida; 4,33 g). A reacção foi deixada a prosseguir em gelo durante 30 min e à temperatura ambiente durante a noite. A diciclo-hexilureia formada foi filtrada e lavada com 40 mL de cloreto de metileno. O filtrado foi evaporado sob pressão reduzida à temperatura ambiente até um xarope e dissolvido em 400 mL de acetato de etilo. Esta solução foi extraída com (150 mL de cada) 2 x ácido cítrico a 5%, 1 x água, 2 x NaHCC>3 sat., 1 x NaCl sat. A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e o solvente evaporado sob pressão reduzida. O óleo resultante foi triturado com éter de petróleo e seco sob alto vácuo durante um mínimo de 1 h: rendimento de 7,51 g (79%); TLC: Rf(CM) = 0,41, Rf (cma> = 0,66; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 476,30 (esperado 476,18). TFA-MAMB-Ox— BocMamb-Ox (7,4 g; 15,5 mmol) foi dissolvida em 30 mL de cloreto de metileno mais 10 mL de TFA (TFA a 25%). A reacção foi deixada a prosseguir à temperatura ambiente durante 1 h e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida à temperatura ambiente durante 10 min e em seguida a 40 °C durante 15 min. O xarope resultante foi triturado com éter (200 mL) a -5 °C, dando. Os cristais resultantes foram filtrados após 1 h e bem lavados com éter: rendimento de 7,22 g (95%); Rí-(cma) = 0,25; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+FI+ = 376,22 (esperado 376,12).
Boc-Asp(OcHex)-Mamb-Ox — 20 mmol de Boc-Asp(OcHex) (6,308 g; Bachem) e 44 mmol de DIEA (7,66 mL) foram dissolvidos em 20 mL de DMF. Foram adicionados 20 mmol de HBTU (7,58 g; Advanced Chemtech) e a reacção foi deixada prosseguir durante 2 minutos com agitação vigorosa. TFA Mamb-Ox (7,13 g; 15 mmol) foi adicionado e a reacção foi deixada a prosseguir ao longo da noite à temperatura ambiente. O solvente foi removido sob pressão reduzida dando um óleo, o qual foi dissolvido em 500 mL de acetato de etilo e esta solução foi extraída com (150 mL de cada) 2 x ácido cítrico a 5%, 1 x água, 2 x NaHC03 sat., 1 x NaCl sat. A camada orgânica foi seca sobre
MgS04 e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O óleo resultante foi triturado com éter de petróleo e seco sob alto vácuo: rendimento de 9,76 g (97%); TLC: Rf(cm) = 0,55; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 673,45 (esperado 673,23). TFAAsp(OcHex)-MAMB-Ox— 15mmol de Boc-Asp(OcHex)--MAMB-Ox foi dissolvida em 50 mL de TFA a 35% em CH2C12 e deixada reagir 90 min. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida à temperatura ambiente durante 10 min e em seguida a 40 °C durante 15 min. Para remover traços de TFA, 25 mL de DMF foram adicionados e o solvente foi evaporado a 50 °C. O xarope resultante foi triturado com éter (200 mL) e em seguida seco sob alto vácuo: rendimento de 9,61 g (93%); Rf(CMA)= 0,45; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 573,56 (esperado 573,23).
Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB-Ox— 10,0mmol de cada um de TFA-Asp(OcHex)-MAMB-Ox, Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly e HBTU, mais 30 mmol de DIEA foram dissolvidos em 20 mL de DMF. Após 4 h, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo recebido em 600 mL de acetato de etilo, o qual foi extraído com 300 mL de cada um de ácido cítrico a 5%, água e NaCl sat. A camada orgânica foi seca sobre MgS04, evaporada sob pressão reduzida, triturada com éter e seca em vácuo: rendimento de 9,90 g (86%); Rf(CM) = 0,10; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ - 1153,22 (esperado 1153,47). TFAD-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB-Ox — Este composto foi preparado a partir de Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)--MAMB-Ox (9,8 g; 8,5 mmol) por tratamento com TFA/CH2C12 (1:1) durante 45 min. O solvente foi evaporado e o produto triturado com éter: rendimento de 9,73 g (98%); Rf(CM) = 0,10; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 1053,22 (esperado 1053,4). ciclo(D- Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB) — TFA-D--Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB-Ox (1,80 g; 1,54 mmol) e 2mmol de cada um de DIEA e ácido acético foram dissolvidos em 200 mL de DMF. A mistura foi aquecida a 50 °C durante 2 dias e em seguida evaporada sob pressão reduzida. O xarope foi dissolvido em 400 mL de acetato de etilo/«-butanol (1:1) e extraído com 200 mL de cada um de ácido cítrico a 5% (3x) e NaCl sat. (lx). A camada orgânica foi seca sobre MgS04 e triturada duas vezes com 200 mL de éter; rendimento de 1,07 g (86%); Rf(CM) = 0,10; o NMR é consistente com a estrutura; FAB-MS: M+H+ = 811,25 (esperado 811,38). ciclo(-D-Val-NMeArg-Gly-Asp-MAMB) — 0,50 g de ciclo(D-Val--NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB) foram tratados com 5 mL de HF a 0 °C na presença de 0,5 mL de anisole durante 30 min. O HF foi removido sob pressão reduzida e o péptido cru foi triturado com éter, acetato de etilo e éter. O sólido resultante foi dissolvido em ácido acético a 10% e liofílizado: rendimento de 0,321 g (82% calculado como sal acetato). O produto foi purificado com uma recuperação de 40% usando o mesmo método que o descrito para o material sintetizado pelo procedimento em fase sólida.
Ciclização do Intermediário 4 do Composto Cíclico Preparação de Formas de Sal do Intermediário 4 do Composto Cíclico
Foi agora descoberto que os compostos da presente invenção podem ser isolados por cristalização do composto a partir de solventes orgânicos e aquosos. O ião «zwitter» do Intermediário 4 do Composto Cíclico foi convertido para o sal mesilato (metanossulfonato) do Intermediário 4 do Composto Cíclico Intermediário 4 do Composto Cíclico (metanossulfonato)) pelo refluxo do ião «zwitter» com agitação em isopropanol a 25 mg/mL e adicionando lentamente uma solução de 1,0 equivalente molar de ácido metanossulfónico (corrigindo para o conteúdo de água do ião «zwitter») dissolvido em isopropanol. O aquecimento foi desligado e a solução arrefecida até 5 °C num banho de gelo. Após agitação durante 1 hora, a solução foi filtrada e o sólido enxaguado três vezes com isopropanol frio e seco em vácuo até peso constante.
Os seguintes sais do composto de Intermediário 4 do Composto Cíclico foram preparados usando o mesmo procedimento, adicionando 1,0 equivalente do ácido apropriado:
Intermediário 4 do Composto Cíclico (bifenilsulfonato): ião «zwitter» +1,0 equivalente de ácido bifenilsulfónico.
Intermediário 4 do Composto Cíclico (β-naftalenossulfonato): ião «zwitter» + 1,0 equivalente de ácido β-naftalenossulfónico.
Intermediário 4 do Composto Cíclico (benzenossulfonato): ião «zwitter» + 1.0 equivalente de ácido benzenossulfónico.
Intermediário 4 do Composto Cíclico (benzenossulfonato): ião «zwitter» + 1.0 equivalente de ácido p-toluenossulfónico.
Os seguintes sais dos compostos de Intermediário 4 do Composto Cíclico foram preparados por cristalização do composto a partir de sistemas aquosos.
Intermediário 4 do Composto Cíclico (sulfato): 10 mg de Intermediário 4 do Composto Cíclico amorfo (feito por liofilização do ião «zwitter» a partir de uma solução de 2 equivalentes molares de ácido acético em água) dissolvidos por mL de H2SO4 1 N, pH ajustado a 2,5. No repouso à temperatura ambiente formou-se um precipitado. Este foi filtrado através de um funil de vidro sintetizado e seco em vácuo até peso constante.
Intermediário 4 do Composto Cíclico (metanossulfonato (mesilatoV): 100 mg de DMP728 amorfo dissolvidos por mL de água foram adicionados de 1,2 equivalentes molares de ácido metanossulfónico (este foi obtido na forma de uma solução aquosa 4M). No repouso à temperatura ambiente formou-se um cristal espalmado grande.
Intermediário 4 do Composto Cíclico (benzenossulfonato): 100 mg de ião «zwitter» dissolvidos por mL de água foram adicionados de 1.2 equivalentes molares de ácido benzenossulfónico. No repouso à temperatura ambiente formou-se um precipitado. Este foi filtrado através de um funil de vidro sintetizado, lavado com uma pequena porção de isopropanol e seco em vácuo até peso constante.
Intermediário 4 do Composto Cíclico (p-toluenossulfonato): 100 mg de ião «zwitter» dissolvidos por mL de água foram adicionados de 1.2 equivalentes molares de ácido p-toluenossulfónico. No repouso à temperatura ambiente formou-se um precipitado. Este foi filtrado através de um funil de vidro sinterizado e seco em vácuo até peso constante. -92-
Intermediário 4b do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-D-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Val, K = D-NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,596 mmol para dar o péptido cíclico protegido (186 mg; 38,6%). O péptido (183 mg) e 0,183 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0°C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (145 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 9 até 22,5% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TF A do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 14,8%, rendimento global de 5,3%). FAB-MS: [M+H] = 575,31.
Intermediário 5 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Leu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Leu, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,115 mmol para dar o péptido cíclico protegido (92,4 mg; 98%). O péptido (92,4 mg) e 93 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 20 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (45,7 mg; 63%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl 8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7 até 21% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 29%; rendimento global de 16,5%). Espectro de massa: [M+H] = 589,48.
Intermediário 7 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Nle-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Nle, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,586 mmol para dar o péptido cíclico protegido (305 mg; 63,3%). O péptido (295 mg) e 0,295 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título (207 mg; 95,4%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 5,4 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 44%, rendimento global de 22,9%). FAB-MS: [M+H] = 589,26.
Intermediário 11 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Phg-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Phg, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o -94- procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,611 mmol para dar o péptido cíclico protegido (296 mg; 57,4%). O péptido (286 mg) e 0,286 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (210 mg; 98,9%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 5,4 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 24,2%, rendimento global de 11,9%). FAB-MS: [M+H] = 609,27.
Intermediário 12 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Phe-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Phg, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,611 mmol para dar o péptido cíclico protegido (140 mg; 26,7%). O péptido (135 mg) e 0,135 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (108 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7,2 até 22,5% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 35%, rendimento global de 8,7%). FAB-MS: [M+H] = 623,28. Síntese em Fase Sólida do Intermediário 13f do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Lys, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,586 mmol para dar o péptido cíclico protegido (349 mg; 58,9%). O péptido (334 mg) e 334 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (168 mg; 79,1%; calculado como sal difluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 5,4 até 14,4% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 33,6%, rendimento global de 12,1%). FAB-MS: [M+H] = 604,32. Síntese em Fase de Solução do Intermediário 13f do Composto Cíclico
Um Esquema delineando a síntese descrita abaixo aparece imediatamente após a respectiva descrição.
Ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Lys, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, RI = R2 = H
Parte A — Boc-Asp(OBzl) A uma solução de Boc-Asp(OBzl) (45,80 g; 140mmol) e HOSu (N-hidroxissuccinimida; 16,10 g; 140 mmol) em 300 mL de p-dioxano a 5-10 °C foi adicionada DCC (30,20 g; 140 mmol). A solução foi agitada durante 30 minutos a 5-10 °C e em seguida os sólidos foram filtrados e lavados com dioxano (3 x 50 mL). Os orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida para darem um óleo límpido que cristalizou até um sólido incolor (42,98 g; 73%) quando triturado com éter etílico (3 x 100 mL). O NMR é consistente com a estrutura; p.f. = 98-99 °C; DCI-MS: [M+NH4] = 438.
Parte B — Boc-Asp(OBzl)-Mamb Ácido 3-aminometilbenzóico HCl (Mamb; 13,08 g; 70,0 mmol) foi dissolvido em 120 mL de DMF e foi adicionada DIEA (24,32 mL; 140 mmol), mudando o pH de 4 para 7,5. A suspensão branca foi agitado à temperatura ambiente durante 30 min antes de ser adicionada uma solução de Boc-Asp(OBzl)-OSu (29,40 g; 70,0 mmol) em DMF (50 mL). A mistura foi deixada em agitação durante 24 h, tempo durante o qual virou para uma solução dourada. A solução foi adicionada a ácido cítrico a 5% (2000 mL) e arrefecida a 5 °C durante 3 h. Os sólidos foram em seguida recolhidos por filtração, lavados com água arrefecida em gelo (200 mL) e éter arrefecido em gelo (100 mL) e secos sob pressão reduzida para darem o composto mencionado em título na forma de um sólido incolor (29,62 g; 92%). p.f. = 149-151 °C; DCI-MS: [M+NH4] = 474.
Parte C — HCl.H-Asp(OBzl)-Mamb
Boc-Asp(OBzl)-Mamb (7,92 g; 17,4 mmol) foi dissolvido em HC1 4 N em dioxano (50 mL), agitado durante 2 h e a solução foi concentrada sob -97- pressão reduzida para dar o composto mencionado em título na forma de um sólido incolor (6,80 g; 99%). DCI-MS: [M+NH4] = 374.
Parte D — Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (14,40 g; 29,4 mmol), Boc-D-Lys(Tfa) (10,00 g; 29,4 mmol) e HBTU (11,37 g; 62,0 mmol) foram dissolvidos em cloreto de metileno (40 mL). Após arrefecimento até 0 °C, DIEA (10,44 g; 62,0 mmol) foi adicionada e a reacção foi deixada a prosseguir durante 20 minutos a 0 °C e 2 dias à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi diluída com acetato de etilo (800 mL), extraída com porções de 200 mL de HC1 0,2 N (lx), NaHC03 sat. (lx) e NaCl sat. (2x), seca (MgS04) e evaporada sob pressão reduzida até um sólido amarelo. A purificação por cromatografia flash (sílica gel; EtOAc:acetonitrilo 5:1) deu o composto mencionado em título na forma de um sólido incolor (20,34 g; 85%). p.f. = 78-85 °C; DCI-MS: [M+NH4] = 831.
Parte E — Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly
Uma solução de Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (11,00 g; 13,5 mmol) em metanol (200 mL) foi colocada numa garrafa agitadora de Parr, purgada com N2 durante 10 minutos e tratada com catalisador de 10% de paládio em carbono (10% Pd/C; 3,6 g). A garrafa agitadora foi ainda purgada com 7 ciclos de pressurização-evacuação, repressurizada e deixada em agitação durante 90 minutos, tempo durante o qual a quantidade calculada de hidrogénio foi consumida. O catalisador foi removido por filtração através de um leito de Celite® e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida produzindo um sólido. A trituração com éter etílico refluxante (75 mL) deu o produto puro (9,18 g; 94%) na forma de um sólido incolor. DCI-MS: [M+NH4] = 724.
Parte F — Boc-D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly-OSu
Boc-D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly (8,00 g; 11,0 mmol), HOSu (1,25 g; 10,8 mmol) e DCC (2,22 g; 10,8 mmol) foram dissolvidos em DMF (75 mL) e agitados à temperatura ambiente durante 2 dias. Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com DMF (2 x 15 mL). O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o xarope resultante foi seco sob pressão reduzida a 40 °C para dar um sólido acastanhado (6,50 g; 72%). p.f. = 66-69 °C; FAB-MS: [M+H] = 821.
Parte G —Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb
Uma suspensão de Boc-D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly-OSu (8,85 g; 10,8 mmol) e HCl.Asp(OBzl)-Mamb (4,24 g; 10,8 mmol) em dioxano:DMF 4:1 (100 mL) foi tratada com DIEA (1,39 g; 10,8 mmol) ao longo de 10 minutos. A mistura resultante foi agitado à temperatura ambiente durante 2 dias e concentrada sob pressão reduzida até um xarope. Este xarope foi dissolvido em acetato de etilo (300 mL) e lavado com porções de 75 mL de HC1 0,2 N (3x), NaHC03 sat. (2x), H20 (lx) e NaCl saturado (lx). A camada orgânica foi seca (MgS04) e concentrada sob pressão reduzida a 40 °C até um sólido âmbar pegajoso (9,13 g; 78%). p.f. = 90-93 °C; FAB-MS: [M+H] = 1062.
Parte H—HCl.D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb
Boc-D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb (8,30 g; 7,8 mmol) foi parcialmente dissolvido em HC1 4 N em dioxano (50 mL), agitado à temperatura ambiente durante 30 min e concentrado sob pressão reduzida para dar um sólido amarelo. A trituração com EtOAc quente (60 mL) produziu o produto (7,65 g; 98%) na forma de um sólido amarelo. FAB-MS: [M+H] = 962.
Parte I - Ciclo-(D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb) HCl»D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb (3,00 g; 3,0 mmol), DIEA (0,77 g; 6,0 mmol) e TBTU (0,98 g; 3,0 mmol) foram dissolvidos em DMF (100 mL). A reacção foi agitado à temperatura ambiente durante 22 horas e o pH foi mantido a 7-8 pela adição de DIEA conforme necessário. A reacção foi concentrada sob pressão reduzida e o óleo resultante foi dissolvido em acetato de etilo:l-butanol 3,75:1 (110 mL). A solução orgânica foi lavada com porções de 50 mL de HC1 0,2 N (2x), NaHC03 saturado (lx), H20 (lx) e NaCl saturado (lx), seca (MgS04), concentrada até um óleo castanho. A trituração com éter etílico (100 mL) deu um sólido castanho que foi purificado por cromatografia flash (sílica gel; EtOAciEtOH 5:1) para dar o composto mencionado em título (1,62 g; 57%) na forma de um sólido incolor, p.f. = 128-130 °C; FAB-MS: [M+H] = 944.
Parte J — Ciclo-(D-Lvs(Tfa)-N-MeArg-Gly-Asp-Mamb)
Ciclo-(D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb) (0,85 g; 0,9 mmol) foi dissolvido em TF A (10 mL) e arrefecido até -10 °C. Ácido tríflico (ácido trifluorometanossulfónico; 10 mL) foi adicionado lentamente à mistura reaccional agitada enquanto se manteve a temperatura a -5 °C. Anisole (2 mL) foi adicionado e a agitação continuou durante 3 horas a -5 °C. A temperatura da reacção foi diminuída até -78 °C, éter etílico (200 mL) foi adicionado e a mistura reaccional foi agitada durante 1 hora. Os sólidos pegajosos brancos foram removidos por filtração e lavados com éter arrefecido em gelo (50 mL). Os sólidos foram dissolvidos em acetona^O 1:1 (10 mL) e liofilizados para darem o produto (0,63 g; 100%) na forma de um sólido incolor felpudo. FAB-MS: [M+H] = 700.
Parte K — Ciclo-(D-Lys-N-MeArg-Gly-Asp-Mamb)
Ciclo-(D-Lys(Tfa)-N-MeArg-Gly-Asp-Mamb) (0,63 g; 0,9 mmol) foi dissolvido em piperidina aquosa 1,0 M (10 mL) a 0 °C e a mistura reaccional foi deixada aquecer lentamente até à temperatura ambiente ao longo de 3 horas. A solução foi liofilizada para dar um sólido amarelo. A purificação foi realizada por HPLC preparativa com uma coluna Vydac® proteína-péptido C-18 (2,1 cm) usando um gradiente a 0,36%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilização para dar o composto mencionado em título (0,20 g; 90%) na forma de um sólido felpudo incolor, p.f. = 138-142 °C; FAB-MS: [M+H] = 604.
Boc-N-MeArg(Toi)-OH Síntese em fase de solução de 13f H-Gly*OBzl H-N-MeAi|(Tot)-Gly-OBil
HBTU.DIEA Boc-D-Ly<Tf»K)H
Boc-N-MeAig(Tos)-Gly-OBz] -3ΣΑ
HBTU.DEEA
Boc-D-Lyi(Tf»>-N-MíArg(To*)-Gly-OBU
% PdJC
HOSu. DCC, DMF
Boc-D-Lyi(Tf»)-N-MfcArg(Toj)-Gly-OSu
Boc-Asp(OBzl) OH NIncr1 NH*Boc
Boc-Asp(OB zl )-OSu DIEA.DMF
2. Boc-D-Lys(Tfi). N-MeArgCTos>-Gly4DSuI DEEADMF 1. TFA. CH2 Cl* N-MeArg(Tos) —Gly/ \ Boc-D-Lys(Tfa) Asp(OBzl)
ΟΧ NH
1. 4N HCl/Dioxano
Z TBTU, DIEA DMF ^Gly N-MeArg(Tos) 'ÀspfOBzl)O-L^rna) 1. TFA.Ácido Triflico /Gly N-MeArg / D-Lys
NH
2. 1M Piperidina 3. HPLC
-CF3C02H
Intermediário 13r do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Ile-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Ile, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,611 mmol para dar o péptido cíclico protegido (349 mg; 69,2%). O péptido (342 mg) e 0,342 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título (227 mg; 90%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 10,8 até 19,8% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 22,5%, rendimento global de 12,1%). FAB-MS: [M+H] = 589,34.
Intermediário 17 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Met-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Met, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina. O péptido foi preparado numa escala de 0,179 mmol para dar o péptido cíclico protegido (105 mg; 69,7%). O péptido (105 mg) e 0,105 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 20 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título (72 mg; 92,3%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 14,4 até 23,4% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 13,2%, rendimento global de 7,4%). FAB-MS: [M+H] = 607,3.
Intermediário 18 do Composto Cíclico
Ciclo-(NMeGly-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = NMeGly, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,43 mmol para dar o péptido cíclico protegido (205 mg; 60%). O péptido (200 mg) e 200 mL de w-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar (18) na forma de um sólido amarelo pálido (148 mg; 97%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7 até 22% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA de (18) na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 14,7%, rendimento global de 7,9%). FAB-MS: [M+H] = 547,34.
Intermediário 24 do Composto Cíclico
CicIo-(Pro-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = Pro, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,43 mmol para dar o péptido cíclico protegido (170 mg; 48,8%). O péptido (164 mg) e 164 mL de /n-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofílizado para originar (24) na forma de um sólido amarelo pálido (101 mg; 79%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7 até 22% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA de (24) na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 5,8%, rendimento global de 2,1%). FAB-MS: [M+H] = 573,46.
Intermediário 25 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Pro-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Pro, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,43 mmol para dar o péptido cíclico protegido (211 mg; 60,8%). O péptido (200 mg) e 200 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofílizado para originar (25) na forma de um sólido amarelo pálido (145 mg; 93,3%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7 até 22% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA de (25) na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 6,4%, rendimento global de 3,3%). FAB-MS: [M+H] = 573,35.
Intermediário 28c do Composto Cíclico
Ciclo-(P-Ala-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = β-AIa, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,586 mmol para dar o péptido cíclico protegido (264 mg; 57,5%). O péptido (258 mg) e 258 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (231 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 5,4 até 14,4% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 53,2%, rendimento global de 32,5%). FAB-MS: [M+H] = 547,28.
Intermediário 28f do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Tyr-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Tyr, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,313 mmol para dar o péptido cíclico protegido (342 mg; maior que rendimento - 105- quantitativo). O péptido (331 mg) e 0,330 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (218 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 11,3%, rendimento global de 10,8%). FAB-MS: [M+H] = 639,54.
Intermediário 29 do Composto Cíclico
Ciclo-(Gly-Arg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = Gly, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,283 mmol e metade foi ciclizado para dar o péptido cíclico protegido (62 mg; 58%). O péptido (60 mg) e 60 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (48 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,30%/min de 0 até 9% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 36%, rendimento global de 19,9%). FAB-MS: [M+H] = 519,26. -106 -
Intermediário 30 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Ala-Arg-GIy-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Ala, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,189 mmol para dar o péptido cíclico protegido (211 mg; maior que rendimento quantitativo). O péptido (195 mg) e 195 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0°C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (125 mg; 83%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,30%/min de 2 até 11% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 12,5%, rendimento global de 13,8%). FAB-MS: [M+H] = 533,26.
Intermediário 31 do Composto Cíclico
Ciclo-(Ala-Arg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = Ala, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,324 mmol para dar o péptido cíclico protegido (191 mg; 76,4%). O péptido (100 mg) e 100 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (75 mg; 97,4%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl 8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 2 até 11% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 15,5%, rendimento global de 10,5%). FAB-MS: [M+H] = 533,25.
Intermediário 32 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-Arg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Vai, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,193 mmol para dar o péptido cíclico protegido (199 mg; maior que rendimento quantitativo). O péptido (193 mg) e 193 mL de w-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0°C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (130 mg; 86%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 2 até 13% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 57%, rendimento global de 58,1%). FAB-MS: [M+H] = 561,22.
Intermediário 33 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Leu-Arg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Leu, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,202 mmol para dar o péptido cíclico protegido (152 mg; 93%). O péptido (150 mg) e 150 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (78 mg; 66%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 5 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 26%, rendimento global de 14,8%). FAB-MS: [M+H] = 575,45.
Intermediário 34 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Abu-Arg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Abu, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,193 mmol para dar o péptido cíclico protegido (210 mg; maior que rendimento quantitativo). O péptido (206 mg) e 206 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (158 mg; 99%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 2 até 11% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 57%, rendimento global de 72,2%). FAB-MS: [M+H] = 547,21.
Intermediário 35 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Ser-Arg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Ser, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,193 mmol para dar o péptido cíclico protegido (224 mg; maior que rendimento quantitativo). O péptido (210 mg) e 210 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0°C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HO Ac aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (145 mg; 89%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® 08 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 2 até 13% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 22%, rendimento global de 27%). FAB-MS: [M+H] = 549,31.
Intermediário 36 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Phe-Arg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Phe, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,266 mmol para dar o péptido cíclico protegido (202 mg; 90%). O péptido (157 mg) e 157 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (125 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7 até 23% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 35%, rendimento global de 29,3%). FAB-MS: [M+H] = 609,25.
Intermediário 37 do Composto Cíclico
Ciclo-(Phe-Arg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = Phe, K = Arg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido foi preparado numa escala de 0,335 mmol para dar o péptido cíclico protegido (306 mg; maior que rendimento quantitativo). O péptido (275 mg) e 275 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 1 hora. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título na forma de um sólido amarelo pálido (214 mg; 98%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 9 até 23% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 32%, rendimento global de 31,5%). FAB-MS: [M+H] = 609,26.
Intermediário 40 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeAmf-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Val, K = NMeAmf, L = Gly, M - Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-GIy-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,586 mmol para dar o péptido cíclico protegido (189 mg; 93,9%). O péptido (189 mg) e 0,189 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título (212 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 10,8 até 22,5% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 8,1%, rendimento global de 4,1%). FAB-MS: [M+H] = 595,23.
Intermediário 48a do Composto Cíclico O composto mencionado em título pode ser sintetizado usando procedimentos descritos em Mosher et al., Tett. Lett. 29 3183-3186 e conforme mostrado esquematicamente abaixo. Este mesmo procedimento é um método geralmente útil para a conversão de uma amina primária numa funcionalidade guanidina.
- 112-
Intermediários 42 - 45 do Composto Cíclico A síntese dos Intermediários 42 - 45 do Composto Cíclico é mostrada esquematicamente abaixo.
.S(CH2)2NH2
ver síntese do composto 41
HNH
Q R6—N / D-Val (CH^n
Giy.
S(CH2)2NH-ζ «HS03O NH, vAsp \
NH
Intermediários 46 e 47 do Composto Cíclico
Os Intermediários 46 e 47 do Composto Cíclico são preparados de acordo com procedimentos padrão, por exemplo, conforme descrito em Garigi-pati, Tett. Lett. 31 (1990) 1969-1972 e na Patente Canadiana N° 2008311, conforme é mostrado esquematicamente abaixo. O grupo ácido aspártico pode ser protegido (e. g., com um grupo de protecção fenacilo) para evitar reacções laterais.
C==N
(CH,),, (CH,)n
Me—N/|^" / 0 Gly VA»p \ MH 1) MeAI(CI)NRaR" Tolueno, 80*C R· = R” = H Me— / o GK vA.p \ i/-ver \ ^ / 2) HzO D-Vat \ MH V"' L \\ OU 0 1 í s n = 0, 1 1) HíS/Pyr/EtjN 2} Mel/ acetona 3) Amm. acetato
Intermediário 54 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-P-Ala-Asp-Mamb); J = D-Val, K = NMeArg,
L = β-Ala, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,586 mmol para dar o péptido cíclico protegido (227 mg; 46,9%). O péptido (219 mg) e 219 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar (54) na forma de um sólido amarelo pálido (150 mg; 93,2%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7,2 até 16,2% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA de (54) na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 43,6%, rendimento global de 16,5%). FAB-MS: [M+H] = 589,32. - 114-
Intermediários 55 - 58 do Composto Cíclico A síntese dos Intermediários 55 - 58 do Composto Cíclico é mostrada esquematicamente abaixo.
1) 25% TFA In DCM 2} 10% DIEA in DCM BOC-Asp-Mamb- oxinia --
3) Br{CHj)nCOOH n = 1.2 DCC
O
Br(CH2)n Λ
Mamb- oxima
TOS—NH ^=ΝΗ
continua como no esquema geral 55, 56, 57, e 53 - 115-
Intermediário 58c do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-L-Ala-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = L-AIa, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,611 mmol para dar o péptido cíclico protegido (375 mg; 74,6%). O péptido (360 mg) e 0,360 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título (220 mg; 83%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 19,9%, rendimento global de 10,6%). FAB-MS: [M+H] = 589,31.
Intermediários 63 e 63a do Composto Cíclico
CicIo-(D-Val-NMeArg-GIy-a-MeAsp-Mamb); os compostos de fórmula (II) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly, M = α-MeAsp, R1 = R2 = H
Os compostos mencionados em título foram preparados usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,794 mmol para dar o péptido cíclico protegido (237 mg; 36,1%). O péptido (237 mg) e 0,237 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (165 mg; 94,3%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo; isómero n° 1: recuperação de 8,36%, rendimento global de 2,5%; FAB-MS: [M+H] = 589,29; isómero n° 2: recuperação de 9,16%, rendimento global de 2,7%; FAB-MS: [M+H] - 589,27.
Intermediários 64 e 64a do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-P-MeAsp-Mamb); os compostos de fórmula (II) em que J = D-Vai, K = NMeArg, L = Gly, M = β-MeAsp, R1 = R2 = H
Os compostos mencionados em título foram preparados usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,611 mmol para dar o péptido cíclico protegido (201 mg; 40,0%). O péptido (200 mg) e 0,200 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (162 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a - 117- 0,23%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo; isómero n° 1: recuperação de 12,7%, rendimento global de 4,8%; FAB-MS: [M+H] = 589,43; isómero n° 2: recuperação de 13,9%, rendimento global de 5,3%; FAB-MS: [M+H] = 589,45.
Intermediário 64b do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-NMeAsp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly, M = NMeAsp, R1 = Rz = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,611 mmol para dar o péptido cíclico protegido (232 mg; 46,1%). O péptido (225 mg) e 0,225 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título (160 mg; 96,4%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 28,2%, rendimento global de 10,9%); FAB-MS: [M+H] = 589,42.
Intermediário 64c do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-D-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Vai, K = NMeArg, L = Gly, M = D-Asp, R1 = H, R2 = H
I
I
118- O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,611 mmol para dar o péptido cíclico protegido (257 mg; 51,9%). O péptido (250 mg) e 0,250 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título (192 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 44,4%, rendimento global de 20,7%); FAB-MS: [M+H] = 575,42.
Intermediário 89e do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Abu-di-NMeOrn-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Abu, K = di-NMeOrn, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,498 mmol para dar o péptido cíclico protegido (150 mg; 39,3%). O péptido (150 mg) e 0,150 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofílizado para originar o composto mencionado em título (93 mg; 86%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® C18 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,45%/min de 3,6 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofllizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 49,3%, rendimento global de 14,2%); FAB-MS: [M+H] = 533,34.
Intermediário 89f do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-D-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Abu, K = NMeArg, L = Gly, M = D-Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. Foi usado TBTU como agente de acoplamento. O péptido foi preparado numa escala de 0,596 mmol para dar o péptido cíclico protegido (273 mg; 57,6%). O péptido (263 mg) e 0,263 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 20 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (218 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 10,8 até 19,8% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 40,4%, rendimento global de 21,9%); FAB-MS: [M+H] = 561,37.
Intermediário 89g do Composto Cíclico
CicIo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Abu, K = D-NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedi- mento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. Foi usado TBTU como agente de acoplamento. O péptido foi preparado numa escala de 0,596 mmol para dar o péptido cíclico protegido (241 mg; 50,8%). O péptido (235 mg) e 0,235 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 20 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (168 mg; 98,3%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® 08 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 12,6 até 21,6% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 2,3%, rendimento global de 0,99%); FAB-MS: [M+H] = 561,36.
Intermediário 89h do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Ala-p-guanidinil-Phe-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Ala, K = />-guanidinil-Phe, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H
Dissolveram-se 25 mg (38,3 mmol) de ciclo-(D-Ala-/?-amino-Phe--Gly-Asp-Mamb) (sal TFA), 14,3 mg (114,9μτηο1) de formamidina-ácido sulfónico e 18,7 mg (153,2 μτηοΐ) de 4-dimetil-aminopiridina em 5 mL de etanol - 121 - num balão de fundo redondo de 10 mL. A mistura foi refluxada durante 3 horas e em seguida foi adicionada de 14,3 mg de formamidina-ácido sulfónico e 18,7 mg de 4-dimetil-aminopiridina. Após refluxar durante mais 3 horas, verificou-se que a reacção estava completa -75% por HPLC de inversão de fases. O etanol foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo purificado numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,45%/min de 0 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA. A liofilização produziu o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco (recuperação de 28%, rendimento global de 26,4%); FAB-MS: [M+H] = 581,30.
Intermediário 89i do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Abu-(DiNMe,guanidinil-Orn)-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Abu, K = diNMe,guanidinil-Orn,
L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H
—V”
u
Dissolveram-se 10,53 mg (16,3 mmol) de ciclo-(D-Abu-di-NMeOm-Gly-Asp-Mamb) (sal TFA), 6,08 mg (48,99 pmol) de formamidina--ácido sulfónico e 8,00 mg (65,57 pmol) de 4-dimetil-aminopiridina em 2,5 mL de etanol num balão de fundo redondo de 10 mL. A mistura foi refluxada durante 2 horas e em seguida foi agitado à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi refluxada durante uma hora, foram adicionados mais 6,08 mg de formamidina-ácido sulfónico e 8,00 mg de 4-dimetilaminopiridina e em seguida - 122- refluxada durante mais 2 horas. O etanol foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo purificado numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,45%/min de 3,6 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA. A liofilização produziu o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco (recuperação de 57,2%, rendimento global de 53,5%); FAB-MS: [M+H] = 575,34.
Intermediários 89j do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Abu-DiNMeLys-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Abu, K = Di-NMeLys, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H
Ciclo-(D-Abu-NMeLys-Gly-Asp-Mamb); o composto de fórmula (II)
em que J = D-Abu, K = NMeLys, L = Gly, M = Asp, R1 = H, R2 = H
Os derivados de aminoácido de di-N-metilo podem ser preparados usando métodos que já foram previamente descritos (Olsen, J. Org. Chem. 35 (1970) 1912) ou, altemativamente, através do uso de NaH/CH3I. O aminoácido NMe-Lisina foi obtido como produto secundário durante a síntese do derivado di-NMe-lisina correspondente. Os compostos mencionados em título foram preparados usando técnicas convencionais de química de péptidos em fase de solução anteriormente descritas. Ciclo-(D-Abu-DiNMeLys-Gly-Asp-Mamb) foi obtido com rendimento global de 0,31%, FAB-MS: [M+H] = 547,3. Ciclo-(D-Abu-NMeLys-Gly-Asp-Mamb) foi obtido com rendimento global de 0,25%, FAB-MS: [M+H] = 533,3.
Intermediário 90 do Composto Cíclico CicIo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 2-aminometilfenilacético) O composto mencionado em título foi preparado por uma - 123 - modificação do caminho geral da química em fase de solução. Esta aproximação empregou um éster de succinimida de aminoácido acoplando-se à porção ciclizante aromática e a oxima de dinitrobenzofenona, conforme mostrado esquematicamente abaixo no Esquema que se segue (n = 1).
Esquema
Boe*A»p(OeHex)-OSu NaHCO], THF/HjO NMeArg(To*)-Boc-D-Vel I ( GJy * I Aap{OcHex)-NH
Ox
1. TFA, CHjCIj
2. AcOH, IPfjNEt. DMF, 60’ C
1. TFA, CHjCIj 27 Boe-D*Vâl— NMeArg(To»)-Cly, TBTU, IPfjNEi, DMF
N-MHTo*)Arg D-Vai
Aep(OcHex)
O
NH
1. HF, PhOMc 2. TFA, HPLC
Ácido Boc-Asp(OcHex)-2-aminometilfenilacético
A uma suspensão de ácido 2-aminometilfenilacético.HCl (4,0 g; 20 mmol) em H20 (20 mL) foi adicionado NaHC03 (5,0 g; 60 mmol), seguido por uma solução de Boc-Asp(OcHex)-OSu (7,5 g; 18 mmol) em THF (20 mL). A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 3 horas, filtrada, diluída com H20, acidificada com HC1 1 N e extraída com acetato de etilo. O extractos foram lavados com H20, água salgada, secos sobre sulfato de magnésio anidro e evaporados até à secura sob pressão reduzida. Este material foi triturado com éter para produzir o composto mencionado em título (7,0 g; 83%) na forma de um pó branco. !H-NMR (D6-DMSO) 12,40 (br s, 1H), 8,30 (br t, 1H), 7,20 (m, 5H), 4,65 (m, 1H), 4,35 (q, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,65 (s, 2H), 2,70 (dd, 1H), 2,55 (dd, 1H), 1,70 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 1,35 (m, 6H).
Oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona O composto mencionado em título foi preparado por modificação de procedimentos previamente reportados na literatura (Chapman e Fidler, J. Chem. Soc. (1936) 448; Kulin e Leffek, Can. J. Chem. 51 (1973) 687). Uma solução de anidrido crómico (20 g; 200 mmol) em 125 mL de H20 foi adicionada gota a gota ao longo de 4 horas a uma suspensão de bis(4-nitrofenil)metano (25 g; 97 mmol) em 300 mL de ácido acético aquecido em refluxo. A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 1 hora, arrefecida até à temperatura ambiente e vertida em água. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com H20, bicarbonato de sódio a 5%, H20 e foi seco ao ar para proporcionar uma mistura 1:1 de bis(4-nitrofenil)metano/4,4'-dinitrobenzofenona via ’Η-NMR. Este material foi oxidado com uma segunda porção de anidrido crómico (20 g; 200 mmol), seguido por um procedimento de manipulação idêntico para proporcionar o produto cru. A trituração com 200 mL de benzeno aquecido em refluxo durante 16 horas produziu 4,4'-dinitrobenzofenona (20,8 g; 79%) na forma de um pó amarelo.
Uma solução de hidrocloreto de hidroxilamina (10,2 g; 147 mmol) foi adicionada a uma suspensão de 4,4-dinitrobenzofenona (19 g; 70 mmol) em 100 mL de etanol. A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 2 horas, arrefecida até à temperatura ambiente e o sólido foi recolhido por filtração. A recristalização a partir de etanol produziu o composto mencionado em título - 125 - (14,0 g; 70%) na forma de cristais amarelos pálidos, p.f. 194 °C; *H-NMR (D6-DMSO) 12,25 (s, 1H), 8,35 (d, 2H), 8,20 (d, 2H), 7, 60 (d, 4H).
Boc-Asp(OcHex)-2-aminometilfenilacetato de oxima da 4,4’-di-nitrobenzofenona A uma solução arrefecida em gelo de ácido Boc-Asp(OcHex)-2--aminometilfenilacético (3,5 g; 7,6 mmol) e oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona (2,2 g; 7,5 mmol) em 50 mL de acetato de etilo e 5 mL de DMF foi adicionada DCC (1,6 g; 7,8 mmol). A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 8 horas, filtrada, diluída com acetato de etilo, lavada com solução saturada de bicarbonato de sódio, H20, água salgada, seca sobre sulfato de magnésio anidro e evaporada até à secura sob pressão reduzida. Este material foi purificado por cromatografla em coluna sobre sílica gel (EM Science, malha 234-400 mesh) usando diclorometano/acetato de etilo 10:1 para dar o composto mencionado em título (4,3 g; 78%) na forma de cristais amarelos. 'H-NMR (D6-DMSO) 8,30 (dd, 5H), 7,80 (d, 2H), 7,65 (d, 2H), 7,15 (m, 5H), 4,65 (m, 1H), 4,35 (q, 1H), 4,15 (m, 2H), 3,90 (s, 2H), 2,70 (dd, 1H), 2,50 (dd, 1H), 1,70 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 1,35 (m, 6H).
Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-2-amlnometilfenil--acetato de oxima da 4,4,-dinitrobenzofenona A uma solução de Boc-Asp(OcHex)-2-aminometilfenilacetato de oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona (1,5 g; 2 mmol) em 4mL de diclorometano foram adicionados 2 mL de ácido trifluoroacético. A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 1 hora e evaporada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi concentrado sob alto vácuo para remover traços de ácido trifluoroacético em excesso. A uma solução do sal de TFA cru e Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly - 126 - (1,2 g; 2 mmol) em 5 mL de DMF foram adicionados TBTU (640 mg; 2 mmol) e DIEA (780 mg; 6 mmol). A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 16 horas, concentrada sob alto vácuo, diluída com acetato de etilo, lavada com ácido cítrico a 5%, H2O, água salgada, seca sobre sulfato de magnésio anidro e evaporada até à secura sob pressão reduzida. Este material foi triturado com éter para produzir o composto mencionado em título (2,3 g; 95%) na forma de um pó amarelo. Este material foi usado sem mais purificação.
CicIo-(D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-ácido 2-aminome-tilfenilacético) A uma solução de Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-2--aminometilfenil-acetato de oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona (1,2 g; 1 mmol) em 4 mL de diclorometano foram adicionados 2 mL de ácido trífluoroacético. A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 3 horas, diluída com diclorometano e evaporada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi concentrado sob alto vácuo para remover traços de ácido trifluoroacético em excesso. A uma solução do sal de TFA cru em 100 mL de DMF foi adicionado ácido acético (0,50 mL; 8,7 mmol) e DIEA (1,52 mL; 8,7 mmol). A mistura reaccional foi agitada a 60 °C durante 3 dias, concentrada sob alto vácuo, diluída com acetato de etilo e a solução foi deixada a cristalizar durante a noite. A filtração proporcionou o composto mencionado em título (563 mg; 68%) na forma de um pó amarelo. 'H-NMR (Dô-DMSO) 8,70 (d, 1H), 8,40 (br s, 1H), 8,30 (br s, 1H), 8,05 (t, 1H), 7, 65 (d, 2H), 7,25 (d, 2H), 7,20 (m, 4H), 7,10 (br d, 1H), 6,80 (br s, 1H), 6,60 (br s, 1H), 5,10 (dd, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,55 (m, 1H), 4,40 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,65 (d, 1H), 3,45 (m, 2H), 3,05 (m, 2H), 2,80 (s, 3R), 2,80 (m, 1H), 2,60 (dd, 1H), 2,30 (s, 3H), 1,70 (m, 6H), 1,30 (m,9H), 0,95 (d, 3H), 0,80 (d, 3H). DCI (NH3)-MS: [M+H] = 825.
Ciclo-(D-Val-NMeArg-GIy-Asp-ácido 2-aminometilfenilacético)
Uma mistura de 352 mg (0,43 mmol) de ciclo-(D-Val-NMeArg-(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-ácido 2-aminometiIfenil-acético) e 352 pL de anisole foi tratada a 0 °C com 5 mL de HF durante 20 minutos. O HF em excesso foi removido sob pressão reduzida, o resíduo triturado com éter, dissolvido em 50% de acetonitrilo em água e liofílizado para produzir o péptido cíclico*sal de HF cru na forma de um pó esbranquiçado. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,8%/min de 10 até 38% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título (225 mg; 75%) na forma de um sólido branco felpudo; 'H-NMR (D6-DMSO) 8,70 (d, 1H), 8,35 (d, 1H), 8,20 (t, 1H), 8,00 (t, 1H), 7,45 (t, 1H), 7,20 (m, 3H), 7,10 (m, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,10 (dd, 1H), 4,50 (dt, 1H), 4,40 (m, 2H), 3,85 (dt, 2H), 3,65 (d, 1H), 3,50 (dd, 1 H), 3,45 (d, 1H), 3,10 (m, 2H), 2,90 (s, 3H) 2,75 (dd, 1H), 2,55 (dd, 1H), 2,00 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 1,65 (m, 1H), 1,30 (m, 2H), 0,95 (d, 3H), 0,85 (d, 3H). FAB-MS: [M+H] = 589.
Intermediário 91 do Composto Cíclico Cicio-(D-VaI-NMeArg-GIy-Asp-ácido 2-aminometilbenzóico) O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--ácido 2-aminometilfenilacético) e conforme mostrado esquematicamente acima no Esquema para o Intermediário 90 do Composto Cíclico (n = 0). O péptido cíclico (192 mg; 0,24 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,8%/min de 10 até 38% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético - 128- te*=e===»=f para dar o sal de TF A do composto mencionado em título (20 mg; 12%) na forma de um sólido branco felpudo; 'H-NMR (D6-DMSO) 8,75 (d, 1H), 8,50 (d, 1H), 7,65 (t, 1H), 7,60 (t, 1H), 7,50 (m, 2H), 7,40 (m, 3H), 7,00 (br s, 4H), 5,05 (dd, 1H), 4,50 (t, 1H), 4,30 (m, 2H), 4,10 (dd, 1H), 3,70 (m, 2H), 3,15 (q, 2H), 3,05 (s, 3H), 2,80 (dd, 1H), 2,55 (dd, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,60 (m, 1H), 1,40 (m, 2H), 1,05 (d, 3H), 0,95 (d, 3H). FAB-MS: [M+H] = 575.
Intermediário 92 do Composto Cíclico Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminofenilacético) O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--Mamb) e conforme mostrado esquematicamente acima no Esquema abaixo. O péptido cíclico (360 mg; 0,44 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna LiChrospher® RP-18 preparativa (5 cm) usando um gradiente a 2,3%/min de 22 até 90% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TF A do composto mencionado em título (150 mg; 50%) na forma de um sólido branco felpudo; 'H-NMR (D6-DMSO) 12,40 (br s, 1H), 8,95 (s, 1H), 8,55 (m, 2H), 8,45 (t, 1H), 7,90(d, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,20 (t, 1H), 7,00 (br s, 4H), 6,90 (m, 2H), 5,15 (dd, 1H), 4,65 (q, 1H), 4,55 (t, 1H), 3,65 (m, 2H), 3,60 (dd, 1H), 3,10 (m, 2H), 2,85 (s, 3H), 2,85 (d, 1H), 2,70 (dd, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,75 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 0,90 (d, 3H), 0,85 (d, 3H) . FAB-MS: [M+H] = 575.
Intermediários 87 e 88 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 4-aminometilbenzóico); o composto de fórmula (III) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly,
M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito acima para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação do ácido Boc-4-aminometil-benzóico á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,43 mmol para dar o péptido cíclico protegido (212 mg; 60,8%). O péptido (200 mg) e 200 mL de m-cresol foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em HOAc aquoso e liofilizado para originar o péptido cru na forma de sólido amarelo pálido (152 mg; 97%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 7 até 22% de acetonitrilo contendo 0,1% de TF A. Foram isolados dois picos para darem o isómero n° 1 (87) (recuperação de 17,1%, rendimento global de 9,3%) e o isómero n° 2 (88) (recuperação de 13,4%, rendimento global de 7,3%); FAB-MS: [M+H] = 575,41 (isómero n° 1; 87); 575,44 (isómero n° 2; 88).
Intermediários Substituídos por R1 ou R2
Os Intermediários do Composto Cíclico que incorporam substituintes em R1 ou R2 são sintetizados a partir das porções ciclizantes substituídas correspondentes. Os seguintes esquemas, discussões e exemplos ensinam a preparação desta classe de porção ciclizante e os intermediários do composto cíclico correspondentes. Ácido í-butiloxicarbonil-N-metil-3-aminometilbenzóico (Boc-NMeMamb) O composto mencionado em título pode ser preparado de acordo com procedimentos padrão, por exemplo, conforme revelado em Olsen, J. Org. Chem. 35 (1970) 1912, e conforme mostrado esquematicamente abaixo. ο ο O Me BOC—ΝΗ OH *8jO —Ν CHjT Me DMF, 4$· o 1) NaOH/EtOH 2) Η*
BOC—N L ΌΗ Síntese de análogos de ácido aminometilbenzóico
As porções ciclizantes da fórmula abaixo podem ser preparadas usando procedimentos de síntese padrão, por exemplo, conforme mostrado nos esquemas de reacção indicados mostrados abaixo.
NH-BOC
Para R = CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3, CH(CH3)CH2CH3j benzilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo; ver Esquema 1. ^ Para R = CH3, CH2CH2CH2CH3j fenilo; ver Esquema 2.
Para R = CH3, fenilo; ver esquemas 3 e 4.
Esquema 1 DBU/CHjI/THF
10% Pd-C/Hy HCt/ElOH
O nh,.hci
MeO^
Ph
HO
(0 Desprotecç5o
Ph
(ii) BOC-ON
HNa^ Ph OfeCfe ΒΊ RX
Ácido 3-[l'-(í-butiloxicarbonil)amino]etilbenzóico (Boc-MeMAMB) O composto mencionado em título para o propósito desta invenção foi preparado de acordo com o Esquema 4 (acima).
Acido 3-acetilbenzóico (0,50 g; 3 mmol), hidrocloreto de hidroxilamina (0,70 g; 10 mmol) e piridina (0,70 mL; 9 mmol) foram refluxados em 10 mL de etanol durante 2 h. A mistura reaccional foi concentrada, o resíduo triturado com água, filtrado e seco. A oxima foi isolada na forma de um sólido branco (0,51 g; rendimento de 94,4%). ’Η-NMR (CD3OD) 7,45-8,30 (m, 4H), 2,30 (s, 3H). MS (CH4-CI): [M+H-O] = 164.
Uma solução da oxima (0,51 g; 3 mmol) em etanol contendo 10% de Pd em carbono (1,5 g) e HC1 concentrado (0,25 mL; 3 mmol) foi hidrogenada à pressão de 2,1 bar (30 psi) de H2 num hidrogenador de Parr durante 5 h. O catalisador foi filtrado e 0 filtrado concentrado. O resíduo foi triturado com éter. O hidrocloreto da amina foi isolado na forma de um sólido branco (0,48 g; rendimento de 85,7%). 'H-NMR (CD3OD) 7,6-8,15 (m, 4H), 4,55 (q, 1H), 1,70 (s,3H). MS: [M+H]= 166. O hidrocloreto da amina (0,40 g; 2 mmol) foi dissolvido em 15 mL de água. Uma solução de BOC-ON (0,52 g; 2,1 mmol) em 15 mL de acetona foi adicionada seguida pela adição de trietilamina (0,8 mL; 6 mmol). A reacção foi deixada a prosseguir durante 20 h. A mistura reaccional foi concentrada e repartida entre acetato de etilo e água. A camada aquosa foi acidificada até pH 2 usando solução a 10% de HC1. O produto foi extraído em acetato de etilo, o qual depois da manipulação usual e recristalização de acetato de etilo/hexano, deu o composto mencionado em título na forma de um sólido branco (0,30 g; rendimento de 57%); p.f. 116-118 °C. 'H-NMR (CDC13) 7,35-6,2 (m, 4H), 4,6 (bs, 1,5H), 1,50 (d, 3H), 1,40 (s, 9H). MS (NH3-CI): [M+NH4] = 283. Ácido 3-[ 1 '-(í-butiloxicarbonil)aminolbenzilbenzóico (Boc-PhMAMB) 0 composto mencionado em título para o propósito desta invenção foi preparado e acordo com o Esquema 4 (acima), pelo procedimento semelhante ao do derivado de metilo.
Uma solução de ácido 3-benzoilbenzóico (2,00 g; 9 mmol), hidrocloreto de hidroxilamina (2,00 g; 29 mmol) e piridina (2,00 mL; 25 mmol) em etanol foi refluxada durante 12 h. Após a manipulação extractiva habitual, foi obtido um sólido branco (2,41 g). O produto ainda continha traços de piridina, mas foi usado no passo seguinte sem mais purificação. O produto cru (2,00 g; ~8 mmol) foi dissolvido em 200 mL de etanol. Foram adicionados 10% de Pd em carbono (2,00 g) e HC1 conc. (1,3 mL; 16 mmol). A mistura reaccional foi hidrogenada à pressão de 2,1 bar (30psi) durante 1 h. O catalisador foi filtrado e a mistura reaccional concentrada. Na trituração do resíduo com éter e secagem sob vácuo, o hidrocloreto da amina foi obtido na forma de um sólido branco (2,12 g; rendimento de 97%). 'H-NMR (CD3OD) 7,4-8,15 (m, 10H), 5,75 (s, 1H). MS (CH4-CI): [M+H-OH] = 211. O hidrocloreto da amina (1,00 g; 4 mmol) foi convertido ao seu derivado BOC por um procedimento semelhante ao do caso metilo. 0,60 g (rendimento de 48%) do composto mencionado em título recristalizado (de etanol/hexano) foram obtidos na forma de um sólido branco; p.f. 190-192 °C. ’Η-NMR (CD3OD) 7,2-8,0 (m, 10H), 5,90 (2s, 1H, 2 isómeros), 1,40 (s, 9H). MS (NH3-CI): [M+NH4-C4H8] - 289.
Intermediários 68 e 68a do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-GIy-Asp-MeMamb); 0 composto de fórmula (II) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = CH3, R2 = H
A porção ciclizante MeMAMB foi preparada via Esquema 4 (descrito mais acima). O composto mencionado em título foi preparado seguindo a via de síntese em fase de solução para ligar MeMAMB ao tripéptido. A ciclização deu o péptido cíclico protegido. A desprotecção foi conseguida por tratamento do péptido (390 mg) e anisole (0,390 mL) com HF anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em ácido acético aquoso a 10% e liofílizado para dar a mistura dois isómeros (330 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal acetato). A purificação e a separação dos isómeros foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,48%/min de 7 até 23% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA. As fracções recolhidas em Rf 24,1 min e 26,8 min foram liofilizadas para darem os sais de TFA dos isómeros 1 e 2 respectivamente. FAB-MS (isómero 1): [M+H] = 589,31; FAB-MS (isómero 2): [M+H] = 589,31.
Intermediários 76 e 76a do Composto Cíclico
CicIo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-PhMamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = Ph, R2 = H A porção ciclizante MeMAMB foi preparada via Esquema 4 (descrito mais acima). O composto mencionado em título foi preparado seguindo a via de síntese em fase de solução para ligar PhMAMB ao tripéptido. A ciclização deu o péptido cíclico protegido. A desprotecção foi conseguida por tratamento do péptido (470 mg) e anisole (0,470 mL) com HF anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em ácido acético aquoso a 10% e liofílizado para dar a mistura dois isómeros (310 mg; recuperação global de 82,4%). A purificação e a separação dos isómeros foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,55%/min de 18 até 36% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA. As fracções recolhidas em Rf22min e 24,6 min foram liofilizadas para darem os sais de TFA dos isómeros 1 e 2 respectivamente. FAB-MS (isómero 1): [M+H] = 651,33; FAB-MS (isómero 2): [M+H] = 651,33.
Intermediários 79 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-NMeMamb); o composto de fórmula (II) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = Ph, R2 = CH3 O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação do ácido Boc-NMeMamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,456 mmol para dar o péptido cíclico protegido (406 mg; maior que rendimento quantitativo). O péptido (364 mg) e 0,364 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0°C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (251 mg; 93,5%; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 34,2%, rendimento global de 29,9%); FAB-MS: [M+H] = 589,33.
Porções Ciclizantes R31 Substituídas no Anel
As porções ciclizantes que possuem um anel aromático que suporta um grupo substituinte podem ser preparadas usando os métodos ensinados nos seguintes exemplos e Esquemas. - 136 - Síntese de Derivados de Ácido 3-aminometilbenzóico.HC1, 4,5 e 6-Substituídos, e de ácido í-Butiloxicarbonil-3-aminometilbenzóico 4,5 e 6-Substituídos
Os derivados de ácido 3-aminometilbenzóico«HCl 4, 5 e 6-substi-tuídos e ácido í-butiloxicarbonil-3-aminometilbenzóico 4, 5 e 6-substituídos úteis como intermediários na síntese dos compostos da invenção são preparados usando procedimentos padrão, por exemplo, conforme descrito em Felder et al, Helv. Chim. Acta, 48 (1965) 259, de Diesbach, Helv. Chim. Acta, 23 (1949) 1232, Truitt e Creagn, J. Org. Chem., 27 (1962) 1066, ou Sekiya et al., 11 (1963) 551, e conforme se mostra esquematicamente abaixo.
Síntese do Ácido 4-Cloro-3-amínometilbenzóico*HCI O composto mencionado em título foi preparado por modificação dos procedimentos previamente reportados na literatura (Felder et al., Helv. Chim. Acta, 48 (1965) 259). A uma solução de ácido 4-clorobenzóico (15,7 g; 100 mmol) em 150 mL de ácido sulfurico concentrado foi adicionada dicloroacetamida de N-hidroximetilo (23,7 g; 150 mmol) em porções. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 2 dias, vertida em 375 g de gelo e agitada durante 1 hora e o sólido foi recolhido por filtração e lavado com - 137 - Η20. Ο sólido húmido foi dissolvido em solução a 5% de bicarbonato de sódio, filtrado e acidificado até pH 1 com HC1 concentrado. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com H20 e seco ao ar durante a noite para dar o ácido 4-cloro-3--dicloroacetilaminometilbenzóico (26,2 g; 89%) na forma de um pó branco.
Uma suspensão de ácido 4-cloro-3-dicloroacetilaminometilbenzóico (26,2 g; 88 mmol) em 45 mL de ácido acético, 150 mL de HC1 concentrado e 150 mL de H20 foi aquecida em refluxo durante 3 horas, filtrada enquanto quente e deixada arrefecer até à temperatura ambiente. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com éter, lavado com acetona-éter e seco ao ar durante a noite para dar o composto mencionado em título (7,6 g; 39%) na forma de cristais esbranquiçados, p.f. 278-9 °C; 'H-NMR (D6-DMSO) 13,40 (br s, 1H), 8,75 (br s, 3H), 8,20 (s, 1H), 7, 95 (dd, 1H), 7,70 (d, 1H), 4,20 (br s, 2H). Ácido í-Butiloxicarbonil-4-cloro-3-aminometilbenzóico*HC1
Uma suspensão de ácido 4-cloro-3-aminometilbenzóico#HCl (6,7 g; 30 mmol) e trietilamina (9,3 g; 92 mmol) em 50 mL de H20 foi adicionada a uma solução de Boc-ON (9,2 g; 38 mmol) em 50 mL de tetra-hidrofurano arrefecido até 0 °C. A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante a noite e os compostos voláteis foram removidos por concentração sob pressão reduzida. 0 resíduo foi diluído com H20, lavado com éter, acidificado até pH 3 com HC1 1 N e extraído com acetato de etilo. Os extractos foram lavados com H20, água salgada, secos sobre sulfato de magnésio anidro e evaporados até à secura sob pressão reduzida. Este material foi triturado com éter-hexano para produzir o composto mencionado em título (7,4 g; 87%) na forma de um pó branco, p.f. 159 °C (dec.); 'H-NMR (D6-DMSO) 13,20 (br s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,80 (dd, 1H), 7, 60 (br s, 1H), 7,55 (d, 1H), 4,20 (br d, 2H), 1,40 (s, 9H).
Síntese do Ácido 3-aminometil-6-iodobenzóico*HCL O composto mencionado em título foi preparado por modificação dos procedimentos previamente reportados na literatura (Felder et al., Helv. Chim. Acta, 48 (1965) 259). A uma solução de ácido 6-iodobenzóico (24,8 g; lOOmmol) em 150mL de ácido sulfúrico concentrado foi adicionada dicloroacetamida de N-hidroximetilo (23,7 g; 150 mmol) em porções. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 7 dias, vertida em 375 g de gelo e agitada durante 1 hora. O sólido foi em seguida recolhido por filtração e lavado com H20. O sólido húmido foi dissolvido em solução a 5% de bicarbonato de sódio, filtrado e acidificado até pH 1 com HC1 concentrado. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com H20 e seco ao ar durante a noite para dar o ácido 3-dicloroacetil-aminometil-6-iodobenzóico (32,0 g; 82%) na forma de um pó branco.
Uma suspensão de ácido 3-dicloroacetilaminometil-6-iodobenzóico (32,0 g; 82 mmol) em 51 mL de ácido acético, 170 mL de HC1 concentrado e 125 mL de H20 foi aquecida em refluxo durante 3 horas, filtrada enquanto quente e deixada arrefecer até à temperatura ambiente. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com éter, lavado com acetona-éter e seco ao ar durante a noite para dar o composto mencionado em título (13,2 g; 51%) na forma de um pó bege; ‘H-NMR (D6-DMSO) 13,50 (br s, 1H), 8,50 (br s, 3H), 8,05 (d, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,40 (d, 1H), 4,05 (br s, 2H). Ácido í-Butiloxicarbonil-3-aminometil-6-iodobenzóico
Uma suspensão de ácido 3-aminometil-6-iodobenzóico*HCl (8,0 g; 26 mmol) e trietilamina (8,7 g; 86 mmol) em 32 mL de H20 foi adicionada a uma solução de Boc-ON (8,0 g; 32 mmol) em 23 mL de tetra-hidrofurano arrefecido até 0 °C. A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante a noite e os compostos voláteis foram removidos por concentração sob pressão reduzida. - 139 - 0 resíduo foi diluído com H20, lavado com éter, acidificado até pH 3 com HC1 1 N e extraído com acetato de etilo. Os extractos foram lavados com H20, água salgada, secos sobre sulfato de magnésio anidro e evaporados até à secura sob pressão reduzida. Este material foi triturado com éter-hexano para produzir o composto mencionado em título (5,7 g; 59%) na forma de um pó branco, p.f. 182 °C (dec.); 'H-NMR (D6-DMSO) 13,35 (br s, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,50 (br t, 1H), 7,10 (d, 1H), 4,10 (d, 2H), 1,40 (s, 9H). Λ 1
Outros exemplos de porções ciclizantes R substituídas no anel preparadas usando o procedimento geral descrito acima para o ácido í-butiloxi-carbonil-3-aminometil-6-iodobenzóico são dados no quadro abaixo.
eL!£ 159 168 155 171
ISO 182
16S 79
Os derivados 4-bromo e 6-bromo úteis como intermediários na síntese dos compostos da invenção podem ser preparados conforme descrito acima para o ácido t-butiloxicarbonil-S-aminometil-ó-iodobenzóico^HCl. Os derivados 4-hidroxi e 6-hidroxi úteis como intermediários na síntese dos compostos da invenção podem ser preparados conforme descrito em Sekiya et ai, Chem. Pharm. Buli, 11 (1963) 551. Os derivados 5-nitro e 5-amino úteis como intermediários na síntese dos compostos da invenção podem ser preparados conforme descrito em Felder et ai, Helv. Chim. Acta, 48 (1965) 259. Os derivados 5-amino podem ser convertidos para os derivados 5-iodo, 5-bromo, 5-cloro ou 5-fluoro via sal diazónio conforme descrito em Org. Coll. Vol., 2 (1943) 130, 2 (1943) 299, 2 (1943) 351 e 3 (1955) 185. -140 -140
X y Z H H Br Br H H H H HO HO H H H no2 H H nh2 H H 1 H H Br H H α H H F H
Síntese de Intermediários do Composto Cíclico Usando Porções ClCLIZANTES R31 SUBSTITUÍDAS NO ANEL
Os intermediários do composto cíclico nos quais a porção ciclizante contém um anel aromático que suporta um grupo substituinte podem ser preparados conforme se ensina nos exemplos seguintes.
Intermediário 93 do Composto Cíclico Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-4-clorobenzóico) O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento em fase de solução acima descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O péptido cíclico (240 mg; 0,28 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna LiChrospher RP-18 preparativa (5 cm) usando um gradiente a 1,4%/min de 22 até 90% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TF A do composto mencionado em título (80 mg; 39%) na forma de um sólido branco felpudo; ’Η-NMR (D6-DMSO) 9,00 (d, 1H), 8,50 (d, 1H), 8,45 (t, 1H), 7,60 (d, 2H), 7,45 (s, 1H), 7,45 (d, 2H), 7,00 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,45 (m, 2H), 4,20 (m, 2H), 4,10 (d, 1H), 3,55 (d, 1H), 3,10 (m, 2H), 2,90 (s, 3H), 2,65 (dd, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,05 (m, 2H), 1,50 (m, 1H), 1,30 (m, 2H), 1,05 (d, 3H), 0,85 (d, 3H); FAB-MS: [M+H] = 609. - 141 - «esi
Intermediário 94 do Composto Cíclico
CicIo-(D-Val-NMeArg-GIy-Asp-iodo-Mamb); o composto de fórmula (VII) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R1 = R2 = H,
Rl° = jj R10a = j O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-iodo-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 1,05 mmol para dar o péptido cíclico protegido (460 mg; 46,8%). O péptido (438 mg) e 0,5 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em ácido acético aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (340 mg; 95,6%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® C18 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 12,6 até 22,5% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 39,7%, rendimento global de 16,6%); 'H-NMR (D6-DMSO) δ 9,05 (d„ 1H), 8,55 (d, 1H), 8,55 (t, IR), 7,90 (d, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,55 (t, 1H), 7,20 (d, 1H), 7,15 (s, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,50 (g, 1H), 4,30 (m, 3H), 3,95 (dd, 1H), 3,60 (d, 1H), 3,10 (m, 2H), 3,00 (s, 3H), 2,75 (dd, 1H), 2,55 (dd, 1H), 2,10 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 1,10 (d, 3H), 0,90 (d, 3H); FAB-MS: [M+H] = 701,37.
Intermediário 95 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometiI-4-metoxibenzóico ) O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento
I geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--Mamb). O péptido cíclico (600 mg; 0,71 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,33%/min de 7 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título (104 mg; 32%) na forma de um sólido branco felpudo; 'H-NMR (D6-DMSO) 12,40 (br s, 1H), 8,25 (d, 1H), 8,20 (br s, 1H), 8,00 (br s, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,65 (br s, 1H), 7,05 (d, 1H), 7,05 (br s, 4H), 5,00 (dd, 1H), 4,60 (q, 1H), 4,30 (d, 1H), 4,25 (d, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,85 (dd, 1H), 3,70 (dd, 1H), 3,10 (q, 2H), 3,00 (s, 3H), 2,70 (m, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 1,65 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 1,00 (d, 3H), 0,90 (d, 3H); FAB-MS: [M+H20+H] = 623.
Intermediário 96 do Composto Cíclico Ciclo-(D-V al-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-4-metilbenzóico) O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--Mamb). O péptido cíclico (210 mg; 0,25 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna LiChrospher RP-18 preparativa (5 cm) usando um gradiente a 2,3%/min de 22 até 90% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título (75 mg; 42%) na forma de um sólido branco felpudo; 1 H-NMR (D6-DMSO) 12,30 (br s, 1H), 8,85 (d, 1H), 8,55 (d, 1H), 8,30 (t, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,40 (s, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,20 (dd, 1H), 4,55 (q, 1H), 4,45 (dd, 1H), 4,30 (m, 2H), 4,05 (dd, 1H), 3,60 (d, 1H), 3,10 (q, 2H), 3,00 (s, 3H), 2,70 (dd, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,25 (s, 3H), 2,10 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 1,10 (d, 3H), 0,90 (d, 3H); FAB-MS: [M+H] = 589. - 143 - - 143 -
Intermediário 97 do Composto Cíclico Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-6-clorobenzóico) O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--Mamb), com a excepção de ter sido empregue a oxima de 4,4'-dinitrobenzo-fenona. O péptido cíclico (550 mg; 0,65 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl 8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,8%/min de 10 até 38% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título (254 mg; 54%) na forma de um sólido branco felpudo; *H-NMR (D6-DMSO) 12,30 (br s, 1H), 9,05 (d, 1H), 8,45 (m, 2H), 7,50 (t, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,30 (m, 2H), 7,10 (s, 1H), 7,05 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,45 (dd, 1H), 4,40 (q, 2H), 4,05 (dt, 2H), 3,55 (dd, 1H), 3,15 (q, 2H), 3,10 (s, 3H), 2,70 (dd, lH),-2,50 (m, 1H), 2,05 (m, 2H), 1,65 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 1,10 (d, 3H), 0,90 (d, 3H); FAB-MS: [M+H] = 609.
Intermediário 99 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-6-metoxibenzóico ) O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--Mamb), com a excepção de ter sido empregue a oxima de 4,4'-dinitrobenzo-fenona. O péptido cíclico (256 mg; 0,30 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl 8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,8%/min de 10 até 38% de acetonitrilo contendo - 144-
0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TF A do composto mencionado em título (137 mg; 63%) na forma de um sólido branco felpudo; ’Η-NMR (D6-DMSO) 8,45 (d, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,30 (t, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,50 (t, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,20 (dd, 1H), 4,55 (dd, 1H), 4,50 (q, 1H), 4,35 (dd, 1H), 4,25 (dd, 1H), 3,95 (dd, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,55 (d, 1H), 3,10 (q, 2H), 3,00 (s, 3H), 2,70 (dd, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,05 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 1,10 (d, 3H), 0,95 (d, 3H); FAB-MS: [M+H] - 605.
Intermediário 100 do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-6-metilbenzóico)
O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--Mamb), com a excepção de ter sido empregue a oxima de 4,4'-dinitrobenzo-fenona. O péptido cíclico (230 mg; 0,28 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl 8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,8%/minuto de 10 até 38% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título (54 mg; 27%) na forma de um sólido branco felpudo; !H- NMR (D6-DMSO) 12,30 (br s, 1H), 8,80 (d, 1H), 8,40 (d,-lH), 8,30 (t, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,15 (q, 2H), 7,00 (s, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,45 (m, 37H), 4,05 (m, 2H), 3,55 (dd, 1H), 3,10 (q, 2H), 3,05 (s, 3H), 2,70 (dd, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,05 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 1,05 (d, 3H), 0,90 (d, 3,H); FAB-MS: [M+H] - 589.
Intermediário 100a do Composto Cíclico Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-6-clorobenzóico) O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento - 145 - geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--Mamb), com a excepção de ter sido empregue a oxima de 4,4'-dinitrobenzo-fenona. O péptido cíclico (330 mg; 0,40 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 1,0%/minuto de 10 até 38% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título (114 mg; 41%) na forma de um sólido branco felpudo; !H-NMR (D6-DMSO) 9,00 (d, 1H), 8,40 (m, 2H), 7,50 (m, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,30 (m, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,65 (q, 1H), 4,50 (dd, 1H), 4,40 (q, 1H), 4,05 (dd, 1H), 3,95 (dd, 1H), 3,65 (dd, 1H), 3,10 (q, 2H), 3,05 (s, 3H), 2,75 (dd, 1H), 2,50,(m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,75 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 0,95 (t, 3H); FAB-MS: [M+H] = 595,4.
Intermediário 89d do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-iodo-Mamb); o composto de fórmula (VII) em que J = D-Abu, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp,
R1 = R2 = H, R10 = H, R10a = I O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-iodo-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 3,53 mmol para dar o péptido cíclico protegido (4,07 g; maior que rendimento quantitativo). O péptido (4,07 g) e 4,0 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em ácido acético aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em titulo (2,97 g; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um - 146 -
gradiente a 0,16%/min de 16,2 até 22,5% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 28,7%, rendimento global de 30,2%); FAB-MS: [M+H] = 687,33.
Intermediário 100b do Composto Cíclico Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-6-iodobenzóico)
O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp--Mamb), com a excepção de ter sido empregue a oxima de 4,4'-dinitrobenzo-fenona. O péptido cíclico (350 mg; 0,38 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 1,0%/minuto de 10 até 38% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título (150 mg; 49%) na forma de um sólido branco felpudo; 'H-
NMR (D6-DMSO) 8,90 (d, 1H), 8,40 (m, 2H), 7,70 (d, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,30 (m, 1H), 7,05 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,65 (q, 1H), 4,45 (dd, 1H), 4,40 (q, 1H), 4,00 (q, 1H), 3,90 (q, 1H), 3,65 (dd, 1H), 3,10 (q, 2H), 3,05 (s, 3H), 2,70 (dd, 1H), 2,50 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,75 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 1,40 (m, 2H), 0,95 (t, 3H); FAB-MS: [M+H] = 687,3.
Intermediário 100c do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-6-metilbenzóico); o composto de fórmula (VII) em que J = D-Abu, K = NMeArg, L = Gly, M = Asp, R10 = Me O composto mencionado em título foi preparado pelo procedimento geral em fase de solução descrito acima para o ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp- - 147 -
-Mamb), com a excepção de ter sido empregue a oxima de 4,4'-dinitrobenzo-feriona. O péptido cíclico (130 mg; 0,16 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 1,0%/minuto de 10 até 38% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TF A do composto mencionado em título (31 mg; 28%) na forma de um sólido branco felpudo; ‘H-
NMR (D6-DMSO) 8,70 (d, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,30 (t, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,45 (m, 1H), 7,15 (q, 2H), 7,05 (s, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,65 (q, 1H), 4,45 (m, 2H), 4,00 (m, 2H), 3,65 (dd, 1H), 3,10 (q, 2H), 3,05 (s, 3H), 2,75 (dd, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,00 (m, 1H), 1,75 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 0,95 (t, 3H); FAB-MS: [M+H] = 575,4.
Esquema 5: procedimento para a síntese do intermediário do composto cíclico
2. Boc-D*Val— NM«Aro(Toc).GIy, TBTU. SPfjNEl, DMF 1. TPA. CHjCI*
N-MeAro^ ^Asp
2. AcOH, IPr2NEt. DMF, 60* C
CF3CQ2H· G|y Ull. « ^ I \ D-Ve) NH
- 148- Síntese em Fase Sólida do Intermediário 101 do Composto Cíclico Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-4-iodobenzóico); O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-iodo-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 1,05 mmol para dar o péptido φ cíclico protegido (460 mg; 46,8%). O péptido (438 mg) e 0,5 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em ácido acético aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (340 mg; 95,6%; calculado como sal acetato). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 12,6 até 22,5% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 39,7%, rendimento global de 16,6%); 'H-NMR (D6-DMSO) δ 9,05 (d, 1H), 8,55 ® (d, 1H), 8,55 (t, 1H), 7,90 (d, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,55 (t, 1H), 7,20 (d, 1H), 7,15 (s, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,50 (q, 1H), 4,30 (m, 3H), 3,95 (dd, 1H), 3,60 (d, 1H), 3,10 (m, 2H), 3,00 (s, 3H), 2,75 (dd, 1H), 2,55 (dd, 1H), 2,10 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 1,10 (d, 3H), 0,90 (d, 3H); FAB-MS: [M+H] = 701,37. Síntese em Fase de Solução do Intermediário 102 do Composto Cíclico Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-6-iodobenzóico); O composto mencionado em título foi preparado de acordo com o método do Esquema 6, mostrado abaixo. -149 - Esquema
ClttHjN
Boe-A*p(Ocl-Wx}-OSu NaHCO), TMF/HjO
Boc-A*p(OeH»x>-KH
HO*. OCC EtOAe NMaArgfTos) · BocOVal I Gly
1. TFA.CHJCI, 2. AeOH. IPfjNEt, OMF, 60“ C 1.TTA,CH|Cli 'r 2. BocOVat— NM*ArSfTot)-Cly, ΤΒΐυ,ίΡτιΝει, dmf
u
1. Ácido Boc-Asp(OHex)-3-aminometiI-6-iodobenzóico A uma suspensão ácido 3-aminometil-6-iodobenzóicoeHCl (4,9 g; 16 mmol) em H2O (16 mL) foi adicionado NaHC03 (3,9 g; 47 mmol), seguido por uma solução de Boc-Asp(OcHex)-OSu (5,9 g; 14 mmol) em THF (16 mL). A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante a noite, filtrada, diluída com H20, acidificada com HC1 1 N e extraída com acetato de etilo. Os extractos foram lavados com H20, água salgada, secos sobre sulfato de magnésio anidro e evaporados até à secura sob pressão reduzida. Este material foi triturado com éter para produzir o composto mencionado em título (6,7 g; 82%) na forma de um pó branco. ‘H-NMR (D6-DMSO) 8,45 (br t, 1H) 7,90 (d, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,15 (m, 2H), 4,65 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,25 (d, 2H), 2,70 (m, 1H), 2,55 (m, 1H), 1,70 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 1,35 (m, 6H). 2. Oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona O composto mencionado em título foi preparado por modificação dos procedimentos previamente reportados na literatura (Chapman e Fidler, J. Chem. Soc. (1936) 448; Kulin e Leffek, Can. J. Chem. 51 (1973) 687). Uma solução de anidrido crómico (20 g; 200 mmol) em 125 mL de H20 foi adicionada gota a gota ao longo de 4 horas a uma suspensão de bis(4-nitrofenil)metano (25 g; 97 mmol) em 300 mL de ácido acético aquecido em refluxo. A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 1 hora, arrefecida até à temperatura ambiente e vertida em água. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com H20, bicarbonato de sódio a 5%, H20 e foi seco ao ar para proporcionar uma mistura 1:1 de bis(4-nitrofenil)metano/4,4'-dinitrobenzofenona via 1 H-NMR. Este material foi oxidado com uma segunda porção de anidrido crómico (20 g; 200 mmol), seguido por um procedimento de manipulação idêntico para proporcionar o produto cru. A trituração com 200 mL de benzeno aquecido em refluxo durante 16 horas produziu 4,4'-dinitrobenzofenona (20,8 g; 79%) na forma de um pó amarelo.
Uma solução de hidrocloreto de hidroxilamina (10,2 g; 147 mmol) foi adicionada a uma suspensão de 4,4'-dinitrobenzofenona (19 g; 70 mmol) em 100 mL de etanol. A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 2 horas, arrefecida até à temperatura ambiente e o sólido foi recolhido por filtração. A recristalização a partir de etanol produziu o composto mencionado em título (14,0 g; 70%) na forma de cristais amarelos pálidos, p.f. 194 °C; 'H-NMR (D6-DMSO) 12,25 (s, 1H), 8,35 (d, 2H), 8,20 (d, 2H), 7,60 (d, 4H). 3. Boc-Asp(OcHex)-3-aminometil-6-iodobenzoato de oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona A uma solução arrefecida em gelo de ácido Boc-Asp(OcHex)-3- - 151 - -aminometil-6-iodobenzóico (3,3 g; 5,7 mmol) e oxima da 4,4-dinitrobenzofeno-na (1,7 g; 5,9 mmol) em 32 mL de acetato de etilo foi adicionada DCC (1,2 g; 5,8 mmol). A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 3 horas, filtrada, diluída com acetato de etilo, lavada com solução saturada de bicarbonato de sódio, H20, água salgada, seca sobre sulfato de magnésio anidro e evaporada até à secura sob pressão reduzida. Este material foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (EM Science, malha 234-400 mesh) usando diclorometano/acetato de etilo 10:1 para dar o composto mencionado em título (1,8 g; 36%) na forma de cristais amarelos pálidos. 'H-NMR (D6-DMSO) δ 8,40 (dd, 5H), 7,90 (m, 5H) 7,45 (s, 1H), 7,20 (m, 2H), 4,65 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,20 (m, 2H), 2,75 (dd, 1H), 2,50 (dd, 1H), 1,70 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 1,35 (m, 6H). 4. Boc-D-VaI-NMeArg(Tos)-Gly A uma mistura de Boc-NMeArg(Tos) (11,07 g; 25 mmol) e tosilato de Gly-OBzl (10,10 g; 30 mmol) em 25 mL de diclorometano foi adicionado HBTU (9,48 g; 25 mmol) e DIEA (9,69 g; 75 mmol). A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 1 hora, concentrada sob alto vácuo, diluída com acetato de etilo, lavada com ácido cítrico a 5%, H20, solução saturada de bicarbonato de sódio, água salgada, seca sobre sulfato de magnésio e evaporada até à secura sob pressão reduzida. O óleo resultante foi triturado com éter de petróleo para produzir Boc-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (14,7 g; 100%); FAB-MS: [M+H] = 590,43. Este material foi usado sem mais purificação.
Uma solução de Boc-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (14,5 g; 24,6 mmol) em 30 mL de ácido trifluoroacético foi agitada à temperatura ambiente durante 5 minutos e evaporada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi diluído com acetato de etilo frio, lavado com solução saturada de bicarbonato de - 152 - sódio, a fase aquosa foi extraída com acetato de etilo. Os orgânicos combinados foram lavados com água salgada, evaporados até à secura sob pressão reduzida e o óleo resultante foi triturado com éter. O sólido resultante foi filtrado, lavado com éter e seco num dessecador de vácuo para produzir NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (10,3 g; 86%); FAB-MS: [M+H] = 490,21. Este material foi usado sem mais purificação. A uma solução de NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (4,80 g; 9,8 mmol) e Boc-D-Val (2,13 g; 9,8 mmol) em 10 mL de diclorometano, arrefecida num banho de gelo, foi adicionado HBTU (3,79 g; 10,0 mmol) e DIEA (2,58 g; 20,0 mmol). A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 48 horas, diluída com acetato de etilo, lavada com ácido cítrico a 5%, água salgada, seca sobre sulfato de magnésio anidro e evaporada até à secura sob pressão reduzida. O óleo resultante foi triturado com éter para produzir Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (4,58 g; 68%); FAB-MS: [M+H] = 689,59. Este material foi usado sem mais purificação.
Uma solução de Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl (4,50 g; 6,53 mmol) em 80 mL de metanol foi purgada com gás azoto, foram adicionados 1.30 g de 10% de Pd/C e foi passado através da reacção gás hidrogénio. Após 1 hora, o catalisador foi removido por filtração através de um leito de Celite e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O sólido resultante foi triturado com éter, filtrado e lavado com éter de petróleo para produzir Boc-D-Val-NMeArg-(Tos)-Gly (3,05 g; 78%); 'H-NMR (D6-DMSO) δ 7,90 (br t, 1H), 7,65 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7,00 (d, 1H), 6,85 (br d, 1H) 6,60 (br s, 1H) 5,00 (dd, JH) 4,15 (t, 1H), 3,70 (m, 2H), 3,05 (m, 2H), 2,90 (s, 3H), 2,35 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,55 (m, 1H), 1,35 (s, 9H), 1,25 (m, 2H), 0,80 (br t, 6H). - 153 - 5. Boc-D-Val-NMeArg(T os)-Gly-Asp(OcHex)-3-aminometil-6-io-dobenzoato de oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona A uma solução de Boc-Asp(OcHex)-3-aminometil-6-iodobenzoato de oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona (0,5 g; 0,59 mmol) em 1 mL de diclorometano foram adicionados 0,5 mL de ácido trifluoroacético. A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 90 minutos, diluída com diclorometano e evaporada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi concentrado sob alto vácuo para remover traços de ácido trifluoroacético em excesso. A uma solução do sal de TFA cru e Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly (0,52 g; 0,87 mmol) em 3,8 mL de DMF foi adicionado TBTU (0,28 g; 0,87 mmol) e DIEA (0,33 g; 2,58 mmol). A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob alto vácuo, diluída com acetato de etilo, lavada com ácido cítrico a 5%, H20, água salgada, seca sobre sulfato de magnésio anidro e evaporada até à secura sob pressão reduzida, este material foi triturado com éter para produzir o composto mencionado em título (0,48 g; 61%) na forma de um pó. Este material foi usado sem mais purificação. 6. Ciclo-(D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-ácido 3-aminome-til-6-iodobenzóico) A uma solução de Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)--3-aminometil-6-iodobenzoato de oxima da 4,4'-dinitrobenzofenona (0,48 g; 0,36 mmol) em 1 mL de diclorometano foram adicionados 0,5 mL de ácido trifluoroacético. A mistura reaccional foi agitado à temperatura ambiente durante 45 minutos, diluída com diclorometano e evaporado até à secura sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi concentrado sob alto vácuo para remover traços de excesso de ácido trifluoroacético. A uma solução do sal de TFA cru em 38 mL de DMF foi adicionado ácido acético (0,09 mL; 1,57 mmol) e DIEA (0,26 mL; 1,49 mmol). A mistura reaccional foi agitada a 60 °C durante 3 dias, concentrada sob alto vácuo, diluída com acetato de etilo, lavada com ácido cítrico a 5%, água salgada, seca sobre sulfato de magnésio anidro e evaporada até à secura sob pressão reduzida. Este material foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (EM Science, malha 230-400 mesh) usando clorofórmio/isopropanol 10:1 para dar o composto mencionado em título (0,13 g; 38%) na forma de um pó; 'H-NMR (D6-DMSO) Ô 8,95 (d, 1H), 8,50 (t, 1H), 8,45 (d, 1H), 7,70 (d, 1H), 7,60 (d, 2H), 7,30 (d, 3H), 7,05 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 6,80 (br s, 1H), 6,60 (br s, 1H), 5,10 (dd, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,55 (dd, 1H), 3,05 (m, 2H), 3,00 (s, 3H), 2,70 (dd, 1H), 2,55 (dd, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,05 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 1,75 (m, 1H), 1,65 (m, 1H), 1,35 (m, 13H), 1,15 (d, 3H), 0,85 (d, 3H); FAB (GLYC)-MS: [M+H] = 937. 7. Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido 3-aminometil-6-iodoben- zóico) A O péptido cíclico (490 mg; 0,52 mmol) foi desprotegido com HF em excesso na presença de anisole como eliminador. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,8%/minuto de 10 até 38% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para dar o sal de TFA do composto mencionado em título (194 mg; 46%) na forma de um sólido branco felpudo; 'H-NMR (D6-DMSO) δ 12,30 (br s, 1H), 9,00 (d, 1H), 8,40 (m, 2H), 7,70 (d, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,30 (m, 1H), 7,05 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,00 (br s, 4H), 5,15 (dd, 1H), 4,40 (d, 1H),4,40 (q, 2H), 4,0 (m, 2H), 3,55 (dd, 1H), 3,15 (q, 2H), 3,10 (s, 3H), 2,70 (dd, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,05 (m, 2H), 1,65 (m, 1H), 1,35 (m, 2H), 1,15 (d, 3H), 0,90 (d, 3H); FAB-MS: [M+H] = 701. O Quadro A mostra o FAB-MS obtido para alguns intermediários do composto cíclico.
Quadro A Glv N-MeArg /
Asp NH
O
Intermediário de composto cíclico número R X Z FAB-MS (M+Hl 101 D-Vai I H 701.37 98,102 D-Val H I 401 103 D-Abu I H 687.33 104 D-Abu H I 687.3 105 D-Val Cl H 609 106 D-Vai H Cl 609 107 D-Abu H Cl 595.4 108 D-Val Me H 589 109 D-Val H Me 589 110 D-Abu H Me 575.4 111 D-Val MeO H 623 (+H20) 112 D-Val H MeO 605
X
Outras porções ciclizantes substituídas no anel podem ser sintetizadas conforme se ensina nos seguintes esquemas e discussão. A porção da fórmula acima onde Z = NH2 pode ser sintetizada por pelo menos duas vias diferentes. Por exemplo, partindo com ácido 4-acetamidobenzóico (Aldrich Chemical, Co.), uma alquilação de Friedel-Crafts com N-hidroximetildicloroace-tamida daria o derivado dicloroacetilo de ácido 3-aminometil-4-acetamidobenzói-co (Felder, Pitre e Fumagalli, Helv. Chim. Acta, 48 (1964) 259-274). A hidrólise das duas amidas dará o ácido 3-aminometil-4-aminobenzóico.
- 156 - AcNH Ο C02H C]jCHCONHCH2OH. h2so4
Cl
HjO, H*
co2h
Dicarbonato de Di-t-butilo EijN, MeOH
Altemativamente, partindo com 3-ciano-4-nitrotolueno, a oxidação com trióxido de crómio seguido por redução dará ácido 3-aminometil-4--aminobenzóico.
A porção da fórmula anterior onde Y = CH2NH2 pode ser sintetizada a partir de 3,5-dicianotolueno por oxidação do grupo metilo com trióxido de crómio seguido por redução.
a] CrC>3 b] K2_ catalisador - 157 - A porção da fórmula acima onde Z = CH2NH2 pode ser sintetizada a partir do ácido 3-ciano-4-metilbenzóico (K & K Rare e Fine Chemicals). A bromação usando N-bromossuccinimida dará ácido 4-bromometil-3-cianobenzói-co. Uma reacção de substituição nucleofílica na posição do bromometilo usando um anião amida produziria a amina protegida. Os aniões de amida que podem ser usados nesta reacção incluem ftalimida de potássio (síntese de Gabriel) e o anião de trifluoroacetamida (Usui, Nippon Kagaku Kaishi, (1991) 206-212) usado neste exemplo. A redução do nitrilo produzirá o segundo grupo aminometilo, o qual será protegido por reacção com dicarbonato de di-í-butilo. A remoção do grupo de protecção trifluoroacetamida usando piperidina aquosa dará a porção.
NC
NC^yC02H
MBS
CO,H CFjCONH· Na*
Br per NHTfa
C02H h2. Pd/c „ M-^rv.C02H Dicarbonato de H2N jr T Di.t-butilo_ NHTfa co2h
Boc-HN^^yc°2^ IM Piperidina Boc-HN'^J' NHTfa NH, ir do ácido
Altemativamente, a porção pode ser preparada a Paft 4-bromobenzóico conforme mostrado no esquema.
HO
Br
OH o,r>^v~ NHcocHq b -
OH
NH-boc Br
OH NH-boc
OH^OC SH2 - 158 -
Estas porções ciclizantes substituídas no anel podem ser usadas para sintetizar intermediários do composto cíclico.
Intermediário 113 do Composto Cíclico Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb (4-NH2))
Este composto pode ser preparado usando o procedimento acima descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) substituindo a porção ciclizante substituída no anel onde Z = NH2.
Intermediários 114,115 e 116 do Composto Cíclico
- 159 -
X] = 2-propilo, etilo ou p-hidroxifenilmetilo; X2 = H
Os compostos ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb (5-CH2NHX2)), ciclo(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb (5-CH2NHX2)) e ciclo(D-Tyr-NMeArg--Gly-Asp-Mamb (5-CH2NHX2)) podem ser preparados pelos métodos descritos acima usando a porção ciclizante substituída no anel onde Y = CH2NH2.
Intermediários 117,118 e 119 do Composto Cíclico
NH
rr°
0^NS H HNv^vx^OH
Xi = 2-propilo, etilo ou />-hidroxifenilmetilo; X2 = H
Os compostos ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb (4-CH2NHX2)), ciclo(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb (4-CH2NHX2)) e ciclo(D-Tyr-NMeArg--Gly-Asp-Mamb (4-CH2NHX2)) podem ser preparados pelos procedimentos descritos acima usando a porção ciclizante substituída no anel onde Z = CH2NH2.
Outras Porções Ciclizantes R31
Alternativas a Mamb úteis como porções ciclizantes R31 nos péptidos cíclicos da invenção incluem resíduos ácido aminoalquil-naftóico e - 160 - aminoalquil-tetra-hidronaftóico. Intermediários de ácido aminoalquil-naftóico e aminoalquil-tetra-hidronaftóico representativos úteis na síntese de péptidos cíclicos da presente invenção são descritos abaixo. A síntese destes intermediários é delineada abaixo no Esquema 7. - 160 -
CO.H E|0H
Esquema 7 rfcso* Δ 97%
NoOH. ElOH
CHjC
COjEl NaOCI. NaOH GO Et AiClj Acetilo Cl EDC 83V.
co2h AlClj.NaCI
HjO* 99%
CO,H
HCC 9S% O II HOC
â 95%
Hidrocloreto do Ácido 8-Amino-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftóico (8) O composto mencionado em título foi preparado de acordo com - 161 - uma modificação de procedimentos padrão previamente reportados na literatura (I. Eamest, J. Kaldova, G. Rihs e M. Mutter, Tett. Lett., 31, n° 28, (1990) 4011-4014).
Conforme mostrado acima no Esquema 7, o ácido 4-fenilbutírico (1) foi convertido para o éster de etilo (2) que foi acilado via cloreto de alumínio e cloreto de acetilo para dar éster de etilo do ácido 4-acetilfenilbutírico (3). Este éster foi sujeito a saponificação para dar o ácido 4-acetilfenilbutírico (4). Subsequentemente, o grupo acetilo foi oxidado para dar o ácido 4-carboxifenilbu-tírico (5), o qual foi convertido ao ácido l-tetralina-7-carboxílico (6) usando cloreto de alumínio numa ciclização de Friedel-Crafts com um rendimento razoavelmente alto. Neste ponto, a tetralona foi dividida em duas porções e alguma foi convertida para a oxima (7) usando acetato de sódio e hidrocloreto de hidroxilamina. A oxima foi sujeita a hidrogenólise para dar a mistura racémica de ácido 8-amino-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftóico na forma de hidrocloreto (8) para uso como intermediário para incorporação no péptido cíclico.
Parte A - Uma solução de ácido 4-fenilbutírico (50,0 g; 0,3 mol) em etanol (140 mL) com ácido sulfúrico concentrado (0,53 mL) foi agitada em refluxo ao longo de 5 horas. A solução arrefecida foi vertida em gelo-água e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas em contracorrente com água salgada, secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas até à secura sob pressão reduzida para darem o éster de etilo do ácido 4-fenilbutírico (56,07 g; 0,29 mol; 97%) na forma de um líquido amarelo. 'H-NMR (CDC13) Ô 7,3-7,1 (m, 5H), 4,1 (q, 2H, J=7,l Hz), 2,7 (t, 2H, J=7,7 Hz), 2,3 (t, 2H, J=7,5 Hz), 1,95 (quinteto, 2H, J=7,5 Hz), 1,25 (t, 3H, J=7,l HZ).
Parte B - A uma solução de cloreto de alumínio (153 g; 1,15 mol) e cloreto de acetilo (38,5 mL; 42,5 g; 0,54 mol) em diclorometano (1500 mL) foi adicionada, gota a gota, uma solução de éster de etilo do ácido 4-fenilbutírico (50,0 g; 0,26 mol) em diclorometano (500 mL). Foi tudo agitado à temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução foi vertida em ácido clorídrico concentrado frio (2000 mL) e em seguida extraída com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas em contracorrente com água salgada, secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas até à secura sob pressão reduzida para darem o éster de etilo do ácido 4-acetilfenilbutírico (53,23 g; 0,23 mol; 88%) na forma de um líquido amarelo escuro. ’Η-ΝΜΚ (CDC13) δ 7,9 (d, 2H, J=8,l Hz), 7,25 (d, 2H, J=8,4 Hz), 4,1 (q, 2H, J=7,l Hz), 2,75 (t, 2H, J=7,6 Hz), 2,6 (s, 3H), 2,35 ( t, 2H, J=7,6 Hz), 2,0 (quinteto, 2H, J=7,5 Hz), 1,25 (t, 3H, J=7,l Hz).
Parte C - A uma solução de éster de etilo do ácido 4-acetilfenilbutírico (50,0 g; 0,21 mol) em etanol (1250 mL) foi adicionada, gota a gota, uma solução de hidróxido de sódio (50,0 g) em água (1250 mL). Foi tudo agitado em refluxo durante 4 horas. A solução foi concentrada até meio volume e em seguida acidificada até um pH igual a 1,0 usando ácido clorídrico (1 N). O precipitado resultante foi recolhido e lavado com água para dar ácido 4-acetilfenilbutírico (53,76 g; 0,26 mol; 99%) na forma de um sólido branco, p.f. = 50-52 °C; !H-NMR (CDC13) δ 7,9 (d, 2H, J=8,l Hz), 7,25 (d, 2H, J=9,l Hz), 2,75 (t, 2H, J=7,7 Hz) 2,6 (s, 3H) 2,4 (t, 2H, J=7,3 Hz), 2,0 (quinteto 2H, J=7,4 Hz).
Parte D- A uma solução de hipoclorito de sódio (330 mL; 17,32 g; 0,234 mol) numa solução de hidróxido de sódio (50%; 172 mL), aquecida até 55 °C, foi adicionado, em porções na forma de um sólido, ácido 4-acetilfenilbutírico (16,0 g; 0,078 mol) enquanto se manteve a temperatura no intervalo 60-70 °C. Foi tudo agitado a 55 °C ao longo de 20 horas. A solução arrefecida foi adicionada gota a gota de uma solução de bissulfito de sódio (25%; 330 mL). A mistura foi em seguida transferida para um copo de boca larga e acidificada pela adição cuidadosa de ácido clorídrico concentrado. O sólido resultante foi - 163- recolhido, lavado com água e seco, em seguida foi triturado sequencialmente com clorobutano e hexano para dar o ácido 4-carboxifenilbutírico (15,31 g; 0,074 mol; 95%) na forma de um sólido branco, p.f. = 190-195 °C; 'H-NMR (DMSO) δ 12,55 (bs, 1H) 8,1 (s, 1H) 7,85 (d, 2H, >8,1 Hz), 7,35 (d, 2H, J=89,l Hz), 2,7 (t, 2H, J=7,57 Hz) 2,2 (t, 2H, >7,43 Hz), 1,8 (quinteto, 2H, >7,5 Hz).
Parte E - Uma mistura de ácido 4-carboxifenilbutírico (10,40 g; 0,05 mol), cloreto de alumínio (33,34 g; 0,25 mol) e cloreto de sódio (2,90 g; 0,05 mol) foi aquecida com agitação contínua a 190 °C ao longo de 30. minutos. Quando a mistura arrefeceu até 60 °C, foi adicionado cuidadosamente ácido clorídrico frio (1 N; 250 mL). A mistura foi extraída com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com ácido clorídrico diluído e água, secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas até à secura sob pressão reduzida. O sólido resultante foi triturado com clorobutano para dar o ácido l-tetralona-7-carboxílico (9,59 g; 0,05 mol; 100%) na forma de um sólido castanho, p.f. = 210-215 °C; ’Η-NMR (DMSO) δ 8,4 (s, 1H), 8,1 (d, 2H, >8,0 Hz) 7,5 (d, 1H, >7,9 Hz), 3,0 (t, 2H, >6,0 Hz), 2,65 (t, 2H, >6,6 Hz), 2,1 (quinteto, 2H, >6,3 Hz).
Parte F- Uma solução de ácido l-tetralona-7-carboxílico (1,0 g; 0,0053 mol) e acetato de sódio (1,93 g; 0,024 mol) e hidrocloreto de hidroxilamina (1,11 g; 0,016 mol) numa mistura de metanol e água (1:1; 15 mL) foi agitada em refluxo ao longo de 4 horas. A mistura foi arrefecida e em seguida foi adicionada mais água (50 mL). O sólido foi recolhido, lavado com água e seco e em seguida triturado com hexano para dar o ácido l-tetralonoxima-7-carboxílico (0,78 g; 0,0038 mol; 72%) na forma de um sólido branco, p.f. = 205-215 °C; 'H-NMR (DMSO) δ 11,3 (s, 2H), 8,4 (s, 1H), 7,8 (d, 1H, >7,7 Hz), 7,3 (d, 1H, >7,7 Hz), 2,8 (t, 2H, >5,9 Hz), 2,7 (d, 2H, >6,6 Hz), 1,9-1,7 (m, 2H).
Parte G- Uma mistura de ácido l-tetralonoxima-7-carboxílico (0,75 g; 0,0037 mol) em metanol (25 mL) com ácido clorídrico concentrado (0,54 mL; 0,20 g; 0,0056 mol) e catalisador de paládio em carbono (0,10 g; 5% de Pd/C) foi batida durante 20 horas à temperatura ambiente sob uma atmosfera de hidrogénio (4,1 bar (60 psi)). A mistura reaccional foi filtrada sobre Celite® e lavada com metanol. O filtrado foi evaporado até à secura sob pressão reduzida e o resíduo purificado por cromatografia flash usando hexano:acetato de etilo 1:1 para dar a mistura racémica de hidrocloreto do ácido 8-amino-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftóico (0,225 g; 0,001 mol; 27%) na forma de um sólido branco, p.f. = 289-291 °C; ’Η-NMR (DMSO) δ 8,55 (bs, 3H), 8,2-8,1 (m, 1H), 7,85-7,8 (m, 1H), 7,35-7,25 (m, 1H), 4,5 (m, 1H), 2,9-2,8 (m, 2H), 2,1-1,9 (m, 3H), 1,85-1,7 (m, 1H). Ácido N-(BOC)-8-aminometiI-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftóico (12)
Conforme se mostra no Esquema 7, a tetralona restante foi em seguida convertida para p éster de metilo (9). Usando um procedimento de G. B. Gregory e A. L. Johnson, J. O. C., 55 (1990) 1479, o éster de metilo da tetralona (9) foi convertido, primeiro, à cianidrina por tratamento com cianeto de trimetilsi-lilo e iodeto de zinco e em seguida, via desidratação in situ com cloreto de fosforilo em piridina, ao 8-ciano-5,6-di-hidro-2-naftoato de metilo (11). Este naftoato foi dividido em duas porções e uma delas foi sujeita a hidrogenólise, protecção N-BOC e saponificação para dar o ácido N-(BOC)-8-aminometil--5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftóico (12) como um intermediário para incorporação no péptido cíclico.
Parte A- Uma mistura de ácido l-tetralona-7-carboxílico (7,0 g; 0,037 mol) em metanol (13,6 mL; 10,8 g; 0,30 mol) com uma quantidade catalítica de ácido clorídrico (0,07 mL; 0,12 g; 0,0012 mol) foi agitada em refluxo durante 5 horas. A mistura reaccional arrefecida foi vertida em gelo-água e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água e água salgada, secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas até à secura sob pressão reduzida. O sólido resultante foi purificado por cromatografia flash usando hexano:acetato de etilo 75:25. O sólido resultante foi triturado com hexano para dar o éster de metilo do ácido 1-tetralona--7-carboxílico (3,61 g; 0,018 mol; 49%) na forma de um sólido amarelo, p.f. = 170-172 °C; 'H-NMR (CDC13) δ 8,7 (s, 1H), 8,15 (d, 1H, J=8,l Hz) 7,35 (d, 1H, J=8,l Hz), 3,95 (s, 3H), 3,05 (d, 2H, J= 6,1 Hz) 2,7 (t, 2H, J=6,4 Hz), 2,15 (quinteto, 2H, J=6,2 Hz).
Parte B - Uma solução de éster de metilo do ácido 1-tetralona--7-carboxílico (3,50 g; 0,017 mol), cianeto de trimetilsililo (1,98 g; 0,02 mol) e iodeto de zinco (0,10 g) em benzeno (20 mL) foi agitado à temperatura ambiente durante 15 horas. Foi adicionada em seguida, sequencialmente e gota a gota, piridina (20 mL) e cloreto de fosforilo (4,0 mL; 6,55 g; 0,0425 mol). A mistura reaccional foi agitada em refluxo durante 1 hora e em seguida evaporada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi recebido em clorofórmio, lavado com água, seco sobre sulfato de magnésio e evaporado até à secura sob pressão reduzida para dar 8-ciano-5,6-di-hidro-2-naftoato de metilo (1,70 g; 0,008 mol; 47%) na forma de um sólido amarelo, p.f. = 73-75 °C; *H-NMR (CDC13) δ 8,0-7,9 (m, 1H), 7,3-7,2 (m, 1H), 6,95 (t, 1H, J=4,8 Hz), 3,95 (s, 3H), 2,9 (t, 2H, J=8,3 Hz), 2,6-2,4 (m, 3H).
Parte C - Uma mistura de 8-ciano-5,6-di-hidro-2-naftoato de metilo (0,80 g; 0,0038 mol) em metanol (25 mL) com ácido clorídrico concentrado (0,56 mL) e catalisador de paládio em carbono (0,40 g; 5% de Pd/C) foi batida durante 20 horas à temperatura ambiente sob uma atmosfera de hidrogénio (3,4 bar (50 psi)). A mistura reaccional foi filtrada sobre Celite® e lavada com - 166 - metanol. O filtrado foi evaporado até à secura sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com hexano para dar a mistura racémica de 8-aminometil-5,6,7,8--tetra-hidro-2-naftoato de metilo (0,80 g; 0,0037 mol; 97%) na forma de um sólido branco, p.f. = 172-179 °C; 'H-NMR (DMSO) δ 8,2-8,0 (m, 4H), 7,9-7,7 (m, 6H), 7,5-7,2 (m, 4H), 3,9-3,8 (m, 7H), 3,3-2,7 (m, 10H), 2,0-1,6 (m, 8H).
Parte D - A uma solução de 8-aminometil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftoa-to de metilo (0,78 g; 0,0036 mol) e trietilamina (0,55 mL; 0,40 g; 0,0004 mol) em tetra-hidrofurano aquoso (50%; 75 mL) foi adicionado, em porções na forma de um sólido, 2-(fó/r-butoxicarboniloxiimino)-2-fenilacetonitrilo (0,99 g; 0,004 mol). Foi tudo agitado à temperatura ambiente ao longo de 3 horas. A solução foi concentrada até metade do volume e extraída com éter dietílico. A camada aquosa foi em seguida acidificada até um pH de 1,0 usando ácido clorídrico (1 N) e em seguida extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas até à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash usando hexano:acetato de etilo 8:2 para dar N-(BOC)-8-aminometil-5,6,7,8-tetra-hidro--2-naftoato de metilo (0,54 g; 0,0017 mol; 47%) na forma de um sólido branco, p.f. = 72-80 °C; 'H-NMR (DMSO) δ 13,8 (s, 1H), 7,8-7,65 (m, 3H), 7,6-7,5 (m, 3H), 7,25-7,20 (m, 1H), 7,15-7,05 (m, 1H), 3,9-3,8 (m, 1H), 3,2-2,8 (m, 4H), 1,8-1,6 (m, 3H), 1,4 (s, 6H).
Parte E - A uma solução de N-(BOC)-8-aminometil-5,6,7,8-tetra--hidro-2-naftoato de metilo (0,50 g; 0,0016 mol) em etanol (12,5 mL) foi adicionada, gota a gota, uma solução de hidróxido de sódio (0,50 g) em água (12,5 mL). Foi tudo agitado em refluxo durante 4 horas. A mistura reaccional foi concentrada até metade do volume e em seguida acidificada até um pH igual a 1,0 usando ácido clorídrico (1 N). O resíduo foi purificado por cromatografia - 167 - «ΒΒΒ5·β®ΒΊ flash usando um gradiente de hexano: acetato de etilo 1:1 até acetato de etilo até acetato de etilo:metanol 9:1 para dar a mistura racémica do composto mencionado em título, ácido N-(BOC)-2-aminometil-5,6,7,8-tetra-hidro-2--naftóico (0,19 g; 0,00062 mol; 39%) na forma de um sólido branco, p.f. = 172-176 °C; ‘H-NMR (DMSO) δ 7,8 (s, 1H), 7,65 (d, 1H, J=8,l Hz), 7,15 (d, 1H, J=8,l Hz) 7,1-7,0 (m, 1H), 3,2-3,1 (m, 2H), 3,0-2,7 (m, 4H), 1,8-1,6 (m, 4H), 1,4 (s, 9H). Ácido N-(BOC)-8-aminometil-2-naftóico (14) O naftoato (11) restante foi tratado com 2,3-dicloro-5,6-diciano-l,4--benzoquinona (DDQ) em dioxano para aromatizar o anel adjacente para dar o 8-ciano-2-naftoato de metilo (13). Em seguida, o nitrilo foi reduzido via hidrogenação e o éster de metilo saponificado para o ácido carboxílico. Este ácido foi em seguida protegido por N-BOC para dar o ácido N-(BOC)-8-amino-metil-2-naftóico (14) como um intermediário para incorporação no péptido cíclico.
Parte A - Uma solução de 8-ciano-5,6-di-hidro-2-naftoato de metilo (1,0 g; 0,0047 mol) e 2,3-dicloro-5,6-diciano-l,4-benzoquinona (1,07 g; 0,0047 mol) em dioxano (50 mL) foi agitada a 120 °C ao longo de 16 horas. A mistura reaccional foi vertida em gelo-água e extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas até à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash usando acetato de etilo para dar 8-ciano-2-naftoato de metilo (0,72 g; 0,0034 mol; 73%) na forma de um sólido acastanhado. p.f. = 178-182 °C; 'H-NMR (CDC13) δ 8,95 (s, 1H), 8,3-8,2 (m, 1H), 8,15-8,10 (m, 1H), 8,0-7,95 (m, 2H), 7,7-7,6 (m, 1H), 4,05 (s, 1H).
Parte B- Uma mistura de 8-ciano-2-naftoato de metilo (1,0 g; 0,0047 mol) em metanol (35 mL) com ácido clorídrico concentrado (0,69 mL) e catalisador de paládio em carbono (0,20 g; 5% de Pd/C) foi batida durante 6 horas à temperatura ambiente sob uma atmosfera de hidrogénio (3,4 bar (50 psi)). A mistura reaccional foi filtrada sobre Celite® e lavada com metanol. O filtrado foi evaporado até à secura sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com hexano para dar 8-aminometil-2-naftoato de metilo (0,76 g; 0,0035 mol; 75%) na forma de um óleo. 'H-NMR (DMSO) δ 8,75 (s, 1H), 8,5 (bs, 2H), 8,2-8,05 (m, 3H), 7,75-7,70 (m, 2H), 4,6 (s, 2H), 3,95 (m, 3H).
Parte C - A uma solução de 8-aminometil-2-naftoato de metilo (0,75 g; 0,0035 mol) em tetra-hidrofurano seco (50 mL), arrefecido até 0°C, foi adicionada uma solução de hidróxido de lítio (0,5 M; 5,83 mL). Foi tudo agitado à temperatura ambiente ao longo de 20 horas. Um outro alíquota de hidróxido de lítio foi adicionado e foi tudo agitado durante mais 20 horas. O sólido foi recolhido e o filtrado foi evaporado até à secura sob pressão reduzida. Os sólidos foram triturados com éter dietílico para darem o ácido 8-aminometil-2-naftóico (0,67 g; 0,0033 mol; 95%) na forma de um sólido branco, p.f. = 223-225 °C; !H-NMR (DMSO) δ 8,6 (s, 1H), 8,1-7,9 (m, 1H), 7,8-7,7 (m, 4H), 7,55-7,5 (m, 114) 7,45-7,35 (m, 2H), 4,2 (s, 2H).
Parte D - A uma solução de ácido 8-aminometil-2-naftóico (0,50 g; 0,00025 mol) e foi adicionada trietilamina (0,038 mL; 0,028 g; 0,000275 mol) em tetra-hidrofurano aquoso (50%; 5 mL) foi adicionado, em porções na forma de um sólido, 2-(íe/'c-butoxicarboniloxiimino)-2-fenilacetonitrilo (0,068 g; 0,000275 mol). Foi tudo agitado à temperatura ambiente ao longo de 5 horas. A solução foi concentrada até metade do volume e extraída com éter dietílico. A camada aquosa foi em seguida acidificada até um pH de 1,0 usando ácido clorídrico (1 N) e em seguida extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas até à secura sob pressão reduzida para dar o composto mencionado em título, o ácido N-(BOC)-8-aminometil-2-naftóico (0,050 g; 0,00017 mol) na forma de um sólido branco, p.f. = 190-191 °C; 'H-NMR (DMSO) δ 13,1 (bs, 1H), 8,8 (s, 1H), 8,0 (q, 2H, J=7,9 Hz), 7,9 (d, 1H, J=8,l Hz), 7,6 (t, 1H, J=7,5 Hz), 7,65-7,55 (m, 2H), 4,6 (d, 2H, J=5,5 Hz), 1,4 (s, 9H).
Intermediários 89a e 89b do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido aminotetralinacarboxílico); o composto de fórmula (VIII) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly,
M = Asp, R1 = R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de Boc-Mamb á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,164 mmol para dar o péptido cíclico protegido (69 mg; 49,3%). O péptido (69 mg) e 0,069 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 30 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (59,7 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® 08 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,23%/min de 16,2 até 27% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo. Foram obtidos dois isómeros; isómero n° 1 (recuperação de 12,5%, rendimento global de 6,2%); FAB-MS: [M+H] = 615,34; isómero n° 2 (recuperação de 18,6%, rendimento global de 9,3%); FAB-MS: [M+H] = 615,35. - 170 - - 170 -
Intermediário 89c do Composto Cíclico
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-ácido aminometilnaftóico); o composto de fórmula (IX) em que J = D-Val, K = NMeArg, L = Gly,
M = Asp, R1 = H, R2 = H O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (Intermediário 4 do Composto Cíclico). O método de DCC/DMAP foi usado para a ligação de ácido Boc-aminometil-naftóico á resina de oxima. O péptido foi preparado numa escala de 0,737 mmol para dar o péptido cíclico protegido (463 mg; 73,1%). O péptido (463 mg) e 0,463 mL de anisole foram tratados com fluoreto de hidrogénio anidro a 0 °C durante 20 minutos. O material cru foi precipitado com éter, redissolvido em acetonitrilo aquoso e liofilizado para originar o composto mencionado em título (349 mg; maior que rendimento quantitativo; calculado como sal fluoreto). A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,5 cm) usando um gradiente a 0,45%/min de 4,5 até 22,5% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido branco felpudo (recuperação de 12,1%, rendimento global de 7,8%); FAB-MS: [M+H] = 625,32. Síntese de Intermediários de Composto Cíclico Modificados por Ligante
Intermediários de composto cíclico modificados por ligante podem ser sintetizados ou por incorporação de um ligante apropriadamente protegido numa porção ciclizante e em seguida sintetizando o intermediário de composto cíclico modificado por ligante ou por ligação do ligante ao intermediário de composto cíclico. - 171 -
Porções Ciclizantes Modificadas por Ligante
Porções ciclizantes modificadas por ligante podem ser sintetizadas ou por ligação do ligante à porção ciclizante substituída no anel sintetizada conforme descrita acima ou por incorporação de um ligante apropriadamente protegido na síntese da porção ciclizante.
Por exemplo, a porção ciclizante substituída no anel descrita acima onde X = NH2 pode reagir com o ligante de succinimidilo, RCOOSu (R = -(CH2)5-NH2 ou -CH2C6H5-/>-NH2), para dar um ligante ligado na posição X via um grupo amida.
OH
a] Boc-ON b] RCOOSu
OHO^W^H-boc ^WL
“NHCOR A porção ciclizante substituída no anel com X = OH pode reagir com um ligante derivado de tetraetilenoglicol. Este ligante consiste de quatro unidades de etileno separadas por grupos éter e carregando um grupo amina protegido por Z numa extremidade da cadeia ou trela e um grupo separável tal como tosilato na outra extremidade da cadeia. Isto dará um ligante ligado na posição X via um grupo éter. A porção ciclizante substituída no anel com Z = NH2 pode reagir com (Z-NH(CH2)5C0)20 para dar um ligante ligado na posição Z via um grupo amida.
Boc-NH/YYC°2H
Boc-NHCOaH Z-NH(CH2)5CONH'i^ - 172 -
Os ligantes podem ser ligados à porção ciclizante substituída no anel com Z = OH. A ligação dos ligantes ao anel requererá que o ligante tenha um grupo separável adequado para reacção com um ião fenolato. Tais grupos separáveis incluem haletos, arilsulfonatos (e. g., tosilato) e alquilsulfonatos (e. g., mesilato). Por exemplo, é usada uma cadeia alquilo que suporta um grupo tosilo numa extremidade da cadeia e uma amina protegida na outra extremidade. A literatura proporciona vários exemplos de alquilação num grupo fenólico na presença de um grupo ácido carboxílico (ver, por exemplo, Brockmann, Kluge e Muxfeldt, Ber. Deutsch. Chem. Ges., 90 (1957) 2302). - 172 - I | Z-NH-(CH2)nCH2-OTs. „0^
NaOH Z-NH-(CH2)nCH20^^ co2h A porção ciclizante substituída no anel com Z = CH2NH2 pode reagir com Z-NH(CH2)n-COOSu para dar ligantes ligados na posição Z via um grupo amidometilo.
Z-NH-(CHj)a-CONH •
Os exemplos anteriores demonstraram o uso de ligantes que terminam numa amina protegida. Os ligantes que terminam num ácido carboxílico ou grupos éster também podem ser desejáveis. Vários de tais grupos podem ser ligados às porções ciclizantes descritas acima. Por exemplo, no esquema seguinte, o ácido 3-aminometil-4-hidroxibenzóico protegido por í-Boc é - 173- tratado com cloroacetato de benzilo e base para introduzir um ligante pequeno que termina num éster. - 173-
CI-CH2C02-Bzl NaOH
Z-NH
CO2-Bzl
CO2H
Um ligante pode estar ligado à porção ciclizante substituída no anel onde Y = NH2. Conforme se mostra no Esquema 8, a hidrólise do éster de metilo 3-aminometil-5-aminobenzoato de metilo protegido por t-Boc sob condições de básicas suaves, seguida por tratamento com acrilato de benzilo (Lancaster Synthesis, Inc.) e catalisador de ácido acético produzirá o produto de adição de Michael. Mesmo pensando" que esta porção ciclizante modificada por ligante contém uma amina secundária desprotegida, ele poderia ser usado directamente numa síntese em fase sólida. Contudo, a protecção da amina, se desejada, poderá ser realizada por tratamento com cloroformato de benzilo e uma base suave.
Boc-NH CO,CH3 0
NaOH. HjO
Boc-NH co2h nh2 NHj í^COj-Bzl
AcOH, 60°C
Boc-NH
HN
COjH Z-CI, NaHCOa (opcional)
Boc-NH
COjH
Z-N 'N-^'COrBzl
Esquema 8 0 ligante também pode ser incorporado na síntese das porções ciclizantes. Um exemplo é a síntese da porção ciclizante modificada pelo ligante 5-Aca-Mamb. Síntese de Boc-Mamb(Z-5-Aca)
Esta síntese é delineada no Esquema 9, abaixo.
Parte A - 3-Nitro-5-hidroximetilbenzoato de metilo A uma solução de 3-nitroisoftalato de monometilo (396,0 mg; 1,76 mol) em THF anidro (1000 mL) foi adicionado BMS 2,0 M (complexo borano/sulfureto de metilo) em THF (880 mL; 1,76 mol) gota a gota ao longo de 1 hora. A solução resultante foi aquecida em refluxo durante 12 horas e foi lentamente adicionado MeOH (750 mL) para extinguir a reacção. A solução foi concentrada para dar um sólido amarelo que foi recristalizado de tolueno (297,5 g; 80%). ’Η-NMR (CDC13) δ 8,71-8,70 (m, 1H), 8,41-8,40 (m, 1H), 8,31-8,30 (m, 1H) 4,86 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 2,47 (s, 1H); p.f. = 76,5-77,5 °C; DCI-MS: [M+H] = 212.
Parte B - Metanossulfonato de 3-carbometoxi-5-nitrobenzilo 3-Nitro-5-hidroximetilbenzoato de metilo (296,0 g; 1,40 mol) e esponja de protões (360,8 g; 1,68 mol) foram dissolvidos em dicloreto de etileno (150 mL). Anidrido tríflico (292,3 g; 1,68 mol) dissolvido em dicloreto de etileno (800 mL) foi adicionado gota a gota à suspensão ao longo de 90 minutos e a mistura foi deixada em agitação durante 18 horas sob azoto. A reacção foi extinta com H20 (2000 mL), as duas camadas foram separadas e a camada orgânica foi lavada com porções de 1000 mL de HC1 1 N, H20, NaHC03 saturado, H20 e NaCl saturado. A camada orgânica foi seca (MgS04) e concentrado sob pressão reduzida. O sólido amarelo resultante foi recristalizado de tolueno para dar o composto mencionado em título na forma de um sólido acastanhado (366,8 g; 91%). !H-NMR (CDC13) δ 8,84-8,85 (m, 1H), 8,45-8,46 (m, 1H), 8,40-8,39 (m, 1H), 5,35 (s, 2H), 3,98 (s, 3H), 3,10 (s, 3H); p.f. = 96-97 °C; DCI-MS: [M+NH4] = 307.
Parte C - 3-AzidometiI-5-nitrobenzoato de metilo
Metanossulfonato de 3-carbometoxi-5-nitrobenzilo (300,0 g; 1,04 mol) e azida de sódio (81,0 g; 1,25 mol) foram suspensos em DMF (1700 mL) e agitados à temperatura ambiente durante 5 horas. A reacção foi diluída com acetato de etilo (2000 mL), lavada com porções de 1000 mL de H20 (2x) e NaCl saturado (lx), seca (MgS04) e concentrada sob pressão reduzida. O xarope âmbar resultante foi seco em vácuo a 40 °C para produzir o composto mencionado em título na forma de um sólido acastanhado (226,5 g; 92%). ‘H-NMR (CDC13) δ 8,60 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,88 (s, 3H); p.f. = 44-46 °C.
Parte D - 3-Amino-5-aminometilbenzoato de metilo
Uma solução de 3-azidometil-5-nitrobenzoato de metilo (15,50 g; 65,7 mmol) e ácido benzenossulfónico (22,14 g; 140 mmol) em metanol quente (320 mL) foi colocada numa garrafa de agitação de Parr e purgada com azoto durante 15 minutos. Catalisador de paládio em carbono (10% de Pd/C; 4,0 g) foi adicionado e a garrafa de agitação foi ainda purgada com 7 ciclos de pressurização-evacuação, repressurizada e deixada em agitação durante 18 horas, tempo durante o qual a quantidade requerida de hidrogénio foi consumida. O catalisador foi removido por filtração através de um leito de Celite® e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida produzindo um óleo acastanhado. A trituração com EtOAc refluxante (2 x 150 mL) seguida por arrefecimento durante 12 horas a -5 °C deu um sólido acastanhado que foi recolhido por filtração, lavado com EtOAc (2 x 50 mL) e seco em vácuo (25,82 g; 80%). 1H-NMR (CD3OD) δ 8,25-8,23 (m, 1H), 8,07-8,06 (m, 1H), 7,86-7,80 (m, 5H), 7,49-7,42 (m, 6H), 4,29 (s, 2H), 3,97 (s, 3H).
Parte £ - 3-Amino-5-(t-butoxicarbonilamino)metilbenzoato de metilo
Uma solução de 3-amino-5-aminometilbenzoato de metilo (19,32 g; 39.0 mmol), TEA (7,89 g; 78,0 mmol) e dicarbonato de di-í-butilo (8,51 g; 39.0 mmol) em MeOH (350 mL) foi deixada a reagir durante 24 horas à temperatura ambiente e concentrada para produzir um sólido incolor. A purificação por cromatografia flash (sílica gel; hexano:EtOAc 1:1;) deu o produto (9,21 g; 84%) na forma de um sólido incolor. 'H-NMR (CD3OD) δ 7,26-7,25 (m, 2H), 6,86-6,85 (m, 1H), 4,16 (s, 2 H), 3,88 (s, 3H), 1,48 (s, 9H); p.f. = 57-65 °C; ESI-MS: [M+H] = 281.
Parte F - Boc-Mamb(Z-5-Aca)-OMe Ácido N-CBZ-g-aminocapróico (7,77 g; 29,3 mmol) e TEA (2,97 g; 29,3 mmol) foram dissolvidos em THF anidro (250 mL) e arrefecidos até -20 °C. Cloroformato de isobutilo (4,00 g; 29,3 mmol) foi adicionado gota a gota e a mistura foi deixada reagir durante 5 minutos a -20 °C. 3-Amino-5-(/-butoxicar-bonilamino)metilbenzoato de metilo (8,20 g; 29,3 mmol) dissolvido em THF anidro (50 mL) foi arrefecido até -20 °C e adicionado à reacção. A mistura reaccional foi deixada aquecer lentamente até à temperatura ambiente e foi agitada durante mais 2 dias. Os sólidos foram removidos por filtração e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em EtOAc (125 mL) e lavado com duas porções de 50 mL cada de HC1 0,2 N, NaHC03 saturado e NaCl saturado. A camada orgânica foi seca (MgS04) e concentrada sob pressão reduzida. O produto cru foi purificado por cromatografia flash (sílica gel; hexano:EtOAc 1:2) e a recristalização de CC14 deu o composto mencionado em título (10,09 g; 65%) na forma de um sólido incolor. ^-NMR (CDC13) δ 8,03-7,63 (m, 3H), 7,32-7,28 (m, 5H), 5,12-4,92 (m, 4H), 4,27-4,25 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,17-3,12 (m, 2H), 2,34-2,28 (m, 2H), 1,72-1,66 (m, 2H), 1,48-1,53 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,36-1,34 (m, 2H); p.f.= 52-54 °C; ESI-MS: [M+H] = 528.
Parte G - Boc-Mamb(Z-5-Aca)
Boc-Mamb(Z-5-Aca)-OMe (22,58 g; 43,0 mmol) foi dissolvido em NaOH 1 N:MeOH 1:1 (500 mL) e deixado em agitação 18 horas à temperatura ambiente. A reacção foi repartida entre EtOAc (300 mL) e H20 (200 mL) e as duas camadas foram separadas. O pH da camada aquosa foi diminuído para 4,5 e o precipitado oleoso resultante foi extraído com EtOAc (2 x 300 mL). O extracto orgânico foi seco (MgS04) e concentrado até um sólido amarelo. O sólido foi triturado com CC14 refluxante (3 x 100 mL) para dar o produto (14,17 g; 64%) na forma de um sólido incolor. 'H-NMR (CD3OD) δ 8,04 (s, 1H), 7,71-7,66 (m, 2H), 7,30-7,23 (m, 5H), 5,02 (s, 2H), 4,24 (s, 2H), 3,32 (s, 3H), 3,11 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,34 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,74-1,35 (m, 15H); p.f. = 168-169 °C; DCI-MS: [M+NH4] = 531.
Esquema 9
co2ch3 no2 1) BH3*SMe2 2) Anidrido metanossulfónico, esponja dc protões
NOj COjCHj
NaN3 DMF
N02 h2n
co2ch3 •c6h5so3h nh2 H2) Pd/C, MeOH C02CH3 __:_ Ácido benzenossulfónico
Dicarbonato dc di-í-butilo —-»
EtjN, MeOH
co2ch3 Z-NH(CH2)5C02H -» Acoplamento de anidrido misto
- 178 - çgasssssss m ru NaOH, MeOH λ λ COiH Boc-NH^ÇyCOjCHl -í-> Z-NH(CH2)íCONH Z-NH(CHj)jCONH
O Esquema 10 ensina como um ligante ligado à porção ciclizante via um grupo funcional amida reversa pode também ser sintetizado. A redução do grupo nitro de 3-nitroisofíalato de monometilo (Fluka) usando paládio em carbono dará 3-aminoisoftalato de monometilo, o qual pode ser convertido ao ni-trilo correspondente pelo procedimento de Sandmeyer. O tratamento deste éster com uma diamina monoprotegida produzirá a amida correspondente. O grupo de protecção na diamina deverá ser estável às condições de hidrogenação. O Esquema demonstra o uso do grupo Teoc (2-trimetilsililetiloxicarbonilo), mas outros, familiares dos peritos na técnica, podem também ser usados. A redução do nitrilo usando paládio em carbono dará a porção ciclizante modificada pelo ligante. Esquema 10
0,N
COjCHj
COjH
H2, Pd/C
H,N
COjCHj co2h
1) NâNOj 2) CuCN
COjH COaCH3
Teoc-NH-ÍCHjVNHj NC.
C02H
H2. Pd/C
Teoc-NH-(CH2)n-NH*^ O - 179- - 179- fQ ti 2 Dicarbonato de di-í-butilo
Teoc-NH-(CH2)n.NH
Boc-NH'^N^Y'C°2H
I
TeocNH-(CHjV-NH O
Os ligantes ligados na posição Y das porções ciclizantes substituídas no anel via um encadeamento éter podem ser sintetizados, a partir do ácido 3-hidroxi-5-aminobenzóico. Uma reacção de Sandmeyer pode ser usada para converter a amina a um ácido 3 hidroxi-5-cianobenzóico. A alquilação conforme anteriormente introduz o ligante. A redução do nitrilo usando catalisador de paládio em carbono proporcionará o grupo aminometilo. A protecção da amina com o grupo í-Boc usando dicarbonato de di-í-butilo proporcionará as porções ciclizantes modificadas pelos ligantes prontas para uso numa síntese em fase sólida. Isto é mostrado no Esquema 11.
Esquema 11
HjN
OH
2) CuCN COjH n 2 1) NaNOj, H‘ "
OH
COjH || Tcoc-NH-tCHACHa-OTs, NaOH "ΧΓ" ^ -'rr"’-
Teoc-NH-(CH2)eCH20 Teoc-NH-(CH2)nCH20
Dicarbonato de di-í-butilo
Boc-NH co2h
Teoc-NH-(CH2)„CH20 -180-
Os ligantes que terminam num grupo ácido carboxílico podem ser sintetizados usando anidridos cíclicos. O Esquema 12 ilustra uma tal síntese usando anidrido succínico. A reacção de 3-aminometil-5-aminobenzoato de metilo protegido por M3oc com anidrido succínico dará o ligante de ácido carboxílico. A activação do ácido carboxílico e condensação com carbazato de benzilo (Lancaster Synthesis, Inc.) dará a hidrazida protegida. Esta hidrazida serve para proteger o ácido carboxílico durante o resto da síntese. A hidrólise do éster de metilo produz a porção ciclizante modificada por ligante numa forma pronta para ser usada na síntese em fase sólida. Depois da síntese estar completa, a remoção do grupo de protecção Cbz da hidrazida abre o caminho para a preparação de uma azida e o acoplamento da azida ao quelante (Hofmann, Magee e Lindenmann, J. Amer. Chem. Soc., 72 (1950) 2814). Isto é mostrado no Esquema 12. -180- Esquema 12
Os ligantes também podem ser incorporados nas sínteses de porções ciclizantes alternativas. Por exemplo, uma porção ciclizante heterocíclica modificada por ligante pode ser sintetizada a partir de 4-amino-6-carbetoxi-l--hidroximetilpirimidina (Boger, J. Amer. Chem. Soc., 116 (1994) 82-92). O álcool será convertido à amina em três passos. Primeiro, o tratamento com cloreto de toluenossulfonilo e base dará o tosilato, o qual no tratamento com azida de sódio dará a azida. A redução da azida sobre catalisador de paládio em carbono produzirá a diamina. A grande diferença de nucleofilicidade das duas aminas permitirá a protecção selectiva do grupo aminometilo usando dicarbonato de di-í-butilo. A ligação de um ligante protegido, tal como Ζ-5-Aca, à amina restante será conseguida usando anidrido misto ou química de anidrido simétrico. Finalmente, a hidrólise do éster de etilo dará a porção ciclizante heterocíclica modificada por ligante pronta para ser acoplada à resina da síntese em fase sólida. Isto é mostrado no Esquema 13.
Esquema 13
nh2 nh2
nh2
h2n
Z-NH(CH2)5CONH Z-NHÍCHjJjCONH - 182 -
Esquema 13
LlGANTES A preparação da trela de tetraetilenoglicol discutida acima é mostrada no Esquema 14. A síntese começa com 1-amino-l l-azido-3,6,9-trioxa-undecano (Bertozzi e Bednarski, J. Org. Chem., 56 (1990) 4326-4329). A redução da azida com catalisador de paládio em carbono dá a amina, a qual é protegida com o grupo Cbz (designado como "Z" no Esquema 14 e daqui em diante). O álcool é agora convertido para o tosilato usando cloreto de toluenossulfonilo e base.
1) Hj. Pd/C
N3-(CH2CH20)<-H -;-► Z-NH-(CH2CH20)<-H
2) Z-CU EtjN
Ts-Cl. EijN Z-NH-(CH2CH20)4-Tí
Esquema 14
Um segundo tipo de ligante composto por unidades etilenoglicol é mostrado no Esquema seguinte. Este ligante carrega um grupo ácido carboxílico numa extremidade, permitindo-lhe estar ligado a porções ciclizantes que contêm grupos funcionais amina. A síntese começa com o aminoálcool protegido por Cbz descrito acima. O tratamento do álcool com diazoacetato de etilo e acetato de ródio (II) dímero dá o éster de ácido glicólico que tem a cauda de tetraetilenoglicol. A hidrólise do éster de etilo proporcionará o ligante prontamente para ser acoplado à porção ciclizante. Isto é mostrado no Esquema 15. N2CH2C02Et Z-NH-(CH2CH20)4-H - Rh2(OAc)4 Z-NH-(CH2CH20)4-CH2CC>2Ei
NaOH, H20
-— Z-NH-(CH2CH20)4-CH2C02H
Esquema 15
Conforme se ensina abaixo, estas porções ciclizantes modificadas por ligante podem ser usadas para sintetizar intermediários de composto cíclico modificado por ligante.
Composto Cíclico Modificado Por Ligante 1
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) A síntese do composto mencionado em título é delineada no Esquema 16, mostrado abaixo. A um recipiente de reacção de péptido de 60 mL foi adicionada resina de oxima (1,61 g; nível de substituição = 0,62mmol/g). A resina foi inchada lavando-a uma vez com DMF (30 mL). Ao recipiente de reacção foi adicionado Boc-Mamb(Z-5-Aca) (513 mg; l,0mmol), HBTU (379 mg; 1,0 mmol) e DIEA (0,52 mL; 3 mmol). A suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 96 h. A resina foi completamente lavada com porções de 30 mL de DMF (3x), MeOH (lx), DCM (3x), MeOH (2x) e DCM (3x). O nível de substituição foi determinado ser 0,381 mmol/g pelo teste de ácido pícrico. Os grupos de oxima não reagidos foram bloqueados por tratamento com 30 mL de cloreto de trimetilacetilo 0,5 M / DIEA 0,5 M em DMF durante 2 horas.
Foram em seguida realizados os seguintes passos: (Passo 11 A resina foi lavada com porções de 30 mL de DMF (3x), MeOH (lx), DCM (3x), MeOH (2x) e DCM (3x). (Passo 21 A resina foi lavada com 30 mL de 50% de TFA em DCM o grupo í-Boc foi retirado usando 30 mL de 50% de TFA em DCM durante 30 minutos. (Passo 31 A resina foi lavada completamente com DCM (3x), MeOH (lx), DCM (2x), MeOH (3x) e DMF (3x). (Passo 4) A Boc-Asp(OBzl) (0,982 g; 3,04 mmol), HBTU (1,153 g; 3,04 mmol), DIEA (1,59 mL; 9,14 mmol) e DMF (14 L) foram adicionados à resina e a reacção foi deixada a prosseguir durante 22 horas. (Passo 5) O completamento da reacção de acoplamento foi monitorizado pelo teste de ácido pícrico. Os Passos 1-5 foram repetidos até a sequência desejada ter sido atingida.
Depois do péptido linear estar montado, o grupo í-Boc N-terminal foi removido primeiro lavando com 50% de TFA em DCM, seguido por tratamento com 30 mL de 50% de TFA em DCM durante 30 minutos. A resina foi completamente lavada com DCM (3x), MeOH (2x) e DCM (2x) e em seguida neutralizada com porções de 30 mL de 10% de DIEA em DCM (2x1 min). A resina foi lavada com DCM (3x) e MeOH (3x) e seca em vácuo para dar 1,965 g de resina castanha. A resina foi ciclizada pela sua suspensão em DMF (20 mL) contendo HOAc (35 pL; 0,609 mmol) e aquecendo a 50 °C durante 72 horas. A resina foi filtrada num funil de vidro sinterizado e lavada profundamente com 10 mL de DMF (3x). O filtrado de DMF foi evaporado e o óleo resultante foi redissolvido em acetonitrilo:H20 1:1 (20 mL) e liofilizado para dar o péptido cíclico protegido (342 mg). A purificação foi realizada usando HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,1 cm) e uma fase móvel isocrática de acetonitrilo:H20 1:1 contendo 0,1% de TFA. A liofilização da fracção do produto deu o péptido protegido purificado (127 mg). O péptido (120 mg; 0,11 mmol) foi desprotegido por tratamento com TFA (1 mL) e ácido tríflico (1 mL) contendo anisole (0,2 mL) durante três horas a -10 °C. O péptido foi precipitado pela adição de éter e arrefecimento até - 185- -35 °C durante 1,5 horas. O péptido foi recolhido por filtração, lavado com éter e seco. O sólido resultante foi dissolvido em acetona:H20 1:1 (12 mL) e o pH é ajustado a 4-6 por tratamento com resina de permuta iónica de ião acetato Bio-Rad AG1-8X. A resina foi filtrada e lavada com água. O filtrado foi liofilizado para dar o péptido puro por HPLC (75 mg; rendimento global de 13,5%); FAB-MS: [M+H] = 703,3951.
Esquema 16
1. 25%TFA/CHjC1j 1. 25% TFA/CH2G2 i. 25%TFA/CH2C12
2. Boc-Asp(OBzl)-OH. HBTU, DIEA, DMF 2. Boc-Gly-OH, z Boc-N-MtArgtfoi)-OH.
HBTU. DIEA, DMF HBTU, ΌΒΑ, DMF 1. 25%TFArt:H2Cl2
2. Boc-D-VaJ-OH. HBTU, DIEA DMF
Boc-D*Val —N-MeArgfTos) — Q|y
O
1. TFA.CH2C12 2. DIEA
3. HOAc, DMF 50°C
1. TFATFMSA. Aniso lí Z TF A. HPLC 0
N-MeAfS D-Val
Gly \ Asp
O
-2CF,C02H - 186 -
Composto Cíclico Modificado Por Ligante 2
Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) O composto mencionado em título foi preparado usando o procedimento geral descrito para Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5--Aca)). O péptido foi preparado numa escala de 1,35 mmol para dar o péptido protegido cíclico cru (1,05 g; 73%). O péptido (500 mg) foi desprotegido por tratamento com TFA (4 mL) e ácido tríflico (4 mL) contendo anisole (0,8 mL) durante três horas a -10 °C. O péptido foi precipitado pela adição de éter e arrefecimento até -35 °C durante 1,5 horas. O péptido foi recolhido por filtração, lavado com éter e seco. O sólido resultante foi dissolvido em acetona:H20 1:1 (50 mL) e liofilizado. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,1 cm) usando um gradiente a 0,36%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido incolor felpudo (218 mg; recuperação de 69%, rendimento global de 37%). FAB-MS: [M+H] = 689,3735.
Compostos Cíclicos Modificados Por Ligante 3-8
NHCOR - 187 - R = -(CH2)5-NH2 ou CH2-C6H5-/7-NH2 X] = 2-propilo, etilo ou p-hidroxifenilmetilo
Os compostos ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(4-NHCOR)), ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(4-NHCOR)) e ciclo-(D-Tyr-NMeArg--Gly-Asp-Mamb(4-NHCOR)) podem ser preparados via procedimento descrito acima.
Os ligantes podem ser incorporados na síntese de intermediários do composto cíclico.
Compostos Cíclicos Modificados Por Ligante 9, 10 e 11
NH
x = ch2ch2, ch2ch2ch2, ch2ch2ch2ch2
Compostos: Ciclo-(0-2-aminoetil-D-Tyr)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb, ciclo-(0-3-aminopropil-D-Tyr)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb e ciclo-(0-4-aminobutil-D-Tyr)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb:
Estes compostos podem ser preparados usando o procedimento descrito acima para cic]o-(D-Tyr-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) usando D-Tyr modificado por ligante. O D-Tyr derivatizado em O pode ser preparado via alquilação do Boc-D-Tyr com a 2-bromoetilamina (ou 3-bromoetilamina ou 4-bromoetilamina) com amina protegida na presença de uma base.
Os ligantes também podem ser ligados a intermediários do composto cíclico.
Composto Cíclico Modificado Por Ligante 12
CicIo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) A preparação do composto mencionado em título está delineada no Esquema 17, mostrado abaixo.
Uma solução de ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (100 mg; 0,12 mmol), éster de hidroxissuccinimida do ácido Boc-5-aminocapróico (47 mg; 0,144 mmol) e Et3N (50 pL; 0,36 mmol) em DMF (1,50 mL) foi deixada reagir à temperatura ambiente durante 60 minutos. O progresso da reacção foi monitorizado por TLC em fase normal (CHCl3:MeOH:HOAc 90:8:2) usando os testes de ninidrina e Sakaguchi. O DMF foi removido sob pressão reduzida. O conjugado cru foi tratado com TFA (3 mL) à temperatura ambiente durante 45 minutos para remover o grupo de protecção í-Boc. O TFA foi removido sob pressão reduzida e o conjugado foi purificando usando por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,1 cm) usando acetónitrilo a 6% contendo 0,1% de TFA durante 20 minutos, seguido por um gradiente a 3,0%/min de 6 até 36% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido incolor felpudo (80 mg; 70%); FAB-MS: [M+H] = ?. - 189 - - 189 - ΝΗ
Esquema 17
Composto Cíclico Modificado Por Ligante 13
CicIo-([3-(4-hidroxifenil)propil-L-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Uma solução de 3-(4-hidroxifenil)-propionato de N-succinimidilo (reagente de Bolton-Hunter; 0,022 g; 0,08 mmol) e DIEA (0,02 mL; 0,10 mmol) em dioxano (5 mL) foi adicionada a uma solução de ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly--Asp-Mamb) (0,026 g; 0,04 mmol) em tampão fosfato a pH 9 (5 mL) e a reacção foi deixada em agitação durante 2 dias à temperatura ambiente. A solução foi liofilizada e o sólido branco resultante foi purificado por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,1 cm) usando um gradiente a 0,36%/min de 9 até 18% de acetonitrilo contendo 0,1% de TF A para dar o produto (0,018 g; 60%) na forma de um sólido incolor; p.f. = 146-155 °C; ESI-MS: [M] = 751. -190-
Composto Cíclico Modificado Por Ligante 14 Ciclo-((N-E-Tyr-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) -190-
O composto desejado pode ser preparado a partir da reacção de ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) com Boc-Tyr-OSu num solvente tal como DMF na presença de uma base tal como trietilamina, seguido por desprotecção.
Composto Cíclico Modificado Por Ligante 15
Ciclo-((N-E-(4-aminofenilacetil)-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
NH
OH O composto desejado pode ser preparado a partir da reacção de ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) com fmoc-4-aminofenilacetato de - 191 - succinimidilo num solvente tal como DMF na presença de uma base tal como trietilamina, seguido por desprotecção.
Composto Cíclico Modificado Por Ligante 16
Ciclo-((N-E-(4-amino-2-hidroxibenzoil)-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
O composto desejado pode ser preparado a partir da reacção de ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) com 4-amino-2-hidroxibenzoato de succinimidilo num solvente tal como DMF ou THF na presença de uma base tal como trietilamina.
Uma variedade de compostos cíclicos modificados por ligante pode ser sintetizada usando reagentes de ligação cruzada bifuncionais desenvolvidos para a derivatização de proteínas. Tais reagentes consistem de dois grupos electrofílicos, tais como ésteres ou isocianatos activos, separados por um espaçador. Os reagentes podem ser homobifuncionais, significando que os dois grupos reactivos são idênticos ou heterobifuncionais. O espaçador pode ser alifático ou aromático e pode conter funcionalidade adicional para modificar a lipofilicidade dos conjugados, ou para permitir a clivagem da cadeia. Os exemplos seguintes ilustrarão o uso de vários reagentes de ligação cruzada comercialmente disponíveis usando como ponto de partida um intermediário de - 192 - composto cíclico sintetizado com a unidade 4-aminometil-Mamb.
No primeiro exemplo, o composto cíclico é tratado com um excesso de DSS (suberato de dissuccinimidilo, Pierce Chemical Co.) em solvente quer aquoso quer orgânico a um pH entre 7 e 9. Estas são condições de reacção típicas para estes reagentes de ligação cruzada. O excesso de Iigante cruzado minimiza a quantidade de espécies diméricas formadas. O pH 7-9 permite que a amina reaja a uma velocidade razoável mas não produza qualquer hidrólise apreciável do segundo grupo reactivo e previna a reacção com o grupo guanidino na arginina. O éster activo na extremidade do Iigante é suficientemente estável para permitir a purificação por HPLC ou cromatografia flash. Uma vez purificado, o composto cíclico modificado por Iigante pode ser conjugado a um quelante contendo um grupo nucleofílico, tal como uma amina ou um tiol. Isto é delineado no Esquema 18.
Esquema 18
Os reagentes heterobi funcionais são tipicamente usados para conseguir a activação muito selectiva de péptidos e proteínas. Nos exemplos seguintes SMPB (4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo; Pierce Chemical Co.) é usado para modificar um composto cíclico que contém amina e prepará-lo para acoplamento a um quelante que contém tiol. O tratamento do composto cíclico com SMPB sob condições ligeiramente básicas dá o composto cíclico modificado por Iigante no qual o Iigante termina num grupo maleimido. A - 193 - selectividade é alcançada porque o grupo maleimido mostra baixa reactividade em relação a grupos amina e a dimerização é minimizada. Após purificação, o grupo maleimido pode ser acoplado a um quelante que contém tiol. Isto é delineado no Esquema 19. - 193 -
pH 7-9
Esquema 19
Os grupos funcionais interiores que contêm ligantes podem ser preparados com os reagentes mostrados no Esquema 20. EGS (etilenoglicol--bis(succinimidato de succinimidilo); Sigma Chemical Co.) é um éster de bis-succinimidilo que reage preferencialmente com aminas. 3,3'-Ditiobispropio-nimidato de dimetilo (DTBP, também chamado reagente de Wang e Richards); Pierce Chemical Co.) também reage preferencialmente com aminas. O dissulfureto é separado por tióis. Meares e colaboradores mostraram (.Int. J. Câncer. Suplemento 2, (1988) 99-102) que conjugados anticorpo-quelato marcados com 111 In juntos por um ligante que contém dissulfureto mostram um desaparecimento mais rápido de radioactividade em ratos do que conjugados que - 194- não contêm um ligante clivável. 0 terceiro exemplo do Esquema 20 demonstra o uso de BSOCOES (bis[2-(succinimido-oxicarboniloxi)etil]sulfona; Pierce Chemical Co.), um ligante de ligação cruzada homobifuncional que contém um grupo sulfona interior. Este reagente produz um grupo carbamato na conjugação com uma amina.
(Su.02CCH2CH2C02CH2-)2 pH 7-9
N-MeArg Asp / I D-Val NH
NH
*H2N >^(CH2)2-S MeO
(Su-0CO2CHzCHz)2SO2 a!^S's^vnh McO^^ S sh2*
Esquema 20 - 195- O Esquema 21 ilustra o uso de bis-isocianatos e bis-isotiocianatos na preparação de compostos cíclicos modificados por ligante. Estes reagentes reagem com aminas para formar grupos ureia e tioureia, respectivamente. Os reagentes serão usados em excesso para minimizar a formação de dímeros. Os grupos isocianato e isotiocianato na extremidade dos ligantes são suficientemente estáveis para permitir a purificação dos produtos. - 195-
/Gly
SCN-(CH2)n-NCS
Asp
N-MeArg \ D-Vai
Esquema 21
Quelantes A presente invenção também proporciona novos reagentes úteis para a preparação de produtos radiofarmacêuticos. Estes reagentes consistem num quelante, Ch, ligado via um grupo ligante, Ln, a um intermediário de composto cíclico, Q. Estes reagentes podem ser sintetizados por várias maneiras, quer por ligação de um quelante a um intermediário de composto cíclico modificado por ligante quer por ligação de um quelante que suporta um grupo ligante ao intermediário do composto cíclico. Preferivelmente, o quelante é ligado ao intermediário de composto cíclico modificado por ligante.
Qualquer quelante pode ser usado nesta invenção com a condição de que forma um complexo estável com um isótopo radioactivo. Tipicamente, o isótopo radioactivo é um metal ou metal de transição e o complexo com o quelante é um complexo de quelato de metal. Exemplos de complexos de quelato de metal podem ser encontrados numa revisão recente: S. Jurisson et al., Chem. Rev., 93 (1993) 1137-1156.
Os quelantes podem ser ligados aos ligantes por uma variedade de meios conhecidos dos peritos na técnica. Em geral, um grupo reactivo do ligante pode reagir com o quelante ou altemativamente um grupo reactivo no quelante pode reagir com o ligante. Grupos reactivos adequados incluem ésteres, isotiocianatos, haletos de alquilo e arilo, aminas, tióis, hidrazinas e maleimidas activos. Vários compostos cíclicos modificados por ligante que suportam grupos reactivos são descritos nos exemplos abaixo.
Os quelantes representativos incluem: ácido dietilenotriamina-pen-tacético (DTPA), ácido etilenodiamina-tetracético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,N',N",N"'-tetracético (DOTA), ácido 1,4,7,10-tetraaza-ciclo-dodecano-N,N',N"-triacético, ácido hidroxibenzil-etilenodiamina-diacético, N,N'--bis(piridoxil-5-fosfato)etileno-diamina, Ν,Ν'-diacetato, ácido 3,6,9-triaza-12--oxa-3,6,9-tricarboximetileno-10-carboxi-13-fenil-tridecanóico, ácido 1,4,7-tri-azaciclononano-N,N',N''-triacético, ácido 1,4,8,11-tetraazaciclo-tetradecano--N,N'N",N"'-tetracético, ácido 2,3-bis(S-benzoil)mercaptoacetamidopropanóico e os quelantes descritos abaixo. Outros quelantes podem incluir derivados de - 197 - regiões de ligação a metal de proteínas que ligam metal tais como, por exemplo, metalotioninas, as quais são proteínas citoplásmicas ricas em sulfídrilo presentes em vertebrados, invertebrados e fungos. Síntese de Quelantes Síntese de ácido 4,5-bis((S-benzoil)mercaptoacetamido)pentanóico (MAPT) O quelante foi sintetizado conforme descrito em Fritzberg et al., φ Appl. Radiat. Isot., 42 (1991) 525-530. Síntese de ácido (S-benzoil)mercaptoacetilglicilglicilglicina (MAG3) O quelante foi sintetizado conforme descrito em W. Brandau et al, Appl. Radiat. Isot., 39 (1988) 121-129. Síntese de 6-Boc-hidrazinopiridina-3-carboxilato de succinimidilo (SHNH) O quelante foi sintetizado conforme descrito em EP-A-0 384 769. Síntese de éster de N-hidroxissuccinimida de N-[4-(carboxi)benzil]-N,N’--bis[(2-trifenilmetiltio)etil]glicinamida A síntese do composto mencionado em título é delineada abaixo no
Esquema 22.
Parte A S-Trifenilmetil-2-aminoetanotiol
Uma solução de hidrocloreto de cisteamina (79,5 g; 0,7 mol) em TFA (500 mL) foi tratada com trifenilmetanol (182 g; 0,7 mol) e foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora. O TFA foi removido sob pressão reduzida a uma temperatura de 45 °C e o óleo laranja escuro resultante foi dissolvido em EtOAc (700 mL). A solução de EtOAc foi lavada com NaOH 2 N frio (3 χ 350 mL), H20 (2 x 350 mL), NaHC03 saturado (350 mL) e NaCl saturado (350 mL). As lavagens aquosas combinadas foram extraídas com EtOAc (350 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas (MgS04) e concentradas até um sólido amarelo. A trituração com éter (500 mL) deu o produto (97,2 g; 43%) na forma de um sólido incolor; p.f. 90-92 °C (D. Brenner et al., J. Inorg. Chem., 23 (1984) 3793-3797, p.f. 93-94 °C). A concentração do éter triturante até um volume de 100 mL e arrefecimento produziram um adicional de 40,9 g de produto, p.f. 89-91 °C, para um rendimento combinado de 62%.
Parte B N-2-Bromoacetil-S-trifenilmetil-2-aminoetanotiol
Uma solução de S-trifenilmetil-2-aminoetanotiol (48 g; 0,15 mol) e Et3N (20,9 mL; 0,15 mol) em DCM (180 mL) foi lentamente adicionada a uma solução agitada de brometo de bromoacetilo (13,9 mL; 0,15 mol) em DCM (100 mL) a uma temperatura de -20 °C. A reacção foi deixada aquecer até à temperatura ambiente ao longo de um período de uma hora. A reacção foi lavada com porções de 500 ml de H2O, HC1 0,2 N, NaHC03 saturado e NaCl saturado. A solução orgânica foi seca (MgS04) e concentrada até um óleo. Este óleo foi recristalizado de DCM-hexano para dar o produto (54,9 g; 83%) na forma de um sólido incolor; p.f. 137-139,5 °C (J. A. Wolff, in Ph. D. Thesis, Massachusetts Institute of Technology, Fevereiro de 1992; p.f. 130-135 °C).
Parte C N,N'-Bis[(2-trifenilmetiltio)etil]glicinamida
Uma solução de N-2-bromoacetil-S-trifenilmetil-2-aminoetanotiol (35,2 g; 0,08 mol), S-trifenilmetil-2-aminoetanotiol (25,5 g; 0,08 mol) e Et3N (16,7 mL; 0,12 mol) em DCM (375 mL) foi mantida à temperatura ambiente durante 24 horas. A solução foi lavada com porções de 200 mL de H20 (lx), - 199 -
NaHCOj saturado (2x), H20 (lx) e NaCl saturado (lx), seca (MgS04) e concentrada para dar um óleo viscoso. O óleo foi dissolvido em DCM:EtOAc 70:30 (150 mL) e arrefecido num banho de gelo. O óleo que se formou foi removido por filtração. O filtrado foi concentrado até um óleo viscoso. Este óleo foi purificado por cromatografia flash usando malha 200-400 mesh, sílica gel de 6,0 nm (60 Â), usando DCM:EtOAc 70:30 como fase móvel, para dar o produto (34,4 g; 63%) na forma de um sólido espumoso amorfo incolor. 'H-NMR (CDC13) 7,42-7,18 (m, 30H), 3,12-3,01 (m, 4H), 2,48-2,27 (m, 6H).
Parte D 4-(Metanossulfonilmetil)benzoato de metilo
Uma solução de 4-(hidroximetil)benzoato de metilo (10,8 g; 0,065 mol) e esponja de protões (19,5 g; 0,091 mol) em DCM (200 mL) foi tratada com anidrido metanossulfónico (13,94 g; 0,08 mol) e agitada à temperatura ambiente durante 20 horas. A mistura reaccional foi lavada com porções de 100 mL de H20 (lx), HC1 1 N (2x), H20 (lx), NaHC03 saturado (lx) e H20 (lx). A fase orgânica foi seca (MgS04) e concentrada para dar 15,5 g de sólido amarelo pálido. A recristalização de CC14 (150 mL) usando carbono descorante deu o produto (14,2 g; 90%) na forma de agulhas incolores; p.f. 91-94 °C.
Parte E N-[4-(Carboxi)benzil]-N,N’-bis[(2-trifenilmetiltio)etil]glicinamida
Uma solução de N,N'-bis[(2-trifenilmetiltio)etil]glicinamida (16,27 g; 0,024 mol) e 4-(metanossulfonilmetil)benzoato de metilo (4,88 g; 0,02 mol) em dicloreto de etileno (200 mL) foi aquecida até refluxo durante 28 horas. A reacção foi lavada com porções de 200 mL de NaHC03 e H20, seca (MgS04) e concentrada até um óleo castanho claro (30 g). Este óleo foi purificado por cromatografia flash usando malha 200-400 mesh, sílica gel de 6,0 nm (60 Á), DCM:EtOAc como fase móvel, para dar o produto (9,9 g; 60%) na forma de um sólido espumoso amorfo incolor. 'H-NMR (CDC13) 7,90 (d, 2H, J = 6,5 Hz), 7,49-7,18 (m, 32H), 3,91 (s, 3H), 3,47 (s, 2H), 3,01 (q, 2H, J = 6,2 Hz), 2,88 (s, 2H), 2,43 (t, 2H, J = 6,2 Hz), 2,39-2,27 (m, 4H).
Parte F N-[4-(Carboxi)benzil]-N,N'-bis[(2-trifenilmetiltio)etil]glicinamida
Uma mistura de N-[4-(carboxi)benzil]-N,N'-bis[(2-trifenilmetiltio)-etil]glicinamida (6,00 g; 7,26 mmol) em dioxano (65 mL) e NaOH 1 N (65 mL) foi agitado à temperatura ambiente durante 24 horas. A mistura foi acidificada com ácido cítrico 2,5 M (100 mL) e o precipitado gomoso que se formou foi extraído para EtOAc (400 mL). A solução de EtOAc foi lavada com H20 (3x200 mL) e NaCl saturado (100 mL), seca (MgS04) e concentrada para dar o produto (5,90 g; 100%) na forma de um sólido espumoso amorfo incolor. 'H-NMR (CDC13) 7,96 (d, 2H, J =8,1 Hz), 7,40-7,16 (m, 32H), 3,71 (s, 3H), 3,49 (s, 2H), 3,00 (q, 2H, J = 5,4 Hz), 2,91 (s, 2H), 2,44 (t, 2H, J = 5,4 Hz), 2,38 2,30 (m, 4H).
Parte G Éster de N-hidroxissuccinimida da N-[4-(carboxi)benzil]-N,N'- -bis[(2-trifenilmetiltio)etil]glicinamida
Uma solução de N-[4-(carboxi)benzil]-N,N'-bis[(2-trifenilmetiltio)-etil]glicinamida (450 mg; 0,55 mmol) e N-hidroxissuccinimida (76 mg; 0,66 mmol) em DCM (10 mL) foi tratada com uma solução de WSCD*HC1 (122 mg; 0,66 mmol) em DCM (7 mL) e foi agitado à temperatura ambiente durante 22 horas. A mistura reaccional foi concentrada e os sólidos redissolvidos em EtOAc (60 mL). A solução de EtOAc foi lavada com H20 (2x25 mL), NaOH 0,1 N (35 mL), H20 (2x25 mL) e NaCl saturado (35 mL), seca (Na2S04) e concentrada para dar o produto (469 mg; 93%) na forma de um sólido incolor.
^SH
Ph3COH
TFA ^nh2 S TEA, 15 min Tf
Brometo de bromoacetil
_-NH Br
Tr
TEA, 24 hr
MS0CH2-^3>'C02CH3
C1CH2CH2C1,65°C
• NH V-\ /—ί~Λ-0Ο20Η3 N^ \=/
IN NaOH
°< NH S I Tr S' i Tr
Dioxano /—/"VcOzH \=/ S I Tr S' I Tr
Tr Tr H05u, WSCD-HC)
Esquema 22 Síntese do ácido N-[2-(benzoiItio)propionil]glicilglicil--γ-amino-butírico (Bz-Me-MAG2-gaba) O composto mencionado em título foi preparado de acordo com o Esquema 23 a partir de N-(2-mercaptopropionil)-glicina (1), o qual está comercialmente disponível em Aldrich. A protecção do grupo tiol no composto 1 é conseguida por reacção com cloreto de benzoílo sob condições básicas para dar o composto 2. O grupo carboxílico pode ser activado pela formação do seu éster de succinimida (3), o qual reage com ácido glicil-y-aminobutírico em solução de metanol a 90% para dar Me-MAG2-gaba protegido por benzoílo (4). Os dados espectrais (IR, 1H-NMR e FAB-MS) são completamente consistentes com a formulação proposta.
O Μδγ^Ν^γ.Ο
COOH
Gli-gaba
Esquema 23 Síntese de Me-MAG2-gaba Protegido por Benzoílo
Passo 1: N-[2-(BenzoiItiol)propionil]glicina (2)
Hidróxido de sódio (4,5 g; 0,109 mol) e N-(2-mercaptopropionil)-glicina (8,20 g; 0,05 mol) foram dissolvidos numa mistura de água (40 mL) e tolueno (30 mL). A temperatura foi baixada até 5-15 °C usando um banho de gelo. Cloreto de benzoílo (4,6 mL; 0,051 mol) em tolueno (10 mL) foi adicionado gota a gota com agitação vigorosa. Após a adição, a mistura foi agitada a 5-15 °C durante outros 30min e em seguida à temperatura ambiente durante 2 h. A camada orgânica foi separada, lavada com H20 (2x20 mL) e descartada. As fracções aquosas foram combinadas e acidificadas até pH~l,5 usando HC1 concentrado formando-se um sólido branco. O precipitado foi -203- recolhido por filtração, lavado com H20 e pequena quantidade de etanol e seco sob vácuo. O rendimento foi de 13,0 g (97%). Anál. Cale8 (encontrada) para Ci2H13N04S: C-53,90 (53,89); H-4,90 (4,81); N-5,24 (5,22). IR (disco de KBr; em cm'1): 3375 (s, nN-H), 3200-2500 (br, n0-H), 1745 (vs, nc=o de tioéster), 1663, 1625 (vs, nc=o de amida e carboxílico). 'H-NMR (DMSO-de, δ em ppm): 1,47 (d, 3H, CH3, J = 7,0 Hz); 3,79 (d, 2H, CH2, J = 5,9 Hz), 4,40 (q, 1H, CH, J = 7,0 Hz) ; 7,53 (m, 2H, =CH) ; 7,69 (m, 1H, -CH) ; 7,90 (dd, 2H, =CH, J = 7,0 Hz) ; 8,59 (t, 1H, NH, J = 5,8 Hz); 12,6 (bs, 1H, COOH). DCI-MS: m/z = 268 ([M+H]+).
Passo 2: Éster de Succinimida de N-[2-(Benzoiltiol)propionil]glicina (3) A uma suspensão de N-hidroxissuccinimida (5,80 g; 0,05 mol) e N-[2-(benzoiltiol)propionil]glicina (13,35 g; 0,05 mol) em THF seco (400 mL) foi adicionado DCC (12,0 g; 0,052 mol) no mesmo solvente (100 mL de THF) a 5-10 °C. A mistura foi agitada a 5-10 °C durante 2 h e em seguida à temperatura ambiente durante 2 dias. À mistura reaccional foram adicionados 2-3 mL de ácido acético e em seguida agitou-se durante mais 2 h. O sólido foi separado por filtração, lavado com 2x150 mL de THF. As fracções orgânicas foram combinadas e o solvente foi removido sob pressão reduzida para dar um sólido branco, o qual foi recolhido, lavado com éter dietílico e seco ao ar. O rendimento foi 14,5 g (80%). Anál. Calca (encontrada) para Ci6Hi6N206S: C-52,72 (52,70); H-4,43 (4,21); N-7,69 (7,69). IR (disco de KBr; em cm'1): 3290 (s, nN.H), 1820 (m, nc=o de succinimida), 1785 (m, éster de n0_H), 1735 (vs, nc=0 de tioéster), 1600 (vs, nc=o de amida). 'H-NMR (CDC13, δ em ppm): 1,57 (d, 3H, CH3, J = 7.0 Hz); 2,79 (s, 4H, CH2); 4,33 (q, 1H, CH, J = 7,0 Hz) ; 4,39 (m, 2H, CH2) ; 7.00 (t, 1H, NH, J = 5,8 Hz), 7,44 (m, 2H, =CH) ; 7,59 (m, 1H, =CH) ; 7 93 (dd, 2H, =CH, J - 7,0 Hz). DCI-MS: m/z = 365 ([M+H]+). -204-
Passo 3: Ácido N-[2-(Benzoiltio)propionil]glicilglicil-y-amino-butírico (Bz-Me-MAG2-gaba) (4) Éster de succinimida de N-[2-(bènzoiltiol)propionil]glicina (1,82 g; 5 mmol) e ácido glicil-y-aminobutírico (0,80 g; 5 mmol) foram suspensos numa mistura de metanol (150 mL) e água (30 mL). A mistura foi aquecida em refluxo durante 5 h, tempo durante o qual a mistura turva se tomou numa solução límpida. A solução foi em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e foi mantida em agitação durante a noite. A evaporação dos solventes sob pressão reduzida deu um sólido branco, o qual foi purificado por lavagem com água e seco em vácuo. O rendimento foi 1,85 g (93%). Anál. Calca (encontrada) para C18H23N306S: C-52,78 (52,69); H-5,66 (5,70); N-10,27 (10,17). IR (disco de KBr; em cm'1): 3380, 3320 (s, nN.H), 3100-2500 (br, π0.η), 1725 (vs, nc=o de tioéster), 1680, 1640, 1624 (vs, nc=o de amida). ‘H-NMR (DMSO-dô, δ em ppm): 1,49 (d, 3H, CH3, J - 7,0 Hz) 1,62 (quint, 2H, CH2, J = 7,1 Hz) ; 2,21 (t, 2H, CH2COOH, J = 7,5 Hz); 3,05 (quart, 2H, NH-CH2, J = 7,0 Hz); 3,67 (d, 2H, NH-CH2, J = 5,7 Hz); 3,75 (d, 2H, NH-CH2, J = 7,0 Hz); 4,42 (q, 1H, CH, J = 7,0 Hz); 7,57 (m, 2H, =CH); 7,70 (m, 1H, =CH); 7,80 (t, 1H, NH, J = 3,0 Hz) ; 7,90 (dd, 2H, =CH, J = 7,0 Hz); 8,14 (t, 1H, NH, J = 5,70 Hz); 8,57 (t, 1H, NH, J = 5,90 Hz), 12,0 (bs, 1H, COOH). DCI-MS: m/z = 410 ([M+H]+). Síntese de N-[2-(Benzoiltio)propionil]glicilglicil-glicina (Bz-Me-MAG3) O composto mencionado em título foi sintetizado conforme descrito para Bz-Me-MAG2-gaba por substituição de ácido glicil-y-aminobutírico por glicilglicina. O rendimento foi de 83%. Anál. Calca (encontrada) para C,6H19N306S: C-50,39 (50,59); H-5,02 (5,78); N-11,02 (10,70). IR (disco de KBr; em cm'1): 3380, 3300 (s, nN.H), 3100-2500 (br, η0-κ), 1738 (vs, n<>o de tioéster), 1680, 1660 (vs, nc=o de amida). 1 H-NMR (DMSO-ú^, δ em ppm): 1,48 -205- (d, 3H, CH3, J = 7,05 Hz), 3,78 (m, 4H, CH2), 3,85 (d, 2H, CH2, J = 6,00 Hz), 4,41 (m, 1H, CH), 7,52 (m, 2H, =CH), 7,70 (m, 1H, =CH), 7,90 (m, 2H, =CH), 8,15 (t, 1H, NH, J = 3,00 Hz), 8,51 (t, 1H, NH, J = 3,00 Hz), 8,80 (t, 1H, NH, J = 3,00 Hz). FAB-MS: m/z = 382 ([M+H]+). ESI-MS: m/z = 381,9 ([M+H]+). Síntese de Ácido N-[2-(BenzoiItio)propionil]glicilglicil-4-amino--metilciclo-hexanocarboxílico (Bz-Me-MAG2-ACA) A síntese de Bz-Me-MAG2-ACA envolve vários passos (Esquema 24). O composto 1 pode ser facilmente convertido ao seu cloreto 2, o qual reage com ácido 4-/ra«s-aminometilciclo-hexanocarboxílico para dar o composto 3. A desprotecção de 3 usando hidrazina em etanol, seguido por adição de HC1 produz 4. A reacção de 4 com Bz-Me-MAG-Succ em metanol na presença de Et3N produziu Bz-Me-MAG2-ACA (5).
1 k*. « SOC12/CHC13 O^N O-i-
COOH O
3 2
1. NH2NH2 2. HC1 "
4
Esquema 24 Síntese de Bz-Me-MAG2-ACA
Passo 1: Cloreto de ftaloilglicilo
Ftaloilglicina (40 g) foi suspensa em clorofórmio (400 mL), seguida pela adição de cloreto de tionilo (60 mL). A mistura foi aquecida em refluxo durante 2 h, tempo durante o qual a mistura se tomou numa solução límpida homogénea. O solvente e excesso de cloreto de tionilo foram removidos sob pressão reduzida para dar um sólido esbranquiçado, o qual foi seco em vácuo e usado sem mais purificação. O 'H-NMR foi consistente com a estrutura proposta.
Passo 2: Ácido 4-fra/is-[(ftaloilglicil)aminometil]ciclo-hexanocarboxílico Ácido 4-íra«5,-aminometilciclo-hexanocarboxílico (7,85 g; 50mmol) e K2C03 (5 g; 50 mmol) em DMF (150 mL). À suspensão foi adicionado cloreto de ftaloilglicilo (11,85 g; 50 mmol) em acetonitrilo (150 mL). A mistura reaccional foi refluxada durante 3 h e em seguida filtrada enquanto quente. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida para dar um óleo. Aquando da adição de éter dietílico (50 mL), formou-se um sólido branco. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com éter dietílico e seco ao ar. O rendimento foi de 10,32 g (60%). 1 H-NMR (DMSO-dó, δ em ppm relativamente a TMS): 0,87-2,00 (m, 9H, CH2 e CH de anel ciclo-hexano), 2,10 (m, 1H, CHCOOH), 2,92 (t, 2H, CH2, J = 4,6 Hz), 4,19 (s, 2H, CH2), 7,85 (m, 4H, -CH=), 8,21 (t, ΙΗ,ΝΗ, J = 4,l Hz).
Passo 3: Hidrocloreto do Ácido glicil-4-/‘ra/i5-(aminonietil)ciclo-hexano- carboxílico (Gly-ACA*HC1) A uma suspensão de ácido 4-íra«s-[(ftaloilglicil)aminometil]ciclo--hexanocarboxílico (10,32 g; 30 mmol) em etanol (300 mL) foi adicionado hidrato de hidrazina a 85% (100 mL). A mistura foi aquecida em refluxo durante 12 h, tempo durante o qual se formou um precipitado branco. Depois do solvente ser removido, foi adicionado ao resíduo HC1 2 N (200 mL). A mistura foi aquecida até 60-70 °C durante 20 min e o sólido foi separado por filtração e descartado. O filtrado foi concentrado até 1/3 do seu volume original. A mistura foi arrefecida num banho de gelo durante 2 h. O precipitado foi recolhido por filtração, lavado com uma pequena quantidade de água e etanol e seco sob vácuo. O rendimento foi de 3,45 g (45%). 'H-NMR (D20, δ em ppm relativamente a TMS): 1,04 (m, 2H, CH2), 1,45 (m, 2H, CH2), 1,57 (m, 1H, CH), 1,81-2,05 (m, 4H, CH2), 2,35 (m, 1H, CHCOOH), 3,15 (d, 2H, CH2, J = 4,9 Hz), 3,81 (s, 2H, CH2).
Passo 4: Ácido N-[2-(BenzoiItio)propionil]glicilglicil-4-amino-inetilciclo--hexanocarboxílico (Bz-Me-MAG2-ACA)
Gly-ACA*HC1 (1,25 g; 5 mmol), Et3N (1,0 g; lOmmol) e Bz-Me-MAG-Succ (1,82 g; 5 mmol) foram suspensos numa mistura de metanol (200 mL) e acetonitrilo (100 mL). A mistura foi refluxada durante a noite. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida para dar um resíduo sólido branco, ao qual foi adicionado HC1 6N (10 mL). O sólido foi separado por filtração, lavado com água e uma pequena quantidade de etanol e seco em vácuo. O rendimento foi de 1,35 g (58%). Anál. Calca (encontrada) para C22H29N306S: C-57,00 (58,41); H-6,31 (6,70); N-9,06 (9,72). IR (disco de KBr; em cm’1): 3600-2000 (br, OH—N); 3270 (s, nN.H), 1720, 1655, 1625 e 1565 (vs, η<>ο). FAB-MS: m/z = 464 (M+l). 1 H-NMR (DMSO-í^, δ em ppm relativamente a TMS): 0,81-1,90 (m, 9H, CH2 e CH de anel de ciclo-hexano), 1,48 (d, 3H, CH3, J = 5,2 Hz), 2,10 (t, 1H, CHCOOH, J = 9,0 Hz), 2,91 (t, 2H, CH2, J = 4,6 Hz), 3,68 (d, 2H, CH2, 4,2 Hz), 3,75 (d, 2H, CH2, J = 4,1 Hz), 4,42 (q, 1H, CH, J = 5,2 Hz), 7,50 (t, 2H, -CH=, J - 5,8 Hz), 7,71 (t, 2H, -CH=, J = 5,4 Hz), 7,91 (d, 1H, -CH=, J = 6,4 Hz), 8,14 (t, 1H, NH, J - 4,2 Hz), 8,60 (t, 1H, NH, J = 4,1 Hz), 12,00 (bs, 1H, COOH). Síntese de Ácido 3,4-Bis[3-(benzoiItioacetil)amido]benzóico (Bz-MABA) A uma solução de cloreto de S-benzoiltioacetilo (8,69 g; 40 mmol), -208 - -208 -
preparado recentemente a partir da reacção de ácido S-benzoiltioacético com excesso de cloreto de tionilo em clorofórmio, em THF seco (300 mL) foi adicionado ácido 3,4-diaminobenzóico (3,04 g; 20 mmol) enquanto a reacção vira para castanho. A solução foi refluxada durante a noite, formando-se um precipitado. A mistura foi arrefecida e o sólido foi separado por filtração, lavado com THF, etanol e éter dietílico e seco em vácuo para dar um sólido cinzento pálido. O rendimento foi de 5,8 g (54%). Anál. Cale3 (encontrada) para C25H2oN206S2: C-59,04 (58,82); H-3,96 (4,04); N-5,51 (5,46). IR (disco de KBr; em cm'1): 3600-2000 (br, OH—N); 3340 (s, nN.H), 1690, 1670, 1655, 1610 e 1595 (s ou m, nc=o)· FAB-MS: m/z = 509 (M+l). 'H-NMR (CDC13, δ em ppm relativamente a TMS): 4,12 e 4,14 (s, 4H, CH2), 7,50-8,30, (m, 13H, HH aromáticos), 9,85 e 9,89 (s, 2H, NH), 12,99 (bs, 1H, COOH). Síntese de Éster de Etilo de 2-(S-Trifenilmetilmercapto)etilaminoacetil--S-trifenilmetil-L-cisteína (T r2-MA-MAMA)
a: Trifenilmetanol, TFA; b: brometo de bromoacetilo, TEA, THF; c: S-trifenilmetil-2-aminoetanotiol, TEA, cloreto de metileno
Esquema 25 Éster de etilo de S-trifenilmetil-L-cisteína (2) A uma solução de hidrocloreto do éster de etilo de L-cisteína (18,6 g; 0,1 mol) em 200 mL de TFA foi adicionado trifenilmetanol (52 g; 0,2 mol). A solução castanha escura resultante foi deixada em agitação durante 2 h à temperatura ambiente sob azoto. O solvente foi removido em vácuo e foi adicionado etanol (100 mL) ao resíduo. Uma solução 1 M de etóxido de sódio (50 mL) foi adicionada à solução etanólica e agitada durante 90 minutos, tempo durante o qual a solução virou turva. A mistura foi filtrada, o filtrado foi concentrado em vácuo para dar um resíduo oleoso. A cromatografia flash em coluna usando acetato de etilo:hexano (1:3) e acetato de etilo deu o produto desejado (contendo algum acetato de etilo, o qual é difícil de remover) que foi guardado em vácuo. Éster de etilo de N-bromoacetil-S-trifenilmetil-L-cisteína (3)
Uma solução de éster de etilo de S-trifenilmetil-L-cisteína (18 g; 46 mmol) e trietilamina (6,4 mL; 46 mmol) em THF seco (250 mL) sob azoto foi arrefecida até 0 °C. Uma solução de brometo de bromoacetilo (9,28 g; 46 mmol) em THF seco (60 mL) foi adicionada gota a gota e durante esse tempo a solução virou turva. A mistura reaccional foi agitada a 0 °C durante 1 h e em seguida à temperatura ambiente durante 1 h. A mistura reaccional foi filtrada e o filtrado foi concentrado em vácuo para dar um óleo. O óleo foi repartido entre cloreto de metileno e água (60 mL cada), a camada orgânica foi lavada com HC1 a 5%, NaHCC>3, seca (sobre sulfato de magnésio), filtrada e os voláteis foram removidos para dar o produto desejado (69%). - 210 -
Éster de etilo de 2-(S-trifenilmetilmercapto)etilaminoacetil-S- -trifenilmetíl-L-cisteína (4) A uma solução de éster de etilo de N-bromoacetil-S-trifenilmetil-L--cisteína (1,0 g; 1,98 mmol) e trietilamina (0,4 mL; 2,9 mmol) em cloreto de metileno (10 mL) foi adicionado S-trifenilmetil-2-aminoetanotiol (0,64 g; 2,0 mmol). A mistura reaccional foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante sete dias. Foi adicionada água (10 mL). A camada orgânica foi lavada com NaHC03 (2x10 mL), água (2x10 mL) e água salgada (10 mL), seca (sobre sulfato de magnésio) e concentrada em vácuo para dar um produto espumoso. A cromatografia flash usando acetato de etilo:hexano (3:1) deu o produto com rendimento de 22%. MS (M+H) = 751; calculado: 751,3. A síntese de um quelante que tem um grupo ácido carboxílico único disponível para ligação ao ligante é mostrada no Esquema 26. A síntese começa com a N-alquilação de Cys(Acm)OMe com bromoacetaldeído-acetal dimetílico. A amina secundária do produto de alquilação é agora protegida de outra reacção com o grupo Teoc. Outros grupos de protecção que são estáveis não só em ácido suave mas também em base suave e que podem ser removidos na presença de enxofre também podem ser usados. O grupo Teoc é introduzido pelo uso de /?-nitrofenilcarbonato de 2-(trimetilsilil)etilo. O acetal é agora hidrolisado com ácido aquoso suave e o aldeído é aminado redutivamente com S-trifenilmetil-2--aminoetanotiol. A amina livre do quelante é protegida com o grupo Teoc e o éster de metilo é hidrolisado com base aquosa para dar o ácido carboxílico pronto para reacção com o grupo reactivo de um composto cíclico modificado por ligante.
C02Me
BrCH2CH(OMc)2 (MeO)2CH·
COíMe Acm
Teoc-OpNP (MeO)2CH—\Teoc
C02Me Acm 1) h2o.h+ 2) NaCNBH3
NH2
Teoc N' COaMc Acm
J 1) Teoc-OpNP 2) NaOH, H20
Acm
Acm Acm
Esquema 26
Um quelante que tem uma amina adicional disponível para conjugação com o composto cíclico modificado por ligante pode ser sintetizado de acordo com o procedimento do Esquema 27. O ácido tioglicólico protegido por Acm será acoplado a N-í-butoxicarboniletilenodiamina usando qualquer dos métodos de acoplamento padrão da síntese de péptidos. O grupo de protecção Boc será removido usando TFA e a amina resultante será acoplada a Boc-Cys(Acm)-OH. A remoção do grupo de protecção Boc proporciona o quelante com S protegido numa forma apropriada para reacção com o grupo reactivo de um composto cíclico modificado por ligante. -212-
I Aon
H2NCH2CH2NH-Boc HBTU
NH-Boc i Aon
TFA
Am
Boc-Cys(Acm)-OH HBTU
Esquema 27
Também são sujeitos desta invenção os reagentes da fórmula (QL„)d Qi para marcação radioactiva, os quais compreendem mais do que um intermediário de composto cíclico modificado por ligante ligado a um quelante bem como reagentes da fórmula (Q)d· L„-Ch, que tem dois ou mais intermediários de composto cíclico ligados a um ligante comum que também suporta um quelante.
Um exemplo de um reagente que compreende dois intermediários de composto cíclico modificado por ligante ligados a um quelante é mostrado abaixo (Esquemas 28 e 29). Outros exemplos representativos são mostrados nos esquemas seguintes. Neste esquema, grupos amina em dois compostos intermediários com ligante reagem com os dois grupos ésteres activados mostrados para produzirem um composto desta invenção de fórmula (QLn)2 Q . -213-
Esquema 28 O grupo de protecção de enxofre, Pg, mostrado acima, tal como todos os grupos Pg aqui reivindicados, pode ser qualquer grupo de protecção de enxofre capaz de ser deslocado na reacção com o nuclido de metal. Tais grupos de protecção são bem conhecidos dos peritos na técnica. Exemplos de protecção adequada são ensinados nas Patentes dos E.U.A. Nos 4 897 255, 4 965 392 e 4 980 147.
Desprotecção
I 11 ~ 99mTc
ο
QL Γ\ Ο
ΝΗ ΗΝ /LflQ
SH HS
Esquema 29
Os quelantes úteis na síntese de tais reagentes são descritos em Chervu et al., Patente dos E.U.A. 4 883 862 e Bergstein et al., Patente dos E.U.A. 5 279 811. A síntese de outros quelantes úteis é descrita nos esquemas seguintes.
Os exemplos seguintes ilustram como três de tais quelantes podem ser preparados. O Esquema 30 esboça a síntese do ligando de N2S2 que tem dois grupos ácido carboxílico aos quais o composto cíclico de marcação pode ser conjugado. A síntese começa com uma reacção de alquilação nas duas aminas de -215- ácido DL-2,3-diaminossuccínico (Sigma Chemical Co.), usando S-trifenilmetil-2--bromoetanotiol. As aminas secundárias devem agora ser protegidas para evitar a autocondensação quando os ácidos carboxílicos são activados. Isto pode ser conseguido com qualquer dos grupos de protecção de amina padrão. Os grupos Z serão uma boa escolha porque podem ser removidos sob condições acídicas (HBr/HOAc ou TFA/ácido trifluorometanossulfónico) ao mesmo tempo que a protecção por tritilo no enxofre. ho2c.co2h >—c + Tr-S'^ ^Br El3N h2n nh2 HOjC C02H /—c rfi fh Z-Cl ho2c. ,co2h .N N r z z ί Ht3N Tr Tr Tr f Tr
Esquema 30 A síntese de um segundo N2S2 que tem dois grupos ácidos carboxílicos é mostrada no Esquema 31. A alquilação do ácido etilenodiamina--Ν,Ν'-dipropiónico (American Tokyo Kasei) com S-trifenilmetil-2-bromoetano-tiol dará o N2S2 pronto para conjugação. As aminas são terciárias e não é requerida protecção adicional.
-216- H02C
co2h
Br ho2c c
co2h
Esquema 31 O Esquema 32 esboça a síntese de um ligando de N2S2 que tem dois grupos aminas adicionais para conjugação com compostos cíclicos de marcação que suportam grupos electrofílicos reactivos (e. g., ésteres activos). Uma reacção de aminação redutora entre benzilamina e glioxal dá Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina. A alquilação das duas aminas com N-(3-bromopropil)ftalimida dará a tetramina completamente protegida. A protecção por benzilo nas duas aminas secundárias será removida por redução catalítica e as aminas livres serão então alquiladas com S-trifenilmetil-2-bromoetanotiol para dar o ligando completamente protegido. A desprotecção selectiva das aminas primárias será realizada com hidrazina. -217-
HCO-CHO NaCNBH3
Bzl-NH' ,ΝΗ-Βζΐ
Phih.N-(CHj)3-Br
Bzl N^^^N-Phth
H2. PdC
N-Phih
Phih-N
N-Phih 1) NH2NH2
2) NaOH
H2N
nh2
Esquema 32
Os reagentes que têm dois grupos de marcação e um quelante ligado a um ligante comum podem ser sintetizados de acordo com o caminho mostrado no Esquema 33. A reacção de benzilamina com N-(3-bromopropil)ftalimida produzirá N,N-bis(3-ftalimidopropil)benzilamina (Niitsu e Samejima, Chem. Pharm. Bul., 34 (1986) 1032-1038). O tratamento com hidrazina removerá os grupos de protecção de ftalimido. N,N-Bis(3-aminopropil)benzilamina reagirá em seguida com anidrido succínico para dar o diácido, o qual será convertido ao bis-éster activo com DCC e N-hidroxissuccinimida. Este bis-éster activo será em seguida conjugado com um composto cíclico modificado por ligante. A -218- hidrogenação para remover o grupo de protecçào benzilo e a conjugação com um quelante activado produzirão o produto final.
Esquema 33
Bzl-NH2
Phih-(CH2)rBr
N-Phth
1) NH2NH2 2) NtOH
1) Anidrido succínico 2) HOSu, DCC *
SuO
0 C02Su
Q.DMF
Q-CO
-A
CO-Q 0
Q-CO ^ N ^· Quelante ‘íí 0 1. H2, Catalisador 2. Quelante activado
CO-Q
Mais do que dois compostos Q e mais do que um quelante podem ser unidos em conjunto usando iniciadores ou dendrímeros de cascata como ligantes. Os dendrímeros são construídos adicionando segmentos ramificados num núcleo funcionalizado, produzindo um produto que tem duas vezes o número de grupos funcionais como núcleo original. Este adição de unidades -219- ramificadas pode ser realizada através de várias gerações para produzir moléculas polifuncionais grandes. Um exemplo são os dendrímeros PAMAM (poliamidoamina) (Aldrich Chemical Co.), os quais usam etilenodiamina como núcleo iniciador. O Esquema 34 mostra a preparação generalizada de um produto radiofarmacêutico à base de dendrímero PAMAM contendo compostos cíclicos de marcação e quelantes numa razão de 2:1. Para esta estrutura um dendrímero de geração = 0 (n = 1) terá dois compostos cíclicos de marcação e um quelante. Um dendrímero de geração = 1 (n = 2) terá quatro compostos cíclicos de marcação e dois quelantes. A razão e o número absoluto de compostos cíclicos de marcação e quelantes serão controlados pela estequiometria das reacções de conjugação.
Esquema 34
j 1 equivalente de | quelante activado 0 0 Q'NHv/sA_ NH- Quelante o 0 „ * n .
Um sistema semelhante, chamado sistema de péptido de antígeno múltiplo (MAP) foi desenvolvido por Posnett, McGrath e Tam, J. Biol. Chem., 263 (1988) 1719 para facilitar a geração de antibióticos. Este sistema constrói uma rede de ramificação num suporte sólido usando os dois grupos amino de lisina. Porque os dois grupos amino na lisina podem ser protegidos ortogonalmente, este sistema permite um nível de controlo mais alto das reacções de conjugação. No Esquema 35 um sistema MAP terminando em quatro grupos lisina é primeiro conjugado com quatro compostos cíclicos de marcação nos grupos α-amino e deles a quatro quelantes nos grupos ε-amino.
Boc-Ly'
Fmoc
Boc-Lys
Lys-Beta-Ala
1) TFA 2) Q 3) E'2NH 4) Quelante
Activado
Quelante
Quelante
Quelante
Glys
Lys-Beta-A!a
Esquema 35 Síntese de Compostos Marcados Radioactivamente
Os compostos plaqueta glicoproteína Ilb/IIIa cíclicos da presente invenção podem ser sintetizados usando métodos sintéticos padrão conhecidos dos peritos na técnica, usando radioisótopos de halogéneos (tais como cloro, flúor, bromo e iodo), tecnécio e índio, bem como outros. Preferivelmente os radioisótopos incluem 123I, l251,13II, 99mTc e nlIn.
Os compostos plaqueta glicoproteína Ilb/IIIa cíclicos da invenção podem ser marcados quer directamente (isto é, por incorporação da radiomarcação directamente nos compostos) quer indirectamente (isto é, por incorporação da radiomarcação nos compostos através de um quelante que tenha sido incorporado nos compostos). Por marcação directa, conforme os peritos na técnica reconhecerão, a marcação pode ser isotópica ou não isotópica. Com marcação isotópica, um grupo já presente no composto cíclico é substituído pelo (trocado pelo) radioisótopo. Com marcação não isotópica, o radioisótopo é adicionado aos compostos cíclicos sem substituição por (troca por) um grupo já existente.
Geralmente, os compostos marcados são preparados por procedimentos que introduzem o átomo marcado numa fase mais tardia da síntese. Isto permite rendimentos radioquímicos máximos e reduz o tempo de manuseamento de materiais radioactivos. Quando se lidam com isótopos de meia-vida curta, uma consideração principal é o tempo requerido para conduzir os procedimentos de síntese e os métodos de purificação. Os protocolos para a síntese de produtos radiofarmacêuticos são descritos em: Tubis e Wolf, Eds., "Radiopharmacy", Wiley-Interscience, Nova Iorque, 1976; Wolf, Christman, Fowler, Lambrecht, "Synthesis of Radiopharmaceuticals and Labeled
Compounds Using Short-Lived Isotopes", in " Radiopharmaceuticals and Labeled Compounds", 1973, Vol. 1,345-381. Vários procedimentos podem ser empregues na preparação de compostos da invenção marcados radioactivamente onde a marcação radioactiva é um halogéneo. Algumas metodologias de síntese comuns para a marcação de halogéneo isotópico de compostos aromáticos tais como do tipo aqui presente são reacções de iododesdiazonização, iododesboração, iododesestanhização, iododessilização, iododestalização e permuta de halogéneo. A metodologia de síntese mais comum para a marcação de halogéneo não isotópico de compostos aromáticos tais como os do tipo aqui presente é a de iododesprotonação e a de reacções de substituição aromática electrofílica. Tais métodos e procedimentos adicionais são descritos em Merkushev, Synthesis, (1988) 923 e Seevers et ai, Chem. Rev., 82 (1982) 575. A título de exemplo, derivados 4, 5 e 6-halo de ácido f-butiloxicar-bonil-3-aminometilbenzóico radiomarcados isotopicamente podem ser preparados usando os procedimentos gerais acima descritos para a síntese dos compostos não marcados. Quando se realiza tal radiomarcação, é importante que a meia-vida do isótopo escolhido seja muito maior do que o tempo de manuseamento das sequências de reacção. Materiais de partida conhecidos incluem os ácidos 2, 3 e 4-iodo(123I, 125I e 131I)benzóico.
Os derivados de Mamb marcados radioactivamente com iodo também podem ser preparados isotopicamente a partir de anilinas pela reacção de Sandmeyer conforme descrito em Ellis et al, Aust. J. Chem., 26 (1973) 907.
Altemativamente, tais compostos podem ser preparados por meio de marcação isotópica a partir de derivados de bromo ou iodo não marcados por várias sequências de reacção de dois passos, tais como através do uso de «synthons» de trialquilsililo conforme descrito em Wilson et al, J. Org. Chem., 51, (1986) 483 e Wilbur et al, J. Label. Compound. Radiopharm,, 19 (1982) 1171, uso de «synthons» de trialquilsililo conforme descrito em Chumpradit et al, J. Med. Chem., 34 (1991) 877 e Chumpradit et al., J. Med. Chem., 32 (1989) 1431, e uso de «synthons» de ácido borónico conforme descrito em Kabalka et al., J. Label. Compound. Radiopharm,, 19 (1982) 795 e Koch et al, Chem. Ber., 124 (1991) 2091. Tais transformações sintéticas são delineadas no Esquema 36 abaixo.
Boo-HN
COjH 1. HMOj BooHN
>'Vv^'^sy^C02H u. t 1.HNO, ZCuBrof Kl
1. BuU 2. R.SiCI I.BuU ZR^nCI 1. Buli 2. B(OR),
β(οη)2
Esquema 36
Ainda que o protocolo precedente possa ser empregue na preparação de compostos marcados radiactivamente da presente invenção, para maximizar rendimentos radioquímicos, para reduzir o tempo de manuseamento de materiais radioactivos e para preparar compostos marcados com halogéneo de meia-vida curta, é preferível realizar a marcação com halogéneo isotópico como um dos passos finais na síntese do composto cíclico. O que se segue proporciona procedimentos exemplares para tais marcações em fase tardia.
Os compostos de iodo não marcados são precursores versáteis que podem ser convertidos aos derivados marcados por qualquer das sequências de reacção de dois passos acima descritas. A funcionalidade útil para incorporar na porção Mamb do composto cíclico inclui os grupos bromo, nitro, trialquilsililo, trialquilestanho e ácido borónico. A síntese e aplicação de cada um dos precursores são descritas acima. O meio complexo mínimo de radioiodação dos compostos cíclicos da presente invenção via marcação isotópica durante as fases finais da sua preparação é a substituição de iodo radioactivo por um átomo de iodo estável já presente na molécula. Isto pode muitas vezes ser feito por aquecimento do composto com iodo radioactivo num solvente apropriado conforme descrito em Ellis et al., Aust. J. Chem., 26 (1973) 907. Quando aplicado a iodos aromáticos, as quantidades extremamente pequenas e baixa concentração de iodo radioactivo empregue leva à incorporação de actividade específica apenas modesta. Esta sequência de reacção é delineada no Esquema 37.
Esquema 37
Os compostos cíclicos também podem ser isotopicamente marcadas por iodo durante as fases finais da sua preparação a partir de anilinas pela reacção de Sandmeyer conforme descrito em Ellis et al, Aust. J. Chem., 26 (1973) 907. Esta aproximação leva a um composto cíclico marcado com actividade específica alta. Para evitar complicações na síntese do composto cíclico, o grupo nitro proporciona um «synthon» ideal para a anilina.
Altemativamente, os compostos cíclicos podem ser isotopicamente marcados tarde no esquema de reacção a partir de derivados de bromo ou iodo não marcados por várias sequências de reacção de dois passos, conforme descrito acima, tal como através do uso de «synthons» de trialquilsililo conforme descrito em Wilson et al, J. Org. Chem., 51, (1986) 4833 e Wilbur et al, J. Label. Compound. Radiopharm,, 19 (1982) 1171, através do uso de «synthons» de trialquilsililo conforme descrito em Chumpradit et al, J. Med. Chem., 34 (1991) 877 e Chumpradit et al., J. Med. Chem., 32 (1989) 1431, e através do uso de «synthons» de ácido borónico conforme descrito em Kabalka et al, J. Label. Compound. Radiopharm,, 19 (1982) 795 e Koch et al., Chem. Ber., 124 (1991) 2091.
Uma aproximação relacionada onde a radiomarcação por halogéneo isotópico pode ser realizada tarde no esquema de síntese envolve a conversão de derivados de Mamb substituído a compostos cíclicos que já incorporam os grupos trialquilsililo, trialquilestanho ou ácido borónico. A síntese de cada derivado de -226-
Mamb foi descrita numa secção anterior.
As transformações sintéticas precedentes nos compostos cíclicos são delineadas no Esquema 38.
Gry N-fceíToiJArg^ ''s*A»p(OeH·*) / \
Esquema 38 -227-
Os derivados de iodo marcados também podem ser prontamente preparados de forma não isotópica a partir de compostos cíclicos substituídos por amino, hidroxi ou metoxi conforme descrito em Arora et al., J. Med. Chem., 30 (1987) 918. As reacções de substituição aromática electrofílica são melhoradas pela presença de tais substituintes dadores de electrões. Esta sequência de síntese é delineada nos Esquemas 39 e 40. .ciy. N-M «fToiJA rg
I D-Val
Atp(QcHex) m o
NO,
Ht RlNf
39 Esquema -228-
Ν-Μ·(Το*)Αγ8 D-V»l
Gly
*Atp(OeHex) MS OMe I.HF.PhOMt L1FA.HPLC ' '
Esquema 40
Numa aproximação alternativa à incorporação de um halogéneo radiomarcado, os compostos cíclicos substituídos por metilo podem ser convertidos ao derivado α-halotolueno com NBS ou NCS sob condições de halogenação de radical livre. Os haletos benzílicos podem ser suavemente trocados por iodeto radiomarcado através de uma reacção de substituição nucleofilica. Esta sequência sintética é delineada no Esquema 41.
-229-
Esquema 41
Ainda que primariamente ilustrados para os compostos marcados radioactivamente por iodo, a química de processo acima descrita pode ser usada para preparar qualquer isótopo de halogéneo radioactivo.
Os derivados 18F destes compostos cíclicos podem ser preparados por conjugação de intermediários de fenilo funcionalizados com F. Os compostos de fenilo funcionalizados com 18F podem ser preparados conforme mostrado no Esquema 42 (R. H. Mach et al., J. Med. Chem., 36 (1993) 3707-3720). A reacçâo de p-trimetilamónio-benzaldeído com [18F]CsF/DMF aquosa a 120 °C durante lOmin ([ F]KF aquoso/kryptofix/ACN pode também ser usada para originar os compostos de F-fenilo a partir dos grupos trimetilamónio ou nitro correspondentes), seguido por LAH/THF/pentano e Hl io ' aquoso a 57% dá o iodeto de p- F-benzilo.
CHO N(CH3)3+ OTf
Esquema 42 A reacção com a funcionalidade amina do intermediário do composto cíclico ciclo(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) ou composto cíclico modificado por ligante ciclo(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) pode dar 18 os produtos marcados com F adequados para uso em tomografia de emissão de positrão (PET):
NH
NH
NH 1ΘΡ
N H
0 Vários procedimentos podem também ser empregues na preparação de compostos da invenção marcados radioactivamente onde a radiomarcação é um metal, tal como quando a radiomarcação é tecnécio ou índio. Estes procedimentos são utilizados para a marcação de compostos desta invenção de fórmulas: (QLn)d Q, e (Q)d' Ln-Ch. Procedimentos exemplares para tais -231 - marcações com tecnécio ou índio são reveladas, por exemplo, em Cerqueira et al, Circulation, Vol. 85, N° 1 (1992) 298-304, Pak et al, J. Nucl. Med., Vol. 30, N° 5, p. 793, "36th Ann. Meet. Soc. Nucl. Med." (1989), Epps et al, J. Nucl. Med., Vol. 30, N° 5, p. 794, "36th Ann. Meet. Soc. Nucl. Med." (1989), Pak et al, J. Nucl. Med., Vol. 30, N° 5, p. 794, "36th Ann. Meet. Soc. Nucl. Med." (1989) e Dean et al, J. Nucl. Med., Vol. 30, N° 5, p. 794, "36th Ann. Meet. Soc. Nucl. Med." (1989).
Em aditamento, são proporcionados procedimentos específicos nos exemplos abaixo.
Um outro método útil para a marcação de compostos cíclicos da presente invenção envolve a preparação de um quelante de 99mTc (ao nível de traçador) e conjugando-o ou a um intermediário de composto cíclico ou a um composto cíclico modificado por ligante. Este método é chamado de aproximação pré-quelato. Conforme mostrado, por exemplo, no esquema abaixo, o ácido 4,5-bis(S-benzoil)mercaptoacetamidopentanóico (1) é complexado com 99mTc04 sob condições de redução para formar (2). Em seguida, (2) é convertido ao éster activo (3) que contém o grupo tetrafluorofenilo. O complexo (3) pode em seguida reagir com um intermediário de composto cíclico apropriado tal como (5) ou (6), para produzir os compostos marcados radioactivamente (4). Um outro quelante de tecnécio apropriado é o ácido 2,3-bis(S-benzoil)mercaptoacetamido--propanóico (7). A purificação por HPLC do complexo de 99mTc pode ser realizada em cada passo. Esta aproximação é delineada no Esquema 43. -232-
I I ΒΖ Βζ (1) BzsBenzoílo rC'
ν\?„ν I S S' (2) co2h
NHR (3) (4) RNHj = w σ°γ\ Η ΗΝ'^Ο
CO2H ΝΗ
HaN*
(5)
COjH COjH Γ\ ην^,ο 'S S' I I Βζ Βζ(7) Βζ = Benzoílo
Esquema 43
Exemplos
Secção A Reagentes para Marcação Radioactiva
Exemplo 1
Conj ugado ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca))--N-[4-(carboxi)benzil]-N,N'-bis[(2-trifenilmetiltio)etil]-glicinainida
Uma solução de éster de N-hidroxissuccinimida de N-[4-(carboxi)-benzil]-N,N'-bis[(2-trifenilmetiltio)etil]glicinamida (0,017 mmol), ciclo-(D-Val--NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) (13,9 mg; 0,015 mmol) e Et3N (6,25 pL; 0,045 mmol) em DMF (350 pL) foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante 14 horas. O progresso da reacção foi monitorizado por TLC em fase normal (CHCl3:MeOH:HOAc 90:8:2) usando os testes de ninidrina e Sakaguchi. A DMF foi removida sob pressão reduzida. O conjugado foi purificado usando HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,1 cm) usando um gradiente a 1,0%/min de 18 até 36% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido incolor felpudo (11 mg; 53%); FAB-MS: [M+H] = ?.
Exemplo 2
Conj ugado ciclo-(D-Ly s-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)--N-[4-(carboxi)benzil]-N,N'-bis[(2-trifenilmetiltio)etil]-glicinamida
Uma solução de éster de N-hidroxissuccinimida de N-[4-(carboxi)-benzil]-N,N'-bis[(2-trifenilmetiltio)etil]glicinamida (30 mg; 0,033 mmol), ciclo--(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (23,8 mg; 0,029 mmol) e Et3N (12 pL; 0,087 mmol) em DMF (0,60 mL) foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante 63 horas. O progresso da reacção foi monitorizado por TLC em fase normal (CHCl3:MeOH:HOAc 90:8:2) usando os testes de ninidrina e Sakaguchi. A DMF foi removida sob pressão reduzida. O conjugado foi purificado usando HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa (2,1 cm) usando um gradiente a 0,9%/min de 18 até 36% de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA e em seguida liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido incolor felpudo (24 mg; 60%); ESI-MS: [M] = 1397,3.
Exemplo 3
Sal TFA de ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb--(N-hidrazino-nicotinil-5-Aca))
Parte A Síntese de sal TFA de ciclo-(D-VaI-NMeArg-Gly-Asp-Mamb-(N-boc-hidrazino-nicotinil-5-Aca)) A uma solução de ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) (10 mg; 0,011 mmol), boc-hidrazinonicotinato de succinimidilo (4,6 mg; 0,0132 mmol) em DMF (0,3 mL) foi adicionada trietilamina (0,0061 mL; 0,044 mmol) e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 24 horas. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo dissolvido numa solução de acetonitrilo-água e liofilizado durante a noite para dar um sólido esbranquiçado. A purificação de parte do produto foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa usando um gradiente a 2,0%/min de acetonitrilo aquoso a 6,3-72% contendo 0,1% de TFA e liofilizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido felpudo. MS (M+H = 938,4849; cale. 938,4848).
Parte B Desprotecção dando o sal de TFA de ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly--Asp-Mamb(N-hidrazinonicotinil-5-Aca))
Sal de TFA de ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-boc-hi-drazino-nicotinil-5-Aca)) foi dissolvido numa mistura de TFA:anisole 98:2 (2 mL) e a mistura reaccional foi agitada durante 15 min. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo dissolvido numa solução de actonitrilo-água e liofílizado para dar um sólido branco. A purificação foi conseguida por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa usando um gradiente a 2,0%/min de acetonitrilo aquoso a 6,3-72% contendo 0,1% de TFA e liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido felpudo. MS (M+H = 838,4324; calc. 838,4324).
Exemplo 4
Sal TFA de ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb--(N-hidrazinonicotiniI-5-Aca))
Parte A Síntese de sal TFA de ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb- (N-boc-hidrazino-nicotinil-5-Aca)) A uma solução de sal de TFA de ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp--Mamb(5-Aca)) (10 mg; 0,0109 mmol), boc-hidrazinonicotinato de succinimidilo (4,55 mg; 0,0131 mmol) em DMF (0,4 mL) foi adicionada trietilamina (0,0061 mL; 0,044 mmol) e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 24 horas. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo dissolvido numa solução de acetonitrilo-água e liofílizado durante a noite para dar um sólido esbranquiçado. A purificação de parte do produto foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa usando um gradiente a 2,0%/min de acetonitrilo aquoso a 6,3-72% contendo 0,1% de TFA e liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido felpudo. MS (M+H = 924,4699; calc. 924,4692).
Parte B Desprotecção dando o sal de TFA de ciclo-(D-Abu-NMeArg- -Gly-Asp-Mamb(N-hidrazinonicotinil-5-Aca))
Sal de TFA de ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-boc-hi- -236- drazinonicotinil-5-Aca)) foi dissolvido numa mistura de TFA:anisole 98:2 (2 mL) e a mistura reaccional foi agitada durante 15 min. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo dissolvido numa solução de actonitrilo-água e liofílizado para dar um sólido branco. A purificação foi conseguida por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa usando um gradiente a 2,07%/min de acetonitrilo aquoso a 6,3-85,5% contendo 0,1% de TFA e liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido felpudo.
Exemplo 5
Sal TFA de ciclo-((N-E-hidrazinonicotinil-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Parte A Síntese de sal TFA de ciclo-((N-E-hidrazinonicotinil-D-Lys)--NMeArg-Gly-Asp-Mamb) A uma solução de ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)*2TFA (4,2 mg; 0,005 mmol), boc-hidrazinonicotinato de succinimidilo (2,1 mg; 0,006 mmol) em DMF (0,15 mL) foi adicionada trietilamina (0,003 mL; 0,02 mmol) e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 48 horas. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo dissolvido numa solução de acetonitrilo-água e liofílizado durante a noite para dar um sólido esbranquiçado. A purificação foi realizada por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa usando um gradiente a 1,7%/min de acetonitrilo aquoso a 6,3-85,5% contendo 0,1% de TFA e liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido felpudo. MS (M+H = 839,4157; calc. 839,4164).
Parte B Desprotecção dando o sal de TFA de ciclo-((N-E-hidrazinonico-tinil-D-Lys)-NMeArg-GIy-Asp-Mamb)
Sal de TFA de ciclo-((N-E-boc-hidrazinonicotinil-D-Lys)- -237- -NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (3 mg) foi dissolvido numa mistura de TFA:anisole 98:2 (2mL) e a mistura reaccional foi agitada durante 15min. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo dissolvido numa solução de actonitrilo-água e liofílizado para dar um sólido branco. A purificação foi conseguida por HPLC de inversão de fases numa coluna Vydac® Cl8 preparativa usando um gradiente a 2,0%/min de acetonitrilo aquoso a 6,3-72% contendo 0,1% de TFA e liofílizado para dar o sal de TFA do composto mencionado em título na forma de um sólido felpudo. MS (M+H = 739,3629; calc. 739,3640).
Exemplo 6
Conjugado de ciclo-([DTPA-D-Lys]-NMeArg-GIy-Asp-Mamb) A uma solução de 250 mg (2 mmol) de ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly--Asp-Mamb) em 208 mL de borato 0,1 M (pH 9,88) à temperatura ambiente foi adicionado anidrido do DTP A (743 mg; 10 mmol) com agitação constante. A reacção foi agitada em agitação durante 2 h. A mistura crua de produtos obtida após remoção do solvente foi purificada por HPLC preparativa (coluna Vydac® Cl8, gradiente ACN 0-50% contendo 0,1% de TFA ao longo de 60min, velocidade de fluxo de 20 mL/min). Foram isolados dois componentes principais. O componente A é ciclo-([DTPA-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). MS: (M+H+) 979,1.
Exemplo 7
Conjugado de [ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)]2-DTPA O componente B da síntese descrita no Exemplo 6 é [ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)]2-DTPA. MS: (M+) 1565,4.
Secção B Compostos Marcados Radioactivamente
Marcação Directa
Exemplo 8
Ciclo-((125I)D-Tyr-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) A um frasco de 5 mL foram adicionados 22 mCi (45 pL) de Na I aquoso, 100 pL de tampão fosfato 0,5 M pH 7,5, 4,5 pL de HC1 1 N, 75 pg do intermediário do composto cíclico ciclo-(D-Tyr-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) dissolvidos em 75 pL de TFA aquoso a 0,1% e 50 pg de Cloramina-T dissolvidos em 50 pL de H20. A reacção foi deixada a prosseguir durante 1 minuto e em seguida 50 pg de metabissulfito de sódio dissolvidos em H20 foram adicionados. O produto foi purificado por HPLC (coluna Zorbax® RX-C18, velocidade de fluxo = 1 mL/min, gradiente desde 100% de A até 100% de B ao longo de 30 minutos; Solvente A = 0,1% de TFA em H20, Solvente B = 40% de etanol em A. O produto tinha um tempo de retenção de 30 min.
Exemplo 9 [(12SI)N-3-(4-Hidroxifenil)propionil]-ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) A um frasco de 5 mL foram adicionados ll,4mCi (25 pL) de Na,25I aquoso, 100 pL de tampão fosfato 0,5 M pH 7,5, 4,5 pL de HC1 1 N, 50 pg do composto cíclico modificado por ligante [N-3-(4-hidroxifenil)pro-pionil]-ciclo-(D-Tyr-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) dissolvidos em 50 pL de TFA aquoso a 0,1% e 50 pg de Cloramina-T dissolvidos em 50 pL de H20. A reacção foi deixada a prosseguir durante 1 minuto e em seguida 50 pg de metabissulfito de sódio dissolvidos em H20 foram adicionados. O produto foi purificado por HPLC preparativa, usando a condição descrita no Exemplo 10. O produto tinha um tempo de retenção de 32 min.
Marcação Indirecta
Exemplo 10 99mTcO (MAMA)-ciclo-(D-VaI-NMeArg-GIy-Asp-Mamb(5-Aca))
Parte A Desprotecção
Os grupos de protecção tritilo no reagente descrito no Exemplo 1 são removidos. Para um frasco de 10 mL limpo, separado, foi adicionado o reagente e 0,1 mL de ácido trifluoroacético (TFA). O sólido foi dissolvido para dar uma solução amarela.
Parte B Síntese de 99mTc-gluco-heptanoato
Um frasco Glucoscan® foi reconstituído com 1,0 mL de Milli-Q H2O. 0,2 mL da solução foram removidos e adicionados a um frasco de 10 mL limpo seguido por 99mTc04’. A reacção prosseguiu à temperatura ambiente durante 20 minutos.
Parte C Síntese de "mTcO(MAMA)-ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp- -Mamb (5-Aca)) À solução de reagente desprotegido da Parte A foram adicionados 0,2 mL de NaOH 5 N e 0,4 mL de tampão fosfato 0,2 M pH 6. O pH foi medido e ajustado conforme necessário até 6. Esta solução foi imediatamente adicionada ao frasco de solução de 99mTc-gluco-heptanoato, dobrado e aquecido a 100 °C durante 15 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 20 juL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 1).
Exemplo 11 99mTcO (MAMA)-ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Parte A Desprotecção
Os grupos de protecção tritilo no reagente descrito no Exemplo 2 são removidos. Para um frasco de 10 mL limpo, separado, foi adicionado o reagente e 0,1 mL de ácido trifluoroacético (TFA). O sólido foi dissolvido para dar uma solução amarela.
Parte B Síntese de "mTcO(MAMA)-cicIo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp- -Mamb) À solução de reagente desprotegido da Parte A foram adicionados 0,2 mL de NaOH 5 N e 0,4 mL de tampão fosfato 0,2 M pH 6. O pH foi medido e ajustado conforme necessário até 6. Esta solução foi imediatamente adicionada ao frasco de solução de 99mTc-gluco-heptanoato, criado conforme descrito na Parte B do Exemplo 10, dobrado e aquecido a 100 °C durante 15 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 20 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 1).
Exemplo 12 99mTc(Tricina)2-ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mainb- (hidrazino-nicotinil-5-Aca)) A uma solução de 70 mg de tricina em 1,0 mL de água foram adicionados 0,05 mL de NaOH 1,0 N para aumentar o pH até 7. Foi adicionado 0,1 - 1,0 mL de ""TcCV em salina (10 - 100 mCi) seguido por 10 pg do reagente descrito no Exemplo 3 dissolvidos em 100 pL de HC1 0,1 N e 100 pg de SnCl2*2H20 dissolvidos em HC1 0,1 N. A reacção prosseguiu à temperatura ambiente durante 45 minutos. O produto foi analisado por HPLC usando o Método 1 e por TLC usando o Método 2 (ver Quadro 1).
Exemplo 13 "mTc(EDDA)-ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb- (hidrazino-nicotinil-5-Aca)) A uma solução de 10 mg de ácido etilenodiamina-N,N'-diacético (EDDA) em 1,0 mL de água foram adicionados 0,05 mL de NaOH 1,0 N para aumentar o pH até 7. Foi adicionado 0,1-1,0 mL de 99mTc04' em salina (10 - 100 mCi) seguido por 50 pg do reagente descrito no Exemplo 3 dissolvidos em 100 pL de HC1 0,1 N e 100 pg de SnCl2*2H20 dissolvidos em HC1 0,1 N. A reacção prosseguiu à temperatura ambiente durante 45 minutos. O produto foi analisado por HPLC usando o Método 1 e por TLC usando o Método 2 (ver Quadro 1).
Exemplo 14 99mT c(T ricina)2-cicIo-(D-Abu-NMe Arg-Gly-Asp-Mamb-(hidrazino-nicotinil-5-Aca)) A uma solução de 70 mg de tricina em 1,0 mL de água foram adicionados 0,05 mL de NaOH 1,0 N para aumentar o pH até 7. Foi adicionado 0,1 - 1,0 mL de 99mTc04' em salina (10 - 100 mCi) seguido por 10 pg do reagente descrito no Exemplo 4 dissolvidos em 100 pL de HC1 0,1 N e 100 pg de SnCl2*2H20 dissolvidos em HC1 0,1 N. A reacção prosseguiu à temperatura ambiente durante 45 minutos. O produto foi analisado por HPLC usando o Método 1 e por TLC usando o Método 2 (ver Quadro 1).
Exemplo 15 99mTc(Tricina)2-ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb- (hidrazino-nicotinil-5-Aca)) A uma solução de 70 mg de tricina em 1,0 mL de água foram adicionados 0,05 mL de NaOH 1,0 N para aumentar o pH até 7. Foi adicionado 0,1 - 1,0 mL de "mTc04‘ em salina (10 - 100 mCi) seguido por 10 pg do reagente descrito no Exemplo 5 dissolvidos em 100 pL de HC1 0,1 N e 100 pg de SnCl2*2H20 dissolvidos em HC1 0,1 N. A reacção prosseguiu à temperatura ambiente durante 45 minutos. O produto foi analisado por HPLC usando o Método 1 e por TLC usando o Método 2 (ver Quadro 1).
Quadro 1. Dados Analíticos e Rendimentos para Reagentes Marcados com 99mTc HPLC - Tempo de Retenção (min) Rendimento (%) Exemplo 10 20,4 99 Exemplo 11 19,6 95 Exemplo 12 13,4 95 Exemplo 13 11,5 60 Exemplo 14 11,5 97 Exemplo 15 8,8 90
Exemplo 16
Ciclo-([1 uIn-DTPA-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) 50 pL de inInCl3 (—100 mCi/mL em HC1 0,05 M) obtido de DuPont-NEN Products, Billerica, MA, foram combinados com um volume igual de acetato de amónio 1,0 M preparado recentemente. Após cerca de cinco minutos, foram adicionados 0,1 - 1 mg do reagente descrito no Exemplo 6 dissolvidos em 0,25 mL de água. A reacção prosseguiu à temperatura ambiente durante 30 minutos. O produto foi analisado por HPLC usando o Método 3.
Exemplo 17 niIn-DTPA-[Ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)]2 A 0,5 mL de uma solução do reagente descrito no Exemplo 7 em água (0,9mg/mL) foi adicionado ulInCl3 (~3 mCi) em 0,5 mL de solução de NH4OAc 1 N. A mistura foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos e em seguida foi analisada por HPLC usando o Método 3 (ver Quadro
Quadro 2. Dados Analíticos e Rendimentos para Reagentes Marcados com 1MIn HPLC - Tempo de Retenção (min) Rendimento (%) Exemplo 16 13,3 97 Exemplo 17 14,5 98
Secção C Reagentes Marcados com 99mTc Via Aproximação de
Pré-quelato
Os reagentes marcados com 99mTc descritos nestes exemplos foram sintetizados usando a aproximação de pré-quelato. A aproximação de pré-quelato envolve os passos: (1) quelação de 99mTc pelo quelante; (2) activação de um grupo carboxílico não coordenado no complexo resultante pela formação do seu éster de tetrafluorofenilo (TFP); e (3) conjugação do complexo de éster de TFP pela formação de uma ligação amida com um intermediário do composto cíclico ou composto cíclico modificado por ligante.
Exemplo 18
Ciclo-([ [99raTcO (mapt)]'-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Parte A Quelação de 99mTc A um frasco limpo de 10 mL foram adicionados 0,35 mL de Bz-mapt (3,0 mg/mL em NaOH 1 N), 0,10 mL de SnCl2*2H20 (lOmg/mL em HC1 1 N) e 99mTc04' 200 mCi em salina. O frasco foi dobrado e colocado num banho de água a 100 °C durante 25 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 10 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1. -244-
Parte B Activação À solução da Parte A foram adicionados 0,3 mL de fosfato de sódio 0,5 M, pH 6, 0,3 mL de 2,3,5,6-tetrafluorofenol (100 mg/mL em acetonitrilo a 90%), 0,3 mL de l-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida (100 mg/mL em acetonitrilo a 90%) e ~0,1 mL de HC1 1 N. O pH foi ajustado conforme necessário até pH 6. O frasco foi dobrado e aquecido a 40 °C durante 25 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 20 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1.
Parte C Conjugação 1,0 - 2,5 mg do intermediário do composto cíclico ciclo-(D-Lys--NMeArg-Gly-Asp-Mamb) foi dissolvido em 0,3 mL de tampão fosfato 0,5 M, pH 9, e adicionado à solução da Parte B. Usando NaOH 1 N, o pH foi ajustado até 9. A reacção foi aquecida a 40 °C durante 30 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 25 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 3).
Exemplo 19
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(["mTcO (mapt)]'-5-Aca)) 1.0- 2,5 mg do composto cíclico modificado por ligador
ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) foi dissolvido em 0,3 mL de tampão fosfato 0,5 M, pH 9, e adicionado à solução do Exemplo 18, Parte B. Usando NaOH 1 N, o pH foi ajustado até 9. A reacção foi aquecida a 40 °C durante 30 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 25 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 3).
Exemplo 20
Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(l"mTcO (mapt)]"-5-Aca)) 1.0- 2,5 mg do composto cíclico modificado por ligador ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) foi dissolvido em 0,3 mL de tampão fosfato 0,5 M, pH 9, e adicionado à solução do Exemplo 18, Parte B. Usando NaOH 1 N, o pH foi ajustado até 9. A reacção foi aquecida a 40 °C durante 30 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 25 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 3).
Exemplo 21
Ciclo-([([99mTcO (mapt)]‘-5-Aca)-D-Lys]-NMeArg-GIy-Asp-Mamb) 1,0-2,5 mg do composto cíclico modificado por ligador ciclo-((5-Aca)-D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) foi dissolvido em 0,3 mL de tampão fosfato 0,5 M, pH 9, e adicionado à solução do Exemplo 18, Parte B. Usando NaOH 1 N, o pH foi ajustado até 9. A reacção foi aquecida a 40 °C durante 30 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 25 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 3).
Exemplo 22
CicIo-([[99mTcO (MeMAG2gaba)]-D-Lys]-NMeArg-GIy-Asp-Mamb) Parte A Quelação A um frasco de 10 mL foram adicionados 100-250 mCi de "mTc04‘ em 1,0 mL de salina, 1,0 mL de solução de Bz-MeMAG2gaba (1 mg/mL em tampão fosfato 0,5 M de pH 12) seguido por 0,15-0,20 mL de solução de SnCl2*2H20 (15 mg/3 mL em HC1 1 N). O pH foi ajustado para ~11 e a mistura foi aquecida durante 30 min a 100 °C. A solução foi analisada por HPLC usando o Método 1.
Parte B Activação
À solução da Parte A foram adicionados 0,2 mL de HC1 1 N, 0,5 mL de solução de tetrafluorofenol (100 mg/mL em CH3CN a 90%) e 0,5 mL de solução de cloreto de l-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (100 mg/mL em CH3CN a 90%). O pH foi ajustado até pH 6 e a mistura foi aquecida a 50 °C durante 30 min.
Parte C Conjugação 1,0-2,5 mg do intermediário do composto cíclico ciclo-(D-Lys--NMeArg-Gly-Asp-Mamb) foi dissolvido em 0,3 mL de tampão fosfato 0,5 M, pH 9, e adicionado à solução da Parte B. Usando NaOH 1 N, o pH foi ajustado até 9. A reacçâo foi aquecida a 40 °C durante 30 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 25 pL da solução foram analisados por HPLC usando 0 Método 1 (ver Quadro 3).
Exemplo 23
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(["mTcO (MeMAG2gaba)]-5-Aca» 1.0- 2,5 mg do composto cíclico modificado por ligador ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) foi dissolvido em 0,3 mL de tampão fosfato 0,5 M, pH 9, e adicionado à solução do Exemplo 22, Parte B. Usando NaOH 1 N, o pH foi ajustado até 9. A reacção foi aquecida a 40 °C durante 30 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 25 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 3).
Exemplo 24
Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(["mTcO (MeMAG2gaba)]'-5-Aca)) 1.0- 2,5 mg do composto cíclico modificado por ligador
ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) foi dissolvido em 0,3 mL de tampão fosfato 0,5 M, pH 9, e adicionado à solução do Exemplo 22, Parte B. Usando NaOH 1 N, o pH foi ajustado até 9. A reacção foi aquecida a 40 °C durante 30 minutos. Após arrefecimento durante ~2 minutos, 25 pL da solução foram analisados por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 3).
Exemplo 25
Ciclo-([[99mTcO (MAG3)]'-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Este exemplo foi sintetizado seguindo o procedimento descrito no Exemplo 22, substituindo por BZ-MAG3 como quelante (ver Quadro 3).
Exemplo 26
Ciclo-([[99mTcO (Me-MAG3)]'-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Este exemplo foi sintetizado seguindo o procedimento descrito no Exemplo 22, substituindo por Bz-Me-MAG3 como quelante (ver Quadro 3).
Exemplo 27
CicIo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO(MeMAG2ACA)]-5-(Aca)) O composto mencionado em título foi preparado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 22, substituindo por Bz-Me-MAG2-ACA como quelante na Parte A e usando ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb-(5-Aca)) como composto cíclico modificado por ligante na Parte C (ver Quadro 3).
Exemplo 28
Ciclo-([[99mTcO (ΜABA)] -D-Lys] -NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Parte A Quelação A um frasco de 10 mL foram adicionados 50-300 mCi de 99mTc04' em 0,5 mL de salina, seguido por 0,5 mL de solução de Bz-MABA (1 mg/mL em tampão fosfato 0,5 M de pH 12) e 0,15 mL de solução de Na2S204 (5 mg/mL em tampão fosfato 0,5 M de pH 11,5). O pH foi ajustado para 10-12 usando NaOH 1 N e a mistura foi aquecida durante 30 min a 100 °C e em seguida analisada por HPLC usando o Método 1.
Parte B Activação À solução da Parte A foram adicionados 0,2 mL de HC1 1 N, 0,5 mL de solução de TFP (50 mg/0,5 mL em CH3CN a 90%) e 0,5 mL de solução de DCI (50 mg em 0,5 mL em CH3CN a 90%). O pH foi ajustado até pH 6, se necessário, e a mistura foi aquecida a 45-50 °C durante 30 min e em seguida analisada por HPLC usando o Método 1.
Parte C Conjugação À solução da Parte B foram adicionados 2-3 mg do intermediário do composto cíclico ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) dissolvidos em 0,5 mL de tampão fosfato 0,5 M de pH 9 e o pH foi em seguida ajustado até 9,5-10. A reacção foi aquecida a 50 °C durante 30 min e em seguida analisada por HPLC usando o Método 1 (ver Quadro 3).
Exemplo 29
Ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(["mTcO(MABA)r-5-(Aca)) O composto mencionado em título foi sintetizado seguindo 0 procedimento descrito no Exemplo 28, substituindo o intermediário de composto cíclico ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) pelo composto cíclico modificado por ligante ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) na Parte C.
Exemplo 30
Ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO (MABA)]'-5-(Aca)) O composto mencionado em título foi sintetizado seguindo o procedimento descrito no Exemplo 28, substituindo o intermediário de composto cíclico ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) pelo composto cíclico modificado por ligante ciclo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) na Parte C.
Exemplo 31
Ciclo-([[99mTcO (MA-MAMA)]-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Parte A Desprotecção
Os grupos de protecção tritilo no quelante MA-MAMA foram removidos dissolvendo 6 mg em 1 mL de ácido trifluoroacético (TFA) anidro. A solução amarela resultante foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 5 minutos. Trietilsilano (0,5 mL) foi adicionado à solução amarela para dar uma mistura límpida de duas camadas. Os voláteis foram removidos sob pressão reduzida para dar um resíduo branco.
Parte B Hidrólise do Éster de Etilo
Ao resíduo branco da Parte A foram adicionados 0,5 mL de NaOH 5 M e 1 mL de THF. A mistura foi aquecida num banho de água (100 °C durante 5 minutos, tempo durante o qual a maior parte do THF foi evaporada. A mistura reaccional foram adicionados 3 mL de tampão fosfato 0,5 M de pH 11,5. O pH foi ajustado até 10-12 e foi adicionado ditionito de sódio (15-30 mg). A mistura foi filtrada e o volume total foi ajustado até 6 mL usando tampão fosfato 0,5 M de pH 11,5.
Parte C Quelação A um frasco de 10 mL foram adicionados 50-150 mCi de "mTc04‘ em 0,5 mL de salina, seguido por 0,5 mL de solução de ligando da Parte B. O pH foi ajustado até 10-12 usando NaOH 1 N e a mistura foi aquecida durante 30 min a 100 °C e em seguida analisada por HPLC usando o Método 1.
Parte D Activação À solução da Parte C foram adicionados 0,2 mL de HC1 1 N, -250- ijflUpim-ja 0,5 mL de solução de TFP (50 mg/0,5 mL em CH3CN a 90%) e 0,5 mL de solução de DCI (50 mg em 0,5 mL de CH3CN a 90%). O pH foi ajustado até 6, se necessário, e a mistura foi aquecida a 45-50 °C durante 30 min e em seguida analisada por HPLC usando o Método 1.
Parte E Conjugação A solução da Parte D foram adicionados 2,5 mg do intermediário do composto cíclico ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) dissolvido em 0,5 mL de tampão fosfato 0,5 M de pH 9 e o pH foi em seguida ajustado até 9,5-10. Após aquecimento a 50 °C durante 30 min, a solução foi analisada por HPLC usando o Método 1.
Exemplo 32
Ciclo-(D-Val-NMe Arg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO (MA-MAMA)]-5-(Aca)) O composto mencionado em título foi sintetizado seguindo o procedimento descrito no Exemplo 31, substituindo o intermediário de composto cíclico ciclo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) pelo composto cíclico modificado por ligante ciclo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) na Parte E.
Quadro 3. Dados Analíticos e Rendimentos para Reagentes Marcados com 99mTc HPLC - Tempo de Retenção (min) Rendimento (%) Exemplo 18 15,0 60 Exemplo 19 16,2 45 Exemplo 20 15,3 35 Exemplo 21 15,5 55 Exemplo 22 14,3 44 Exemplo 23 15,5 34
Exemplo 24 14,5 70 Exemplo 25 13,2 50 Exemplo 26 13,0 55 Exemplo 27 14,3 40 Exemplo 28 18,2 10 Exemplo 29 19,1 22 Exemplo 30 19,3 22 Exemplo 31 14,8 23 Exemplo 32 16,2 34 Métodos Analíticos HPLC - Método 1 Coluna: Vydac® Cl8, 250 mm x 4,6 mm, dimensão de poro 30,0 nm (300 Â) Solvente A: fosfato de sódio 10 mM, pH 6,0 Solvente B: acetonitrilo a 100% Gradiente: 0% de B 30% de B 75% de B 0’ 15' 25' Velocidade de fluxo: l,0mL/min
Detecção por sonda de Nal TLC - Método 2 tira de ITLC-SG, 1 cm x 7,5 cm, desenvolvida em acetona:água 1:1 HPLC - Método 3
Coluna: Vydac® Cl8, 250 mm x 4,6 mm, dimensão de poro 30,0 nm (300 À)
Solvente A: fosfato de sódio 10 mM, pH 6,0 -252-
Solvente B: acetonitrilo a 75% em Solvente A Gradiente:
5% de B 5% de B 100% de B 0' 5' 40'
Velocidade de fluxo: 1,0 mL/min Detecção por sonda de Nal
Utilidade
Os compostos marcados radioactivamente da invenção são úteis como produtos radiofarmacêuticos para a formação da imagem de um trombo tal como o que pode estar presente num paciente com angina instável, enfarte do miocárdio, ataque isquémico transiente, derrame cerebral, aterosclerose, diabetes, tromboflebite, embolia pulmonar, ou tampões, trombos e êmbolos de plaquetas causados por dispositivos cardíacos prostéticos tais como válvulas do coração e, por conseguinte, podem ser usados para diagnosticar tais desordens presentes ou potenciais. O paciente pode ser um qualquer tipo de mamífero, mas é preferivelmente um humano. Os compostos marcados radioactivamente podem ser usados isoladamente ou podem ser empregues como uma composição com um agente de suporte radiofarmaceuticamente aceitável e/ou em combinação com outros agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Os agentes de suporte radiofarmaceuticamente adequados e as suas quantidades adequadas são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, e The United States Pharmacopeia - The National Formulary, 22a Revisão, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, textos de referência padrão no campo farmacêutico. Outros materiais podem ser adicionados, conforme conveniente, para estabilizar a composição, como os peritos na técnica reconhecerão, incluindo agentes antioxidantes tais como bissulfíto de sódio,
I sulfito de sódio, ácido ascórbico, ácido gentísico ou ácido cítrico (ou seus sais) ou ácido etilenodiaminotetracético de sódio (EDTA de sódio), conforme bem conhecido do perito na técnica. Estes outros materiais, bem como suas quantidades adequadas, são também descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences e The United States Pharmacopeia - The National Formulary, acima citadas. A presente invenção também inclui kits de produtos radiofarmacêu-ticos que contêm os compostos marcados da invenção. Tais kits podem conter os compostos marcados em forma liofilizada estéril e podem incluir um contentor estéril de um líquido de reconstituição radiofarmaceuticamente aceitável. Os líquidos de reconstituição adequada são revelados em Remington's Pharmaceutical Sciences e The United States Pharmacopeia - The National Formulary, acima citados. Tais kits podem altemativamente conter um contentor estéril de uma composição dos compostos marcados radioactivamente da invenção. Tais kits podem também incluir, se desejado, outros componentes de kit convencionais, tais como, por exemplo, um ou mais agentes de suporte, um ou mais frascos adicionais durante a mistura. Instruções, quer na forma de inserções quer na de rótulos, indicando quantidades dos compostos marcados da invenção e agente de suporte, directrizes para a mistura destes componentes e protocolos para administração, podem também ser incluídos no kit. A esterilização dos contentores e quaisquer materiais incluídos no kit e a liofilização (também referida como secagem por congelação) dos compostos marcados da invenção podem ser levados a cabo usando metodologias de esterilização e de liofilização conhecidas dos peritos na técnica.
Para realizar o método da invenção, os compostos marcados -254- radioactivamente são geralmente administrados intravenosamente, por injecção de bolos, ainda que eles possam ser administrados por qualquer meio que produza contacto do composto com plaquetas. Quantidades adequadas para administração serão prontamente apuradas pelos peritos na técnica, uma vez armados com a presente revelação. A dosagem administrada variará, certamente, na dependência de factores conhecidos tais como o composto particular administrado, a idade, saúde e peso ou natureza e extensão de quaisquer sintomas experimentados pelo paciente, a quantidade de radiomarcação, o radionuclido particular usado como marcação, a taxa de eliminação do sangue dos compostos radiomarcados.
Intervalos adequados para administração de materiais marcados radioactivamente são tabulados, por exemplo, em Physicians Desk Reference (PDR) for Nuclear Medicine, publicado por Medicai Exonomics Company, um texto de referência bem conhecido. Uma discussão de algumas das considerações acima mencionadas é proporcionada em Eckelman et ai, J. Nucl. Med., 209 (1979) 350-357. A título de guia geral, uma gama de dosagem dos compostos marcados radioactivamente da invenção pode estar entre 1 e 40 mCi.
Uma vez os compostos marcados radioactivamente da invenção administrados, a presença de trombos pode ser visualizada usando um sistema de formação de imagens radiocintigráfícas padrão, tal como, por exemplo, uma câmara gama ou um dispositivo termográfico computadorizado, e as desordens tromboembólicas detectadas. Tais sistemas de formação de imagens são bem conhecidos na técnica e são discutidos, por exemplo, em A. Macovski, Medicai Imaging Systems, Informations and Systems Science Series, T. Kailath, ed., Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, 1983. Particularmente preferidas são a tomografia computadorizada de emissão de fotão único (SPECT) e tomografla de emissão de positrão (PET). Especificamente, a formação de imagens é realizada por varrimento de todo o paciente ou de uma região particular do paciente suspeita de ter uma formação de trombo, usando o sistema radiocintigráfíco e detectando o sinal de radioisótopo. O sinal detectado é em seguida convertido numa imagem do trombo pelo sistema. As imagens resultantes deverão ser lidas por um observador experimentado, tal como, por exemplo, um médico de medicina nuclear. O processo precedente é aqui referido como "formação de imagem" do paciente. Geralmente, a formação de imagem é levada a cabo em 1 minuto a 48 horas seguintes à administração do composto marcado radioactivamente da invenção. O horário preciso da formação da imagem dependerá de factores tais como a meia-vida do radioisótopo empregue e da taxa de eliminação do composto administrado, como se tomará prontamente aparente aos peritos na técnica. Preferivelmente, a formação de imagens é levada a cabo entre cerca de 1 minuto e cerca de 4 horas a seguir à administração. A vantagem de serem empregues os compostos marcados radioactivamente da invenção, os quais têm a capacidade de localizar especificamente e com alta afinidade os trombos, para detectar a presença de trombos e/ou para diagnosticar desordens tromboembólicas num paciente, será prontamente aparente aos peritos na técnica, uma vez na posse da presente revelação.
Modelo de Shunt Arteriovenoso Cães híbridos adultos de ambos os sexos (9-13 kg) foram anestesiados com pentobarbital de sódio (35 mg/kg, i.v.) e ventilados com ar ambiente via um tubo endotraqueal (12 batidas por minuto/min; 25 mL/kg). Para a determinação da pressão arterial, a artéria carótida esquerda foi canulada com um cateter de polietileno cheio de salina (PE-240) e conectada a um transdutor de pressão Statham (P23ID; Oxnard, CA). A pressão sanguínea arterial média foi determinada via amortecimento do sinal de pressão pulsátil. O ritmo cardíaco foi monitorizada usando um cardiotacómetro (Biotach, Grass Quincy, MA) iniciado por um electrocardiograma de condutor II gerado por condutores de. Uma veia jugular foi canulada (PE-240) para administração da droga. Ambas as artérias femorais e veias femorais foram canuladas com entubamento de polietileno (PE-200) tratado com silício (Sigmacote, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) cheio de salina e conectado com uma secção de 5 cm de entubamento (PE-240) tratado com silício para formar «shunts» arteriovenosos (A-V) extracorporais. A potência do «shunt» foi monitorizada usando um sistema de fluxo de Doppler (modelo VF-1, Crystal Biotech Inc., Hopkinton, MA) e sonda de fluxo (2-2,3 mm, Titronics Med. Inst., Iowa City, IA) colocada próximo do local do «shunt». Todos os parâmetros foram monitorizados continuamente num gravador polígrafo (Grass, modelo 7D) a uma velocidade de papel de lOmm/min ou 25 mm/s.
Ao completar-se um período de estabilização pós-cirúrgica de 15 min, formou-se um trombo oclusivo pela introdução de uma superfície trombogénica (fio de seda entrançado 4-0, 5 cm de comprimento, Ethicon Inc., Somerville, NJ) no «shunt» com o outro servindo como controlo. Dois períodos de «shunt» de 1 h consecutivos foram empregues com o agente de teste administrado na forma de uma infusão ao longo de 5 min começando 5 min antes da inserção da superfície trombogénica. No final de cada período de «shunt» de 1 h, a seda foi cuidadosamente removida e pesada e a % de incorporação determinada via boa contagem. O peso dos trombos foi calculado subtraindo o peso da seda antes da colocação do peso total da seda na remoção do «shunt». Os resultados são mostrados no Quadro 4. O sangue arterial foi retirado antes do primeiro «shunt» e cada 30 min depois para a determinação da eliminação no sangue, agregação de plaquetas induzida por colagénio em sangue completo, desgranulação de plaquetas induzida por trombina (libertação de ATP de plaquetas), tempo de pró-trombina e contagem de plaquetas. O tempo de hemorragia do modelo foi também feito em intervalos de 30 min.
Modelo de Trombose da Veia Profunda Canina
Este modelo incorpora a tríade de eventos (estado de hipercoagulá-vel, período de estase, ambiente de baixo corte) essencial para a formação de um trombo que cresce activamente rico em fibrina venoso. O procedimento foi como se segue: cães híbridos adultos de ambos os sexos (9-13 kg) foram anestesiados com pentobarbital de sódio (35 mg/kg, i.v.) e ventilados com ar ambiente via um tubo endotraqueal (12 batidas por minuto/min; 25 mL/kg). Para a determinação da pressão arterial, a artéria femoral direita foi canulada com um cateter de polietileno cheio de salina (PE-240) e conectada a um transdutor de pressão Statham (P23ID; Oxnard, CA). A pressão sanguínea arterial média foi determinada via amortecimento do sinal de pressão pulsátil. O ritmo cardíaco foi monitorizada usando um cardiotacómetro (Biotach, Grass Quincy, MA) iniciado por um electrocardiograma de condutor II gerado por condutores de. A veia femoral direita foi canulada (PE-240) para administração da droga. Um segmento de 5 cm foi isolado de cada uma das veias jugulares, liberto da fáscia e circunscrito com sutura de seda. Uma sonda termorresistora foi colocada no recipiente, o que serve como medida indirecta do fluxo venoso. Um cateter de embolectomia de balão foi utilizado para induzir o período de 15 min de estase, tempo durante o qual um estado de hipercoagulabilidade foi em seguida induzido usando 5 U de trombina (American Diagnosticia, Greewich, CT) administrada no segmento ocludido. Quinze minutos mais tarde, o fluxo foi restabelecido por deflação do balão. O agente foi infundido durante os primeiros 5 min de refluxo e a taxa de incorporação foi monitorizada usando cintigrafia gama. Os resultados para os Exemplos 12 e 19 são mostrados na Figura 1.
ExeiMPLO 33
Quadro 4. Dados Experimentais do Modelo de Shunt Arteriovenoso (média ± DP; T/B = trombo/fundo
Ex. N° Condições Venosas Condições arteriais Captação (%id/g) Razão T/B Captação (%id/g) Razão T/B 8 0,25 + 0,15 19 ±9 1,81 ±0,18 173 ±22 9 0,45 ±0,11 8 ± 3 2,60 ± 0,05 44 ±4 10 0,16 + 0,02 7 ±0,6 5,00 ±0,51 221 ± 16 12 0,46 ±0,19 7,0 ±2 6,15 ±0,66 111 ±6 13 1,64 ± 1,32 33 ± 27 8,50 ± 0,20 163 ± 14 16 0,08 14 0,95 ± 0,29 128 ± 24 18 0,04 ±0,01 13 ±3 0,47 ±0,12 147 ± 44 19 0,58 ± 0,22 13 ±4 5,75 ± 1,28 142 ± 24 21 0,06 ± 0,03 4,0 ±2 1,6 ±0,12 113 ± 1 22 0,045 ± 0,02 7 ± 4 1,28 ±0,44 158 ±5 23 0,21 ±0,05 7 ±0,4 5,41 ± 0,70 195 ±39 32 0 0 7,4 102
Ensaio de Agregação de Plaquetas
Sangue canino foi recolhido em tubos Vacutainer citrados de 10 mL. O sangue foi centrifugado durante 15 minutos a 150 x g à temperatura ambiente e o plasma rico em plaquetas (PRP) foi removido. O sangue restante foi centrifugado durante 15 minutos a 1500 x g à temperatura ambiente e o plasma pobre em plaquetas (PPP) foi removido. As amostras foram ensaiadas num agregómetro (PAP-4 Platelet Aggregation Profiler) usando PPP como branco (transmitância de 100%). 200 pL de PRP foram adicionados a cada tubo de microteste e a transmitância foi regulada a 0%. 20 pL de vários agonistas (ADP, colagénio, araquidonato, epinefrina, trombina) foram adicionados a cada tubo e os perfis de agregação foram representados em gráfico (% de transmitância contra o tempo). Os resultados foram expressos como % de -259- inibição de agregação de plaquetas induzida por agonista. Para a avaliação de IC5o, os compostos de teste foram adicionados em várias concentrações antes da activação das plaquetas.
Ensaio de Ligação Plaqueta-Fibrinogénio ΙΛΓ A ligação de I-fibrinogénio a plaquetas foi realizado conforme descrito por Bennett et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80 (1983) 2417-2422, com algumas modificações conforme abaixo descrito. PRP humano (h-PRP) foi aplicado a uma coluna Sepharose para a purificação de fraeções de plaquetas. Alíquotas de plaquetas (5 x 108 células) em conjunto com cloreto de cálcio 1 mM foram adicionados a placas de 96 cavidades removíveis antes da activação das plaquetas purificadas em gel humanas (h-GPP). A activação das plaquetas purificadas em gel humanas foi conseguida usando ADP, colagénio, araquidonato, epinefrina e/ou trombina na presença do ligando, 125I-fibrinogénio. O 125I-fibrinogénio ligado às plaquetas activadas foi separado a partir da forma livre por centrifugação e em seguida contado num contador gama. Para uma avaliação da IC50, os compostos de teste foram adicionados em várias concentrações antes da activação das plaquetas.
Os novos compostos plaqueta glicoproteína Ilb/IIIa cíclicos da invenção também podem possuir eficácia trombolítica, quer dizer, eles são capazes da lise (desagregação ou colapso) os coágulos de sangue de plaquetas ricas em fibrina já formados e por conseguinte podem ser úteis no tratamento de uma formação de trombo, conforme evidenciado pela sua actividade nos testes abaixo descritos. Os compostos cíclicos preferidos da presente invenção para uso em trombólise deverão incluir os compostos que têm um valor IC50 (quer dizer, a concentração molar do composto cíclico capaz de alcançar a lise de 50% do coágulo) menor que 1 mM, mais preferivelmente um valor IC50 menor que 0,1 mM, mesmo mais preferivelmente um valor IC50 menor que 0,01 mM, ainda mais preferivelmente valor IC50 menor que 0,001 mM, sendo o mais preferível um valor IC50 menor que 0,0005 mM.
As determinações de IC50 podem ser feitas usando um ensaio de trombólise padrão, conforme descrito abaixo. Uma outra classe de compostos trombolíticos preferida da invenção incluirá aqueles compostos que têm um Kd <100 nM, preferivelmente < 10 nM, sendo 0 mais preferível 0,1 a 1,0 nM.
Ensaio Trombolítico
Sangue venoso foi obtido do braço de um dador humano saudável que estava isento de drogas e isento de aspirina durante pelo menos duas semanas antes da recolha de sangue e colocado em tubos Vacutainer citrados de 10 mL. O sangue foi centrifugado durante 15 minutos a 1500 xgà temperatura ambiente e 0 plasma rico em plaquetas (PRP) foi removido. Ao PRP foi em seguida adicionado 1 x 10'3M do agonista ADP, epinefrina, colagénio, araquidonato, serotonina ou trombina, ou uma sua mistura, e o PRP incubado durante 30 minutos. O PRP foi centrifugado durante 12 minutos a 2500 xgà temperatura ambiente. O sobrenadante foi em seguida vertido para fora e as plaquetas restantes no tubo de teste foram ressuspensas em plasma pobre em plaquetas (PPP), o que serviu como fonte de plasminogénio. A suspensão foi em seguida ensaiada num contador Coulter Counter (Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL) para determinar a contagem de plaquetas no instante zero. Após obtenção do instante zero, os compostos foram adicionados em várias concentrações. As amostras de teste foram retiradas em vários instantes e as plaquetas foram contadas usando o Coulter Counter. Para determinar a percentagem de lise, a contagem de plaquetas num instante subsequente à adição do composto de teste foi subtraída da contagem de plaquetas no instante zero e o número resultante foi -261 - dividido pela contagem de plaquetas no instante zero. Multiplicando este resultado por 100 obteve-se a percentagem de lise do coágulo alcançada pelo composto de teste. Para a avaliação da IC50, os compostos de teste foram adicionados em várias concentrações e a percentagem de lise causada pelos compostos de teste foi calculada.
Lisboa, 28 de Agosto de 2000
JORGE CRUZ
Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14
1200 LISBOA

Claims (26)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um reagente para a preparação de um produto radiofarma-cêutico de fórmulas: (QLn)d Ch; (Q)d' Ln-Ch, em que: dé 1-3; d' é 2-20; Ln é um grupo de ligação sendo uma ligação entre Q e Ch; ou, um composto da fórmula: Μ1- [Y1 (CR55R56)h (Z'V· Y2]h. - M2 em que: M' é - [(CH2)8Z']g. - (CR55R56)g. -; M2 é - (CRs5R5\. - [Z^CHjU,. -; g é independentemente 0-10; g' é independentemente 0-1; g"é 0-10; h é 0-10; h' é 0-10; h" é 0-1; Y1 e Y2, em cada ocorrência, são independentemente seleccionados de entre: uma ligação, O, NR56, C=0, C(=0)0, 0C(=0)0, C(=0)NH-, C=NR56, S, SO, S02, S03, NHC(=0), (NH)2C(=0), (NH)2OS; Z1 é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre um sistema em anel C6-C]4 saturado, parcialmente saturado ou carbocíclico aromático, substituído com 0-4 R57; um sistema em anel heterocíclico, facultativamente substituído com 0-4 R ;
    R55 e R56 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de cn entre: hidrogénio, alquilo Cj-Cjo substituído com 0-5 R ; (alquil Ci-Cio)arilo em que o arilo é substituído com 0-5 R57; R é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: hidrogénio, OH, NHR58, C(=0)R58, 0C(=0)R58, 0C(=0)0R58, C(=0)0R58, C(=0)NR58-, ON, SR58, SOR58, S02R58, NHC(=0)R58, NHC(=0)NHR58, NHC(=S)NHR58; ou, altemativamente, quando ligado a uma molécula adicional Q, R57 é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: O, NR58, C=0; C(=0)0, 0C(=0)0, C(=0)N-, C=NR58, S, SO, S02, S03, NHC(=0), (NH)2C(=0), (NH)2C=S; R58 é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: hidrogénio, alquilo Q-Có, benzilo e fenilo. AV-A2-VV ^ V Ch é um quelante de metal seleccionado de entre: ,W-A* / \ w j | . W A2 t A3^ A2 W >_ -I w— A3 w A1 A2 ^ ^A4 .WA A1 I W I A3 .1- ^A2 A3 A*1 kw. At W ^At-W-Al w wx A5 yr a2-w-a3-w-a4-w-a5v VV>.A2-W-A3-W-A^-W-A6 w \ -3- .W λ' ^A4 íi' a 2—W- WA Axw At w W I a3 xATA V, λ* A A2-W-A3-W-A4-W-A^X V< vr A2^W_A3_W_A4_W_A6 W \ l,r-A2-VV-A3-W—A5—W-A5„v\r i w A,—W. yy<. A3-VV~aa—W~A6 W A1 A A3' I,w wa^ A5 A6 W A6. A"w J L ' 5w*AVAVA A5 / W A1—W v/ ^2 i i A\ W / w / r 2—w \ W—A3 \ W A4 W A\ W—a3 / w' ,A2—w—A3—vv—A4—w—A5—W—a6 w Δ’ w^,A2—W—A3—w—A4—W—A5—W A7 ^ w \7 -4- ,A2—w—A3—w—A4—W—a6—W—A7 w' I A1 W w' . A2—w— A3—w—A6— w—A7 W i. i 1^ < 1 L· _A2“ 1 w—A4—W—a6—W—a7 w A1 W 4 A3 W \ 6 A6 A5 yf\ w A3 w I A / W / A5 -W \ ,w XA6 / w\, A1-W \ ,/ W—A3^ w w / \ / W-A3 \ w / A7 w em que: A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 e A8 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: NR40R41, S, SH, S(Pg), O, OH, PR42R43, P(0)R42R43, P(S)R42R43, P(NR44)R42R43; W é uma ligação, CH ou um grupo espaçador seleccionado de entre: alquilo -5- Cι-Cio substituído com 0-3 R52, arilo substituído com 0-3 R52, cicloalquilo substituído com 0-3 R , heterocicloalquilo substituído com 0-3 R52, aralquilo substituído com 0-3 R52 e alquilarilo substituído com 0-3 R52; Wa é um grupo alquilo CrCio ou um carbociclo C3-Ci4; R40, R41, R42, R43 e R44 são cada um independentemente seleccionados de entre: uma ligação a Ln, hidrogénio, alquilo CrCio substituído com 0-3 R , arilo substituído com 0-3 R , cicloalquilo substituído com 0-3 R52, heterocicloalquilo substituído com 0-3 R , aralquilo substituído com 0-3 R , alquilarilo substituído com 0-3 R , heterociclo substituído com 0-3 R e um electrão, com a condição de que quando um dos R40 ou R41 é um electrão, então o outro é também um electrão, e com a condição de que quando um dos R42 ou R43 é um electrão, então o outro é também um electrão; adicionalmente, R40 e R41 podem combinar-se para formarem =C(alquil Ci-C3)(alquilo CrC3); R é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: uma ligação a Ln, =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R53, -C(=0)R53, -C(=0)N(R53)2, -CHO, -CH2OR53, -0C(=0)R53, -OC(=0)OR53a, -OR53, -0C(=0)N(R53)2, -NR53C(=0)R53, -NR54C(=0)0R53a, -NR53C(=0)N(R53)2, -NR54S02N(R53)2, -NR54S02R53a, -SO3H, -S02R53a, -SR53, -S(=0)R53a, -S02N(R53)2, -N(R53)2, -NHC(=NH)NHR53, -C(=NH)NHR53, =NOR53, N02, -C(=0)NH0R53, -C(=0)NHNR53R53a, -OCH2-C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo C1-C5, alcenilo C2-C4, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, alcoxialquilo C2-Q, arilo substituído com 0-2 R53, um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente -6- mrr Μ,Λ seleccionados de entre N, S e O; R53, R53a e R54 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: uma ligação a Ln, alquilo CpCg, fenilo, benzilo, alcoxi Ci-C6, haleto, nitro, ciano e trifluorometilo; Pg é um grupo de protecção de tiol capaz de ser deslocado por uma reacção com um radionuclido; Q é um composto de fórmula (I): / J 1 R32 K' \ M \ NR‘ (R22 (R23) ^J,C (R21) Rl) n. (I) ou uma sua forma de sal ou pró-droga farmaceuticamente aceitável, em que: R31 é um sistema em anel carbocíclico C6-C14 saturado, parcialmente saturado ou aromático, substituído com 0-4 R10 ou RIOa, e suportando facultativamente uma ligação a Ln; um sistema em anel heterocíclico, facultativamente substituído com 0-4 R10 ou RIOa, e suportando facultativamente uma ligação a Ln; R32 é seleccionado de entre: -C(=0)-, -C(=S)-, -S(=0)2-, -S(=0)-, -P(=Z)(ZR13)-; Z é S ou O; n" e n’ são independentemente 0-2; -7- R e R são independentemente seleccionados de entre: hidrogénio; alquilo CrCg substituído com 0-2 R11; alcenilo C2-C8 substituído com 0-2 R11; alcinilo C2-C8 substituído com 0-2 R11; cicloalquilo C3-C10 substituído com 0-2 R11; bicicloalquilo Cô-Qo substituído com 0-2 R11; uma ligação a Ln; arilo substituído com 0-2 R12; um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R12; =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R13)2, -CHO, -CH2OR13, -OC(=0)R13, -OC(=0)OR13a, -OR13, -0C(=0)N(Ri3)2, -NR13C(=0)R13, -NR,4C-(=0)OR13a, -NR13C(=0)N(R13)2, NR14S02N(R13)2, -NR14S02R13a, -SO3H, -S02R13a, -SR13, -S(=0)R13a, -S02N(R13)2, -N(R13)2, -NHC(=NH)NHR13, -C(=NH)NHR13, =NOR13, N02, -C(=0)NHOR13, -C(=0)NHNRl3Rl3a, -0CH2C02H, 2-(l-morfolino)etoxi; R1 e R21 podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 3-7 membros substituído com 0-2 R12; quando n' é 2, R1 ou R21 podem altemativamente ser considerados em conjunto com R1 ou R21 sobre um átomo de carbono adjacente para formarem uma ligação directa, formando por esse meio uma ligação dupla ou tripla entre os referidos átomos de carbono; R22 e R23 são independentemente seleccionados de entre: hidrogénio; alquilo C1-C4 facultativamente substituído com 1-6 halogéneos; benzilo; 77 *y\ · R e R podem altemativamente juntar-se para formarem um anel 1 7 carbocíclico de 3-7 membros substituído com 0-2 R ; quando n" é 2, R22 ou R23 podem altemativamente ser considerados em 77 7*3 conjunto com R ou R sobre um átomo de carbono adjacente para formarem uma ligação directa, formando por esse meio uma ligação dupla ou tripla entre os átomos de carbono adjacentes; -8- « 1 2 21 R e R , onde R é H, podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 5-8 membros substituído com 0-2 R12; R11 é seleccionado de entre um ou mais dós seguintes: =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(Ri3)2, -CHO, -CH2OR13, -0C(=0)R13, -0C(=0)0R13a, -OR13, -0C(=0)N-(R,3)2, -NR13C(=0)R13, -NR14C(=0)0R13a, -NR13C(=0)N(R13)2, NR,4S02N(R13)2, -NR14S02R13a, -S03H, -S02R13a, -SR13, -S(=0)R,3a, -S02N(R13)2, -N(R13)2, -NHC(=NH)NHR13, -C(=NH)NHR13, =NOR13, N02, -C(=0)NH0R13, -C(=0)NHN‘ Rl3Rl3a, -0CH2C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo C1-C5, alcenilo C2-C4, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, alcoxialquilo C2-C6, cicloalcoxi Q-c6, alquilo C1-C4 (sendo alquilo substituído com 1-5 grupos seleccionados independentemente de entre: -NR13R14, -CF3, N02, -S02R,3a ou -S(=0)R13a), arilo substituído com 0-2 R12, um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O, sendo o referido anel 1 Λ heterocíclico substituído com 0-2 R ; R12 é seleccionado de entre um ou mais dos seguintes: fenilo, benzilo, fenetilo, fenoxi, benziloxi, halogéneo, hidroxi, nitro, ciano, alquilo C1-C5, cicloalquilo C3-C6, cicloalquilmetilo C3-C6, arilalquilo C7-Cio, alcoxi CrC5, -C02R13, -C(=0)NHOR13a, -C(=0)NHN(R13)2, =NOR13, -B(R34)(R35), cicloalcoxi C3-C6, -OC(=0)R13, -C(=0)R13, -OC(=0)ORI3a, -OR13, -(alquil Ci-C4)OR13, N(R13)2, -0C(=0)N(R13)2, -NR13C(=0)R13, -NR13C(=0)0Rl3a, -NR13C(=0)N(R13)2, -NR,3S02N(R13)2, -NR13S02Rl3a, -SO3H, -S02R13a, -S(=0)R13a, -SR13, -S02N(R13)2, alcoxialquilo C2-Cé, metilenodioxi, etilenodioxi, haloalquilo C1-C4, haloalcoxi C1-C4, (alquil Ci-C4)carboniloxi, -9-
    (alquil CrC4)carbonilo, (alquil Ci-C4)carbonilamino, -OCH2-C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo CpC4 (sendo o alquilo substituído com -N(R13)2, -CF3, N02 ou -S(=0)R13a); 1 'λ R é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo C,-C,0, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-Ci2} arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-C10; Rl3a é alquilo Q-Cio, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-Ci2, arilo, -(alquil Ci-Ci0)arilo ou alcoxialquilo C3-C|0; quando dois grupos R13 estão ligados a um N isolado, os referidos 1 grupos R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)2_5 ou -(CH2)0(CH2)-; R14 é OH, H, alquilo CrC4 ou benzilo; R2 é H ou alquilo Ci-C8; rIO e R10a são independentemente seleccionados de entre um ou mais dos seguintes: fenilo, benzilo, fenetilo, fenoxi, benziloxi, halogéneo, hidroxi, nitro, ciano, alquilo C1-C5, cicloalquilo C3-C6, cicloalquilmetilo C3-C6, arilalquilo C7-C10, alcoxi C1-C5, -C02R]3, -C(=0)N(R13)2, -C(=0)NH0R13a, -C(=0)NHN(R13)2, =NOR13, -B(R34)(R35), cicloalcoxi C3-C6, -0C0(=0)R13, -C(=0)R13, -0C(=0)0R13a, -OR13, -(alquil CrC4)OR13, N(R13)2, -0C(=0)N(R13)2, -NR13C(=0)R13, -NR13C(=0)0R13a, -NR13C(=0)N(R13)2, -NR13S02N(R13)2, -NR13S02R13a, -S03H, -S02Rl3a, -S(=0)R13a, -SR13, -S02N(Ri3)2, alcoxialquilo C2-C6, metilenodioxi, etilenodioxi, haloalquilo CrC4 (incluindo -CVFW onde v=laté3 e w=l até(2v+l)), haloalcoxi C]-C4, (alquil C]-C4)carboniloxi, (alquil Ci-C4)carbonilo, (alquil C]-C4)carbo-nilamino, -0CH2C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo CrC4 (sendo o alquilo substituído com -N(R13)2, -CF3, N02 ou -S(=0)R13a); - 10 - J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de estrutura -N(R3)C(R4)(R5)C(=0)-, em que: RJ é H ou alquilo CrCg; R4 é H ou alquilo Ci-C3; R5 é seleccionado de entre: hidrogénio; alquilo Q-Cg substituído com 0-2 R11; alcenilo C2-Cg substituído com 0-2 R11; alcinilo C2-Cg substituído com 0-2 R11; cicloalquilo C3-Cio substituído com 0-2 11 19 R ; uma ligação a Ln; arilo substituído com 0-2 R ; um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R ; =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R13)2, -CHO, -CH2OR13, -OC(=0)R13, -OC(=0)OR13a, -OR13, -0C(=0)N(R13)2, -NR13C(=0)R13, -NR14C(=0)0R13a, -NR,3C(=0)N(R13)2, NR14S02N(R13)2, -NRI4S02Rl3a, -S03H, -S02R13a, -SR13, -S(=0)R13a, -S02N(R13)2, -N(R13)2, -NHC(=NH)NHR13, -C(=NH)NHR13, =NOR13, N02, -C(=0)NHOR13, -C(=0)NHNR13R13a, =NOR13, -B(R34)(R35), -0CH2C02H, 2-( 1 -morfolino)etoxi, -SC(=NH)NHR13, N3, -Si(CH3)3, (aquil C,-C5)NHR16; -(alquil C0-C6)X;
    onde q é independente mente 0-1;
    -(CH2)mS(0)p(CH2)2X onde m = 1-2 e p' = 0-2, em que X é definido abaixo; e R3 e R4 podem também ser considerados em conjunto para (CH2)nX formarem -CH2 CHCH2-, onde NR13 // n = 0-1 e Xé -NH- N(R13)R13 ; R3 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)t- ou -CH2S(0)PC(CH3)2-, onde t = 2-4 e p' = 0-2; ou R4 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)„-, onde u = 2-5; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura -N(R6)CH(R7)C(=0)-, em que: R6 é H ou alquilo CrC8; n R é seleccionado de entre: -(alquil Ci-C7)X; -(CH2) 2'q / \ em que cada q é indepen- "•(CH2)q-X n r dentemente 0-2 e a substituição no fenilo é na posição 3 ou 4;
    em que cada q é independen temente 0-2 e a substituição no ciclo-hexilo é na posição 3 ou 4; -(CH2)mO-(alquil Ci-C4)-X, onde m = 1 ou 2; -(CH2)mS(0)p-(alquil CrC4)-X, onde m=l ou 2 e p-0-2; e X é seleccionado de entre: - 12- -NH-C // λ NR 13 N(R13)R' ; -N(NRIJ)RU; -C(=NH)(NH2); -SC- (=NH)-NH2; -NH-C(=NH)(NHCN); -NH-C(=NCN)(NH2); -NH-C(=N-OR13)(NH2); R6 e R7 podem altemativamente ser considerados em conjunto para (CH2)nX formarem -(CH2)q CH(CH2)q-, em que cada q é independentemente 1 ou 2 e em que n = 0 ou 1 e X é NH2 ou NR13 // -NH-C \ N(R13)R’ ; L é -Y(CH2)vC(=0)-, em que: Y é NH, N(alquilo Ci-C3), O ou S; e v = 1 ou 2; M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura - NR17- <pH-C(=0)-(CjH(R4))qi R8 , em que q' é 0-2; R17 é H, alquilo C,-C3; R8 é seleccionado de entre: -C02R13, -S03R13, -S02NHR14, -B(R34)(R35), -NHS02CF3, -C0NHNHS02CF3, -PO(OR,3)2j -PO(OR13)Ri3, -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O), -S02NHC0R13, -C0NHS02R13a, -CH2C0NHS02R13a, -NHS02NHC0R13a, -NHC0NHS02Rl3a, -S02NHC0NHR13; R34 e R35 são independentemente seleccionados de entre: -OH, - 13 - -F, -N(R13)2 ou alcoxi CrC8; R34 e R35 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem: um éster de boro cíclico onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida de boro cíclica divalente onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida-éster de boro cíclica onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O.
  2. 2. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: R31 está ligado a (C(R23)R22)n" e (C(R21)R')n- em 2 átomos diferentes no referido anel carbocíclico.
  3. 3. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: n" é 0 e n' é 0; n" é 0 e n' é 1; n" é 0 e n' é 2; n" é 1 e n' é 0; n" é 1 e n' é 1; n" é 1 e n' é 2; n" é 2 e n' é 0; n" é 2 e n' é 1; ou n" é 2 e n' é 2. -14- 4. Ο reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: R6 é metilo, etilo ou propilo.
  4. 5. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: R32 é seleccionado de entre: -C(=0)-, -C(=S)~, -S(=0)2-; R1 e R22 são independentemente seleccionados de entre: hidrogénio; alquilo CpCg substituído com 0-2 R11; alcenilo C2-Cg substituído com 0-2 R11; alcinilo C2-Cg substituído com 0-2 R11; cicloalquilo C3-C8 substituído com 0-2 R11; bicicloalquilo Có-Cjo substituído com 0-2 R11; uma ligação a Ln; arilo substituído com 0-2 R12; um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R12; =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R13)2, -CHO, -CH2OR13, -OC(=0)R13, -OC(=0)OR13a, -OR13, -0C(=0)N(R13)2, -NR13C(=0)R13, -NR14C-(=0)OR13a, -NR13C(=0)N(Rl3)2, NR14S02N(R13)2, -NR14S02R13a, -SO3H, -S02Rl3a, -SR13, -S(=0)R13a, -S02N(R13)2, -CH2N(RI3)2, -N(Ri3)2, -NHC(=NH)NHR13, -C(=NH)NHR13, N02; R1 e R21 podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 5-7 membros substituído com 0-2 R ; quando n' é 2, R1 ou R21 podem altemativamente ser considerados em 1 01 conjunto com R ou R sobre um átomo de carbono adjacente para formarem uma ligação directa, formando por esse meio uma ligação dupla ou tripla entre os referidos átomos de carbono; R e R podem altemativamente juntar-se para formarem um anel 1 7 carbocíclico de 3-7 membros substituído com 0-2 R ; 77 77 quando n" é 2, R ou R podem altemativamente ser considerados em 22 23 conjunto com R ou R sobre um átomo de carbono adjacente para formarem uma ligação directa, para formar por esse meio uma ligação dupla ou tripla entre os referidos átomos de carbono; R1 e R2, onde R21 é H, podem altemativamente juntar-se para formarem um anel carbocíclico de 5-8 membros substituído com 0-2 R12; R11 é seleccionado de entre um ou mais dos seguintes: =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -C02R13, -C(=0)R13, -C(=0)N(R13)2, -CHO, -CH2OR13, -0C(=0)R13, -OC(=0)OR,3a, -OR13, -OC(=0)N-(R13)2, -NR13C(=0)R13, -NR14C(=0)0R13a, -NR,3C(=0)N(R13)2, -NR14S02N(R13)2, -NR14S02R13a, -S03H, -S02R13a, -SR13, -S(=0)R13a, -S02N(R13)2, -CH2N(R13)2, -N(R13)2, -NHC(=NH)-NHR13, -C(=NH)NHR13, =N0R13, N02, alquilo C,-C5, alcenilo C2-C4, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, alcoxialquilo C2-C6, alquilo Ci-C4 (substituído com -NR13R14, -CF3, N02, -S02R13 ou -S(=0)R13a), arilo substituído com 0-2 R , um sistema em anel heterocíclico de 5-10 membros contendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S e O, sendo o referido anel heterocíclico substituído com 0-2 R12; R3 é H ou CH3; R5 é H, alquilo CrC8, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil Ci-C6)metilo, (cicloalquil Ci-C6)etilo, fenilo, fenilmetilo, CH2OH, CH2SH, CH2OCH3, CH2SCH3, CH2CH2SCH3, (CH2)sNH2, (CH2)sNHC-(=NH)(NH2), (CH2)sNHR16, onde s = 3-5; uma ligação a Ln; R e R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)t- (t = 2-4) ou -CH2SC(CH3)2-; ou R7 é seleccionado de entre: -(alquil CpCyjX; - 16- - 16-
    em que cada q é indepen- -(CH2)q- '^‘(CH2)q-X dentemente 0-2 e a substituição no fenilo é na posição 3 ou 4; —(CH2) g
    A ^(^2) -X em que cada q é independen- ^ t temente 0-2 e a substituição no ciclo-hexilo é na posição 3 ou 4;
    -(CH2)mO-(alquil C]-C4)-X, onde m = 1 ou 2; -(CH2)mS-(alquil CrC4)-X, onde m=l ou 2; e X é seleccionado de entre: -NH-C(=NH)(NH2), -NHR13, -C(=NH)(NH2), -SC(NH)-NH2; R6 e R7 podem altemativamente ser considerados em conjunto para (CH2)nX formarem -CH2 CHCH2-, onden = 0ou 1 eXéNH2ou -NH-C(=NH)(NH2); L é -Y(CH2)vC(=0)-, em que: Y é NH, N(alquilo C1-C3), O ou S; e v = 1 ou 2; M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura - NR17- (pH-C(=0)-(CjHfR4)),· R8 , em que q' é 0-2; R17 é H, alquilo CrC3; - 17- R1 2 3 4 é seleccionado de entre: -C02R13, -SO3R13, -SO2NHR14, -B(R34)(R35), -NHSO2CF3, -CONHNHSO2CF3, -PO(OR13)2, -PO(OR13)R13, -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O), -SO2NHCOR13, -CONH-S02R13a, -CH2C0NHS02R13a, -NHS02NHC0Rl3a, -NHCONH-S02R13a, -SO2NHCONHR13; R34 e R35 são independentemente seleccionados de entre: -OH, -F, -NR,3R14 ou alcoxi C,-C8; R34 e R35 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem: um éster de boro cíclico onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida de boro cíclica divalente onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O; uma amida-éster de boro cíclica onde a referida cadeia ou anel contém desde 2 a 20 átomos de carbono e, facultativamente, 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O. 1 O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: 2 R31 é seleccionado de entre: 3 (a) um anel carbocíclico de 6 membros saturado, parcialmente 4 saturado ou aromático, substituído com 0-3 R5 ou R10a, e suportando 5 facultativamente uma ligação a Ln; - 18- (b) um anel carbocíclico bicíclico condensado de 8-11 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, substituído com 0-3 R10 ou R,0a, e suportando facultativamente uma ligação a Ln; ou (c) um anel carbocíclico tricíclico condensado de 14 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, substituído com 0-3 R10 ou RIOa, e suportando facultativamente uma ligação a Ln.
  5. 7. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: R31 é seleccionado de entre: (a) um anel carbocíclico de 6 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, de fórmulas: W' em que qualquer das ligações que formam o anel carbocíclico pode ser uma ligação simples ou dupla, em que o referido anel carbocíclico é substituído com 0-3 R10, e suporta facultativamente uma ligação a Ln; (b) um anel carbocíclico bicíclico de 10 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, de fórmula: em que qualquer das ligações que formam o anel carbocíclico pode ser uma ligação simples ou dupla, em que o referido anel carbocíclico é independentemente substituído com 0-4 R10, e suporta facultativamente uma ligação a Ln; e - 19- (c) um anel carbocíclico bicíclico de 9 membros saturado, parcialmente saturado ou aromático, de fórmula:
    em que qualquer das ligações que formam o anel carbocíclico pode ser uma ligação simples ou dupla, em que o referido anel carbocíclico é independentemente substituído com 0-4 R10, e suporta facultativamente uma ligação a Ln.
  6. 8. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: R31 é seleccionado de entre (a linha a tracejado pode ser uma ligação simples ou dupla):
    em que R31 pode ser independentemente substituído com 0-3 R10 ou R10a, e suporta facultativamente uma ligação a Ln; n" é 0 ou 1; e n' é 0-2. -20-
  7. 9. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: R1 e R22 são independentemente seleccionados de entre: fenilo, benzilo, fenetilo, fenoxi, benziloxi, halogéneo, hidroxi, nitro, ciano, alquilo CpCs; cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, arilalquilo C7-C10, alcoxi C,-C5, -C02R13, -C(=0)NH0R13a, -C(=0)NHN(R13)2, =NOR13, -B(R34)(R35), cicloalcoxi C3-C6, -0C(=0)R13, -C(=0)R13, -0C(=0)0Rl3a, -OR13, -(alquil C,-C4)-OR13, -N(R13)2, -0C(=0)N-(R13)2, -NR13C(=0)R13, -NRl3C(=0)0R13a, -NR13C(=0)N(R13)2, -NRi3S02N(R13)2, NR13S02R13a, -S03H, -S02R13a, -S(=0)R13a, -SR13, -S02N(R13)2, alcoxialquilo C2-Cô, metilenodioxi, etilenodioxi, haloalquilo C1-C4, haloalcoxi C1-C4, (alquil CrC4)carboniloxi, (alquil Ci-C4)carbonilo, (alquil C1-C4)carbonilamino, -0CH2C02H, 2-(l-morfolino)etoxi, alquilo CpC4 (sendo o alquilo substituído com -N(R13)2, -CF3, N02 ou -S(=0)R13a).
  8. 10. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: R31 é seleccionado de entre:
    -21 - QgSSBSOSi em que R31 pode ser independentemente substituído com 0-3 R10 ou R10a, e pode facultativamente suportar uma ligação a Ln; R32 é -C(=0)-; n" é 0 ou 1; n* é 0-2; R1 e R22 são independentemente seleccionados de entre: H, alquilo Ci-C4, fenilo, benzilo, fenil-(alquilo C2-C4), alcoxi C|-C4; e uma ligação a Ln; 21 23 R e R são independentemente H ou alquilo CrC4; R2 é H ou alquilo Ci-C8; R10 e R10a são independentemente seleccionados de entre: H, alquilo CpCg, fenilo, halogéneo ou alcoxi CpC4; J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de estrutura -N(R3)C(R4)(R5)C(=0)-, em que: R3 é H ou CH3; R4 é H ou alquilo C1-C3; R5 é H, alquilo Ci-Cg, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C<5)metilo, (cicloalquil C3-C6)etilo, fenilo, fenilmetilo, CH2OH, CH2SH, CH2OCH3, CH2SCH3, CH2CH2SCH3, (CH2)sNH2, (CH2)sNHC-(=NH)(NH2), (CH2)sNHR16, onde s = 3-5; e uma ligação a Ln; ou 3 5 R e R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)t- (t = 2-4) ou -CH2SC(CH3)2-; ou R4 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)U-, onde u = 2-5; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; ou 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero L de aminoácido de estrutura -N(R6)CH(R7)C(=0)-, em que: R6 é H ou alquilo CrC8;
    -(CH2)rX, onde r = 3-6;
    -(CH2)mS(CH2)2X, onde m = 1 ou 2; -(alquil C3-C7)-NH-(alquilo CrC6); - (Ci~C4 alquilo V ' / 0-3 -(CH2)m-0-(alquil Ci-C4)-NH-(alquilo CpCg), onde m = 1 ou 2; -(CH2)m-S-(alquil CrC4)-NH-(al quilo Q-Có), onde m=l ou 2; e X é -NH2 ou -NHC(=NH)(NH2); ou R6 e R7 podem altemativamente ser considerados em conjunto para (CH2)nX formarem -CH2 CHCH2-, onde n = 0 ou 1 e X é NH2 ou -NHC(=NH)(NH2); L é -Y(CH2)vC(=0)-, em que: Y é NH, O ou S; e v = 1 ou 2;
    M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura -NR17· })- , em que q' é 0-2; R17 é H, alquilo C1-C3; R8 é seleccionado de entre: -C02R13, -S03R13, -S02NHR14, -B(R34)(R35), -NHS02CF3, -C0NHNHS02CF3, -PO(OR13)2, -PO(OR13)Ri3, -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre N, S ou O), -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos seleccionados independentemente de entre N, S ou O), -S02NHC0R13, -C0NHS02R,3a, -CH2C0NHS02R13a, -NHS02NHC0R13a, -NHC0NHS02R13a, -S02NHC0NHR13; R13 é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo Ci-Qo, cicloalquilo C3-Cio, alquilcicloalquilo C4-C12, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-Ci0; Rl3a é alquilo CpCio, cicloalquilo C3-Ci0, alquilcicloalquilo C4-Ci2, arilo, -(alquil Ci-C]0)arilo ou alcoxialquilo C3-Ci0; quando dois grupos R13 estão ligados a um N isolado, os referidos grupos R13 podem altemativamente ser considerados em -24- conjunto para formarem -(CH2)2-5- ou -(CH2)0(CH2)-; R14 é OH, H, alquilo C1-C4 ou benzilo.
  9. 11. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: Q é um composto de fenilo 1,3-dissubstituído da fórmula (II): / K M \ NíC J \
    CHR1 <II) em que: o anel fenilo mostrado na fórmula (II) pode ser substituído com 0-3 R10 e pode facultativamente suportar uma ligação a Ln; R10 é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo CpCg, fenilo, halogéneo ou alcoxi C1-C4; R1 é H, alquilo C1-C4, fenilo, benzilo, fenil(alquilo C2-C4), ou uma ligação a Ln, R2 é H ou metilo; J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de estrutura -N(R3)C(R4)(R5)C(=0)-, em que: R3 é H ou CH3; R4 é H ou alquilo C,-C3; R5 é H, alquilo C]-C8, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, (cicloalquil Q-C^etilo, fenilo, fenilmetilo, CH2OH, CH2SH, CH2OCH3, CH2SCH3, CH2CH2SCH3s (CH2)sNH2, -(CH2)sNHC-(=NH)(NH2), -(CH2)sNHR16, onde s = 3-5, ou uma ligação a Ln; R e R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -CH2CH2CH2-; ou R4 e R5 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)U-, onde u = 2-5; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero L de aminoácido de estrutura -N(R6)CH(R7)C(=0)-, em que: R6 é H ou alquilo C]-C8;
    -(CH2)rX, onde r = 3-6;
    -(CH2)mS(CH2)2X, onde m = 1 ou 2; -(alquil C3-C7)-NH-(alquilo CrC6);
    -(CH2)m-0-(alquil C|-C4)-NH-(alquilo Ci-C6), onde m = 1 ou 2; -(CH2)m-S-(alquil Ci-C4)-NH-(alquilo Ci-C6), onde m=l ou 2; e X é -NH2 ou -NHC(=NH)(NH2), com a condição de que X não é -NH2 quando r = 4; ou R6 e R7 podem altemativamente ser considerados em conjunto para (CH2)nX formarem -CH2CHCH2-, onde n = 0-1 e X é -NH2 ou -NHC(=NH)(NH2); L é -Y(CH2)vC(=0)-, em que: Y é NH, O ou S; ev = 1-2; M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura - NR17- <pH-C(=0> (CjH(R4))q· R8 , em que q' é 0-2; R17 é H, alquilo Ci-C3; R8 é seleccionado de entre: -C02R13, -S03R13, -S02NHR14, -B(R34)(R35), -NHS02CF3, -C0NHNHS02CF3j -PO(ORI3)2, -PO(ORi3)R13, -S02NH-heteroarilo (sendo o referido heteroarilo de 5-10 membros e tendo 1-4 heteroátomos seleccionados independentemente de entre N, S ou O), -S02NHC0R13, -C0NHS02R13a, -CH2C0NHS02R13a, -NHS02NHC0R13a, -NHC0NHS02R13a, -S02NHC0NHR13; Rlj é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo Q-Qo, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-C12, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-C10; R13a é alquilo C 1-C10, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-C12, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-C10; 11 quando dois grupos R estão ligados a um N isolado, os referidos grupos R13 podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -(CH2)2-5- ou -(CH2)0(CH2)-; R14 é OH, H, alquilo C1-C4 ou benzilo.
  10. 12. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: Q é um composto de fenilo 1,3-dissubstituído da fórmula (II): /J \ K M \
    cm1 (II) em que: o anel fenilo mostrado na fórmula (II) pode ser substituído com 0-3 R10 ou Ri03; R10 ou R,0a são independentemente seleccionados de entre: H, alquilo Cj-Cg, fenilo, halogéneo ou alcoxi C,-C4; R1 é H, alquilo C1-C4, fenilo, benzilo ou fenil(alquilo C2-C4); R é H ou metilo; -28- J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de estrutura -N(R3)C(R4)(R5)C(=0)-, em que: R3 é H ou CH3; R4éH; R5 é H, alquilo CrC8, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6)metilo, (cicloalquil C3-C6)etilo, fenilo, fenilmetilo, CH2OH, CH2SH, CH2OCH3, CH2SCH3, CH2CH2SCH3, (CH2)sNH2, (CH2)sNHC-(=NH)(NH2), (CH2)sNHR16, onde s = 3-5; ou uma ligação a Ln; R e R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -CH2CH2CH2-; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero L de aminoácido de estrutura -N(R6)CH(R7)C(=0)-, em que: R6 é H ou alquilo C3-C8; R7 é —(CH2)q-
    ,NH NK—C' NH,. * f onde q = 0 ou 1; — (CH2)q
    ^nh c \jh2 -(CH2)rX, onde r = 3-6; CK2X ~CH2 — ch2
    -29-
    -(CH2)mS(CH2)2X, onde m = 1 ou 2; -(alquil C4-C7)-NH-(alqui1o C,-C6);
    - (Cl“C4 alquilo) -(CH2)m-0-(alquil Ci-C4)-NH-(alquilo CpCé), onde m = 1 ou 2; -(CH2)m-S-(alquil CrC4)-NH-(alquilo CrCô), onde m=l ou 2; e X é -NH2 ou -NHC(=NH)(NH2), com a condição de que X não é -NH2 quando r = 4; ou L é -YCH2C(=0)-, em que: Y é NH, O;
    R M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura - NR17· 3)- , em que q'é 1; R17 é H, alquilo Ci-C3; R8 é seleccionado de entre: -C02H ou -S03R13; R13 é independentemente seleccionado de entre: H, alquilo CpCio, cicloalquilo C3-C10, alquilcicloalquilo C4-Ci2, arilo, -(alquil Ci-Cio)arilo ou alcoxialquilo C3-Ci0.
  11. 13. O reagente de acordo com a reivindicação 12, em que: o anel fenilo mostrado na fórmula (II) suporta uma ligação a Ln e pode ainda ser substituído com 0-2 R10 ou RIOa; R10 ou R10a são independentemente seleccionados de entre: H, alquilo CrCs, fenilo, halogéneo ou alcoxi CrC4; -30-
    J é β-Ala ou um isómero L ou isómero D de aminoácido de fórmula -N(R3)CH(R5)C(=OK em que: R3 é H e R5 é H, CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, CH(CH3)CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, CH2CH2SCH3, CH2CH(CH3)2, (CH2)4NH2, (alquil C3-C5)NHR16; ou R3éCH3eR5éH; ou 3 5 R e R podem altemativamente ser considerados em conjunto para formarem -CH2CH2CH2-; R16 é seleccionado de entre: um grupo de protecção de amina; 1-2 aminoácidos; 1-2 aminoácidos substituídos com um grupo de protecção de amina; K é um isómero L de aminoácido de fórmula -N(CH3)CH(R7)C(=0)-, em que: R7 é -(CH2)3NHC(=NH)(NH2); L é -NHCH2C(=0)-; e
    M é um isómero D ou isómero L de aminoácido de estrutura -NR17· ))- , em que q'é 1; R4 é H ou CH3; R17éH; R8 é -C02H; -S03H. -31 -
  12. 14. O reagente de acordo com as reivindicações 11 ou 12, em que: o anel fenilo na fórmula (II) suporta uma ligação a Ln; R'eR2 são independentemente seleccionados de entre H, metilo; J é seleccionado de entre D-Val, ácido D-2-aminobutírico, D-Leu, D-Ala, Gly, D-Pro, D-Ser, D-Lys, β-Ala, Pro, Phe, NMeGly, D-Nle, D-Phg, D-Ile, D-Phe, D-Tyr, Ala, NE-p-azidobenzoil-D-Lys, NE-p-benzoilben-zoil-D-Lys, NE-triptofanil-D-Lys, NE-o-benzilbenzoil-D-Lys, NE-p-ace-tilbenzoil-D-Lys, NE-dansil-D-Lys, NE-glicil-D-Lys, NE-glicil-/?-ben-zoilbenzoil-D-Lys, NE-/?-fenilbenzoil-D-Lys, NE-m-benzoilbenzoil-D--Lys, NE-o-benzoiIbenzoil-D-Lys; K é seleccionado de entre NMeArg, Arg; L é seleccionado de entre Gly, β-Ala, Ala; M é seleccionado de entre: Asp, otMeAsp, βΜεΑερ, NMeAsp, D-Asp.
  13. 15. O reagente de acordo com a reivindicação 1, em que: R31 suporta uma ligação a Ln; R'eR2 são independentemente seleccionados de entre H, metilo; J é seleccionado de entre D-Val, ácido D-2-aminobutírico, D-Leu, D-Ala, Gly, D-Pro, D-Ser, D-Lys, β-Ala, Pro, Phe, NMeGly, D-Nle, D-Phg, D-Ile, D-Phe, D-Tyr, Ala; K é seleccionado de entre NMeArg; L é Gly; M é seleccionado de entre: Asp, aMeAsp, βΜεΑερ, NMeAsp, D-Asp.
  14. 16. O reagente de acordo com as reivindicações 1-15, em que: Ch é seleccionado de entre: „V*-AJ W-A*-W A’ . A1 V wa A3 A2 A1-VV A3-W“A4-W“A6 vr | A2 w As ^A2-W —A<-W_A5_VY_A7 W^A2- W—A4—w—A6—w_A7 Ar VV 4 A3 w \ A6 W L w / w\ A1-w / \ ^Wv W A2 \ I A« / w A1-WVwvâ. W\ w / w A8, \ ^Aí \ / W-a3\ w / A7 w em que: A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 e A8 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: NR40R41, S, SH, S(Pg), OH; W é uma ligação, CH ou um grupo espaçador seleccionado de entre: alquilo C1-C3 substituído com 0-3 R52; Wa é um grupo metileno ou um carbociclo C3-C14; -33- R40, R41, R42, R43 e R44 são cada um independentemente seleccionados de entre: uma ligação a Ln, hidrogénio, alquilo CpCio substituído com 0-3 R , e um electrão, com a condição de que quando um dos R40 ou R41 é um electrão, então o outro é também um electrão, e com a condição de que quando um dos R42 ou R43 é um electrão, então o outro é também um electrão; adicionalmente, R40 e R41 podem combinar-se para formarem =C(alquil CrC3)(alquilo CrC3); R52 é independentemente seleccionado em cada ocorrência de entre: uma ligação a Ln, =0, F, Cl, Br, I, -CF3, -CN, -CO2R53, -C(=0)R53, -C(=0)N(R53)2, -CHO, -CH2OR53, -0C(=0)R53, -0C(=0)0R53a, -OR53, -0C(=0)N(R53)2, -NR53C(=0)R53, -NR54C(=0)0R53a, -NR53C(=0)N(R53)2, -NR54S02N(R53)2, -NR54S02R53a, -S03H, -S02R53a, -SR53, -S(=0)R53a, -S02N(R53)2, -N(R53)2, -NHC(=NH)NHR53, -C(=NH)NHR53, =NOR53, N02, -C(=0)NH0R53, -C(=0)NHNR53R53a, -OCH2-C02H, 2-(l-morfolino)etoxi; e R53, R53a e R54 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: uma ligação a Ln, alquilo Q-Cô·
  15. 17. O reagente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, da fórmula: (QLn)dCh , em que d é 1; e Ch é seleccionado de entre: ,w. W, ,W. A1 A2 ‘A3 A4 / -34- ÇgggS2SESB«! em que: A1 e A4 são SH ou SPg; A2 e A3 são NR41; W é independentemente seleccionado de entre: CHR52, CH2CHR52, CH2CH2CHR52 e CHR52C=0; e R41 e R52 são independentemente seleccionados de entre hidrogénio e uma ligação a Ln, e .W—a2 A1 / em que: A1 é NH2 ou N=C(alquil Ci-C3)(alquilo C1-C3); W é uma ligação; A2 é NHR40, em que R40 é um heterociclo substituído com R52, em que o heterociclo é seleccionado de entre: piridina, pirazina, prolina, furano, tiofurano, tiazole e diazina, e R52 é uma ligação a Ln.
  16. 18. O reagente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, da fórmula: (QLn)dCh , em que d é 1; e em que Ch é: ,W-A2 A1 t em que: A1 NH2 ou N=C(alquil C,-C3)(alquilo CrC3); W é uma ligação; A2 é NHR40, em que R40 é um heterociclo substituído com R52, em que 0 -35- μ heterociclo é seleccionado de entre piridina e tiazole e R é uma ligação a Ln.
  17. 19. O reagente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, em que Ln é um composto de fórmula: Μ1- [Y1 (CR55R56)h (Z V Υ2]Λ- - M2 em que Μ1, Μ2, Z1, R55, R26, Y1, Y2, h, h' e h" são como definidas de acordo com a reivindicação 1.
  18. 20. O reagente de acordo com a reivindicação 16, em que Ln é: -(CR55R56)g"-[Yl(CR55R56)hY2]h' - (CR55R56)g-, em que g", h, h’, Y1, Y2, R53 e R56 são definidas de acordo com a reivindicação 1.
  19. 21. O reagente de acordo com a reivindicação 17, em que Ln é: -(CR55R56)g"-[Y1(CR55R56)hY2]h' - (CR55R56)g"-, em que: g" é 0-5; h é 0-5; h’é 1-5; Y1 e Y2, em cada ocorrência, são independentemente seleccionados de entre: O, NR56, C=0, C(=0)0, 0C(=0)0, C(=0)NH-, C=NR56, S, SO, S02, S03, NHC(=0), (NH)2C(-0), (NH)2C-S; R55 e R56 são independentemente seleccionados em cada ocorrência de entre: hidrogénio, alquilo C]-Ci0; (alquil Ci-Ci0)arilo.
  20. 22. O reagente de acordo com a reivindicação 18, em que Ln é: -(CR55R56)g"-[Y,(CR55R56)hY2]h' - (CR55R56)g"-, em que: g” é 0-5; h é 0-5; h'é 1-5; Y1 e Y2, em cada ocorrência, são independentemente seleccionados de entre: O, NR56, C=0, C(=0)0, 0C(=0)0, C(=0)NH-, C=NR56, S, NHC(=0), (NH)2C(=0), (NH)2C=S; R55 e R56 são hidrogénio.
  21. 23. O reagente de acordo com a reivindicação 1, o qual é seleccionado de entre: H W OH ^0° o .—, o T .’^νΌ'ιτ Tr Tr NH
    -37-
    ΜΗ Λ
    ΟΗ e
  22. 24. Um estojo para a preparação de um composto radiofarmacêutico que compreende uma quantidade predeterminada de um reagente estéril, farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-23.
  23. 25. Um composto radiofarmacêutico que compreende um complexo de um reagente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 e um radionuclido seleccionado de entre 99mTc, 94mTc, 95Tc, inIn, 62Cu, 43Sc, 45Ti, 67Ga, 68Ga, 97Ru, 72As, 82Rb e 201T1.
  24. 26. Um composto radiofarmacêutico que compreende um complexo de um reagente de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-21 e um radionuclido seleccionado de entre 99mTc, nlIn e 62Cu.
  25. 27. Um composto radiofarmacêutico que compreende um complexo de um reagente de acordo com a reivindicação 22 e um radionuclido seleccionado de entre 99mTc e 11 'in.
  26. 28. Um composto radiofarmacêutico de acordo com a reivindicação 25, qual é seleccionado de entre: -39- -39- ΝΗ Λ
    ΝζΗ r'--rVr“
    ' ΗΝν^γ Γ.Η HhT^O ° •χτ1 ΜΗ Λ Β^Λ^ο ΟγΝν. Η rtT^O0 °V O ,-- Ο T (r/yN'N^vf« Cxy^H °
    OH Η N
    o OH
    HO HO ?S0xT OH HO -40- M J 'A ο ' ίΓ^Α^ο. λ^Ν-, Η ΗΝ^-γ(
    ΗΚΤ^'Ο°^Çr ,ΝΗ Vo- iLoV
    Νν. ^ΝΗ
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    \>w° η°Χμ^οη HO qu ur/
    -41 -
    -42-
    -43 -
    e
    -44- ΝΗ μΑr-yw*ν^Η πγΎ ην^Ο°^Τ· ^ σ^-Hj NHj ^=0 CH Ht*=<
    ,^ΝΗ Η ΜΗ
    .ΜΗ 29. 0 uso de um reagente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, para a preparação de um composto radiofarmacêutico para a visualização de locais de deposição de plaquetas num mamífero por formação de radioimagens. Lisboa, 28 de Agosto de 2000 V JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
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