PT662148E - Anticorpos monoclonais que reagem com regioes definidas do receptor de antigenios das celulas t - Google Patents

Description

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

DESCRICÃO

“Anticorpos monoclonais que reagem com regiõe6 definidas do receptor de antigénios das células T”

1. CAMPO DO INVENTO O presente invento, no campo da imunologia e da medicina, é dirigido a anticorpos monoclonais que reconhecem regiões definidas do receptor de antigénios das células T. Estes anticorpos monoclonais são úteis no diagnóstico e terapia de uma variedade de doenças relacionadas com o sistema imunitário e são ferramentas úteis para o estudo do sistema imunitário.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

2.1. O RECEPTOR DE ANTIGÉNIOS DE CÉLULAS T

Os linfócitos T interagem com os antigénios através do complexo receptor de antigénios das células T (TCR). O TCR é um heterodímero específico para cada clone em células T, que reconhece o seu antigénio alvo em associação com um antigénio de histocompatibilidade principal. Foi mostrado que o TCR estava associado de forma não covalente ao complexo CD3. O TCR é altamente polimórfico entre células T de diferentes especificidades. Aproximadamente 90 porcento das células T de sangue periférico expressam um TCR que consiste num polipéptido α e num polipéptido β. Foi mostrado que uma pequena percentagem de células T expressava um TCR consistindo num polipéptido γ e num polipéptido δ. (Relativamente a moléculas de TCR, ver Davis e Bjorkman, 1988, Nature 334: 395-402; Marrack e Kappler, 1986, Sei. Amer. 254: 36; Meuer et ai, 1984, Ann. Rev. Immunol. 2: 23-50; Brenner et al., 1986, Nature 322: 145-159; Krangel et ai, 1987, Science 237:1051-1055; Hata et ai, 1987, Science 238: 678-682; Hochstenbach et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 761-776). Cada uma das cadeias do receptor de antigénios das células T de um clone de células T é composta por uma combinação única de domínios designados variáveis (V), [de diversidade (D)] , de união (J) e constantes (C) (Siu et ai, 1984, Cell 37: 393; Yanagi et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3430). Foram identificadas regiões hiper-variáveis (Patten et ai, 1984, Nature 312: 40; Becker et ai, 1985, Nature 317: 430). Em cada clone de células T, a combinação dos domínios V, D e J de ambas as cadeias alfa e beta ou de ambas as cadeias delta e gama participa no reconhecimento do antigénio de um modo que é unicamente característico desse clone de células T e que define

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 2 um local de ligação único, também conhecido como idiotipo do clone de células T. Em contraste, o domínio C não participa na ligação ao antigénio.

2.2. GENES DO RECEPTOR DE ANTIGÉNIOS DE CÉLULAS T

Os genes de TCR, tal como os genes das imunoglobulinas, consistem em regiões que se reorganizam durante a ontogenia das células T (Chien et al., 1984, Nature 312: 31-35; Hedrick et al., 1984, Nature 308: 149-153; Yanagi et al., 1984, Nature 308:145-149). No ADN genómico, cada gene de TCR tem regiões V, J e C; os polipéptidos β e δ do TCR também têm regiões D. As regiões V, D, J e C são separadas umas das outras através de regiões espaçadoras no ADN genómico. Existem habitualmente muitos segmentos da região variável e menos segmentos das regiões de diversidade, de junção e constante. À medida que um linfócito amadurece, estes vários segmentos são unidos uns aos outros para criar uma sequência génica contínua consistindo numa região V, (D), J e C. A diversidade dos TCR, e portanto a especificidade das células T, é derivada de várias fontes (Barth et al., 1985, Nature 316: 517-523; Fink et al., 1986, Nature 321: 219-225): uma multiplicidade de segmentos génicos da linha germinativa (Chien et al., 1984, Nature 309: 322-326; Malissen etal., 1984, Ce//37: 1101-1110; Gascoigne et al., 1984, Nature 310: 387-391; Kavaler et al., 1984, Nature 310: 421-423; Siu et al., 1984, Nature 311: 344-349; Patten et al., 1984, Nature 312: 40-46); diversidade combinatória através da ligação dos diferentes segmentos V, D, J e C (Siu et al., 1984, Cell 37: 393-401; Goverman et al., 1985, Cell 40: 859-867); e flexibilidade de união, diversidade da região N e a utilização de múltiplas regiões D ou de qualquer um dos três enquadramentos de leitura para tradução para os segmentos de Dp. A diversidade dos TCR não parece surgir do mecanismo de hipermutação somática observado para as imunoglobulinas (Barth et al., supra). Como resultado destes mecanismos, são gerados TCR que diferem nos seus domínios amino-terminais, ou N-terminais (chamados regiões variáveis, ou V, construídas a partir de combinações dos segmentos génicos V, D e J) mas que são semelhantes no resto, incluindo nos seus domínios carboxi-terminais, ou C-terminais (chamados regiões constantes). De forma concordante, é estabelecido um repertório de TCR quase ilimitado. O gene //do TCR parece assemelhar-se muito ao gene V da imunoglobulina por ter três segmentos génicos, V//, Όβ e όβ os quais se reorganizam para formar um gene β contíguo (Siu et al., 1984, Cell 37: 393-401). O locus β foi bem

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 3 caracterizado em ratinhos, onde abrange 700-800 quilobases de ADN e é constituído por duas regiões C quase idênticas organizadas em série com um elemento D e um grupo de 5-6 elementos J a 5’ do cada uma (Kronenberg et al., 1986, Ann. Rev. Immunol. 3: 537-560). Aproximadamente vinte a trinta regiões Μβ localizam-se a montante (5’) dos elementos D, J e C (Behlke et al., 1985, Science 229: 566-570) embora os genes Μβ se possam também localizar a 3’ dos genes C/? de murídeo (Malissen et al., 1986, Nature 319: 28). O estudo da estrutura e da diversidade dos genes da região variável da cadeia β do TCR humano conduziu ao agrupamento dos genes em duas sub-famílias Μβ distintas (Tillínghast et al., 1986, Science 233: 879-883; Concannon et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 6598-6602; Borst et al., 1987, J. Immunol. 139:1952-1959). O gene y de TCR foi identificado, primeiro em ratinhos (Saito et al., 1984, Nature 309: 757-762; Kranz et al., 1985, Nature 313: 762-755; Hayday et al., 1985, Ce//40: 259-269) e depois em humanos (Lefranc et al., 1985, Nature 316: 464-466; Murre et al., 1985, Nature 316: 549-552). O locus y do TCR humano parece consistir em entre cinco e dez genes da região variável, cinco da de união e dois da constante (Dialynas et ai, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 83: 2619). O locus α e o locus δ do TCR estão um a seguir ao outro no cromossoma humano 14. Os segmentos de codificação do TCR δ localizam-se inteiramente dentro do locus do gene α (Satyanarayana et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 8166-8170; Chien et ai, 1987, Nature 330: 722-727; Elliot et ai, 1988, Nature 331: 627-631). Estima-se que exista um mínimo de 45-50 regiões Va (Becker et ai, Nature 317: 430-434) enquanto que existem apenas aproximadamente 10 regiões V£(Chien et ai, 1987, supra). No sangue periférico, parece serem expressos dois genes VS predominantes, nomeadamente V£ 1 e Ví 2, identificáveis através de anticorpos monoclonais, BB3 e TCS1 δ, respectivamente. As sequências de ácido nucleico dos genes α do TCR foram relatadas (Sim et ai, 1984, Nature 312: 771-775; Yanagi et ai, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3430-3434; Berkout et ai, 1988, Nucl. Acids Res. 16: 5208).

2.3. ANTICORPOS PARA Q RECEPTOR DE ANTIGÉNIOS DE CÉLULAS T

Os anticorpos clonotípicos reagem apenas com um determinado clone de células T. Acuto et ai produziram anticorpos monoclonais clonotípicos contra uma linha celular de timócitos humanos e identificaram portanto o TCR cm células T3+ 4 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ relativamente indiferenciadas (1983, Cell 34: 717-726). Meuer et al. mostraram que anticorpos monoclonais clonotípicos anti-TCR acoplados a contas de Sepharose podiam induzir a produção de interleucina-2 (1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1509-1513). O anticorpo clonotípico anti-TCR dirigido para a linha celular CT8 podia apenas bloquear a função celular efectora citotóxica dessa linha de células T (Meuer et al., 1984, Ann. Rev. Immunol. 2: 23-50). Os anticorpos que reconhecem o TCR de muitas linhas de células T reconhecem epítopos partilhados, ou regiões estruturais, das proteínas do TCR. Brenner et al. verificaram que diferentes linhas de células T clonadas partilhavam determinantes antigénicos, nenhum dos quais parecendo estar acessível na superfície celular (1984, J. Exp. Med. 160: 541-551). O anticorpo monoclonal β-Estrutura-l (pF1 - “β-Framework-l”) reage com um “determinante escondido” na superfície de células T viáveis e reconhece o ^ polipéptido β do TCR em transferências de “Western" (Brenner et al., 1987, J.

Immunol. 138: 1502-1509). Outro anticorpo, WT31, que se pensava originalmente ser um reagente estrutural, é útil na ligação celular, mas não é eficiente em estudos de imunoprecipitação (Spits et al., 1985, J. Immunol. 135: 1922-1928). O WT31 parece agora reconhecer um determinante de CD3 ou talvez um epítopo combinado de TCR αβ:CDR3.

Um grupo relatou a criação de um anticorpo monoclonal que reage com uma cadeia do receptor de antigénios das células T \/β3.1 de murídeo (Pullen et al., (1988) Nature 335: 796-801). Vários grupos relataram a utilização desse anticorpo monoclonal anti-murídeo na caracterização e descrição funcional de clones de células T de murídeo que expressam o receptor νβ3 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Φ (1992) 89: 7727-7731; J. Exp. Med. (1989), 169: 1903-1909; Fukuoka Acta Medica (1991) 82: 59-70; e Nature (1988) 335: 796-801). Enquanto que pelo menos um grupo relatou verificações semelhantes às relatadas aqui no que respeita à implicação de subconjuntos limitados de células T em determinadas situações auto-imunes tais como a artrite reumatóide (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1991) 88: 8534-8538; Publicação Internacional N° WO 92/12996), ninguém foi capaz de desenvolver anticorpos monoclonais anti-V/33 humano.

2.4. ARTRITE REUMATÓIDE A artrite reumatóide (AR), uma doença inflamatória crónica e recorrente que envolve principalmente as articulações, afecta 1-3% dos norte-americanos, com uma proporção de mulheres para homens de 3:1. Os doentes de AR grave tendem a exibir manifestações extra-articulares incluindo vasculite, atrofia muscular,

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ nódulos subcutâneos, linfadenopatia, esplenomegalia e leucopenia. Pode ocorrer remissão espontânea; outros doentes têm episódios breves de artrite aguda com períodos maiores de actividade cm menor grau; ainda outros doentes progridem para deformações graves das articulações. Nalguns doentes com artrite reumatóide, particularmente os de doença prolongada, desenvolve-se uma constelação de sintomas designada “síndroma de Felty”, na qual a artropatia típica é acompanhada de esplenomegalia e de neutropenia. Estima-se que cerca de 15% do doentes de AR (AR grave e síndroma de Felty) ficam completamente incapacitados (“Primer on the Rheumatic Diseases”, 8a edição, 1983, Rodman, G.P. & Schumacher, H.R., Eds., Zvaifler, N.J., Assoe. Ed., Arthritis Foundations, Atlanta, Georgia). O estímulo antigénico que inicia a resposta imunitária e consequente inflamação é desconhecido. Certos tipos de HLA (DR4, Dw4, Dw14 e DR1) têm uma prevalência aumentada na AR, conduzindo talvez a uma susceptibilidade genética para um factor não identificado que inicia o processo da doença. A associação com DR4 é mais alta para a Doença de Felty e AR grave (Westedt, M.L., et ai, Annals of Rheumatic Diseases, 1986, 45: 534-538). Foram sugeridas relações entre o vírus de Epstein-Barr e a AR. Os linfócitos sinoviais produzem IgG que é reconhecida como estranha e estimula uma resposta imunitária local com produção de anticorpos anti-lgG (factores reumatóides). São formados complexos imunitários através da activação do sistema do complemento o que resulta em inflamação incluindo a activação de lisozimas e de outras enzimas. A infiltração de células T ajudantes do sinóvio e a libertação de linfóquinas, tais como IL6, conduzem a acumulação adicional de macrófagos e à destruição lenta e progressiva das articulações (erosões). A abordagem ao tratamento com fármacos em artrite reumatóide foi descrita como uma pirâmide (“Primer on the Rheumatic Diseases”, supra). Os agentes de primeira linha incluem a aspirina e NSAIDS (drogas anti-inflamatórias não esteróides). Quando estes agentes falham, são considerados sais de ouro, penicilamina, metotrexato ou antimaláricos, conhecidos como fármacos de segunda linha convencionais. Finalmente, são tentados esteróides ou citotóxicos em doentes com doença activa grave que é refractária aos tratamentos de primeira e segunda linha. É agora sugerido que a ciclosporina tem um papel no tratamento de doentes cuja doença não responde à aspirina, NSAIDS, ao ouro ou a penicilamina.

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 6

No entanto, os fármacos actualmente experimentais para tratar doentes de AR grave podem-se provar demasiado tóxicos mesmo que sejam eficazes. Têm sido dirigidos numerosos esforços para o desenvolvimento de uma imunoterapia mais segura e mais eficaz para substituir estes fármacos tóxicos. Os doentes de AR grave que eram tratados com irradiação linfóide total ou drenagem do dueto torácico sofreram uma melhoria significativa dos sintomas da doença. Estes procedimentos não são adequados para aplicação de rotina. Devido a estas verificações encorajantes, no entanto, e à demonstração da presença de células T no infiltrado sinovial, é possível conceber novas imunoterapias para eliminar especificamente as células T. A maioria destas novas imunoterapias experimentais são dirigidas para todas ou para a maioria das células T, e podem assim produzir efeitos secundários significativos. Uma melhor abordagem para imunoterapia selectiva pode ser eliminar apenas o subconjunto de células T que está envolvido na AR.

2.5. PAPEL DAS CÉLULAS T NA ARTRITE REUMATÓIDE Têm-se acumulado provas que apoiam um papel para as células T na patogénese da artrite reumatóide (AR). O tecido sinovial e o fluido sinovial envolvente de doentes com artrite reumatóide (AR) são infiltrados com um grande número de células. As células T activadas e em repouso podem mediar danos tissulares através de uma variedade de mecanismos incluindo a citotoxicidade directa de células alvo que expressem um antigénio específico em combinação com os elementos de restrição do HLA apropriados. A forte associação de certos produtos do HLA com a AR conduziu os investigadores a implicarem as células T na destruição auto-imune das articulações de doentes de AR. De facto, os produtos dos genes DR4, Dw4 e Dw14 do HLA estão entre as principais moléculas da classe II que contribuem significativamente para a susceptibilidade à doença em doentes com AR (Nepom, B., et al., 1987, “Abstracts of Amer. Rheumatism Assoe.”, pág. S25; Todd, J.A., et al., 1988, Science 240: 1003-1009) e são capazes de restringir principalmente o reconhecimento do antigénio das células T CD4+. Outras doenças auto-imunes apresentam também uma elevada correlação entre a susceptibilidade à doença e a expressão do HLA.

Este aspecto genético de risco de doença encorajou a análise fenotípica das células T encontradas em articulações doentes. Anteriormente, comparações de células T de articulações com AR e de sangue periférico com AR (SP)

85 285

EP 0 662 148/EP 7 demonstraram diferenças significativas no fenótipo CD4 ou CD8, implicando portanto uma selecção das células T envolvidas na actividade da doença. A maioria dos estudos concorda que as células T infiltradas no tecido sinovial eram maioritariamente células CD4+ indutoras das ajudantes (4B4+) (Duke, O., et ai, 1987, Arth. Rheum., 30, 849) enquanto que o SP continha normalmente uma mistura de células CD4+ e CD8+ incluindo ambas as células indutoras das ajudantes e células indutoras das supressoras (2H4+) (Emery, P., et ai, 1987, Arth. Rheum., 30, 849). Em contraste, existe evidência suplementar de que o infiltrado de CD4+ pode ser constituído predominantemente por células indutoras das supressoras (2H4+) (Mikasa, N., et ai, 1987, Amer. Rheum. Abstracts., pág. S39).

3. SUMÁRIO DO INVENTO O invento é dirigido a anticorpos monoclonais que reagem com um membro da família Vp3 da região variável da cadeia beta do TCR. O presente invento proporciona um anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, que reage com um epitopo de uma região variável Ν/β3.1 de uma molécula intacta do receptor de antigénios das células T humanas e que tem a capacidade de inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e com o número de acesso atribuído HB 11020, ao seu epitopo, através da ligação ao epitopo. O presente invento proporciona também um anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, que reage com um epitopo de uma região variável Vp3.1 de uma molécula intacta do receptor de antigénios das células T humanas e que tem a capacidade de inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e com o número de acesso atribuído HB 11021, ao seu epitopo, através da ligação ao epitopo.

Em particular, o invento proporciona anticorpos monoclonais, designados 5E4 e 8F10, os quais reagem com as regiões variáveis de um membro da família Vp3. Em várias concretizações do invento, estes anticorpos ou seus fragmentos ou derivados, podem ser utilizados para se ligarem a um membro da família Vp3 de sequências de aminoácidos da região variável do TCR, como parte de um TCR intacto ou péptido, ou de uma molécula da superfície das células T, ou um fragmento destes. 8 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Os anticorpos monoclonais 5Ε4 e 8F10 são produzidos por hibridomas depositados na ATCC e com os números de acesso atribuídos HB 11020 e HB 11021, respectivamente. O presente invento proporciona também um método de identificação e selecção de um anticorpo ou de um seu fragmento de acordo com o presente invento, o qual compreende a detecção da capacidade de um anticorpo ou fragmento de anticorpo para inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e com o número de acesso atribuído HB 11020 ao seu epítopo através da ligação ao epítopo, ou inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e com o número de acesso atribuído HB 11021, ao seu epítopo, através da ligação ao epítopo. O presente invento proporciona também um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal do presente invento. O presente invento proporciona ainda um processo para a produção de um anticorpo monoclonal do presente invento, que compreende a cultura de um hibridoma que produza o referido anticorpo monoclonal. O presente invento é também dirigido a um fragmento de qualquer um dos anticorpos de cima, de preferência seleccionado a partir do grupo que consiste num fragmento Fv, um fragmento Fab, um fragmento Fab’ e um fragmento F(ab’). O invento é ainda dirigido a uma linha celular de hibridoma que produza qualquer um dos mAb de cima.

Os anticorpos monoclonais do invento têm valor no diagnóstico e na terapia de condições e doenças que afectem o sistema imunitário.

Em concretizações particulares do invento, a artrite reumatóide pode ser diagnosticada através da detecção de percentagens aumentadas de células T totais que expressem certos genes da região variável de cadeia beta do receptor das células T numa amostra de um doente. Em concretizações específicas do invento, a artrite reumatóide pode ser diagnosticada através da detecção de percentagens aumentadas de células T totais que expressem as regiões variáveis 9 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ \/β3, \/β9 ou \/β10 do receptor das células T numa amostra de um doente. O presente invento proporciona a detecção de células T que expressem um membro da família \/β3, em particular νβ3.1.

Ainda noutra concretização, o presente invento proporciona um método de diagnóstico da artrite reumatóide num indivíduo compreendendo: (a) o contacto de uma amostra biológica de um indivíduo com o anticorpo monoclonal ou um seu fragmento de acordo com o presente invento; (b) a detecção de uma quantidade de ligação imunoespecífica que tenha ocorrido; e (c) a comparação da quantidade de anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado com uma quantidade ligada numa amostra basal, na qual um aumento na quantidade de anticorpo, ou fragmento de anticorpo, ligado na amostra do indivíduo relativamente à amostra basal é indicativo de artrite reumatóide.

No método de cima, a amostra é posta em contacto in vitro e é de preferência um fluido corporal, um tecido ou um espécime histológico.

Um método preferido, tal como descrito acima, é útil para o diagnóstico da artrite reumatóide (AR) num indivíduo. No diagnóstico de AR, a amostra é de preferência seleccionada a partir do grupo que consiste em sangue periférico, tecido sinovial e fluido sinovial.

Ainda noutra concretização, o invento proporciona a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, ou de um seu fragmento ou derivado, tal como acima descrito, num método de tratamento de uma doença ou desordem relacionada com o sistema imunitário num indivíduo, em particular a artrite reumatóide. É aqui também proporcionada uma composição farmacêutica útil para o diagnóstico ou tratamento de uma doença ou desordem relacionada com o sistema imunitário, em particular a artrite reumatóide. compreendendo um anticorpo, fragmento ou derivado, tal como acima, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. De preferência o anticorpo é marcado de forma detectável.

De acordo com concretizações específicas, os anticorpos monoclonais do invento, sozinhos ou em combinação com anticorpos que reconhecem epítopos

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 10 das regiões variáveis Vp9 ou νβ10 do receptor de antigénios das células T, podem ser utilizados para tratar artrite reumatóide. O presente invento é também dirigido a um método in vitro de aumento do número de células T que expressem um membro da família Vp3, em particular um νβ3.1, de região variável do receptor de antigénios das células T, compreendendo a exposição de linfócitos T a uma concentração eficaz de um anticorpo ou seu fragmento ou derivado, reactivo, tal como descrito acima.

3.1. ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES

Tal como aqui se utilizam, os seguintes termos terão os significados indicados:

C D J V ELISA mAb LSP PMA PBS SDS-PAGE TCR SRE AR linha ST SF EBV HLA FCS constante diversidade união variável ensaio de imunossorção com ligação de enzimas anticorpo monoclonal linfócitos de sangue periférico forbol-12-miristato-13-acetato solução salina tamponada com fosfato electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio receptor de antigénios das células T sistema reticuloendotelial artrite reumatóide

células T derivadas de tecido sinovial com AR Síndroma de Felty vírus de Epstein-Barr antigénio leucocitário humano soro fetal de vitelo anticorpo anti- -clonotípico = um anticorpo que reage apenas com o clone de células T contra o qual foi criado. Também referido como um anticorpo anti-idiotípico. anticorpo anti-estrutura 11 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ menor = um anticorpo que reage com um determinante estrutural menor presente num subconjunto de células T. Os anticorpos anti-estrutura menor reconhecem pequenas percentagens de LSP, i.e., menos de 20% num indivíduo normal. Os anticorpos anti-estrutura menor podem ser utilizados para definir TCR intimamente relacionados ou famílias de TCR. anticorpo anti-estrutura principal = um anticorpo que reage com um determinante estrutural principal presente numa grande população de células T.

4. BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Uma série de gráficos mostrando a análise citométrica de citometria de fluxo da reactividade dos mAb de murídeo 5E4 e 8F10 específicos para os epítopos do TCR νβ3 humano com células T de murídeo transfectadas com Vp3 humano. Os transfectantes (painéis B, C, E & F) foram corados com um mAb específico para T3 de murídeo (2C11; painel E), 5E4 (painel C) ou 8F10 (painel F) através de imunofluorescência indirecta. A ligação dos dois mAb anti-Vp3 de murídeo foi detectada com um reagente de Ig de cabra anti-ratinho conjugada com FITC. O mAb 2C11 de hamster foi detectado com um reagente de Ig anti-hamster conjugada com FITC (painel B). É também mostrada a reactividade de controlo da linha mutante progenitora não transfectada no reagente de Ig anti-transferência (painel A) e 2C11 (painel D).

Figura 2. Mostra o padrão de SDS-PAGE da imunoprecipitação de TCR através dos mAb 5E4 e 8F10. A pista 1 mostra um SDS-PAGE de imunoprecipitados de células de murídeo marcadas com 12SI que expressam as proteínas humanas Vp3.1 da superfície celular utilizando aF1 como controlo negativo (pista 1), pF1 como controlo positivo (pista 2), mAb 5E4 (pista 3) e mAb 8F10 (pista 4). As posições dos marcadores de peso molecular marcados com 14C estão indicadas à direita.

Figura 3. Reactividade de 5E4 e 8F10 com LSP humanos. (A) Análise de imunofluorescência a duas cores utilizando ficoeritrina anti-CD3 e o controlo negativo com mAb lgG1, 5E4 ou 8F10 conforme indicado. A ligação dos últimos 3 mAb foi detectada utilizando IgG de cabra anti-ratinho conjugada com FITC; (B) Expressão de 5E4 e 8F10 em células T CD4+ ou CD8+. A imunofluorescência a duas cores utilizou um dos anticorpos conjugados com ficoeritrina para CD4 ou 12 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ CD8 com 5Ε4 ou 8F10. É mostrada a percentagem de células T que reagiram com 5E4 ou 8F10 e que eram também positivas para CD4 ou CD8.

Figura 4. Mostra as sequências de união de V-D-J de células T humanas estimuladas por 5E4 (células 5E4+) ou por 8F10 (células 8F1CT). As sequências nucleotldicas da região de união de V-D-J de oito células T que reagem com 5E4 e de seis que reagem com 8F10 são mostradas em comparação com a região análoga do clone PL4.4 de νβ3.1. A extremidade 5’ das sequências de ϋβ estão identificadas através da comparação com as sequências da linha germinativa.

Figura 5. Reactividade de 5E4 e 8F10 conjugados com FITO, com LSP de macaco cynomolgus. O painel 1 é um gráfico de análise de imunofluorescência a 2 cores utilizando uma combinação de ficoeritrina anti-CD4 e anti-CD8 e mAb de controlo negativo. O painel 2 é um gráfico de análise de imunofluorescência a 2 cores utilizando uma combinação de anti-CD4 e anti-CD8 conjugados com ficoeritrina e 8F10 para corar LSP de macaco cynomolgus. O painel 3 utiliza 5E4 tal como no painel 2 no lugar de 8F10. 8F10 cora uma subpopulação de LSP de macaco que consiste em 1,4%. 5E4 cora uma subpopulação que consiste em 1,46%.

Figura 6. Análise do uso do gene V/? numa linha de células T derivada de tecido sinovial. A linha ST-2, derivada das células que se infiltram na membrana sinovial de um doente de AR, foi analisada quanto à expressão de Μβ do TCR utilizando o protocolo de ADNc, amplificação por PCR, hibridação “slot blot'. O painel da esquerda representa a autorradiografia obtida quando o painel de genes V/? foi hibridado com a sonda de ADNc específico para o TCR amplificado com ST-2. O painel da direita da figura é o traçado da densitometria da autorradiografia.

Figura 7. Mostra a detecção do uso do gene V/? em células T de AR. São mostrados resultados tabelados da expressão do painel de genes V/? em 12 linhas de células T, aos pares, derivadas de tecido sinovial e derivadas de sangue periférico de doentes de AR. Para a parte superior da figura, o eixo vertical representa o número de amostras que eram positivas para um determinado V/?. Os genes V>9 individuais estão indicados no eixo horizontal. Os dados derivados das células T sinoviais e das células T do sangue periférico são representados aos pares como barras a branco e barras traçadas, respectivamente. Na parte inferior 13 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ da figura, são mostradas as frequências dos genes Μβ individuais nas 12 amostras de doentes (% sinovial e % de LSP). Para indicar o uso preferencial dos genes Vy9 é mostrada a razão sinovial/sangue periférico.

Figura 8. Detecção do uso do gene Vj0 dominante em células T de AR. Esta figura é semelhante à Figura 7, excepto que os dados tabelados incluem apenas a expressão dos genes V/? que ocorrem com maior frequência tal como determinado através do traçado de densitometria. Ο \ίβ mais frequente ou dominante foi determinado a partir da altura do maior pico o qual foi utilizado como padrão. Qualquer gene V/? com um pico de densitometria correspondente com altura superior a 50% do padrão foi utilizado na tabela.

5. DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO

Na seguinte descrição, será feita referência a várias metodologias conhecidas dos peritos na arte da imunologia, biologia celular e biologia molecular.

5.1. DOENÇAS RELACIONADAS COM O SISTEMA IMUNITÁRIO O termo “doença relacionada com o sistema imunitário”, tal como aqui se utiliza, refere-se a uma doença na qual o sistema imunitário está envolvido na patogénese da doença ou na qual a estimulação apropriada do sistema imunitário pode resultar em protecção contra a doença. As doenças relevantes incluem, mas não se lhes limitam, doenças auto-imunes, doenças neoplásicas, doenças infecciosas, hipersensibilidade, transplantação, doença de enxerto-versi/s-hospedeiro e doenças degenerativas do sistema nervoso. As doenças auto-imunes incluem, mas não se lhes limitam, artrite, tal como artrite reumatóide, diabetes tipo I, diabetes juvenil, esclerose múltipla, tiroidite auto-imune (tiroidite de Hashimoto), miastenia grave, lúpus sistémico eritematoso (SLE), síndroma de Sjogren, doença de Grave, doença de Addison, síndroma de Goodpasture, esclerodermia, dermatomiosite, mixoedema, polimiosite, anemia perniciosa, doença inflamatória do intestino incluindo doença de Crohn e gastrite atrófica auto-imune, e anemia hemolítica auto-imune. As doenças neoplásicas incluem, mas não se lhes limitam, doenças linfoproliferativas tais como leucemias, linfomas, linfoma que não de Hodgkin e linfoma de Hodgkin, e cancros tais como cancro da mama, do cólon, do pulmão, do fígado, do pâncreas, etc. As doenças infecciosas incluem, mas não se lhes limitam, infecções virais causadas por vírus tais como HIV, HSV, EBV, CMB, Gripe, Hepatite A, B ou C; infecções fúngicas tais como as causadas pelo género de leveduras Candida\ infecções parasíticas tais como as causadas por

85 285

EP 0 662 148/EP 14 quistossomas, filária, nemátodos, triquinose ou protozoários tais como os tripanossomas que causam a doença do sono, o plasmódio que causa a malária ou a leishmania que causa a leishmaniose; e infecções bacterianas tais como as causadas pela micobactéria, corinebactéria ou estafilococos. As doenças de hipersensibilidade incluem, mas não se lhes limitam, hipersensibilidades de Tipo I tais como o contacto com alergénios que conduzem a alergias, hipersensibilidades de Tipo II tais como as presentes no síndroma de Goodpasture, miastenia grave e anemia hemolítica auto-imune, e hipersensibilidades de Tipo IV tais como as manifestadas em lepra, tuberculose, sarcoidose e quistossomíase. As doenças degenerativas do sistema nervoso incluem, mas não se lhes limitam, esclerose múltipla e doença de Alzheimer.

Também se designam por doenças relacionadas com o sistema imunitário, tal como aqui se utiliza, malignidades em que a célula tumoral possui um marcador tumoral, tal como um antigénio tumoral, capaz de ser reconhecido e suscitar uma resposta do sistema imunitário. O TCR pode servir como uma marcador tumoral em células de leucemia das células T ou de linfoma das células T.

Para além dos humanos, outros animais preferidos no presente invento incluem animais domesticados tais como espécies equinas, bovinas, porcinas, caninas, felinas e de murídeo. As doenças auto-imunes em espécies não humanas podem ser análogas às identificadas em humanos ou podem ter características únicas numa determinada espécie ou grupo de espécies. Assim, os métodos do presente invento são úteis no diagnóstico e terapia em medicina humana e veterinária.

5.2. ANTICORPOS DO INVENTO O presente invento é dirigido a um anticorpo monoclonal, ou um fragmento deste, que reage com um epítopo de uma região variável V/33 de uma molécula intacta do receptor de antigénios das células T humanas e que tem a capacidade de inibir a ligação do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na ATCC sob o n° HB 11020 ou 11021 ao seu epítopo através da ligação ao epítopo. Estes anticorpos podem ser utilizados no diagnóstico e terapia de uma doença auto-imune, de preferência AR. A sequência de ADNc para /8.1 é conhecida (Concannon, et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83: 6548-6602) tal como o são outras sub-famílias de Vp3 (Toyonaga et ai, 1987, Ann. Rev. Immunol. 5; 585-620). Os anticorpos do presente invento são úteis em diagnóstico e terapia. 15 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ Ο termo “anticorpo monoclonal” (mAb) e portanto o “anticorpo do presente invento" inclui anticorpos quiméricos (ver abaixo), (Idiotypy in Rinlngy and Medicine, Academic Press, New York, 1984). Os mAb podem ser de qualquer classe de imunoglobulinas incluindo IgG, IgM, IgE, IgA e de qualquer subclasse ou isotipo destas. Os anticorpos preferidos para utilização terapêutica incluem anticorpos do isotipo lgG2a ou do isotipo lgG2b (Rashid et ai., 1992, J. Immunol. 148: 1382-1388). O termo “anticorpo monoclonal” (mAb) e portanto o “anticorpo do presente invento” inclui também moléculas intactas, bem como fragmentos destas, que se ligam ao antigénio, tais como, por exemplo, F(ab’)2, Fab’, Fab e Fv. Estes fragmentos, sem o fragmento Fc da molécula de anticorpo intacta, são eliminados da circulação mais rapidamente e podem ter menos ligação tissular não específica que um anticorpo intacto (Wahl et ai., 1983, J. Nuci. Med. 24: 316-325), propriedades que podem ser desejáveis para determinadas utilizações terapêuticas ou de diagnóstico. Notar-se-á apreciado que estes fragmentos de ligação ao antigénio dos anticorpos, úteis no presente invento, podem ser utilizados para a detecção e quantificação de proteínas ou péptidos do TCR tal como aqui divulgado para moléculas de anticorpo intactas. Tais fragmentos são tipicamente produzidos por clivagem proteolítica, utilizando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab’)2) ou por redução das pontes de dissulfureto.

Os anticorpos monoclonais do invento reagem com uma região variável da família V/J3 da cadeia beta do receptor de antigénios das células T. Em particular, um tal mAb anti-TCR/7 reconhece V/33.1. Numa concretização específica, o invento é dirigido aos anticorpos monoclonais 5E4 e 8F10, tal como depositados na ATCC e com os números de acesso atribuídos HB 11020 e HB 11021, respectivamente, em 15 de Abril de 1992. Os anticorpos monoclonais específicos para V/S.1 do presente invento permitem a análise da expressão do gene Vp3.1 numa amostra biológica. Vários derivados químicos ou bioquímicos dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo do presente invento podem também ser produzidos utilizando métodos conhecidos. Um tipo de derivados que é útil em diagnóstico é um imunoconjugado compreendendo uma molécula de anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao 16 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ antigénio, ao qual é conjugado um marcador detectável tal como um radioisótopo ou outra molécula traçadora. Um imunoconjugado útil em terapia compreende uma molécula de anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, conjugado com uma molécula terapeuticamente útil tal como um fármaco citotóxico ou uma proteína tóxica (ver, para revisão: Dillman, R.O., Ann. Int. Med. 111: 592-603 (1989)). Tais derivados de anticorpo são discutidos com mais detalhe abaixo. O anticorpo, fragmento ou derivado do presente invento, podem-se ser preparados utilizando qualquer uma de várias técnicas bem conhecidas na arte. Para a produção de um mAb, pode ser utilizado qualquer método que proporcione a produção de moléculas de anticorpo através de linhas celulares contínuas em cultura. Estes métodos incluem, mas não se lhes limitam, a técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (1975, Nature 256: 495-497) e a técnica mais recente do hibridoma de células B humanas (Kozbor et ai, 1983, Immunology Today 4: 72), a técnica do hibridoma com EBV (Cole et ai, 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96) e técnicas de trioma. Um hibridoma com origem num roedor que produza os mAb deste invento pode ser cultivado in vitro ou in vivo. Para uma perspectiva geral de métodos de produção de anticorpos, ver: Hartlow, E. et ai, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.

Numa concretização, o anticorpo do presente invento é um mAb humano. Os mAb humanos podem ser feitos através de qualquer uma de várias técnicas conhecidas na arte (p.ex., Teng et ai, 1983, Proc. Nati Acad. Sei. USA 80: 7308-7312; Kozbor et ai, supra; Olsson et ai, 1982, Meth. Enzymoi 92: 3-16).

Noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo quimérico, de preferência um anticorpo quimérico ratinho-humano, em que as regiões variáveis das cadeias pesada e leve são derivadas de um mAb de murídeo e as regiões constantes são de origem humana. Os anticorpos quiméricos deste invento têm a especificidade de reconhecimento do TCR do mAb de ratinho e as propriedades biológicas dos anticorpos humanos, as quais incluem resistência à eliminação no homem e reduzida imunogenicidade para humanos, permitindo múltiplos tratamentos. São divulgados métodos para a produção de moléculas de anticorpos quiméricos, por exemplo, em Gorman et ai, Pub. PCT WO9206193 (4/16/92); Cabilly et ai, Patente U.S. 4616567 (3/28/89) e Pub. Patente Eur. EP125023 (11/14/84); Taniguchi et ai, 17 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Pub. Patente Eur. ΕΡ171496 (2/19/86); Morrison et ai, Pub. Patente Eur. EP173494 (3/5/86); Neuberger et ai, Pub. PCT WO 8601533 (3/13/86); Kudo et ai, Pub. Patente Eur. EP184187 (6/11/86); Robinson et a!., Pub. PCT WO 8702671 (5/7/87); Cabilly et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et ai, Nature 312: 643-646 (1984); Morrison, Science, 229: 1202-1207 (1985); Neuberger et ai, Nature 314: 268-270 (1985); Takeda et ai, Nature 314: 452-454 (1985); Oi et ai, BioTechniques 4: 214 (1986); e Liu et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 3439-3443 (1987):

Para fins terapêuticos em humanos, os mAb ou anticorpos quiméricos podem ser “humanizados” produzindo quimeras da região constante humana, onde mesmo partes das regiões variáveis, em particular as regiões conservadas ou estruturais do domínio de ligação ao antigénio, são de origem humana e apenas as regiões hipervariáveis são não humanas. Ver por exemplo, Publicação Patente do RU, GB 2188638 A intitulada “Chimeric Antibodies”, Harris et ai, Publicação PCT WO 9204381, publicada a 19 de Março de 1992, intitulada “Novel Antibodies for Treatment and Prevention of Infection in Animais and Man”, e Riechmann et ai, 1988, Nature 332: 323-327.

Noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo de cadeia única formado pela ligação do fragmento das cadeias pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoácidos, produzindo um polipéptido de cadeia única (Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et ai, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; e Ward et ai, 1989, Nature 34: 544-546).

As moléculas ou fragmentos de anticorpo podem ser purificados através de técnicas conhecidas, p.ex., cromatografia de imunoabsorção ou de imunoafinidade, métodos cromatográficos tais como HPLC (cromatografia líquida de alta resolução), ou uma combinação destas, etc.

Uma vez criados os anticorpos com a especificidade desejada, estes podem ser utilizados para identificar e seleccionar outros anticorpos possuindo a mesma especificidade para o epítopo ou uma especificidade de reacção cruzada. Por exemplo, um novo anticorpo é testado medindo a sua capacidade para inibir a ligação de um anticorpo de especificidade conhecida ao seu epítopo. Podem ser utilizados vários ensaios de ligação competitiva conhecidos na arte. 18 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ Ο isotipo do anticorpo pode ser seleccionado durante a produção do hibridoma ou através de métodos recombinantes apropriados bem conhecidos na arte para alcançar uma função cfcctora desejada mediada pela porção Fc da cadeia pesada da imunoglobulina. Por exemplo, certos isotipos, tais como lgG2a, possuem uma actividade superior em citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Igualmente, certos isotipos, tais como lgG2a, são eliminados mais rapidamente da circulação através de receptores de Fc nas células do sistema reticuloendotelial e são portanto mais eficientes na remoção de um antigénio ou célula alvo indesejados dos locais de doença activa (Rashid, et ai, 1992, J. Immunol. 148: 1382-1388). De forma concordante, dependendo da utilização pretendida, um determinado isotipo de anticorpo pode ser preferível a outros, tal como pode ser prontamente determinado por um vulgar perito na arte sem experimentação excessiva.

Para identificar um hibridoma que produza um anticorpo de um determinado isotipo, ou para mudar um isotipo de um anticorpo, os sobrenadantes do hibridoma podem ser pesquisados quanto à produção de mAb específicos para o TCR utilizando um ELISA que teste o isotipo da imunoglobulina. O que se segue é um exemplo de um método para a selecção de uma mudança de um isotipo desejado de lgG1 para lgG2a. As células do hibridoma crescem na fase logarítmica durante um período de 2-3 semanas e são depois sujeitas a selecção negativa utilizando contas magnéticas revestidas de anticorpo. Podem ser utilizadas partículas de óxido de ferro super-paramagnéticas revestidas com uma preparação de anticorpo de cabra anti-ratinho incluindo todas as classes de isotipos de IgG (contas Biomag® adquiridas de Advanced Magnetics, Inc.). Para a mudança de um isotipo de lgG1 para lgG2a, é necessário bloquear os locais de ligação de lgG2a nas contas revestidas com anticorpo através da incubação com imunoglobulinas (de especificidade irrelevante) possuindo o isotipo lgG2a. Cerca de 108 células do hibridoma que expressam uma variedade de isotipos são incubadas com tais contas bloqueadas para lgG2a. As células que expressam os isotipos lgG1, lgG2b e lgG3 ligam-se e são removidas magneticamente da população. Tal passo de selecção negativa é de preferência repetido várias vezes. A restante população de células, sem células possuindo lgG1, lgG2b e lgG3 e em vez disso, enriquecida em células possuindo lgG2a, é plaqueada em microplacas a uma densidade celular de cerca de 1000 células/poço. Utilizando reagentes anti-isotipo comercialmente disponíveis num ensaio ELISA, os poços 19 85 28b EP 0 662 148/EP são pesquisados quanto à produção de lgG2a; os ciones positivos são novamente plaqueados a 0,3 céluias/poço seguindo-se outro ciclo de pesquisa e novo plaqueamento. Utilizando uma tal abordagem, aproximadamente 1-5 de 107 células que mudaram o isotipo são optimamente seleccionadas. As células que mudaram de IgM para IgG podem ser seleccionadas utilizando uma abordagem semelhante com as contas revestidas com o anticorpo apropriado.

Tal como aqui se utiliza, um anticorpo que reage com a “região V” do TCR deverá ser construído para ser um anticorpo que reaja com um epítopo da região V, um epítopo de combinação da região V, ou um epítopo de combinação das regiões V-D ou V-D-J. Um anticorpo que reage com uma região V de um TCR pode reconhecer um determinante idiotípico, um determinante clonotípico ou, de preferência, pode reconhecer uma região estrutural menor expressa por um subconjunto discreto de linfócitos T. De preferência, tal anticorpo reage com um único epítopo numa região variável V/33.1 da cadeia β do receptor de antigénios das células T. O termo “região estrutural menor” refere-se a uma região do TCR que não é partilhada por todas as moléculas do TCR, mas que também não é única de um determinado clone de células T. Os mAb anti-TCR β preferidos reconhecem membros da família V/33, de preferência, ΜβόΛ.

5.3. MÉTODOS DE CRIACÁO E CARACTERIZAÇÃO DOS ANTICORPOS DO INVENTO

Este invento proporciona anticorpos monoclonais específicos que reagem com regiões definidas dos membros das regiões variáveis da família V/?3 do receptor β de antigénios das células T. Ao longo dos últimos anos, desde a clonagem dos genes que codificam para o TCR, surpreendentemente poucos anticorpos foram criados contra as diferentes regiões variável, de diversidade, de união ou constante do receptor. Isto indica que o conhecimento da sequência de aminoácidos de um determinada região de interesse não ter sido suficiente para permitir a produção reprodutível de anticorpos específicos. Vários grupos foram capazes de criar um ou dois anticorpos específicos, mas ninguém parece ter sido capaz de criar anticorpos à vontade. Ao longo de vários anos, os presentes inventores criaram vários anticorpos para TCR através de numerosos métodos e têm agora um método preferido para maximizar o sucesso na criação de anticorpos contra um região definida de interesse. 20 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Os elementos principais deste protocolo melhorado incluem 1) a utilização de proteína purificada como imunogénio preferido; 2) monitorização eficaz dos ratinhos através de sangrias da cauda e pré-pesquisa durante a imunização para detectar respostas positivas dos anticorpos; 3) utilização de proteína purificada durante a pesquisa de sobrenadantes de hibridoma para minimizar o número de hibridomas a serem pesquisados para detectar os positivos e para maximizar o sinal positivo sobre o ruído de fundo no procedimento de pesquisa de forma a que os verdadeiros positivos não se percam devido a sinais fracos; e 4) melhor caracterização dos positivos resultantes para determinar a sua verdadeira especificidade.

5.3.1. REQUISITOS DO HOSPEDEIRO Vários animais hospedeiros, incluindo mas não se lhes limitando, ratinhos, ratos ou coelhos, podem ser utilizados na prática deste invento. No entanto, alguns hospedeiros são preferidos, tal como discutido infra. Vários anos de experiência na criação de anticorpos para TCR resultaram na observação de que as proteínas do TCR não são muito imunogénicas. Isto deve-se talvez ao papel essencial que as próprias proteínas têm no sistema imunitário. Apenas aos TCR que reconhecem “não próprios” é permitida a saída do timo durante a ontogenia. Adicionalmente, as proteínas são altamente conservadas evolutivamente e são membros da família supergénica das imunoglobulinas. Os membros desta família supergénica partilham não só homologias de sequência, mas também semelhanças estruturais. Sabe-se agora que existem alguns homólogos humano-ratinho que são muito semelhantes na sequência (Wilson et al., 1988, Immunol. Reviews 101: 149-172). Isto foi primeiro proposto à medida que os genes variáveis iam sendo mapeados quanto à sua posição relativa ao longo do cromossoma (Lai et al., 1988, Nature 331: 543-546). Assim, algumas sequências de Μβ humano e de VyS de murídeo são mais semelhantes entre elas do que qualquer uma em relação a outras regiões variáveis na espécie. O resultado prático desta semelhança é de que as proteínas do TCR humano utilizadas como imunogénios em ratinhos para produzir uma resposta de anticorpo produz resultados variáveis. Geralmente são necessárias várias semanas ou meses para gerar uma resposta nos ratinhos, requerendo reforços múltiplos. Embora possa ser gerada uma melhor resposta imunitária noutros hospedeiros, galinhas, por exemplo, a falta de parceiros de fusão de mieloma de confiança necessários para criar os hibridomas fundidos imortais para células do baço de galinha limita a utilidade destes hospedeiros. 21 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

De forma a maximizar a resposta de anticorpos em ratinhos para imunogénios humanos, vários grupos propuseram a utilização de animais hospedeiros deficientes no homólogo de TCR de interesse. Por exemplo, estirpes de ratinhos tais como SJL, Rlll S/J (H-2r), C57L, C57BR e SWR (Behlke et ai, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 767-771; Haqqi et ai, J. Exp. Med., 1989, 169: 1903-1909; Jouvin-Marche, 1989, Eur. J. Immunol. 19: 1921-1926) que têm eliminadas as porções principais do locus V/? de murídeo podem ser vantajosas para a criação de anticorpos contra os homólogos humanos correspondentes. Outras estirpes de murídeo tais como ratinhos nus ou ratinhos SCID podem ser úteis por razões semelhantes. Levando esta ideia mais longe, um grupo propôs células de ratinho geneticamente modificadas para produzir um TCR quimérico onde todas as porções do TCR são de murídeo, excepto a porção (p.ex. a região variável humana) a ser utilizada para eliciar anticorpos. Este procedimento funcionou em pelo menos um caso para criar anticorpos específicos para V/713.1 e V/713.2 (Pub. Int. N° WO92/02629, publicado a 20 de Fevereiro de 1992), mas não é a resposta completa ao problema de criação de anticorpos à vontade, pelas razões abaixo indicadas em pesquisa.

5.3.2. IMUNOGÉNIOS PREFERIDOS

Existe um grande número de imunogénios diferentes que representam regiões definidas do TCR que podem ser utilizados para criar anticorpos. Alguns destes incluem péptidos; péptidos conjugados; proteína de TCR parcialmente purificada através de, por exemplo imunoprecipitação; proteína mais completamente purificada; clones de células T; células transfectadas; proteína do receptor recombinante solúvel; ou combinações destes. Os anticorpos para TCR que existem actualmente foram criados numa base de acertar ou falhar para cada um destes imunogénios. No entanto, uma compreensão cuidadosa dos méritos relativos de cada imunogénio era necessária de forma a desenvolver o presente procedimento preferido dos inventores para produzir um anticorpo desejado.

Imunogénios peptídicos: Vários grupos utilizaram péptidos de TCR sintetizados quimicamente para criar numerosos anticorpos anti-péptidos para o TCR. Infelizmente, estes anticorpos anti-péptidos muito raramente interagem com o receptor intacto nas células. Assim, não têm utilidade terapêutica ou de diagnóstico in vivo. Frequentemente tais anticorpos anti-péptidos reagem bem com o péptido para o qual foram criados, mas reagem fracamente com as proteínas do TCR, mesmo quando a proteína é desnaturada, por exemplo por transferência de 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 22 “Western”. Outras complicações incluem as observações de que nem todos os péptidos são solúveis e de que os péptidos por vezes não têm os grupos hidrato de carbono presentes na versão nativa do receptor. Em resumo, embora possam ser criados anticorpos anti-péptidos, os anticorpos resultantes têm frequentemente pouca utilidade para aplicações de diagnóstico ou terapêuticas e a utilização de péptidos como imunogénios não deu origem a anticorpos específicos anti-estrutura menor ou anti-região V.

Imunogénios de células completas: Utilizaram-se imunogénios à superfície das células T ou em células T transfectadas, para criar anticorpos específicos. Várias linhas celulares incluindo, mas não se lhes limitando, as aqui divulgadas e linhas celulares divulgadas noutros lados (ver, por exemplo, Toyonaga et ai, 1987, Ann. Rev. Immunol. 5: 585-620) podem ser utilizadas como imunogénios para criar mAb específicos para a região V do TCR humano. Qualquer linha de células T que expresse um TCR, uma cadeia ou fragmento de TCR na superfície celular pode servir como imunogénio. Observe-se que anticorpos para V, D, J, DJ, VJ, VDJ ou combinações destes conhecidas podem também ser criados através de imunização com tais células. A expressão de ADN codificando as regiões V, D, J e C de qualquer cadeia de TCR pode ser determinada em qualquer linha celular através de procedimentos bem conhecidos incluindo sequenciação de ADNc, hibridação in situ, análise por reacção em cadeia com polimerase (PCR), análise de “Northern”, análise de “Southern”, imunoensaio ou citometria de fluxo, apenas para referir alguns. A especificidade para V do anticorpo resultante pode ser determinada a partir do conhecimento da sequência dos TCR expressos pela célula de imunização.

As células completas que podem ser utilizadas como imunogénios para produzir os anticorpos específicos para TCR do presente invento incluem não só células T que expressam naturalmente um TCR, mas também células transfectadas com uma construção de ADN recombinante que codifica uma determinada cadeia ou cadeias de TCR, ou um fragmento destas. Por exemplo, as células Jurkat β que não produzem um TCR funcional podem ser “reconstituídas" por transfecção com um ADNc de TCR β para produzirem um TCR αβ intacto na superfície celular (Ohashi, P.S. et ai, Nature, (1985) 316: 606-609). Tais células transfectadas seriam então utilizadas como imunogénios para a indução de anticorpos específicos para um epítopo de α ou β do TCR. Foram relatados 23 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ exemplos adicionais de tais células transfectadas (Kaye, J. et ai, 1988, Nature 336: 580-583; Dembic, Z., et ai, 1986, Nature 320: 232-238; Saito, T„ et ai, 1987, Nature 325: 125-130). Dc acordo com o presente invento, qualquer procedimento que resulte em expressão de um gene de TCR transfectado na superfície celular podia ser utilizado para produzir um imunogénio de célula completa.

Os imunogénios também podem ser produzidos na forma de proteínas ou células derivadas de sistemas de expressão eucarióticos em que uma proteína ou péptido de TCR é ligado à membrana celular através de um domínio de ancoramento fosfolipídico clivável enzimaticamente (Pedido de Patente Int. PCT/US88/02648, publicado a 9 de Fevereiro de 1989).

Muitos dos anticorpos produzidos utilizando estes imunogénios de células completas são anti-idiotípicos ou anti-clonotípicos, mas alguns anticorpos específicos anti-estrutura menor ou anti-região variável foram também produzidos. Embora não seja impossível, é raro serem produzidos anticorpos anti-região constante utilizando imunogénios de células completas, uma vez que as regiões constantes das cadeias de TCR parecem estar mascaradas uma pela outra e por polipéptidos T3 também presentes no complexo TCR:T3 à superfície celular. A principal desvantagem da utilização de células como imunogénios para a produção de anticorpos anti-TCR é que muitas outras proteínas que não de TCR na célula são também imunogénicas. Os anticorpos específicos para o TCR representam um subconjunto menor da resposta total de anticorpos gerada no hospedeiro. Como resultado, é necessário pesquisar um grande número de hibridomas para detectar os que produzem anticorpos específicos para TCR. Mesmo quando as células utilizadas para imunizar são células de murídeo que expressam apenas uma região humana definida, o procedimento de pesquisa não é óptimo. Por exemplo, de forma a pré-pesquisar os ratinhos para determinar se estes estão a fazer anticorpo específico antes do isolamento das células do baço e da fusão com o parceiro de mieloma, é necessário tentar titular o soro do ratinho por diluição até ser possível observar a diferença entre um resultado negativo versus um positivo. Uma vez que o soro do ratinho tem uma concentração proteica extremamente elevada, a diferença num sobrenadante de hibridoma positivo pode não ser sempre observada acima do ruído de fundo criado pelo próprio soro. Quando os sobrenadantes de hibridoma são pesquisados por análise de citometria de fluxo através da detecção de ligação às mesmas células transfectadas utilizadas 24 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ como imunogénio ou através da sua capacidade para criar uma resposta de IL-2, existe o mesmo problema de detecção de uma diferença positiva acima do ruído de fundo nos procedimentos de teste. Os sinais observados são pequenos relativamente aos do ruído de fundo.

Imunogénios de proteínas purificadas: Quando é utilizada proteína purificada como imunogénio, é gerada uma resposta de anticorpos no hospedeiro menos heterogénea e mais eficiente. Isto resulta numa proporção relativa aumentada de células produtoras de anticorpos contra os antigénios de TCR desejados sobre os outros antigénios contaminantes presentes no imunogénio. Isto é especialmente importante para o aumento das respostas de anticorpos específicos para TCR, uma vez que o TCR não é muito imunogénico para começar. Adicionalmente, uma proporção aumentada de células desejadas minimiza o número de células de hibridoma que tem de ser pesquisado para encontrar positivos. Quanto mais “pura” for a proteína utilizada como imunogénio, melhores são as hipóteses de sucesso. Os presentes inventores preferem a utilização de proteína recombinante purificada, solúvel como imunogénio, se disponível, uma vez que uma grande quantidade de material está disponível para utilizar primeiro como imunogénio e depois em procedimentos melhorados de pré-pesquisa e pesquisa. Com uma proteína purificada é possível maximizar a razão sinal/ruído de fundo dos métodos de pré-pesquisa e pesquisa, de forma a ser mais fácil e de maior confiança a detecção de hibridomas positivos acima do ruído de fundo do ensaio. Uma proteína purificada pode também ser utilizada para criar todos os tipos de anticorpo para TCR, p.ex. é possível identificar especificidades anti-idiotípicas, anti-variável ou anti-estrutura menor, e anti-constante ou anti-estrutura principal. O presente invento numa concretização preferida utiliza assim um polipéptido de TCR V//3 solúvel que pode ser utilizado 1) como imunogénio para criar anticorpos específicos e 2) em protocolos de pesquisa para aumentar as razões sinal/ruído de fundo para identificar e caracterizar os referidos anticorpos.

5.3.3. PROCEDIMENTOS DE PESQUISA MELHORADOS

Os procedimentos de pesquisa que podem ser utilizados para pesquisar células de hibridoma que expressem diferentes anticorpos anti-TCR incluem, mas não se lhes limitam, (1) ensaios de imunossorção com ligação de enzimas (ELISA), (2) análise de citometria de fluxo, (3) imunoprecipitação, (4) transferência de “Western” e (5) a capacidade de co-modular o antigénio CD3 (parte do complexo 25 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ TCR-CD3 presente na superfície das células T) para fora da superfície das células.

Os procedimentos de pesquisa por co-modulação e citometria de fluxo são preferidos para a selecção de anticorpos potencialmente úteis em terapia uma vez que estes procedimentos seleccionam anticorpos que são capazes de reconhecer o TCR intacto em células vivas.

Muitos formatos diferentes de imunoensaio incluindo, mas não se lhes limitando, formatos ELISA, EIA e RIA de um ELISA podem ser utilizados para pesquisar anticorpos anti-TCR tal como pode ser previsto por um perito na arte.

Muitos ensaios de pesquisa adicionais, tais como os baseados em competição com anticorpos anti-TCR de especificidade conhecida ou na capacidade de causar proliferação em cultura de células T que expressem TCR conhecidos, serão conhecidos dos peritos na arte e podem ser utilizados para a selecção de anticorpos apropriados.

Inicialmente era difícil obter anticorpos que reagissem com as regiões V do r receptor das células T. Este problema surgiu quando o sinal observado pela ligação do anticorpo aos LSP através de análise de citometria de fluxo era muito baixo relativamente ao ruído de fundo da própria citometria de fluxo. Como este nível de sinal/ruído de fundo era tão baixo e era muitas vezes obscurecido pela variabilidade do próprio ensaio, concluiu-se que os anticorpos estavam a reagir positivamente apenas com o clone de células T utilizado para os criar. À medida que se sabia mais acerca do número de genes dos receptores das células T para a cadeia β (um total de 60-100 genes humanos em cerca de 20 famílias da região variável) e para a cadeia a (cerca de 100 genes humanos), era mais fácil interpretar com maior precisão os dados da citometria de fluxo. Por exemplo, seria de esperar que um anticorpo específico para a região Μβ reagisse em média com cerca de 5% dos LSP. Estudos posteriores sobre as percentagens de famílias de V/5ls em LSP normais indicam que as famílias estão de facto presentes de 1 % a 8% dependendo de cada família. Dependendo do instrumento, da sua calibração, da perícia do operador e da variabilidade inter-ensaios inerente da análise de citometria de fluxo, os níveis de ruído de fundo na citometria de fluxo podem facilmente estar no intervalo de 3-4%. Assim, ironicamente, o mesmo problema que confundiu os investigadores que tentavam fazer anticorpos específicos para TCR há 7-8 anos ainda hoje existe: a capacidade de distinguir um hibridoma 26 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ verdadeiramente positivo através de um método de pesquisa é diminuída em ensaios que proporcionam baixos sinais com ruídos de fundo elevados.

Os presentes inventores melhoraram as hipóteses de sucesso na identificação dos hibridomas desejados, proporcionando ensaios de pesquisa melhorados com maiores razões sinal/ruído de fundo. Um tal ensaio é um formato ELISA utilizando proteína purificada, melhor ainda proteína recombinante purificada e solúvel, para se ligar a anticorpos em sobrenadantes de hibridoma para criar sinais positivos fortes. Uma vez que a “substância a analisar” nestes ensaios é uma proteína purificada conhecida, os sinais são mais altos que os obtidos se forem utilizados os lisados celulares ou outras preparações proteicas parcialmente purificadas contendo numerosos contaminantes. Estes ensaios de pesquisa mais eficazes e eficientes aumentam a capacidade de pré-pesquisar soro de ratinho para monitorizar respostas de anticorpo eficazes no hospedeiro após a imunização e de pesquisar sobrenadantes de hibridomas reunidos durante a pesquisa inicial de muitos hibridomas candidatos. Outra vantagem dos ensaios ELISA é a de que a escolha do anticorpo de plaqueamento (pan-lg ou lgG2a específico, por exemplo) pode seleccionar positivamente anticorpos específicos para TCR de um isotipo preferido. Assim, uma vez identificado um anticorpo para TCR desejado, não é necessário mudar depois o seu isotipo. Com proteína solúvel e purificada é também possível ligar o antigénio directamente à placa em vez de utilizar formatos de imunoensaio em sanduíche.

5.3.4. PROCEDIMENTOS DE CARACTERIZAÇÃO MELHORADOS

Após um hibridoma ter sido detectado através do protocolo de pesquisa inicial, este é depois ainda pesquisado e analisado para se determinar a sua especificidade. Tal caracterização inclui, por exemplo 1) imunoprecipitação seguida por electroforese em gel-SDS para determinar se o anticorpo precipita proteínas de tamanhos esperados para os TCR, com ou sem co-precipitação dos polipéptidos T3; 2) a capacidade do anticorpo para co-modular o receptor T3 para fora da superfície das células, indicando que o anticorpo está a reagir com o TCR; 3) determinação da percentagem de LSP positivos para CD3 aos quais o anticorpo se liga através de análise de citometria de fluxo para determinar se é específico anti-idiotípico, anti-região variável ou anti-região constante; 4) análise de transferência de “Western” para determinar a especificidade para a cadeia β 5) experiências de bloqueio com outros anticorpos ou péptidos conhecidos para determinar a especificidade para o epítopo ou a semelhança com anticorpos conhecidos; e 6) 27 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ análise contra um painel de células que expressem TCR conhecidos para determinar a reactividade da região variável ou constante.

Adicionalmente a estes procedimentos os presentes inventores verificaram que o seguinte procedimento permite uma caracterização ainda melhor dos anticorpos. Uma vez criado e caracterizado um anticorpo tal como indicado acima, este é então utilizado para estimular LSP a expandirem-se em cultura. O anticorpo interage especificamente com o subconjunto de LSP que expressa o epítopo que reage com o anticorpo e estimula uma resposta mitogénica. À medida que ocorrem os ciclos desta resposta mitogénica, o anticorpo vai amplificando selectivamente estas células até ser possível gerar linhas celulares que reajam até 95% com o anticorpo. Isto resulta num sinal positivo muito elevado que é fácil de distinguir do ruído de fundo, por exemplo um sinal positivo de 95% em citometria de fluxo sobre um sinal de ruído de fundo de 2-4%. Utilizando este procedimento foi possível distinguir a verdadeira especificidade do anticorpo W112 (V/fô.3) da do anticorpo 1C1 (V/55.2 e V/35.3) (Boylston et ai, 1986, Immunol. 137(2): 741). Adicionalmente, os presentes inventores foram capazes de determinar a especificidade fina dos anticorpos 5E4 e 8F10 como sendo uma especificidade para a região variável e não uma especificidade combinada para as regiões variável e de união. Uma outra vantagem deste método de amplificação é a de que é simples distinguir um verdadeiro anticorpo anti-idiotípico de um que reconhece uma das famílias da região V menos expressas. O anticorpo anti-região variável conduzirá produtivamente os LSP através de ciclos mitogénicos para gerar uma linha celular amplificada. Uma vez que é extremamente improvável que um anticorpo anti-idiotípico encontre o seu antigénio cognato numa população de LSP, este não gerará linhas celulares amplificadas.

Os presentes inventores caracterizaram ainda a capacidade de anticorpos específicos para interagirem com células de macaco, p.ex. a presença de um homólogo de macaco. Uma vez que os anticorpos anti-TCR humano não reagem de forma cruzada com TCR que não de primatas, uma vantagem importante do presente invento é a de permitir um modelo de primatas para estudos de segurança, toxicidade e eficácia. Embora alguns anticorpos anti-região V do TCR reajam com células de macaco e outros não (ver Axberg et ai, 1991, J. Clin. Immunol. 11: 1-12), os presentes inventores mostraram que 5E4 e 8F10 reagem com células de macaco. É possível definir ainda as especificidades finas destes anticorpos, uma vez que anticorpos semelhantes através de outros procedimentos 28 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ de caracterização, podem interagir com percentagens diferentes de células de macaco. Assim, embora estes reconheçam antigénios semelhantes, podem reconhecer diferentes epítopos ou epítopos combinados.

5.4. UTILIDADE EM DIAGNÓSTICO DOS ANTICORPOS DO INVENTO

Os anticorpos e fragmentos do presente invento podem ser empregues para fins de diagnóstico ou investigação em vários imunoensaios bem conhecidos na arte. Os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, úteis no presente invento podem ser utilizados para detectar, quantitativa ou qualitativamente, a presença de células que expressem um membro da família VyS3 de TCR, particularmente V/S3.1, ou os níveis de proteína de TCR presentes numa amostra. Isto pode ser realizado através de técnicas de imunofluorescência empregando um anticorpo marcado com fluorescência (ver abaixo) acoplado a detecção por microscopia óptica, citométrica por citometria de fluxo ou fluorimétrica.

Os anticorpos (ou fragmentos destes) úteis no presente invento podem ser empregues histologicamente, tal como em microscopia de imunofluorescência ou imunoelectrónica, para detecção in situ da molécula de TCR.

Uma maneira de medir a reactividade de um epítopo do receptor das células T com um anticorpo específico do presente invento é através de imunoensaio enzimático (EIA) tal como um ensaio de imunossorção com ligação de enzimas (ELISA) (Voller, A. et al., J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980). A enzima, conjugada com o anticorpo do invento ou com um parceiro de ligação para o anticorpo, quando exposta posteriormente a um substrato apropriado, reagirá com o substrato de forma a produzir uma porção química que possa ser detectada, por exemplo, através de meios espectrofotométricos, fluorométricos ou visuais.

Um método preferido de enumeração do total das cadeias β do receptor das células T ou do total das cadeias de TCR do subconjunto da região V é efectuado utilizando amostras de sangue completo tratadas com detergente. Em particular o subconjunto V/33.1 pode ser detectado a partir de uma amostra ou são adicionadas amostras de sangue completo a poços numa placa de 96 poços previamente revestidos com 5 pg/ml de anticorpo de revestimento. O anticorpo de revestimento é um controlo negativo, um anticorpo anti-estrutura principal tal como W76 (para

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 29 detectar ο total de cadeias β) ou um anticorpo monoclonal especial para a região V de TCR tal como os do presente invento (para detectar um subconjunto das cadeias /7 de TCR). Um anticorpo DF1 conjugado com HRP, o qual reconhece um epítopo da região C de cadeia β diferente do W76 é utilizado como anticorpo de detecção. O ensaio pode ser utilizado para detectar o total de cadeias β de TCR bem como subconjuntos da cadeia β tais como V/33.1 O formato do ensaio é descrito na Publicação PCT WO9208981 de Rittershaus C.W., publicada a 29 de Maio de 1992, intitulada “Therapeutic and diagnostic methods using total Leukocyte surface antigens”. A detecção de um membro da família VyS3 de TCR, de proteínas ou células, pode ser realizada utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, é possível detectar a ligação de um anticorpo à região V de TCR através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março de 1986, págs. 1-5, 46-49 e 68-78; Work, T.S. et ai, Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, New York, 1978). É também possível marcar o anticorpo no qual a ligação é medida utilizando anticorpos conjugados radioactivos, fluorescentes, quimioluminescentes ou bioluminescentes.

Para os sistemas EIA e RIA está disponível uma variedade de formatos de imunoensaio. Por exemplo, os ensaios podem ser competitivos ou não competitivos. Podem ser utilizados ensaios de dois locais ou em sanduíche, ensaios “directos", “simultâneos” ou “inversos”, os quais são bem conhecidos na arte.

Tipos adicionais de imunoensaios incluem reacções de precipitina, reacções de precipitina com difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixaçãu do complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios de proteína A e ensaios de imunoelectroforese. A ligação do anticorpo, ou fragmento ou derivado deste ao epítopo do TCR para o qual este é específico, pode ser realizada e/ou detectada in vitro ou in vivo. A ligação in vitro, tal como acima descrito, pode ser efectuada utilizando espécimes 30 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ histológicos, ou fracções ou extractos de tecido ou fluido, incluindo células T substancialmente purificadas. A ligação in vivo pode ser realizada administrando o anticorpo (ou fragmento ou derivado) através de qualquer via ou meio conhecidos na arte, incluindo, mas não se lhes limitando, via intravenosa, intraperitoneal, intranasal e intra-arterial, de forma a que a ligação específica possa ser detectada.

Para doenças envolvendo articulações, tais como AR, a administração intra-articular de um anticorpo marcado (ou derivado ou fragmento) pode também ser utilizada como procedimento de diagnóstico.

Podem ser utilizadas técnicas de imageologia in vivo, em que o anticorpo, derivado ou fragmento é ligado a um marcador detectável que possa ser localizado in vivo. Muitos marcadores e métodos de marcação diferentes são conhecidos na arte. O presente invento proporciona um método para diagnosticar uma doença relacionada com o sistema imunitário, incluindo uma malignidade linfática, com base na detecção da ligação específica de um mAb, ou seu derivado ou fragmento, a uma região definida de um TCR numa amostra biológica de um indivíduo suspeito de ter a doença ou desordem. As amostras biológicas que podem ser testadas de acordo com o presente invento incluem qualquer fluido corporal, tal como sangue periférico, plasma, fluido cerebrospinal, linfa, fluido peritoneal ou fluido pleural e semelhantes ou qualquer tecido corporal ou extracto deste.

De acordo com o presente invento, a AR pode ser diagnosticada num indivíduo detectando a presença aumentada de células T expressando Μβ3, em particular, V/J3.1, sozinhas ou concomitante com a presença aumentada de células T expressando V/fè ou Vy?10, numa amostra biológica do indivíduo em comparação com amostras basais. Tal diagnóstico pode ser realizado utilizando um mAb, fragmento ou derivado, específico para a região V do TCR particular associada à doença, tal como acima descrito. Tal como aqui se utiliza, o termo “amostra basal” refere-se a uma amostra de um indivíduo normal e saudável que não tem artrite reumatóide ou uma amostra do indivíduo antes do aparecimento da doença ou num momento de remissão da doença. Noutro aspecto, uma amostra basal pode ser uma mistura ou uma média de amostras de uma população genérica. Numa concretização especial a amostra biológica a testar é do local da doença e a basal é o sangue periférico. 31 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Alternativamente, tal diagnóstico pode ser realizado através da detecção da presença de sequências de ácido nucleico características destas regiões V de TCR utilizando técnicas moleculares. De preferência, tal diagnóstico molecular é realizado detectando a presença de sequências de ácido nucleico homólogas a um gene que codifique uma região de TCR ou Vy33 definida, de preferência V/33.1, em ARNm numa amostra do doente. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos para os membros da família génica Vy03 e produtos génicos são conhecidos (Toyonaga et ai, 1987 Ann. Rev. Immunol., 5: 595-620). Um perito na arte podia prontamente conceber testes de diagnóstico para detectar o aumento de V/33 aqui descrito. As abordagens moleculares utilizadas para correlacionar a expressão génica de TCR com a doença incluem: (1) produção e análise de bibliotecas de ADNc obtidas a partir das células T relacionadas com a doença obtidas de um ou mais indivíduos possuindo a doença, para determinar a presença de genes de TCR frequentemente utilizados ou “dominantes”. (2) análise de “Southern" de amostras de doença para determinar se existem polimorfismos genéticos específicos (p.ex., RFLP) ou rearranjos oligoclonais de TCR; (3) análise de amostras de doença através de procedimentos de síntese de ADNc, amplificação por PCR e hibridação “slot blot”, descritos com maior detalhe abaixo; este procedimento requer menos tempo e permite o teste de um maior número de doentes; (4) hibridação de ácido nucleico in situ de sondas de TCR com células T sem cultura prévia destas células.

Deve entender-se que os métodos de diagnóstico do presente invento são melhor utilizados juntamente com outros métodos de diagnóstico conhecidos para obter um diagnóstico exaustivo do doente. Por exemplo, um diagnóstico de AR pode ser feito com base nos métodos do presente invento juntamente com o reconhecimento de diagnóstico convencional das características clínicas da AR, tais como: (a) envolvimento típico das articulações (artrite crónica, simétrica); (b) envolvimento inicial mais frequentemente nas mãos; (c) aspectos radiográficos característicos; (d) presença de factor reumatóide; (e) presença de nódulos reumatóides; etc. 32 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Ver, por exemplo, Fishman et ai, Medicine, Segunda £d., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, págs. 340-346. Tal como com quaisquer critérios de diagnóstico, os parâmetros divulgados no presente invento podem não ser determinantes exclusivos, ou patognomónicos, de uma determinada desordem.

5.5. UTILIDADE TERAPÊUTICA DOS ANTICORPOS DO INVENTO

Tal como acima mencionado, o presente invento é também útil na terapia de uma doença relacionada com o sistema imunitário, de preferência uma doença auto-imune ou uma malignidade linfática. As concretizações terapêuticas do presente invento são mais bem aplicadas uma vez estabelecida uma correlação entre a doença de interesse, por exemplo AR, e a utilização preferencial de um determinado gene V de TCR em células T associadas à doença, por exemplo genes que codificam um membro da família V/33, em particular Vy33.1, sozinha ou concomitante com a utilização de genes codificando V/39 ou V/710. O TCR que é expresso em particular ou que “marca” as células T que medeiam o processo auto-imunitário é designado um “TCR marcador”. Numa concretização preferida, o TCR marcador para a artrite reumatóide é V/8.1. Os anticorpos, fragmentos ou derivados do presente invento são terapeuticamente úteis em parte devido à sua capacidade para interferir na ligação da célula T, através do seu TCR, ao complexo MHC/antigénio (ou ao antigénio sozinho) necessária para a iniciação ou propagação do processo auto-imunitário.

Os TCR marcadores associados a uma dada doença são identificados utilizando qualquer uma de várias técnicas bem conhecidas na arte. Os genes V dos TCR marcadores para AR são exemplificados com maior detalhe abaixo. Uma abordagem genética utilizando doentes que se sabia terem miastenia grave ou esclerose múltipla foi descrita por Oksenberg, J.R., ef a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 988-992 (1989). As sequências da cadeia β do TCR apropriada são obtidas por análise genómica utilizando polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição encontrados em famílias possuindo uma prevalência da doença auto-imune particular, por exemplo, tal como descrito por Seboun, E., et al., Cell 87: 1095-1100 (1989); Burns, F.R., et ai, J. £xp. Med. 169: 27-39 (1989). Assim está ao nível da vulgar perícia na arte identificar outras doenças associadas à expressão de V/33, em particular V>S3.1. 33 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Deverá ser notado que, para os fins do presente invento, a determinação do TCR marcador associado a uma doença auto-imune não requer que o “auto-antigénio" seja caracterizado. É suficiente que a doença auto-imune envolva uma resposta imunitária mediada por células T como parte necessária do processo pàtogénico. De facto, tal como é conhecido na arte, a doença auto-imune pode não envolver um verdadeiro auto-antigénio na fase indutiva, mas sim, pode representar uma resposta a um antigénio exógeno, tal como um antigénio virai ou bacteriano, o qual reage de forma cruzada com antigénios próprios, ou resulta numa resposta imunopatológica dirigida ao antigénio exógeno presente no hospedeiro.

As células T do subconjunto associado à doença auto-imune, as quais podem reconhecer um verdadeiro auto-antigénio ou um antigénio associado a uma doença auto-imune (tal como certos antigénios virais ou bacterianos) podem ser clonadas e expandidas ou imortalizadas em cultura através de métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, as células T podem ser fundidas com uma célula imortalizante, p.ex., uma linha de células T de longo prazo, uma linha de linfoma de células T ou um hibridoma de células T e depois postas a crescer em cultura. As células cultivadas servem com fonte de cadeias de TCR da superfície celular que são analisadas utilizando os anticorpos do presente invento, ou como fonte do ADNc que codifica o TCR apropriado para a identificação molecular da utilização de TCR. Tal ADNc é clonado e expresso através de métodos bem conhecidos na arte. (Ver, por exemplo, Sambrook, J. et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). As células T podem ser isoladas a partir de humanos que sejam susceptíveis a uma doença auto-imune, de preferência a partir de indivíduos susceptíveis que têm a doença auto-imune e são expandidas em cultura utilizando técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Zamvil et ai, Nature 317: 355-358 (1985); Nature 324: 258-260 (1986)).

Uma correlação absoluta entre uma doença auto-imune e a utilização de um determinado TCR não é nem esperada nem necessária para cada indivíduo praticar com sucesso o presente invento. Foram demostradas correlações para alguns indivíduos com artrite reumatóide e a expressão ou presença de V/?3 no tecido sinovial relativamente ao sangue periférico. Também existe correlação para expressão aumentada de V/Í9 ou V/J10 relativamente ao sangue periférico, ou de ambos, especialmente quando detectada em adição a V/33.

Θ5 205 ΕΡ 0 662 148/ΕΡ 34 Ο TCR expresso por células Τ especificamente associadas a uma doença pode ser identificado utilizando anticorpos específicos para TCR, policlonais, monoclonais ou quiméricos, tais como os aqui descritos. Especificamente os anticorpos para um epítopo de um membro da família V/33 de TCR, especificamente V/?3.1, podem ser utilizados para detectar expressão à superfície, empregando técnicas de microscopia de fluorescência, citometria de citometria de fluxo, imunocitoquímica ou outras técnicas conhecidas na arte. Tais anticorpos são aqui descritos e foram relatados por outros para várias regiões V da cadeia αβ de TCR em sistemas de roedores (ver, por exemplo, Ohashi, M., et a/., J. Exp. Med. 168: 2153-2164 (1988); Gascoigne, N.R.J., et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 2936 (1987); Kappler, J.W., et ai, Nature 332: 35 (1988); Kappler, J.W., et ai, Cell 49: 263 (1987); MacDonald, H.R., et ai, Nature 332: 40 (1988)).

Como alternativa à análise da superfície celular utilizando anticorpos, o ADN ou o ARNm das células T pode ser sondando directamente, ou após amplificação por reacção em cadeia com polimerase (Synha et ai, Science 239: 1026 (1988); Saiki et ai, Nature 324: 163 (1986)), por hibridação específica com sondas de ácido nucleico para as várias famílias génicas de TCR, utilizando métodos de hibridação bem conhecidos na arte (ver exemplos, abaixo).

Onde não foram identificados auto-antigénios específicos, a oligoclonalidade das células T na região anatómica associada à doença pode ser utilizada como uma base para o enriquecimento de células T reactivas. Por exemplo, células associadas unicamente a AR são encontradas no fluido sinovial da articulação; células associadas unicamente a EM são encontradas no fluido cerebrospinal (CSF); e células T associadas a doença infiltram o tecido da tiróide na tiroidite de Hashimoto e na doença de Graves. Nestes casos, as células T podem ser isoladas a partir da localização anatómica relevante e expandidas em cultura, (ver, por exemplo, Londei, M. et ai, Science 228: 85-89 (1985); Stamenkovic, I. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 1179-1183 (1988); Oksenberg, J.R., et ai, supra). O tratamento de um indivíduo utilizando os anticorpos, fragmentos ou derivados de acordo com o presente invento compreende a administração parentérica de uma única dose ou de doses múltiplas do anticorpo, fragmento ou derivado. A dose eficaz é uma função de cada anticorpo (ou fragmento ou derivado), da presença e natureza de um agente terapêutico conjugado, do indivíduo e do seu estado clínico. As doses eficazes dos anticorpos, fragmentos ou 35 85 280 ΕΡ 0 662 148/ΕΡ derivados deste invento para utilização na prevenção, supressão ou tratamento de uma doença relacionada com o sistema imunitário estão dentro da gama de cerca de 1 ng a 100 mg/kg de peso corporal. Uma gama de doses preferida é entre cerca de 10 ng e 10 mg/kg. Uma gama de doses ainda mais preferida é entre cerca de 100 ng e 1 mg/kg. A via de administração pode incluir a via intravenosa (IV), subcutânea (SC), intramuscular, intrapulmonar, intraperitoneal (IP), intranasal, intracerebroventricular, intratecal, intradérmica ou outras vias conhecidas.

Tal como acima mencionado, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio, pode ser conjugado com proteínas citotóxicas, incluindo proteínas inibidoras de ribossomas tais como Ricina-A, toxina de Pseudomona e toxina de Difteria, bem como outras proteínas tais como o factor de necrose tumoral. As toxinas conjugadas com anticorpos ou outros ligandos, são conhecidas na arte (ver, por exemplo, Olsnes, S. et ai, Immunol. Today 10: 291-295 (1989)). Uma vez que um anticorpo para um epítopo de TCR reagirá com uma proporção muito menor dos linfócitos totais do que as imunotoxinas mais amplamente reactivas utilizadas até à data, serão toleradas pelos doentes doses mais elevadas de um anticorpo anti-TCR conjugado com toxinas, ou reciprocamente, serão eficazes doses mais baixas.

Numa concretização preferida, a cadeia de ricina A é conjugada com um anticorpo especifico para TCR do presente invento, i.e., um anticorpo anti-Vy33, resultando num imunoconjugado capaz de se ligar ao TCR dos linfócitos que são um agente causador de uma desordem auto-imune, tal como AR, e de destruir as células, tratando assim a doença. As doses eficazes de um anticorpo monoclonal anti-TCR conjugado com ricina A estão na gama de cerca de 0,005 a 0,5 mg/kg/dia, com a dose preferida na gama de cerca de 0,05 a 0,2 mg/kg/dia.

Os anticorpos anti-TCR deste invento podem ser conjugados com tipos adicionais de porções terapêuticas incluindo, mas não se lhes limitando, radionuclidos e fármacos citotóxicos, para tratar indivíduos com autoimunidade ou com doença maligna ou linfoproliferativa. Exemplos não limitantes de radionuclidos que podem ser acoplados a anticorpos e entregues in vivo nos locais do antigénio incluem 212Bi, 131T, 186Re e 90Y. Tais radionuclidos exercem o seu efeito citotóxico

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 36 irradiando localmente as células, conduzindo a várias lesões intracelulares, tal como é bem conhecido na arte da radioterapia.

Os fármacos citotóxicos que podem ser conjugados com anticorpos e subsequentemente utilizados para terapia in vivo incluem, mas não se lhes limitam, daunorubicina, doxorubicina, metotrexato e mitomicina C. Para uma exposição mais completa destas classes de fármacos que são conhecidos na arte e dos seus mecanismos de acção, ver Goodman, A.G., et ai, Goodman and Gilman s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7a Ed., Macmillan Publishing Co., (1985).

As abordagens terapêuticas aqui divulgadas baseiam-se em qualquer um de vários mecanismos possíveis através dos quais os anticorpos, fragmentos ou derivados do presente invento podem actuar para alcançar os benefícios terapêuticos. Os presentes inventores não pretendem ficar presos a qualquer teoria em particular quanto ao mecanismo de acção.

Numa concretização, se um determinado anticorpo específico para V/?3 de TCR for capaz de induzir proliferação de células T in vitro (ver Exemplos, abaixo), este pode ser administrado terapeuticamente para induzir activação e/ou proliferação de células T que possuam um membro da família V/?3 de TCR, conduzindo a imunidade específica mediada por células.

Noutra concretização, um anticorpo dirigido contra um TCR V/J3 marcador associado a células T causadoras de doença pode ser utilizado, sozinho ou conjugado com um agente tóxico, para remover as células T indesejadas.

Ainda noutra concretização, o anticorpo específico para V/33 de TCR é administrado terapeuticamente para bloquear a interacção das células T efectoras com o antigénio para o qual são específicas, modulando assim um resposta imunitária deletéria.

Um anticorpo, fragmento ou derivado do presente invento administrado pode actuar ligando-se a uma molécula de TCR V/?3 in vivo e marcando a célula T que possuiu esse TCR Μβό para eliminação através de qualquer um dos sistemas de defesa do hospedeiro tal como o sistema reticuloendotelial ou através de citotoxicidade celular dependente de anticorpos.

Tipicamente, quando o anticorpo é utilizado para estimular a subpopulação de células T que possui o TCR V/33 particular, o anticorpo é administrado numa menor concentração conhecida como concentração “mitogénica”. Quando o anticorpo é utilizado para eliminação de células T, é administrado numa concentração muito maior.

Para o anticorpo, fragmento ou derivado do presente invento ser útil em terapia, tem que ter a capacidade de reconhecer e de modular ou conduzir à destruição de um subconjunto específico de células T relacionadas com uma doença. A natureza exacta desta modulação terapêutica, através de estimulação, bloqueio ou eliminação de células T, depende da doença a tratar e da natureza do(s) subconjunto(s) específico(s) de células T envolvido(s).

Os tratamentos de primeira geração baseados em agentes terapêuticos de anticorpos anti-V/33 de TCR podem ser desenvolvidos utilizando o conhecimento da correlação entre uma doença e a expressão de uma sub-família génica específica da região V/33 de TCR em indivíduos possuindo a doença. Tais agentes terapêuticos oferecem uma melhoria sobre procedimentos conhecidos, tais como a utilização de um anticorpo anti-CD3, no tratamento da rejeição em transplantação renal, em que a ampla reactividade do anti-CD3 com todas as células T resulta na modulação de toda a população de células T. Os métodos terapêuticos do presente invento resultam na modulação apenas do subconjunto de células T particular que expressa a sub-família da região V de TCR de interesse.

Em adição, reagentes dirigidos a sub-famílias da região V/33 de TCR, tal como aqui divulgado, são aplicáveis ao tratamento de grupos de doentes que apresentam expressão semelhante da região V. Isto contrasta com a terapia dirigida a uma única cadeia clonal V/33 (V-D-J-C) que deve ser útil apenas nos doentes individuais nos quais essa precisa cadeia V/33 de TCR é expressa.

Espera-se que os agentes terapêuticos baseados em anticorpos anti-TCR V/33 de segunda geração se apoiem em apuramentos adicionais do nosso conhecimento sobre a associação de determinadas regiões V, D e J dos genes β de TCR, a estados específicos de doença. Por exemplo, os doentes podem ser ainda subdivididos em grupos para tratamento com base nas regiões V, D e J de V/Ώ de TCR envolvidas. O objectivo permanece como a modulação apenas das

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 38 células Τ relacionadas com a doença, ao mesmo tempo que poupando, ou não afectando, outras células T no indivíduo para alcançar uma maior especificidade da terapia.

De acordo com o presente invento, onde V/?3 é acima discutido, este refere-se a qualquer membro da família V/S; de preferência a sub-família é V/J3.1.

5.6. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DO INVENTO A utilização terapêutica pré-clínica e clínica do presente invento no tratamento de doenças ou desordens relacionadas com o sistema imunitário será melhor alcançada pelos peritos, empregando princípios aceites de diagnóstico e tratamento. Tais princípios são conhecidos na arte e são expostos, por exemplo, em Braunwald, E. et ai, eds., Harríson’s Principies of Internai Medicine, 11a Ed., McGraw-Hill, editor, New York, N.Y. (1987).

Os anticorpos, fragmentos e derivados do presente invento, são bem adequados para a preparação de composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas do invento podem ser administradas a qualquer animal que possa sentir os efeitos benéficos das composições do invento. Em primeiro lugar entre tais animais estão humanos, embora não se pretenda que o invento seja a eles limitado.

As composições farmacêuticas do presente invento podem ser administradas por qualquer meio que atinja o seu objectivo pretendido. Por exemplo, a administração pode ser através das vias parentérica, subcutânea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica ou bucal. Alternativamente, ou concorrentemente, a administração pode ser através da via oral. As composições farmacêuticas podem ser administradas parentericamente por injecção única ou por perfusão gradual ao longo do tempo. A dosagem administrada estará dependente da idade, sexo, saúde e peso do receptor, lipo de tratamento concorrente, se houver algum, frequência do tratamento e da natureza do efeito desejado. As gamas de doses para a administração das composições do presente invento são as suficientemente grandes para produzir o efeito desejado. As doses não devem ser tão grandes que causem efeitos secundários adversos, tais como reacções cruzadas indesejadas, imunossupressão generalizada, reacções anafiláticas e semelhantes. 39 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

As doses preferidas para humanos variam entre cerca de 0,0001-25 mg de anticorpo, fragmento ou derivado por kg do peso corporal.

Adicional mente ao anticorpo, fragmento ou derivado do invento o qual é por si farmacologicamente activo, as composições farmacêuticas contêm de preferência transportadores adequados, farmaceuticamente aceitáveis, compreendendo excipientes e auxiliares que facilitem o processamento dos compostos activos em preparações que possam ser utilizadas farmaceuticamente. Tais transportadores farmaceuticamente aceitáveis são estéreis. Para além disso, tal como aqui se utiliza, o termo transportadores farmaceuticamente aceitáveis não inclui meios de cultura celular ou quaisquer componentes não aprovados para utilização em humanos.

As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções aquosas do anticorpo numa forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água. Adicionalmente, podem ser administradas suspensões do anticorpo na forma de suspensões oleosas apropriadas para injecção. Os solventes lipofílicos ou veículos adequados incluem óleos gordos, por exemplo, óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, por exemplo, etiloleato ou triglicéridos. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão e incluem, por exemplo, carboximetil-celulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes. Os anticorpos, fragmentos ou derivados do invento são de preferência formulados numa forma purificada substancialmente isenta de agregados e outros materiais proteicos, de preferência em concentrações de cerca de 1,0 ng/ml a 100 mg/ml.

As composições são formuladas utilizando veículos parentéricos convencionais farmaceuticamente aceitáveis para administração por injecção. Estes veículos não são tóxicos e são terapêuticos e várias formulações são expostas em Remingtor>’s Pharmaceutical Sciences, 16a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). São exemplos não limitantes de excipientes, a água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e solução salina equilibrada de Hank. As formulações de acordo com o invento podem também conter quantidades menores de aditivos tais como substâncias que mantêm a isotonicidade, o pH fisiológico e a estabilidade. 40 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Para melhorar a entrega ou a bioactividade, os anticorpos, fragmentos ou derivados destes, podem ser incorporados am lipossomas utilizando métodos e compostos conhecidos na arte.

Tendo-se já descrito genericamente o invento, o mesmo será mais rapidamente compreendido através de referência aos seguintes exemplos os quais são proporcionados como meio de ilustração e não se pretende que sejam limitantes do presente invento, a menos que especificado. 6. EXEMPLO: PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA V/73.1

6.1. MÉTODOS

6.1.1. IMUNIZAÇÃO E PESQUISA DE HIBRIDQMAS A proteína Μβ3.1 solúvel purificada (20 pg) foi obtida tal como descrito na Secção 6.1.7. e emulsionada em adjuvante de Freund completo antes de injecção intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.) em ratinhos Balb/c. A intervalos de 3-4 semanas, os ratinhos foram imunizados i.p. com 20 pg de Vy33.1 emulsionada em adjuvante de Freund. Quatro semanas após a terceira imunização, um ratinho recebeu um reforço intravenoso (i.v.) de 20 pg de V/23.1 e o baço foi removido 4 dias depois. Os esplenócitos foram fundidos com células de mieloma P3X63-Ag8.653 através da adição de 1 ml de PEG-1500 a 50% (p/v) (Boehringer Mannheim, Indianapolis IN), depois diluídos com 20 ml de meio Opti-MEM isento de soro (GIBCO). Após a fusão, as células foram plaqueadas em poços de placas de 96 poços de fundo raso e seleccionadas em meio Opti-MEM-I contendo 7,5 % de FCS, 10% de soro de vitelo (Hyclone), 5% de Origen (IGEN, Rockville, MD) e HAT (GIBCO). Os poços com crescimento foram pesquisados quanto à produção de mAb anti-TCR utilizando um ELISA de pesquisa de “captura de TCR".

Os poços de placas de 96 poços de fundo raso foram revestidos de um dia para o outro a 4°C com 100 pl de anticorpos de cabra anti-lgG de ratinho específicos para Fc (Cappel, Westchester, PA) a 2 pg/ml em PBS. Após o bloqueio das placas durante 1 h com uma solução a 1% de BSA em PBS, as placas foram lavadas com tampão de lavagem (Tween-20 a 0,05% em PBS). O sobrenadante da cultura de hibridoma (100 μΙ) foi adicionado e incubado durante 1-2 h à temperatura ambiente. Os poços foram então lavados com tampão de lavagem e foram 41 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ adicionados 100 μΙ de uma solução contendo aproximadamente 1 μ9/ιτιΙ de V/J3.1 solúvel, fragmento Fab de W76 conjugado com peroxidase de rábano (um anticorpo que reage com as regiões C/3), 2% de soro de ratinho normal, NP-40 a 0,25% e FCS a 25% em tampão de lavagem, e incubou-se durante 2 horas. Após a lavagem, as reacções foram reveladas. A análise do isotipo foi feita utilizando um estojo comercial (Boehringer Mannheim).

6.1.2. MARCACÃO RADIOACTIVA E IMUNOPRECIPITACAO

As proteínas de superfície foram marcadas radioactivamente com 125l através da técnica da lactoperoxidase. Resumidamente, 5x107 células foram lavadas 3 vezes com PBS e incubadas 30 minutos à temperatura ambiente em 1 ml de PBS com 100 ng de lactoperoxidase, 2 ng de glicose-oxidase, Na125l a 1 mCi e glucose 10 mM. As células foram lavadas duas vezes com PBS com Nal 10 mM e lisadas durante 1 hora a 4°C em 1,0 ml de uma solução contendo Tris-HCI 10 mM, pH 8,0, NaCI 0,15 M, NP-40 a 1%, PMSF 1 mM, 0,6 U/ml de aprotinina, EDTA 1 mM e iodoacetamida 10 mM. Os núcleos das células lisadas foram sedimentados e descartados. Foi adicionada hemoglobina até uma concentração final de 0,5% e o lisado foi então purificado numa coluna NAP-5 Sephadex G25 (Pharmacia) para remover o 125l livre.

Antes da imunoprecipitação, o lisado foi pré-clarificado por incubação com 0,2 ml de Pansorbin (Calbiochem, La Jolla, CA) por ml de lisado durante 1 hora a 4°C. Foram adicionados os mAb de controlo ou 50 μΙ de sobrenadante da cultura de mAb a 2x106 cpm de lisado e incubou-se de um dia para o outro a 4°C. Os complexos imunitários foram precipitados por adição de 5-10 μρ de anti-lgG de ratinho de cabra-Sepharose (Cappel) e incubou-se 4 h a 4°C. Após lavar 4 vezes em tampão de lise, os imunoprecipitados foram eluídos da Sepharose por ebulição durante 5 min em tampão de amostra de SDS-PAGE e analisados sob condições redutoras num gel de SDS-poliacrilamida a 11%. O gel foi seco sob vácuo e analisado através de autorradiografia.

6.1.3. MÉTODOS DE CITOMETRIA DE FLUXO

Para imunofluorescência de uma única cor, foram incubadas 5χ105 células com os sobrenadantes de hibridoma ou mAb de controlo durante 30 minutos sobre gelo. As células foram então sedimentadas, lavadas duas vezes com tampão de citometria de fluxo (PBS com NaN3 a 0,02% e FCS a 2%) e incubadas com F(ab)’2 de cabra anti-lgG de ratinho conjugado com fluoresceína (Cappel) durante 30 42 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ minutos sobre gelo. Quando o mAb de hamster 2C11 foi testado, um F(ab)’2 de coelho anti-lgG de hamster conjugado com fluoresceína (Jackson ImrnunoResearch, West Grove, PA) foi o reagente de detecção. Após 2 lavagens com tampão de citometria de fluxo, as células foram ressuspensas em 1,5 ml de tampão de citometria de fluxo e analisadas num citofluorógrafo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Para a imunofluorescência a duas cores, foram incubados 100 μΙ de sangue completo heparinizado ou tratado com EDTA de dadores humanos normais com os sobrenadantes de hibridoma ou mAb de controlo durante 30 minutos sobre gelo. As células foram então sedimentadas, lavadas duas vezes com tampão de citometria de fluxo e incubadas com F(ab)’2 de cabra anti-lgG de ratinho conjugado com fluoresceína (Cappel) durante 30 minutos sobre gelo. Após 1 lavagem com tampão de citometria de fluxo, as células foram incubadas com mAb conjugado com ficoeritrina específico para CD4, CD8 ou CD3 durante 30 min. Os eritrócitos foram então lisados incubando 5 min com 2 ml de solução de lise (NH4CI 0,16 M, KHC03 0,01 M, EDTA 0,1 mM) à temperatura ambiente. As restantes células foram sedimentadas, lavadas uma vez com tampão de citometria de fluxo e ressuspensas em 0,5 ml de tampão de citometria de fluxo. A análise de citometria de fluxo foi efectuada após entrada na população de linfócitos.

6.1.4. ESTIMULAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T UTILIZANDO mAb ANTI-TCR O sangue heparinizado de dadores humanos normais foi diluído 2 vezes com PBS e as células mononucleares foram isoladas por centrifugação em Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Após lavar 2-3 vezes com PBS para remover as plaquetas, as células foram ressuspensas a 1x106 células/ml em meio RPMI-1640 suplementado com soro humano normal a 10% e cultivadas em placas revestidas com mAb preparadas como se segue. Os poços das placas de 24 poços foram incubados de um dia para o outro a 4°C com anticorpo de cabra anti-lgG de ratinho específico para Fc (Cappel) diluído para 1 pg/ml em PBS. Após 1 lavagem com PBS, foram adicionados 100 ml de um dos sobrenadantes da cultura de anli-V/33 (5E4 ou 8Γ10) e incubou-sc 1 hora a 37°C. Após as placas terem sido lavadas várias vezes com RPMI-1640, as células foram adicionadas e cultivadas durante 48 h a 37°C numa atmosfera de C02 a 5%. Foi então adicionada IL-2 recombinante (Amgen, Thousand Oaks, CA) diluída para 20 U/ml em meio sem mAb em intervalos de 3-5 dias. Após 7 dias as células foram re-estimuladas incubando-as em placas revestidas com mAb. As células foram analisadas através 43 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ de citometria de fluxo e colhidas para preparação de ARN 5-7 dias após a última estimulação. 6.1.5. ANÁLISE DE PCR DE LSP ESTIMULADOS COM mAb PARA V63 O ARN total foi preparado através da técnica do ácido-fenol-tiocianato de guanidínio (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA). O ADNc foi sintetizado a partir de 1 pg de ARN utilizando o estojo de PCR para ARN Geneamp® (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) e oligo dT para iniciação. A PCR foi efectuada utilizando um iniciador com sentido específico de Μβ3 (iniciador 3-1 5’GGAGATATTCCTGAGGGGTAC3’ ou iniciador 3-2 5’GATGTGAAAGTAACCCAGAGC3’) e um iniciador anti-sentido de C/? (5’CTGATGGCTCAAACACAGCGACCTCG3’) utilizando 0,5 μΜ de cada iniciador, 2,5 U de AND-polimerase AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus), KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM, pH 8,3, MgCI2 2 mM e 0,2 mM de cada um dos desoxinucleósido-trifosfatos. O perfil de PCR utilizado para as amplificações com o iniciador 3-1 foi: desnaturação a 94°C durante 1 min, hibridação a 60°C durante 2 min e prolongamento a 72°C durante 2 min em 25 ciclos. Quando foi utilizado o iniciador 3-2, as condições da PCR foram as mesma excepto que a hibridação foi feita a 56°C. Após a amplificação, a reacção foi tomada 5 mM em MgCI2 e as extremidades dos produtos de PCR foram tomadas lisas incubando 30 min à temperatura ambiente com 1-2 U de fragmento de Klenow. Metade do produto de PCR foi purificado a partir de um gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1%, fosforilado com a AND-quinase de T4 tal como descrito e clonado em pUC18 digerido com Smal que tinha sido tratado com fosfatase intestinal de vitelo (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Este ADN foi utilizado para transformar células competentes DH5a e colónias individuais foram isoladas, e o ADN plasmídico foi sequenciado com a polimerase de ADN T7 (Sequenase, U.S. Biochemical, Cleveland, OH).

6.1.6. MÉTODOS DE CITOMETRIA DE FLUXO UTILIZANDO CÉLULAS DE MACACO

Para imunofluorescência a duas cores, foram incubados 100 μΙ de sangue completo heparinizado ou tratado com EDTA de macacos do género Macaca (“cynomolgus’’) (TSI Mason, Research) com 8F10 e 5E4 marcados com FITC e com uma mistura de mAb conjugado com ficoeritrina específico para CD4 e CD8 durante 30 minutos. Os eritrócitos foram então lisados incubando 5 minutos com 2 44 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ ml de solução de lise (NH4CI 0,16 M, KHC03 0,01 M, EDTA 0,1 mM) à temperatura ambiente. As restantes células foram sedimentadas, lavadas uma vez com tampão de cilometria de fluxo e ressuspensas em 0,5 ml de tampão de citometria de fluxo. A análise de citometria de fluxo foi efectuada após entrada na população de linfócitos. 6.1.7. PRODUÇÃO DE PROTEÍNA ΜΕ&Λ SOLÚVEL (sV^3.11 A inserção da cadeia β de 1,3 quilobases de YT35 (Yanagi et al., 1984, Nature 308: 148-149) foi subclonada em pUC18, digerida com Sful e Sph\ e o fragmento grande contendo o vector e a maior parte da região de codificação da cadeia β, foi purificado. Este fragmento grande foi então ligado a dois oligómeros complementares (5’CCTGGGGTAGAGCAGACTGTTCGTAGCATG3’ e 5’CTACGAACAGTCTGCTCTACCCCAGG3’, New England Biolabs, Beverly, MA) os quais foram hibridados por incubação a 65°C durante 15 minutos e depois arrefecidos lentamente até à temperatura ambiente. Isto produziu um construção de cadeia β de TCR humana designada sV/38.1, semelhante à construção solúvel de murídeo descrita anteriormente (Gascoigne et ai, 1990, J. Biol. Chem., 265: 9296-9301) com uma substituição de glicina para serina no aminoácido 258 após o codão de iniciação seguida por um codão de terminação enquadrado. O clone de ADNc PL4.4 (Concannon et ai, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83: 6598-6602) foi utilizado como molde para a sequência de codificação de V/33.1. Uma vez que este clone não possuía ADN que codificasse toda a sequência sinal ou de comando, o ADN que codifica a sequência de comando do clone de ADNc YT35 foi unido ao ADN que codificava as regiões V, D e J de PL4.4 utilizando mutagénese dirigida ao locus. A região de codificação de TCR de YT35 (V/58.1, Cp) foi clonada em pUC18 e digerida com HincU e BglW. O fragmento grande, englobando pUC18, o comando completo (L) e as regiões inteiras V de TCR, e a região 3’ Cβ^ do local BglII, foi ligado a um fragmento StuUBglU do clone PL4.4 (V/X3.1, C/22), englobando as regiões inteiras V, D e J de PL4.4 e a região 5’ de Cβ2 do local BglW. O local BglW é comum a ambas as sequências de Cfi\ e ΟβΖ. Este intermediário de clonagem continha toda a região V, D, J e C de PL4.4 correctamente fundida com a Cp\ de YT35 na extremidade 3’, mas fora de enquadramento com V/?8.1 de YT35 na extremidade 5’. A mutagénese dirigida ao local com o oligómero 5’GCATACAGATGCTAAAGTAACCCAGAGAG3’ foi utilizada para remover a volta indesejada da sequência dc V/fô.1 e restabelecer o 45 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ enquadramento de leitura aberto. Os primeiros 13 nucleótidos deste oligómero hibridam com o ADN que codifica a região L de V/38.1 até à junção L-V/®.1 enquanLo que o resto do oligómero se liga à região dc codificação N-terminal de V/33.1. A hibridação deste oligómero com o intermediário fez com que a sequência interveniente indesejada de Μβ8 perdesse a sua volta. Resumidamente, o ADN intermediário de V/33.1 (1 pg) foi linearizado com Xmn\ (estas enzima corta no gene de resistência à ampicilina de pUC18), desfosforilado com fosfatase intestinal de vitelo (Boehringer Mannheim) e misturado com 1 pg pUC18 desfosforilado e digerido com EcoRI//-//ndlll num volume final de 25 pl. A mistura de ADN foi desnaturada incubando 5 minutos com 25 pl de NaOH 0,4 M, neutralizada através da adição de 450 pl de Tris-HCI 0,1 M, pH 7,5 e depois aquecida a 68°C durante 2 horas. Isto criou uma pequena proporção de ADN em heterodúplex que consiste numa cadeia de apenas pUC18 e numa cadeia de pUC18 mais o ADN intermediário de V/?3.1. O oligómero mutagénico (50 pmol) foi fosforilado, hibridado a 45 pl de ADN em heterodúplex durante 20 minutos a 60°C e arrefecido à temperatura ambiente durante 10 minutos. O hiato foi preenchido e o plasmideo foi fechado através da adição de desoxinucleótidos 10 mM, 5 U do fragmento de Klenow da AND-polimerase I de E. coli, ditiotreitol 4 mM, adenosina-trifosfato 0,2 mM e 100 U de AND-ligase de T4 (todas as enzimas foram adquiridas de New England Biolabs, Beverly, MA). Foram utilizadas diluições da mistura de ligação para transformar células competentes DH5cc (BRL). As colónias resistentes à ampicilina foram transferidas para membranas de nylon (Colony/Plaque Screen, New England Nuclear, Boston, MA) e as que possuíam a mutação foram detectadas através de hibridação das colónias com o oligómero mutagénico marcado na extremidade 5’ (γ32Ρ-ΑΤΡ New England Nuclear). A hibridação foi efectuada a 37°C em NaCI 0,9 M, citrato de sódio 1,0 M. Os filtros foram lavados a 65°C, uma temperatura que favorece a hibridação do oligómero com o ADN correctamente mutado. O ADN das colónias positivas foi analisado por digestão de restrição e sequenciação do ADN para confirmar que codificava uma cadeia de V/53.1 completa. Esta construção foi designada flVy33.1.

Para criar sVp3.1, o pequeno fragmento EcoR\IBgl\\ de flV/33.1 foi ligado ao grande fragmento EcoR\IBgl\\ de sV/?8.1. Este fragmento ligado foi então clonado no local Xho\ do vector de expressão de mamíferos pTCSgpt (ver Pub. Patente Int. #WO 91/05047, publicada a 18 de Abril de 1991) para criar sV//3.1 -pTCSgpt.

85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 46 A co-transfecção mediada por fosfato de cálcio das células CHO DUX B11 foi efectuada utilizando 3 pg de pSV2 DHFR e 30 pg de sV/?3-pTCSgpt tal como descrito (Graham e van der Erb, 1973, Virol. 52: 456-467). A3 células foram seleccionadas através de crescimento em meios contendo metotrexato (Lederle, White Plains, NY) tal como descrito (Kaufman, et ai, 1985, Molec. and Cell Bioi, 5: 1750-1759). Os subclones foram analisados quanto à produção da cadeia β de TCR com um ELISA duplo em sanduíche de mAb específico para a cadeia β de TCR no qual os lisados da linha celular positiva para TCR Jurkat serviram como padrão. Resumidamente, foram revestidas placas de 96 poços de fundo raso (Immulon 2, Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) de um dia para o outro à temperatura ambiente numa câmara humidificada com 100 μΙ de mAb W76 anti-C/? de TCR a 2 pg/ml em PBS. Após a incubação das placas durante 2 horas a 37°C em tampão de bloqueio (BSA a 1%, Tween-20 a 0,05%, NaCI 0,15 M, Tris-HCI 0,025 M, pH 7,4, timerosal a 0,01%), as amostras a testar ou os padrões de lisados de Jurkat foram diluídos em tampão de bloqueio contendo NP-40 a 0,25% e as placas foram incubadas 1,5 horas a 37°C. As placas foram então lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (Tween-20 a 0,05%, timerosal a 0,01% em PBS) e foram adicionados 100 μΙ de /3F1 conjugado com peroxidase de rábano diluído em tampão de bloqueio contendo FCS a 50% e deixou-se a incubar 1,5 horas a 37°C. Após 3 lavagens, as placas foram reveladas utilizando 100 μΙ de solução de substrato (o-fenilenodiamina a 0,2%, citrato de sódio 0,017 M, Na2HP04 0,065 M, H202 a 0,04%). Esta reacção foi parada através da adição de 50 μΙ de H2S04 2 N e a absorvância de cada poço foi lida a 490 nm num leitor de placas de microtítulo (Dynatech). Os subclones positivos da co-transfecção foram identificados utilizando o ELISA acima descrito e foram subsequentemente amplificados cultivando as células em concentrações crescentes de metotrexato (Kaufman, et al., Mol. Cell Bioi, 5: 1750-1759). Um subclone cultivado em metotrexato 250 nM foi seleccionado para estudos posteriores e designado CHO-sV/?3.1.

Para cultura em larga escala, as células CHO-sV/33.1 cresceram em microtransportadores (Ventregel II, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME) em meios CHO-SFM (Gibco) contendo FCS dialisado a 1 % (Gibco). O sobrenadante de 6 litros de cultura foi colhido em confluência, concentrado 30 vezes por ultrafiltração (sistema de citometria de fluxo Benchmark Vortex, Membrex, Inc., Fairfield, NJ) e a proteína sV/?3.1 foi purificada por cromatografia de afinidade numa coluna do mAb W76 anti-cadeia C/7de TCR acoplado a Affigel-10 (Bio-Rad, 47 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Richmond, CA). A coluna foi eluída com dietilamina 50 mM, pH 11,5 e as fracções foram neutralizadas com um volume de 1/10 de HEPES 0,5 M, pH 7,0. A concentração proteica foi estimada utilizando o ensaio de reagente de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL) versus uma curva padrão de BSA e a pureza foi avaliada através de coloração com Azul de Coomassie e Prata do material corrido em SDS-PAGE.

6.1.8. CÉLULAS T DE MURÍDEO QUE EXPRESSAM V£3.1 HUMANO

Para criar uma linha de células T que expressa V/?3 humano, foram transfectadas células T de hibridoma de murídeo GLS5h/7 através de electroporação, com a inserção de V/33.1 completo de flV/?3.1 que fora clonada no local SamH1 do vector de expressão de mamífero pFneo (Ohashi et al., 1985, Nature 316: 606-607). Cinco milhões (5x106) de células GLS5h/? suspensas em 0,8 ml de meio Opti-MEM-I (Gibco) foram misturadas com 20 pg de ADN plasmídico e sujeitas a 200 volt, 960 pF utilizando um aparelho de electroporação Genepulser (BioRad). Após 2 dias de cultura, as células foram ressuspensas em meios contendo 1 mg/ml de G-418 (Gibco). Após aproximadamente 2 semanas, as culturas foram analisadas quanto à expressão de TCR por citometria de fluxo com mAb. 2C11 anti-CD3 de murídeo. A clonagem com diluição limitante produziu subclones que foram escolhidos com base na reactividade positiva com 2C11 e reactividade negativa com H57-597, um mAb específico para a cadeia /?do TCR de murídeo. Um subclone positivo foi designado GLS5hy#/hV/?3.1.

6.2. RESULTADOS

Uma fusão, tal como descrito acima, resultou em 6 mAb que eram fortemente reactivos com Μβ3 no ELISA de pesquisa de captura de TCR. Dois destes, designados 5E4 e 8F10, eram também reactivos com LSP humanos normais (ver abaixo) através de citometria de fluxo e foram seleccionados para posterior análise. Ambos os mAb eram do isotípo lgG1. Para confirmar que 5E4 e 8F10 reconheciam cadeias /?de TCR da superfície celular, os mAb foram testados quanto à sua capacidade para se ligarem à superfície de um hibridoma de células T de murídeo que expressa V/8.1 humana. Os resultados aparecem na Figura 1. Ambos os mAb reagiam com o transfectante de murídeo, embora 5E4 tenha exibido uma intensidade de fluorescência mais fraca que 8F10 ou o mAb de controlo positivo 2C11 específico para CD3 de murídeo. Nenhum destes mAb reagiu com a linha celular mutante negativa para TCR. 48 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Foram então feitas experiências para determinar as características bioquímicas da molécula reconhecida por 5ΕΊ o 8F10. Cada mAb foi utilizado para imunoprecipitar proteínas de superfície marcadas com 125l do transfectante de células T de murídeo. Os imunoprecipitados foram sujeitos a SDS-PAGE sob condições redutoras e os géis foram analisados por autorradiografia (Figura 2). Ambos os mAb 5E4 e 8F10 imunoprecipitaram uma molécula de tamanho idêntico à imunoprecipitada pelo mAb /3F1, um anticorpo específico para Cp de TCR, indicando que os novos mAb se ligaram a uma molécula semelhante a TCR. Tal como esperado, um mAb específico para a região constante da cadeia α do TCR humano, aF1, não reagiu com a cadeia α de murídeo expressa pelo transfectante e serviu por isso como controlo negativo.

Foram analisados LSP de vários dadores humanos normais quanto à reactividade com 5E4 e 8F10. Para delinear que população de células T foi corada, fez-se reagir as amostras também com conjugados de ficoeritrina de mAb Leu-4 (anti-CD3) ou com uma mistura de Leu-3a (anti-CD4) e Leu-2a (anti-CD8). A Figura 3A mostra resultados representativos obtidos de um dador. A análise da reactividade com LSP de 19 dadores mostrou que 5E4 reagiu com 0,7-8,1% (média = 4,0%) das células T do sangue periférico. 8F10 reagiu com 0,9-9,9% (média = 4,9%) das células T do sangue periférico. Estes resultados indicam que os indivíduos variam consideravelmente na expressão do epítopo ou epítopos de \/β3 reconhecidos por 5E4 e 8F10.

Estudos familiares em humanos utilizando os anticorpos anti-região V de TCR disponíveis demonstraram recentemente uma influência de MHC na expressão da cadeia α e β de TCR porque os indivíduos com MHC idênticos pareciam ter um padrão mais semelhante de utilização da região V que os seus semelhantes de MHC diferente. A identificação dos mAb do presente invento facilitará o estudo da relação entre o MHC e a expressão de V/J3.

Para determinar se V/J3.1 era preferencialmente expresso em células T CD4+ ou CD8+, foram analisados LSP de 5 dadores possuindo células que reagiam com 5E4 ou 8F10 através de imunofluorescência a duas cores quanto à reactividade com os mAb anti-CD4 ou anti-CD8 (Figura 3B). Os LSP de 2 dadores exibiram uma reactividade com 5E4 e 8F10 muito maior nas células T que reagem com CD8 (quadrados a cheio) em comparação com as células T que reagem com 49 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ CD4 (quadrados a branco). Os LSP de um dador diferente mostraram maior reactividade com 8F10 na população de CD4\ Assim, embora alguns indivíduos exibissem uma distribuição desigual entre as células T positivas para CD4 e CD8 dos epítopos de V/33.1 detectados pelos novos mAb, não houve qualquer inclinação aparente para qualquer uma das populações na amostra limitada aqui apresentada. 0 desvio da expressão de V/33 para as células T CD8+ ou CD4+ observado nos indivíduos podia reflectir as influências dos diferentes produtos génicos de MHC de Classe I ou Classe II na selecção das células de V/?3. No entanto, a contribuição de influências antigénicas na expressão de V/33 não pode ser posta de parte, uma vez que a expressão de V/23 em populações antigenicamente “ingénuas”, tais como linfócitos do sangue do cordão, não foi estudada.

Para estudar a especificidade fina dos mAb 5E4 e 8F10, os mAb foram utilizados para estimular a proliferação de linhas celulares de LSP humanos, as quais foram então sujeitas a análise por PCR das sequências de Μβ3 expressas utilizando iniciadores específicos de C/?e V/X3.1. As PBMC purificadas por Ficoll-Hypaque de 2 dadores foram estimuladas com 5E4 ou 8F10. Após aproximadamente 2,5 semanas de cultura, as células foram colhidas para análise citométrica de citometria de fluxo com os mAb e para preparação de ARN.

Em duas linhas estimuladas com 5E4, aproximadamente 70% das células coraram com 5E4. Nas duas linhas estimuladas com 8F10, aproximadamente 83% das células reagiram com 8F10. As linhas derivadas pela estimulação com um dos mAb reagiram igualmente com o outro mAb, sugerindo que os dois mAb reconhecem populações celulares quase idênticas embora não necessariamente o mesmo epítopo.

Para determinar se estas linhas celulares estimuladas por anticorpos expressavam genes da sub-famíiia V/8 distintos dos da V/X3.1, foi transcrito inversamente ARN das 4 linhas de LSP acima descritas utilizando um iniciador oligo dT e submeteu-se a análise por PCR com um iniciador de Οβ e o iniciador 3-2 (que pode detectar as sequências de V/33.1 e de uma Vy#3.2 publicada). Os produtos de PCR foram então clonados e sequenciados. Foi obtido um total de 6 sequências de colónias bacterianas individuais para cada grupo de células T 50 85 2bb

EP 0 662 148/EP estimuladas com mAb (4 de células estimuladas com 5E4 do dador 1, 2 de células estimuladas com 5E4 do dador 2, e 3 cada uma de células estimuladas com 8F10 de ambos os dadores). Todas as 12 sequências eram idênticas à sequência de V/33.1 do clone PL4.4, com uma excepção: uma sequência da linha estimulada com 5E4 do dador 1 continha uma alteração de um único nucleótido no par de bases #118 na sequência de PL4.4, T->C. Esta alteração do nucleótido podia representar simplesmente um artefacto da PCR ou podia resultar de uma diferença alélica em V/33.1. Uma vez que não se encontrou nenhuma sequência de V/33.2, é provável que a reactividade de 5E4 e 8F10 esteja restrita a células que expressem genes da sub-família V/33.1.

Foi efectuada a clonagem e a sequenciação dos produtos de PCR para se detectar qualquer restrição na utilização do segmento D ou J nas sequências de V/33.1 expressas pelas células estimuladas por mAb de cima. A análise por PCR foi efectuada tal como acima utilizando o iniciador da região V 3-2 (que hibrida cerca de 100 p.b. a montante da união V-D-J do clone PL4.4) e o iniciador de C/3 para gerar fragmentos curtos que podiam ser completamente sequenciados com relativa facilidade. Foram analisadas sequências de V/33 de LSP estimulados com 5E4 e 8F10 de apenas um dador. Catorze sequências de ADN independentes desta análise (8 da linha estimulada com 5E4 e 6 da linha estimulada com 8F10) são mostradas na Figura 4 que mostra também a junção V-D-J de PL4.4 (o ADNc que codifica a proteína V/33.1 utilizada como imunogénio para os novos mAb). Não houve diferenças perceptíveis na especificidade dos dois mAb (5E4 e 8F10) na medida em que sequências das linhas celulares derivadas utilizando qualquer um dos mAb exibiam um grau comparável de variabilidade na utilização da região J. É de notar que 9 (5 do tipo estimulado com 5E4 e 4 do tipo estimulado com 8F10) dos 14 clones de V/33.1 aqui representados utilizam o segmento do gene J/32.7. Também, 12/14 rearranjaram-se para o segmento do gene C/32. O gene J/32.7 foi frequentemente utilizado por ambos os LSP estimulados com 5E4 e 8F10. Apesar da aparente utilização preferencial de J/32.7 nas sequências de V/33.1 dos LSP estimulados com 5E4 e 8F10, outros segmentos do gene J foram também utilizados, embora com frequências muito mais baixas. Embora seja possível que o(s) epítopo(s) reconhecido(s) pelos dois mAb seja(m) formado(s) por regiões partilhadas de identidade ou homologia entre as várias sub-famílias J/3, a variedade de regiões J observada sugere que os mAb não são específicos para a região J. 51 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ É possível que rearranjos envolvendo o gene V/33.1 utilizem de preferência o yene J/32.7. Foi relatado que alguns segmentos de J são utilizados mais frequentemente embora não em associação com um determinado segmento do gene V.

Em conclusão, a análise por PCR dos LSP humanos estimulados com mAb mostrou que 5E4 e 8F10 eram específicos para as cadeias /?de TCR codificadas por V^3.1.

Os mAb 5E4 e 8F10 são portanto úteis para a confirmação destas observações e para posterior análise e modulação de células de \1β3 em condições normais e de doença.

Foram analisados LSP de 3 macacos cynomolgus quanto à reactividade com 5E4 e 8F10. Para delinear que população de células T era corada, fez-se também reagir as amostras com conjugados de ficoeritrina de uma mistura de mAb Leu-3a (anti-CD4) e Leu-2a (anti-CD8), ambos possuindo reactividade cruzada com LSP de macaco. A Figura 5 mostra resultados representativos obtidos a partir de macacos cynomolgous mostrando que 5E4 reagiu com 0,2 a 1,46% (média = 0,83%) das células T CD4+/CD8+ do sangue periférico. 8F10 reagiu com 0,6-1,40% (média = 1,07%) das células T do sangue periférico de macaco. Estes resultados indicam que os mAb do presente invento reagem de forma cruzada com células T do sangue periférico de macaco cynomolgous. 7. EXEMPLO: OS ANTICORPOS MONOCLONAIS QUE REAGEM COM AS REGIÕES VARIÁVEIS DO RECEPTOR DE ANTIGÉNIOS DE CÉLULAS T HUMANAS E £ SÃO ÚTEIS NO TRATAMENTO DE ARTRITE REUMATÓIDE O primeiro passo necessário no desenvolvimento de agentes terapêuticos específicos para receptores de células T é correlacionar a utilização específica do gene de receptores das células T com a doença. Uma vez conhecidos quais os receptores das células T (TCR) que estão principalmente envolvidos na doença, podem ser produzidos agentes terapêuticos específicos.

Foi utilizado um painel de genes da região variável do TCR para determinar quais as regiões variáveis que se correlacionavam com a artrite reumatóide. Os dados apresentados infra envolvem a análise de amostras de doentes com artrite 52 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ reumatóide utilizando sondas para os genes Va e V/? de TCR. Uma análise semelhante pode também ser efectuada utilizando também os genes V/e V&

7.1. MATERIAIS E MÉTODOS AMOSTRAS: Foram preparadas em paralelo linhas de células T derivadas da membrana sinovial e de células T derivadas do sangue periférico de 12 doentes com AR. Foram também obtidas linhas do sangue periférico de 5 indivíduos normais para controlos utilizando procedimentos de cultura celular. SONDAS PARA GENES DA REGIÃO VARIÁVEL DO RECEPTOR DAS CÉLULAS T: Foram identificadas até à data 17 sub-famílias Va humanas e 24 V/? humanas (Robinson, M.A., 1991, J. Immunol. 146: 4392-4397). Estas sub-famílias V/? são designadas V/?1 a V024. À medida que regiões variáveis adicionais se tornam disponíveis, estas podem ser testadas de forma semelhante. Uma vez identificadas as correlações entre a doença e as sub-famílias específicas de V de TCR, o membro específico da sub-família responsável pela correlação pode também ser identificado. PREPARAÇÕES DE ARN: O ARN foi isolado através do procedimento de isotiocianato de guanidínio-cloreto de césio (Maniatis, T„ et al., 1982, em “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratories, NY). O ARN total foi precipitado duas vezes em acetato de sódio 0,3 M e 2,5 volumes de etanol. Em média, eram obtidos 5 a 10 pg de ARN total a partir de 10 milhões de células T cultivadas. ANÁLISE DA UTILIZAÇÃO DO RECEPTOR DE ANTIGÉNIOS DAS CÉLULAS T: A utilização das cadeias α e β do receptor de antigénios das células T nas linhas de células T foi determinada utilizando 3 passos principais: I) síntese de ADNc; ii) amplificação por reacção em cadeia com polimerase; e iii) análise de “slot blot” do ADN.

SlNTESE DE ADNc: Cinco μο de ARN total de cada amostra foram iniciados para síntese de ADNc utilizando oligonucleótidos de Ca e Cy?. Para analisar a utilização dos genes γβ δ de TCR, podiam ser utilizados iniciadores de Cye Câde um modo análogo. Ambos os iniciadores de Ca e C/7 foram sintetizados com 18-meros por New England Biolabs, Beverly, MA utilizando as sequências 53 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ publicadas das regiões constantes de a e de β (Yanagi, Y., et ai, 1984, Nature 308, 145-149). A sequência do iniciador de Ca (5’-TTAGAGTCTCTCAGCTGG-3’) localiza-se 31 nucleótldos a 3' do terminal NN2 da região constante da cadeia α. A sequência para o iniciador de C0 (5’-TTCTGATGGCTCAAACAC-3’) localiza-se 36 nucleótidos a 3’ do terminal NH2 da região constante da cadeia β. O oligonucleótido de C/? iniciou a síntese do ADNc de ambas as regiões constantes da cadeia β (Yanagi, Y., et al., 1984, Nature, 308: 145-149; Jones, N., et ai, 1984. Nature, 227: 311-314). A localização destes iniciadores foi escolhida de forma a que o ADNc sintetizado compreendesse as regiões variável, de diversidade e de união do ARNm do receptor das células T e apenas uma pequena porção da região constante. A síntese da primeira cadeia de ADN foi efectuada de acordo com procedimentos publicados (Okayama, H„ e Berg, P., 1982, Mol. Cell Biol., 2: 161-170; Gubler, U. e Hoffman, B.J., 1983; Gene, 25: 263-269) excepto que a reacção foi terminada antes da síntese da segunda cadeia. Os moldes resultantes estavam na forma de híbridos de ARN:ADN. Estas dúplices foram então utilizadas numa reacção de terminação com caudas oligo-dG (Deng, G-R. e Wu, R., 1983, Meth. in Enzymoi, 100: 96-117) a qual coloca caudas na extremidade 3’ da cadeia de ADNc de preferência à cadeia de ARN.

AMPLIFICAÇÃO POR REACÇÃO EM CADEIA COM POLIMERASE (PCR): A reacção PCR foi efectuada num aparelho de ciclos térmicos (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) utilizando a AND-polimerase Taq (Cetus Corp., Emerville, CA). Os oligonucleótidos, d(C)10 e Ca e Οβ, foram utilizados como iniciadores para a amplificação. O procedimento de amplificação por PCR de Loh, E.Y., et ai, (1989, Nature, 243: 217-243) foi utilizado com as seguintes modificações. A amplificação por PCR foi efectuada durante 30 ciclos compreendendo cada ciclo incubações a 92°C durante 1 minuto, 50°C durante 1,5 minutos e 72°C durante 2,5 minutos. A última reacção de prolongamento foi de 10 minutos a 72°C. Todas as amostras foram amplificadas num total de 3 vezes com isolamento do fragmento de ADN amplificado de cerca de 300-400 pares de bases entre cada ciclo. As amostras finais de ADN amplificado foram então precipitadas com espermina para remover os nucleótidos livres, antes da marcação com nucleótidos marcados radioactivamente com 32P. A marcação foi feita durante 5 ciclos de amplificação por PCR utilizando todos os quatro nucleótidos marcados com 32P numa razão de 1:10 nucleótidos não marcados radioactivamente. Os ADN marcados com 32P 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 54

Jf**' resultantes foram purificados em colunas elute-tip™ (Scleicher & Schuell, Keene, NH) para remover os nucleótidos 32P não incorporados. ANÁLISE DE TRANSFERÊNCIA “SLOT BLOT’ DO ADN: Os “slot blot’ de ADN foram preparados utilizando um aparelho de “slot blof (Scleicher & Schuell, Keene, NH) e membranas de nylon (Oncor, Gaithersburg, MD) de acordo com os protocolos dos fabricantes. Um painel de subclones de ADNc compreendendo a região variável dos genes das cadeias a e β de TCR foi aplicado por pontos, em duplicado, em cada “slot blot’ (3 pg por fenda). Após as transferências terem sido preparadas contendo o painel de ADN da região V de TCR, cada uma foi então hibridada com o ADNc derivado das células T marcado com 32P gerado no passo #2. As amostras de cada indivíduo foram hibridadas com as transferências em duplicado. As condições de hibridação e as lavagens (Southern, E., 1979, J. Mol. Biol., 98: 503-517) foram escolhidas para assegurar que não ocorria hibridação cruzada entre membros de diferentes sub-famílias. Os passos de lavagem foram efectuados a 42°C em SSC 0,2x (cloreto de sódio 30 mM, citrato de sódio 3 mM, pH 7,4) com dodecilsulfato de sódio a 0,1% utilizando 4 lavagens de 20 minutos cada. Após a lavagem, as transferências foram secas e depois autorradiografadas a -70°C durante 2-6 dias utilizando película para raios-x Eastman Kodak, X-Omat (Rochester, NY). As autorradiografias reveladas foram então pesquisadas quanto à intensidade utilizando um densitómetro de vídeo (Modelo 620, Biorad Corp., Richmond, CA).

7.2. RESULTADOS

Mesmo num estado normal sem doença, a expressão de TCR varia para as diferentes sub-famílias. Algumas sub-famílias, p.ex., V/8, V/fô e Va10, são expressas muito frequentemente e a expressão de outras é quase rara. Para a correlação com a doença, os níveis aumentados de expressão na doença são determinados relativamente a estes níveis basais.

Utilizando procedimentos de síntese de ADNc, amplificação por PCR e hibridação “slot blot’, as amostras dc AR em pares, incluindo linhas de células T derivadas de sangue periférico e de tecido sinovial, de cada um dos 12 doentes foram analisadas relativamente à expressão em 5 controlos de sangue periférico normal. Uma suposição básica nesta análise é a de que as células T relacionadas com a doença são mais abundantes no local da doença, p.ex. na membrana sinovial de doentes com artrite reumatóide, que na periferia. 55 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ

Um exemplo desta análise é mostrado na Figura 6. O painel da esquerda da Figura 6 mostra a autorradiografia obtida quando a linha de células T ST-2 obtida de linfócitos que se infiltram no tecido sinovial foi analisada com o painel de genes de TCR Μβ. O lado direito desta figura mostra o traçado de densitometria. Nesta linha celular, é claro que vários genes de TCR Μβ (V/? 2, 4, 6, 7, 8, 11 e 18) são expressos, sendo o Vftt expresso em maiores quantidades. Para determinar quais destes é que se correlacionam com a doença, este padrão de expressão foi comparado com o padrão de expressão observado nas linhas de células T derivadas do sangue periférico (ver Figuras 7 e 8). A Figura 7 tabela os resultados observados para a expressão do gene Μβ em cada uma das linhas de células T em pares, derivadas de tecido sinovial e de sangue periférico, dos 12 doentes de AR analisados. O eixo dos YY representa o número de amostras de doentes (12 no total) onde foi observado um V/? pela análise de densitometria tal como ilustrado na Figura 6 para a linha celular ST-2. O eixo dos XX representa cada uma das 16 sondas para o gene Μβ testadas. Os dados do sangue periférico estão representados por uma barra traçada e os dados do tecido sinovial estão representados por uma barra a branco para cada Μβ. Desta figura, pode ser determinado que nas amostras dos 12 doentes de AR analisadas, V/53, Μβ&, Μβ10 e Μβ 12 eram expressos mais frequentemente nas linhas de células T derivadas de tecido sinovial que nas linhas de células T derivadas de sangue periférico. Por exemplo, verificou-se que a razão da presença na amostra de sinóvio para a presença na amostra de sangue periférico era de 1,4 para Μβ3. Através desta análise, os genes Μβ mais frequentemente expressos no sinóvio relativamente ao sangue periférico de doentes com artrite reumatóide eram Μβό,Μβ9, Vpi0 e V/?12.

Quando os mesmos dados foram analisados tal como se mostra na Figura 8, os genes frequentemente utilizados eram Μβ1 (razão = 4,0), V/33 (razão = infinita), Μβ6 (razão = 3,0), Μβ9 (razão = infinita) e Μβ10 (razão = infinita). Para a análise na Figura 8 apenas foi utilizado ο Μβ dominante em cada amostra tal como determinado pelo traçado de densitometria, supondo que embora a linha de células T possa conter subpopulações variáveis de células T, a subpopulação dominante seria a mais relevante. As frequências de Μβ3, Μβ9 e Μβ10 foram elevadas quando 56 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ os dados dos 12 doentes foram analisados quanto à expressão total ou expressão dominante.

7.3. SUMÁRIO

Esta análise mostrou que populações de células T no local da doença, p.ex. membrana sinovial das articulações, parecem expressar predominantemente cadeias V/? especificas. Um mecanismo de auto-imunidade pode ser um em que auto-antigénios relacionados com a doença sejam reconhecidos pelas células T do próprio corpo através das cadeias a, β, ye δύο receptor de antigénios das células T específicas. Após o reconhecimento do antigénio, estas células T expandem-se clonalmente para darem origem a uma população oligoclonal de células T relacionadas com a doença. Outros mecanismos que podem estar envolvidos incluem o recrutamento de células específicas para o local da doença que representariam então uma população oligoclonal de células. Na população total de células presentes no local da doença, as células oligoclonais podem ser detectadas, à medida que vão utilizando as regiões variáveis de TCR que são mais frequentemente expressas. Até à data, o nosso estudo mostrou que os genes V/? mais frequentemente expressos na membrana sinovial dos 12 doentes de AR eram VyS3, V/39 e V/?10. Para refinar ainda mais esta correlação, pode ser determinado o tipo de HLA dos doentes, o estado da doença e de expressão dos genes de TCR para as cadeias a, β, y e δ, e de expressão da região de diversidade-união de TCR. Espera-se que à medida que os doentes sejam subagrupados pelo tipo de HLA, as correlações da utilização do gene de TCR com a doença se tomem ainda mais fortes.

7.4 TRATAMENTO DE DOENTES COM ARTRITE REUMATÓIDE COM REGENTES ESPECÍFICOS PARA α E /7 DE TCR

Uma vez feita a correlação de uma doença entre o estado da doença e a expressão do gene de TCR específico, depois o próximo passo consiste em desenvolver agentes terapêuticos específicos para o TCR. Uma classe de tais agentes terapêuticos são os anticorpos anti-TCR.

Para a análise apresentada supra sobre a utilização preferencial dos genes V/53.1 em doentes com artrite reumatóide, prevê-se que um agente terapêutico específico possa envolver anticorpos anti-TCR específicos para V/33, em particular V/33.1. Noutra concretização, uma mistura de múltiplos anticorpos de anticorpos 57 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ para V/S, em particular V/S.1, e Vyô9 ou V/?10, ou ambos, pode ser utilizada num agente terapêutico. Tais agentes terapêuticos direccionar-se-iam apenas para subconjuntos de células T que expressassem estes TCR Ίβ e não afectariam outras células T que não os expressassem. Foram produzidos anticorpos específicos para V/8 tal como mostrado na Secção 6, supra.

8. DEPÓSITO DE H1BRIDOMAS

As seguintes linhas celulares de hibridoma, que produzem o anticorpo monoclonal indicado, foram depositadas na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Neuroorganismos para Efeitos do Processo de Concessão de Patente, e foram-lhes atribuídos os números de acesso listados: Hibridoma AnticorDO Monoclonal Número de Acesso 5E4.A6 5E4 HB 11020 8F10.B2 8F10 HB 11021

Lisboa,

V

'v-n L.C>J 1

PorASTRA AB O AGENTE OFICIAL O ADJUSTO

ENG.” ANTÓNIO JOÃO •A CUNHA FERRE1RA A9. Of. Pr. Ind. I«i d«s Fleres, 74-4,* ISSO LISBOA

Claims (39)

1. «5 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 1« REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, que é reactivo com um epítopo de uma região variável V/33.1 de uma molécula intacta do receptor de antigénios das células T humanas e que tem a capacidade de inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e a que foi atribuído o número de acesso HB 11020, ao seu epítopo, através de ligação ao epítopo.
2. 2. Anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, que é reactivo com um epítopo de uma região variável V/33.1 de uma molécula intacta do receptor de antigénios das células T humanas e que tem a capacidade de inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e a que foi atribuído o número de acesso HB 11021, ao seu epítopo, através de ligação ao epítopo.
3. 3. Anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a capacidade do anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, para inibir a ligação do anticorpo de referência ao seu epítopo é determinada utilizando um ensaio de ligação competitiva.
4. 4. Anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e a que foi atribuído o número de acesso HB 11020.
5. 5. Anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e a que foi atribuído o número de acesso HB 11021.
6. 6. Anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o qual é um anticorpo monoclonal humano.
7. 7. Fragmento Fv, fragmento Fab, fragmento Fab’ ou fragmento F(ab’)2 de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o qual é um anticorpo monoclonal quimérico. 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 2/5
9. 9. Anticorpo monoclonai de acordo com a reivindicação 8, o qual é um anticorpo humanizado.
10. 10. Anticorpo monoclonai de acordo com a reivindicação 8, o qual é uma quimera da região constante humana.
11. 11. Anticorpo monoclonai de acordo com a reivindicação 10, o qual compreende também partes de regiões variáveis de origem humana.
12. 12. Anticorpo monoclonai de acordo com a reivindicação 11, em que as regiões variáreis de origem humana compreendem as regiões conservadas ou estruturais do domínio de ligação ao antigénio.
13. 13. Anticorpo monoclonai de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 6 e 8 a 12, o qual é um isotipo possuindo uma propriedade ou função efectora específicas.
14. 14. Anticorpo monoclonai de acordo com a reivindicação 13, o qual é capaz de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos.
15. 15. Anticorpo monoclonai ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o qual é marcado de forma detectável.
16. 16. Anticorpo monoclonai ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, conjugado com uma molécula terapeuticamente útil.
17. 17. Anticorpo monoclonai ou fragmento de acordo com a reivindicação 16, em que a molécula terapeuticamente útil é um fármaco citotóxico ou proteína citotóxica.
18. 18. Anticorpo monoclonai ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em mistura com um anticorpo que reconhece um epítopo de uma região variável V/59 do receptor de antigénios das células T e/ou com um anticorpo que reconhece um epítopo de uma região variável V/710 do receptor de antigénios das células T. 8b 285 EP 0 662 148/EP 3/5
19. 19. Método de identificação e selecção de um anticorpo, ou de um fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende a detecção da capacidade de um anticorpo ou fragmento de anticorpo para inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e a que foi atribuído o número de acesso HB 11020, ao seu epítopo, através da ligação ao epítopo.
20. 20. Método de identificação e selecção de um anticorpo, ou de um fragmento deste, de acordo com a reivindicação 2, o qual compreende a detecção da capacidade de um anticorpo ou fragmento de anticorpo para inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e a que foi atribuído o número de acesso HB 11021, ao seu epítopo, através da ligação ao epítopo.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindicação 20, em que a capacidade do anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, para inibir a ligação do anticorpo de referência ao seu epítopo é determinada utilizando um ensaio de ligação competitiva.
22. 22. Linha celular de hibridoma que tem o número de acesso no ATCC HB 11020.
23. 23. Linha celular de hibridoma que tem o número de acesso no ATCC HB 11021.
24. 24. Método de diagnóstico da artrite reumatóide num indivíduo, compreendendo: (a) o contacto de uma amostra biológica de um indivíduo com um anticorpo monoclonal ou fragmento deste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15; (b) a detecção de uma quantidade de ligação imunoespecífica que tenha ocorrido; e (c) a comparação da quantidade de anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado a uma quantidade ligada numa amostra basal, em que um aumento na quantidade de anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado na amostra do indivíduo relativamente à amostra basal é indicativo de artrite reumatóide.

    85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 4/5
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 24, compreendendo ainda: (a) a detecção da expressão de V/59 e/ou V/J10 na amostra do indivíduo; e (b) a comparaç3o da quantidade de V/79 e/ou V//10 expressa com a quantidade expressa na amostra basal, em que um aumento na quantidade na amostra do indivíduo relativamente à amostra basal é indicativo de artrite reumatóide.
26. 26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou a reivindicação 25, em que a amostra é sangue, tecido sinovial ou fluido sinovial.
27. 27. Método in vitro para aumentar o número de células T que expressam uma região variável V//3.1 de um receptor de antigénios das células T, compreendendo a exposição das células T a uma quantidade de um anticorpo monoclonal ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, eficaz para estimular uma resposta mitogénica nas células T.
28. 28. Utilização de um anticorpo monoclonal ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 na preparação de uma composição para aumentar o número de células T que expressam uma região variável Vj33.1 de um receptor de antigénios das células T através da exposição das células T a uma quantidade da composição eficaz para estimular uma resposta mitogénica nas células T.
29. 29. Composição compreendendo um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 e 19 e um transportador farmaceuticamente aceitável,
30. 30. Composição de acordo com a reivindicação 29, a qual compreende também um anticorpo que reconhece um epítopo de uma região variável V/39 do receptor de antigénios das células T e/ou um anticorpo que reconhece um epítopo de uma região variável V//10 do receptor de antigénios das células T.
31. 31. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a14e16a18, para utilização em terapia.
32. 32. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 16 a 18, para utilização no tratamento de uma doença auto-imune. 85 285 ΕΡ Ο 662 148/ΕΡ 5/5
33. 33. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a14e16a18, para utilização no tratamento de artrite reumatóide.
34. 34. Utilização de um anticorpo monoclonal ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e 16 a 18, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença auto-imune.
35. 35. Utilização de acordo com a reivindicação 34, em que a doença auto-imune é artrite reumatóide.
36. 36. Anticorpo monoclonal ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 para utilização no diagnóstico de níveis elevados de células T que expressam a região variável V/X3.1 do receptor de antigénios das células T.
37. 37. Hibridoma que produz um anticorpo monoclonal tal como definido na reivindicação 1 ou na reivindicação 2.
38. 38. Processo para a produção de um anticorpo monoclonal que é reactivo com um epítopo de uma região variável V/Õ.1 de uma molécula intacta do receptor de antigénios das células T humanas e que tem a capacidade de inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) e a que foi atribuído o número de acesso HB 11020, ao seu epítopo, através da ligação ao epítopo, ou de inibir a ligação do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) com o número de acesso atribuído HB 11021 ao seu epítopo através da ligação ao epítopo, o qual compreende a cultura de um hibridoma que produza o referido anticorpo monoclonal.
39. 39. Processo de acordo com a reivindicação 38, em que o anticorpo monoclonal é tal como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 6 e 8 a 14, o qual compreende a cultura de um hibridoma que produza o referido anticorpo. Lisboa, Por ASTRA AB O AGENTE OFICIAL QAPJUNTO

    ANTÓNIO JOÀO CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74 - 4.* 1300 LISBOA