PT660712E - Activacao in vivo transdermal de agentes fotossensiveis no sangue - Google Patents

Activacao in vivo transdermal de agentes fotossensiveis no sangue Download PDF

Info

Publication number
PT660712E
PT660712E PT93918860T PT93918860T PT660712E PT 660712 E PT660712 E PT 660712E PT 93918860 T PT93918860 T PT 93918860T PT 93918860 T PT93918860 T PT 93918860T PT 660712 E PT660712 E PT 660712E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
light
cells
blood
dbp
patient
Prior art date
Application number
PT93918860T
Other languages
English (en)
Inventor
Anna M Richter
Original Assignee
Quadra Logic Tech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quadra Logic Tech Inc filed Critical Quadra Logic Tech Inc
Publication of PT660712E publication Critical patent/PT660712E/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Radiation-Therapy Devices (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

1 I
Descrição “Activação in vivo transdermal de agentes fotossensíveis no sangue’*
Campo da Invenção [0001] A presente invenção diz respeito genericamente ao campo da medicina e da farmacoterapia com agentes fotossensibilizadores. Dito de forma concreta, a invenção tem por objecto a utilização de determinados agentes sensibilizantes, para a preparação de medicamentos úteis num método de destruição ou de enfraquecimento das células destinatárias visadas, transportadas pelo sangue, que tenham incorporado um agente fotossensibilizador, mediante a aplicação de radiação por via transdermal para enfraquecer ou destruir de forma selectiva essas células destinatárias e de modo a que as células não visadas fiquem relativamente inalteradas.
Antecedentes da Invenção [0002] A terapia fotodinâmica implica a administração de um composto fotossensibilizador e a subsequente irradiação, com uma luz, do tecido onde o composto fotossensibilizador tenha sido selectivamente incorporado. O tecido em causa, contendo uma concentração suficientemente elevada do composto fotossensibilizador vai absorver de forma selectiva a luz que determina o enfraquecimento ou a destruição das células da vizinhança imediata. A patente de invenção norte-americana n° 5 095 030 descreve os procedimentos em que são administrados compostos fotossensibilizadores a animais que são depois irradiados com fontes de luz exteriores. Assim, o exemplo 5 dessa patente de invenção descreve a injecção subcutânea de células tumorais P815 em murganhos, as quais se desenvolvem originando um tumor palpável. A seguir são injectados compostos fotossensibilizadores e depois de os animais serem mantidos no escuro durante 3 horas, os seus tumores são expostos a uma luz forte. As taxas de sobrevivência dos animais tratados foram superiores à dos animais de contraprova não tratados.
De igual modo, o exemplo 8 dessa patente de invenção descreve a utilização de um sistema de rhabdomyosarcoma em murganhos, segundo um protocolo semelhante. Assim, estes exemplos têm por objecto o tratamento de tumores sólidos localizados, em que a luz aplicada extemamente é apontada ao tumor. Em tais circunstâncias, o tecido visado não está contido na corrente sanguínea, em que o tratamento tem de evitar os danos eventuais provocados aos vasos sanguíneas e às células sanguíneas não visadas.
[0003] A patente a invenção norte-americana n° 4 960 408 descreve o tratamento do conteúdo da corrente sanguínea (VIH e células T infectadas) por fotoforese. De acordo com esta técnica, o sangue do paciente é encaminhado através de um equipamento extracorpóreo onde a fracção leucocitária do sangue é exposta à luz ultravioleta, antes de os leucócitos regressarem ao paciente.
[0004] Foi já assinalado que os derivados de benzoporfirina (DBP), em combinação com luz vermelha (400-900 nm), são eficazes na eliminação de células sem vírus e de células infectadas com vírus, retiradas de amostras de produtos derivados do sangue e a partir de sangue integral retirado de gatos virémicos. Os eritrócitos comportaram-se de forma viável após o tratamento virucida. North et al., Blood Cells, 18: 129-40,1992.
[0005] Os DBP também demonstraram possuir para com os tecidos tumorais, incluindo as células leucémicas, uma afinidade mais elevada do que para as células não malignas normais. Jamieson et ai, Leukemia Res.. 14: 209-19, 1990.
[0006] A patente de invenção norte-americana n° 5 095 030, concedida a 10 de Março de 1992, descreve e reivindica diversos agentes citotóxicos, específicos de um determinado comprimento de onda, descritos genericamente como “porfirinas verdes”. Estes compostos são derivados de porfírina, modificados por meio de uma reacção de Diels Alder, de uma forma eficaz que desvia o comprimento da onda de absorção para um comprimento de onda mais longo. Daqui resultam determinadas propriedades favoráveis, comparativamente com as dos derivados de hematoporfirina, por exemplo, quando estes compostos são utilizados genericamente em terapia fotodinâmica. Conforme descrito nessa patente de invenção, estes agentes citotóxicos, quando administrados de forma sistémica, “encaminham-se” para as células indesejadas, em particular para as células tumorais ou para os vírus patogénicos, e a subsequente irradiação com luz que é absorvida por estes compostos faz com que estes se modifiquem de modo a desencadearem efeitos citotóxicos.
[0007] O documento EP 0569113 descreve a preparação de Iipossomas contendo fotossensibilizadores de porfirina.
Descrição Abreviada da Invenção [0008] A presente invenção diz respeito à utilização de determinados agentes fotossensibilizadores para a preparação de medicamentos úteis numa metodologia para destruir ou para enfraquecer células destinatárias visadas que tenham acumulado de forma selectiva um agente fotossensibilizador, em que essas células destinatárias se encontram na corrente sanguínea de um animal intacto. A corrente sanguínea e o animal também contem células não visadas. O método consiste em aplicar radiação, por via transdermal, pelo menos a uma parte do animal intacto, com uma intensidade eficaz para enfraquecer ou para destruir 7ii de forma selectiva as células visadas, deixando ficar as células não visadas relativamente inalteradas.
[0009] De acordo com outros dos seus aspectos, a presente invenção é aplicável a células destinatárias visadas que se multipliquem mais rapidamente do que as células não visadas. De acordo com outra variante, as células visadas podem ser células leucémicas, células que contenham vírus, células que contenham parasitas, bactérias, vírus livres ou outros agentes infecciosos contidos no sangue.
[0010] Embora possa ser utilizado qualquer agente fotossensibilizador neste método, de acordo com a invenção o agente é seleccionado entre clorinas (tais como a clorina e6), bacterioclorinas, ftalocianinas, porfirinas, purpurinas, merocianinas e o pró-fármaco ácido δ--aminolevulínico que pode produzir fármacos, tais como a protoporfirina, nos tecidos. Segundo outras variantes, os agentes fotossensibilizadores são DBP-MA (em inglês BPD-MA) e porfímero sódico.
Descrição Abreviada dos Desenhos [0011] A figura IA mostra o espectro da luz fornecida pela caixa de luminárias e a figura 1B mostra o espectro da luz que activa os DBP.
[0012] A figura 2 traduz a concentração dos DBP no plasma de murganhos em diversos momentos a seguir à injecção de DBP lipossómicos, à razão de 20 pg/murganho (0,9 mg/kg).
[0013] A figura 3 traduz as concentrações dos BDP no plasma de murganhos em diferentes momentos a seguir à injecção de DBP lipossómicos, à razão de 20 pg/murganho (0,9 mg/kg), no caso de murganhos expostos à luz e no caso dos murganhos de contraprova mantidos ao abrigo da luz.
[0014] 7& A figura 4 traduz a fotodegradação in viíro dos DBP (1 μg/ml) no sangue de murganhos expostos à luz durante períodos diversos.
[0015] A figura 5 é um gráfico que traduz a percentagem dos DBP fotodegradados no sangue de murganhos in vivo e in vitro por exposição à luz, em comparação com sangue não exposto.
[0016] A figura 6 é um gráfico que traduz a quantidade (pgfrnl) de DBP fotodegradados no sangue de murganhos expostos à luz vermelha (600-900 nm) in vitro e in vivo (irradiação total do corpo), em comparação com o sangue não exposto.
Descrição Abreviada da Invenção [0013] A presente invenção descreve a utilização de um agente fotossensibilizador seleccionado entre o conjunto constituído por uma clorina, uma bactenoclonna, uma ftalocinanina, uma porfirina, uma benzoporfirina, uma purpurina, uma merocianina e o pró-fármaco ácido δ--aminolevulínico (AAL) para a preparação de um medicamento para alterar ou destruir células destinatárias visadas na corrente sanguínea de um paciente, consistindo a referida alteração ou destruição transdermal no procedimento seguinte: (a) administrar ao referido paciente o medicamento numa quantidade suficiente para produzir uma concentração de agente fotossensibilizador, na corrente sanguínea do paciente, compreendida entre cerca de 0,01 pg/ml e 10 pg/ml; (b) esperar que decorra um período pós-injecção suficiente para permitir que o agente fotossensibilizador chegue às células visadas, mantendo simultaneamente a concentração do referido agente fotossensibilizador na corrente sanguínea; e (c) irradiar pelo menos uma parte do referido paciente com uma luz com um comprimento de onda absorvido pelo referido agente fotossensibilizador ou então, se o agente fotossensibi- lizador for um pró-fármaco, absorvida pelo produto que dele resulte, em que a referida irradiação tem lugar por via transdermal; e em que a concentração do agente fotossensibilizador na corrente sanguínea do paciente, o período decorrido pós-injecção, a intensidade da luz e a duração do referido passo de irradiação são tais que as células visadas na corrente sanguínea sejam alteradas ou destruídas de forma selectiva, ao mesmo tempo que é praticamente evitada a fotossensibilização da pele.
[0018] Os medicamentos da invenção podem ser utilizados num método para destruir ou alterar células destinatárias transportadas pelo sangue, que tenham acumulado de forma selectiva uma gente fotossensibilizador, deixando ficar relativamente inalteradas as células não visadas. O método consiste em aplicar radiação por via transdermal pelo menos a uma parte de um animal intacto, com uma intensidade eficaz para alterar ou destruir de forma selectiva as células visadas.
[0019] A expressão aqui utilizada “células visadas” designa as células que se pretende alterar ou destruir por meio deste método de tratamento. As células visadas incorporam o agente fotossensibilizador e depois, após a aplicação de uma quantidade suficiente de radiação, essas células visadas são alteradas ou destruídas. As células visadas podem ser todas as células existentes no sangue. Entre as células visadas refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as células leucémicas, as células que contêm vírus e as células que contêm parasitas. Entre as células visadas também estão as células que experimentam uma divisão rápida, comparativamente com as células não visadas. A expressão “células visadas” também designa, mas sem que isso constitua qualquer limitação, microrganismos tais como bactérias, vírus, parasitas e outros agentes infecciosos. Assim sendo, a expressão “células visadas” não serve só para designar células vivas mas também partículas infecciosas tais como vírus.
[0020] A expressão “células não visadas” designa todas as células de um animal intacto, que não se pretenda alterar ou destruir pelo método de tratamento. Entre as células não visadas, mas sem que isso constitua qualquer limitação, estão as células saudáveis do sangue, as células normais que constituem os vasos sanguíneos sujeitos à radiação e as células dos tecidos subjacentes ou sobrejacentes dos vasos sanguíneos sujeitos à radiação.
[0021] O termo “destruir” aqui utilizado significa a aniquilação das células visadas pretendidas. O termo “alterar” significa modificar as células visadas, de tal modo que haja interferência com a sua actividade. Por exemplo, North et al., verificaram que após uma exposição à luz, de células T infectadas com vírus e tratadas com DBP, surgiam orifícios na' membrana das células T cujo tamanho aumentava até ao ponto de a membrana se decompor totalmente (Blood Cells 18:129-40,1992). Subentende-se que as células visadas são alteradas ou destruídas, mesmo nos casos em que essas células visadas são eliminadas, em última instância, pelos macrofagos.
[0022] O “agente fotossensibilizador” é um composto químico que se encaminha para um ou vários tipos de células visadas seleccionadas e nelas se aloja e que ao ser contactado pela radiação absorve a luz, dai resultando uma alteração ou a destruição das células visadas. No método para destruir ou alterar células visadas transportadas pelo sangue é possível utilizar virtualmente todos os compostos químicos que se encaminhem para uma célula visada seleccionada e nela se aloje e absorva a luz. De preferência, o composto químico em causa é não tóxico para o animal ao qual irá ser administrado ou pode ser formulado numa composição não tóxica. De preferência , a forma fotodegradada desse composto químico também é não tóxica. É possível encontrar uma listagem exaustiva de compostos químicos fotossensíveis na obra de Kreimer-Bimbaum, Sem. Hematol. 26: 157-73, 19689. De acordo com a invenção, 7ί£ os compostos fotossensíveis são seleccionados entre clorinas, bacterioclorinas, ftalocianinas, porfirinas, purpurinas, merocianinas e o pró-fármaco ácido δ-aminolevulínico, que pode produzir fármacos tais como a protoporfirina. São preferíveis os derivados e benzoporfirina (DBP) e o porfimero sódico. A preferência máxima vai para o derivado de benzoporfirina designado por anel A monoácido (DBP-MA).
[0023] O termo “radiação” aqui utilizado compreende todos os comprimentos de onda.
De preferência, o comprimento de onda da radiação é escolhido de modo a aproximar-se dos comprimentos de onda que excitam o composto fotossensível. Ainda mais preferencialmente, o comprimento de onda da radiação é bastante próximo do comprimentos de onda de excitação do composto fotossensível e a sua absorção pelas células não visadas e pela parte restante do animal intacto é exígua, incluindo as proteínas do sangue. Por exemplo, o comprimento de onda preferido para os DBP-MA está compreendido no intervalo entre 600-900 nm.
[0024] Na presente invenção, a radiação também é definida pela sua intensidade, duração e calendário de aplicação em relação ao doseamento com o agente fotossensível. A intensidade tem de ser suficiente para que a radiação penetre na pele e chegue às células visadas transportadas pelo sangue. A duração tem de ser suficiente para fotoactivar convenientemente o agente fotossensível para que este actue nas células visadas. A intensidade e a duração têm de ser limitadas para se evitar o tratamento excessivo do animal. O calendário de aplicação, em relação ao doseamento com o agente fotossensível, é importante uma vez que 1) o agente fotossensível administrado necessita que decorra um determinado período para chegar às células visadas e nelas se alojar e 2) o nível sanguíneo de muitos agentes fotossensíveis diminui rapidamente com o tempo.
[0025] Os medicamentos da invenção podem ser utilizados num método para tratar um animal que pode ser, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um ser humano ou qualquer outro mamífero. O termo “mamífero” designa também animais de explorações pecuárias, tais como bovinos, suínos e caprinos, e também os animais de estimação ou de desporto, tais como cavalos, cães e gatos.
[0026] A expressão “animal intacto” é utilizada para significar que todo o animal, indiviso, está disponível para ficar exposto à radiação. Não há nenhuma parte do animal que seja removida para uma radiação separada, ao contrário da fotoforese, em que o sangue do animal é obrigado a circular por fora do seu corpo para ser exposto à radiação. Não é necessário expor todo o animal à radiação. Há apenas uma parte do animal intacto que tem de ser ou que necessita de ser exposta à radiação. Dito de uma forma prática, a radiação de áreas com vasos sanguíneos p; óximos da superfície pode ser preferível para uma radiação selectiva.
[0027] O termo “transcutâneo ou transdermal” é aqui utilizado para designar uma aplicação através da pele de um animal.
[0028] Dito de forma abreviada, administra-se o agente fotossensibilizador geralmente ao animal antes deste ser submetido à radiação.
[0029] De acordo com a invenção, o agente fotossensibilizador é seleccionado entre clorinas, porfirinas, purpurinas, merocianinas e o pró-fármaco ácido δ-aminolevulínico, o qual pode produzir fármacos tais como a protoporfirina. São mais preferíveis os derivados de benzoporfirina (DBP) e o porfímero sódico. A maior preferência é atribuída ao derivado de benzoporfirina designado por anel A monoácido (DBP-MA).
[0030] O agente fotossensibilizador é administrado localmente ou de forma sistémica. O agente fotossensibilizador é administrado por via oral ou por injecção, a qual pode ser intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal. O agente fotossensibilizador também pode ser administrado por via entérica ou por via tópica, por meio de emplastros ou implantes.
7iS
[0031] Ο agente fotossensibilizador pode ser sintetizado sob a forma de um dímero, para absorver mais luz em termos de uma base molar. O agente fotossensibilizador também pode ser conjugado com ligandos específicos reactivos com o alvo, tais como os ligandos específicos dos receptores ou as imunoglobulinas ou as partes imunoespecíficas de imuno-globulinas, permitindo fazer com que fiquem mais concentradas em células visadas ou em microrganismos desejados. Esta conjugação pode permitir eventualmente fazer baixar o nível de doseamento necessário, uma vez que o material é encaminhado de forma mais selectiva e irá haver menos desperdícios na distribuição pelo interior de outros tecidos cuja destruição deva ser evitada.
[0032] O agente fotossensibilizador pode ser administrado como formulação anidra, por exemplo, sob a forma de pílulas, cápsulas, supositórios ou emplastros. O agente fotossensibilizador também pode ser administrado numa formulação líquida, por si só ou com água, ou com excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, tais como os que vêm descritos na publicação Remington’s Pharmaceutical Sciences. A formulação líquida pode ser uma suspensão ou uma emulsão. Em particular, as formulações lipossómicas ou lipofílicas são mais desejáveis. No caso de serem utilizadas suspensões ou emulsões, os excipientes adequados são seleccionados entre água, solutos salmos, dextrose, ghcerol e não só. Estas composições podem conter quantidades insignificantes de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes humectantes ou emulsionantes, antioxidantes, agentes de tamponamento do pH e outros que tais.
[0033] A dose de agente fotossensibilizador irá variar com as células visadas relevantes, o nível sanguíneo óptimo (ver o exemplo 2), o peso do animal e o calendário de aplicação da radiação. Consoante o agente fotossensibilizador, assim se definirá o nível terapêutico óptimo.
De preferência, calcula-se a dose de modo a obter-se um nível sanguíneo compreendido aproximadamente entre 0,01 pg/mL e 100 μg/mL. De preferência, a dose administrada irá gerar um nível sanguíneo compreendido entre cerca de 0,01 pg/mL e 10 pg/mL. Se o agente fotossensibilizador for o DBP-MA, o nível sanguíneo irá ficar compreendido preferencialmente entre cerca de 0,01 pg/mL e 4 pg/mL. Mais preferencialmente, atinge-se um nível sanguíneo de DBP-MA compreendido entre cerca de 0,1 pg/mL e 2 pg/mL.
[0034] A intensidade da radiação no interior da corrente sanguínea está compreendida preferencialmente entre cerca de 2 mW/cm2 e 150 mW/cm2. Mais preferencialmente, a intensidade da radiação no interior da corrente sanguínea está compreendida entre cerca de 10 mW/cm2 è 100 mW/cm2 Muito mais preferencialmente, a intensidade da radiação no interior da corrente sanguínea irá estar compreendida entre cerca de 15 mW/cm e 70 mW/cm .
[0035] A duração da exposição à radiação irá estar compreendida preferencialmente entre cerca de 0,25 minuto e 24 horas. Mais preferencialmente, a duração da exposição à radiação irá estar compreendida entre cerca de 0,25 minuto e 6 horas. Muito mais preferencialmente, a duração da exposição à radiação irá estar compreendida entre cerca de 0,25 minuto e 2 horas.
[0036] Sem pretender estabelecer nenhuma dependência em ralação a qualquer teoria, o inventor sugere que o DBP pode ser bastante fotoactivado no sangue ao fim de um intervalo de tempo relativamente curto e sem excesso de toxicidade. Assim, presume-se que haja uma janela terapêutica delimitada pela dose de DBP e pela dose de radiação. Utilizou-se a formação de produtos de degradação dos DBP como um indicador de fotoactivação. Foi postulado que a fotoactivação dos DBP determinava a formação de oxigénio atómico, o qual tem um efeito citotóxico. Face aos problemas relacionados quer com o tratamento extracorporal do sangue quer com a activação intravenosa por acção de luz conduzida por meio de fibras ópticas, a irradiação do corpo todo que tem lugar num “leito de luz vermelha” de pacientes injectados com os DBP, parece ser uma solução aíractiva para o tratamento de agentes infecciosos no sangue.
[0037] Os exemplos seguintes têm por finalidade demonstrar a eficácia da invenção e auxiliar na prática da presente invenção. Os exemplos seguintes são praticados com um agente fotossensibilizador e proporcionam um sistema para pesquisar outros agentes fotossensibilizadores ou novos compostos utilizáveis no método da invenção. Os exemplos seguintes pretendem ser apenas exemplos, sem limitarem a invenção de forma alguma.
Comentários gerais [0038] Os comentários gerais seguintes sobre materiais e procedimentos aplicam-se aos exemplos 1 a 4, salvo quando especificado de outro modo.
Materiais [0039] Sintetizou-se DBP-MA conforme descrito nas patentes de invenção norte--americanas n- 4 920 143 e 4 883 790, aqui incorporadas por referência. Obteve-se os DBP-MA na instituição ‘QuadraLogic Technologies, Inc.’, tendo sido guardados depois de dissolvidos em DMSO (4,5 mg/mL) a -70°C. Preparou-se os DBP lipossómicos (4,95 mg/mL) conforme descrito no documento EP 0569113. Utilizou-se a formulação seguinte:
Ingrediente Quantidade (mg/mL) DBP-MA 4,95 Dimiristoíl-fosfatidil-colina 23,27 Fosfatidil-glicerol do ovo 16,09 Lactose ou trealose 148,50 Palmitato de ascorbilo 0,05 Hidroxi-tolueno butilado 0,005 Agua para injecções QS. 7&
Os DBP lipossómicos foram secos e guardados depois de congelados a -20°C em aliquotas de 1 mL. Imediatamente antes da sua utilização, efectuou-se o descongelamento do número conveniente de aliquotas que foram diluídas com dextrose a 5% em água para injecções administráveis aos animais.
[0040] Foram utilizados murganhos machos da estirpe Balb/c (7-11 semanas de idade; Charles River, Canadá) nestes estudos, salvo quando especificado de outro modo. Os murganhos da estirpe Balb/c foram os seleccionados para os estudos devido ao facto de não terem a pele pigmentada. Por um processo de rapar e de depilar efectuou-se uma remoção muito eficiente do pêlo de todo o corpo, com excepção da cabeça. Surgiu então a pele dos murganhos bastante transparente. Os órgãos internos, especialmente os órgãos de cor vermelho escuro, tais como o fígado e o baço, ficaram visíveis através da pele. Os murganhos foram rapados e depilados com um dispositivo depilador comercialmente disponível (Neet® ou Nair®) 5 dias antes de terem sido utilizados nas experiências. Os murganhos de contraprova, injectados com os DBP, mas não expostos à luz, não foram rapados. A seguir as injecções manteve-se os murganhos ao abrigo da luz durante diversos intervalos de tempo, conforme adiante se descreve. Antes e depois das experiências os murganhos foram mantidos numa instalação para animais com 12 horas de luz e 12 horas sem luz diariamente. A seguir às experiências, com o intuito de se reduzir a quantidade de luz incidente sobre os murganhos, as suas gaiolas foram colocadas na prateleira mais baixa, com uma folha de alumínio colocada sobre todas elas.
[0041] A caixa de luminárias foi construída à medida na oficina da universidade de ‘British Columbia’. Era constituída por dois conjuntos de 14 lâmpadas reflectoras de tungsténio--halogénio de 75 W (General Electric) que iluminavam a zona de tratamento a partir da parte de cima e a partir do fundo. A luz foi filtrada por 1) um conjunto de filtros constituídos por películas de plástico amarelas e vermelhas que absorviam a maior parte da luz com comprimentos de onda inferiores a 600 nm e 2) filtros de água com a espessura de 15 mm que absorviam a luz com comprimentos de onda superiores a 900 nm. O arrefecimento foi conseguido por meio de um fluxo estacionário de água fria nos filtros de água e por meio de um conjunto de 5 ventoinhas. A intensidade da luz foi medida por meio de um fotómetro de modelo IL 1350 (Intemational Light).
[0042] O espectro de luz fornecido pela caixa de luminárias está ilustrado na figura 1 A. Para efeitos de comparação, temos na figura 1B o espectro de absorção dos DBP. Grosso modo, um terço da luz fornecida estava dentro do domínio espectral de activação dos DBP.
[0043] A intensidade da luz fornecida pelos conjuntos de lâmpadas da parte superior e da parte inferior não era uniforme. O conjunto da parte de baixo forneceu 33-40 mW/cm2, conforme medido ao nível do chão do compartimento de exposição, ao passo que o conjunto da parte de cima forneceu 27-33 mW/cm2, conforme medido à superfície da pele do dorso dos animais. Estes intervalos apurados resultaram da influência inconsistente no plano horizontal de irradiação. Além disso, os murganhos movimentaram-se durante a exposição à luz, pelo que em momentos diferentes houve partes das respectivas peles que receberam quantidades diferentes de luz. Por tal motivo, as doses fornecidas à superfície da pele dos murganhos têm de ser aproximadas e têm de ser efectuados cálculos com base numa intensidade de 30 mW/cm2.
Procedimentos [0044] Testes de sangue: retirou-se sangue por meio de seringas que continham 50 pL de heparina (1000 unidades/mL de soluto salino). Foram enviadas amostras de sangue (0,45 mL), pelo menos de um murganho para cada momento de medida, para o ‘Diagnostic Laboratoiy’ 75d do hospital universitário da Universidade de ‘British Columbia’, para efeitos de análise com um contador de Coulter. Determinou-se a morfologia do sangue utilizando películas de sangue preparadas a partir de amostras seleccionadas por um técnico de laboratório.
[0045] Determinação da concentração dos DBP no plasma: as amostras de plasma foram obtidas por centrifugação de sangue retirado de murganhos e guardado depois de congelado a -20°C, até ao momento das determinações. Determinou-se a concentração dos DBP nas amostras por fhiorometria, utilizando para tal um espectrofluorómetro de modelo FP-770 da ‘Jasco’ (Japan Spectroscopic Co.) e um cadinho (Far UV Quartz Cell, Stama Cells Inc.). Os comprimentos de onda de excitação e de emissão foram respectivamente de 439 nm e 699 nm. As amostras de plasma foram diluídas 20 vezes com STP contendo Triton® X-100 a 1%, imediatamente antes de se ter determinado a fluorescência. Os padrões dos DBP foram preparados em plasma de murganho a 5% em STP contendo Triton® X-100 a 1%. Nestas condições, a relação entre a concentração dos DBP e o número de unidades de fluorescência foi linear (coeficiente de correlação > 0,99) para concentrações compreendidas entre 0,1 ng/mL e 1 pg/mL. O limite de detecção ficou abaixo de 0,1 ng/mL de amostra, o que correspondeu a 2 ng/mL de plasma. A autofluorescência máxima do plasma foi observada a 520 nm. O máximo de fluorescência a 699 nm, dos DBP, estava virtualmente isento de qualquer interferência.
Exemplo 1
Teste de fotossensibilidade da pele [0046] Efectuou-se a preparação de 6 murganhos da estirpe Balb/c (com o peso de 22 g ± 1 g) conforme descrito antes. Houve 5 murganhos que foram injectados 2 vezes (com um intervalo de 24 horas) com os DBP a partir de uma reserva de DMSO (DBP não lipossómicos) 7^ e que foram expostos à luz 1 hora depois das injecções. Um dos murganhos não foi injectado, mas foi exposto à luz (contraprova apenas de luz). Durante o primeiro tratamento, os murganhos foram injectados à razão de 15 pg de DBP/mmganho, em 200 pL de STP (em inglês PBS). Durante o segundo tratamento, os murganhos foram injectados à razão de 20 pg de DBP/murganho (0,9 mg/kg). Utilizou-se um único murganho como contraprova para os dois tratamentos.
[0047] hnediatamente a seguir às injecções (nas duas ocasiões) manteve-se os animais durante 1 hora no escuro, tendo sido colocados depois em recipientes individuais de plástico (9x4x5 cm), que foram por sua vez colocados na caixa de luminárias e expostos à luz. Retirou-se cada um dos murganhos da caixa de luminárias com intervalos diferentes: respecti-vamente 15, 30, 45, 60 e 75 minutos. As doses de luz fornecidas à superfície da pele foram respectivamente de 27, 54, 81, 108 e 135 J/cm . Na segunda ocasião foram utilizadas as mesmas doses de luz. No entanto, os murganhos que tinham recebido as doses de luz mais elevadas no primeiro dia receberam doses de luz menores no segundo dia. O murganho de contraprova foi exposto à luz durante 60 minutos nas duas ocasiões. Isto está resumido no quadro 1. Durante a exposição à luz, os murganhos foram permanentemente observados, à procura de sinais de desconforto ou prurido. Depois da segunda exposição à luz, os murganhos foram observados diariamente durante um período de 2 semanas para se estudar o aspecto da pele e o padrão geral de comportamento.
[0048] Decorridas 2 semanas após o tratamento, retirou-se de cada murganho amostras de sangue, por meio de uma punção cardíaca, sob anestesia com halotano. Foram então sacrificados e autopsiados 10 murganhos. Efectuou-se a pesagem dos respectivos baços, fígados e nns.
[0049] Os murganhos injectados com os DBP aceitaram muito bem todas as doses de luz administradas (27, 54, 81, 108 e 135 J/cm2) e o tratamento repetido. Em ambos os dias de tratamento, o seu comportamento foi normal sob a acção da luz, sem nenhuns sinais de desconforto, com a excepção de coçadelas ocasionais que poderiam ter sido provocadas pela activação do fármaco na pele. Não foram observadas alterações importantes na pele dos murganhos, quer imediatamente após a exposição quer durante o período subsequente de duas semanas. Também não foram observadas nenhumas alterações comportamentais. Surpreendentemente, o único murganho que revelou sinais de desconforto, sob a forma de alguma agitação e de algumas coçadelas, foi o murganho de contraprova à luz. Por tal motivo, este murganho foi mantido exposto à luz durante 60 minutos apenas (e não durante 75 minutos conforme planeado originalmente).
[0050] O número de murganhos era muito pequeno para permitir tirar conclusões definitivas relativamente ao efeito do tratamento sobre os órgãos internos tais como o fígado, o baço e os rins; no entanto, no grupo testado, que foi examinado duas semanas após o tratamento duplo, a morfologia geral e os pesos corporais eram normais. O peso total dos corpos e o correspondente peso dos órgãos estão agrupados no quadro 2.
[0051] O quadro 3 indica os parâmetros do sangue dos murganhos duas semanas após o tratamento, incluindo o número de leucócitos no sangue (NLS) e o número de eritrócitos no sangue (NES), a hemoglobina (HB), o hematócrito (Hct), o volume corpuscular médio (VCM) e o número de plaquetas (PLT). A morfologia dos hematócitos, determinada ao fim de duas semanas após o tratamento, está traduzida no quadro 4. Todos os valores estão dentro dos intervalos normais. A agregação das plaquetas pode ter contribuído eventualmente para a contagem de um número ligeiramente inferior de plaquetas e para uma contagem superior de NLS.
Quadro 1 1° Dia (15 |ig/murganho; 0,68 mg/kg) 2o Dia (20 ^murganho; 0,9 mg/kg) Murganho n° DBP, em mg/kg Luz, em J/cm2 DBP, em mg/kg Luz, em J/cm2 1 0,75 27 1,0 135 2 0,71 54 0,95 108 3 0,71 81 0,95 81 4 0,63 108 0,87 54 5 0,71 135 0,95 27 6 0 108 0 108
Quadro 2
Peso (g) Murganho Do corpo todo Fígado Baço Rins Fármaco + luz 22 1,105 0,077 0,172(1) 23 1,190 0,106 0,343 24 1,208 0,094 0,380 25 1,348 0,108 0,396 21 0,958 0,078 0,310 Só luz 22 1,125 0,05 0,371
Quadro 3
Murganho n° NLS 106/mL NES 109/mL HB g/L Hct VCM fl PLT 106/mL 1 4,0 7,11 122 0,352 49,5 328 2 14,7* 7,76 126 0,382 49,2 274 3 8,2 7,46 124 0,365 48,9 119 4 7,6 7,65 123 0,364 47,6 438 5** 2,9 6,47 108 0,316 48,8 134 5,3 5,97 109 0,297 49,8 388 o agregado plaquetário pode contribuir, eventualmente, para este número uma certa evidência de o sangue ter sido diluído com um volume duplo de heparina contraprova só para a luz
?iS
Quadro 4
NLS (%) Murganho n° Granulócitos Linfócitos Monócitos 1 9 90 1 2 11 88 1 3 19 78 3 4 36 62 2 5 7 92 1 Normal (intervalo) 12-15 65-85 N/A
Exemplo 2
Estudos de farmacocinética (TC) [0052] Para se determinar o nível dos DBP no plasma durante o tratamento com luz, realizou-se a experiência a seguir descrita. Injectou-se 14 murganhos da estirpe Balb/c (com o peso de 22 g ± 1 g) com DBP lipossómicos, à razão de 20 pg/murganho (0,9 mg/kg) em 200 pL de STP por murganho. As amostras de sangue foram obtidas por punção cardíaca em diversos momentos, a intervalos compreendidos entre 15 minutos e 2 horas após as injecções. A exposição à luz começou ao fim de 15 minutos após as injecções no caso de alguns murganhos. Determinou-se a concentração dos DBP no plasma, conforme descrito antes. Os resultados estão agrupados no quadro 5 e na figura 2.
[0053] Estes resultados foram utilizados para se testar o efeito do calendário de exposição à luz. Decorridas 2 horas após as injecções, isto é, no momento correspondente ao fim de 1 hora de exposição à luz (108 J/cm2), no primeiro exemplo, o nível dos DBP no plasma era de 2,44 pg/mL. No início da exposição à luz, no mesmo exemplo, o nível dos DBP no plasma era de cerca de 4 pg/mL. Para se avaliar melhor a fotossensibilidade da pele a estes níveis baixos, expôs-se os murganhos à luz num instante mais antecipado após a injecção, isto é, aos 15 minutos, quando o nível dos DBP no plasma era de 6,32 pg/mL. No entanto, os murganhos que começaram a ser expostos à luz aos 15 minutos sentiram-se quase imediatamente desconfortáveis e morreram ao fim de 30 minutos de exposição (54 J/cm ). Isto significa que um nível inicial dos DBP no plasma da ordem de 6,5 pg/mL e uma exposição à luz da ordem de 50 J/cm2, com a irradiação do corpo todo, foram letais para os murganhos. No entanto, conforme se demonstrou no exemplo 1, quando os níveis plásmicos eram inferiores, a mesma dose de luz é aparentemente inofensiva.
Quadro 5
Murganho n° Dose de DBP, em mg/kg Tempo após a injecção Cone. no plasma (pg/mL) 1 0,87 15 minutos 6,32 2 0,83 20 minutos 4,68 3 0,95 1 h e 23 minutos 3,26 4 0,91 1 h e 24 minutos 2,92 5 0,91 1 h e 32 minutos 2,98 6 0,87 1 h e 38 minutos 1,80 7 0,87 1 h e 42 minutos 3,22 8 0,83 2 h e 5 minutos 2,44
Exemplo 3
Activacão transdermal dos DBP
[0054] Neste estudo foram utilizados 14 murganhos (com o peso de 22 g ± 1 g). Em 12 murganhos injectou-se 20 pg (0,9 mg/kg) de DBP lipossómicos (em 200 pL), tendo os animais sido mantidos ao abrigo da luz durante 1 hora, antes da exposição à luz. Expôs-se cada um dos murganhos à luz durante 30 minutos, 1 hora ou 1,5 horas, o que permitiu
2 administrar doses de luz à superfície da pele respectivamente iguais a 54, 108 e 162 J/cm . Imediatamente após a exposição à luz foram retiradas amostras de sangue. Nos momentos correspondentes, foram retiradas amostras de sangue de 2 murganhos injectados com os DBP, mas não expostos à luz. Foram testados mais 2 murganhos 1 hora após as injecções.
[0055] O objectivo deste estudo foi o de se determinar a penetração da luz através dos tecidos para activar os DBP. Estipulou-se que a fotodegradação substancial dos DBP no sangue representava uma activação substancial dos DBP.
[0056] Determinou-se pela fluorescência a concentração dos DBP no plasma. Efectuou-se a comparação entre concentrações dos DBP não modificados no plasma de murganhos de contraprova expostos e não expostos. Os resultados (apresentados no quadro 6 e na figura 3) demonstraram que entre 36% e 76% dos DBP tinham sido fotodegradados por doses de luz entre 54 e 162 J/cm2. Esta quantidade de fotodegradação indicou que houve uma quantidade suficiente de luz que penetrou nos tecidos e que activou e consequentemente degradou os DBP nos vasos sanguíneos. Acima de tudo, estas exposições à luz e estas doses de fármaco não provocaram fotossensibilidade da pele, o que confirmou a segurança verificada no exemplo 1. Além disso, não foram observados nenhuns efeitos agudos sobre os parâmetros sanguíneos (quadro 7).
Quadro 6
Grupo Dose de luz Tempo após DBP no Média ± D.P. DBP fotodegradados J/cm2 ainjecção plasma pg/mL (%) Oh-C 0 lh 1,428 1,243 ±0,262 - 1,058 30 minutos - C 0 1,5 h 0,618 0,930 ±0,441 - 1,242 1 h-C 0 2h 0,646 0,944 ±0,421 - 1,242 1,5 h-C 0 2,5 h 0,724 0,690 ±0,048 - 0,656 30 minutos 54 1,5 h 0,566 0,596 ±0,042 36% 0,626 lh 108 2h 0,258 0,301 ±0,061 68% 0,344 1,5 h 162 2,5 h 0,191 0,168 ±0,033 76% 0,145
Quadro 7 DBP mg/kg Luz J/cm2 Tempo após ainjecção Parâmetros do sangue NLS 106/mL NES 109/mL HB Hct VCM fl PLT 106/mL 0 0 - 4,5 6,58 113 0,326 49,5 417 0 0 - 2,3 7,53 127 0,370 49,1 399 0 0 - 6,0 7,61 132 0,378 49,7 498 0 0 - ' 7,3 7,64 133 0,382 50,0 613 0,87 0 lh 5,5 7,61 124 0,368 48,4 608 0,87 0 1,5 h 4,4 6,77 117 0,329 48,7 428 0,93 0 2h 11,4 7,79 129 0,382 49,1 475 0,87 0 2,5 h 3,9 7,68 129 0,372 48,5 447 0,95 54 1,5 h 7,0 7,28 127 0,363 49,9 613 0,95 108 2 h 8,5 7,53 131 0,378 50,1 440 0,93 162 2,5 h 4,9 7,17 116 0,353 49,2 506 [0057] Os resultados obtidos neste exemplo foram comparados com os resultados de estudos anteriormente publicados (Photochem. Photobiol. (1991) 53: 281-286), depois de a dosimetria óptica ter sido recalculada utilizando o mesmo fotómetro que foi utilizado no presente estudo. Nos estudos anteriormente publicados, foram utilizados murganhos DBA/2 (rapados e depilados) que haviam sido injectados à razão de 4 mg/kg e que haviam sido expostos localmente a uma luz de espectro laigo e de 153 J/cm (intensidade igual a 170 mW/cm) às 3 horas após as injecções. Efectuando uma extrapolação a partir da figura 2, obter-se-ia uma concentração máxima no plasma, às 3 horas (o momento inicial de um período de 30 minutos de exposição à luz) igual a 2,987 ± 0,312 (D.P.) pg/mL. Como consequência, embora não tenham sido observadas alterações imediatas da pele após a exposição, ao fim de 24 horas após a exposição os murganhos desenvolveram necrose grave da pele, que progrediu durante 96 horas e a que se seguiu um período de cicatrização. Eventualmente as lesões cicatrizaram e o pêlo voltou a crescer.
[0058] No presente estudo, as concentrações dos DBP no plasma no início da exposição à luz eram superiores a 3 pg/mL e não foram observadas alterações da pele quer imediatamente quer durante as duas semanas após o período de exposição. As diferenças entre os estudos anterior e o actual são: (1) uma concentração plásmica máxima mais elevada devido à dose mais elevada dos DBP (4 mg/kg comparativamente com 0,9 mg/kg), (2) um período mais longo entre a injecção e a exposição à luz (3 horas comparativamente com 1 hora), o que permitiu uma acumulação maior de DBP na pele (os DBP acumulam-se aparentemente na pele por um período até 5 horas) e (3) uma intensidade de luz mais elevada (170 mW/cm2 comparativamente com 30 mW/cm2). Os dados sugerem que todos estes factores têm de ser considerados na definição de uma janela terapêutica para a irradiação de todo o corpo.
Exemplo 4
Activação dos DBP in vitro no sangue de murganho [0059] Para se avaliar a quantidade de luz que penetra nos tecidos foram realizadas experiências in vitro com o sangue dos murganhos. Utilizou-se a mesma fonte de luz, pelo que o espectro de luz era igual. As doses de luz nesta experiência foram escolhidas de modo a simular as doses das experiências in vivo.
[0060] Juntou-se DBP lipossómicos a sangue de murganho heparinizado, recentemente obtido, até se atingir uma concentração de 1 pg/mL, após o que foram aplicadas aliquotas de 0,85 pL de sangue em pratos de Petri com o diâmetro de 35 mm que foram por sua vez colocados depois na caixa de luminárias e expostos à luz vermelha. Os pratos foram irradiados na caixa de luminárias apenas pela parte de baixo. A intensidade da luz foi de 35 mW/cm2 Foram aplicadas três doses diferentes de luz, com períodos de exposição de 30 minutos, 1 hora e 1,5 horas a que corresponderam respectivamente as intensidades de 63, 126 e 189 J/cm2. Foram utilizados pratos em duplicado que foram mantidos tapados com folha de alumínio. Imediatamente a seguir à exposição à luz, retirou-se o sangue dos pratos. Depois separou-se o plasma por centrifugação. As amostras de contraprova não expostas foram estudadas em momentos correspondentes aos das amostras expostas à luz.
[0061] A concentração dos DBP no plasma separado a partir de sangue exposto à luz e a partir de sangue não exposto à luz foram determinadas por fluorescência. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 8 e na figura 4. Houve uma degradação de 51% a 83% dos DBP para os intervalos de doses de luz praticados.
[0062] Comparou-se a intensidade da fotodegradação dos DBP in vitro com a degradação in vivo para se avaliar a quantidade de luz que realmente penetra nos tecidos e que chega aos DBP nos vasos sanguíneos. Quando as quantidades dos DBP fotodegradados nas duas 7& experiências foram expressas em termos de percentagem da degradação em relação à quantidade dos DBP não modificados presentes no plasma na ausência de luz, as percentagens determinadas in vitro e in vivo foram relativamente semelhantes (quadro 9, figura 5). No entanto, quando as quantidades dos DBP degradados foram comparadas em termos de pg de DBP degradados por cada mL de plasma, tomou-se evidente que cerca de 65% da dose de luz aplicada à superfície da pele in vivo chegava realmente aos DBP nos vasos sanguíneos (quadro 9, figura 6).
Quadro 8
Tempo Dose de luz (J/cm2) Dose de DBP (pg/mL) % de DBP fotodegradados Oh 0 0,760 - 0,5 h 0 0,806 - 0,5 h 63 0,394 51% lh 0 0,810 - lh 126 0,220 73% 1,5 h 0 0,830 - 1,5 h 189 0,144 83%
Quadro 9 IN VITRO IN VIVO Luz (J/cm2) %Fotodegradada Dose (pg/mL) Luz (J/cm2) % Fotodegradada Dose (pg/mL) 63 51 0,412 54 36 0,334 126 73 0,590 108 68 0,643 (?) 189 83 0,686 162 76 0,522 [0063] Para se determinar o nível dos DBP no plasma durante o tratamento com luz, foi realizada a experiência a seguir descrita.
[0064] Os resultados dos exemplos anteriores indicam que há uma janela terapêutica para a activação dos DBP no sangue por meio de irradiação do corpo todo. Depois de os 7Χ murganhos terem sido expostos à luz vermelha (600-900 nm) durante 1 hora após a injecção dos DBP à razão de 0,9 mg/kg, num intervalo de doses de luz entre 27 e 135 J/cm2 (a intensidade da luz ao nível da pele foi de cerca de 30 mW/cm2), os murganhos não apresentaram nenhuns sinais de fotossensibilização da pele durante 2 semanas após o tratamento. Além disso, não foi detectada nenhuma toxicidade durante um exame rudimentar do fígado, do baço e dos rins, nem a partir de modificações dos parâmetros do sangue determinados duas semanas após o tratamento. Os níveis plásmicos aproximados durante a exposição à luz ficaram compreendidos entre 2,5 μg/mL e 4 μg/mL.
[0065] A mais elevada concentração dos DBP no plasma (6,3 pg/mL imediatamente após a administração) conjuntamente com uma dose de luz de 54 J/cm2 foram letais para os murganhos. A exposição à luz in vivo teve como resultado uma fotodegradação de 36%-76% dos DBP no sangue. A comparação com a fotodegradação dos DBP in vivo no sangue do murganho indicou que aproximadamente 65% da dose fornecida à superfície da pele tinha penetrado nos tecidos do murganho para chegar aos DBP no interior dos vasos sanguíneos. A comparação destes resultados com os dados de estudos anteriormente publicados indicou que a fotossensibilidade da pele é determinada pela concentração máxima no plasma, pelo tempo de exposição à luz contado a partir do momento da injecção e pela intensidade da luz.
Exemplo 5 [0066] Foram utilizados murganhos machos plenamente desenvolvidos das estirpes DBA/2 e Balb/c que foram injectados por via intravenosa com células P815 e L1210, respectivamente, tendo sido previamente incubadas durante 1 hora com os DBP (lipossómicos) na concentração de 100 ng/mL. Imediatamente antes de se ter injectado os animais, acrescentou-se mais 2 μg de DBP às seringas que continham as células. Daqui resultou uma concentração de DBP igual a 1 jig/mL no plasma dos murganhos imediatamente após a injecção (presumindo-se que o volume total do sangue de um murganho é de cerca de 2 mL). Houve um grupo de murganhos (rapados e depilados) que foi exposto imediatamente à luz vermelha (600-900 nm) na caixa de luminárias durante 1,5 horas (162 J/cm2) e o outro grupo foi mantido ao abrigo da luz, como contraprova.
[006η Imediatamente após a exposição à luz foram obtidas amostras de sangue por punção cardíaca, sob anestesia com halotano. Determinou-se por fluorescência a concentração dos DBP no plasma dos murganhos expostos à luz e dos murganhos de contraprova. Determinou-se o número de células tumorais clonogénicas no sangue dos murganhos, criando em cultura amostras de sangue em meio de cultura enriquecido com 10% de soro de bovino, utilizando para tal um protocolo de ensaio de diluição limitante. Após o tratamento, efectuou-se a observação de diversos murganhos, quer do grupo de contraprova quer do grupo experimental, para se pesquisar as modificações da pele e o seu comportamento geral durante um período até 2 semanas. Os resultados estão resumidos nos quadros 10 e 11.
Quadro 10
Murganho Balb/c injectado com células L1210 pré-incubadas durante 1 hora com os DBP lipossómicos Concentração dos DBP no plasma Tratamento ng/mL % Grupo de contraprova, ao abrigo da luz 126,45 100% Grupo exposto à luz 52,23 41% Percentagem fotodegradada 59% Células sobreviventes no plasma (média de 3 murganhos/grupo)
Grupo de contraprova, ao abrigo da luz: 234 células L1210/2 mL de sangue/murganho Grupo exposto à luz: 21 células L1210/2 mL de sangue/murganho 28
Quadro 11
Murganho DBA/2 injectado com células P815 Concentração dos DBP no plasma Tratamento ng/mL % Grupo de contraprova, ao abrigo da luz 94,09 100% Grupo exposto à luz 58,14 62% Percentagem fotodegradada 38% Células sobreviventes no plasma (média de 3 murganhos/grupo) Grupo de contraprova, ao abrigo da luz: 50 células P815/2 mL de sangue/murganho Grupo exposto à luz: 8 células P815/2 mL de sangue/murganho [0068] Os resultados obtidos nos exemplos anteriores comprovaram que a exposição de todo o corpo à luz vermelha, a seguir à injecção dos DBP, determinou a activação dos DBP no sangue. Em consequência, houve uma certa quantidade de DBP que foi fotodegradada e simultaneamente houve um grande número de células tumorais pré-carregadas com os DBP que foram destruídas. Após o tratamento, não foi observada nem fotossensibilidade da pele nem nenhuma alteração do comportamento dos animais (para um período máximo de observação de 2 semanas). Os resultados indicam a existência de uma janela terapêutica, pelo que é possível efectuar o combate terapêutico de agentes infecciosos transportados pelo sangue, sem que haja danificação dos vasos sanguíneos e da pele.
[0069] A presente invenção foi descrita por meio de uma exposição directa e por meio de exemplos. Conforme se disse antes, os exemplos são apenas exemplos e com eles não se pretende limitar a invenção de nenhuma forma significativa.
Rua do Salitre, 195, r/c-Drtv 1269-063 LISBOA

Claims (8)

  1. Reivindicações Utilização de um agente fotossensibilizador seleccionado entre o conjunto constituído por uma clorina, uma bacterioclorina, uma ftalocinanina, uma porfirina, uma benzoporfirma, uma purpurina, uma merocianina e o pró-fármaco ácido δ-aminolevulínico (AAL) para a preparação de um medicamento para alterar ou destruir células destinatárias visadas na corrente sanguínea de um paciente, consistindo a referida alteração ou destruição transdermal no procedimento seguinte: (a) administrar ao referido paciente o medicamento numa quantidade suficiente para produzir uma concentração de agente fotossensibilizador, na corrente sanguínea do paciente, compreendida entre cerca de 0,01 pg/ml e 10 pg/ml; (b) esperar que decorra um período pós-injecção suficiente para permitir que o agente fotossensibilizador chegue às células visadas, mantendo simultaneamente a concentração do referido agente fotossensibilizador na corrente sanguínea; e (c) irradiar pelo menos uma parte do referido paciente com uma luz com um comprimento de onda absorvido pelo referido agente fotossensibilizador ou então, se o agente fotossensibilizador for um pro-fármaco, absorvida pelo produto que dele resulte, em que a referida irradiação tem lugar por via transdermal; e em que a concentração do agente fotossensibilizador na corrente sanguínea do paciente, o período decorrido pós-injecção, a intensidade da luz e a duração do referido passo de irradiação são tais que as células visadas na corrente sanguínea sejam alteradas ou destruídas de forma selectiva, ao mesmo tempo que é praticamente evitada a fotossensibilização da pele. 2
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido agente fotossensibilizador é uma porfirina, uma benzoporfirina ou AAL.
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a porfirina é porfímero sódico e a benzoporfirina é um derivado de benzoporfirina (DBP).
  4. 4. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que as referidas células visadas são células leucémicas, células que contêm vírus, células que contêm parasitas ou microrganismos.
  5. 5. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a referida concentração na corrente sanguínea do paciente está compreendida entre cerca de 0,01 μ^ηΛ e 10 μg/mL.
  6. 6. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a referida concentração na corrente sanguínea do paciente está compreendida entre cerca de 0,01 pg/mL e 4 μg/mL.
  7. 7. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a referida concentração na corrente sanguínea do paciente está compreendida entre cerca de 0,01 pg/mL e 2 pg/mL.
  8. 8. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o referido comprimento de onda é escolhido no intervalo entre 400 nm e 900 nm. Lisboa, 27 de Acosto de 2001 fm O Agente Oficial da Propriedade Industrial
    JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.I. Rua do Salitre, 195, r/c-Drt. 1269-063 LISBOA
PT93918860T 1992-09-21 1993-09-20 Activacao in vivo transdermal de agentes fotossensiveis no sangue PT660712E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94811392A 1992-09-21 1992-09-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT660712E true PT660712E (pt) 2001-11-30

Family

ID=25487290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT93918860T PT660712E (pt) 1992-09-21 1993-09-20 Activacao in vivo transdermal de agentes fotossensiveis no sangue

Country Status (21)

Country Link
US (2) US5484803A (pt)
EP (1) EP0660712B1 (pt)
JP (2) JP3598306B2 (pt)
AT (1) ATE201596T1 (pt)
AU (1) AU681088B2 (pt)
CA (1) CA2144327C (pt)
DE (1) DE69330277T2 (pt)
DK (1) DK0660712T3 (pt)
ES (1) ES2160600T3 (pt)
FI (1) FI951295A (pt)
GR (1) GR3036479T3 (pt)
HU (1) HU220251B (pt)
IL (1) IL107035A (pt)
NO (1) NO951066L (pt)
NZ (1) NZ255302A (pt)
PL (1) PL308116A1 (pt)
PT (1) PT660712E (pt)
SK (1) SK35295A3 (pt)
TW (1) TW241204B (pt)
WO (1) WO1994006424A1 (pt)
ZA (1) ZA936968B (pt)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5955490A (en) * 1989-07-28 1999-09-21 Queen's University At Kingston Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
US20020058008A1 (en) * 1989-07-28 2002-05-16 Kennedy James C. Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
US6710066B2 (en) * 1989-07-28 2004-03-23 Queen's University At Kingston Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
US5798238A (en) * 1990-04-16 1998-08-25 Baxter International Inc. Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants with quinolines as photosensitizer
US5587490A (en) * 1990-04-16 1996-12-24 Credit Managers Association Of California Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants
US20040110819A1 (en) * 1991-10-28 2004-06-10 Queen's University At Kingston Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
DE69334009T2 (de) * 1992-11-20 2006-11-23 The University Of British Columbia, Vancouver Verfahren zur Aktivierung von photoempfindlichen Mitteln
WO1996039188A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 Queen's University At Kingston Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
US6008211A (en) * 1995-07-27 1999-12-28 Pdt Pharmaceuticals, Inc. Photoactivatable compounds comprising benzochlorin and furocoumarin
AU723016B2 (en) * 1995-11-06 2000-08-17 New York Blood Center, Inc., The Viral inactivation treatment of red blood cells using phthalocyanines and red light
US5895786A (en) * 1996-05-08 1999-04-20 New York Blood Center, Inc. Method for treating viral infections
US6159733A (en) * 1996-06-20 2000-12-12 New York Blood Center, Inc. Method for photoinactivating malignant cells
US5922278A (en) † 1996-11-19 1999-07-13 Baxter International Inc. Method and apparatus for inactivating contaminants in biological fluid
US5742380A (en) * 1996-12-31 1998-04-21 Ronn Avigdor M Plasma assay spectrometer
US6010890A (en) * 1997-04-29 2000-01-04 New York Blood Center, Inc. Method for viral inactivation and compositions for use in same
US6103706A (en) * 1997-04-29 2000-08-15 New York Blood Center, Inc. Methods for treating viral infections
US5856566A (en) 1997-09-02 1999-01-05 Dusa Pharmaceuticals, Inc. Sterilized 5-aminolevulinic acid
US6159178A (en) 1998-01-23 2000-12-12 Heartport, Inc. Methods and devices for occluding the ascending aorta and maintaining circulation of oxygenated blood in the patient when the patient's heart is arrested
US6096066A (en) * 1998-09-11 2000-08-01 Light Sciences Limited Partnership Conformal patch for administering light therapy to subcutaneous tumors
US6183773B1 (en) 1999-01-04 2001-02-06 The General Hospital Corporation Targeting of sebaceous follicles as a treatment of sebaceous gland disorders
JP2002534483A (ja) * 1999-01-15 2002-10-15 ライト サイエンシーズ コーポレイション 代謝性骨障害または骨転移のための治療的組成物
US6454789B1 (en) * 1999-01-15 2002-09-24 Light Science Corporation Patient portable device for photodynamic therapy
US6602274B1 (en) * 1999-01-15 2003-08-05 Light Sciences Corporation Targeted transcutaneous cancer therapy
CA2356532A1 (en) * 1999-01-15 2000-07-20 Light Sciences Corporation Noninvasive vascular therapy
US6376483B1 (en) 1999-05-27 2002-04-23 Miravant Pharmaceuticals, Inc. Bacteriochlorins and bacteriopurpurins useful as photoselective compounds for photodynamic therapy and a process for their production
US20030114434A1 (en) * 1999-08-31 2003-06-19 James Chen Extended duration light activated cancer therapy
DE19960705A1 (de) * 1999-12-16 2001-06-21 Laser & Med Tech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines autologen Immunisierungsimpfstoffes gegen Krebserkrankungen (Tumorvakzine)
US7897140B2 (en) 1999-12-23 2011-03-01 Health Research, Inc. Multi DTPA conjugated tetrapyrollic compounds for phototherapeutic contrast agents
WO2001051087A2 (en) * 2000-01-12 2001-07-19 Light Sciences Corporation Novel treatment for eye disease
KR100365151B1 (ko) * 2000-05-08 2003-02-11 김형락 어류 병원성 세균과 바이러스의 감염 예방 및 치료를 위한δ-아미노레불린산의 신규한 용도
DE10034673C1 (de) 2000-07-17 2002-04-25 Medac Klinische Spezialpraep Dermales Applikationssystem für Aminolävulinsäure und seine Verwendung
EP2269645A3 (en) 2000-08-16 2011-01-12 The General Hospital Corporation doing business as Massachusetts General Hospital Topical aminolevulinic acid-photodynamic therapy for acne vulgaris
EP2248536A3 (en) 2000-12-14 2010-12-08 The General Hospital Corporation doing business as Massachusetts General Hospital Topical Aminolevulinic acid-photodynamic therapy for acne vulgaris
WO2002100326A2 (en) * 2001-05-01 2002-12-19 The General Hospital Corporation Photoimmunotherapies for cancer using photosensitizer immunoconjugates and combination therapies
US20030103995A1 (en) * 2001-06-04 2003-06-05 Hamblin Michael R. Detection and therapy of vulnerable plaque with photodynamic compounds
DE10162712A1 (de) * 2001-12-19 2003-07-17 Blutspendienst Der Landesverba Verfahren zur Inaktivierung von Bakterien und Leukozyten in Blut oder Blutprodukten
JP2005527493A (ja) * 2002-01-23 2005-09-15 ライト サイエンシーズ コーポレイション 光線力学療法のためのシステムおよび方法
DE60328496D1 (en) 2002-06-27 2009-09-03 Health Research Inc Fluorinierte chlorin und bacteriochlorin photosensitizer für fotodynamische therapie
AU2003249742A1 (en) 2002-07-02 2004-01-23 Health Research, Inc. Efficient synthesis of pyropheophorbide a and its derivatives
US7220778B2 (en) * 2003-04-15 2007-05-22 The General Hospital Corporation Methods and devices for epithelial protection during photodynamic therapy
US7659301B2 (en) * 2003-04-15 2010-02-09 The General Hospital Corporation Methods and devices for epithelial protection during photodynamic therapy
US20070020272A1 (en) * 2003-04-30 2007-01-25 Tayyaba Hasan Indirectly linked photosensitizer immunoconjugates, processes for the production thereof and methods of use thereof
EP1633337A4 (en) * 2003-05-29 2007-09-05 Mitos Pharmaceuticals Inc METHODS OF USING NITROXIDES IN CONJUNCTION WITH PHOTOSENSITIZERS AND SENOSENSITIZERS
FR2857264A1 (fr) * 2003-07-09 2005-01-14 Maco Pharma Sa Procede d'inactivation photodynamique des pathogenes au moyen d'ala
GB0424833D0 (en) 2004-11-10 2004-12-15 Photocure Asa Method
US8585707B2 (en) 2006-06-07 2013-11-19 Gary S. Rogers Continuous low irradiance photodynamic therapy method
US20080164224A1 (en) * 2007-01-04 2008-07-10 Whirlpool Corporation System for connecting mechnically dissimilar consumer electronic devices to an adaptor or a host
ES2454974T3 (es) 2007-06-27 2014-04-14 The General Hospital Corporation Aparato para la inhibición óptica de la terapia fotodinámica
US20090062724A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Rixen Chen System and apparatus for sonodynamic therapy
US8835104B2 (en) * 2007-12-20 2014-09-16 Fenwal, Inc. Medium and methods for the storage of platelets
EP3662750A1 (en) 2011-04-07 2020-06-10 Fenwal, Inc. Automated methods and systems for providing platelet concentrates with reduced residual plasma volumes and storage media for such platelet concentrates

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4649151A (en) * 1982-09-27 1987-03-10 Health Research, Inc. Drugs comprising porphyrins
US5095030A (en) * 1987-01-20 1992-03-10 University Of British Columbia Wavelength-specific cytotoxic agents
US4961920A (en) * 1988-12-08 1990-10-09 Luminis Pty, Ltd. Phototherapeutic monovinyl and divinyl ether-linked dimers
US4960408A (en) * 1989-01-10 1990-10-02 Klainer Albert S Treatment methods and vaccines for stimulating an immunological response against retroviruses

Also Published As

Publication number Publication date
EP0660712B1 (en) 2001-05-30
FI951295A0 (fi) 1995-03-20
HU220251B (hu) 2001-11-28
SK35295A3 (en) 1996-05-08
WO1994006424A1 (en) 1994-03-31
GR3036479T3 (en) 2001-11-30
DE69330277T2 (de) 2002-04-18
ZA936968B (en) 1994-04-12
IL107035A0 (en) 1993-12-28
ATE201596T1 (de) 2001-06-15
JPH08501301A (ja) 1996-02-13
IL107035A (en) 1998-12-27
PL308116A1 (en) 1995-07-24
JP3598306B2 (ja) 2004-12-08
DE69330277D1 (de) 2001-07-05
FI951295A (fi) 1995-05-17
US5736563A (en) 1998-04-07
US5484803A (en) 1996-01-16
JP2001316288A (ja) 2001-11-13
CA2144327C (en) 2002-08-06
DK0660712T3 (da) 2001-08-27
EP0660712A1 (en) 1995-07-05
HUT70966A (en) 1995-11-28
NO951066L (no) 1995-05-19
ES2160600T3 (es) 2001-11-16
AU681088B2 (en) 1997-08-21
TW241204B (pt) 1995-02-21
NO951066D0 (no) 1995-03-20
NZ255302A (en) 2001-04-27
AU4940593A (en) 1994-04-12
CA2144327A1 (en) 1994-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT660712E (pt) Activacao in vivo transdermal de agentes fotossensiveis no sangue
US6984655B1 (en) Photodynamic therapy for selectively closing neovasa in eyeground tissue
PT680365E (pt) Activacao de agentes fotossensibilizadores
Zhou et al. An ultrastructural comparative evaluation of tumors photosensitized by porphyrins administered in aqueous solution, bound to liposomes or to lipoproteins
Gomer et al. The effect of localized porphyrin photodynamic therapy on the induction of tumour metastasis
JP2002534218A (ja) 非侵襲性の脈管療法
AU2001229674A1 (en) Local drug delivery using photosensitizer-mediated and electromagnetic radiation-enhanced vascular permeability
WO2001052814A1 (en) Local drug delivery using photosensitizer-mediated and electromagnetic radiation-enhanced vascular permeability
PT642342E (pt) Inactivacao selectiva de celulas de sangue
Neave et al. Hematoporphyrin uptake in atherosclerotic plaques: therapeutic potentials
Veenhuizen et al. Intraperitoneal photodynamic therapy in the rat: comparison of toxicity profiles for photofrin and MTHPC
CA2270558C (en) Treatment of autoimmune diseases by photochemotherapy
Richter et al. Activation of benzoporphyrin derivative in the circulation of mice without skin photosensitivity
Nakajima et al. Therapeutic effect of interstitial photodynamic therapy using ATX-S10 (Na) and a diode laser on radio-resistant SCCVII tumors of C3H/He mice
US6495585B2 (en) Method for treating hyperproliferative tissue in a mammal
Teicher et al. Modulation of alkylating agents by etanidazole and Fluosol-DA/carbogen in the FSaIIC fibrosarcoma and EMT6 mammary carcinoma
WO1997033620A2 (de) Verbindungen zur behandlung von tumoren
Chopp et al. Photodynamic therapy of normal cerebral tissue in the cat: a noninvasive model for cerebrovascular thrombosis
US20020115649A1 (en) Use of texaphyrins in macrophage-mediated disease
Hampton et al. Photodynamic therapy: a new modality for the treatment of cancer
CA2336134A1 (en) Use of texaphyrins in macrophage-mediated disease
Castro et al. Biodistribution of rhodamine‐123 in nude mice heterotransplanted with human squamous cell carcinomas
JPS61240970A (ja) 悪性腫瘍抑制方法
Berger et al. Photochemotherapy
DE19654186A1 (de) Verbindungen zur Behandlung von Tumoren und deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln