JP2001316288A - 血液における感光剤の皮膚を通しての生体内活性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】この発明は感光剤を選択的に蓄積した標的細胞
を破壊するか又は害う(impair)方法に使用する光活性剤
を提供し、標的細胞は、完全な(intact)動物の血液流中
にあるものである。 【解決手段】感光剤を選択的に蓄積した標的細胞を害う
か又は破壊する。標的細胞は完全な動物の血中に存在す
ると共に、そのような動物の血中にはさらに非標的細胞
も含まれている。標的細胞は選択的に害うか又は破壊す
るが非標的細胞は比較的害わないような効果のある強度
で完全な動物の少なくとも一部に皮膚を通して光照射す
る。標的細胞には白血病細胞、ウイルス感染細胞、寄生
物含有細胞やバクテリア、寄生物、フリーのウイルスの
ような微生物が含まれている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】この発明は一般に感光剤を使った薬や薬
物治療の領域に関わる。特に、この発明は標的細胞を選
択的に害うか又は破壊し、非標的細胞は比較的害わない
ようにするように皮膚を通して光照射をすることによっ
て感光剤をとりこんだ血液・骨系標的細胞を損壊させる
という方法に使用する光活性化剤である。

【０００２】

【発明の背景】光動態治療（photodynamic therapy）
は、感光性化合物を投与し、続いてその感光性化合物が
選択的に入りこんだ組織に光を照射することを含む。十
分な高濃度の感光剤を含む標的組織は選択的に光を吸収
し、その結果、そのすぐまわりの細胞が損傷又は破壊さ
れる。米国特許 5,095,030は手順について次のように述
べている。動物に感光剤を与え、続いて外部光源を使っ
て光照射をする。例えば、この特許の実施例５では、触
診して分かる腫瘍にまで大きくなるようなＰ815腫瘍細
胞をマウスの皮下に注射したときについて述べられてい
る。次いで感光剤が注入され、その動物を３時間暗所に
置いた後、その腫瘍に強い光を照射した。この処理をし
た動物の生存率は未処理のコントロール動物よりも高か
った。同様に、同特許の実施例８では、同様のプロトコ
ールを使ったマウスの横紋筋腫(rhabdomyosarcoma)の系
について述べられている。このように、これらの例は局
所的な固定腫瘍の処理について示されている。そこでは
外部から当てられる光が腫瘍上に向けられている。これ
らの例では、標的組織にはそこでは血管や非標的の血液
細胞に対する損傷は避けられなければならない血液流は
含まれていない。

【０００３】米国特許 4,960,408は光伝達により血液流
内容物 （ＨＩＶウイルスや感染Ｔ細胞）を処理するこ
とについて表している。その技術では患者の血液は身体
外の(extracorporeal) 身体器官を通して運ばれる。そ
の器官では、白血球が患者に戻される前に、血液の白血
球画分に紫外線を照射する。

【０００４】ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）は、
赤外光（400−900nm）と組み合わせて、スパイク(spik
e)された血液内容物から、また、ウイルス血症(viremi
c)の猫から得られた全血から、フリーのウイルスとウイ
ルス感染細胞の両方を除去するのに有効であるというこ
とが報告されていた。赤血球は殺ウイルス剤(virucida
l)で処理した後も生存しているようであった。（雑誌名
North ら Blood Cells 18. 129-140, 1992）ＢＰＤは
また普通の非悪性細胞に対してよりも白血病細胞を含め
た腫瘍組織に対してより高い親和性があることが示され
ている。（Jamieson ら Leukemia Res. 14: 209-19, 19
90）1992年３月10日発行の米国特許 5,095,030（その全
文は本願の中に、引用をもって組みこまれている）は、
一般に「緑色ポルフィリン」と述べられているようなさ
まざまな波長特異的細胞毒性物質のことを示しかつクレ
ームに記載している。これらの化合物は吸収波長が効率
よく長波長側へシフトするようなディールズ・アルダー
（Diels Alder）反応によって修飾されたポルフィリン
誘導体である。これによって、これらの化合物が一般に
光動態治療に使われるとき、例えばヘマトポルフィリン
誘導体と比べるといくつかの好ましい性質をもつように
なっている。この特許の中で述べられているように、こ
のような細胞毒性のある物質は、それが望ましくない細
胞、特に腫瘍細胞や病原性ウイルスにとりこまれる(hom
e)ように投与処理され、その後、これらの化合物によっ
て吸収されるような光を照射することによって、細胞毒
性に影響を与えるように、それらの物質を変化させる。

【０００５】出願中のＮo. 07/832,542は、1992年２月
５日に提出されたが、これは、ポルフィリン感光剤のリ
ポソームの調製について開示している。

【０００６】

【発明の概要】この発明は感光剤を選択的に蓄積した標
的細胞を破壊するか又は害う(impair)方法に使用する光
活性化剤であり、標的細胞は、完全な(intact)動物の血
液流中にあるものである。血液流中及び動物の中には、
非標的細胞も含まれている。本方法は標的細胞を選択的
に破壊するか又は害い、非標的細胞は比較的害わないよ
うな効果をもつような強度で完全な動物の少くとも１部
分に皮膚を通して光を照射するというものである。

【０００７】別の実施態様としては、本発明は非標的細
胞よりも急速に増えているような標的細胞に対して適用
されるものである。さらに他の実施態様によれば、標的
細胞は血液内の白血病細胞、ウイルス含有細胞、寄生物
含有細胞、バクテリア、フリーのウイルス、他の感染体
(agents)であってもよい。

【０００８】この発明は任意の感光剤の使用について規
定しているが、好ましくは、感光剤はクロリン（例えば
クロリンｅ６）、バクテリオクロリン、フタロシアニ
ン、ポルフィリン、プルプリン、メロシアニン、ソラレ
ンや、組織の中でプロトポルフィリンのような薬剤をつ
くることのできるδ−アミノレブリン酸のようなプロド
ラッグ(pro-drugs)の中から選ばれたものである。他の
実施態様によれば、ＢＰＤ−ＭＡやポルファイマーナト
リウムが感光剤である。

【０００９】

【発明の簡単な説明】この発明は感光剤を選択的に蓄積
した血液−骨系の標的細胞を害うか又は破壊し、一方で
非標的細胞は比較的害わないようにする方法に使用する
光活性化剤である。本方法は、標的細胞を選択的に害う
か又は破壊するのに有効な強度で完全な(intact)動物の
少なくとも一部分に皮膚を通して光を照射するものであ
る。

【００１０】この中で使われているように、「標的細
胞」とは、今回示した処理方法により害われるか又は破
壊されるべき細胞である。標的細胞は感光剤をとりこ
む。そして、十分な光照射がなされたとき、その標的細
胞は害われるか又は破壊される。標的細胞は血液中にみ
られる任意の細胞でありうる。標的細胞には、白血病細
胞、ウイルス感染細胞、寄生虫含有細胞が含まれるがそ
れに限られたものではない。また、標的細胞のなかに
は、非標的細胞と比較して急速に細胞分裂している細胞
が含まれる。「標的細胞」という語はまたバクテリア、
ウイルス、寄生物ないし寄生虫(parasites)、他の感染
体のような微生物も含んでいるがそれに限られたもので
はない。このように、「標的細胞」という語は生きてい
る細胞に限らず、ウイルスのような感染性粒子も含まれ
る。

【００１１】「非標的細胞」は今回の処理方法により害
われるか又は破壊されるべきでない完全なないし完全な
(intact)動物の細胞全てである。これらの非標的細胞に
は健康な血液細胞、光にさらされる血管をつくっている
正常な(normal)細胞、光にさらされる血管の上あるいは
下にある組織の細胞が含まれるが、これらには限定され
ない。

【００１２】「破壊する」(destroy)とは望まれる標的
細胞を殺すという意味で使われている。「害なう」(imp
air)とは、その細胞の機能を妨げるように、その標的細
胞を変えてしまうという意味である。例えば、ノース(N
orth)らは、ＢＰＤ処理したウイルス感染Ｔ細胞に光を
照射した後では、Ｔ細胞の膜上に穴が開き、膜が完全に
分解されるまでその穴の大きさが大きくなっていくとい
うことを観察した。（Blood Cells 18: 129-40, 1989）
標的細胞は、たとえ最終的にはマクロファージによりや
られるとしても、害われ、破壊されると解される。

【００１３】「感光剤」とは１つあるいは多くのタイプ
の選ばれた標的細胞に入りこむ(home)化学化合物であ
る。それは、光照射により光に接すると、その光を吸収
し、その結果、標的細胞を害ないないし破壊する。実
際、選ばれた標的に入りこみ光を吸収するような任意の
化学化合物をこの発明で使うことができる。さらに、そ
の化合物は、これが投与される動物に対して毒性はな
く、あるいは、毒性のでないように調剤することができ
るようなものであることが好ましい。また、その物質の
光分解型も無毒であることが好ましい。感光物質の総合
的なリストは、クライマー・ビルンバウム(Kreimer−Bi
runbaumの Sem. Hematol 26: 157-73, 1989に載ってい
る。感光物質は、次のものを含む：即ち、クロリン、バ
クテリオクロリン、フタロシアニン、ポルフィリン、プ
ルプリン、メロシアニン、ソラレン、プロトポルフィリ
ンのような薬剤をつくり出すことのできるδ−アミノレ
ブリン酸のようなプロドラッグ(pro-drugs)を含むが、
それに限られない。ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰ
Ｄ）とプロファイマーナトリウムが最も好まれる。ベン
ゾポルフィリン誘導体の一酸塩基の環Ａ（ＢＰＤ−Ｍ
Ａ）が最も好まれる。

【００１４】ここで使われる「照射」は、全波長を含ん
でいる。また、その照射は感光剤を励起させるような波
長に合うように選択されている。さらに好ましくは、そ
の照射波長は感光剤の励起波長には合っていて、血液中
のタンパク質を含めて、非標的細胞やその他の完全な動
物にはあまり吸収されないものとする。例えば、ＢＰＤ
−ＭＡにとって好ましい波長は600−900nmの範囲であ
る。

【００１５】光照射に際してはさらに、その強度、継続
時間、感光剤を投与するときのタイミングについてこの
発明の中で定義されている。強度は、皮膚を通過し、血
液−骨系標的細胞に到達するのに十分な照射でなければ
ならない。継続時間は感光剤が標的細胞に対し作用する
のに十分な光活性化能をもつような十分な長さにしなけ
ればならない。強度と継続時間は両方とも、動物に対し
て過剰処理になるようなことは避けなければならない。
感光剤を投与するタイミングは重要である。なぜなら、
１）投与された感光剤は標的細胞にとり込まれるのにし
ばらくの時間が必要である。２）多くの感光剤の血液中
のレベルは時間とともに急速に減少していく。

【００１６】この発明は、ヒトや他のホ乳類を含めた、
しかしそれらに限られてはいないが、動物を処理する方
法を示している。その「動物」という語は、また馬や
犬、猫のようなペットや娯楽のための動物と同様に、
牛、豚、羊などの牧場の動物も含んでいる。

【００１７】「完全な動物」とは、全体の、分割されて
いない動物のことであり、それに光照射を行うことがで
きるものである。フォトフォレシス(photophoresis)の
−この際には動物の血液が光照射されるために体の外を
循環しているのだが−とは対照的に、本発明の方法では
動物の体のどの部分も、別に照射をするために取り除く
ことはしない。動物全体が照射される必要はない。完全
な動物の一部分だけが照射されればよく、あるいはされ
る必要がある。

【００１８】実際には、表面に近く血管のある部分に照
射することが、選択的照射のためには望ましいだろう。

【００１９】「皮膚を通して」とは、この中では動物の
皮膚を通してといういみで使われている。

【００２０】簡単に言って、感光剤は一般に光照射前に
動物に投与されなければならない。

【００２１】好まれる感光剤にはクロリン、バクテリオ
クロリン、フタロシアニン、ポルフィリン、プルプリ
ン、メロシアニン、ソラレンや、プロトポルフィリンの
ような薬剤をつくり出すδ−アミノレブリン酸のような
プロドラッグが含まれるが、それらに限られたものでは
ない。ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）やプロファ
イマーナトリウムがより好まれる。ベンゾポルフィリン
誘導体の一酸塩基環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）が最も好まれ
る。

【００２２】感光剤は局所的にあるいは全身的に与えら
れる。感光剤は経口投与あるいは、静脈、皮下、筋肉、
腹膜内等の注射により投与される。感光剤は、また一部
片（パッチ）や移植片を使って腸内や局所に投与するこ
ともできる。

【００２３】感光剤はダイマーとして合成され、１モル
単位あたりでより多くの光を吸収するように合成され得
る。感光剤はまたリセプタに特異的なリガンドや免疫グ
ロブリン、あるいは免疫グロブリンの免疫特異性をもつ
部分のような標的と反応できる特異的リガンドを結合し
たものでよい。その場合、これらは、標的としている細
胞や微生物中でより濃縮されるようになっている。その
結合物質は、目的の細胞にはより選択的にいって、そし
て、破壊してはならないような他の組織にいくという無
駄はなくなっているので、この結合物質により必要とさ
れる投与レベルを下げることができる。

【００２４】感光剤は、丸薬、カプセル、座薬、貼付薬
のような乾燥状態として調合することができる。感光剤
は、また水のみ、あるいは Remington's Pharmaceutica
lSciences （書名）の中で示されているような製薬とし
て認められる賦形薬のような液体状態の処方で調合され
るかもしれない。液体状の調合はまた、懸濁状態かある
いは乳濁液にすることができる。特にリポソーム状か脂
肪親和性の調合が最も好まれる。もし、懸濁液か乳濁液
が利用されたら、適当な賦形薬としては、水、生理的食
塩水かブドウ糖、グリセロールなどのようなものが含ま
れる。これらの組成物は、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、
ｐＨ緩衝剤などの少量の非毒性の補助物質が含まれても
よい。

【００２５】感光剤の投与量は、目的とする標的細胞や
最適の血中レベル（例２を見よ）、動物の体重と照射の
タイミングによって変わってくる。使われる感光剤に依
存して同等の最適治療レベルが確立されなければならな
いだろう。（好ましくは、投与量は約0.01から100μg／
mlの間の血中レベルとなるように計算される。さらに、
投与量は約0.01から10μg／mlの間の血中レベルとなる
だろう。感光剤がＢＰＤ−ＭＡのときは、血中レベルは
0.01から４μg／mlの間だろう。ＢＰＤ−ＭＡの血中レ
ベルが0.01から２μg／mlに達しているときがより好ま
しい。血流内の照射強度は約２−150mＷ／cm2の間が好
まれ、もっといい照射強度は約10−100mＷ／cm2のとき
である。最も好まれる血流内照射強度は約15−70mＷ／c
m2である。

【００２６】光照射の時間は約0.25分から24時間という
のが好まれる。より好まれる照射時間は約0.25分−６時
間である。最も好ましい照射時間は約0.25分−２時間で
ある。

【００２７】理論により限定することは意図しないが、
発明者は次のことを提唱する。ＢＰＤは比較的に短い期
間内で、過度の毒性なしに、血中で実質的に光活性化さ
れることができる。このように、ＢＰＤの投与と光照射
の投与を結びつけて治療の窓をつくり出せるようにみえ
る。ＢＰＤの光分解産物の生成は、光活性化の指標とし
て使われた。ＢＰＤの光活性化は、細胞毒性の作用を与
えるような酸素単体(singlet)を形成させると仮定され
ていた。血液の体外処理あるいはファイバーオプティッ
クスによる静脈内光活性化ということに関連した諸問題
の点からみると、ＢＰＤを投与した患者の「赤色光ベッ
ド」の中で行われる全身照射は血中の感染性物質の処理
に対する興味深いアプローチであるようである。

【００２８】続いて出てくる実施例は、本発明の効果を
立証し、本発明の実施の手助けとなるべきものである。
次の実施例は、１つの感光剤をカバーし、本発明の方法
に使用するため、他の感光剤あるいは新しい化合物を選
び出すときの手段を与えてくれる。

【００２９】以下の実施例は、例としてのみ意図したも
ので、決して本発明を限定しようと意図しない。一般的コメント 材料と手順のところの次の一般的コメントは、特段の記
載のない限りは実施例１−４に関する。材料 ＢＰＤ−ＭＡは、本願中に引用により繰込みしている米
国特許 No.4,920,143や4,883,790の中で述べられている
ようにして合成された。ＢＰＤ−ＭＡはＱuadra Ｌogic
Ｔechnologies Ｉnc.（会社名）より得られ、ＤＭＳＯ
中に（4.5mg／ml）溶かして−70℃で保存された。リポ
ソームＢＰＤ（4.95mg／ml）は1992年２月５日に提出さ
れた米国特許出願 No. 07/832,542の中で述べられてい
るようにして調製された。次のような処方が使われた。 リポソームＢＰＤは乾燥させ、１mlのサンプルにして−
20℃で凍らせて保存した。適当数のサンプルを使う直前
に解凍し、動物に注入するため、水にとかした５％デキ
ストロースで希釈した。

【００３０】オスのＢalb／cマウス（生後７−11週；Ch
arles River，カナダ）というのが、特段の指定のな
い限りはこの研究で使われた。Ｂalb／cマウスは、その
体表面皮膚に色素がないために、今回の研究材料として
選ばれた。毛を刈って除毛して、頭以外の全身から体毛
を効率よく除いた。すると、そのマウスの皮膚はかなり
透明にみえた。内部の器官、特に肝臓、脾臓のような暗
赤色の器官は皮膚を通して目でよくみえた。そのマウス
は、実験に使われる５日前に、商業的に手に入れること
のできる除毛機（商標名 Neet or Nair）を使って、体
毛を刈りとられた。ＢＰＤは注入するが、光照射はしな
いコントロールマウスは毛は刈り取られなかった。マウ
スに注入してから、以下のようにいろいろな長さの時間
暗所に置いた。実験の前後で、そのマウスは毎日12時間
明るい所、12時間暗所という動物施設に置かれた。実験
の後、マウスに届く光の量をへらすために、そのおりは
上にアルミホイルをかぶせた状態で下段の棚の上に置か
れた。

【００３１】光箱というものがブリティッシュ コロン
ビア大学のワークショップでつくられた。それは２層の
1475Ｗタングステン−ハロゲン反射器付ランプ（Genera
lElectric社）からなっていて、それは上部及び底部か
ら必要な地域を照らした。光は次のようにしてフィルタ
ーにかけられた。

【００３２】１）600nmより短波長のところで大部分の
光を吸収するように黄色と赤色のプラスチックフィルム
からなる一連のフィルターを通す。２）900nm超の波長
を吸収するような15mmの厚さの水フィルターを通す。冷
却は、水フィルターの中に一定に、冷却水を流し、一連
の５つのファンを備えることによって行われた。光強度
はＩＬ1350光度計（International Light社）によって
測定された。

【００３３】光箱により供給された光のスペクトルは図
１Ａの中で示されている。比較のために、ＢＰＤの吸収
スペクトルが図１Ｂの中で示されている。大まかにみ
て、供給光の３分の１はＢＰＤ活性化スペクトルの範囲
内にある。

【００３４】上部と底部のランプにより供給された光の
強度は一様ではなかった。底部のセットは光照射チャン
バーの床レベルで測定して、33−40mＷ／cm2である。一
方、上部のセットは動物の背中の皮膚表面で測定して27
−33mＷ／cm2であった。ここで述べた範囲は照射の水平
面での影響が一様でないことから由来している。さら
に、マウスは光照射の間動きまわるのでいろいろな時間
で、皮膚の異なる部分が異なった光量をうけている。そ
のため、マウスの皮膚に伝わる光量は、概算されなけれ
ばならず、その計算は30mＷ／cm2の強度に基づいて行わ
れた。手順 血液テスト： 血液は50μlのヘパリン（濃度1000 unit
s／ml生理的食塩水）を含むシリンジ中に採取された。
１時点あたり少なくとも１マウスから血液サンプル（0.
45ml）が、Coutler Counterによる分析のためにブリテ
ィッシュ コロンビア大学にある大学病院のDiagnostic
研究室に送られた。血液の形態は研究室の技術者によっ
て選ばれたサンプルから調製した血液フィルム上で決定
された。

【００３５】プラズマ中のＢＰＤ濃度の決定： プラズ
マサンプルは、マウスから採取した血液を遠心すること
によって得られ、検査が行われるまで−20℃に冷凍保存
した。サンプル中のＢＰＤ濃度はJasco Model FP-770
（Japan Spectroscopic社）ケイ光光度計とマイクロキ
ュベット（Far UV Quartz Cell, Starna Cells Inc.）
を使って、フルオロメトリーにより決定された。励起波
長とケイ光(emission)波長はそれぞれ439と699nmであっ
た。プラズマサンプルはケイ光が決定の直前に１％Trit
on（商標名） X-100（界面活性剤）を含むＰＢＳ（リン
酸バッファー）で20倍希釈された。ＢＰＤのスタンダー
ドは１％Triton X-100を含むＰＢＳ中で５％マウスプラ
ズマとなるように調製された。このような条件下では、
ＢＰＤ濃度とケイ光の単位との間の関係は0.1ng／mlか
ら１μg／mlの間で直線性を示していた（相関係数＞0.9
9）。検出限界は２ng／mlプラズマに相当する0.1ng／ml
未満のサンプルである。最大のプラズマ自己ケイ光は52
0nmで観察された。699nmでのＢＰＤのケイ光ピークには
事実上干渉はなかった。

【００３６】実施例１ 皮膚の光感受性のテスト ６匹のＢalb／cマウス（体重22±１g）が前記のように
調製された。５匹のマウスはＤＭＳＯ ストック（リポ
ソームＢＰＤではない）からＢＰＤを２回（24時間間隔
で）注入し、注入して１時間後に光を照射した。１匹の
マウスは、ＢＰＤは注入しなかったが光は照射した（光
のみのコントロールとなる）。最初の処理の間、そのマ
ウスは200μlのＰＢＳ中で１マウスあたり15μgのＢＰ
Ｄを注入した。２回目の処理では１マウスあたり20μg
のＢＰＤ（0.9mg／kg）を注入した。１匹のマウスは両
方の処理に対するコントロールとして使われた。

【００３７】注入後すぐ（両方の場合とも）動物は暗所
に１時間おき、そして個々のプラスチック容器（大き
さ：９×４×５（cm））に置かれた。その容器は光箱の
中に置かれ、光を照射された。それぞれのマウスは異な
る間隔をおいて光箱から取り出された。なお、その時間
はそれぞれ15，30，45，60，75分である。皮膚表面に供
給された光量はそれぞれ27，54，81，108，135Ｊ／cm2
である。２回目についても、同じ光量が使われた。しか
しながら、１日目に高い光量をうけたマウスは、２日目
は低い量を与えた。コントロールマウスは両方の場合と
も60分光をあてた。これは表１に要約されている。光照
射の間、マウスは常に不快さやかゆみ(itching)の症状
を示しているのが観察された。２回目の光照射後、毎日
２週間そのマウスの皮膚の様子と一般的行動パターンを
観察した。

【００３８】投与後２週間たった血液サンプルはハロセ
イン麻酔のもとで、心臓に針をさしてそれぞれのマウス
より採取した。そしてそのマウスは犠牲となり、解剖さ
れた。その脾臓、肝臓、腎臓の重さをはかった。

【００３９】ＢＰＤ注入マウスは供給されたあらゆる量
の光（27，54，81，108，135Ｊ／cm2 ）をうけ、非常に
うまくくり返し処理をうけた。処理する日のどちらの日
でも、マウス達は光をあてていても普通のふるまいと変
わらず、皮膚上に薬による活性化のため生じうるひっか
き傷(scratching)がときおりみられることを除いては、
不快な症状は何も見せなかった。照射の直後またその後
２週間の間のどちらでもマウスの皮膚上で大きな変化は
観察されなかった。行動の変化もみられなかった。驚く
べきことに、やや興奮とひっかき傷という形で不快の症
状を示した唯一のマウスは光コントロールマウスであっ
た。それゆえ、60分間という光の条件のみにした。（当
初予定の75分はなしにした。）マウスの数がとても少な
いので、肝臓、脾臓、腎臓のような内部器官に対する投
与の影響について決定的な結論を導き出すことはできな
かった。しかしながら、２回の処理を行ってから２週間
観察を続けていたテストマウスのグループでは、全体の
形態も体重も普通と変らなかった。全体重と相当する器
官の重さは表２の中で示されている。

【００４０】表３は、白血球数（ＷＢＣ）、赤血球数
（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＢ）、ヘマトクリット
（Ｈct）、平均血球体積（ＭＣＶ）、血小板数（ＰＬ
Ｔ）も含めて処理後２週間のマウスの血液パラメーター
を示している。処理後２週間で決定された血液細胞の形
態は表４に示されている。全ての値は、正常の範囲内に
ある。血小板凝集はわずかに低い血小板数で高いＷＢＣ
数に寄与したかも知れない。

【００４１】

【表１】

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】

【表４】

【００４５】実施例２ 薬物動態学（ＰＫ）の研究 光をあてている間プラズマ中のレベルを決定するため
に、次のような実験が行われた。14匹のＢalb／cマウス
（体重22±１g）は１マウスあたり200μlのＰＢＳ中に
１マウスあたり20μg（0.9mg／kg）のリポソームＢＰＤ
を注入した。血液サンプルを注入後15分から２時間のさ
まざまな時間間隔で心臓に針を刺すことにより採取し
た。光照射は何匹かのマウスで注入後15分から始まっ
た。プラズマ中のＢＰＤ濃度は前記のようにして決定さ
れた。その結果は表５と図２に示されている。

【００４６】これらのデータは光照射のタイミングの影
響をテストするのに使われた。最初のサンプル(exampl
e)で注入して２時間後つまり、光照射をはじめて１時間
たったとき（108Ｊ／cm2 ）に、ＢＰＤのプラズマレベ
ルは2.44μg／mlであった。同じサンプルで、光照射を
はじめたときでは、ＢＰＤのプラズマレベルは約４μg
／mlであった。さらに、このような低いレベルでの皮膚
の光感受性を調べるため、マウスは注入後のもっと早い
時間、つまり15分後のプラズマ中のＢＰＤのレベルが6.
32μg／mlのときに光にあてた。しかしながら、15分後
に光照射をはじめたマウスはほとんどすぐに不快を訴
え、照射をはじめて30分後（54Ｊ／cm2 ）には死んでし
まった。このことは、約6.2μg／mlのＢＰＤの最初のプ
ラズマレベルと約50Ｊ／cm2 の全身への光照射はマウス
を死に至らしめるということを示した。しかしながら、
実施例１で示されているように、プラズマレベルがより
低いときは、同じ光量でも明らかに無害である。

【００４７】

【表５】

【００４８】実施例３ ＢＰＤの皮膚を通しての活性化 14匹のマウス（体重22±１g）がこの研究で使われた。1
2匹のマウスには（200μl中）20μgのリポソームＢＰＤ
（0.9mg／kg）が注入され、光照射前に１時間暗所に置
かれた。マウスはそれぞれ30分、１時間、1.5時間光に
あてられた。それは皮膚表面に伝わる光量にすると、そ
れぞれ54，108，162Ｊ／cm2 に相当する。光をあててす
ぐに、血液サンプルが採取された。相当する時間で、Ｂ
ＰＤを投与したが光にはあてなかった２匹のマウスから
血液サンプルが採取された。さらにもう２匹のマウスは
投与後１時間でテストされた。

【００４９】この研究のねらいはＢＰＤを活性化するよ
うな、組織の光透過性を決定するということである。血
液中のＢＰＤの実際の光分解がＢＰＤの実際の活性化を
代表するものと仮定している。

【００５０】ＢＰＤのプラズマ濃度はケイ光法により決
定された。光照射されたものと、されていないコントロ
ールのマウスのプラズマ中の未変化ＢＰＤの濃度が比べ
られた。

【００５１】結果（表６と図３に示してある）は、ＢＰ
Ｄの36−76％が54−162Ｊ／cm2 の光量により光分解(ph
otodegradation)されるということを示した。このよう
な光分解量から次のようなことが示された。十分量の光
が組織を通過し、血管内においてＢＰＤを活性化し、こ
れによって分解する。重要なのは、このような光照射
と、薬剤投与量(drug doses)は皮膚の光感受性を誘起し
なかったということである。このことは、実施例１にお
いてみられた安全性を確かなものにした。さらに、血液
のパラメーターに対して急性の影響を与えるというよう
なことは観察されなかった（表７）。

【００５２】

【表６】

【００５３】

【表７】

【００５４】本研究の中で使われたように、同じ光度計
を使って、光量測定が再計算された後に、本実施例で得
られたデータは以前に発表された研究（Photochem. Pho
tbiol, 1991 53: 281-286）のデータと比較された。以
前に発表された研究では、ＤＢＡ／２というマウス（体
毛を刈り取られた）に、４mg／kgを注入し注入して３時
間後に局所的に153Ｊ／cm2 の広いスペクトルの光（強
度にして170mＷ／cm2）をあてた。図２より外挿する
と、３時間（30分光照射の最初）での最大のプラズマ濃
度が2.987±0.312（SD）μg／mlという値が得られるだ
ろう。結果として、皮膚で照射後すぐでは、変化はなか
ったけれども、照射後最初の24時間のうちに、深刻な皮
膚の壊死が起きはじめ96時間までにそれが進行する。続
いて治癒の期間になる。結局、傷は治り、毛は再生し
た。

【００５５】本研究では、光をあてはじめたときのＢＰ
Ｄのプラズマ濃度は、３μg／mlをこえるくらいで、皮
膚において照射後、すぐに、あるいは２週間の間でも何
も変化はみられなかった。以前と本研究のちがいは次の
ようなことである。(1)ＢＰＤの投与量が高い（４mg／k
gに対して0.9mg／kg）ため、最大のプラズマ濃度が高い
こと。(2)注入してから光照射までの時間が長いこと
（３時間に対して１時間）、このため、皮膚により多く
ＢＰＤがたまっていたのである（ＢＰＤは見かけ上５時
間くらいまでの間皮膚にたまっている）。(3)光強度が
高いこと（170mＷ／cm2 に対して30mＷ／cm2 ）。この
データから、全てのこのような因子が全身照射のための
治療方法を定義する際には考慮されなければならない。

【００５６】実施例４ マウスの血液内でのＢＰＤの試験管内活性化 組織を通過する光の量を見積もるため、マウスの血液を
使って試験管内の実験が行われた。同じ光源が使われ、
それゆえに、光のスペクトルは同じだった。この実験に
おける光量は生体内実験をまねるようにして選ばれた。

【００５７】リポソームＢＰＤが１μg／mlの濃度にな
るように、新鮮に採取され、ヘパリンで凝血防止された
マウス血液に加えられた。続いて、0.85μlの血液サン
プルを直径35mmのペトリ皿にまいて、光箱内におき、赤
色光をあてた。そのペトリ皿は光箱内で下からのみ光を
あてられた。光の強度は35mＷ／cm2 であった。30分、
１時間、1.5時間ときめて照射した、３つの異なった光
量はそれぞれ63，126，189Ｊ／cm2 であった。二重のペ
トリ皿はアルミホイルでカバーをかけておかれた。光を
あててすぐに、血液はペトリ皿より回収した。そして、
プラズマは遠心により分りされた。コントロールの未照
射サンプルは、光を照射したサンプルに相当する各時間
で処理された。

【００５８】光照射と未照射血液より分離されたプラズ
マ中のＢＰＤ濃度はケイ光法により決定された。結果は
表８と図４に示されている。ＢＰＤの約51−83％が使わ
れた光量の範囲内で分解されていた。

【００５９】試験管内でのＢＰＤの光分解の程度は、実
際に組織を通過し、血管内のＢＰＤに届くような光の量
を見つもるために、生体内の分解と比べられた。両方の
実験で光分解されたＢＰＤの量が、光のないところでプ
ラズマ中に存在する未変化のＢＰＤの量に関して分解の
割合として表されると、試験管内、生体内で決定される
分解の割合は比較的似ていた。（表９、図５）しかしな
がら、分解されたＢＰＤの量が、１mlのプラズマあたり
に光分解されたＢＰＤのμgとして比較されると、生体
で実際に皮膚表面に伝わる光量の約65％が血管内のＢＰ
Ｄに到達しているということが明らかとなった（表９、
図６）。

【００６０】

【表８】

【００６１】

【表９】

【００６２】光をあてている間のプラズマ中のＢＰＤの
レベルを決定するために次のような実験が行われた。

【００６３】先の例の結果より、全身照射という方法に
よって血液中のＢＰＤを活性化するような治療方法があ
るということが示唆された。0.9mg／kgでＢＰＤを投与
して１時間後に27−135Ｊ／cm2 （皮膚レベルでの光強
度として約30mＷ／cm2 ）の光量の範囲内で、そのマウ
スは赤色光（600−900nm）にてらされた後、処理をして
２週間たっても皮膚の光感受性の症状は何もみられなか
った。さらに、肝臓、脾臓、腎臓を調べている間、毒性
は検出されなかった。あるいは処理をして２週間で血液
パラメーターを決定したところ、それらの値の変化はみ
られなかった。光をあてている間のおよそのプラズマレ
ベルは2.5−４μg／mlの間であった。

【００６４】ＢＰＤの最も高いプラズマ濃度（投与後す
ぐの6.3μg／ml）は54Ｊ／cm2 の光と組み合わされると
マウスを死に至らしめる。生体内で光をあてると、結果
的に血液中のＢＰＤの36−76％が光分解される。試験管
内でのマウス血液のＢＰＤの光分解と比較することによ
って、皮膚の表面に伝えられる光量のおよそ65％がマウ
スの組織を通過して血管内のＢＰＤに到達するというこ
とが示された。以前発表された研究とこれらのデータを
比較することによって、皮膚の光感受性は、最大のプラ
ズマ濃度や、投与して光をあてるときの時間、そのとき
の光の強度によって決定される。

【００６５】実施例５ オス成熟ＤＢＡ／２とＢalb／cマウスは、１時間 100n
g／mlのＢＰＤ（リポソーム）とプレインキュベートさ
れたＰ815とＬ１ 210細胞をそれぞれ静脈注射された。
動物に注入する直前に、さらに２μgのＢＰＤが細胞を
ふくむシリンジに加えられた。これによって、注入直後
のマウスプラズマ１mlあたり１μgのＢＰＤということ
になる（マウス血液の全体積を約２mlと仮定してい
る）。マウスの１つのグループ（毛を刈られたもの）は
1.5時間（162Ｊ／cm2 の強さ）光箱内で赤色光（600−9
00nm）を直接あてられた。もう１つのグループはコント
ロールとして暗所におかれた。

【００６６】光をあてた後すぐに、ハロセイン麻酔のも
と心臓に針をさして血液サンプルを採取した。光照射マ
ウスとコントロールマウスのプラズマ中のＢＰＤの濃度
は、ケイ光法により決定された。マウス血液中のクロー
ンをつくり増殖していく腫瘍細胞の数は限界希釈アッセ
イのプロトコールを使って、10％のウシの血清を加えて
ある培養液中で血液サンプルを培養することによって決
定される。処理した後、コントロールと実験用グループ
の両方のマウスについて、２週間までの間皮膚の変化と
一般的な行動を観察した。その結果は表10と11に要約さ
れている。

【００６７】

【表１０】

【００６８】

【表１１】

【００６９】先の例の結果から、ＢＰＤを注入してから
赤色光で全身を照射すると、血中のＢＰＤが活性化され
ることが示された。結果として、ＢＰＤの幾分かは光分
解され、同時に、あらかじめＢＰＤ処理しておいた腫瘍
細胞の多くは破壊された。処理した後、皮膚の光感受性
も動物の行動の変化も観察されなかった（最大観察期間
２週間の間において）。その結果から、血管や皮膚には
損傷を与えず、血液・骨系感染体の治療を行うことので
きるような、治療方法の窓が存在するということが示さ
れた。

【００７０】この発明は直接の記述と実施例により示さ
れてきた。上記のように、その実施例は実施例であると
いうことのみが意図されており、決してその発明を限定
することを意味しているのではない。さらに、本明細書
と、請求の範囲（クレーム）について検討する際、この
分野で一般の技術をもっている人は、本発明のクレーム
された特徴に均等なものがあるということを認めるだろ
う。発明者は、請求された発明の妥当な範囲内で均等な
ものを含めることを意図している。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａは光箱により供給される光のスペクト
ルを示している。図１ＢはＢＰＤを活性化する光のスペ
クトルを示している。

【図２】 図２は、１マウスあたり20μg（0.9mg／kg）
のリポソームＢＰＤを注入してからさまざまな時間での
マウスプラズマ中のＢＰＤ濃度を示している。

【図３】 図３は、１マウスあたり20μg（0.9mg／kg）
のリポソームＢＰＤを注入し、そのマウスに光を照射し
あるいはコントロールとして暗所においたままにしたと
きのさまざまな時間でのマウスプラズマ中のＢＰＤ濃度
を示している。

【図４】 図４は、さまざまな時間光にてらされたマウ
スの血液中のＢＰＤ（１μg／ml）の試験管内光分解を
示している。

【図５】図５は、生体内と試験管内での、光を照射して
いない血液と比較して、光を照射されたマウス血液の、
ＢＰＤの光分解の割合をグラフにしている。

【図６】図６は、試験管内と生体内（全身照射）で、未
照射血液と比較したときの赤色光（600−900nm）を照射
したマウス血液の、ＢＰＤの光分解の割合をグラフにし
ている。

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】動物の血液の中で標的細胞を破壊するか又
   は害う方法において使用するための組成物であって、該
   方法が、（ａ）感光剤である光活性化剤を血液中に投与
   すること、（ｂ）投与後、当該光活性化剤が当該濃度を
   維持しながら標的細胞に入り込むように十分な時間を経
   過すること、及び（Ｃ）当該光活性化剤により、プロド
   ラッグの場合はその活性化剤生産物により、吸収される
   光を当該動物の少なくとも一部分に皮膚を通して照射す
   ること、更に動物の血液中の光活性化剤濃度、投与後の
   時間、光の照射強度、及び光照射時間は全て、皮膚の光
   感受性が実質的に回避される範囲で血液中の標的細胞が
   選択的に害われ、又は破壊される程度であることを含
   み、前記組成物が光活性化剤組成物であることを特徴と
   する光活性化剤組成物。
2. 【請求項２】当該投与される光活性化剤がそのプロドラ
   ッグの形態を含み、血液中の光活性化剤濃度で、プロド
   ラッグの場合はその活性化剤生産物の濃度で、およそ
   ０．０１〜１００μｇ／ｍｌとなるように十分な量の光
   活性化剤である請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】前記の光活性化剤が、クロリン、バクテリ
   オクロリン、フタロシアニン、ポルフィリン、ベンゾポ
   ルフィリン、プルプリン、メロシアニン、ソラレン及び
   プロドラッグアミノレブリン酸（ＡＬＡ）の何れかであ
   る請求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】前記の光活性化剤が、ポルフィリン、ベン
   ゾポルフィリン又はＡＬＡである請求項１記載の組成
   物。
5. 【請求項５】ポルフィリンがポルファイマーナトリウム
   であり、ベンゾポルフィリンがＢＰＤである請求項３記
   載の組成物。
6. 【請求項６】前記の標的細胞が白血病細胞、ウイルス含
   有細胞、寄生物含有細胞又は微生物である請求項１記載
   の組成物。
7. 【請求項７】前記動物の血液中の濃度がおよそ０．０１
   〜１０μｇ／ｍｌである請求項１記載の組成物。
8. 【請求項８】前記動物の血液中の濃度がおよそ０．０１
   〜４μｇ／ｍｌである請求項１記載の組成物。
9. 【請求項９】前記動物の血液中の濃度がおよそ０．０１
   〜２μｇ／ｍｌである請求項１記載の組成物。
10. 【請求項１０】血液中の光照射強度が１５−１００ｍＷ
    ／ｃｍ２である請求項１記載の組成物。
11. 【請求項１１】薬剤を動物の血液に接触させるのに用い
    るための薬剤として調合するための感光剤を含む光活性
    化剤組成物であって、 動物の血液中に含まれている標的細胞が選択的に害われ
    るか又は破壊されるが他の細胞は比較的傷つけないよう
    な効果の強度で光を皮膚の層を通して前記血液に照射す
    る方法と組み合わせて使用することを特徴とする光活性
    化剤組成物。
12. 【請求項１２】当該組成物が、光照射を行うおよそ３０
    分〜３時間前に投与されるためのものである請求項１１
    記載の組成物。
13. 【請求項１３】動物の血液中の標的細胞を破壊するか害
    う方法において使用するための組成物であって、該方法
    が、（ａ）前記動物に感光剤である光活性化剤を血液に
    投与すること、その後（ｂ）光を前記の動物の少なくと
    も一部分に経皮的に照射し、動物の血液中の光活性剤の
    濃度、投与後の時間（投与工程（ａ）と照射工程（ｂ）
    の間の時間）、光照射の強度、及び光照射時間が血液中
    の標的細胞が選択的に害われ又は破壊され、皮膚の光感
    受性が実質的に回避され、かつ前記活性化剤投与後光照
    射までの時間経過がおよそ３０分〜３時間の範囲である
    ことを含み、前記組成物が光活性化剤であることを特徴
    とする光活性化剤組成物。
14. 【請求項１４】前記の標的細胞が、非標的細胞と比較し
    て急速に分裂している活性化細胞である請求項１３記載
    の組成物。
15. 【請求項１５】前記の光活性化剤が、クロリン、バクテ
    リオクロリン、フタロシアニン、ポルフィリン、プルプ
    リン、メロシアニン及びソラレンの何れかである請求項
    １３記載の組成物。
16. 【請求項１６】ポルフィリンがＢＰＤ又はポルファイマ
    ーナトリウムである請求項１５記載の組成物。
17. 【請求項１７】ＢＰＤがＢＰＤ−ＭＡである請求項１６
    記載の組成物。
18. 【請求項１８】前記の標的細胞が白血病細胞、ウイルス
    含有細胞、寄生物含有細胞又は微生物である請求項１３
    記載の組成物。
19. 【請求項１９】動物がホ乳動物である請求項１３記載の
    組成物。
20. 【請求項２０】ホ乳動物がヒトである請求項１３記載の
    組成物。
21. 【請求項２１】当該光が６００〜９００ｎｍ程度の範囲
    にある波長を有する請求項１３記載の組成物。
22. 【請求項２２】血液中の光照射の強度が１５−１００ｍ
    Ｗ／ｃｍ２程度である請求項１３記載の組成物。
23. 【請求項２３】動物の血液中の白血病細胞を破壊又は害
    う方法において使用する組成物であって、当該方法が、
    （ａ）光活性化量のベンゾポルフィリン誘導体-モノア
    シッドＢＰＤ−ＭＡを前記動物に投与すること、及び
    （ｂ）光を前記動物の少なくとも一部分に経皮的に照射
    し、動物の血液中のＢＰＤ-ＭＡの濃度、投与後の時間
    （投与工程（ａ）と照射工程（ｂ）の間の時間）、光の
    照射強度、及び光照射時間が血液中の当該白血病細胞が
    選択的に害われ又は破壊されるが、皮膚の光感受性は実
    質的に回避され、かつ投与後の時間経過がおよそ３０分
    〜３時間の範囲であることを含み、前記組成物が光活性
    化剤であることを特徴とする光活性化剤組成物。
24. 【請求項２４】当該光がおよそ６００〜９００ｎｍの範
    囲にある波長を有する請求項２３記載の組成物。