SK35295A3 - Method of transcutaneous in vivo activation of photosensitive agents in blood - Google Patents

Method of transcutaneous in vivo activation of photosensitive agents in blood Download PDF

Info

Publication number
SK35295A3
SK35295A3 SK352-95A SK35295A SK35295A3 SK 35295 A3 SK35295 A3 SK 35295A3 SK 35295 A SK35295 A SK 35295A SK 35295 A3 SK35295 A3 SK 35295A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
target cells
blood
bpd
cells
light
Prior art date
Application number
SK352-95A
Other languages
English (en)
Inventor
Anna M Richter
Original Assignee
Quadra Logic Tech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quadra Logic Tech Inc filed Critical Quadra Logic Tech Inc
Publication of SK35295A3 publication Critical patent/SK35295A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Description

Spôsob in vivo transkutánnej aktivácie fotosenzitívnych činidiel v krvi
Oblasť techniky
Predložený vynález sa všeobecne týka oblasti medicíny a farmakoterapeutík s fotosenzitívnymi činidlami. Špecificky vynálezom je metóda zničenia alebo poškodenia v krvi sa nachádzajúcich buniek, ktoré prijali fotosenzitívne činidlo, aplikáciou ožiarenia transkutánne, pre selektívne poškodenie alebo zničenie cieľových buniek, pričom necieľové bunky zostávajú relatívne nepoškodené.
Doterajší stav techniky
Fotodynamická terapia zahrňuje podanie fotosenzitívnej zlúčeniny a následné ožiarenie tkaniva, v ktorom sa fotosenzitívna zlúčenina selektívne usadí, svetlom. Cieľové tkanivo, obsahujúce dostatočne vysokú koncentráciu fotosenzitívnej zlúčeniny, selektívne absorbuje svetlo, čo vedie k poškodeniu alebo zničeniu buniek v bezprostrednom okolí. US patentový spis č. 5095030 opisuje postupy, pri ktorých sú fotosenzitívne zlúčeniny podávané živočíchom, ktoré sú následne ožiarené za použitia vonkajšieho zdroja svetla. Napríklad príklad 5 tohto patentu opisuje subkutánne injektovanie myší nádorovými bunkami P815, ktoré rastú do hmatateľného tumoru. Fotosenzitívne zlúčeniny sú injektované následne a potom sú zvieratá udržované v tme tri hodiny. Pomer prežívajúcich bol u ošetrených zvierat voči neošetrenej kontrole zlepšený. Podobne príklad 8 tohto patentu opisuje použitie rhabdomyosarkómového systému u myší s podobným protokolom. Tieto príklady sú teda zamerané na ošetrenie lokalizovaných pevných tumorov, kde vonkajšie aplikované svetlo je vedené na tumor. V týchto prípadoch nie je cieľové tkanivo obsiahnuté v krvnom prúde, kde ošetrenie musí vylúčiť poškodenie krvných ciev a necielových krvných buniek.
US patent č. 4960408 opisuje ošetrenie obsahov krvného prúdu /HIV vírus a infikované T-bunky/ fotoforézou. Pri tejto technike pacientova krv prechádza mimotelovým prístrojom, v ktorom sa frakcia bielych krviniek vystaví ultrafialovému žiareniu pred tým, než sa biele krvinky vrátia pacientovi.
Benzoporfyrínové deriváty /BPD/, v kombinácii s červeným svetlom /400-900 nm/, boli opísané ako účinné pri odstránení ako voíných vírusov tak aj vírusmi infikovaných buniek z krvných produktov a z plnej krvi odobranej od viremických mačiek. Červené krvinky sa javia ako životaschopné po virucidálnom ošetrení /North a spol., Blood Cells 18:129-40, 1992/.
BPD tiež demonštruje vyššiu afinitu pre tumorové tkanivo, zahrňujúce leukemické bunky, než pre normálne nemaligné bunky /Jamieson a spol., Leukémia Res. 14:209-19, 1990/.
US patent č. 5095030, udelený 10.marca 1992, ktorý je tu zahrnutý ako literárny odkaz, opisuje a nárokuje rôzne činidlá špecifické k rôznym vlnovým dĺžkam, ktoré sú všeobecne nazvané ako zelené porfyríny. Tieto zlúčeniny sú porfyrínové deriváty, ktoré sú modifikované Dielsovou - Alderovou reakciou, ovplyvňujúce posun vlnovej dĺžky absorpcie k dlhšej vlnovej dĺžke. Toto vedie k o niečo lepším vlastnostiam v porovnaní, napríklad s hematoporfyrínovým derivátom, keď tieto zlúčeniny sú používané všeobecne vo fotodynamickej terapii. Ako je opísané v tomto patente, tieto cytotoxické činidlá, ak sú podávané systémovo, sa udomácňujú v nechcených bunkách, predovšetkým v nádorových bunkách alebo patogénnych vírusoch a následné ožiarenie svetlom, ktoré tieto zlúčeniny absorbujú, spôsobí u nich takú premenu, že pôsobia cytotoxicky.
Prihláška v konaní č. 07/832,542 podaná 5. februára 1992 opisuje prípravu lipozómov porfyrínových fotosenzibilátorov.
Podstata vynálezu
Predložený vynález poskytuje spôsob zničenia alebo poškodenia cielových buniek, ktoré selektívne akumulujú fotosenzitívne činidlo, pričom cielové bunky sú v krvnom prúde intaktného živočícha. Krvný prúd a živočích tiež obsahujú necielové bunky. Spôsob zahrňuje transkutánnu aplikáciu ožiarenia aspoň časti intaktného živočícha v intenzite, ktorá je účinná pre poškodenie alebo zničenie selektívne delových buniek a zanecháva necielové bunky relatívne nepoškodené.
V inom uskutočnení je vynález aplikovaný na cielové bunky, ktoré sa rýchle množia v porovnaní s necielovými bunkami. V inom uskutočnení môžu byt cielové bunky leukemické bunky, bunky, obsahujúce vírus, bunky, obsahujúce parazity, baktérie, volné vírusy alebo iné infekčné činidlá v krvi.
Aj keď vynález poskytuje použitie akéhokolvek činidla citlivého na svetlo, výhodne je činidlo vybrané z chlorínov (ako je chlorín e6), bakteriochlorínov, ftalokyanínov, porfyrínov, purpurínov, merokyanínov a prekurzorov liečiv ako je delta-aminolevulová kyselina, ktoré môžu produkovať liečivá ako je protoporfyrín v tkanive. V iných uskutočneniach sú fotosenzitívnymi činidlami BPD-MA a porfimer-sodík.
Predložený vynález predstavuje spôsob zničenia alebo poškodenia krvných delových buniek, ktoré selektívne akumulujú fotosenzitívne činidlo, zatial čo necielové bunky zostávajú relatívne nepoškodené. Spôsob zahrňuje aplikáciu ožiarenia transkutánne aspoň časti intaktného živočícha v intenzite účinnej pre selektívne poškodenie alebo zničenie delových buniek.
Tu použitý výraz cielové bunky zahrňuje tie bunky, ktoré majú byt poškodené alebo zničené týmto spôsobom ošetrenia. Cielové bunky prijímajú fotosenzitívne činidlo. Ak je potom aplikované dostatočné ožiarenie, sú cielové bunky poškodené alebo zničené. Cielovými bunkami môžu byť akékolvek z buniek, nachádzajúcich sa v krvi.Cielové bunky zahrňujú, ale nie sú tým obmedzené, leukemické bunky, bunky, obsahujúce vírus, a bunky, obsahujúce parazity. Medzi cielové bunky patria bunky, ktoré prechádzajú rýchlym delením v porovnaní s necielovými bunkami. Výraz cielové bunky tiež zahrňuje, ale nie je tým obmedzený, mikroorganizmy, ako sú baktérie, vírusy, parazity a iné infekčné činidlá. Výraz cielové bunky tak nie -je obmedzený na žijúce bunky, ale zahrňuje tiež infekčné častice ako sú vírusy.
Necielové bunky sú všetky bunky intaktného živočícha, ktoré nie sú zamýšľané pre to, aby boli poškodené alebo zničené liečebnou metódou. Tieto necielové bunky zahrňujú, ale nie sú tak obmedzené, zdravé krvné bunky, normálne bunky krvného riečiska, podrobené ožiareniu, bunky tkaniva pod alebo nad krvným riečiskom podrobené ožiareniu.
Zničenie tu znamená usmrtenie cielovej bunky. Poškodenie znamená zmenu cielovej bunky takým spôsobom, ktorý sa dotýka jej funkcie. Napríklad North a spol. pozorovali, že po vystavení BPD-ošetrených, vírusom infikovaných T buniek svetlu, sa objavujú v T bunkovej membráne otvory, ktorých velkosť sa zväčšovala, až bola membrána celkom rozložená (Blood Cells 18:129-40, 1992). Cielové bunky prechádzajú poškodením alebo zničením i keď sú cielové bunky okamžite vystavené makrofágom.
Fotosenzitívne činidlo je chemická zlúčenina, ktorá sa usadí v jednom alebo viacerých typoch vybraných cielových buniek a, ak je vystavená ožiareniu, absorbuje svetlo, čím dochádza k poškodeniu alebo deštrukcii cielových buniek.
Vlastne môže byt akákoľvek zlúčenina, ktorá sa usadí vo zvolenom cieli a absorbuje svetlo, použitá v predloženom vynáleze. Výhodne je chemickou zlúčeninou zlúčenina netoxická pre živočícha, ktorému je podávaná, alebo je schopná byt upravená do netoxického prípravku. Výhodne je chemická zlúčenina vo svojej fotodegradovanej forme tiež netoxická. Zoznam takýchto fotosenzitívnych chemikálií je možné nájsť v práci Kreimera-Birnbauma, Sem.Hematoi. 26:157-73, 1989. Fotosenzitívne zlúčeniny zahrňujú, ale nie sú tak obmedzené, chloríny, bakteriochloríny, ftalokyaníny, porfyríny, purpuríny, merokyaníny, psoralény a prekurzory liečiv ako je kyselina delta-aminolevulová, ktoré produkujú liečivá ako je protoporfyrín. Preferované sú benzoporfyrínové deriváty /BPD/ a porfimer-sodík. Najvýhodnejší je benzoporfyrínový derivát monokyselinového kruhu A benzoporphyrine derivative monoacid ring A (BPD-MA).
Ožiarenie, ako je tu uvedené, zahrňuje všetky vlnové dĺžky. Výhodne je vlnová dĺžka ožiarenia vybraná tak, že je to vlnová dĺžka (vlnové dĺžky), ktoré excituje fotosenzitívna zlúčenina. Výhodnejšie je vlnová dĺžka ožiarenia vlnovou dĺžkou pôsobiacou excitáciu fotosenzitívnej zlúčeniny a má malú absorpciu necieľovými bunkami a zbytkom intaktného živočícha, včítane krvných proteínov. Napríklad je preferovanou vlnovou dĺžkou pre BPD-MA rozmedzie 600 až 900 nm.
Ožiarenie je ďalej definované v tomto vynáleze svojou intenzitou, trvaním a načasovaním s ohľadom na dávkovanie fotosenzitívneho činidla. Intenzita musí byť postačujúca pre to, aby ožiarenie penetrovalo kožou a dosiahlo krvné cieľové bunky. Trvanie musí byť postačujúce pre fotoaktiváciu fotosenzitívneho činidla tak, aby pôsobilo v cieľových bunkách. Ako intenzita, tak trvanie musia byt obmedzené, aby sa zabránilo nadmernému ošetreniu živočícha. Načasovanie s ohľadom na dávkovanie fotosenzitívneho činidla je dôležité, pretože 1) podávané fotosenzitívne činidlo vyžaduje určitú dobu pre to, aby sa usadilo v delových bunkách a 2) hladina mnohých fotosenzitívnych činidiel v krvi sa rýchlo znižuje v závislosti na čase.
Tento vynález poskytuje spôsob ošetrenia živočíchov, ktorý zahrňuje, ale nie je tým obmedzený, ludí a iných cicavcov. Výraz cicavce tiež zahrňuje poľnohospodárske zvieratá ako sú kravy, ošípané a ovce, ako aj domácich miláčikov alebo športové zvieratá ako sú kone, psi a mačky.
Intaktným živočíchom je mienené, že celý, nedelený živočích je schopný byt vystavený ožiareniu. Žiadna čast živočícha nie je odstránená pre separátne ožiarenie, na rozdiel od fotoforézy, v ktorej krv cirkuluje mimo jeho tela preto, aby bola vystavená ožiareniu. Celý živočích nemusí byt vystavený ožiareniu. Iba čast intaktného živočícha môže alebo musí byt vystavená ožiareniu. Prakticky povedané, môže byt preferované ožiarenie plôch s krvnými riečiskom tesne pod povrchom pre selektívne ožiarenie.
Transkutánne ako je tu použité, znamená cez kožu /kožou/ živočícha.
Stručne vyjadrené je fotosenzitivne činidlo všeobecne podávané živočíchovi pred tým, než je tento podrobený ožiareniu.
Preferované fotosenzitivne činidlá zahrňujú, ale nie sú tým obmedzené, chloríny, bakteriochloríny, ftalokyaníny, porfyríny, purpuríny, merokyaníny, psoralény a prekurzory liečiv ako je delta-aminolevulová kyselina, ktoré produkujú liečivá ako je protoporfyrín. Preferovanejšie sú benzoporfyrínové deriváty /BPD/ a porfimer-sodík. Najpreferovanejší je benzoporfyrínový derivát monokyselinového kruhu A (BPD-MA).
Fotosenzitivne činidlo je podávané lokálne alebo systémovo. Fotosenzitívne činidlo je podávané orálne alebo injekciou, ktorá môže byt intravenózna, subkutánna, intramuskulárna alebo intraperitoneálna. Fotosenzitívne činidlo tiež môže byt podané enterálne alebo topicky cez náplaste alebo implantáty.
Fotosenzitívne činidlo môže byt syntetizované ako dimér, aby absorbovalo viacej svetla na mólovej báze. Fotosenzitívne činidlo môže tiež byt konjugované ku špecifickým ligandom reagujúcim s cieľom, ako sú receptorové ligandy alebo imunoglobulíny alebo imunošpecifické časti imunoglobulínov, čo im umožňuje, aby boli viac koncentrované v požadovanej cieľovej bunke alebo mikroorganizme. Táto konjugácia môže umožniť zníženie požadovanej dávkovej hladiny, pretože materiál je selektívnejšie cielený a má menšie straty pri distribúcii do iných tkanív, ktorých deštrukciu je nutné vylúčiť.
Fotosenzitívne činidlo môže byt podávané v suchom prípravku, ako sú piluly, kapsle, čapiky alebo náplaste. Fotosenzitívne činidlo tiež môže byť podané v kvapalných prípravkoch, buď samotné s vodou, alebo farmaceutický prijateľnými prísadami, ako sú opísané v Remington s Pharmaceutical Sciences. Kvapalný prípravok môže byt tiež suspenzia alebo emulzia. Najviac sú žiadúce lipozomálne alebo lipofilné prípravky. Ak sú ako suspenzie alebo emulzie, zahrňujú vhodné prísady vodu, salinický roztok, dextrózu, glycerín a podobne. Tieto prípravky môžu obsahovať malé množstvá netoxických pomocných substancií ako sú zmáčacie alebo emulgačné činidlá, antioxidanty, pH pufrovacie činidlá a podobne.
Dávka fotosenzitívneho činidla sa bude meniť s cieľovými bunkami, optimálnou hladinou v krvi a načasovaním ožiarenia. Podľa použitého fotosenzitívneho činidla sa stanoví zodpovedajúca optimálna terapeutická hladina. Výhodne sa dávka vypočíta tak, aby bola dosiahnutá hladina v krvi asi 0,01 až 100 μg/ml. Výhodne bude dávka poskytovať krvnú hladinu medzi asi 0,01 a 10 μg/ml. Ak je fotosenzitívnym činidlom BPD-MA, je krvná hladina výhodne medzi asi 0,01 a 4 μ9/πι1. Výhodnejšie je BPD-MA krvná hladina udržovaná na asi 0,01 až 2 ug/ml.
Intenzita ožiarenia v krvnom prúde je výhodne medzi asi 2 a 150 mW/cm2. Výhodnejšia je intenzita ožiarenia v krvnom prúde medzi asi 15 a 70 mW/cm2.
Doba trvania ožarovania je výhodne medzi asi 0,25 min a 24 hodinami. Výhodnejšie trvá ožarovanie medzi asi 0,25 min a 6 hodinami. Najvýhodnejšie trvá ožarovanie medzi asi 0,25 min a 2 hodinami.
Bez akéhokoľvek obmedzovania teóriou vynálezca predpokladá, že BPD môžu byť v podstate fotoaktivované v krvi v relatívne krátkej dobe a bez nadbytočnej toxicity. Terapeutická voľba sa tak javí byť vymedzená dávkou BPD a dávkou ožiarenia. Tvorba fotodegradačných produktov BPD bola použitá ako indikátor fotoaktivácie. Fotoaktivácia BPD bola postulovaná vyvolaním tvorby radikálového kyslíka, ktorý má cytotoxický účinok. Z hľadiska problémov spojených s buď extrakorporálnym ošetrením krvi alebo s intravenóznou svetelnou aktiváciou pomocou optických vlákien, sa javí uvedené ožiarenie celého tela v lôžku červeného svetla u pacientov injektovaných BPD ako atraktívne riešenie pre liečbu infekčných činidiel v krvi.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1A predstavuje spektrum svetla dodávaného zo svetelného zdroja, a obr. IB predstavuje spektrum svetla, ktoré aktivuje BPD.
Obr. 2 predstavuje koncentráciu BPD v myšej plazme v rôznych časoch po injekcii lipozomálneho BPD v dávke 20 μg/myέ (0,9 mg/kg).
Obr. 3 predstavuje koncentráciu BPD v myšej plazme v rôznych časoch po injekcii lipozomálneho BPD v dávke 20 μ9/ηψέ (0,9 mg/kg) na myš vystavenú svetlu a kontrolnú myš udržovanú v tme.
Obr. 4 predstavuje in vitro fotodegradáciu BPD /1 ug/ml) v myšej krvi vystavenej svetlu počas rôznej doby.
Obr. 5 predstavuje percentuálne grafické vyjadrenie BPD fotodegradovaného v myšej krvi in vivo a in vitro vystavením svetlu v porovnaní s nevystavenou krvou.
Obr. 6 je grafickým znázornením ^g/ml) BPD fotodegradovaného v myšej krvi vystavenej červenému svetlu /600 až 900 nm/ in vitro a in vivo /ožiarenie celého tela/ v porovnaní s nevystavenou krvou.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklady, ktoré nasledujú, sú mienené ako dokladujúce účinnosť vynálezu a pre priblíženie praktického uskutočnenia vynálezu. Nasledujúce príklady uvádzajú jedno z fotosenzitívnych činidiel a poskytujú prostriedky pre vyhľadávanie iných fotosenzitívnych činidiel alebo nových zlúčenín pre použitie v spôsobe podía vynálezu. Nasledujúce príklady sú mienené iba ako príklady a v žiadnom prípade predložený vynález nijako neobmedzujú.
Všeobecná poznámka
Nasledujúce všeobecné poznámky, týkajúce sa materiálov a postupov, sú aplikované v príkladoch 1 až 4, pokiaí nie je uvedené inak.
Materiály
BPD-MA bol syntetizovaný ako je opísané v US patente č.
4,920,143 a 4,883,790. BPD-MA bol získaný od QuadraLogic Technologies, Inc. a uchovávaný rozpustený v DMSO /4,5 mg/ml/ pri -70 ’C. Lipozomálny BPD /4,95 mg/ml/ bol pripravený ako je opísané v US patentovej prihláške č. 07/832542, podanej 5.februára 1992.
Bolo použité nasledujúce zloženie:
Zložka Množstvo
BPD-MA 4,95
dimyristoyl-fosfatidyl cholín 23,27
vaječný fosfatidyl glycerol 16,09
laktóza alebo trehalóza 148,50
askorbylpalmitát 0,05
butylovaný hydroxytoluén 0,005
voda pre injekcie q.s.
Lipozomálny BPD bol sušený a uchovávaný zmrazený pri -20 ’C po 1 ml podieloch. Vhodný počet podielov bol roztopený bezprostredne pred použitím a zriedený 5 % dextrózou vo vode pre injekcie pre živočíchy.
V týchto pokusoch boli použití samci myší Balb/c /7-11 týždňov starí, Charles River, Kanada/, pokial nie je uvedené inak. Myši Balb/c boli zvolené pre tieto štúdie, pretože nemajú na svojej koži pigment. Oholenie a depilačné odstránenie chlpov je veľmi účinné po celom tele s výnimkou hlavy. Potom sa koža myší javí ako transparentná. Vnútorné orgány, predovšetkým tmavočervené orgány ako sú pečeň a slezina, sú kožou viditeľné. Myši boli oholené a zbavené chĺpkov komerčne dostupným depilátorom /NeetR alebo NairR/ 5 dní pred tým, než boli použité v týchto experimentoch. Kontrolné myši, injekto11 vané BPD, ale nevystavené svetlu, neboli oholené. Po injekcii boli myši udržované v tme počas rôzne dlhej doby, ako je uvedené ďalej.Pred a po pokusoch boli myši udržované v ustajnení s 12 hodinami svetla a 12 hodinami tmy. Po pokusoch, za účelom zníženia množstva svetla, dopadajúceho na myš, boli ich klietky umiestnené čo najnižšie a prikryté hliníkovou fóliou.
Svetelný box bol vyrobený v dielňach University of British Columbia. Bol zložený z dvoch vrstiev 14 75 W reflektorov volfrám-halogén /General Electric/, ktoré osvetľujú ošetrovanú plochu zhora a zospodu. Svetlo bolo filtrované 1/ sadou filtrov, obsahujúcich žlté a červené plastové fólie, ktoré absorbujú väčšinu svetla s vlnovými dĺžkami kratšími než 600 nm a 2/ 15 mm silnými vodnými filtrami, ktoré absorbujú svetlo nad 900 nm. Chladenie bolo uskutočňované trvalým prietokom studenej vody vo vodných filtroch a usporiadaním 5 ventilátorov. Svetelná intenzita bola meraná na prístroji IL 1350 Photometer /International Light/.
Svetelné spektrum dodávané zo svetelného boxu je uvedené na obr. 1. Pre porovnanie je absorpčné spektrum BPD uvedené na obr. 1B. Zhruba 1/3 dodávaného svetla bola v rozsahu spektra, aktivujúceho BPD.
Intenzita svetla dodávaného vrchnými a spodnými sadami žiaroviek nebola jednotná. Spodná časť dodávala 33 až 40 mW/cm2 merané v hladine podlahy ožarovanej komôrky, zatial čo o
horná sada dodávala 27 až 33 mW/cm merané na povrchu kože chrbáta zvierat. Uvedený rozsah vznikol z nekonzistentného ovplyvňovania v horizontálnej rovine ožarovania. Navyše sa myši pohybujú počas ožarovania svetlom, takže rôzne časti ich tela sú ožarované rôznymi dávkami svetla. Preto dávky dodávané na povrch kože myší musia byť aproximované a výpočty boli založené na intenzite 30 mW/cm2.
Postupy
Krvné testy:
Krv bola odobraná do striekačiek, obsahujúcich 50 μΐ heparínu /1000 jednotiek/ml salinického roztoku/. Krvné vzorky /0,45 ml/ od najmenej 1 myši na časový bod, boli zaslané do diagnostického laboratória University Hospital, University of British Columbia, na analýzu pomocou Coulter Counter. Krvná morfológia bola stanovená na krvných filmoch pripravených zo zvolených vzoriek laborantom.
Stanovenie koncentrácie BPD v plazme:
Vzorky plazmy boli získané odstredením krvi odobranej myšiam a boli uložené zmrazené na -20 °C do použitia. Koncentrácia BPD vo vzorkách bola stanovená fluorometricky s použitím spektrofluorometra Jasco Model FP-77 /Japan Spectroscopic Co./ a mikrokyvety /Far UV Quartz Celí, Starna Cells Inc./. Excitačné a emisné vlnové dĺžky sú 439 a 699 nm. Vzorky plazmy boli zriedené 20 násobne s PBS obsahujúcim 1% TritonuR X-100 bezprostredne pred stanovením fluorescencie. BPD štandardy boli pripravené v 5% myšej plazme v PBS s 1% Tritonu R X-100. Za týchto podmienok bol vzťah medzi koncentráciou BPD a jednotkami fluorescencie lineárny /korelačný koeficient > 0,99/ pre koncentrácie medzi 0,1 ng/ml a 1 μg/ml. Hranica stanovenia bola pod 0,1 ng/ml vzorky, čo zodpovedá 2 ng/ml plazmy. Maximálna plazmová autofluorescencia bola pozorovaná pri 520 nm. 699 nm fluorescenčný pík BPD bol vlastne zbavený akejkoívek interferencie.
Príklad 1
Testy fotosenzitivity kože
Šesť Balb/c myší /22+1 g hmotnosť/ bolo pripravených ako je opísané vyššie. Päť myší bolo dvakrát injektovaných /24 hodinový interval/ BPD z DMSO zásobného roztoku /nelipozomálny BPD/ a vystavených svetlu po dobu 1 hodiny po injekcii. Jedna myš nebola injektovaná, ale bola vystavená svetlu /kontrola - iba svetlo/. Počas prvého ošetrenia boli myši injektované 15 μg BPD/myš v 200 μΐ PBS. Počas druhého ošetrenia boli myši injektované 20 μg BPD/myš /0,9 mg/kg/. Jedna myš bola použitá ako kontrola v oboch ošetreniach.
Ihneď po injekcii /v oboch prípadoch/ boli zvieratá udržované 1 hodinu vo tme a potom boli umiestnené do individuálnych plastových kontajnerov /9x4x5 cm/, ktoré boli umiestnené vo svetelnom boxe a vystavené svetlu. Jednotlivo boli myši odstraňované zo svetelného boxu v rôznych intervaloch: 15, 30, 45, 60 a 75 min. Svetelné dávky dodané na povrch kože boli 27, 54,81, 108 a 135 J/cm2.V druhom prípade boli použité rovnaké svetelné dávky, avšak myši, ktoré dostali vyššie svetelné dávky prvý deň, dostali nižšie dávky druhý deň. Kontrolná myš bola vystavená svetlu po dobu 60 min v oboch prípadoch. Výsledky sú zhrnuté v tabulke 1. Počas vystavenia svetlu boli myši nepretržite pozorované z hladiska prejavov nepohodlia alebo svrbenia. Po druhom vystavení svetlu bola u myší pozorovaná denne po dobu 2 týždňov pokožka a správanie sa.
Dva týždne po ošetrení boli získané vzorky krvi srdečnou punktúrou pri anestézii halotanom. Potom boli myši usmrtené a bola uskutočnená autopsia. Ich slezina, pečeň a ladviny boli zvážené.
BPD-injektované myši dostali všetky dávky svetla /27, o
54, 81, 108 a 135 J/cm / a opakované ošetrenie taktiež. Oba dni ošetrenia sa chovali normálne za svetla, bez známok nepohodlia, s výnimkou občasného škrabania sa, ktoré mohlo byť spôsobené pôsobením liečiva na kožu. Neboli pozorované žiadne velké zmeny na myšej koži ani ihneď po vystavení alebo počas nasledujúcej dvojtýždennej periódy. Neboli takisto pozorované žiadne zmeny v správaní sa. S prekvapením myš, ktorá vykazovala známky nepohodlia vo forme otáčania a škrabania sa, bola myš zo svetelnej kontroly. Preto bolaudržovaná iba 60 min na svetle /nie 75 min ako bolo pôvodne zamýšľané/.
Počet myší bol príliš malý pre urobenie definitívnych záverov pokiaľ ide o vplyv liečby na vnútorné orgány ako sú pečeň, slezina a ľadviny, predsa však v testovanej skupine, ktorá bola skúšaná 2 týždne po dvojitom ošetrení, boli morfológia rastu a hmotnosti normálne.Hmotnosť celého tela a zodpovedajúce hmotnosti orgánov sú uvedené v tabulke 2.
Tabulka 3 predstavuje parametre myšej krvi dva týždne po ošetrení, zahrňujúce počet bielych krviniek /WBC/, počet červených krviniek /RBC/, hemoglobín /HB/, hematokryt /Het/, priemerný korpuskulárny objem /MCV/ a počet doštičiek /PLT/. Morfológia červených krviniek, stanovená 2 týždne po ošetrení, je uvedená v tabulke 4. Všetky hodnoty sú v normálnom rozsahu. Agregácia doštičiek bola pričítaná o niečo nižšiemu počtu doštičiek a vyššiemu počtu WBC.
Tabulka 1
Deň 1 (15 μg/myš Deň 2 (20 μg/myš 0.9 mg/kg)
0.68 mg/kg)
Myš BPD Svetlo BPD Svetlo
č. mg/kg J/cm^ mg/kg J/cm^
1 0,75 27 1,0 135
2 0,71 54 0,95 108
3 0,71 81 0,95 81
4 0,63 108 0,87 54
5 0,71 135 0,95 27
6 0 108 0 108
Tabuľka 2
Hmotnosť (g)
Myš celková hmotnosť pečeň slezina ľadviny
22 1,105 0,077 0,172(1)
23 1,190 0,106 0,343
Liek + 24 1,208 0,094 0,380
svetlo 25 1,348 0,108 0,396
Iba 21 0,958 0,078 0,310
Svetlo 22 1,125 0,05 0,371
Tabuľka 3
Myš č. WBC 106/ml RBC 109/ml HB g/i Het MCV fl PLT 106/ml
1 4,0 7,11 122 0,352 49,5 328
2 14,7* 7,76 126 0,382 49,2 274
3 8,2 7,46 124 0,365 48,9 119
4 7,6 7,65 123 0,364 47,6 438
5** 2,9 6,47 108 0,316 48,8 134
6*** 5,3 5,97 109 0,297 49,8 388
* k tomuto číslu môže byť priradená . doštičková agregácia
** krv bola zriedená dvojnásobným objemom heparínu *** kontrola - iba svetlo
Tabulka 4 % WBC
Myš č. granulocyty lymfocyty monocyty
1 9 90 1
2 11 88 1
3 19 78 3
4 36 62 2
5 7 92 1
normálny (rozsah) 12-15 65-85 N/A
Príklad 2
Farmakokinetické (PK) štúdie
Za účelom stanovenia hladiny BPD v plazme počas ošetrenia svetlom, bol uskutočnený nasledujúci pokus. Štrnásť myší Balb/c (22 ± 1 g hmotnosti) bolo injektovaných lipozomálnym
BPD v dávke 20 μg/myš /0,9 mg/kg/ v 200 μΐ PBS na myš. Vzorky krvi boli získané srdečnou punktúrou v rôznych časových intervaloch medzi 15 min a 2 hodinami po injekcii. Vystavenie svetlu začalo 15 min po injekcii u niektorých myší. BPD koncentrácia v plazme bola stanovená ako je opísané vyššie. Výsledky sú zhrnuté v tabulke 5 a obr. 2.
Tieto údaje boli použité pre test účinnosti načasovania vystavenia svetlu. 2 hodiny po injekcii tj. v dobe zodpovedáp júcej koncu 1 hodiny vystavenia svetlu /108 J/cm / v prvom príklade, bola hladina BPD v plazme 2,44 μg/ml. Na začiatku vystavenia svetlu v rovnakom príklade bola hladina BPD asi 4 μg/ml. Pre ďalšie hodnotenie fotosenzitivity v týchto níz17 kých hladinách boli myši vystavené svetlu v čo najkratšej dobe po injekcii, tj. asi po 15 min, keď hladina BPD v plazme bola 6,32 pg/nil. Avšak myši, ktoré boli vystavené svetlu po 15 min boli väčšinou nespokojné a uhynuli po 30 min od vystavenia /54 J/cm2/. Toto naznačuje, že počiatočná hladina BPD v plazme asi 6,5 μ9/πι1 a svetelné vystavenie asi 50 J/cm2 ožiarením celého tela boli pre myši letálne. Predsa však ako je demonštrované v príklade 1, ak sú hladiny v plazme nižšie, je rovnaká svetelná dávka zrejme neškodná.
Tabuľka 5
Myš Dávka BPD Doba po injekcii Kone.v
č. mg/kg μg/ml
1 0,87 15 min 6,32
2 0,83 20 min 4,68
3 0,95 1 h 23 min 3,26
4 0,91 1 h 24 min 2,92
5 0,91 1 h 32 min 2,98
6 0,87 1 h 38 min 1,80
7 0,87 1 h 42 min 3,22
8 0,83 2 h 5 min 2,44
Príklad 3
Transkutánna aktivácia BPD
Štrnásť myší bolo použitých (hmotnost 22 ± 1 g) v tejto štúdii. Dvanásť myší bolo injektovaných 20 μg /0,9 mg/kg/ lipozomálneho BPD /v 200 μΐ/ a udržovaných v tme 1 hodinu pred vystavením svetlu. Každá myš bola vystavená svetlu na 30 min, 1 h alebo 1,5 hodiny, ktoré dodávalo svetelné dávky na povrch kože 54, 108 a 162 J/cm2. Ihneď po vystavení svetlu boli odobrané vzorky krvi. V zodpovedajúcich časoch boli odobrané vzorky krvi od dvoch myší injektovaných BPD, ale nevystavených svetlu. Dve ďalšie myši boli testované jednu hodinu po injekcii.
Cielom tejto štúdie bolo stanoviť svetelnú penetráciu do tkanív pre aktiváciu BPD. Bolo zistené, že podstatná fotodegradácia BPD v krvi by mala predstavovať podstatnú aktiváciu BPD.
Koncentrácia BPD v plazme potom bola stanovená fluorescenčné. Koncentrácia nezmeneného BPD v plazme vystavenej a nevystavenej kontrolnej myši boli porovnané. Výsledky /tabulka 6 a obr. 3/ ukazujú, že 36 až 76 % BPD bolo fotodegran dovaných svetelnými davkami 54 až 162 J/cm. Takýto rozsah fotodegradácie naznačuje, že svetlo dostatočne penetruje tkanivom a aktivuje a tým degraduje BPD v krvných cievach. Dôležité je, že tieto vystavenia svetlu a dávkam liečiva nespôsobujú citlivosť kože na svetlo, čo potvrdzuje bezpečnosť zistenú v príklade 1. Naviac neboli pozorované žiadne akútne vplyvy na krvné parametre /tabulka 7/.
Tabuíka 6
Skupina Svetelná dávka J/cm2 Doba po injekcii BPD v plazme pg/ml Priemer +SD Fotodegra
dácia (%) BPD
1,428
0 h - C 0 1 h 1,058 1,243 + 0,262 -
30 min 0,618
- C 0 1,5 h 1,242 0,930 + 0,441 -
0,646
1 h - C 0 2 h 1,242 0,944 + 0,421 -
1,5 h 0,724
- C 0 2,5 h 0,656 0,690 + 0,048 -
0,566
30 min 54 1,5 h 0,626 0,596 + 0,042 36
0,258
1 h 108 2 h 0,344 0,301 + 0,061 68
0,191
1,5 h 162 2,5 h 0,145 0,168 + 0,033 76
Tabuľka 7
BPD mg/kg Svetlo J/cm2 Doba po injekcii Krvné parametre
WBC 10°/ml RBC 109/ml HB g/1 Het MCV fl PLT 10°/ml
0 0 - 4,5 6,58 113 0,326 49,5 417
0 0 - 2,3 7,53 127 0,370 49,1 399
0 0 - 6,0 7,61 132 0,378 49,7 498
0 0 - 7,3 7,64 133 0,382 50,0 613
0,87 0 lh 5,5 7,61 124 0,368 48,4 608
0,87 0 1,5 h 4,4 6,77 117 0,329 48,7 428
0,93 0 2 h 11,4 7,79 129 0,382 49,1 475
0,87 0 2,5 h 3,9 7,68 129 0,372 48,5 447
0,95 54 1,5 h 7,0 7,28 127 0,363 49,9 613
0,95 108 2 h 8,5 7,53 131 0,378 50,1 440
0,93 162 2,5 h 4,9 7,17 116 0,353 49,2 506
Údaje získané v tomto príklade boli porovnané s údajmi, ktoré boli predtým publikované v štúdiách /Photochem. Photobiol.(1991)53/ po prepočte svetelnej dozimetrie na rovnaký fotometer, ktorý bol použitý v predloženej štúdii. V predtým publikovaných štúdiách boli myši DBA/2 /oholené a zbavené chlpov/ injektované 4 mg/kg a boli vystavené lokálne 153 J/cm2 širokospektrálneho svetla /intenzita 170 mW/cm2/ 3 hodiny po injekcii. Extrapoláciou z obr.2 bol získaný výsledok maxima koncentrácie v plazme po 3 hodinách /začiatok 30 min od vystavenia svetlu/ 2,987+0,312 /SD/ μg/ml. Výsledkom je, že i ked neboli pozorované ihneď po vystavení na koži žiadne zmeny,počas prvých 24 hodín po vystavení, sa u myší vyvinulo niekoíko kožných nekróz, ktoré sa rozvíjali počas 96 hodín a nasledovala perióda uzdravovania. Prípadné rany sa zahojili a znovu narástli chlpy.
V predloženej štúdii koncentrácie BPD v plazme na začiatku vystavenia svetlu boli nad 3 μ9/ιη1 a ešte nebola pozorovaná žiadna zmena na koži ani bezprostredne ani počas 2 týždňov po vystavení. Rozdiely medzi predchádzajúcimi a súčasnými štúdiami zahrňujú 1/vyššiu maximálnu koncentráciu v plazme vďaka vyššej dávke BPD /4 mg/kg oproti 0,9 mg/kg/, 2/ dlhšiu dobu medzi injekciou a vystavením svetlu /3 hodiny oproti 1 hodine/, čo umožňuje akumuláciu BPD v koži /BPD sa zjavne akumuluje v koži až do 5 hodín/ a 3/ vyššiu intenzitu svetla (170 mW/cm2 oproti 30 mW/cm2). Tieto hodnoty potvrdzujú, že všetky tieto faktory musia byť zahrnuté v definícii terapeutického okna pre ožiarenie celého tela.
Príklad 4
In vitro aktivácia BPD v myšej krvi
Za účelom vyhodnotenia množstva svetla penetrujúceho tkanivami, boli uskutočnené in vitro pokusy s myšou krvou.Bol použitý rovnaký svetelný zdroj, preto bolo spektrum svetla rovnaké. Svetelné dávky boli v tomto pokuse zvolené tak, že napodobňovali dávky v pokusoch in vivo.
Lipozomálny BPD bol pridaný k čerstvo získanej heparinizovanej myšej krvi tak, aby bola dosiahnutá koncentrácia 1 μς/ιηΐ, a potom boli odobrané podiely 0,85 μΐ do Petriho misiek s priemerom 35 mm. Misky boli umiestnené do svetelného boxu a vystavené červenému svetlu. Misky boli ožarované vo svetelnom boxe iba zdola. Tri rôzne svetelné dávky, s vystavením 30 min, Íha 1,5 h, boli 63, 126 a 189 J/cm2. Duplikáty misiek boli prikryté hliníkovou fóliou. Ihneď po svetelnom vystavení bola krv z misiek odobraná. Potom bola plazma oddelená odstredením. Kontrolné nevystavené vzorky boli spracované v rovnakých časoch ako vzorky vystavené svetlu.
Koncentrácia BPD v plazme oddelenej z krvi vystavenej svetlu a krvi nevystavenej, bola stanovená fluorescenciou. Výsledky sú uvedené v tabulke 8 a na obr. 4. Asi 51 až 83 % BPD bolo degradovaných v rozmedzí použitej svetelnej dávky.
Rozsah fotodegradácie in vitro BPD bol porovnaný s in vivo degradáciou pre vyhodnotenie množstva svetla aktuálne penetrujúceho tkanivami a dosahujúceho BPD v krvnom riečisku. Ak množstvá forodegradovaného BPD v oboch pokusoch sú vyjadrené ako percentá degradácie vo vzťahu k množstvu nezmeneného BPD prítomného v plazme za neprítomnosti svetla, sú percentá stanovené in vitro a in vivo relatívne rovnaké /tabuľka 9, obr. 5/. Avšak ak sa množstvo degradovaného BPD vyjadrí ako μ9 fotodegradovaného BPD na ml plazmy, porovnaním sa zistí, že asi 65 % svetelnej dávky dodanej na povrch kože in vivo dosiahlo aktuálne BPD v krvnom riečisku /tabuľka 9, obr. 6/.
Tabuľka 8
Čas Svetelná dávka J/cm2 BPD dávka ^g/ml Fotodegradovaný BPD %
• 0 h 0 0,760 -
0,5 h 0 0,806 -
• 0,5 h 63 0,394 51 %
1 h 0 0,810 -
1 h 126 0,220 73 %
1,5 h 0 0,830 -
1,5 h 189 0,144 83 %
Tabuľka 9
IN VITRO IN VIVO
Svetlo (J/cm2) Fotode- gradá- cia % Dávka úg/ml Svetlo (J/cm2) Fotode- gradá- cia % Dávka μg/ml
63 51 0,412 54 36 0,334
126 73 0,590 108 68 0,643 (?)
189 83 0,686 162 76 0,522
Za účelom stanovenia hladiny BPD v plazme počas ošetrenia svetlom, bol uskutočnený nasledujúci pokus.
Výsledky predchádzajúcich pokusov naznačujú, že je tu terapeutické okno pre aktiváciu BPD v krvi prostredníctvom ožiarenia celého tela. Po vystavení myší červenému svetlu /600 až 900 nm/ po dobu 1 hodiny po injekcii BPD v dávke 0,9 mg/kg, v rozmedzí svetelnej dávky medzi 27 až 135 J/cm2 /intenzita svetla na úrovni kože bola asi 30 mW/cm2), nevykazovala myš žiadne znaky citlivosti kože na svetlo počas dvoch týždňov po ošetrení. Naviac nebola detegovaná žiadna toxicita počas pokusu u pečene, sleziny a ľadvín, alebo zmeny krvných parametrov ako bolo stanovené 2 týždne po ošetrení. Približné • hladiny v plazme počas vystavenia svetlu boli medzi 2,5 a 4 μ9/ιη1.
Najvyššia koncentrácia BPD v plazme /6,3 ug/ml ihneď po podaní) v kombinácii s 54 J/cm svetla bola pre myš smrteľná. Vystavenie svetlu in vivo vedie ku 36 až 76 % fotodegradácii BPD v krvi. Porovnanie s in vitro fotodegradáciou BPD v myšej krvi indikuje, že približne 65 % dávky dodanej na povrch kože penetruje myším tkanivom a dosahuje BPD v krvnom riečisku. Porovnanie týchto údajov s predtým publikovanými štúdiami indikuje, že fotosenzitivita kože je determinovaná maximálnou koncentráciou v plazme, dobou vystavenia svetlu vzhľadom k injekcii a intenzitou svetla.
Príklad 5
Dospelé samce DBA/2 a Balb/c myší boli injektované intravenózne P815 a L1210 bunkami, preinkubovanými po 1 h s BPD /lipozomálnou/ v dávke 100 ng/ml. Bezprostredne pred injekci, ou bol do striekačky, obsahujúcej bunky pridaný ďalší BPD v množstve 2 ug. Koncentrácia potom je 1 μg BPD/ml myšej plazmy bezprostredne po injekcii /súčet celkového objemu myšej krvi je asi 2 ml/. Jedna skupina myší /oholená a zbavená chlpov/ bola vystavená ihneď červenému svetlu /600 až 900 nm/ vo svetelnom boxe po dobu 1,5 hodiny /162 J/cm2/, ďalšia skupina bola udržovaná v tme ako kontrola.
Ihneď po vystavení svetlu boli odobrané krvné vzorky srdečnou punkciou za halotanovej anestézy. Koncentrácia BPD v plazme svetlu vystavených a kontrolných myší bola stanovená fluorescenciou. Počet klonogénnych tumorových buniek v myšej krvi bol stanovený kultiváciou krvných vzoriek v kultivačnom médiu doplnenom s 10 % hovädzieho séra, za použitia protokolu obmedzeného riedenia. Po ošetrení boli myši ako z kontrolnej tak aj ošetrenej skupiny pozorované ' z hladiska zmien na koži a celkového správania sa po dobu dvoch týždňov. Výsledky sú zhrnuté v tabulke 10 a 11.
Tabulka 10
Balb/c myši injektované L1210 bunkami hodina s BPD lipozómami
BPD koncentrácia v plazme
Ošetrenie ng/ml
9.
kontrola v tme vystavené svetlu
126,45
52,23
100 % %
Percentá fotodegradácie %
Prežívajúce bunky v krvi/priemer 3 myši/skupina/: kontrola v tme: 234 L1210 bunky /2 ml krvi/myš vystavené svetlu: 21 L1210 bunky/2 ml krvi/myš
Tabulka 11
DBA/2 myši injektované P815 bunkami
BPD v plazme
Ošetrenie ng/ml %
Kontrola v tme 94,09 100 %
Vystavené svetlu 58,14 62 %
Percentá fotodegradácie 38 %
Prežívajúce bunky v krvi/priemer 3 myši/skupina/: kontrola v tme: 50 P 815 bunky /2 ml krvi/myš vystavené svetlu: 8 P815 bunky/2 ml krvi/myš
Výsledky z predchádzajúcich príkladov ukazujú, že ak sa celé telo vystaví červenému svetlu, po injekcii BPD, spôsobí aktiváciu BPD v krvi. Výsledkom je, že čast BPD je fotodegradovaná a súčasne bol zničený velký počet BPD zatažených tumorových buniek. Po ošetrení nebola pozorovaná ani citlivosť na svetlo u pokožky ani zmena v chovaní zvierat /maximálna doba pozorovania bola 2 týždne/. Výsledky naznačujú existenciu terapeutického okna, kde je možná terapeutická kontrola v krvi obsiahnutých infekčných činidiel, bez poškodenie krvného riečiska a kože.
Predložený vynález bol opísaný v opise a príkladoch. Ako je uvedené vyššie, sú príklady mienené iba ako príklady a v žiadnom smere predložený vynález nijako neobmedzujú. Ďalej odborník po preštudovaní opisu a nárokov, ktoré nasledujú, bude schopný posúdit skutočnost, že v rozsahu nárokov sú možné ekvivalenty. Prípadné ekvivalenty riešenia spadajú taktiež do rozsahu predloženého vynálezu.

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY l
    1. Spôsob zničenia alebo poškodenia cieľových buniek> ktoré selektívne akumulujú fotoaktívne činidlo, kde cieľové bunky sú v krvnom prúde intaktného živočícha, pričom krvný prúd a živočích ďalej obsahujú necieľové bunky, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje transkutánne ožiarenie aspoň časti uvedeného intaktného živočícha intenzitou účinnou pre poškodenie alebo zničenie selektívne cieľových buniek, ponechanie necieľových buniek relatívne nepoškodených, a tým zničenie alebo poškodenie uvedených cieľových buniek.
  2. 2. Spôsob zničenia alebo poškodenia cieľových buniek v krvi živočícha, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje a/ podanie fotoaktívneho činidla v dávke takej, že uvedené cieľové bunky selektívne akumulujú uvedené činidlo a b/ ožiarenie aspoň časti uvedeného živočícha svetlom s intenzitou účinnou pre zničenie alebo poškodenie selektívne cieľových buniek, zatiaľ čo ostatné bunky zostávajú relatívne nepoškodené, a tým zničenie alebo poškodenie uvedených cieľových buniek .
  3. 3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedené cieľové bunky sú aktivované bunky, ktoré sa rýchlo delia v porovnaní s necieľovými bunkami, alebo sú to bunky, obsahujúce vírus, bunky, obsahujúce parazity alebo mikroorganizmy a/alebo kde uvedeným fotoaktivačným činidlom je chlorín, bakteriochlorín, ftalokyanín, porfyrín, purpurín, merokyanín alebo psoralén.
  4. 4. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že chlorinom je chlorín e6, porfyrinom je BPD alebo porfimer-sodík a/alebo cieľovými bunkami sú leukemické bunky.
  5. 5. Spôsob podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že BPD je BPD-MA.
  6. 6. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňje podanie prekurzoru liečiva intaktnému živočíchovi, kde tento prekurzor liečiva sa premieňa na fotoaktívne činidlo v živočíchovi.
  7. 7. Spôsob podlá nároku 6, vyznačujúci sa tým, že prekurzorom liečiva je kyselina delta-aminolevulová.
  8. 8. Spôsob podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že živočíchom je cicavec.
  9. 9. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je človek.
  10. 10. Spôsob podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že fotoaktívne činidlo má koncentráciu v krvnom prúde 0,01 až 4 pg/ml a/alebo kde intenzita ožiarenia v krvnom prúde je 15 až 100 mW/cm2.
  11. 11. Spôsob zničenia alebo poškodenia cieľových buniek v krvi živočícha, obsahujúcej uvedené cielové bunky a necielové bunky, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje a/ kontakt krvi s fotoaktívnym činidlom tak, že uvedené cieíové bunky selektívne akumulujú fotoaktívne činidlo a b/ ožiarenie krvi cez kutánnu vrstvu svetlom s intenzitou účinnou pre poškodenie alebo zničenie selektívne cieíových buniek, zatiaí čo ostatné bunky zostávajú relatívne nepoškodené, čím sa zničia alebo poškodia uvedené cieíové bunky.
  12. 12. Spôsob podía nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedené cieíové bunky sú aktivované bunky, ktoré sa rýchlo delia v porovnaní s necieíovými bunkami, alebo sú to bunky, obsahujúce vírus, bunky obsahujúce parazity alebo mikroorganizmy a/alebo kde uvedeným fotoaktivačným činidlom je chlorín, bakteriochlorín, ftalokyanín, porfyrín, purpurín, merokyanín alebo psoralén.
  13. 13. Spôsob podía nároku 12, vyznačujúci sa tým,, že chlorínom je chlorín e6, porfyrínom je BPD alebo porfimer-sodík a/alebo cieíovými bunkami sú leukemické bunky.
  14. 14. Spôsob podía nároku 13, vyznačujúci sa tým, že BPD je BPD-MA.
  15. 15. Spôsob podía ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14, vyznačujúci sa tým, že fotoaktívne činidlo má koncentráciu v krvi 0,01 až 4 p-g/ml a/alebo kde intenzita ožiarenia v krvi je 15 až 100 mW/cm^.
  16. 16. Použitie fotoaktívneho činidla pre prípravu liečiva pre použitie pri kontakte krvi živočícha s uvedeným liečivom tak, že cielové bunky obsiahnuté v krvi uvedeného živočícha selektívne akumulujú fotoaktívne činidlo a ožiarením krvi cez kutánnu vrstvu svetlom s intenzitou účinnou pre poškodenie alebo zničenie selektívne cielových buniek, zatial čo ostatné bunky sú ponechané relatívne nepoškodené .
  17. 17. Použitie podlá nároku 16, kde uvedeným fotoaktivačným činidlom je chlorín, bakteriochlorín, ftalokyanín, porfyrín, purpurín, merokyanín alebo psoralén.
  18. 18. Použitie podlá nároku 17, kde chlorínom je chlorín e6, porfyrínom je BPD alebo porfimer-sodík.
  19. 19. Použitie podlá nároku 18, kde BPD je BPD-MA.
  20. 20. Prípravok pre použitie v spôsobe zničenia alebo poškodenia cielových buniek v krvi živočícha, obsahujúcej uvedené cielové bunky a necielové bunky, kde tento spôsob zahrňuje a/ kontakt krvi s fotoaktívnym činidlom tak, že uvedené cielové bunky selektívne akumulujú fotoaktívne činidlo a b/ ožiarenie uvedenej krvi cez kutánnu vrstvu svetlom s intenzitou účinnou pre poškodenie alebo zničenie selektívne cielových buniek, zatial čo ostatné bunky zostávajú relatívne nepoškodené, kde prípravkom je fotoaktívne činidlo.
  21. 21. Prípravok podľa nároku 20, kde uvedeným fotoaktivačným činidlom je chlorín, bakteriochlorín, ftalokyanín, porfyrín, purpurín, merokyanín alebo psoralén.
  22. 22. Prípravok podľa nároku 20, kde chlorínom je chlorín e6, porfyrínom je BPD alebo porfimer-sodík.
  23. 23. Prípravok podľa nároku 20,kde BPD je BPD-MA.
SK352-95A 1992-09-21 1993-09-20 Method of transcutaneous in vivo activation of photosensitive agents in blood SK35295A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94811392A 1992-09-21 1992-09-21
PCT/CA1993/000382 WO1994006424A1 (en) 1992-09-21 1993-09-20 Transcutaneous in vivo activation of photosensitive agents in blood

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK35295A3 true SK35295A3 (en) 1996-05-08

Family

ID=25487290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK352-95A SK35295A3 (en) 1992-09-21 1993-09-20 Method of transcutaneous in vivo activation of photosensitive agents in blood

Country Status (21)

Country Link
US (2) US5484803A (sk)
EP (1) EP0660712B1 (sk)
JP (2) JP3598306B2 (sk)
AT (1) ATE201596T1 (sk)
AU (1) AU681088B2 (sk)
CA (1) CA2144327C (sk)
DE (1) DE69330277T2 (sk)
DK (1) DK0660712T3 (sk)
ES (1) ES2160600T3 (sk)
FI (1) FI951295A (sk)
GR (1) GR3036479T3 (sk)
HU (1) HU220251B (sk)
IL (1) IL107035A (sk)
NO (1) NO951066L (sk)
NZ (1) NZ255302A (sk)
PL (1) PL308116A1 (sk)
PT (1) PT660712E (sk)
SK (1) SK35295A3 (sk)
TW (1) TW241204B (sk)
WO (1) WO1994006424A1 (sk)
ZA (1) ZA936968B (sk)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5955490A (en) * 1989-07-28 1999-09-21 Queen's University At Kingston Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
US20020058008A1 (en) * 1989-07-28 2002-05-16 Kennedy James C. Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
US6710066B2 (en) * 1989-07-28 2004-03-23 Queen's University At Kingston Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
US5798238A (en) * 1990-04-16 1998-08-25 Baxter International Inc. Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants with quinolines as photosensitizer
US5587490A (en) * 1990-04-16 1996-12-24 Credit Managers Association Of California Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants
US20040110819A1 (en) * 1991-10-28 2004-06-10 Queen's University At Kingston Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
DE69334009T2 (de) * 1992-11-20 2006-11-23 The University Of British Columbia, Vancouver Verfahren zur Aktivierung von photoempfindlichen Mitteln
WO1996039188A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 Queen's University At Kingston Photochemotherapeutic method using 5-aminolevulinic acid and other precursors of endogenous porphyrins
US6008211A (en) * 1995-07-27 1999-12-28 Pdt Pharmaceuticals, Inc. Photoactivatable compounds comprising benzochlorin and furocoumarin
EP0881874B1 (en) * 1995-11-06 2003-04-02 New York Blood Center, Inc. Viral inactivation treatment of red blood cells using phthalocyanines and red light
US5895786A (en) * 1996-05-08 1999-04-20 New York Blood Center, Inc. Method for treating viral infections
US6159733A (en) * 1996-06-20 2000-12-12 New York Blood Center, Inc. Method for photoinactivating malignant cells
US5922278A (en) † 1996-11-19 1999-07-13 Baxter International Inc. Method and apparatus for inactivating contaminants in biological fluid
US5742380A (en) * 1996-12-31 1998-04-21 Ronn Avigdor M Plasma assay spectrometer
US6010890A (en) * 1997-04-29 2000-01-04 New York Blood Center, Inc. Method for viral inactivation and compositions for use in same
US6103706A (en) * 1997-04-29 2000-08-15 New York Blood Center, Inc. Methods for treating viral infections
US5856566A (en) 1997-09-02 1999-01-05 Dusa Pharmaceuticals, Inc. Sterilized 5-aminolevulinic acid
US6159178A (en) 1998-01-23 2000-12-12 Heartport, Inc. Methods and devices for occluding the ascending aorta and maintaining circulation of oxygenated blood in the patient when the patient's heart is arrested
US6096066A (en) * 1998-09-11 2000-08-01 Light Sciences Limited Partnership Conformal patch for administering light therapy to subcutaneous tumors
US6183773B1 (en) 1999-01-04 2001-02-06 The General Hospital Corporation Targeting of sebaceous follicles as a treatment of sebaceous gland disorders
US6602274B1 (en) * 1999-01-15 2003-08-05 Light Sciences Corporation Targeted transcutaneous cancer therapy
AU2412800A (en) * 1999-01-15 2000-08-01 Light Sciences Corporation Noninvasive vascular therapy
CA2358662A1 (en) * 1999-01-15 2000-07-20 James Chen Therapeutic compositions for metabolic bone disorders or bone metastases
US6454789B1 (en) * 1999-01-15 2002-09-24 Light Science Corporation Patient portable device for photodynamic therapy
US6376483B1 (en) 1999-05-27 2002-04-23 Miravant Pharmaceuticals, Inc. Bacteriochlorins and bacteriopurpurins useful as photoselective compounds for photodynamic therapy and a process for their production
US20030114434A1 (en) * 1999-08-31 2003-06-19 James Chen Extended duration light activated cancer therapy
DE19960705A1 (de) * 1999-12-16 2001-06-21 Laser & Med Tech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung eines autologen Immunisierungsimpfstoffes gegen Krebserkrankungen (Tumorvakzine)
US7897140B2 (en) 1999-12-23 2011-03-01 Health Research, Inc. Multi DTPA conjugated tetrapyrollic compounds for phototherapeutic contrast agents
US7166719B2 (en) 2002-06-27 2007-01-23 Health Research, Inc. Fluorinated photosensitizers related to chlorins and bacteriochlorins for photodynamic therapy
JP2003519670A (ja) * 2000-01-12 2003-06-24 ライト サイエンシーズ コーポレイション 眼疾患の新規処置
KR100365151B1 (ko) * 2000-05-08 2003-02-11 김형락 어류 병원성 세균과 바이러스의 감염 예방 및 치료를 위한δ-아미노레불린산의 신규한 용도
DE10034673C1 (de) 2000-07-17 2002-04-25 Medac Klinische Spezialpraep Dermales Applikationssystem für Aminolävulinsäure und seine Verwendung
EP2248536A3 (en) 2000-12-14 2010-12-08 The General Hospital Corporation doing business as Massachusetts General Hospital Topical Aminolevulinic acid-photodynamic therapy for acne vulgaris
DE60141758D1 (en) 2000-08-16 2010-05-20 Gen Hospital Corp Topische aminolevulinsäure-photodynamische therapie für akne vulgaris
WO2002100326A2 (en) * 2001-05-01 2002-12-19 The General Hospital Corporation Photoimmunotherapies for cancer using photosensitizer immunoconjugates and combination therapies
DE60219627T2 (de) * 2001-06-04 2008-02-07 The General Hospital Corp., Boston Nachweis und therapie von empfindlichem plaque mit photodynamischen verbindungen
DE10162712A1 (de) * 2001-12-19 2003-07-17 Blutspendienst Der Landesverba Verfahren zur Inaktivierung von Bakterien und Leukozyten in Blut oder Blutprodukten
CA2473924A1 (en) * 2002-01-23 2003-07-31 Light Sciences Corporation Systems and methods for photodynamic therapy
AU2003249742A1 (en) 2002-07-02 2004-01-23 Health Research, Inc. Efficient synthesis of pyropheophorbide a and its derivatives
US7659301B2 (en) * 2003-04-15 2010-02-09 The General Hospital Corporation Methods and devices for epithelial protection during photodynamic therapy
US7220778B2 (en) * 2003-04-15 2007-05-22 The General Hospital Corporation Methods and devices for epithelial protection during photodynamic therapy
WO2004099375A2 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 The General Hospital Corporation Indirectly linked photosensitizer immunoconjugates, processes for the production thereof and methods of use therof
EP1633337A4 (en) * 2003-05-29 2007-09-05 Mitos Pharmaceuticals Inc METHODS OF USING NITROXIDES IN CONJUNCTION WITH PHOTOSENSITIZERS AND SENOSENSITIZERS
FR2857264A1 (fr) * 2003-07-09 2005-01-14 Maco Pharma Sa Procede d'inactivation photodynamique des pathogenes au moyen d'ala
GB0424833D0 (en) 2004-11-10 2004-12-15 Photocure Asa Method
US8585707B2 (en) 2006-06-07 2013-11-19 Gary S. Rogers Continuous low irradiance photodynamic therapy method
US20080164224A1 (en) * 2007-01-04 2008-07-10 Whirlpool Corporation System for connecting mechnically dissimilar consumer electronic devices to an adaptor or a host
CA2724949A1 (en) 2007-06-27 2008-12-31 The General Hospital Corporation Method and apparatus for optical inhibition of photodynamic therapy
US20090062724A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Rixen Chen System and apparatus for sonodynamic therapy
US8835104B2 (en) * 2007-12-20 2014-09-16 Fenwal, Inc. Medium and methods for the storage of platelets
JP2014518547A (ja) 2011-04-07 2014-07-31 フェンウォール、インコーポレイテッド 削減された残存血漿容積を有する血小板濃縮物を提供するための自動化方法とシステムおよびそのような血小板濃縮物のための貯蔵媒体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4649151A (en) * 1982-09-27 1987-03-10 Health Research, Inc. Drugs comprising porphyrins
US5095030A (en) * 1987-01-20 1992-03-10 University Of British Columbia Wavelength-specific cytotoxic agents
US4961920A (en) * 1988-12-08 1990-10-09 Luminis Pty, Ltd. Phototherapeutic monovinyl and divinyl ether-linked dimers
US4960408A (en) * 1989-01-10 1990-10-02 Klainer Albert S Treatment methods and vaccines for stimulating an immunological response against retroviruses

Also Published As

Publication number Publication date
ATE201596T1 (de) 2001-06-15
HUT70966A (en) 1995-11-28
FI951295A (fi) 1995-05-17
JP3598306B2 (ja) 2004-12-08
NO951066D0 (no) 1995-03-20
DK0660712T3 (da) 2001-08-27
PT660712E (pt) 2001-11-30
EP0660712A1 (en) 1995-07-05
AU681088B2 (en) 1997-08-21
NO951066L (no) 1995-05-19
HU220251B (hu) 2001-11-28
CA2144327C (en) 2002-08-06
TW241204B (sk) 1995-02-21
EP0660712B1 (en) 2001-05-30
DE69330277T2 (de) 2002-04-18
AU4940593A (en) 1994-04-12
CA2144327A1 (en) 1994-03-31
ZA936968B (en) 1994-04-12
JP2001316288A (ja) 2001-11-13
JPH08501301A (ja) 1996-02-13
IL107035A0 (en) 1993-12-28
PL308116A1 (en) 1995-07-24
WO1994006424A1 (en) 1994-03-31
US5736563A (en) 1998-04-07
ES2160600T3 (es) 2001-11-16
FI951295A0 (fi) 1995-03-20
GR3036479T3 (en) 2001-11-30
DE69330277D1 (de) 2001-07-05
NZ255302A (en) 2001-04-27
IL107035A (en) 1998-12-27
US5484803A (en) 1996-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0660712B1 (en) Transcutaneous in vivo activation of photosensitive agents in blood
EP0947222B1 (en) Method of activating photosensitive agents
RU2166331C2 (ru) Фотодинамическая терапия для селективной инактивации клеток в крови и для лечения заболеваний с иммунной дисфункцией
US6984655B1 (en) Photodynamic therapy for selectively closing neovasa in eyeground tissue
WO1990012573A1 (en) Bacteriochlorophyll-a derivatives useful in photodynamic therapy
JP3174821B2 (ja) 血液中の選択的な細胞不活性化用医薬組成物
AU2001229674A1 (en) Local drug delivery using photosensitizer-mediated and electromagnetic radiation-enhanced vascular permeability
EP1251828A1 (en) Local drug delivery using photosensitizer-mediated and electromagnetic radiation-enhanced vascular permeability
CA2270558C (en) Treatment of autoimmune diseases by photochemotherapy
US5015478A (en) Porphycene anti-cancer agents and treatment methods
Chopp et al. Photodynamic therapy of normal cerebral tissue in the cat: a noninvasive model for cerebrovascular thrombosis
US20020115649A1 (en) Use of texaphyrins in macrophage-mediated disease
AU4860899A (en) Use of texaphyrins in macrophage-mediated disease
JPS61240970A (ja) 悪性腫瘍抑制方法