DE60219627T2 - Nachweis und therapie von empfindlichem plaque mit photodynamischen verbindungen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion und Therapie von dünnkappigen Fibro-Atheromen („empfindliche Plaques") unter Verwendung selektiv abgezielter photodynamischer Verbindungen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Vorrichtungen zur Verwendung bei der Detektion und Therapie empfindlicher Plaques.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Kardiovaskuläre Erkrankung ist nach wie vor die führende Krankheits- und Todesursache in den Vereinigten Staaten. Ein Hauptbeitragender zur Pathologie dieser Erkrankung ist die Ausbildung arteriosklerotischer oder „atheromatöser" Plaques in den Koronararterien (Farb et al. (1995) Circulation 92:1701-1709). Jedoch reduzieren oder verhindern Therapien, die zur Milderung der verstopfenden Wirkungen atheromatöser Plaques auf den koronaren Blutfluss konzipiert wurden, wie etwa die Bypass-Chirurgie der Koronararterien und die perkutane transluminale Koronar-Angioplastie, nicht das Auftreten von akutem Koronarsyndrom. Das „akute Koronarsyndrom” deckt eine Gruppe von Koronarerkrankungen mit plötzlichem Eintreten ab, einschließlich instabiler Angina, akutem Myocardinfarkt und plötzlichem Herztod. Das auslösende Agens des akuten Koronarsyndroms ist die Spaltung (Fissur), Erosion oder der Bruch (Ruptur) einer spezifischen Art von atheromatösem Plaque, die als „empfindlicher Plaque" bekannt ist. Empfindliche Plaques sind verantwortlich für die Mehrzahl der Herzattacken, Schlaganfälle und Fälle von Blitztod.
  • Die nach dem Tode vorliegenden Anzeichen deuten darauf hin, dass der Bruch von empfindlichen Plaques in Regionen der Koronararterien erfolgt, die weniger als etwa 50% Stenose zeigen. Daher führen Angioplastie und Bypass-Prozeduren, die an Arterien mit starker Stenose durchgeführt werden, selten zur Entfernung empfindlicher Plaques oder zur Reduzierung des Auftretens von akutem Koronarsyndrom (Plutzky (1999) Am J Cardiol 84:15J-20J). Selbst mit den derzeit verfügbaren therapeutischen Ansätzen, wie etwa Lipidsenkung, Angioplastie und Bypass verbleibt eine inakzeptabel hohe Häufigkeit von akutem Koronarsyndrom (Sacks et al. (2000) Circulation 102:1893-1900).
  • Atheromatöse Plaques umfassen charakteristischer Weise eine fibröse („faserige") Kappe, die einen zentralen Kern aus extrazellulären Lipiden und partikulären Ablagerungen, die im zentralen Teil der verdickten Gefäßintima befindlich sind – bekannt als „Atherom" – umgibt. Auf der Lumenseite des Lipidkerns ist die fibröse Kappe hauptsächlich aus Bindegeweben zusammen gesetzt, typischerweise aus einer dichten, fibrösen extrazellulären Matrix, die aufgebaut ist aus Collagenen, Elastinen, Proteoglykanen und anderen extrazellulären Matrixmaterialien. An den Rändern der fibrösen Kappe, die über dem Lipidkern liegt, befindet sich die Schulterregion, die mit Makrophagen angereichert ist. Die Makrophagen nehmen kontinuierlich durch Phagozytose oxidierte LDL über Scavenger-Rezeptoren auf, die eine hohe Ligandenspezifität für oxidiertes LDL besitzen. Die fortgesetzte Phagozytose resultiert in der Bildung von Schaumzellen, einem Kennzeichen des arteriosklerotischen Plaque (Parthasarathy et al. (1992) Annu Rev Med 43: 219-225). Schaumzellen, zusammen mit der Bindung extrazellulärer Lipide an Collagenfasern und Proteoglykane, spielen eine wichtige Rolle bei der Ausbildung und dem Wachstum des lipidreichen Atheroms.
  • Die histopathologische Untersuchung atheromatöser Plaques hat wesentliche Variationen bei der Dicke der fibrösen Kappen, der Größe der Atherome, dem Ausmaß der dystrophischen Calcifizierung und dem relativen Beitrag wesentlicher Zelltypen offen gelegt (van der Wal et al. (1994) Coron Artery Dis 5:463-469). Ortsansässige Zellen, die in atheromatösen Plaques vorhanden sind, beinhalten eine signifikante Population entzündungsbezogener Zellen, wie etwa Monozyten/Makrophagen und T-Lymphozyten. Die Emigration von Monozyten in die Arterienwand und ihre nachfolgende Differenzierung zu Makrophagen und schließlich zu Schaumzellen bleibt einer der frühesten Schritte der Plaque-Bildung. Sobald dieses Stadium erreicht ist, spielen diese Zellen eine entscheidende Rolle beim Sekretieren von Substanzen, die weiter zur Arteriosklerose beitragen.
  • Ein empfindlicher Plaque ist strukturell und funktionell unterscheidbar von einem stabilen atheromatösen Plaque. Beispielsweise unterscheiden mehrere histologische Merkmale einen empfindlichen Plaque von einem stabilen atheromatösen Plaque. Ein empfindlicher Plaque ist gekennzeichnet durch ein überreiches Vorkommen an Entzündungszellen (z.B. Makrophagen und/oder T-Zellen), einen großen Lipidpool und eine dünne fibröse Kappe. Ein atheromatöser Plaque bezieht sich auf ein weites Spektrum von Koronarläsionen, von subtilen Ansammlungen von Lipid bis hin zu verstopfenden Koronarläsionen, die Angina auslösen.
  • Im Gegensatz zu empfindlichen Plaques liegt die große Mehrzahl atheromatöser Plaques ruhig vor. Nur die seltene atheromatöse Läsion verursacht Herzattacken oder Schlaganfälle. Krankheitsstudien haben weitere Erkenntnis darüber bereitgestellt, warum empfindliche Plaques eine höhere Neigung zum Bruch aufweisen als andere atheromatöse Plaques. Die Dicke und Integrität der fibrösen Kappe, die über dem lipidreichen Kern liegt, ist ein Hauptfaktor für die Stabilität des Plaques. Empfindliche Plaques, die eine Neigung zum Bruch haben, können so charakterisiert werden, dass sie dünnere fibröse Bereiche, eine erhöhte Anzahl an Entzündungszellen (z.B. Makrophagen und T-Zellen) sowie eine relative Knappheit an glatten Gefäßmuskelzellen besitzen. Glatte Gefäßmuskelzellen sind die Hauptquelle der Produktion extrazellulärer Matrix, und somit trägt die Abwesenheit glatter Gefäßmuskelzellen bei einem empfindlichen Plaque zum Fehlen der Dichte von dessen fibröser Kappe bei.
  • Während das fibröse Gewebe innerhalb der Kappe dem Plaque strukturelle Integrität verleiht, so ist das Innere des Atheroms weich, schwach und hochgradig thromboseauslosend. Es ist reich an extrazellulären Lipiden und weitgehend frei von lebenden Zellen, jedoch umsäumt von einem Rand an Lipid-beladenen Makrophagen (van der Wal et al., (1999) Cardiovasc Res 41: 334-344). Der Lipidkern stellt eine hochgradig thrombogene Zusammensetzung dar und ist reich an Gewebefaktor („tissue factor"), der eines der stärksten bekannten Prokoagulantien ist. Die an der Läsion beteiligten Makrophagen und Schaumzellen produzieren eine Vielzahl an koagulationsfördernden Substanzen, einschließlich Gewebefaktor. Die fibröse Kappe ist die einzige Barriere, die den Blutkreislauf von dem Lipidkern und dessen kraftvollem Koagulationssystem, das dafür prädestiniert ist, einen Thrombus zu erzeugen, trennt. Im Wesentlichen führt die schnelle Freisetzung von Prokoagulantien in den Blutstrom an der Stelle des Bruchs zur Ausbildung eines verstopfenden Gerinnsels, was das akute Koronarsyndrom auslöst. Das heißt, je dünner die fibröse Kappe, umso größer ist die Instabilität des thrombogenen Lipidkerns und umso größer ist die Neigung zu Bruch und Thrombose.
  • Mehrere Faktoren können zu dem geschwächten Zustand der fibrösen Kappe beitragen. Insbesondere hat die Inhibition der Produktion extrazellulärer Matrix oder der Abbau von Komponenten der extrazellulären Matrix eine nachteilige Auswirkung auf die strukturelle Zusammensetzung der fibrösen Kappe. Makrophagen und T-Lymphozyten sind als die dominanten Zelltypen an der Stelle des Plaque-Bruchs oder der oberflächlichen Erosion identifiziert worden, und jede dieser Entzündungszellen trägt zu den inhibitorischen und/oder abbauenden Stoffwechselwegen bei. Ein beschleunigter Abbau von Collagen und anderen Matrix-Komponenten erfolgt durch die Proteasen der Makrophagen, wie etwa Matrixmetalloproteinasen („MMPs"), die an der Stelle des Plaques sekretiert werden. Die MMPs stellen eine ausgedehnte Familie von Enzymen dar, einschließlich interstitieller Collagenase (z.B. MMP-1), Gelatinasen (z.B. MMP-2, MMP-9) und Stromelysin (z.B. MMP-3). Stromelysine können andere Mitglieder der MMP-Familie aktivieren, was einen Abbau bei vielen Matrixbestandteilen verursacht. Die Gegenwart von T-Zellen in dem Plaque kann weiterhin zur Schwächung der fibrösen Kappe beitragen. Aktivierte T-Zellen produzieren und sekretieren Interferon-γ, einen wirkungsstarken Inhibitor der Collagensynthese. Somit stellen die T-Lymphozyten eine potentiell große Quelle von Interferon-γ bereit, die die Matrix-Produktion negativ regulieren kann. Stellen des Brechens von Plaques sind weiterhin gekennzeichnet durch die Expression von Genen des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes (z.B. humanes Lymphozyten-Antigen DR auf Entzündungszellen und benachbarten glatten Muskelzellen), was eine aktive entzündliche Reaktion anzeigt, die die fibröse Kappe ebenfalls schwächt.
  • Derzeitige Verfahren der Plaque-Detektion, von denen mehrere hier diskutiert werden, sind ungeeignet für die Identifizierung empfindlicher Plaques. Gebräuchliche Verfahren der Plaque-Detektion beinhalten Angiographie und Angioskopie. Abgesehen von seltenen Umständen liefert die Angiographie nahezu keine Informationen über die Merkmale der Plaque-Komponenten. Angiographie ist nur sensitiv genug, hämodynamisch signifikante Läsionen zu detektieren (>70% Stenose), die für etwa 33% der Fälle des akuten Koronarsyndroms verantwortlich sind. Angioskopie ist eine Technik, die auf der Faseroptik-Übertragung von sichtbarem Licht basiert, die ein kleines Sichtfeld mit relativ niedriger Auflösung für die Sichtbarmachung innerer Oberflächen von Plaques und Thromben bereitstellt. Da die angioskopische Sichtbarmachung auf die Oberfache der Plaque beschränkt ist, ist sie unzureichend zur Verwendung bei der Detektion empfindlicher Plaques.
  • Mehrere Verfahren werden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, empfindliche Plaques zu identifizieren. Jedoch hat sich keines als hinreichend empfindlich erwiesen. Ein derartiges Verfahren, der intravaskuläre Ultraschall („IVUS"), verwendet miniaturisierte Kristalle, die an Katheterspitzen eingebaut sind, und liefert in Echtzeit aufgenommene Querschnitts- und Längsbilder hoher Auflösung der Arterienwand mit dreidimensionalen Rekonstruktionsmöglichkeiten. IVUS kann dünne Kappen detektieren und Regionen mittlerer Dichte (z.B. die Intima, die reich an glatten Muskelzellen und Fasergewebe ist) von echoarmen Regionen unterscheiden, jedoch bestimmt die derzeitige Technologie nicht, welche echoarmen Regionen eher aus Cholesterolpools als aus thrombotischen oder hämorrhagischen Strukturen oder einigen Kombinationen hiervon bestehen. Darüber hinaus unterscheidet die räumliche Auflösung (d.h. ca. 200 mm) nicht die mäßig verdünnte Kappe von der Hochrisikokappe (d.h. ca. 25-75 mm), und große dichte Calciumablagerungen erzeugen akustische Echos, die „Schatten erzeugen", sodass tiefere Plaques nicht abgebildet werden.
  • Die intravaskuläre Thermographie basiert auf der Prämisse, dass Plaques mit dichter Makrophagen-Infiltration mehr Wärme abgeben als nicht entzündete Plaques (Casscells et al. (1996) Lancet. 347:1447-1451). Die Temperatur der Plaques steht in umgekehrter Korrelation zur Kappendicke. Jedoch kann die Thermographie keine Informationen über erodierte, jedoch nicht entzündete empfindliche Läsionen liefern.
  • Die optische Kohärenztomographie („OCT") misst die Intensität von reflektiertem Nah-Infrarotlicht von Gewebe. Sie liefert Bilder mit hoher Auflösung, die etwa 10- bis 20-mal größer ist als die Auflösung von IVUS. OCT wird primär für die Bestimmung der Morphologie arteriosklerotischer Plaques verwendet. Jedoch machen die lange Dauer der Bildaufnahme, die hohen Kosten, die begrenzte Durchdringung und ein Fehlen physiologischer Daten diesen Ansatz unerstrebenswert für die Detektion empfindlicher Plaques.
  • Die Raman-Spektroskopie nutzt den Raman-Effekt: ein grundlegendes Prinzip der Photonen-Spektroskopie, die nach ihrem Erfinder benannt ist. Der Raman-Effekt entsteht, wenn ein einfallendes Licht Moleküle in einer Probe anregt, die das Licht nachfolgend streuen. Obwohl das meiste dieses gestreuten Lichts auf derselben Wellenlänge liegt wie das einfallende Licht, wird etwas davon bei einer abweichenden Wellenlänge gestreut. Diese Verschiebung der Wellenlänge des gestreuten Lichts wird als Ramanverschiebung bezeichnet. Das Ausmaß der Wellenlängenverschiebung und die Intensität hängen ab von der Größe, Form und der Stärke des Moleküls. Jedes Molekül besitzt seine eigene eindeutige „Fingerabdruck"-Ramanverschiebung. Die Raman-Spektroskopie ist eine sehr empfindliche Technik und ist befähigt, eine genaue Messung chemischer Verbindungen als Ergebnis auszugeben. Begreiflicher Weise kann das Verhältnis von Lipid zu Proteinen, wie etwa Collagen und Elastin, dabei helfen, empfindliche Plaques mit großen Lipidpools zu detektieren. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass empfindliche Plaques allein aufgrund dieses Verhältnisses verlässlich von stabilen Plaques unterschieden werden können.
  • Die „photodynamische Therapie" („PDT") nutzt photoaktivierbare Verbindungen, die als Photosensibilisatoren bekannt sind, um selektiv auf Zellen abzuzielen und diese zu zerstören. Die Therapie beinhaltet die Zufuhr von sichtbarem Licht der geeigneten Wellenlänge, um die Photosensibilisator-Moleküle auf einen angeregten Singulett-Zustand anzuregen. Dieser angeregte Zustand kann dann einen im System stattfindenden Übertritt auf den mit geringfügig niedrigerer Energie versehenen Triplett-Zustand ausführen, der dann durch einen oder beide von zwei Wegen weiterreagieren kann, die als Typ I- und Typ II-Photoprozesse bekannt sind (Ochsner (1997) J Photochem Photobiol B 39:1-18). Der Typ I-Weg beinhaltet Elektronen-Transfer-Reaktionen von dem Photosensibilisator-Triplett, um Radikalionen zu produzieren, die dann mit Sauerstoff reagieren können, um zytotoxische Spezies zu produzieren, wie etwa Superoxid-, Hydroxyl- und von Lipiden abgeleitete Radikale. Der Typ II-Weg beinhaltet die Energieübertragung von dem Photosensibilisator-Triplett auf molekularen Sauerstoff im Grundzustand (Triplett), um Singulett-Sauerstoff im angeregten Zustand zu erzeugen, der dann viele biologische Moleküle, wie etwa Proteine, Nukleinsäuren und Lipide, oxidieren kann und zu Zytotoxizität führt.
  • Die photodynamische Therapie (PDT) hat jüngst die behördliche Zulassung in den Vereinigten Staaten für die Behandlung von Speiseröhrenkrebs und in anderen Ländern für mehrere andere Arten von Krebs erhalten (Dougherty et al., (1998) J Natl Cancer Inst 90:889-905). Bestimmte Photosensibilisatoren akkumulieren bevorzugt in malignen Geweben (Hamblin & Newman (1994) J Photochem Photobiol B 23:3-8), was den Vorteil einer doppelten Selektivität erbringt; der Photosensibilisator ist somit nicht nur in idealer Weise spezifisch für das Zielgewebe, sondern das Licht kann auch akkurat dem Zielgewebe zugeführt werden, wodurch die Region eingegrenzt wird, in der die toxischen Wirkungen des Photosensibilisators freigesetzt werden.
  • Die photodynamische Therapie ist in der kardiovaskulären Medizin für zwei breite Indikationen angewendet worden: die Behandlung von Arteriosklerose („Photoangioplastie") und die Inhibition von Restenose aufgrund von Intima-Hyperplasie nach vaskulären Interventionen (Rockson et al. (2000) Circulation 102:591-596, US-Patente Nr. 5,116,864 , 5,298,018 , 5,308,861 , 5,422,362 , 5,834,503 und 6,054,449 ). Hämatoporphyrin-Derivat („HpD") war der erste aus einer Reihe von Photosensibilisatoren mit demonstrierbarer selektiver Akkumulation in atheromatösen Plaques (Litvack et al. (1985) Am J Cardiol 56:667-671). Nachfolgende Studien haben die Affinität von Porphyrinderivaten für atheromatöse Plaques bei Kaninchen und Zwergschweinen zu gering bewertet. Es gibt eine maximale Akkumulation des Photosensibilisators in den arteriellen intimalen Oberflächenschichten, was im Vergleich zu den arteriellen Medien abgeschwächt wird. Sowohl HpD als auch Photofrin, ein stärker gereinigtes Derivat von HpD, zeigen auch in vitro eine bevorzugte Aufnahme durch humane atheromatöse Plaques. Jedoch besteht im Allgemeinen ein relativer Mangel an Selektivität der meisten Photosensibilisatoren für atheromatöse Plaques und spezifischer für empfindliche Plaques. Darüber hinaus scheitern in der Technik bekannte Verfahren zur photodynamischen Zerstörung arteriosklerotischer Plaques im allgemeinen als Ergebnis der entzündlichen Antwort, die auf die PDT folgt.
  • In jüngerer Zeit sind interventionistische Strategien, die zur Stabilisierung empfindlicher Plaque führen, zu einem aktiven Forschungsgebiet geworden (Rabbani & Topol (1999) Cardiovasc Res 41:402-417). Eine photodynamische Therapie, die dafür konzipiert ist, um empfindliche Plaques zu detektieren, zu stabilisieren, und um empfindliche Plaques ohne Auslösen einer Entzündungsantwort zu reduzieren oder zu eliminieren, wäre demnach hochgradig erstrebenswert.
  • Aufgabe und Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, um die PDT selektiv auf die Entzündungskomponenten empfindlicher Plaques abzuzielen, wie etwa auf Entzündungszellen, Proteasen und Lipide. Als solche stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Identifizierung empfindlicher Plaques bereit. Die photochemischen Verfahren der vorliegenden Erfindung unterscheiden vorteilhafter Weise stabile atheromatöse Läsionen von empfindlichen Plaques. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, um empfindliche Plaques durch selektives Abzielen auf und selektives Eliminieren von Entzündungskomponenten empfindlicher Plaques zu behandeln. Sobald ein empfindlicher Plaque durch Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, können weitere Verfahren angewendet werden, um den Plaque gegen Bruch zu stabilisieren, während zusätzlich spezifische Populationen von Zellen (z.B. von Entzündungszellen, wie etwa Makrophagen und T-Zellen) reduziert werden, oder wobei andere Komponenten (z.B. Lipide und Proteasen) in oder um den Plaque reduziert werden, wodurch die allgemeine Größe und der Schweregrad des Plaques reduziert werden.
  • Bei einem Aspekt der Erfindung können photodynamische Zusammensetzungen selektiv auf Entzündungskomponenten in oder um den empfindlichen Plaque (z.B. Makrophagen, T-Zellen, Lipide und Proteasen) abgezielt werden. Bei einer Ausführungsform werden photodynamische Zusammensetzungen auf Makrophagen abgezielt, um die Sekretion von Proteasen zu reduzieren oder zu eliminieren. Die Reduzierung oder Eliminierung der Proteaseaktivität steigert massiv die Stabilität der fibrösen Kappe und damit des empfindlichen Plaques. Bei wiederum einer anderen Ausführungsform werden die photodynamischen Zusammensetzungen auf T-Zellen abgezielt, um die Sekretion von Faktoren zu eliminieren oder zu reduzieren, die die Produktion extrazellulärer Matrix reduzieren oder inhibieren, wie etwa von Interferon-γ. Es wird eine sorgfältig kontrollierte Applikation von PDT verabreicht, um bei den Zielzellen apoptotischen Zelltod zu induzieren. Vorteilhafter Weise können die Parameter der PDT, einschließlich Licht-Dosimetrie und der Menge der photodynamischen Verbindung, kontrolliert werden, um nur eine Apoptose und keine Nekrose der Zielzellen zu induzieren. Ein Induzieren von Apoptose anstatt von Nekrose reduziert oder eliminiert die Entzündungsantwort nach der PDT und verstärkt die allgemeine therapeutische Wirkung.
  • Bei wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Anwendung der PDT auf empfindliche Plaques eine Vernetzung von Proteinen der extrazellulären Matrix induzieren (z.B. von Collagen), um die fibröse Kappe weiter gegen Bruch zu stabilisieren. Vorteilhafter Weise können die Parameter der PDT, einschließlich der subzellulären Lokalisierung der photodynamischen Verbindungen, kontrolliert werden, um die Clusterbildung der photodynamischen Verbindungen an der Zelloberfläche zu optimieren. Unter diesen Bedingungen induziert die PDT eine Zelloberflachen-Vernetzung und keine Zellnekrose, was die Entzündungsantwort reduziert oder eliminiert.
  • Bei wiederum einem weiteren Aspekt kann die Photoaktivierung unter Verwendung einer speziell konzipierten intravaskulären Vorrichtung durchgeführt werden, die Anregungslicht an die Plaque-Oberfläche im Inneren der Arterie abgibt und die emittierte Fluoreszenz empfängt, die an ein Analyseinstrument weitergeleitet wird. Dieselbe Vorrichtung kann optional dafür verwendet werden, um therapeutisches Licht zu übertragen, wenn ein Fluoreszenzsignal detektiert wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A zeigt ein Detektions-/Behandlungssystem zum Detektieren von und/oder Abzielen auf und/oder Behandeln von empfindlichen Plaques in Übereinstimmung mit einer Ausführungs form der Erfindung. 1B ist ein Diagramm, das eine Anordnung der Kontrolleinheit aus 1A zeigt.
  • Die 2A und 2B sind Diagramme, die eine Sonde/einen Katheter gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigen. Die 2C und 2D sind Diagramme, die alternative Ansichten der 2A bzw. 2B zeigen. Die 2E und 2F zeigen eine Sonde/einen Katheter gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
  • Die 3A, 3B und 3C sind Diagramme, die eine Sonde/einen Katheter gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zeigen.
  • Die 4A und 4B zeigen eine Sonde/einen Katheter gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
  • Die 5A und 5B sind Diagramme, die ein Lichtzufuhrelement und ein Lichtablenkelement gemäß entsprechenden Ausführungsformen der Erfindung zeigen.
  • Die 6A, 6B und 6C zeigen eine Sonde/einen Katheter gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • 7 zeigt das Schema zur Herstellung von Chlorin e6-Photosensibilisator-Konjugaten.
  • 8 zeigt BSA-ce6, das aus nicht umgesetztem ce6-NHS-Ester unter Verwendung einer Sephadex G50-Säule und Aceton-Präzipitation gereinigt wurde (8A: Dünnschichtchromatographie; 8B: SDS-PAGE-Gel, sichtbar gemacht mittels Fluoreszenz (links) und Coomassie-Färbung (rechts) vor der Aceton-Präzipitation; 8C: SOS-PAGE-Gel, sichtbar gemacht durch Fluoreszenz (links) und Coomassie-Färbung (rechts) nach der Aceton-Präzipitation).
  • 9 zeigt die UV-sichtbaren Absorptionsspektren der gereinigten mal-BSA-ce6-Konjugate, sowie von freiem ce6.
  • 10 zeigt die selektive Zielsteuerung und Phototoxizität von maleylierten BSA-ce6-Konjugaten.
  • 11 zeigt einen optischen Mehrkanal-Analysator, der für die Fluoreszenzlokalisierung in ex vivo-Aorten verwendet wird.
  • 12 zeigt eine Analyse von Aortenteilstücken von Kaninchen, die eine Injektion mit oder ohne Konjugate erhalten haben, und zwar etwa 24 Stunden nach der Injektion des Konjugats (Reihe 1: Konfokalfluoreszenz, Rot = Chlorin-e6, Grün = elastische Lamina, Autofluoreszenz; Reihe 2: Fluoreszenzemissionsspektren der intimalen Oberfläche von Aortensegmenten ex vivo; Reihe 3: Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Aortensegmenten; Reihe 4: Verhoefsche Färbung von elastischem Gewebe). Spalte 1 zeigt ein arteriosklerotisches Kaninchen ohne die Injektion von Konjugat. Spalte 2 zeigt ein normales, nicht-arteriosklerotisches Kaninchen, dem Konjugat injiziert wurde. Spalte 3 zeigt ein arteriosklerotisches Kaninchen, dem Konjugat injiziert wurde.
  • 13 zeigt ein signifikantes Fluoreszenzsignal von der intimalen Oberfläche (bestimmt durch „Haut-Scan") bei allen Teilstücken der arteriosklerotischen Kaninchen im Vergleich zu den entsprechenden Teilstücken der Aorta bei normalen Kaninchen, denen Konjugat injiziert wurde (Oben: 1 = thorakale Aorta, 2 = obere abdominale Aorta unterhalb des Zwerchfells, 3 = mittlere abdominale Aorta, 4 = untere abdominale Aorta, 5 = Becken-Aorta genau oberhalb der Gabelung; Mitte: Messung der intimalen Oberflächenfluoreszenz, erstellt durch OMA-LIF-System; Unten: Daten aus der Extraktion von Gewebegroßproben).
  • 14 zeigt den Unterschied zwischen einem großen Aortenplaque und einer Region der abdominalen Aorta 5 mm unterhalb des Plaques (14A), zwischen der Ballon-verletzten Ileum-Arterie und der contralateralen Normalarterie im selben Kaninchen (146), und zwischen der Plaque-beladenen Aorta eines arteriosklerotischen Kaninchens und derselben Region der Aorta bei einem normalen Kaninchen (14C).
  • 15 zeigt eine Laparotomie und eine chirurgische Freilegung der Aorta und der umgebenden Gewebe (15A) und eine histologische Untersuchung der Arterien (15B: Oben – Histopathologie der durch PDT behandelten arteriosklerotischen Aorta; Unten – Histopathologie der arteriosklerotischen Aorta, die Licht, jedoch kein Konjugat erhielt).
  • Detaillierte Beschreibung
  • Verfahren zum Detektieren und Behandeln empfindlicher Plaques
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung von empfindlichen Plaques durch selektives Abzielen auf und Zerstören der Entzündungskomponenten der empfindlichen Plaques. Bei einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Stabilisieren eines empfindlichen Plaques bei einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge wenigstens einer Photosensibilisator-Zusammensetzung, wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert wird; und
    • b) Lichtaktivierung der Photosensibilisatorzusammensetzung zur Erzeugung einer phototoxischen Spezies; und
    • c) Stabilisieren des empfindlichen Plaques gegen Bruch.
  • Ein „empfindlicher Plaque" umfasst eine große Fülle an Entzündungszellen, einen großen Lipidpool und eine dünne fibröse Kappe. Bevorzugt umfasst ein empfindlicher Plaque eine fibröse Kappe, die weniger als 150 μm dick ist. Bevorzugter umfasst ein empfindlicher Plaque eine fibröse Kappe, die weniger als 100 μm dick ist (z.B. zwischen 60 und 100 μm dick). Bevorzugt umfasst ein empfindlicher Plaque einen Gehalt an Makrophagen und/oder Monozyten von mehr als 10%. Bevorzugter umfasst ein empfindlicher Plaque einen Gehalt an Makrophagen und/oder Monozyten von mehr als 25%. Bevorzugt umfasst ein empfindlicher Plaque einen Lipidgehalt von mehr als 10%. Bevorzugter umfasst ein empfindlicher Plaque einen Lipidgehalt von mehr als 25%.
  • „Entzündungskomponenten" beinhalten Entzündungszellen, Lipide, Prokoagulantien (z.B. Gewebefaktor) und Enzyme oder andere Mittel, die eine Inhibition der Produktion extrazellulärer Matrix oder einen Abbau von Komponenten der extrazellulären Matrix fördern (z.B. Proteasen). „Entzündungszellen" beinhalten glatte Muskelzellen, Leukozyten, Lymphozyten (B-Lymphozyten und T-Lymphozyten), Monozyten, Makrophagen, Schaumzellen, Mastzellen, endotheliale Zellen, Blutplättchen, Erythrozyten und polymorphkernige Zellen (z.B. Granulozyten und Neutrophile). Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Thrombus" auf ein Blutgerinnsel, das sich in einem Blutgefäß ausgehend von einem gebrochenen Plaque gebildet hat und das an seiner Entstehungsstelle angeheftet bleibt.
  • Wie hier verwendet, ist ein „Photosensibilisator" eine chemische Verbindung oder ein biologischer Vorläufer hiervon, der bei Photoaktivierung eine phototoxische oder eine andere biologische Wirkung auf Biomoleküle erzeugt. Eine „phototoxische Spezies" ist eine Menge oder Varietät einer reaktiven Spezies, die hinreichend ist, um eine phototoxische Wirkung auf eine Zelle, eine Zellkomponente oder ein Biomolekül zu erzeugen. Bevorzugt ist die reaktive Spezies Sauerstoff. Wie hier verwendet, umfasst eine Photosensibilisator-Zusammensetzung einen Photosensibilisator, der an einen makromolekularen Träger gekoppelt ist. Ein „makromolekularer Träger" bezieht sich auf ein Biomolekül mit Zielsteuerungs-Spezifität für eine oder mehrere Komponenten, die in dem empfindlichen Plaque enthalten sind.
  • Bei wiederum einem anderen Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Detektieren und/oder Identifizieren von empfindlichen Plaques, indem man fluoreszente Zusammensetzungen, einschließlich Photosensibilisatoren, fluoreszenter Farbstoffe und photoaktiver Farbstoffe, auf die Entzündungskomponenten abzielt, die in den empfindlichen Plaques enthalten sind. Bei einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Detektieren eines empfindlichen Plaques in einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer fluoreszenten Zusammensetzung; und
    • b) Lokalisieren der Zusammensetzung an dem empfindlichen Plaque; und
    • c) Lichtaktivierung der Zusammensetzung, um den empfindlichen Plaque zu beleuchten; und Identifizieren des empfindlichen Plaques.
  • Wie hier verwendet, umfasst eine „fluoreszente Zusammensetzung" einen Photosensibilisator, einen Fluoreszenzfarbstoff oder photoaktiven Farbstoff, der an einen makromolekularen Träger gekoppelt ist. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Fluoreszenzfarbstoff auf Farbstoffe, die fluoreszieren, wenn sie mit Licht bestrahlt werden, die jedoch keine reaktiven Spezies erzeugen, die phototoxisch sind oder anderweitig in der Lage sind, mit Biomolekülen zu reagieren. Ein Photosensibilisator wird fluoreszieren, wenn er mit einer bestimmten Wellenlänge und Lichtenergie bestrahlt wird, und außerdem eine reaktive Spezies produzieren, die bei derselben oder einer anderen Wellenlänge und Lichtenergie phototoxisch ist. Der Begriff „photoaktiver Farbstoff", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass der bestrahlte Photosensibilisator eine fluoreszente Spezies erzeugt, jedoch nicht notwendigerweise eine reaktive Spezies in phototoxischen Mengen (d.h. eine phototoxische Spezies). In Abhängigkeit von der verabreichten Wellenlänge und Lichtenergie kann ein Photosensibilisator aktiviert werden, um zu fluoreszieren, und daher als ein photoaktiver Farbstoff fungieren, jedoch ohne dabei eine phototoxische Spezies zu erzeugen. Die Wellenlänge und Lichtenergie können durch Verfahren angepasst werden, die Fachleuten bekannt sind, um einen phototoxischen Effekt zu bewirken, wo es erwünscht ist.
  • Bei wiederum einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Detektieren eines empfindlichen Plaques bei einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer detektierbaren Menge wenigstens einer fluoreszenten Zusammensetzung, wobei die fluoreszente Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert wird; und
    • b) Lichtaktivierung des empfindlichen Plaques, um eine fluoreszente Spezies zu produzieren; und
    • c) Identifizieren des empfindlichen Plaques.
  • Bei wiederum einem anderen Aspekt umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Kombination von Detektion und Behandlung. Bei einer Ausführungsform umfasst ein Verfah ren zum Detektieren und Behandeln eines empfindlichen Plaques bei einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer detektierbaren Menge wenigstens einer fluoreszenten Zusammensetzung, wobei die fluoreszente Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert wird; und
    • b) Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge wenigstens einer Photosensibilisator-Zusammensetzung, wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert wird; und
    • c) Lichtaktivierung des empfindlichen Plaques, um eine fluoreszente Spezies zu produzieren; und
    • d) Identifizieren des empfindlichen Plaques; und
    • e) Lichtaktivierung der Photosensibilisator-Zusammensetzung an der Stelle des empfindlichen Plaques, um eine phototoxische Spezies zu produzieren; und
    • f) Stabilisieren des empfindlichen Plaques gegen Bruch.
  • Bei wiederum einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Detektieren und Behandeln eines empfindlichen Plaques bei einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer fluoreszenten Zusammensetzung, umfassend einen Photosensibilisa tor, der an einen makromolekularen Träger gekoppelt ist; und
    • b) Lokalisieren der Zusammensetzung an dem empfindlichen Plaque; und
    • c) Lichtaktivierung der Zusammensetzung, um den empfindlichen Plaque zu beleuchten; und
    • d) Identifizieren des empfindlichen Plaques; und
    • e) Lichtaktivierung des Photosensibilisators an der Stelle des empfindlichen Plaques, um eine phototoxische Spezies zu produzieren; und
    • f) Stabilisieren des empfindlichen Plaques gegen Bruch.
  • Bei wiederum einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Detektieren und Behandeln eines empfindlichen Plaques bei einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer fluoreszenten Zusammensetzung, umfassend einen photoaktiven Farbstoff, der an einen makromolekularen Träger gekoppelt ist; und
    • b) Lokalisieren der Zusammensetzung an dem empfindlichen Plaque; und
    • c) erste Lichtaktivierung der Zusammensetzung, um den empfindlichen Plaque zu beleuchten; und Identifizieren des empfindlichen Plaques; und
    • d) zweite Lichtaktivierung des photoaktiven Farbstoffs an der Stelle des empfindlichen Plaques, um eine phototoxische Spezies zu erzeugen; und
    • e) Stabilisieren des empfindlichen Plaques gegen Bruch.
  • Bei wiederum einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Detektieren und Behandeln eines empfindlichen Plaques bei einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer detektierbaren Menge wenigstens einer fluoreszenten Zusammensetzung, umfassend einen Photosensibilisator, der an einen makromolekularen Träger gekoppelt ist, wobei die fluoreszente Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert wird; und
    • b) Lichtaktivierung des empfindlichen Plaques, um eine fluoreszente Spezies zu erzeugen; und
    • c) Identifizieren des empfindlichen Plaques; und
    • d) Lichtaktivierung des Photosensibilisators an der Stelle des empfindlichen Plaques, um eine phototoxische Spezies zu erzeugen; und
    • e) Stabilisieren des empfindlichen Plaques gegen Bruch.
  • Bei wiederum einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Detektieren und Behandeln eines empfindlichen Plaques bei einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer detektierbaren Menge wenigstens einer fluoreszenten Zusammensetzung, umfassend einen photoaktiven Farbstoff, der an einen makromolekularen Träger gekoppelt ist, wobei die fluoreszente Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert wird; und
    • b) erste Lichtaktivierung des empfindlichen Plaques, um eine fluoreszente Spezies zu erzeugen; und
    • c) Identifizieren des empfindlichen Plaques; und
    • d) zweite Lichtaktivierung des photoaktiven Farbstoffs an der Stelle des empfindlichen Plaques, um eine phototoxische Spezies zu erzeugen; und
    • e) Stabilisieren des empfindlichen Plaques gegen Bruch.
  • Bei wiederum einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Detektieren und Behandeln eines empfindlichen Plaques bei einem Subjekt die folgenden Stufen:
    • a) Verabreichen einer detektierbaren Menge wenigstens einer fluoreszenten Zusammensetzung, wobei die fluoreszente Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert wird; und Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge wenigstens einer Photosensibilisator-Zusammensetzung, wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert wird; und
    • b) Lichtaktivierung des empfindlichen Plaques, um eine fluoreszente Spezies zu erzeugen; und
    • c) Identifizieren des empfindlichen Plaques; und
    • d) Lichtaktivierung der Photosensibilisator-Zusammensetzung an der Stelle des empfindlichen Plaques, um eine phototoxische Spezies zu erzeugen; und Stabilisieren des empfindlichen Plaques gegen Bruch.
  • Photosensibilisator-Zusammensetzungen
  • Die Photosensibilisatoren der vorliegenden Erfindung können alle in der Technik bekannten sein, einschließlich Photofrin.RTM, synthetische Diporphyrine und Dichlorine, Phthalocyanine mit oder ohne Metallsubstituenten, Chloraluminiumphthalocyanin mit oder ohne verschiedene Substituenten, Chloraluminium-sulfoniertes Phthalocyanin, O-substituierte Tetraphenylporphyrine, 3,1-meso-tetrakis-(o-Propionamidophenyl)porphyrin, Verdine, Purpurine, Zinn- und Zink-Derivate von Octaethylpurpurin, Etiopurpurin, Hydroporphyrine, Bacteriochlorine der Tetra(hydroxyphenyl)porphyrin-Reihe, Chlorine, Chlorin e6, mono-1-Aspartyl-Derivat von Chlorin e6, Di-1-Aspartylderivat von Chlorin e6, Zinn(IV)chlorin-e6, meta-Tetrahydroxphenylchlorin, Benzoporphyrinderivate, Benzoporphyrin-Monosäure-Derivate, Tetracyanoethylen-Addukte von Benzoporphyrin, Dimethylacetylendicarboxylat-Addukte von Benzoporphyrin, Diels-Alder-Addukte, Monosäure-Ring "a" Derivat von Benzoporphyrin, sulfoniertes Aluminium-PC, sulfoniertes AIPc, disulfoniertes, tetrasulfoniertes Derivat, sulfonierte Aluminium-Naphthalocyanine, Naphthalocyanine mit oder ohne Metallsubstituenten und mit oder ohne variierende Substituenten, Zink-Naphthalocyanin, Anthracendione, Anthrapyrazole, Aminoanthrachinon, Phenoxazinfarbstoffe, Phenothiazin-Derivate, Chalcogenapyrylium-Farbstoffe, kationische Selens- und Tellurapyrylium-Derivate, Ring-substituiertes kationisches PC, Pheophorbid-Derivat, Pheophorbid alpha und Ether- oder Esterderivate, Pyropheophorbide und Ether- oder Esterderivate, natürlich vorkommende Porphyrine, Hämatoporphyrin, Hämatoporphyrin-Derivate, Hämatoporphyrin-Ester oder -Ether, Protoporphyrin, ALA-induziertes Protoporphyrin IX, endogene metabolische Vorläufer, 5-Aminolevulinsäure-Benzonaphthoporphyrazine, kationische Imminiumsalze, Tetracycline, Lutetium-Texaphyrin, Zinn-etio-Purpurin, Porphycene, Benzophenothiazinium, Pentaphyrine, Texaphyrine und Hexaphyrine, 5-Amino-levulinsäure, Hypericin, Pseudohypericin, Hypocrellin, Terthiophene, Azaporphyrine, Azachlorine, Rose bengal, Phloxin B, Erythrosin, iodierte oder bromierte Derivate von Fluorescein, Merocyanine, Nilblau-Derivate, Pheophytin und Chlorophyllderivate, Bacteriochlorin- und Bacteriochlorophyll-Derivate, Porphocyanine, Benzochlorine und Oxobenzochlorine, Sapphyrine, Oxasapphyrine, Cercosporine und verwandte Pilzmetabolite, sowie Kombinationen hiervon.
  • Verschiedene in der Technik bekannte Photosensibilisatoren sind von der FDA zugelassen worden und kommerziell erhältlich. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Photosensibilisator ein Benzoporphyrin-Derivat („BPD"), wie etwa BPD-MA, das kommerziell auch bekannt ist als BPD-Verteporfin oder „BPD" (erhältlich von QLT). Das US-Patent Nr. 4,883,790 beschreibt BPD-Zusammensetzungen. BPD ist eine Verbindung der zweiten Generation, der die verlängerte Haut-Phototoxizität von Photofrin® fehlt (Levy (1994) Semin Oncol 21:4-10). BPD ist gründlich charakterisiert worden (Richter et al., (1987) JNCI 79:1327-1331), (Aveline et al. (1994) Photochem Photobiol 59:328-35), und es ist herausgefunden worden, dass es ein hochwirksamer Photosensibilisator für die PDT ist. BPD hat die Neigung, sich in atheromatösen Plaques zu akkumulieren. Ein Abzielen von BPD auf Entzündungszellen, die in empfindlichen Plaques enthalten sind, gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wird die Spezifität der Photoaktivierung erhöhen.
  • Photosensibilisatoren, die als Texaphyrine bekannt sind, haben ebenfalls die Neigung, sich in arteriosklerotischen Plaques anzureichern. Ein Abzielen von Texaphyrinen auf Entzündungszellen, die in empfindlichen Plaques enthalten sind, gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wird die Spezifität der Photoaktivierung erhöhen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Photosensibilisator ein Texaphyrin-Photosensibilisator, wie etwa Motexafin-Lutetium, das kommerziell als Antrin bekannt ist (erhältlich von Pharmacyclics, Hayse et al., (2001) Cardiovasc. Res., 2:449-55).
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Photosensibilisator Zinn-Ethyl-Etiopurpurin, das kommerziell als Purlytin bekannt ist (erhältlich von Miravant).
  • Fluoreszente Zusammensetzungen
  • Die fluoreszenten Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können alle in der Technik bekannten sein, einschließlich Photosensibilisatoren, fluoreszenter Farbstoffe und photoaktiver Farbstoffe.
  • Die Photosensibilisatoren, die für die Detektion empfindlicher Plaques verwendet werden, können alle in der Technik bekannten sein, wie zuvor beschrieben. Beispielsweise sind Hämatoporphyrin-Derivate als Fluoreszenz-Sonden verwendet worden, um die Entwicklung humaner arteriosklerotischer Plaques zu untersuchen (Spokojny (1986) J. Am. Coll. Cardiol. 8:1387-1392). Hämatoporphyrin-Derivate können für die Detektion empfindlicher Plaques verwendet werden, insbesondere von Plaques mit ausgedehnter Angiogenese (d.h. neue Vasa vasorum sind durchlässig, was die Akkumulation von Hämatoporphyrin im Plaque zusätzlich zu der selektiven Zielsteuerung, die vom makromolekularen Träger bereitgestellt wird, antreiben wird).
  • Die fluoreszenten Farbstoffe der vorliegenden Erfindung können sämtliche in der Technik bekannten sein, einschließlich 6-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein-succinimidylester; 5-(und-6)-Carboxyeosin; 5-Carboxyfluorescein; 6-Carboxyfluorescein; 5-(und-6)-Carboxy fluorescein; 5-Carboxyfluorescein-bis-(5-carboxymethoxy-2-nitrobenzyl)ether, -Alanin-Carboxamid oder -Succinimidylester; 5-Carboxyfluorescein-succinimidylester; 6-Carboxyfluoresceinsuccinimidylester; 5-(und-6)-Carboxyfluorescein-succinimidylester; 5-(4,6-Dichlortriazinyl)aminofluorescein; 2',7'-Difluorfluorescein; Eosin-5-isothiocyanat; Erythrosin-5-isothiocyanat; 6-(Fluorescein-5-carboxamido)hexansäure oder -Succinimidylester; 6-(Fluorescein-5-(und-6)-carboxamido)-hexansäure oder -Succinimidylester; Fluorescein-5-EX-Succinimidylester; Fluorescein-5-isothiocyanat; Fluorescein-6-isothiocyanat; Oregon Grün® 488, Carbonsäure oder Succinimidylester; Oregon Grün® 488 Isothiocyanat; Oregon Grün® 488-X Succinimidylester; Oregon Grün® 500 Carbonsäure; Oregon Grün® 500 Carbonsäure, Succinimidylester oder Triethylammoniumsalz; Oregon Grün® 514 Carbonsäure; Oregon Grün® 514, Carbonsäure oder Succinimidylester; Rhodamin GrünTM Carbonsäure, Succinimidylester oder Hydrochlorid; Rhodamin GrünTM Carbonsäure, Trifluoracetamid oder Succinimidylester; Rhodamin GrünTM-X Succinimidylester oder Hydrochlorid; Rhodol GrünTM Carbonsäure, N,O-bis-(Trifluoracetyl) oder -Succinimidylester; bis-(4-Carboxypiperidinyl)sulfonrhodamin oder Di(Succinimidylester); 5-(und-6)-Carboxynaphthofluorescein, 5-(und-6)-Carboxynaphthofluorescein-Succinimidylester; 5-Carboxyrhodamin-6G-Hydrochlorid; 6-Carboxyrhodamin-6G-Hydrochlorid, 5-Carboxyrhodamin-6G-Succinimidylester; 6-Carboxyrhodamin-6G-Succinimidylester; 5-(und-6)-Carboxyrhodamin-6G-Succinimidylester; 5-Carboxy-2',4',5',7'-tetrabromsulfonfluorescein-Succinimidylester oder Bis-(Diisopropylethylammonium)salz; 5-Carboxytetramethylrhodamin; 6-Carboxytetramethylrhodamin; 5-(und-6)-Carboxytetramethylrhodamin; 5-Carboxytetramethylrhodamin-Succinimidylester; 6-Carboxytetramethylrhodamin-Succinimidylester; 5-(und-6)-Carboxytetramethylrhodamin-Succinimidylester; 6-Carboxy-X-rhodamin; 5-Carboxy-X-rhodamin-Succinimidylester; 6-Carboxy-X-rhodamin-Succinimidylester; 5-(und-6)-Carboxy-X-rhodamin-Succinimidylester; 5-Carboxy-X-rhodamin-triethylammoniumsalz; LissaminTM Rhodamin B Sulfonylchlorid; Malachitgrün Isothiocyanat; NANOGOLD® mono(Sulfosuccinimidylester); QSY®-21-Carbonsäure oder Succinimidylester; QSY®-7-Carbonsäure oder -Succinimidylester; Rhodamin RedTM-X Succinimidylester; 6-(Tetramethylrhodamin-5-(und-6)-carboxamido)hexansäure, Succinimidylester; Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat; Tetramethylrhodamin-6-isothiocyanat; Tetramethylrhodamin-5-(und-6)-isothiocyanat; Texas Red® Sulfonyl; Texas Red® Sulfonylchlorid; Texas Red®-X STP-Ester oder Natriumsalz; Texas Red®-X Succinimidylester; Texas Red®-X Succinimidylester; und X-Rhodamin-5-(und-6)-isothiocyanat.
  • Fluoreszente Farbstoffe der vorliegenden Erfindung können z.B. Bodipy-Farbstoffe sein, die kommerziell über Molecular Probes erhältlich sind, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, BODIPY® FL; BODIPY® TMR STP Ester; BODIPY® TR-X STP Ester; BODIPY® 630/650-X STP Ester; BODIPY® 650/665-X STP Ester; 6-Dibrom-4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-succinimidylester; 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3,5-dipropionsäure; 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-pentansäure; 4,4- Difluor-5,7-dimethyt-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-pentansäure-succinimidylester; 4,4-Difluor-5,7-dimethyt-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure; 4,4-Difluor-5,7-dimethyt-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-succinimidylester; 4,4-Difluor-5,7-dimethyt-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-sulfosuccinimidylester oder -Natriumsalz; 6-((4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino)hexansäure; 6-((4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino)hexansäure oder -Succinimidylester; N-(4,4-Difluor-5,7-dimethyt-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)cysteinsäure, -Succinimidylester oder -Triethylammoniumsalz; 6-4,4-Difluor-1,3-dimethyt-5-(4-methoxyphenyl)-4-bora-3a,4a 4,4-difluor-5,7-diphenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure; 4,4-Difluor-5,7-diphenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-succinimidylester; 4,4-Difluor-5-phenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-succinimidylester; 6-((4,4-Difluor-5-phenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino)hexansäure oder -Succinimidylester; 4,4-Difluor-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-succinimidylester; 4,4-Difluor-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-succinimidylester; 6-(((4,4-Difluor-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexansäure oder -Succinimidylester; 4,4-Difluor-5-styryl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure; 4,4-Difluor-5-styryl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-succinimidylester; 4,4-Difluor-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-8-propionsäure; 4,4-Difluor-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-8-propionsäure-succinimidylester; 4,4-Difluor-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure-succinimidylester; 6-(((4-(4,4-Difluor-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)phenoxy)acetyl)amino)hexansäure oder -Succinimidylester; und 6-(((4,4-Difluor-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexansäure oder -Succinimidylester.
  • Die Fluoreszenzfarbstoffe der vorliegenden Erfindung können z.B. Alexa-Fluor-Farbstoffe sein, die kommerziell bei Molecular Probes erhältlich sind, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Alexa Fluor® 350 Carbonsäure, Alexa Fluor® 430 Carbonsäure, Alexa Fluor® 488 Carbonsäure, Alexa Fluor® 532 Carbonsäure, Alexa Fluor® 546 Carbonsäure, Alexa Fluor® 555 Carbonsäure, Alexa Fluor® 568 Carbonsäure, Alexa Fluor® 594 Carbonsäure, Alexa Fluor® 633 Carbonsäure, Alexa Fluor® 647 Carbonsäure, Alexa Fluor® 660 Carbonsäure und Alexa Fluor® 680 Carbonsäure.
  • Die Fluoreszenzfarbstoffe der vorliegenden Erfindung können z.B. Cy-Farbstoffe sein, die kommerziell bei Amersham Pharmacia Biotech erhältlich sind, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Cy3 NHS-Ester, Cy5 NHS-Ester, Cy5.5 NHS-Ester und Cy7 NHS-Ester.
  • Photoaktive Farbstoffe der vorliegenden Erfindung können alle in der Technik bekannten Photosensibilisatoren sein, die fluoreszieren werden, die jedoch bei Bestrahlung nicht notwendi gerweise eine reaktive Spezies in phototoxischen Mengen produzieren werden. In Abhängigkeit von der verabreichten Wellenlänge und Lichtenergie kann ein Photosensibilisator dazu aktiviert werden, zu fluoreszieren und daher als ein photoaktiver Farbstoff zu fungieren, jedoch nicht einen phototoxischen Effekt zu erzeugen, solange nicht, in einigen Fällen, die Wellenlänge und Lichtenergie geeignet angepasst wird, um einen phototoxischen Effekt zu induzieren.
  • Zielsteuerung der Photosensibilisator-Zusammensetzung
  • Selektivität der Photosensibilisatoren für Zielgewebe der vorliegenden Erfindung wird erreicht, indem man kovalente Konjugate verwendet, oder durch Verwendung nicht-kovalenter Komplexe zwischen Photosensibilisatoren und makromolekularen Trägern mit Zielsteuerungsspezifität für eine oder mehrere Komponenten, die in dem empfindlichen Plaque enthalten sind (Hasan, T. (1992) In: B. Henderson und T. Dougherty (Herausgeber), Photodynamic Therapy: Basic Principles and Clinical Applications, S. 187-200: Marcel Dekker). Entsprechend umfassen Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere Photosensibilisatoren und/oder makromolekulare Träger. Die Verwendung makromolekularer Träger erlaubt vorteilhafter Weise, dass der Photosensibilisator nach seinen optischen und photophysikalischen Eigenschaften ausgewählt werden kann, ohne sich auf die molekulare Struktur des Photosensibilisators stützen zu müssen, um einen Gewebe-Zielsteuerungseffekt bereitzustellen.
  • Im allgemeinen basiert die makromolekulare Zielsteuerung auf zwei Facetten der Molekülstruktur. Die ersten Merkmale der Makromoleküle, wie etwa Größe, Ladung, Hydrophobizität und biologische Abbaubarkeit, können manipuliert werden, um die Akkumulation oder Retention in dem Plaque zu steigern, und zweitens kann das makromolekulare Konjugat so konzipiert werden, dass es Antigene, Rezeptoren oder andere Zelltyp-spezifische Strukturen, die auf Entzündungszellen vorliegen, erkennt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der makromolekulare Träger ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Serumproteinen, einschließlich Rezeptorliganden (Hamblin et al. (1994) J. Photochem. Photobiol. 26:147-157; Hamblin und Newman (1994) J. Photochem. Photobiol. 26:45-56), Mikrosphären (Bachor et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:1580-1584), Liposomen (Polo et al. (1996) Cancer Lett. 109:57-61), Polymeren (Hamblin et al. (1999) Br. J. Cancer 81:261-268), monoklonalen Antikörpern (Hamblin et al. (2000) Br. J. Cancer 83:1544-1551), Wachstumsfaktoren (Gijsens und De Witte (1998) Int. J. Oncol. 13:1171-1177), Peptiden (Krinick, (1994) J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 5:303-324), Hormonen (Akhlynina et al. (1995) Cancer Res. 55:1014-1019) und Lipoproteinen (Schmidt-Erfurth et al. (1997) Br. J. Cancer 75:54-61).
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an makromolekulare Träger gekoppelt, die Liganden umfassen, die an „Scavenger-Rezeptoren" binden. Scavenger-Rezeptoren sind Membran-Proteine, die auf der Oberfläche von Makrophagen, Monozyten, Endothelzellen und glatten Muskelzellen exprimiert werden, und die ein breites Spektrum von Liganden, sowohl natürlich vorkommend als auch synthetisch, erkennen (Freeman et al. (1997) Curr. Opin. Hematol. 4:41-47). Derzeit gibt es sechs Mitglieder der Scavenger-Rezeptor-Familie, die zu drei Klassen gehören (z.B. Klasse A, B oder C). Nach der anfänglichen Bindung an den Scavenger-Rezeptor werden die Liganden rasch internalisiert und für ihren Abbau durch Proteasen und andere Iysosomale Enzyme zu den Lysosomen geleitet. Das breite und diverse Spektrum von Strukturen, das von diesen Rezeptoren erkannt wird, hat dazu geführt, dass sie als „molekularer Fliegenfänger" bezeichnet wurden (Krieger et al. (1992) Trends Biochem. Sci. 17:141-146, 1992). Die Liganden sind alle Makromoleküle mit einer ausgeprägten anionischen Ladung, die einige gemeinsame konformative Merkmale besitzen (Haberland und Fogelman (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:2693-2697; Takata (1989) Biochem. Biophys. Acta. 984:273-280). Die spezifische Zielsteuerung von Zusammensetzungen zu J774 und andere Makrophagen-artige Zellen in vitro ist erreicht worden mit Konjugaten von maleyliertem Albumin, Daunorubicin und Doxorubicin (Mukhopadhyay et al (1992) Biochem J. 284:237-241; Basu et al. (1994) FERS Lett. 342:249-254; Hamblin et al. (2000) Photochem Photobiol. 4:533-540).
  • Zahlreiche in der Technik bekannte Scavenger-Rezeptor-Liganden (entweder mit oder ohne Polyethyl-Glykosylierung) können verwendet werden, um Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zielgerichtet zu empfindlichen Plaques zu steuern, einschließlich maleyliertem Albumin, oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte, acetyliertem Lipoprotein niedriger Dichte, oxidiertem Lipoprotein hoher Dichte, Malondialdehydbehandelten Proteinen, Lipoteichonsäure, Formaldehyd-behandeltem Albumin, glykiertem Albumin, Polyinosinsäure, glykierten Lipoproteinen, Dextransufat, anionischen Phospholipiden (Phosphatidylserin), Fucoidin, Carrageenan, Polyvinylsulfat und monoklonalen Antikörpern, die CD11b oder c, CD13, CD14, CD16a, CD32 oder CD68 erkennen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an makromolekulare Träger gekoppelt, die auf Makrophagen und/oder Monozyten empfindlicher Plaques abzielen. Diese makromolekularen Träger können beispielsweise auf folgende Ziele abgezielt werden, diese beispielhaft einschließend Tenascin C, Gewebefaktor, Gewebe-Inhibitor von MMP 1 und 2, Rezeptor von oxidiertem LDL (in der Technik auch bekannt als CD36), Hämoxygenase-1, gp-39 von humanem Knorpel, IL-6, IL-6-Rezeptor, IL-10, IL-10-Rezeptor, Lektin-artigen Rezeptor von oxidiertem LDL ("LOX-1"), Monozyten-Entzündungsprotein-1 und Rezeptoren davon, sowie den Rezeptor von Makropha gen-chemoattraktivem Protein-1 ("CCR-5"). Entsprechende makromolekulare Träger können z.B. Antikörper gegen diese Biomoleküle oder Liganden, die selbige oder Analoga davon binden, sein.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an makromolekulare Träger gekoppelt, die auf die T-Zellen von empfindlichen Plaques abzielen. Diese makromolekularen Träger können z.B. auf IL-10, den IL-10-Rezeptor, das Monozyten-Entzündungsprotein-1 und Rezeptoren davon, und auf Transferrin abzielen. Solche makromolekularen Träger können z.B. Antikörper gegen diese Biomoleküle oder Liganden, die selbige oder Analoga davon binden, sein, einschließlich monoklonaler Antikörper, die CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD25, CD28, CD44, CD71 oder Transferrin erkennen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung über makromolekulare Träger ausgeliefert, die auf den Lipidpool des Atheroms abzielen, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, hydrophobe Photosensibilisatoren oder Photosensibilisatoren, die in hydrophoben Vehikeln ausgeliefert werden, wie etwa durch Liposomen (positiv, neutral oder negativ geladen und optional Cholesterol oder Cardiolipin enthaltend), Cremaphor EL, PEG/Lösungsmittelgemische, iodiertes Rizinusöl und verschiedene Nanopartikel und micellare Präparationen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an makromolekulare Träger gekoppelt, die auf Proteasen abzielen, die die extrazelluläre Matrix abbauen (z.B. Metalloproteinasen), einschließlich monoklonaler Antikörper gegen die Protease, sowie Proteinasesubstrate.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an makromolekulare Träger gekoppelt, die auf die Endothelzellen empfindlicher Plaques abzielen. Diese makromolekularen Träger können z.B. auf Endothel-Adhäsionsmoleküle abgezielt werden, einschließlich ICAM (in der Technik auch bekannt als CD54) und VCAM (in der Technik auch bekannt als CD106), Angiotensin II, Angiotensin-konvertierendes Enzym (in der Technik auch bekannt als CD143), Endothel-abgeleitete Lipase, Gewebefaktor, Hämoxygenase-1, LOX-1, Lipoprotein niedriger Dichte ("LDL"), Lipoprotein hoher Dichte ("HDL"), P-Selectin, L-Selectin und E-Selectin. Solche makromolekularen Träger können z.B. Antikörper gegen diese Biomoleküle sein, oder Liganden, die selbige oder Analoga davon binden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an makromolekulare Träger gekoppelt, die auf Neutrophile der empfindlichen Plaques abzielen. Diese makromolekularen Träger können z.B. auf Myeloperoxidase abgezielt werden. Solche makromolekularen Träger können z.B. Antikörper gegen diese Biomoleküle sein, oder Liganden, die selbige oder Analoga davon binden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an makromolekulare Träger gekoppelt, die auf B-Zellen der empfindlichen Plaques abzielen. Diese makromolekularen Träger können z.B. auf IL-6, IL-6-Rezeptor, IL-10 und IL-10-Rezeptor abgezielt werden. Solche makromolekularen Träger können z.B. Antikörper gegen diese Biomoleküle sein, oder Liganden, die selbige oder Analoga davon binden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an makromolekulare Träger gekoppelt, die auf glatte Muskelzellen der empfindlichen Plaques abzielen. Diese makromolekularen Träger können z.B. auf LOX-1 abgezielt werden. Solche makromolekularen Träger können z.B. Antikörper gegen diese Biomoleküle sein, oder Liganden, die selbige oder Analoga davon binden.
  • Die Merkmale eines empfindlichen Plaques, die von stabilen atheromatösen Plaques unterscheidbar sind, erlauben vorteilhafter Weise eine Unterscheidung empfindlicher Plaques von stabilen atheromatösen Plaques gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung. Empfindliche Plaques umfassen eine überreiche Anzahl an Entzündungszellen, einen großen Lipidpool und eine dünne fibröse Kappe. Bevorzugt umfasst ein empfindlicher Plaque eine fibröse Kappe, die weniger als 150 μm dick ist. Bevorzugter umfasst ein empfindlicher Plaque eine fibröse Kappe, die weniger als 100 μm dick ist (z.B. zwischen 60 und 100 μm dick). Bevorzugt umfasst ein empfindlicher Plaque einen Gehalt an Makrophagen und/oder Monozyten von mehr als 10%. Bevorzugter umfasst ein empfindlicher Plaque einen Gehalt an Makrophagen und/oder Monozyten von mehr als 25%. Bevorzugt umfasst ein empfindlicher Plaque einen Lipidgehalt von mehr als 10%. Bevorzugter umfasst ein empfindlicher Plaque einen Lipidgehalt von mehr als 25%. Somit verleiht die z.B. über einen makromolekularen Träger bewirkte Zielsteuerung eines Photosensibilisators oder einer fluoreszenten Zusammensetzung hin zu aktivierten Makrophagen oder Proteasen, die die extrazelluläre Matrix abbauen, einen selektiven Vorteil gegenüber einem empfindlichen Plaque, sodass die Aufnahme der Zusammensetzung weit größer ist als bei einem nicht-empfindlichen Plaque. Somit kann die Photodetektion oder Photoaktivierung des empfindlichen Plaque bei einer Wellenlänge und Lichtenergie ausgeführt werden, die einen unwesentlichen oder vernachlässigbaren Effekt auf nicht-empfindliche Plaques besitzt. Somit sind die Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise geeignet für die Detektion und Therapie empfindlicher Plaques und nicht lediglich für die weit verbreiteten stabilen atheromatösen Plaques.
  • Die Durchführung der vorliegenden Erfindung nutzt, solange nicht anders angezeigt, konventionelle Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), der Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie, die im Bereich der allgemeinen technischen Fähigkeiten liegen. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt, wie etwa in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller und Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Diese Techniken sind anwendbar auf die Produktion von Polynukleotiden und Polypeptiden der Erfindung, und sie können als solche beim Herstellen und Durchführen der Erfindung in Betracht gezogen werden. Besonders nützliche Techniken für bestimmte Ausführungsformen werden in den folgenden Abschnitten diskutiert.
  • Der Begriff „Kopplungsmittel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Reagenz, das befähigt ist, einen Photosensibilisator an einen makromolekularen Träger zu koppeln, oder einen Photosensibilisator oder einen makromolekularen Träger an eine „Rückgrat " oder eine „Brücken"-Gruppierung. Es ist jedwede Bindung geeignet, die befähigt ist, die Komponenten so zu verbinden, dass sie unter physiologischen Bedingungen und für die zur Verabreichung und Behandlung benötigte Zeit stabil sind, jedoch sind kovalente Bindungen bevorzugt. Die Verbindung zwischen zwei Komponenten kann direkt sein, z.B. da, wo ein Photosensibilisator direkt mit einem makromolekularen Träger verbunden wird, oder indirekt, z.B. da, wo ein Photosensibilisator mit einem Zwischenelement verbunden ist, z.B. einem Rückgrat, und wobei das Zwischenelement mit dem makromolekularen Träger verbunden ist. Ein Kopplungsmittel sollte funktionsfähig sein unter Bedingungen der Temperatur, des pH, der Salzeigenschaften, des Lösungsmittelsystems und anderer Recktanten, die wesentlich die chemische Stabilität des Photosensibilisators, des Rückgrats (wenn vorhanden) und des makromolekularen Trägers aufrechterhalten.
  • Es wird nicht immer ein Kopplungsmittel benötigt; wenn die fluoreszente Verbindung z.B. in Form eines Sulfonylchlorids, als Isothiocyanat oder als Succinimidylester vorliegt, so wird kein Kopplungsmittel benötigt.
  • Ein Kopplungsmittel kann Komponenten verbinden, ohne dass eine Anfügung von Elementen des Kopplungsmittels an die verbundenen Bestandteile erfolgt. Andere Kopplungsmittel resultieren in der Anfügung von Elementen des Kopplungsmittels an die verbundenen Komponenten.
  • Beispielsweise können Kopplungsmittel Vernetzungsmittel sein, die homo- oder hetero-bifunktionell sind, und bei denen ein oder mehrere atomare Bestandteile des Mittels in der Zusammensetzung erhalten bleiben können. Ein Kopplungsmittel, das kein Vernetzungsmittel ist, kann bei der Kopplungsreaktion vollständig entfernt werden, sodass das molekulare Produkt ausschließlich aus dem Photosensibilisator, der Zielsteuerungsgruppierung und einer Rückgrat-Gruppierung (fall vorhanden) zusammengesetzt sein kann.
  • Viele Kopplungsmittel reagieren mit einem Amin und einem Carboxylat, um ein Amid auszubilden, oder mit einem Alkohol und einem Carboxylat, um einen Ester auszubilden. Kopplungsmittel sind in der Technik bekannt, siehe z.B. M. Bodansky, "Principles of Peptide Synthesis", 2. Auflage, hier als Referenz angegeben, und T. Greene und P. Wuts, " Protective Groups in Organic Synthesis," 2. Auflage, 1991, John Wiley, NY. Kopplungsmittel sollten die Komponentengruppierungen stabil verbinden, jedoch so, dass es nur eine minimale oder keine Denaturierung oder Deaktivierung des Photosensibilisators oder des makromolekularen Trägers gibt.
  • Die Photosensibilisator-Konjugate der Erfindung können durch Koppeln des Photosensibilisators an makromolekulare Träger hergestellt werden, und zwar unter Verwendung von Verfahren, die in den folgenden Beispielen beschrieben sind, oder durch in der Technik bekannte Verfahren. Es kann eine Vielzahl von Kopplungsmitteln, einschließlich vernetzender Mittel, für die kovalente Konjugation verwendet werden. Beispiele von vernetzenden Mitteln beinhalten N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), ortho-Phenylendimaleimid (o-PDM) und Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (sulfo-SMCC) (Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Andere Verfahren beinhalten diejenigen, die beschrieben wurden von Paulus und Behring (1985) Ins. Mitt., 78:118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83 und Glennie et al., (1987) J. Immunol, 139:2367-2375. Eine große Anzahl von Kopplungsmitteln für Peptide und Proteine, zusammen mit Puffern, Lösungsmitteln und Anwendungsverfahren, ist beschrieben im Katalog der Pierce Chemical Co., Seiten T155-T200, 1994 (3747 N. Meridian Rd., Rockford IL, 61105, U.S.A.; Pierce Europe B.V., P.O. Box 1512, 3260 BA Oud Beijerland, Niederlande).
  • DCC ist ein nützliches Kopplungsmittel (Pierce #20320; Rockland, IL). Es unterstützt die Kopplung des Alkohols NHS an Chlorin-e6 in DMSO (Pierce #20684), wobei ein aktivierter Ester ausgebildet wird, der an Polylysin vernetzt werden kann. DCC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid) ist ein carboxy-reaktiver Vernetzer, der gebräuchlicher Weise als Kopplungsmittel bei der Peptidsynthese verwendet wird, und der ein Molekulargewicht von 206,32 besitzt. Ein weiteres nützliches Vernetzungsmittel ist SPDP (Pierce #21557), ein heterobifunktioneller Vernetzer zur Verwendung mit primären Aminen und Sulfhydrylgruppen. SPDP besitzt ein Molekulargewicht von 312,4, eine Spacerarm-Länge von 6,8 Angstrom, es ist reaktiv gegenüber NHS-Estern und Pyridyldithiogruppen und erzeugt eine spaltbare Vernetzung, sodass das Mittel bei der weiteren Reaktion eliminiert wird, sodass der Photosensibilisator direkt mit einem Rückgrat oder einem makromolekularen Träger verbunden werden kann. Andere nützliche Konjugationsmittel sind SATA (Pierce #26102) für die Einführung blockierter SH-Gruppen für eine Zweischritt-Vernetzung, welche entblockiert wird mit Hydroxylamin-25-HCl (Pierce #26103), und Sulfo-SMCC (Pierce #22322), das gegenüber Aminen und Sulfhydrylen reaktiv ist. Weitere Vernetzungs- und Kopplungsmittel sind außerdem bei der Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) erhältlich. Zusätzliche Verbindungen und Prozesse, insbesondere solche, die eine Schiff-Base als Zwischenprodukt verwenden, für die Konjugation von Proteinen an andere Proteine oder an andere Zusammensetzungen, z.B. an Reportergruppen oder an Chelatbildner für die Markierung eines Proteins mit Metallionen, sind in der EPO 243,929 A2 (veröffentlicht am 4. Nov., 1987) offenbart.
  • Photosensibilisatoren, die Carboxygruppen enthalten, können mit Lysin-s-Aminogruppen in Zielpolypeptiden entweder über vorab gebildete reaktive Ester (wie etwa N-Hydroxy-Succinimidester) verbunden werden, oder durch Ester, die in situ durch eine Carbodiimidvermittelte Reaktion konjugiert werden. Dasselbe gilt für Photosensibilisatoren, die Sulfonsäuregruppen enthalten, die zu Sulfonylchloriden umgewandelt werden können, die mit Aminogruppen reagieren. Photosensibilisatoren, die Carboxygruppen aufweisen, können durch ein in situ-Carbodiimid-Verfahren mit Aminogruppen an dem Polypeptid verbunden werden. Photosensibilisatoren können außerdem an die Hydroxygruppen von Serin- oder Threoninresten oder an Sulfhydrylgruppen von Serin- oder Threoninresten oder an Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten angeheftet werden.
  • Verfahren zum Anbinden von Komponenten eines Konjugats, z.B. das Koppeln von Polyaminosäureketten, die Photosensibilisatoren tragen, an antibakterielle Polypeptide, können heterobifunktionaie Vernetzungsreagenzien verwenden. Diese Reagenzien binden an eine funktionelle Gruppe in einer Kette und an eine andere funktionelle Gruppe in der zweiten Kette. Diese funktionellen Gruppen sind typischerweise Amino, Carboxyl, Sulfhydryl und Aldehyd. Es gibt zahlreiche Permutationen geeigneter Gruppierungen, die mit diesen Gruppen reagieren werden, und mit unterschiedlich formulierten Strukturen, um diese miteinander zu konjugieren (beschrieben im Pierce Katalog und von Merrifield et al. (1994) Ciba Found Symp. 186:5-20).
  • Die Produktion und Reinigung von Photosensibilisatoren, die an makromolekulare Träger gekoppelt sind, kann durch in der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden. Die Ausbeute bei den Kopplungsreaktionen kann durch die Spektroskopie des Produkts bestimmt werden, das bei einer chromatographischen Auftrennung im letzten Schritt der Reinigung eluiert wird. Die Anwesenheit von nicht-gekoppeltem Photosensibilisator und Reaktionsprodukten, die den Photo sensibilisator enthalten, kann durch die physikalische Eigenschaft verfolgt werden, dass die Photosensibilisator-Gruppierung Licht bei einer charakteristischen Wellenlänge und mit einem charakteristischen Extinktionskoeffizienten absorbiert, sodass der Einbau in Produkte durch die Extinktion bei dieser oder einer ähnlichen Wellenlänge überwacht werden kann. Die Kopplung eines oder mehrerer Photosensibilisator-Moleküle an einen makromolekularen Träger oder an ein Rückgrat verschiebt den Extinktions-Peak im Elutionsprofil bei Fraktionen, die unter Verwendung von größenmessender Gelchromatographie eluiert werden, wobei die passende Wahl hier Sephadex G50, 6100 oder 6200 oder eine andere derartige Matrix (Pharmacia-Biotech, Piscataway NJ) sein kann. Die Auswahl eines geeigneten größenmessenden Gels, z.B. von Sephadex Gel, kann durch das Gel bestimmt werden, bei dem der Photosensibilisator in einer Fraktion eluiert, die jenseits des ausgeschlossenen Materialvolumens liegt, das zu groß ist, um mit dem Bead zu interagieren, d.h. die nicht gekoppelte Ausgangszusammensetzung des Photosensibilisators interagiert in einem gewissen Maße mit den Auftrennungs-Beads und wird gleichzeitig bis zu einem gewissen Maße zurückgehalten. Das passende nützliche Gel kann anhand des Molekulargewichts des nicht gekoppelten Photosensibilisators vorhergesagt werden. Die erfolgreichen Reaktionsprodukte von Photosensibilisatorzusammensetzungen, die an zusätzliche Gruppierungen gekoppelt sind, besitzen im allgemeinen charakteristische höhere Molekulargewichte, was bewirkt, dass sie in einem geringeren Ausmaß mit dem chromatographischen Bead interagieren und somit in Fraktionen erscheinen, die früher eluieren als Fraktionen, die das nicht gekoppelte Photosensibilisatorsubstrat enthalten. Nicht umgesetztes Photosensibilisatorsubstrat erscheint im allgemeinen in Fraktionen, die charakteristisch für das Ausgangsmaterial sind, und die Ausbeute jeder Reaktion kann somit sowohl anhand der Größe des Peaks von Material mit größerem Molekulargewicht als auch anhand der Abnahme des Peaks des charakteristischen Ausgangsmaterials bestimmt werden. Die Fläche unter dem Peak der Produktfraktionen wird unter Verwendung des molekularen Extinktionskoeffizienten in die Größe der Ausbeute umgesetzt.
  • Das Produkt kann unter Verwendung von NMR analysiert werden, wobei die Flächen geeigneter Produkt-Peaks integriert werden, um die relativen Ausbeuten mit verschiedenen Kopplungsmitteln zu bestimmen. Eine Rotverschiebung bei der Extinktion eines Photosensibilisators ist oft nach der Kopplung an eine Polyaminosäure beobachtet worden. Die Kopplung an einen größeren Träger, wie etwa ein Protein, kann eine vergleichbare Verschiebung erzeugen, wie etwa die Kopplung an einen Antikörper in einer Verschiebung von etwa 3-5 nm in dieser Richtung im Vergleich zur Extinktion des freien Photosensibilisators resultierte. Die relevanten Extinktionsmaxima und Extinktionskoeffizienten in 0,1 M NaOH/1% SDS sind für Chlorin-e6 400 nm und 150.000 M–1 cm–1 und für Benzoporphyrin-Derivat 430 nm und 61.000 M–1·cm–1.
  • Die Photosensibilisatorzusammensetzungen der Erfindung beinhalten solche, bei denen ein Photosensibilisator direkt an einen makromolekularen Träger, wie etwa einen Scavenger- Rezeptor-Liganden, gekoppelt wird. Andere Photosensibilisatorzusammensetzungen der Erfindung beinhalten eine „Rückgrat"- oder „Brücken"-Gruppierung, wie etwa eine Polyaminosäure, bei der das Rückgrat sowohl an einen Photosensibilisator als auch an einen makromolekularen Träger gekoppelt ist.
  • Die Einbeziehung eines Rückgrats in eine Zusammensetzung mit einem Photosensibilisator und einem makromolekularen Träger kann eine Reihe von Vorteilen bereitstellen, einschließlich der Bereitstellung größerer stöchiometrischer Bandbreiten von Photosensibilisator und makromolekularen Trägern, die pro Rückgrat angekoppelt sind. Wenn das Rückgrat intrinsische Affinität für einen Zielorganismus besitzt, so kann die Affinität der Zusammensetzung durch Koppeln an das Rückgrat gesteigert werden. Die spezifische Bandbreite von Organismen, auf die man mit einer Zusammensetzung abzielen kann, kann erweitert werden, indem man zwei oder mehr verschiedene makromolekulare Träger an eine einzige Photosensibilisator-Rückgrat-Zusammensetzung koppelt.
  • Peptide, die bei Verfahren und Verbindungen der Erfindung nützlich zur Erstellung und Charakterisierung von Rückgrat-Gruppierungen sind, beinhalten Poly-Aminosäuren, welche Homo- und Hetero-Polymere von L-, D-, racemischen DL- oder gemischten L- und D-Aminosäurezusammensetzungen sein können, und die von definierter oder zufällig gemischter Zusammensetzung und Sequenz sein können. Diese Peptide können nach bestimmten natürlichen Peptiden modelliert werden, und sie können durch die Technik des Phage Display und der Selektion auf gesteigerte Bindung gegenüber einem gewählten Ziel optimiert werden, sodass das ausgewählte Peptid mit der höchsten Affinität charakterisiert und dann synthetisch produziert wird. Weitere Modifikationen funktioneller Gruppen können z.B. für die Zwecke gesteigerter Löslichkeit, verminderter Aggregation und einem veränderten Ausmaß an Hydrophobizität eingeführt werden. Beispiele von Nicht-Peptid-Rückgraten beinhalten Nukleinsäuren und Derivate von Nukleinsauren, wie etwa DNA, RNA und Peptid-Nukleinsäuren; Polysaccharide und Derivate, wie etwa Stärke, Pektin, Chitine, Cellulosen und hemimethylierte Cellulosen; Lipide, wie etwa Triglycerid-Derivate und Cerebroside; synthetische Polymere, wie etwa Polyethylenglykole (PEGS) und PEG Star-Polymere; Dextran-Derivate, Polyvinylalkohole, N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamid-Copolymere, poly(DL-Glycolsäure-Milchsäure); und Zusammensetzungen, die Elemente beliebiger dieser Klassen von Verbindungen enthalten.
  • Die Affinität einer Photosensibilisator-Zusammensetzung kann verfeinert werden durch Modifizieren der Ladung einer Komponente der Zusammensetzung. Konjugate, wie etwa poly-L-Lysin-Chlorin e6, können mit variablen Größen und Ladungen hergestellt werden (kationisch, neutral und anionisch); z.B. können die freien NH2-Gruppen von Polylysin mit einer Acetyl-, Succinyl- oder einer aus einer anderen R-Gruppe bestehenden Kappe verdeckt werden, um die La dung der endgültigen Zusammensetzung zu verändern. Die Nettoladung einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch isoelektrische Fokussierung (IEF) bestimmt werden. Diese Technik verwendet angelegte Spannung, um einen pH-Gradienten in einem nicht-siebenden Acrylamid- oder Agarosegel zu erzeugen, indem sie ein System von Ampholyten (synthetische Pufferkomponenten) verwendet. Wenn geladene Polypeptide auf das Gel aufgebracht werden, so werden sie gemäß der Position, an der sie selbst ungeladen und somit unfähig zu weiterer Bewegung werden, entweder hin zu Regionen des Gels mit einem höheren pH oder mit einem niedrigeren pH wandern. Diese Position kann durch die Bezugnahme auf die Positionen einer Reihe bekannter IEF-Marker-Proteine bestimmt werden.
  • Die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können Photosensibilisatoren beinhalten, die an Antikörper gekoppelt sind, was in der Technik als „Photoimmunkonjugate" bekannt ist. Die Antikörper-Komponente des Photoimmunkonjugats kann mit Spezifität an ein Epitop binden, das auf der Oberfläche einer Zelle vorhanden ist, die in dem empfindlichen Plaque enthalten ist. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „binden mit Spezifität", dass Zellen, die das Epitop nicht exprimieren, von dem Antikörper nur schwach erkannt werden.
  • Der Begriff „Antikörper", wie er bei dieser Erfindung verwendet wird, beinhaltet intakte Moleküle ebenso wie Fragmente davon, wie etwa Fab und Fab', die befähigt sind, die Determinante des Epitops zu binden. Fab-Fragmente behalten eine vollständige leichte Kette und ebenso eine Hälfte einer schweren Kette, wobei beide Ketten über die carboxyterminale Disulfidbindung kovalent verbunden sind. Fab-Fragmente sind im Hinblick auf die Antigen-Bindungsstelle monovalent. Die Antikörper der Erfindung umfassen vollständige native Antikörper, bispezifische Antikörper, chimäre Antikörper, Fab, Fab', Einzelkettenfragmente der variablen Region (scFv) und Fusions-Polypeptide. Bevorzugt sind die Antikörper der Erfindung monoklonal.
  • Die Antikörper dieser Erfindung können auf mehrere Weisen hergestellt werden. Verfahren zur Erzeugung und Isolierung ganzer nativer Antikörper, bispezifischer Antikörper, chimärer Antikörper, Fab, Fab', Einzelketten-V-Region-Fragmenten (scFv) und Fusionspolypeptiden sind in der Technik bekannt. Siehe z.B. Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (Harlow und Lane, 1988).
  • Antikörper werden am praktischsten über Hybridomazellen erhalten, die dafür erstellt werden, um einen Antikörper zu exprimieren. Verfahren zur Herstellung von Hybridomen sind in der Technik wohlbekannt. Die Hybridomazellen können in einem geeigneten Medium kultiviert werden, und das benutzte Medium kann als eine Quelle für Antikörper verwendet werden. Polynukleotide, die den Antikörper codieren, können wiederum aus dem Hybridom erhalten werden, das den Antikörper erzeugt, und der Antikörper kann dann synthetisch oder rekombinant aus diesen DNA-Sequenzen erzeugt werden. Für die Erzeugung großer Mengen an Antikörper ist es im Allgemeinen praktischer, eine Aszitesflüssigkeit zu gewinnen. Das Verfahren zur Erzeugung von Aszites umfasst im allgemeinen das Injizieren von Hybridomazellen in einen immunologisch naiven histokompatiblen oder immuntoleranten Säuger, insbesondere eine Maus. Der Säuger kann durch die vorherige Verabreichung einer geeigneten Zusammensetzung, z.B. Pristan, im Hinblick auf die Produktion von Aszites vorbereitet werden.
  • Ein weiteres Verfahren zum Erhalten von Antikörpern besteht in der Immunisierung geeigneter Wirtstiere mit einem Antigen und der Durchführung von Standardprozeduren für die Produktion polyklonaler oder monoklonaler Antikörper. Die so produzierten monoklonalen Antikörper (Mabs) können durch in der Technik bekannte Verfahren „humanisiert" werden. Beispiele humanisierter Antikörper werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,530,101 und 5,585,089 bereitgestellt.
  • Humanisierte Antikörper sind Antikörper, bei denen wenigstens ein Teil der Sequenz ausgehend von ihrer Startform verändert wurde, um es an menschliche Immunglobuline anzugleichen. Bei einer Version werden die C-Regionen der schweren und der leichten Kette durch humane Sequenzen ersetzt. Bei einer anderen Version umfassen die CDR-Regionen Aminosäuresequenzen für die Erkennung eines Antigens von Interesse, während die variablen Gerüstregionen ebenfalls in menschliche Sequenzen umgewandelt wurden (siehe z.B. EP 0329400 ). Bei einer dritten Version werden die variablen Regionen humanisiert, indem man Konsensussequenzen der variablen Regionen von Mensch und Maus erstellt und Reste außerhalb der CDR, die sich zwischen den Konsensussequenzen unterscheiden, umwandelt. Die Erfindung umfasst humanisierte Mabs.
  • Die Erfindung umfasst außerdem Hybrid-Antikörper, bei denen ein Paar der schweren und leichten Ketten von einem ersten Antikörper erhalten wird, wogegen das andere Paar schwerer und leichter Ketten von einem anderen, zweiten Antikörper erhalten wird. Solche Hybride können auch unter Verwendung humanisierter schwerer und leichter Ketten erzeugt werden.
  • Die Konstruktion von Phage Display-Bibliotheken für die Expression von Antikörpern, insbesondere den Fab- oder scFv-Teil von Antikörpern, ist in der Technik wohlbekannt (Heitner et al. (2001) J Immunol Methods 248:17-30). Die Phage-Display-Antikörper-Bibliotheken, die Antikörper exprimieren, können gemäß den Verfahren hergestellt werden, die im US-Patent Nr. 5,223,409 , das hier durch Referenz in Bezug genommen wird, beschrieben sind. Die Prozeduren der allgemeinen Methodik können unter Verwendung der vorliegenden Offenbarung angepasst werden, um Antikörper der vorliegenden Erfindung zu produzieren. Das Verfahren zur Herstel lung eines humanen monoklonalen Antikörpers beinhaltet im allgemeinen (1) das Herstellen getrennter Bibliotheken für Gene, die die schwere und leichte Kette codieren, in Klonierungsvektoren unter Verwendung menschlicher Immunglobulingene als einer Quelle für die Bibliotheken, (2) das Kombinieren der Bibliotheken der für die schwere und die leichte Kette codierenden Gene in einem einzigen dicistronischen Expressionsvektor, der befähigt ist, ein heterodimeres Antikörpermolekül zu exprimieren und zusammenzusetzen, (3) das Exprimieren des zusammengebauten heterodimeren Antikörpermoleküls auf der Oberfläche eines filamentösen Phagenpartikels, (4) das Isolieren des an der Oberflächen exprimierenden Phagenpartikels unter Verwendung von lmmunaffinitätstechniken, wie etwa dem „Panning" der Phagenpartikel gegenüber einem vorab ausgewählten Antigen, wodurch eine oder mehrere Spezies von Phagemid isoliert werden, die Gene enthalten, die für spezielle schwere und leichte Ketten codieren, bzw. Antikörpermoleküle, die mit dem vorab ausgewählten Antigen immunreagieren.
  • Einzelkettenfragmente der variablen Region werden hergestellt, indem man variable Regionen der leichten und schweren Kette unter Verwendung eines kurzen Linker-Peptids verbindet. Jedwedes Peptid mit einer hinreichenden Flexibilität und Länge kann als ein Linker bei einem scFv verwendet werden. Für gewöhnlich wird der Linker so ausgewählt, dass er wenig bis keine lmmunogenität besitzt. Ein Beispiel für ein Linker-Peptid ist (GGGGS)3, das etwa 3,5 nm zwischen dem Carboxy-Terminus einer der variablen Regionen und dem Amino-Terminus einer anderen variablen Region überbrückt. Andere Linker-Sequenzen können ebenfalls verwendet werden. Die Gesamtheit oder jedweder Teil der schweren oder leichten Kette können in beliebiger Kombination verwendet werden. Typischerweise werden die vollständigen variablen Regionen in das scFv einbezogen. Beispielsweise kann die variable Region der leichten Kette mit der variablen Region der schweren Kette verbunden werden. Alternativ kann ein Teil der variablen Region der leichten Kette mit der variablen Region der schweren Kette oder einem Teil davon verbunden werden. Außerdem wird ins Auge gefasst, dass Zusammensetzungen konstruiert werden können, die ein „biphasisches" scFv umfassen, wobei eine Komponente ein Polypeptid ist, das ein Antigen erkennt, und die andere Komponente ein davon verschiedenes Polypeptid ist, das ein anderes Antigen, wie etwa ein T-Zell-Epitop, erkennt.
  • scFvs können entweder rekombinant oder synthetisch hergestellt werden. Für die synthetische Produktion von scFv kann ein automatisiertes Synthesegerät verwendet werden. Für die rekombinante Produktion von scFv kann ein geeignetes Plasmid, das ein Polynukleotid enthält, das für das scFv codiert, in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden, entweder eukaryotisch, wie etwa Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugerzellen, oder prokaryotisch, wie etwa Escherichia coli, und das durch das Polynukleotid exprimierte Protein kann unter Verwendung von Standardtechniken der Proteinreinigung isoliert werden.
  • Ein besonders nützliches System für die Produktion von scFv ist das Plasmid pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI) in E. coli. pET-22b(+) enthält eine Nickelionen-Bindungsdomäne, bestehend aus 6 aufeinander folgenden Histidinresten, die es dem exprimierten Protein erlaubt, auf einem geeigneten Affinitätsharz gereinigt zu werden. Ein anderes Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), der oben beschrieben ist.
  • Die Expressionsbedingungen sollten sicherstellen, dass das scFv eine funktionelle und, bevorzugt, eine optimale Tertiärstruktur annimmt. In Abhängigkeit von dem verwendeten Plasmid (insbesondere der Aktivität des Promotors) und der Wirtszelle kann es notwendig oder nützlich sein, die Produktionsrate zu modulieren. Beispielsweise kann die Verwendung eines schwächeren Promotors oder die Expression bei niedrigeren Temperaturen notwendig oder nützlich sein, um die Produktion von korrekt gefaltetem scFv in prokaryotischen Systemen zu optimieren; oder es kann bevorzugt sein, scFv in eukaryotischen Zellen zu exprimieren. Verfahren der Antikörperreinigung können z.B. folgendes beinhalten: Salzpräzipitation (z.B. mit Ammoniumsulfat), lonenaustauschchromatographie (z.B. auf einer kationischen oder anionischen Austauschersäule, die man bei neutralem pH laufen lässt und die mit einem Stufengradienten steigender Ionenstärke eluiert wird), Gelfiltrationschromatographie (einschließlich Gelfiltrations-HPLC), und Chromatographie auf Affinitätsharzen, wie etwa Protein A, Protein G, Hydroxyapatit und Anti-Immunglobulin.
  • Die Photosensibilisatoren können gemäß beliebigen in der Technik bekannten Verfahren an Antikörper gekoppelt werden. Beispielsweise kann der Antikörper über ein Polymer oder eine Polypeptid-Verknüpfung direkt mit dem Photosensibilisator verbunden werden. Polymere von Interesse beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Polyamine, Polyether, Polyaminalkohole, derivatisiert zu Komponenten mittels Ketonen, Säuren, Aldehyden, Isocyanaten oder einer Vielzahl anderer Gruppen. Polypeptidverknüpfungen können z.B. poly-L-Lysin-Verknüpfungen umfassen (Del Governatore et al. (2000) Br. J. Cancer 82:56-64; Hamblin et al. (2000) Br. J. Cancer 83:1544-41; Molpus et al. (2000) Gynecol Oncol 76:397-404). Der Antikörper kann an einen Photosensibilisator und wenigstens einen Lösungsvermittler gebunden werden, von denen jeder unabhängig durch eine direkte kovalente Bindung an den Antikörper gebunden wird. Die direkte kovalente Bindung kann z.B. eine Amidbindung an einen Lysinrest des Antikörpers sein, wie beschrieben in der US-Anmeldung Seriennummer 10/137,029.
  • Die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können Photosensibilisatoren umfassen, die an makromolekulare Träger gebunden sind, die Sequenzen natürlich vorkommender Proteine und Peiltide umfassen, von Varianten oder Fragmenten von diesen Peiltiden, und von biologisch oder chemisch synthetisierten Peiltiden oder Peptidfragmenten. Natürlich vorkommende Peiltide, die Affinität für eine oder mehrere Zielzellen besitzen, können Sequenzen von weiteren Peptiden mit erwünschten Eigenschaften, z.B. einer erhöhten Affinität oder Spezifität, bereitstellen, und diese können einzeln oder als Mitglieder einer Bibliothek verwandter Peptide synthetisiert werden. Solche Peptide können auf Basis ihrer Affinität für die Zielzelle ausgewählt werden.
  • Der Ausdruck „oder (ein) Fragment(e) davon", wie er bei der vorliegenden Erfindung und im Zusammenhang mit Polypeptiden der Erfindung verwendet wird, umfasst spezifische Peptide, Aminosäureabschnitte der Polypeptide, wie hier offenbart. Es ist bevorzugt, dass das/die „Fragment(e) davon" (ein) funktionelle(s) Fragment(e) ist/sind. Der Begriff „funktionelles Fragment" bezeichnet einen Teil des oben identifizierten Polypeptids der Erfindung, der, wenigstens teilweise, physiologisch und/oder strukturell, verwandte Aktivitäten des Polypeptids der Erfindung erfüllt. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können rekombinante Polypeptide sein, die in eukaryotischen Zellen, wie etwa in Säugerzellen, exprimiert werden.
  • Allgemein hat rekombinante DNA-Technologie die Expression fremder (heterologer) Proteine in Zelllinien der Wahl möglich gemacht. Bei diesem Prozess wird ein Vektor in den Wirt eingeführt, wobei der Vektor genetisches Material enthält, das eine Wirtszelle dazu veranlasst, ein Protein zu produzieren, das von einem Teil einer heterologen DNA-Sequenz codiert wird, und die transformierte Wirtszelle kann dann fermentiert, kultiviert oder anderweitig Bedingungen unterzogen werden, die die Expression der heterologen DNA erleichtern, was zur Bildung großer Mengen des gewünschten Proteins führt. Plasmide werden in ausgedehntem Maße als Vektoren verwendet, um DNA-Moleküle zu klonieren. Die meisten Plasmidvektoren werden hergestellt, indem man DNA aus einer Vielzahl von Replikons (Plasmide, Bakteriophagen-Chromosomen und bakterielle Chromosomen) entnimmt und die DNA zusammenfügt (unter Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA-Ligase), um ein Plasmid herzustellen, das einen Replikationsursprung, einen Selektionsmarker (gewöhnlich ein Antibiotika-Resistenzgen) und einen Promotor zum Exprimieren von interessierenden Genen in der benötigten Wirtszelle aufweist. Ein Vektor kann z.B. so sein, wie in den US-Patenten der Nummern 5,990,091 und 6,004,777 , und wie in PCT/US00/04203 beschrieben. Verfahren zur Erzeugung und Verwendung rekombinanter Vektoren in vitro sind in der Technik wohlbekannt. Siehe hierzu Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (z.B. Prozeduren zur Isolierung von DNA, Konstruktion rekombinanter Vektoren, Transfizieren und Transformieren von Zellen und zur Produktion heterologer Peptide).
  • Weiterhin kann der rekombinante Vektor zusätzlich zu den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung (z.B. denjenigen, die für das Zielsteuerungs-Peptid oder funktionelle Fragmente davon codieren) Expressionskontrollelemente umfassen, die eine korrekte Expression der codierenden Regionen in geeigneten Wirten erlauben. Solche Kontrollelemente sind in der Technik bekannt und können einen Promotor, eine Spleiß-Kassette, ein Translationsstartcodon, eine Translations- und Insertionsstelle für die Einführung eines Inserts in den Vektor enthalten. Bevorzugt wird das Nukleinsäuremolekül funktionsfähig mit Expressionskontrollsequenzen verbunden, die die Expression in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen erlauben.
  • Kontrollelemente, die die Expression in eukaryotischen und prokaryotischen Zellen sicherstellen, sind Fachleuten wohlbekannt. Wie hier im Obigen erwähnt, umfassen diese für gewöhnlich regulatorische Sequenzen, die die Initiation der Transkription sicherstellen, und optional poly-A-Signale, die die Termination der Transkription und die Stabilisierung des Transkripts sicherstellen. Weitere regulatorische Elemente können transkriptionelle ebenso wie translationale Enhancer und/oder natürlich assoziierte oder heterologe Promotorregionen beinhalten. Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression z.B. in Säugerzellen erlauben, umfassen den CMV-HSV Thymidinkinase-Promotor, SV40, den RSV-Promotor (Rous Sarcoma Virus), den humanen Elongationsfaktor 1α-Promotor, aPM-I-Promotor (Schaffer et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 260:416-425) oder (einen) induzierbare(n) Promotor(en), wie etwa von Metallothionein oder Tetracyclin, oder Enhancer, wie etwa den CMV-Enhancer oder den SV40-Enhancer. Für die Expression in prokaryotischen Zellen ist eine Vielzahl von Promotoren beschrieben worden, einschließlich z.B. dem tac-lac-Promotor oder dem trp-Promotor. Neben Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente auch Transkriptionsterminationssignale umfassen, wie etwa die SV40-poly-A-Stelle oder die tk-poly-A-Stelle stromabwärts des Polynukleotids. In diesem Zusammenhang sind geeignete Expressionsvektoren in der Technik bekannt, wie etwa der Okayama-Berg cDNA-Expressionsvektor pcDV 1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL), Casper, Casper-HS43, pUAST oder prokaryotische Expressionsvektoren, wie etwa lambda gt11.
  • Weiterhin, in Abhängigkeit vom Expressionssystem, können Leader-Sequenzen, die befähigt sind, das Polypeptid an ein zelluläres Kompartiment zu steuern, an die codierende Sequenz der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung angefügt werden; diese sind in der Technik wohlbekannt. Die Leader-Sequenz(en) wird/werden in einer geeigneten Phase mit den Translationsinitiations- und -Terminationssequenzen eingebaut, und bevorzugt eine Leader-Sequenz, die befähigt ist, die Sekretion eines translatierten Proteins zu steuern, etwa in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium. Optional kann die heterologe Sequenz für ein Fusionsprotein codieren, das ein C- oder N-terminales Identifikationspeptid einbezieht, das erwünschte Eigenschaften verleiht, z.B. eine Stabilisierung der exprimierten rekombinanten Produkte. Sobald der Vektor in die geeignete Zelllinie eingebaut wurde, werden die Zellen unter Bedingungen gehalten, die für eine Expression der Nukleotidsequenzen auf hohem Niveau geeignet sind.
  • Eine Zelle kann mit einem rekombinanten Vektor transfiziert oder transformiert werden, der das Zielsteuerungspeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Verfahren zur Transformation und Transfektion sind in der Technik wohlbekannt. Die transformierten Zellen können in Fermentern vermehrt und gemäß in der Technik bekannten Techniken kultiviert werden, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen. Die resultierenden transformierten oder transfizierten Zelllinien sind mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung oder mit einem Vektor, der ein solches Nukleinsäuremolekül umfasst, genetisch modifiziert. Der Begriff „genetisch modifiziert" bedeutet, dass die Zelle zusätzlich zu ihrem natürlichen Genom ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor gemäß der Erfindung umfasst, das/der in die Zelle oder den Wirt oder in einen von deren/dessen Vorläufern oder Eltern eingebracht wurde. Das Nukleinsäuremolekül oder der Vektor kann in der genetisch modifizierten Zelle entweder als ein unabhängiges Molekül außerhalb des Genoms vorliegen, bevorzugt als ein Molekül, das zur Replikation befähigt ist, oder es/er kann stabil in das Genom der Zelle integriert sein.
  • Die vorliegende Erfindung kann jedwede geeignete prokaryotische oder eukaryotische Zelle verwenden. Geeignete prokaryotische Zellen sind diejenigen, die allgemein zur Klonierung verwendet werden, wie etwa Escherichia coli oder Bacillus subtilis. Eukaryotische Zellen umfassen z.B. Pilz- oder Tierzellen, und sie werden im allgemeinen verwendet, um den Spezifitätstest durchzuführen. Tierzellen werden bevorzugt dazu verwendet, um den Spezifitätstest durchzuführen. Geeignete Tierzellen sind z.B. Insektenzellen, Vertebratenzellen, bevorzugt Säugerzellen. Weitere geeignete Zelllinien, die in der Technik bekannt sind, sind bei Zelllinien-Hinterlegungsstellen erhältlich, wie etwa von der American Type Culture Collection (ATCC) und aus dem Katalog des „AIDS Research and Reference Reagent"-Programms. Die Ableitung primärer Zellen von einem Tier, bevorzugt von einem Säugetier, und noch bevorzugter von einem Menschen, kann auch zu dem Zweck durchgeführt werden, eine geeignete Zelllinie zu etablieren.
  • Detektierbare Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können weiterhin makromolekulare Träger umfassen, die radioaktiv markiert sind. Beispielsweise können Photosensibilisator-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung radioaktiv markierte makromolekulare Träger umfassen, die an Photosensibilisatoren gekoppelt sind. Eine Anzahl radioaktiv markierter makromolekularer Träger ist auf ihre Fähigkeit hin getestet worden, an arteriothrombotische Materialien zu binden und eine szintigraphische Detektion dieser Materialien zu erlauben. Diese Träger beinhalten markierte Antikörper gegen oxidiertes LDL, Fibrinogen, autologe Blutplättchen, Fibrinfragment E1, Plasminogenaktivatoren und 99mTc-konjugierte Antikörper gegen modifiziertes LDL (Tsimikas et al. (1999) J. Nucl. Cardiol. 6:41-53).
  • Beispiele geeigneter Radionuklide zur Verwendung bei der radioaktiven Markierung beinhalten 131I, 125I, 123I, 99mTc, 18F, 68Ga, 67Ga, 72As, 89Zr, 62Cu, 111Cu, 203In, 198Pb, 198Hg, 97Ru, 11C und 201TI. Durch Radionuklide werden hochspezifische und sensitive Markierungen bereitgestellt, die dann unter Verwendung von Bilderzeugung mittels Positronenemissions-Tomographie (PET) oder Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT) detektiert werden können. Solche Markierungen können in die makromolekularen Träger durch kovalente Bindung direkt an ein Atom des Trägers eingebaut werden, oder die Markierung kann mit dem Träger in nicht-kovalenter oder kovalenter Weise durch eine chelatbildende Struktur oder durch ein Hilfsmolekül, wie etwa Mannitol, Gluconat, Glucoheptonat, Tartrat und dergleichen, assoziiert werden.
  • Im allgemeinen variieren die Markierungsmethodiken mit der Auswahl des Radionuklids und des zu markierenden Trägers. Markierungsverfahren sind z.B. beschrieben in Peters et al. (1986) Lancet 2:946-949; Srivastava et al. (1984) Semin. Nucl. Med 14:68-82; Sinn et al. (1984) J. Nucl. Med. 13:180; McAfee et al. (1976) J. Nucl. Med. 17:480-487; Welch et al., (1977) J. Nucl. Med. 18:558-562; Thakuret et al. (1984) Semin. Nucl. Med. 14:107; Danpure et al. (1981) Br. J. Radiol. 54:597-601; Danpure et al. (1982) Br. J. Radiol. 55:247-249; Peters et al. (1982) J. Nucl. Med. 24:39-44; Gunter et al. (1983) Radiology 149:563-566 und Thakur et al. (1985) J. Nucl. Med. 26:518-523.
  • Nachdem die Markierungsreaktion abgeschlossen ist, kann das Reaktionsgemisch optional unter Verwendung eines oder mehrerer Chromatographieschritte gereinigt werden, wie etwa mittels Sep Pack oder Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Es kann jedes geeignete HPLC-System verwendet werden, wenn ein Reinigungsschritt durchgeführt wird, und die Ausbeute des kardiovaskulären Bildgebungsmittels, das aus dem HPLC-Schritt erhalten wird, kann optimiert werden, indem man die Parameter des HPLC-Systems variiert, wie es in der Technik bekannt ist. Es kann jedweder HPLC-Parameter variiert werden, um die Ausbeute des kardiovaskulären Bildgebungsmittels der Erfindung zu optimieren. Beispielsweise kann der pH variiert werden, z.B. erhöht werden, um die Elutionszeit desjenigen Peaks zu verringern, der dem radioaktiv markierten Träger entspricht.
  • Verabreichung der Photosensibilisator-Zusammensetzung
  • Die Photosensibilisator-Zusammensetzungen der Erfindung können in einem pharmazeutisch verträglichen Hilfs- oder Trägerstoff, wie etwa Wasser, Saline, wässrige Dextrose, Glycerol oder Ethanol, verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können auch andere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger und Hilfssubstanzen, wie etwa Befeuchtungsmittel oder Emulgatoren und pH-Puffermittel, enthalten.
  • Standardtexte, wie etwa Remington: „The Science and Practice of Pharmacy, 17. Auflage, Mack Publishing Company" können konsultiert werden, um geeignete Zusammensetzungen und Formulierungen für die Verabreichung herzustellen, ohne dabei unangemessen zu experimentieren. Geeignete Dosierungen können auch auf dem Text und den hierin zitierten Dokumenten basieren. Eine Bestimmung der angemessenen Dosierungen liegt im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns, dem die hier vorliegenden Parameter an die Hand gegeben werden.
  • Eine „therapeutisch wirksame Menge" ist eine Menge, die hinreichend ist, um ein günstiges oder erwünschtes klinisches Ergebnis zu erhalten. Eine therapeutisch wirksame Menge kann in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden. In Begriffen der Behandlung ist eine wirksame Menge eine Menge, die hinreichend ist, um eine kardiovaskuläre Erkrankung, die durch das Vorhandensein empfindlicher Plaques gekennzeichnet ist, zu lindern, zu bessern, zu stabilisieren, umzukehren, in ihrem Voranschreiten zu verlangsamen oder anderweitig die pathologischen Konsequenzen eines drohenden (Plaque-)Bruchs zu reduzieren. Eine therapeutisch wirksame Menge kann mit einer oder einer Reihe von Verabreichungen bereitgestellt werden. Die wirksame Menge wird im allgemeinen vom Arzt auf einer Fall-bezogenen Basis bestimmt und liegt im Fähigkeitsbereich eines Fachmanns.
  • In der Regel kann die Dosierung für in vivo-Therapeutika oder Diagnostika variieren. Es werden typischerweise mehrere Faktoren berücksichtigt, wenn eine geeignete Dosierung bestimmt wird. Diese Faktoren beinhalten das Alter, das Geschlecht und Gewicht des Patienten, den behandelten Zustand, den Schweregrad des Zustands und die Form des verabreichten Antikörpers.
  • Die Dosierung der Photosensibilisator-Zusammensetzungen kann von 0,1 bis 10 mg/kg reichen. Verfahren zur Verabreichung von Photosensibilisator-Zusammensetzungen sind in der Technik bekannt und sind z.B. beschrieben in den US-Patenten der Nummern 5,952,329 , 5,807,881 , 5,798,349 , 5,776,966 , 5,789,433 , 5,736,563 , 5,484,803 , sowie in Sperduto et al. (1991) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 21:441-6; Walther et al. (1997) Urology 50:199-206. Solche Dosierungen können z.B. in Abhängigkeit davon variieren, ob mehrfache Verabreichungen gegeben werden, vom Gewebetyp und der Verabreichungsroute, dem Zustand des Individuums, dem gewünschten Ziel und anderen Faktoren, die Fachleuten bekannt sind. Da, wo die Photosensibilisator-Zusammensetzung ein Photoimmunkonjugat umfasst, können die Dosierungen von etwa 0,01 mg/m2 bis etwa 500 mg/m2, bevorzugt von 0,1 mg/m2 bis etwa 200 mg/m2, am bevorzugtesten von etwa 0,1 mg/m2 bis etwa 10 mg/m2 variieren. Die Ermittlung von Dosierungsbereichen liegt ohne weiteres im Fähigkeitsbereich des Fachmanns. Beispielsweise muss die Konzentration von scFv typischerweise nicht so hoch sein wie die von nativen Antikörpern, um therapeutisch wirksam zu sein. Die Verabreichungen können mit geringer Häufigkeit oder auf einer regulären wöchentlichen Basis erfolgen, bis ein gewünschter, messbarer Parameter detektiert wird, wie etwa eine Verringerung der Krankheitssymptome. Die Verabreichung kann dann herabgesetzt werden, wie etwa auf eine zweiwöchentliche oder monatliche Basis, wie es angemessen ist.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden auf eine Weise verabreicht, die der Form der Zusammensetzung angemessen ist. Verfügbare Verabreichungsrouten beinhalten subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale, orale, intranasale, intrapulmonale (z.B. durch Aerosol), intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intracavitale, intrathekale oder transdermale Verabreichung, alleine oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Mitteln. Die therapeutischen Zusammensetzungen der Photosensibilisatoren werden oft durch Injektion oder durch allmähliche Perfusion verabreicht.
  • Zusammensetzungen für die orale, intranasale oder topische Verabreichung können in festen, halbfesten oder flüssigen Formen, einschließlich Tabletten, Kapseln, Pulvern, Flüssigkeiten und Suspensionen, geliefert werden. Zusammensetzungen für die Injektion können als flüssige Lösungen oder Suspensionen, als Emulsionen oder als feste Formen, die geeignet sind, um sie vor der Injektion in Flüssigkeit zu lösen oder zu suspendieren, geliefert werden. Für eine Verabreichung über den Atmungstrakt ist eine bevorzugte Zusammensetzung eine solche, die einen Feststoff, ein Pulver oder ein Flüssig-Aerosol bereitstellt, wenn sie mit einer geeigneten Zerstäubervorrichtung verwendet wird. Obwohl dies nicht zwingend ist, werden die Zusammensetzungen bevorzugt in einer Einheits-Dosierungsform bereitgestellt, die für die Verabreichung einer exakten Menge geeignet ist. Ebenfalls bei dieser Erfindung ins Auge gefasst werden Formen mit verlangsamter oder anhaltender Freisetzung, wodurch über eine verlängerte Zeitspanne ein relativ konstantes Niveau des Wirkstoffs bereitgestellt wird.
  • Ein weiteres Verfahren der Verabreichung ist intravaskulär, z.B. durch direkte Injektion in das Blutgefäß, den Plaque oder das umgebende Gebiet.
  • Es kann weiterhin erstrebenswert sein, die Zusammensetzungen lokal an das Gebiet zu verabreichen, das der Behandlung bedarf; dies kann z.B. erreicht werden durch lokale Infusion bei der Chirurgie, durch Injektion, mittels eines Katheters oder mittels eines Implantats, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht-porösen oder gelatinösen Material besteht, einschließlich Membranen, wie etwa silastischer Membranen oder Fasern. Eine geeignete derartige Membran ist Gliadel®, die von Guilford Pharmaceuticals Inc. geliefert wird.
  • Nach der Verabreichung der Photosensibilisator-Zusammensetzung ist es notwendig, zu warten, damit der Photosensibilisator eine wirksame Gewebekonzentration an der Stelle des Plaques erreicht, bevor die Photoaktivierung erfolgt. Die Dauer des Warteschritts variiert in Abhängigkeit von Faktoren, wie etwa der Verabreichungsroute, der Tumorposition und der Geschwin digkeit der Photosensibilisator-Bewegung im Körper. Zusätzlich, dort, wo die Photosensibilisator-Zusammensetzungen auf Rezeptoren oder Rezeptor-bindende Epitope abzielen, kann die Geschwindigkeit der Photosensibilisator-Aufnahme in Abhängigkeit vom Niveau der Rezeptor-Expression auf der Oberfläche der Zellen variieren. Dort, wo es beispielsweise ein hohes Niveau der Rezeptorexpression gibt, wird die Geschwindigkeit der Bindung und Aufnahme gesteigert. Die Bestimmung eines nützlichen Bereichs für die Dauer des Warteschritts liegt im Bereich der Durchschnittsfachkenntnisse und kann durch die Verwendung optischer Fluoreszenzbilderzeugungstechniken optimiert werden.
  • Vorrichtungen und Verfahren für die Aktivierung der Photosensibilisator-Zusammensetzung
  • Nach dem Warteschritt wird die Photosensibilisator-Zusammensetzung durch photoaktivierendes Licht aktiviert, das an der Stelle des Plaques appliziert wird. Dies wird erreicht, indem man Licht einer geeigneten Wellenlänge und Intensität für eine wirksame Zeitspanne und an der Stelle des Plaques appliziert. Wie hier verwendet, bedeutet „Photoaktivierung" eine lichtinduzierte chemische Reaktion eines Photosensibilisators, die einen biologischen Effekt erzeugt.
  • Die Zielgewebe werden bestrahlt, bevorzugt mit rotem Licht. In Anbetracht dessen, dass rotes Licht und/oder Nahinfrarot-Licht Säugergewebe am besten durchdringt, sind Photosensibilisatoren mit starken Extinktionen im Bereich von 600 nm bis 900 nm optimal für die PDT. Die geeignete Wellenlänge oder der geeignete Bereich von Wellenlängen wird von dem/den speziell verwendeten Photosensibilisator(en) abhängen. Die Wellenlängenspezifität für die Photoaktivierung hängt von der molekularen Struktur des Photosensibilisators ab. Die Photoaktivierung erfolgt mit sub-ablativen Lichtdosen. Die Bestimmung einer geeigneten Wellenlänge, Lichtintensität und Bestrahlungsdauer liegt im Bereich der durchschnittlichen technischen Fähigkeiten.
  • Für die Photoaktivierung wird die Lichtwellenlänge übereinstimmend mit dem elektronischen Absorptionsspektrum des Photosensibilisators gewählt, sodass Photonen von dem Photosensibilisator absorbiert werden und die gewünschte Photochemie stattfinden kann. Abgesehen von der Situation, dass die behandelten Gefäße sehr oberflächlich liegen, liegt der Bereich des Aktivierungslichts typischerweise zwischen 600 und 900 nm. Dies liegt daran, dass endogene Moleküle, insbesondere Hämoglobin, eine starke Lichtabsorption unterhalb von 600 nm zeigen und daher die meisten der eintretenden Photonen einfangen (Parrish et al., (1978) Optical properties of the skin and eyes. New York, NY: Plenum). Der Nettoeffekt wäre die Beeinträchtigung der Penetration des Aktivierungslichts durch das Gewebe. Der Grund für die obere Grenze von 900 nm besteht darin, dass die Energetik bei dieser Wellenlänge unzureichend sein kann, um 1O2, den aktivierten Zustand von Sauerstoff, zu erzeugen, der, ohne sich hier zwingend durch irgendeine Theorie festlegen zu wollen, möglicherweise entscheidend für eine erfolgreiche PDT ist. Zusätzlich beginnt Wasser bei einer Wellenlänge von mehr als etwa 900 nm zu absorbieren.
  • Die wirksame Penetrationstiefe, δeff, einer gegebenen Lichtwellenlänge ist eine Funktion der optischen Eigenschaften des Gewebes, wie etwa Absorption und Streuung. Die Fluenz (Lichtdosis) in einem Gewebe steht wie folgt im Zusammenhang mit der Tiefe (d): e–d/δeff. Typischerweise beträgt die wirksame Penetrationstiefe etwa 2 bis 3 mm bei 630 nm und steigt bei längeren Wellenlängen (700-800 nm) auf 5 bis 6 nm an (Svaasand und Ellingsen, (1983) Photochem Photobiol. 38:293-299). Diese Werte können verändert werden, indem man die biologischen Interaktionen und physikalischen Eigenschaften des Photosensibilisators verändert. Im allgemeinen sind Photosensibilisatoren mit längeren Absorptionswellenlängen und höheren molaren Absorptionskoeffizienten bei diesen Wellenlängen wirksamere photodynamische Mittel.
  • Die PDT-Dosis hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Menge an verabreichtem Photosensibilisator, der Wellenlänge des photoaktivierenden Lichts, der Intensität des photoaktivierenden Lichts und der Dauer der Bestrahlung mit dem photoaktivierenden Licht. Somit kann die Dosis der PDT auf eine therapeutisch wirksame Dosis eingestellt werden, indem man einen oder mehrere dieser Faktoren anpasst. Solche Anpassungen liegen im Bereich der normalen technischen Fähigkeiten.
  • Das Licht für die Photoaktivierung kann durch jedwedes geeignete und in der Technik bekannte Mittel erzeugt und der Stelle des Plaques zugeführt werden. Photoaktivierendes Licht kann der Plaquestelle von einer Lichtquelle, wie etwa einem Laser oder einer optischen Faser, zugeführt werden. Bevorzugt wird das photoaktivierende Licht durch optische Faservorrichtungen ausgeliefert, die die Plaquestelle direkt bestrahlen. Beispielsweise kann das Licht durch optische Fasern ausgeliefert werden, die durch kleinkalibrige hypodermische Nadeln gefädelt sind. Licht kann durch einen geeigneten intravaskulären Katheter zugeführt werden, wie etwa solchen, wie sie in den US-Patenten Nr. 6,246,901 und 6,096,289 beschrieben sind, die eine optische Faser enthalten können. Optische Fasern können auch durch Arthroskope hindurch geleitet werden. Zusätzlich kann Licht durch perkutane Instrumente unter Verwendung von optischen Fasern oder Wellenleitern mit Kanüle übertragen werden. Für offene chirurgische Stellen beinhalten geeignete Lichtquellen konventionelle Breitbandlichtquellen, breite Anordnungen von LEDs und defokussierte Laserstrahlen.
  • Die Auslieferung kann durch alle in der Technik bekannten Verfahren erfolgen, einschließlich Transillumination. Einige Photosensibilisatoren können durch Nahinfrarotlicht aktiviert werden, das tiefer in biologische Gewebe eindringt als andere Wellenlängen. Somit ist Nahinfrarot licht vorteilhaft für die Transillumination. Die Transillumination kann unter Verwendung einer Vielzahl von Vorrichtungen durchgeführt werden. Die Vorrichtungen können Laser- oder Nicht-Laser-Quellen (z.B. Lichtboxen oder konvergente Lichtstrahlen) verwenden.
  • Dort, wo Behandlung erwünscht ist, werden die Dosierung der Photosensibilisator-Zusammensetzung und die Lichtaktivierung der Photosensibilisator-Zusammensetzung in einer Menge verabreicht, die hinreichend ist, um eine phototoxische Spezies zu erzeugen. Wenn die Photosensibilisator-Zusammensetzung beispielsweise Chlorine6 enthält, so erfolgt die Verabreichung bei Menschen in einem Dosisbereich von 0,5-10 mg/kg, bevorzugt von 1-5 mg/kg, bevorzugter von 2-4 mg/kg, und die Dauer der Lichtzufuhr erstreckt sich über Intervalle von 30 Minuten bis 3 Tagen, bevorzugt von 12 Stunden bis 48 Stunden, und bevorzugter von 24 Stunden. Die verabreichte Lichtdosis liegt im Bereich von 20-500 J/cm, bevorzugt von 50-300 J/cm und bevorzugter von 100-200 J/cm. Die Fluenzrate liegt im Bereich von 20-500 mW/cm, bevorzugt von 50-300 mW/cm und bevorzugter von 100-200 mW/cm. Es gibt eine reziproke Beziehung zwischen den Photosensibilisator-Zusammensetzungen und der Licht-Dosis, somit liegt die Bestimmung einer geeigneten Wellenlänge, Lichtintensität und Bestrahlungsdauer im Bereich durchschnittlicher Fachkenntnis.
  • Bevorzugt induziert die phototoxische Spezies Apoptose und nicht Nekrose der Zellen, die in dem empfindlichen Plaque enthalten sind. Eine Verringerung der Fluenzrate wird Apoptose favorisieren (d.h. weniger als 100 mW/cm, z.B. 10-60 mW/cm, für Chlorine6). Die Bestimmung einer geeigneten Fluenzrate für eine Photosensibilisator-Zusammensetzung liegt im Bereich des Durchschnittsfachwissens.
  • Wenn die fluoreszente Zusammensetzung einen photoaktiven Farbstoff umfasst, so können die Wellenlänge und Lichtenergie gemäß den in der Technik bekannten Standardverfahren angepasst werden, um die Erzeugung der phototoxischen Spezies zu kontrollieren. Somit wird unter bestimmten Bedingungen (z.B. niedriger Energie, geringer Fluenzrate, kürzerer Lichtwellenlänge oder irgendeiner Kombination hiervon) eine fluoreszente Spezies aus dem photoaktiven Farbstoff produziert, und jedwede reaktive Spezies, die produziert wird, hat einen vernachlässigbaren Effekt. Diese Bedingungen lassen sich leicht anpassen, um die Erzeugung einer phototoxischen Spezies zu bewirken. Wenn der photoaktive Farbstoff z.B. Chlorine6 umfasst, so beträgt die Lichtdosis, die verabreicht wird, um eine fluoreszente Spezies und eine unwesentliche reaktive Spezies zu erzeugen, weniger als etwa 10 J/cm, bevorzugt weniger als etwa 5 J/cm und bevorzugter weniger als etwa 1 J/cm. Die Bestimmung einer geeigneten Wellenlänge, Lichtintensität und Bestrahlungsdauer liegt im Bereich des Durchschnittsfachwissens.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Photoaktivierung unter Verwendung einer speziell ausgestalteten intravaskulären Vorrichtung durchgeführt werden, die Anregungslicht an die Plaqueoberfläche im Inneren der Arterie ausliefert und emittierte Fluoreszenz oder andere detektierbare Signale (z.B. Wärme oder Radioaktivität) empfängt, die an ein Analyseinstrument übertragen werden. Die gleiche Vorrichtung kann optional verwendet werden, um therapeutisches Licht zu übertragen, wenn ein Fluoreszenzsignal oder ein anderes messbares Signal (z.B. Wärme oder Radioaktivität) detektiert wird.
  • 1A veranschaulicht ein Detektions-/Behandlungssystem 100 zum Detektieren von und/oder Abzielen auf und/oder Behandeln von empfindlichen Plaques in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung. Wie in 1A gezeigt, kann das Detektions-/Behandlungssystem 100 eine Kontrolleinheit 105 und eine Detektions-/Behandlungseinheit 110 beinhalten, die eine Lichtquelle/einen Laser 113 beinhalten kann, sowie eine Detektions-/Behandlungsvorrichtung 115, die eine Sonde, einen Katheder usw. enthalten kann.
  • Die Kontrolleinheit 105 kann ein Netzteil beinhalten; z.B. kann die Kontrolleinheit an eine Stromquelle gekoppelt werden, um die Detektions-/Behandlungseinheit 110 mit Energie zu versorgen. Die Kontrolleinheit 105 kann auch eine Computervorrichtung beinhalten, die zum Kontrollieren Kontroll-Hardware und/oder -Software besitzt, basierend auf eingegebenen Parametern und/oder detektierten Eigenschaften, sowie eine Detektions-/Behandlungs-Einheit 110, eine Lichtquelle/einen Laser 113 und eine Detektions-/Behandlungsvorrichtung 115.
  • 1B ist ein Diagramm, das eine Anordnung der Kontrolleinheit 105 in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung zeigt. Wie in 1B dargestellt, kann die Kontrolleinheit 105 eine Computervorrichtung 125, die ein normaler Altzweck-Computer (wie etwa ein PC), eine Arbeitsstation, ein Großrechner-Computersystem und so fort, sein kann, umfassen. Die Computervorrichtung 125 kann einen Prozessor (oder eine zentrale Prozessierungseinheit, „CPU") 130, eine Speichervorrichtung bzw. einen Arbeitsspeicher 135, eine Datenspeichervorrichtung 140, ein Benutzer-Interface 145, einen Systembus 150 und ein Kommunikations-Interface 155 beinhalten. Die CPU 130 kann jedweder Typ von Prozessorvorrichtung sein, um Befehle auszuführen, Daten weiterzuverarbeiten, und so fort. Die Speichervorrichtung 135 kann jedweder Typ von Speichervorrichtung sein, einschließlich eines jeden oder mehrerer von Random Access Memory ("RAM"), Read-only Memory ("ROM"), Flash Memory, elektrisch löschbarem programmierbarem Read-only Memory ("EEPROM") und so fort sein. Die Datenspeichervorrichtung 140 kann jedwede Datenspeichervorrichtung sein, um auf jedwedem entnehmbarem und/oder integriertem optischen, magnetischen und/oder optisch-magnetischen Datenspeichermedium und der gleichen (z.B. eine Diskette, eine Compact Disc mit Read-only Memory „CD-ROM", eine (wieder)beschreibbare CD „CD-RW", eine „Digital-versatile DISC-ROM" „DVD-ROM", „DVD-RW" und so fort) lesen oder dieses beschreiben zu können. Die Datenspeichervorrichtung 140 kann auch eine Kontrolleinrichtung/ein Interface (nicht gezeigt) beinhalten, um eine Verbindung mit dem Systembus 150 herzustellen. Somit sind die Speichervorrichtung 135 und die Datenspeichervorrichtung 140 geeignet ebenso zum Speichern von Daten wie auch von Anweisungen für programmierte Prozesse für die Ausführung auf der CPU 130. Das Benutzer-Interface 145 kann einen auf Berührung ansprechenden Bildschirm, eine Kontrolltafel, ein Keyboard, ein Keypad, ein Display (Anzeige) oder irgendeinen anderen Typ von Interface beinhalten, das mit dem Systembus 150 durch eine entsprechende Eingabe/Ausgabe-Vorrichtung Interface-Adapter (nicht gezeigt) verbunden sein kann. Das Kommunikations-Interface 155 kann dafür ausgelegt sein, mit jedwedem Typ von externer Vorrichtung zu kommunizieren, einschließlich der Detektions-/Behandlungs-Einheit 110. Das Kommunikations-Interface 155 kann weiterhin angepasst werden, um mit einem beliebigen System oder Netzwerk (nicht gezeigt) zu kommunizieren, so etwa mit einer oder mehreren Computervorrichtungen auf einem Netzwerk lokaler Ebene (local area network, („LAN")), einem Netzwerk weiter Ebene („WAN"), dem Internet und so fort. Das Interface 155 kann direkt mit dem Systembus 150 verbunden sein, oder es kann über ein geeignetes Interface (nicht gezeigt) verbunden sein. Die Kontrolleinheit 105 kann somit für die Ausführung der Prozesse sorgen, und zwar durch sich selbst und/oder in Kooperation mit einer oder mehreren zusätzlichen Vorrichtungen, die Algorithmen zum Kontrollieren der Detektions-/Behandlungs-Einheit 110 gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten können. Die Kontrolleinheit 105 kann programmiert oder instruiert werden, um diese Prozesse gemäß irgendeinem Kommunikationsprotokoll oder einer Programmiersprache auf irgendeiner Plattform durchzuführen. Somit können die Prozesse in Daten und ebenso in Anweisungen verkörpert werden, die in der Speichervorrichtung 135 und/oder der Datenspeichervorrichtung 140 gespeichert sind, oder die am Interface 155 und/oder am Benutzer-Interface 145 für die Ausführung über die CPU 130 empfangen werden.
  • Wiederum bezugnehmend auf 1A kann eine Detektions-/Behandlungs-Einheit 110 eine Handheld-Vorrichtung, ein automatisierter Apparat und dergleichen sein. Wie in 1A gezeigt, kann die Detektions-/Behandlungsvorrichtung 115 in ein Blutgefäß 120 eingeführt und in diesem ausgefahren werden, so etwa in einer Arterie in Gewebe 125. Die Detektions-/Behandlungs-Vorrichtung 115 kann eine Handheld-Vorrichtung bzw. ein automatisierter Apparat sein. Es wird weiterhin angemerkt, dass die Elemente des Detektions-/Behandlungssystems 100 in eine einzige physikalische Einheit integriert sein können oder eine beliebige Anzahl separater Einheiten umfassen können, sodass eine beliebige Anzahl dieser Elemente oder deren Funktionalität in eine physikalische Vorrichtung eingebaut werden kann. Wie unten in weiterem Detail beschrieben werden wird, kann die Detektions-/Behandlungs-Vorrichtung 115 eine Anzahl von Lichtzufuhrelementen für die Übertragung von detektiertem Licht von dem angesteuerten Plaque, für die Zufuhr von therapeutischem Licht und/oder für die Zufuhr von Detektions-/Anregungslicht beinhalten.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann die Lichtquelle 113 einen blauen Pulslaser beinhalten, um Detektions- oder Anregungslicht über die Detektions-/Behandlungsvorrichtung 115 zuzuführen. In Abhängigkeit von dem Farbstoff und/oder dem Anregungseffekt auf den Ziel-Plaque gemäß obiger Beschreibung kann reflektiertes und/oder emittiertes Licht von dem Ziel-Plaque Licht mit einer bestimmten Wellenlänge und/oder Frequenz beinhalten, das dann über die Detektions-/Behandlungs-Vorrichtung 115 detektiert werden kann. Eine große Anzahl von Fluoreszenzsonden (z.B. Photosensibilisatoren, Fluoreszenzfarbstoffe oder photoaktive Farbstoffe) und Verfahren zu deren Verwendung (z.B. Anregungs- und Emissionswellenlängen) ist beschrieben in dem Katalog von Molecular Probes, Inc., (Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6. Auflage, von Richard Haugland).
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung, bei der die Fluoreszenz-Zusammensetzung oder die Photosensibilisator-Zusammensetzung Chlorine6 beinhaltet, kann das Detektions-/Anregungslicht eine Wellenlänge von 337 nm beinhalten (z.B. Stickstofflaser); therapeutisches Licht kann eine Wellenlänge von 405 nm beinhalten (z.B. gepumpter Farbstoff-Laser); und Licht oder Fluoreszenz, die als Ergebnis der Anregung durch Detektions-/Anregungslicht von einem Ziel-Plaque emittiert wurde, kann eine Wellenlänge von 666-668 nm beinhalten. Die Energie des Detektions-/Anregungslichts kann z.B. gemäß der spezifischen Anregungs- oder Emissionswellenlänge der spezifischen verwendeten Fluoreszenz- oder Photosensibilisator-Zusammensetzung angepasst werden. Die Energie des Detektions-/Anregungslichts kann z.B. in Übereinstimmung mit einer Größe und/oder Dimension von Blutgefäß 120 angepasst werden. Die Energie des therapeutischen Lichts kann z.B. in Übereinstimmung mit einer Größe und/oder Dimension von Blutgefäß 120 und/oder gemäß dem Niveau des von dem Ziel-Plaque detektierten Lichts angepasst werden.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann das Detektions-/Behandlungssystem 100 eine Anzahl von Konfigurationen und Instrumenten beinhalten. Es können Algorithmen, die für verschiedene Typen von Prozeduren, Konfigurationen und/oder Instrumenten konzipiert wurden, für die Kontrolleinheit 105 einbezogen werden.
  • Es wird angemerkt, dass das Detektions-/Behandlungssystem 100 per Fernsteuerung kontrolliert werden kann. Beispielsweise kann die Verbindung zwischen der Kontrolleinheit 105 und der Detektions-/Behandlungseinheit 110 eine Fernverbindung sein (per Kabel oder kabellos), die der Kontrolleinheit 105 eine Fernkontrolle über die Lichtquelle 113 und die Detektions-/Behandlungsvorrichtung 115 bereitstellt.
  • Obwohl das obige beispielhafte Detektions-/Behandlungssystem 100 veranschaulichend ist für die Basisbestandteile eines Systems, das zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet ist, soll die gezeigte Architektur nicht als einschränkend betrachtet werden, da viele Variationen der Hardware-Anordnung möglich sind, ohne von der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
  • Die vorliegende Erfindung wird zusätzlich mittels der folgenden veranschaulichenden Beispiele beschrieben, die ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer vielen Vorteile bereitstellen.
  • Wie zuvor beschrieben, kann sich der Ziel-Plaque an der Wand von Blutgefäßen ansammeln, z.B. an Arterien und dergleichen. Somit kann die Detektions-/Behandlungsvorrichtung 115, die die vorliegende Erfindung verkörpert, eine Sonde/einen Katheter und dergleichen beinhalten, wie unten beschrieben, die/der eine Reihe von Elementen beinhalten kann, um den Ziel-Plaque an der Wand dieser Blutgefäße zu detektieren, den Ziel-Plaque von Nicht-Ziel-Plaque zu unterscheiden und/oder um den Ziel-Plaque zu behandeln, ohne den Blutfluss durch diese Gefäße zu blockieren.
  • Die 2A, 2B, 2C, 2D, 2E und 2F sind Diagramme, die eine Sonde/einen Katheter 200 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigen. Wie in 2A gezeigt, kann Sonde/Katheter 200 eine Außeneinheit 202 und eine ausfahrbare Inneneinheit beinhalten, die eine Anzahl von Lichtzufuhrelement(en) 205 und Lichtablenkelement(en) 210 und eine Spitze 215 beinhalten kann. Beispielsweise kann die Außeneinheit 202 jedwedes Kunststoff- und/oder metallische Material (z.B. Nitinol-Legierung) und dergleichen enthalten. 2A veranschaulicht Sonde/Katheter 200, wobei die Inneneinheit in die Außeneinheit 202 zurückgezogen bzw. aus dieser ausgefahren ist, und 2B zeigt Sonde/Katheter 200 mit ausgefahrener und positionierter Inneneinheit. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann die Inneneinheit ausgestreckt bzw. ausgefahren und positioniert werden, um Ziel-Plaque zu detektieren, und dann zurückgezogen werden, um Sonde/Katheter 200 zu einer anderen Region zu bewegen, z.B. im Blutgefäß 120. Beispielsweise kann Sonde/Katheter 200 verwendet werden, um das Blutgefäß 120 zu scannen, wobei Sonde/Katheter 200 entlang des Blutgefäßes 120 bewegt wird und die Inneneinheit alle ein bis sechs Millimeter ausgefahren wird, um eine Detektion durchzuführen. Ein Lenkdraht 223 kann verwendet werden, um Sonde/Katheter 200 entlang des Blutgefäßes 120 zu führen, und/oder um die Inneneinheit (z.B. das/die Lichtzufuhrelement(e) 205 und die Lichtablenkelemente 210 und so fort) aus der Außeneinheit 202 auszufahren bzw. in diese zurückzuziehen. Beispielsweise kann der Lenkdraht 223 jedwedes Kunststoff- und/oder Metallmaterial (z.B. Nitinol-Legierung) beinhalten. Das/die Lichtablenkelement(e) 210 kann eine glatte Oberfläche beinhalten, um mit der Wand des Blutgefäßes 120 in Kontakt zu treten und somit eine Detektion zu erlauben, während Sonde/Katheter 200 bewegt wird. Die Detektion kann durchgeführt werden, ohne die Wand zu berühren, oder Sonde/Katheter 200 kann auch gestoppt werden, um eine solche Detektion durchzuführen. Sonde/Katheter 200 kann vier Lichtzufuhrelemente 205 beinhalten, wobei jedes ein Lichtablenkelement 210 beinhaltet. Jedes der vier Lichtzufuhrelemente 205 kann so positioniert werden, dass die entsprechenden Lichtablenkelemente 210 eine Kreisbahn bilden, jeweils mit Abständen von 90 Grad, wie in den Querschnittsansichten in den 2C und 2D gezeigt. Es wird angemerkt, dass Sonde/Katheter 200 eine beliebige Anzahl von Lichtzufuhr-Element(en) 205 (und Lichtablenkelement(en) 210) beinhalten kann, die durch einen entsprechenden Winkel um eine Kreisbahn getrennt sind, um eine unterteilte Fläche der umgebenden Wand des Blutgefäßes 120 abzudecken. Sonde/Katheter 200 kann auch drehbar sein, um die Kreisbahn des Blutgefäßes 120 abzudecken. In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann Sonde/Katheter 200 drei bis sechs Lichtzufuhrelemente 205 (und Lichtablenkelemente 210) beinhalten. Es wird natürlich angemerkt, dass die Lichtzufuhrelemente 205 aus einem einzelnen Element abgespalten sein können, das mit der Detektion-/Behandlungseinheit 110 verbunden ist, oder sie können in separater Form mit der Detektions-/Behandlungseinheit 110 verbunden sein.
  • Wie in größerem Detail unten beschrieben werden wird, kann/können das/die Lichtablenkelement(e) 210 äußeres Licht, das vom Blutgefäß 120 empfangen wurde, in das/die Lichtzufuhrelement(e) 205 umleiten, die dann das empfangene Licht für die Analyse an die Detektions-/Behandlungseinheit 110 und/oder an die Kontrolleinheit 105 ausliefern. Das/die Lichtablenkelement(e) 210 kann/können auch Detektions-/Anregungslicht ablenken, das von der Detektions-/Behandlungseinheit 110 durch das/die Lichtzufuhrelement(e) 205 ausgeliefert werden kann, wobei das Detektions-/Anregungslicht auf ein Zielgebiet im Blutgefäß 120 abgestrahlt wird. Und so kann reflektiertes und/oder vom angeregten Ziel-Plaque emittiertes Licht empfangen werden, wie oben beschrieben. In Abhängigkeit vom Farbstoff und/oder dem Anregungseffekt auf den Ziel-Plaque gemäß vorheriger Beschreibung kann der Ziel-Plaque Licht mit einer bestimmten Wellenlänge und/oder Frequenz reflektieren und/oder emittieren. Somit kann der Ziel-Plaque identifiziert und lokalisiert werden, indem man Licht mit einer solchen spezifischen Wellenlänge und/oder Frequenz aus dem vom Blutgefäß 120 empfangenen Licht detektiert und identifiziert.
  • Das/die Lichtzufuhrelement(e) 205 kann/können eine optische Faser beinhalten, um Licht, das an der/den entsprechenden Lichtablenkelement(en) 210 empfangen wurde, an die Behandlungseinheit 110 und/oder die Kontrolleinheit 105 auszuliefern. Das/die Lichtzufuhrelement(e) 205 können außerdem Detektions-/Anregungslicht von der Lichtquelle 113 an das/die zugehörige(n) Lichtablenkelement(e) 210 ausliefern, wo es abgelenkt bzw. umgeleitet wird und auf das Blutgefäß 120 abgestrahlt wird. Wie in 2A gezeigt, kann/können das/die Lichtzufuhrelement(e) 205 sich bis zu einer Spitze 215 ausdehnen und sich an diese anschließen.
  • Wie in 2B gezeigt, kann/können das/die Lichtzufuhrelement(e) 205 sich nach außen bewegen, sodass das/die Lichtablenkelement(e) 210 in Richtung der Wand des umgebenden Blutgefäßes 120 bewegt werden, was somit eine bessere Plaque-Detektion erlaubt. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann/können das/die Lichtzufuhrelement(e) 205 eine starre und/oder federartige Struktur beinhalten, z.B. eine Kunststoffstruktur, sodass sich die Struktur beim Ausfahren bzw. Vorschieben ausdehnt, wie in 2B gezeigt, und innerhalb einer Außeneinheit 202 komprimiert werden kann, wenn sie zurückgezogen bzw. eingezogen wird, wie in 2A gezeigt. Die feste Struktur kann jedwedes elastische Material beinhalten, sodass sich die Struktur jedes Mal, wenn sie ausgezogen wird, wie in 2B gezeigt, auf weitgehend dieselbe Größe und Form ausdehnt.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann Sonde/Katheter 200 einen Behälter (oder „Ballon") 220 aufweisen, der ausgedehnt werden kann, indem er mit einem Fluid befüllt wird. Somit kann der Behälter 220 beim Ausfahren, wie in 2B gezeigt, mit einem Fluid befüllt und ausgedehnt werden, was das/die Lichtablenkelement(e) 210 hin zu der umgebenden Wand des Blutgefäßes 120 schiebt. Das Fluid kann jedwedes nicht-toxische Fluid sein, wie etwa Saline und so weiter. Als Beispiel kann das Gefäß 220 ein beliebiges elastisches Material beinhalten, wie etwa Gummi oder Latex. Die Kontrolleinheit 105 und/oder die Detektions-/Behandlungseinheit 110 können den Fluss des Fluids von und zu dem Gefäß 220 kontrollieren, sodass das Fluid zu diesem angeliefert wird, wenn Sonde/Katheter 200 ausgefahren wird, und abgezogen wird, wenn Sonde/Katheter 200 zurückgezogen wird. Vorteilhafterweise kann die Menge an Fluid kontrolliert werden, um zur Größe des umgebenden Blutgefäßes 120 zu passen. Mit anderen Worten kann weniger Fluid ausgeliefert werden, wenn das Blutgefäß 120 relativ klein ist, und mehr Fluid, wenn das Blutgefäß 120 relativ groß ist. Auf diese Weise kann/können das/die Lichtablenkelement(e) 210 in Richtung der Wand eines Blutgefäßes 120 von beliebiger Größe bewegt werden, wobei es verhindert wird, dass (ein) Lichtablenkelement(e) 210 gegen die Wand eines kleineren Blutgefäßes 120 gepresst wird/werden.
  • Die 2C und 2D sind Diagramme, die Querschnittsansichten der 2A bzw. 2B darstellen. Wenn das Gefäß 220 ausgedehnt wird oder das/die Lichtablenkelement(e) 210 auf andere Weise in Richtung der Wand des Blutgefäßes 120 bewegt wird/werden, ist es wichtig, dass der Blutfluss durch das Blutgefäß 120 nicht behindert wird. Daher kann das Gefäß 220 in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung eine Anzahl eines oder mehrerer starrer Elemente 225 beinhalten, sodass sich nur ein bestimmter Teil von Gefäß 220 ausdehnt, wenn dieses mit einem Fluid gefüllt wird. Als Beispiel kann/können das/die starre(n) Element(e) 225 ein starres Material beinhalten, z.B. einen beliebigen Kunststoff und/oder ein metallisches Material (z.B. eine Nitinol-Legierung). Wie in den 2C und 2D gezeigt, kann das Gefäß 220 vier rigide Elemente 225 beinhalten, wie etwa Kunststoffrippen. Wie in 2D gezeigt, kann/können das/die starren Element(e) 225 das Gefäß 220 in Position halten, wobei nur Regionen von Gefäß 220, die sich in Nachbarschaft zu Lichtzufuhrelement(en) 205 und Lichtablenkelement(en) 210 befinden, sich nach außen ausdehnen können. Daher blockiert das Gefäß 220 das Blutgefäß 120 nicht wesentlich, wenn es ausgedehnt wird. Das/die Lichtablenkelement(e) 210 können somit nach außen hin zur Wand von Blutgefäß 120 bewegt werden, ohne den Blutfluss zu behindern.
  • Die 2E und 2F zeigen Querschnittsansichten von Sonde/Katheter 200 in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung. Wie in den 2E und 2F gezeigt, kann das Gefäß 220 eine isolierte Kammer beinhalten, die zu einem bestimmten Lichtablenkelement 210 gehört. Somit kann jedes von einer beliebigen Anzahl bestimmter Lichtablenkelemente 210 in Beziehung zu einer solchen Kammer im Gefäß 220 stehen, sodass das/die Element(e) 210 einzeln zu der Wand von Blutgefäß 120 hin und von dieser weg bewegt werden können, indem man jede Kammer einzeln aufpumpt und entleert. Beispielsweise, wie in 2F gezeigt, kann eine Kammer 230 einzeln entleert werden (d.h. das Fluid wird aus dieser abgelassen), in dem Fall, bei dem therapeutisches Licht auf die entsprechende Region von Blutgefäß 120 gerichtet wird, etwa von Spitze 215 aus, in dem Fall, dass bei der entsprechenden Region aus irgendeinem Grund keine Detektion oder Überwachung vorgenommen werden muss, oder, um sich an eine spezielle Dimension eines Blutgefäßes anzupassen.
  • Die 3A, 3B und 3C sind Diagramme, die eine Sonde/einen Katheter 300 in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung zeigen. Sonde/Katheter 300, wie in den 3A und 3B gezeigt, ist ähnlich zu Sonde/Katheter 200, wie in den 2A bzw. 2B gezeigt, mit dem Unterschied, dass Sonde/Katheter 300 nur ein Lichtzufuhrelement 205 und ein zugehöriges Lichtablenkelement 210 enthalten mag. Vorteilhafter Weise kann die Querschnittsfläche von Sonde/Katheter 300 beim Ausfahren und Positionieren weiter reduziert werden. Beispielsweise, wie in 3C gezeigt, kann Sonde/Katheter 300 nur einen Zweig beinhalten, im Vergleich zu den vier Zweigen, die in 2D für Sonde/Katheter 200 gezeigt sind. Als Ergebnis kann die Behinderung des Blutflusses weiter reduziert werden. Sonde/Katheter 200 kann eine Plattform 305 beinhalten, um z.B. das Gefäß 220 zu stützen. Beispielsweise kann die Plattform 305 ein rigides Material beinhalten, z.B. jedweden Kunststoff und/oder jedwedes metallische Material (z.B. Nitinol-Legierung), sodass die Anordnung in Position gehalten wird, während sich das Gefäß 220 ausdehnt und das Lichtablenkelement 210 nach außen schiebt. Wie zuvor erwähnt, kann das Lichtzufuhrelement 205 eine starre Struktur beinhalten, die nach außen geschoben wird, wenn sie aus der Außeneinheit 202 ausgefahren wird. Die Plattform 305 kann eine solche Struktur tragen bzw. stützen.
  • Die 4A und 4B zeigen eine Sonde/einen Katheter 400 in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung. Wie in den 4A und 4B gezeigt, kann Sonde/Katheter 400 Lichtzufuhrelemente 205 beinhalten, die auf einer starren Struktur angeordnet sind, die komprimiert ist, wenn sie in einer Außeneinheit 202 eingeschlossen ist, wie in 4A gezeigt, und sich ausdehnt, wenn sie ausgefahren wird, wie in 4B gezeigt. Wie zuvor beschrieben, kann die starre Struktur jedwedes elastische Material beinhalten, sodass sich die Struktur bei jedem Ausfahren, wie in 4B gezeigt, auf weitgehend dieselbe Größe und Form ausdehnt. Beispielsweise kann die starre Struktur jedwedes Kunststoff- und/oder Metallmaterial beinhalten (z.B. eine Nitinol-Legierung).
  • Die 5A und 5B sind Diagramme, die das Lichtzufuhrelement 205 und das Lichtablenkelement 210 gemäß entsprechenden Ausführungsformen der Erfindung zeigen. Wie in 5A gezeigt, kann das Lichtablenkelement 210 eine reflektierende Oberfläche 505 und/oder ein lichtbrechendes Element 510 beinhalten, um Licht von einer Zielfläche durch das Lichtzufuhrelement 205 zurück zu einer Detektions-/Behandlungseinheit 110 abzulenken, und/oder um Detektions-/Anregungslicht von der Lichtquelle 113 zu der Zielfläche abzulenken. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann die Lichtquelle 113 eine Lichtquelle für therapeutisches Licht beinhalten, das eine abweichende Wellenlänge und/oder Frequenz aufweist. Somit kann es so sein, dass das Lichtablenkelement 210 nur das Detektions-/Anregungslicht ablenkt, während es dem therapeutischen Licht den Durchtritt erlaubt. Wiederum bezugnehmend auf die 2A und 2B kann das durchgelassene therapeutische Licht an der Spitze 215 nach außen abgelenkt werden, um eine Behandlung der umgebenden Wand von Blutgefäß 120 zu bewirken. Sonde/Katheter 200 kann weiter ausgefahren und/oder zurückgezogen werden, insbesondere, wenn die Behandlung durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass das therapeutische Licht von Spitze 215 die Gebiete erreicht, die von dem/den Lichtablenkelement(en) 210 abgedeckt werden.
  • 5B zeigt das Lichtablenkelement 210, das in Sonde/Katheter 400, wie gezeigt in den 4A und 46, verwendet werden kann, in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung. Wie in 5B gezeigt, kann eine therapeutische Lichtablenkeinheit 515 angrenzend an das Lichtablenkelement 210 angeordnet werden. Da es vorteilhaft ist, therapeutisches Licht breiter am Ziel zu applizieren, um Gewebe abzudecken, das den detektierten Plaque umgibt, kann die therapeutische Lichtablenkeinheit 515 ein lichtbrechendes Material beinhalten, um das therapeutische Licht in alle Richtungen zu verteilen oder zu streuen, um die umgebende Wand von Blutgefäß 120 abzudecken. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann die therapeutische Lichtablenkeinheit 515 auch ein reflektierendes Element 520 beinhalten, um das therapeutische Licht in eine allgemeine Richtung oder auf ein bestimmtes Gebiet zu zielen. Somit, unter erneuter Bezugnahme auf die 4A und 4B, kann eine therapeutische Lichtablenkeinheit 515 am Ende oder an der Spitze jedes Lichtablenkelements 210 angeordnet sein. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung können das Detektions-/Anregungslicht und das therapeutische Licht über getrennte Lichtzufuhrelemente getragen werden.
  • Die 6A, 6B und 6C zeigen eine Sonde/einen Katheter 600 in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Wie in 6A gezeigt, kann Sonde/Katheter 600 einen Detektor 605 beinhalten, wie etwa einen Szintillationsdetektor, um emittiertes und/oder reflektiertes Licht, radioaktive Signale (z.B. Gammastrahlen, Betastrahlen und so weiter), Kernisotope, Radiofrequenz/Mikrowellensignale, Magnetfelder, elektrische Felder, Temperatur (z.B. Wärme), Vibration und so weiter zu detektieren. Durch das Detektieren von beliebigen oder mehreren der vorstehend genannten kann der Ziel-Plaque identifiziert und/oder und in umgebendem Plaque/Gewebe lokalisiert werden. Wie weiterhin in 6A gezeigt, kann Sonde/Katheter 600 auch eine Ablenkvorrichtung 610 für therapeutisches Licht, wie etwa eine streuende Faser, beinhalten, um therapeutisches Licht zu umgebendem Plaque/Gewebe zu streuen. Wie in 6B gezeigt, kann der Detektor 605 unabhängig zurückgezogen werden, sodass therapeutisches Licht in die allgemeine Richtung oder das spezielle Gebiet gelenkt werden kann, in der/dem der Ziel-Plaque bzw. das Zielgewebe detektiert wurde. Weiterhin, wie in 6C gezeigt, kann die Ablenkvorrichtung 610 für therapeutisches Licht ein reflektierendes Element 615 beinhalten, wie etwa einen Schirm und dergleichen, um das therapeutische Licht davon abzuhalten, in eine Nicht-Zielrichtung zu streuen. Nachdem beispielsweise der Detektor 605 Ziel-Plaque/Gewebe detektiert hat, kann die Vorrichtung zurückgezogen werden, und die Ablenkvorrichtung 610 für therapeutisches Licht und das reflektierende Element 615 können therapeutisches Licht lediglich in die allgemeine Richtung und/oder auf das Zielgebiet streuen, das von dem Detektor 605 abgedeckt wird. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann Sonde/Katheter 600 z.B. im Blutgefäß 120 drehbar sein, sodass der Detektor 605 und das therapeutische Licht darin in jedwede Richtung gesteuert werden können.
  • Die vorliegende Erfindung wird zusätzlich anhand der folgenden veranschaulichenden Beispiele beschrieben, die ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer vielen Vorteile ermöglichen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Herstellung und Reinigung von Photosensibilisator-Zusammensetzungen Eine Photosensibilisator-Zusammensetzung, die Chlorine6 ("ce6") umfasst, das an maleyliertes Albumin gekoppelt ist, wurde für eine optimale Ansteuerung der Makrophagen eines Tiermodellsystems für empfindliche Plaques hergestellt.
  • Ergebnisse
  • Es wurden vier Photosensibilisator-Zusammensetzungen untersucht (d.h. zwei BSA-ce6-Konjugate und ihre maleylierten Gegenstücke). Der N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester von ce6 wurde durch Umsetzen von etwa 1,5 Äquivalenten an Dicyclohexylcarbodiimid und etwa 1,5 Äquivalenten an NHS mit etwa 1 Äquivalent an ce6 (Porphyrin Products, Logan, UT) in trockenem DMSO hergestellt. Nach Stehenlassen im Dunklen bei Raumtemperatur für etwa 24 Stunden wurde der NHS-Ester für die weitere Verwendung in Aliquots eingefroren. BSA (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) (etwa 2 × 50 mg) wurde in NaHCO3-Puffer (0,1 M, pH 9,3, etwa 3 ml) gelöst, und es wurden etwa 30 μl und etwa 120 μl an ce6-NHS-Ester unter Mischen mittels Vortexen zu den entsprechenden Röhrchen hinzugegeben. Nach Stehenlassen im Dunklen bei Raumtemperatur für etwa 6 Stunden, wurden die Rohkonjugat-Präparationen auf zwei jeweils etwa gleich große Teile aufgeteilt. Ein Teil jeder der Konjugat-Präparationen wurde maleyliert, indem man festes Maleinsäureanhydrid (etwa 20 mg) portionsweise und unter Vortex-Mischen zu der Proteinpräparation hinzugab, sowie unter Zugabe von gesättigter NaHCO3-Lösung, wie benötigt, um den pH oberhalb von etwa 7,0 zu halten (Takata et al. (1989) Biochim. Biophys. Acta 984:273). Man ließ das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur im Dunklen für etwa 3 Stunden stehen (7). Es wurde außerdem unmodifiziertes BSA maleyliert, um als Kontrolle und als Konkurrenz (Kompetitor) für die zelluläre Aufnahme der Konjugate zu fungieren.
  • Die Rohkonjugat-Präparationen (etwa 5 mg/ml) wurden zu dem etwa 10× Volumen an Aceton (ACS-Qualität) langsam bei etwa 4°C hinzugegeben und wurden für etwa 6 Stunden auf etwa 4°C gehalten, gefolgt von Zentrifugation bei etwa 4000 × g für etwa 15 Minuten bei etwa 4°C. Der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde wiederum in etwa dem gleichen Volumen an Aceton suspendiert, und die Zentrifugation wurde wiederholt. Nach jedem Präzipitationsschritt wurde die Präparation mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) überwacht. Es waren etwa fünf Präzipitationsschritte notwendig, um nicht-kovalent gebundene Chlorin-Spezies vollständig zu entfernen. Schließlich wurde das Pellet in etwa 2 ml PBS gelöst und etwa zweimal gegen 20 Liter PBS über Nacht dialysiert, um Spuren von Aceton zu entfernen.
  • Die Sephadex G50-Säulenchromatographie erfolgte durch Applizieren des Reaktionsgemischs der Konjugation von etwa 50 mg BSA mit etwa 5 mg ce6-NHS-Ester auf einer 50 × 1 cm Sephadex-Säule, die mit PBS bei etwa 4°C eluiert wurde. Die Extinktion der eluierten Fraktionen wurde bei 400 nm und bei 280 nm überwacht.
  • Ein Problem, das bei der Herstellung kovalenter Konjugate von Tetrapyrrol-Photosensibilisator (PS) mit Proteinen auftreten kann, ist die Neigung des Farbstoffs, fest gebundene nicht-kovalente Komplexe ebenso auszubilden wie Konjugate. Diese Gemische können schwer in reines Konjugat und nicht-gebundenen Farbstoff aufzutrennen sein. Dies wird deutlich durch den versuchten Einsatz einer Sephadex G50-Säule zum Abtrennen von BSA-ce6-Konjugat von nicht umgesetztem ce6-NHS-Ester und seinen nachfolgenden Reaktionsprodukten. Die Überwachung der eluierten Fraktionen bei 400 nm und bei 280 nm zeigte einen einzigen Peak, der sowohl ce6 als auch Protein enthielt. Wenn jedoch das Material, das beim Kombinieren der Fraktionen erhalten wurde, mittels TLC untersucht wurde, wie in 8A gezeigt, so war ersichtlich, dass eine beträchtliche Menge an nicht gebundenem Farbstoff vorhanden war. Spur 1 auf der TLC zeigt den Einzel-Peak, der über die Größenausschlusssäule isoliert wurde und demonstriert, dass nach wie vor beträchtliches ungebundenes ce6 als ein schnell laufender Fleck vorhanden war. Wenn dieses Material bei Zellaufnahme-Experimenten verwendet wurde, war es aufgrund einer nicht unterscheidbaren Aufnahme von ungebundenem ce6 sowohl durch Rezeptorpositive als auch durch Rezeptor-negative Zellen schwierig, die Rezeptor-Zielsteuerung zwischen J774- und EMT-6-Zellen zu unterscheiden. Entsprechend zeigt Spur 3 das Rohgemisch nach der Maleylierung, und, dass ungebundenes ce6 vorhanden war.
  • Daher wurden die Konjugate unter Verwendung einer Aceton-Präzipitation gereinigt, die es erlaubte, die lipophilen ce6-Spezies in dem Acetonüberstand zurückzuhalten und die präzipitierten Konjugate in einer gereinigten Form erneut zu lösen. Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgele (SDS-PAGE) wurden mittels Fluoreszenzabbildung optisch ausgewertet, um das ce6 nach der Färbung mit Coomassie Blau zu lokalisieren. 8B zeigt die korrespondierenden Fluoreszenz- und Coomassie-Bilder von BSA, BSA im Gemisch mit freiem ce6 und Konjugaten (BSA-ce6 1 und mal-BSA-ce6 1) nach der Sephadex-Säulenchromatographie, jedoch vor der Aceton-Präzipitation. Das Gemisch von BSA und ce6 (Spuren 2a und 2b) zeigte, dass keine Fluoreszenz durch die Proteinbande auf dem Gel „festgehalten" wird, was somit zeigt, dass eine fluoreszente Bande, die mit dem Protein co-lokalisiert ist, ein Anzeichen für die kovalente Kopplung darstellt. Die Spuren der Konjugate (3a und 3b, 4a und 4b) zeigen, dass eine fluoreszente Bande, die an der Gelfront läuft, nach der Sephadex-Chromatographie verblieb.
  • Die Wirksamkeit der Reinigung durch die Aceton-Präzipitation der Konjugate wurde durch die Gelelektrophoresebilder, die in 8C dargestellt sind, bestätigt. Es ist zu erkennen, dass die schnell laufende fluoreszente Bande sowohl aus dem BSA-ce6 als auch aus dem mal-BSA-ce6 verschwand (Spuren 2c und 2d, 3c und 3d), wobei die TLC ebenfalls das Verschwinden des schnell laufenden Flecks anzeigte (8A, Spuren 2 und 4).
  • Die Konzentrationen der Bestandteile in den Konjugaten und somit die Substitutionsverhältnisse wurden mittels Absorptionsspektroskopie gemessen. Ein Aliquot des Konjugats wurde in etwa 0,1 M NaOH/1% SDS verdünnt, und die Absorption wurde zwischen 240 nm und 700 nm aufgenommen. Der Extinktionskoeffizient von BSA bei 280 nm beträgt etwa 47000 cm–1M–1 (Markwell et al. (1978) Anal Biochem 87:206), während der Extinktionskoeffizient von Ce6 bei 400 nm etwa 150000 cm–1M–1 beträgt. Es wurde Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten durchgeführt (Polygram SIL G/UV254, Macherey Nagel, Duren, Deutschland). Die Chromatogramme wurden mit einem etwa 1:1 Gemisch von etwa 10% wässrigem Ammoniumchlorid und Methanol entwickelt, und die Spots wurden mittels Fluoreszenz- und Absorptionsabbildung betrachtet. Die SDS-PAGE wurde im wesentlichen gemäß in der Technik bekannten Verfahren durchgeführt (Laemmli (1970) Nature 227:680). Es wurden Gradienten von 4-10% Acrylamid in einem nicht-reduzierenden Gel verwendet, und das ce6 wurde mittels eines Fluorimeters (Anregung bei 400-440 nm Bandpass-Filter, Aufnahme der Emission über 580-720 nm Langpass-Filter (Chemilmager 4000, Alpha Innotech Corp, San Leandro, CA) auf dem Gel lokalisiert. Die Proteine wurden durch Coomassie Blau-Färbung lokalisiert.
  • Die im UV sichtbaren Absorptionsspektren der gereinigten mal-BSA-Ce6-Konjugate mit den zwei Substitutionsverhältnissen, gemessen bei etwa gleichen Proteinkonzentrationen, sind in 9 gezeigt, und zwar zusammen mit freiem Ce6 bei etwa der gleichen Konzentration wie sie in mal-BSA-ce6 2 vorhanden war. Ähnliche Spektren wurden für BSA-ce6 1 und 2 erhalten. Unter Verwendung der Werte für die molaren Extinktionskoeffizienten von BSA bei 280 nm von etwa 47000 cm–1M–1 (Markwell et al (1978) Anal Biochem 87:206) und ce6 bei 400 nm von etwa 150000 cm–1M–1, und durch Korrigieren in Hinblick auf die kleine Extinktion von ce6 bei 280 nm können die Substitutionsverhältnisse derart berechnet werden, dass bei mal-BSA-ce6 1 das Verhältnis etwa 1 Protein auf etwa 1 Farbstoff beträgt, und für mal-BSA-ce6 2 entspricht das Verhältnis etwa 1 Protein auf etwa 3 Farbstoffmoleküle.
  • Beispiel 2
  • Makrophagen-Zielsteuerung von Photosensibilisatoren Für die Photosensibilisator-Zusammensetzung, die Chlorine6 umfasst, welches an maleyliertes Albumin gekoppelt ist, und die in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde gezeigt, dass sie sich in den Makrophagen-reichen Plaques eines Tiermodellsystems anreichert, das analog zu empfindlichen Plaques beim Menschen ist. Somit liefern die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine hochspezifische intravaskuläre Detektion und Therapie empfindlicher Plaques.
  • Zellkultur
  • Die Mausmakrophagen-artigen Zelllinien J774.A1 (J774) und RAW 264.7, zusammen mit EMT-6 Maus-Brust-Fibrosarkomzellen, wurden von der ATCC (Rockville, MD) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit HEPES, Glutamin, 10% fetalem Kälberserum (FCS), 100 U/ml an Penicillin und 100 μg/ml an Streptomycin vermehrt. Sie wurden durch Waschen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) ohne Ca2+ und Mg2+ und durch die Zugabe von Trypsin-EDTA zu der Platte für 10 Minuten bei 37°C der Passage unterzogen.
  • Kaninchen
  • Männliche weiße Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5-3,0 kg (Charles River Zuchtlabor) wurden für 6 Wochen bei einer Ernährung mit 2% Chlosterol-6% Erdnussöl (ICN) gehalten.
  • Ergebnisse
  • Für die Zellaufnahmestudien wurden die Zellen in 24-Well-Platten bis zu etwa 90% Konfluenz vermehrt, und das Konjugat oder der Photosensibilisator wurde in etwa 1 ml Medium, das etwa 10% Serum enthielt, zu jedem Well hinzugegeben. Der Konzentrationsbereich für die Konjugate und das freie ce6 lag zwischen etwa 0,5 und 4 μM an ce6-Äquivalent, und die Inkubationszeit betrug etwa 3 Stunden. Nach der Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden etwa dreimal mit etwa 1 ml an sterilem PBS gewaschen und mit etwa 1 ml Trypsin-EDTA für etwa 20 Minuten (OVCAR-5) oder 60 Minuten (J774) inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann abgenommen und zentrifugiert (etwa 5 Minuten bei etwa 250 × g). Der Trypsin-Überstand wurde abgesogen und zurückbehalten, und die Pellets (häufig sichtbar fluoreszent unter langwelligem UV) wurden in etwa 1,5 ml an etwa 0,1 M NaOH/1% SDS für wenigstens etwa 24 Stunden gelöst, um eine homogene Lösung zu ergeben. Der Trypsin-Überstand wurde auf die Anwesenheit von Fluoreszenz geprüft, um jedwede Oberflächenbindung zu quantifizieren, die leicht durch Trypsin entfernt worden sein könnte. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 400 nm gemessen, und die Emission wurde von 580 bis 700 nm aufgezeichnet, um die Peakfläche (λmax = 664 nm) zu berechnen. Es wurde eine Reihe von Verdünnungen in etwa 1,5 ml 0,1 M NaOH/1% SDS mit bekannten Konzentrationen von jedem einzelnen Konjugat und Photosensibilisator wie oben im Hinblick auf Fluoreszenz gescannt, um Eichkurven zu erstellen, um die Quantifizierung von ce6 durch Umsetzen der gemessenen Peak-Flächen in Moläquivalente von ce6 zu ermöglichen. Der Proteingehalt des gesamten Zellextrakts wurde dann mittels eines modifizierten Lowry-Verfahrens (Marwell et al (1978) Anal Biochem 87:296) bestimmt, wobei man zur Erstellung von Eichkurven BSA verwendete, das in etwa 0,1M NaOH/1% SDS gelöst war. Die Ergebnisse wurden als Mol an ce6 pro mg Zellprotein ausgedrückt. Für die Messung der zellulären Aufnahme bei 4°C wurde vorgekühltes Wachtumsmedium verwendet, und die Platten mit den Zellen wurden in einem Eisbad für etwa 20 Minuten auf etwa 4°C abgekühlt, und zwar sowohl vor der Zugabe der Photosensibilisator-Lösungen als auch nach der Zugabe. Die Inkubation erfolgte in Normalatmosphäre im Dunklen (z.B. Einpacken der Platten in Aluminiumfolie).
  • Die Zellen wurden in 24-Well-Platten bei Dichten von etwa 100.000 Zellen in etwa 1 ml Medium ausgesät. Nach etwa 24 Stunden wurde den Zellen etwa 1 ml frisches Medium, enthaltend 10% Serum, und ein spezifisches Konjugat oder freies ce6 (ce6-Äquivalentkonzentration von etwa 4 nmol pro Well) verabreicht, und es wurde für etwa 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Unmittelbar vor der Bestrahlung wurden die Zellen etwa 3-mal mit PBS mit Mg2 +/Ca2+ gewaschen, und die Wells wurden mit etwa 1 ml Medium, enthaltend HEPES und etwa 10% FCS, aufgefüllt. Licht (660 nm) wurde von unterhalb der Wells von einem Diodenlaser mit einer Fluenzrate von etwa 50 mW/cm2 über ein mit einer Faseroptik gekoppeltes Mikroskopobjektiv zugeführt. Die Wells wurden in Blöcken von vier bestrahlt, definiert durch eine schwarze Maske, die unter der 24-Well-Platte angebracht wurde. Die Fluenzen betrugen etwa 2, 5 und 10 J/cm2. Nach Abschluss der Bestrahlung wurden die Schalen für weitere etwa 24 Stunden Inkubation in den Inkubator zurückgestellt. Die Bestimmung des Zellüberlebens erfolgte über den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay, der die Aktivität von mitochondrialer Dehydrogenase misst. Er ist in ausgedehntem Maße für die Messung der Lebensfähigkeit von Zellkulturen nach der PDT verwendet worden und hat gezeigt, dass er eine enge Korrelation mit Assays auf Koloniebildung besitzt (McHale et al (1988) Cancer Letters 41:315). Etwa 24 Stunden nach der Bestrahlung wurde den Zellen frisches Medium zugeführt, und es wurden etwa 100 μl an MTT (5 mg/ml)-Lösung zu jedem Well hinzugegeben, und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert. Nach etwa 1 Stunde Inkubation wurde das Überstandsmedium sanft abgesogen, und es wurde etwa 1 ml an DMSO hinzugegeben, um die Zellen zu lysieren und das tiefblaue Formazan zu lösen. Die Platten wurden auf einem Orbitalschüttler im Dunklen für etwa 15 min sanft geschüttelt, um das Lösen sämtlicher Formazan-Kristalle zu vervollständigen, und die blaue DMSO-Lösung wurde auf 96-Well-Platten übertragen (etwa 200 μl pro Well, 5 Wells pro Well einer 24-Well-Platte). Die Extinktion wurde mittels eines automatisierten Plattenlesegeräts (Modell 2550 EIA, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) bei 570 nm abgelesen. Die Datenpunkte waren der Durchschnittswert von drei Wells der 24-Well-Platte (15 Wells der 96-Well-Platte).
  • Die Rolle der Scavenger-Rezeptoren bei der Aufnahme dieser Konjugate wurde getestet, indem man die Verringerung des zellulären Gehalts an Photosensibilisator maß, die durch die Konkurrenz mit der Aufnahme eines Liganden, der bekanntermaßen von dem Scavenger-Rezeptor erkannt wird, hervorgerufen wurde. Die Verringerung der zellulären Aufnahme wurde dann mit dem Schutz der Zellen vor Phototoxizität in Beziehung gesetzt. Es wurden gleichzeitig mit den Konjugaten steigende Mengen an unmarkiertem mal-BSA zu J774- und OVCAR-5-Zellen hinzugegeben, und es wurde für etwa 3 Stunden inkubiert. Es wurden etwa 0, 50, 100 und 200 μg/ml an mal-BSA verwendet, was einen Bereich von etwa einem 0,25-fachen bis 3-fachen molaren Überschuss an BSA, enthalten in etwa 4 μM BSA-ce6 oder mal-BSA-ce6, darstellte. Die zellulären Aufnahmen und Phototoxizitäten wurden gemäß obiger Beschreibung gemessen.
  • Mausmakrophagenzellen (J774 oder RAW264.7) nahmen mehr als zehnmal so viel Farbstoff auf wie Nicht-Zielzellen des Typs EMT-6, und es wurden bei Bestrahlung mit mäßigen Mengen an Rotlicht ungefähr tausendmal so viele getötet. Die maleylierten Konjugate besaßen eine größere Makrophagenselektivität und daher eine höhere Phototoxizität als ihre nicht-maleylierten Gegenstücke (10).
  • Nach einer Woche Erdnussöl-Ernährung wurde die abdominale Aorta mittels einer modifizierten Baumgartener-Technik des Endothels beraubt. Kurz dargestellt, wurde jedes Tier mit einem Gemisch aus Ketamin und Xylazin betäubt, und die rechte Femoralarterie wurde isoliert. Nachfolgend wurde ein 4F Fogarty Embolektomie-Katheter über Arteriotomie eingeführt und unter fluoroskopischer Führung auf die Höhe des Zwerchfells vorgeschoben. Der Ballon wurde dann auf 3 psi oberhalb des Ballon-Aufblasdruckes aufgeblasen, und es wurden mit dem aufgeblasenen Katheter drei Durchlaufe die abdominale Aorta hinab durchgeführt. Die Femoralarterie wurde nachfolgend abgebunden, und die Wunde wurde verschlossen.
  • Für die Fluoreszenzlokalisierung in ex vivo-Aorten wurden Aortensegmente aufgeschnitten und geglättet, und die Lumenseite wurde durch Spektrofluorometrie untersucht, entweder unter Verwendung eines Faserbündel-basierten doppelten Monochromator-Spektrofluorimeters (Skin Scan, Spex Figure), bei dem die Emissionsspektren (Anregung 400 nm, Emission 580-720 nm) etwa alle 3 mm über die gesamte Fläche der freigelegten intimalen Oberfläche gesammelt wurden, oder mittels eines optischen Mehrkanal-Analysators (11).
  • Für die konfokale Fluoreszenzmikroskopie wurden ausgewählte Teile der Aorten in flüssigem Stickstoff schockgefroren, und es wurden Gefrierschnitte von etwa 10-20 μm hergestellt. Diese Schnitte wurden der Laser-Scan-Konfokal-Fluoreszenzmikroskopie unterzogen, um die Gewebeverteilung von ce6 zu detektieren. Die rote intrazelluläre Fluoreszenz von ce6 zusammen mit grüner Gewebe-Autofluoreszenz wurde in den Zellen in 10 μm-Gefrierschnitten abgebildet. Die Schnitte wurden mit einem Laser-Scan-Konfokal-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Es wurde ein Leica DMR Konfokal-Laser-Fluoreszenzmikroskop (Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar, Deutschland) (Anregung 488 nm Argonlaser) mit einer 4×-40× Luft-Immersionslinse oder einem 100x Öl-Immersionsobjektiv verwendet, um bei einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixeln abzubilden. Zwei Kanäle sammelten Fluoreszenzsignale entweder im Grünbereich (580 nm dichroistischer Spiegel plus 530 nm (+/– 10 nm) Bandpass-Filter) oder im Rotbereich (580 nm dichroistischer Spiegel plus 590 nm Langpass-Filter) und wurden als „falsche" Farbbilder angezeigt. Diese Kanäle wurden unter Verwendung von TCS NT-Software (Version 1.6.551, Leica Lasertechnik, Heidelberg, Deutschland) übereinander gelegt, um die Sichtbarmachung der Überlappung roter und grüner Fluoreszenz zu erlauben. Diese Schnitte wurden auch mittels Immunhistochemie unter Verwendung makrophagenspezifischer monoklonaler Antikörper und konventioneller H&E-Färbung angefärbt. Andere Teile der normalen und arteriosklerotischen Aorta wurden in kleine Stücke geschnitten, gewogen und in Natriumhydroxid/SDS gelöst, und der Gewebegehalt von ce6 wurde mittels Spektrofluorimetrie gemäß vorheriger Beschreibung (Hamblin et al (2000) Br. J. Cancer 83:1544) bestimmt.
  • 12 zeigt eine Analyse der Aortenteilstücke von Kaninchen, denen Injektionen mit oder ohne Konjugat (etwa 2 mg/kg in PBS) verabreicht wurden, etwa 24 Stunden nach der Injektion des Konjugats. Reihe 1 zeigt Konfokalfluoreszenz-Mikrophotographien gefrorener Aortenschnitte (Rot = Chlorin-e6, Grün = elastische Lamina, Autofluoreszenz). Reihe 2 zeigt Fluoreszenzemissionsspektren (Anregung = 400 nm) der intimalen Oberfläche von Aortensegmenten ex vivo. Reihe 3 zeigt Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Aortensegmenten. Reihe 4 zeigt die Verhoefsche Färbung von elastischem Gewebe. Die Konfokal-Mikrophotographien zeigten rote Fluoreszenz von PS (ce6) und grüne Autofluoreszenz vornehmlich von der elastischen Lamina der Arterien. Spalte 1 zeigt ein arteriosklerotisches Kaninchen ohne die Injektion von Konjugat. Es gab keine rote ce6-Fluoreszenz in dem Gewebeschnitt, noch gab es irgendein Fluoreszenzsignal von der intimalen Oberfläche. Spalte 2 zeigt ein normales, nicht-arteriosklerotisches Kaninchen, dem Konjugat injiziert wurde. Es gibt eine kleine Menge an roter Fluoreszenz, die in den Fluoreszenzmikrophotographien eher in der Adventitia als in der Intima sichtbar ist, und ein kleines Fluoreszenzemissionssignal von der intimalen Oberfläche. Spalte 3 zeigt ein arteriosklerotisches Kaninchen, dem Konjugat injiziert wurde. Es gab eine gro ße Menge an roter Fluoreszenz, die in dem Plaque sichtbar war, und dies ergab ein entsprechend großes Fluoreszenzemissionssignal von der intimalen Oberfläche.
  • Das intimale Fluoreszenzsignal wurde bei verschiedenen Aortenschnitten von Aorten arteriosklerotischer und normaler Kaninchen gemessen. Die Bereiche der abdominalen Aorta, die eine Ballon-Verletzung erhielten, entwickelten größere Mengen an Plaque als die benachbarte thorakale und die untere abdominale Aorta. Die Ergebnisse der intimalen Fluoreszenzmessungen wurden bestätigt, indem man Schnitte der Aorten extrahierte und die Fluoreszenz mit einem Spektrofluorimeter maß, was ein Maß für die Anzahl an ce6-Molekülen in den Gewebeschnitten ergab.
  • 13 zeigt ein signifikantes Fluoreszenzsignal von der intimalen Oberfläche (bestimmt durch „Haut-Scan") in allen Schnitten von den arteriosklerotischen Kaninchen im Vergleich zu den entsprechenden Schnitten der Aorta normaler Kaninchen, denen Konjugat injiziert wurde, jedoch besonders hoch in den Schnitten der Ballon-verletzten Gebiete. Schnitt 1 zeigt die thorakale Aorta, Schnitt 2 zeigt die obere abdominale Aorta unterhalb des Zwerchfells, Schnitt 3 zeigt die mittlere abdominale Aorta, Schnitt 4 zeigt die untere abdominale Aorta, und Schnitt 5 zeigt die Beckenaorta genau oberhalb der Gabelung. Es wurden von jedem Arteriensegment wenigstens 6 getrennte Messungen aufgenommen. Durch die Natur der Ballon-Verletzung trugen die Schnitte 3 und 4 im allgemeinen eine stärkere endotheliale Verletzung davon als andere Schnitte und entwickelten daher eine stärkere Arteriosklerose. Diese Plaques sind extrem reich an Makrophagen und sind daher in höchstem Maße analog zu empfindlichen Plaques beim Menschen. Solche Läsionen stellen das Tiermodellsystem dar, das von Fachleuten verwendet wird, um die Merkmale empfindlicher Plaques zu studieren. Das Signal von Schnitt 3 des arteriosklerotischen Kaninchens war größer als der normale Kontrollschnitt 3 (p < 0,0005), und das Signal von dem arteriosklerotischen Schnitt 4 war größer als das des normalen Kontrollschnitts 4 (p < 0,005).
  • Die zweite Messung der intimalen Oberflächenfluoreszenz wurde mit dem oben beschriebenen OMA-LIF-System durchgeführt. Es wurden mindestens 15 getrennte Fluoreszenzmessungen von jedem Arteriensegment aufgenommen. Zusätzlich erlitt die Arteria iliaca, durch die der Ballon geleitet worden war, auch eine Verletzung aufgrund ihres im Vergleich zum Aortenteilstück 5 relativ kleinen Durchmessers, und entwickelte daher im Vergleich zur unverletzten Arteria iliaca Arteriosklerose. 13 zeigt ein ähnliches Muster im Fall der „Haut-Scan"-Messungen, bei dem hochsignifikante Steigerungen der Fluoreszenz in den Arterien mit entzündetem Plaque zu sehen sind (d.h. Ballon-verletzte Aorta und Arteria iliaca). Die Teilstücke 3 und 4 und die verletzte Arteria iliaca bei arteriosklerotischen Tieren im Vergleich zu der normalen Kontrolle besaßen p-Werte < 0,0001, wogegen Teilstück 5 und die unverletzte Arteria iliaca p-Werte von < 0,0005 besaßen. Entsprechend sind die weniger schweren Plaques von Teilstück 5 von den Makrophagen-reichen Plaques der Teilstücke 3 und 4 unterscheidbar. Die Teilstücke 1 und 2 waren bei arteriosklerotischen und normalen Kaninchen nicht signifikant verschieden.
  • Um die Selektivität des auf die Makrophagen abgezielten Konjugats für entzündete Plaque zu bestätigen, wurden die Farbstoffmoleküle aus den zuvor gewogenen Gewebeschnitten extrahiert, indem man das Gewebe in einem Lösungsmittel (1M NaOH/0,2% SDS) auflöste, das dafür konzipiert war, die ce6-Fluoreszenz zu bewahren. Diese gelösten Gewebeschnitte wurden dann auf dem Spektrofluorimeter gemessen, und das Fluoreszenzsignal wurde durch das Gewebegewicht geteilt, um einen Wert pro Gramm Gewebe zu ergeben. Für jeden Datenpunkt wurden mindestens vier Gewebestücke aufgelöst. Die Unterschiede zwischen arteriosklerotischen und normalen Kaninchen waren für die Schnitte 1, 2 und 4 signifikant (p < 0,05). Das geringere Signifikanzniveau bei diesem Test lag vermutlich an der Unmöglichkeit, ebenso viele Punkte auszumessen, wie es bei der Oberflächenfluoreszenzmessung möglich war. Zusätzlich ist es möglich, dass die Oberfächenmessung der Fluoreszenz empfindlicher war als die Massenextraktion zum Detektieren der Makrophagenpopulation, da sich Makrophagen mit größerer Wahrscheinlichkeit in der entzündeten Plaque-Oberfläche konzentrierten.
  • In 14a war ein merklicher Unterschied zwischen einem großen Aorten-Plaque und einem Gebiet der abdominalen Aorta 5 mm unterhalb des Plaques zu sehen. In 14b war ein weiterer merklicher Unterschied zwischen der Ballon-verletzten Arteria iliaca und der contralateralen Normalarterie beim selben Kaninchen zu sehen. In ähnlicher Weise zeigt 14c einen Unterschied zwischen der mit Plaques beladenen Aorta eines arteriosklerotischen Kaninchens und dem gleichen Gebiet der Aorta bei einem normalen Kaninchen. Diese Spektren wurden in einem Kaninchen erhalten, das eine Überdosis der Betäubung erhalten hatte. Das Kaninchen erhielt eine Laparotomie, die die abdominale Aorta und die Arteriae iliacae freilegte. Das Kaninchen erhielt auch eine Arteriotomie im rechten Bein, um die Femoralarterie freizulegen. Der faseroptische Katheter der OMA-LIF-Apparatur wurde durch die Femoralarterie und die Arteriae iliacae zur abdominalen Aorta bis hin zur thorakalen Aorta vorwärts geschoben. Es wurden Spektren erhalten, und der faseroptische Katheter wurde jedes Mal, wenn sukzessive Spektren erhalten wurden, etwa 5 mm zurückgezogen. Durch Abtasten der Außenseite der Arterie wurde die Position des Katheters im Bezug zu den Plaques bestimmt.
  • Somit ist ein neues Verfahren entwickelt worden, um eine Photosensibilisator-Zusammensetzung mit hoher Spezifität auf die aktivierten Makrophagen eines empfindlichen Plaques abzuzielen.
  • Beispiel 3
  • Photodynamische In vivo-Therapie
  • Es wurde ein intravaskulärer Fluoreszenzkatheter entwickelt, der effizient ein Fluoreszenzsignal von einem empfindlichen Plaque im Koronarbereich eines Kaninchens (jedoch nicht beschränkt auf ein Kaninchen) durch fließendes Blut hindurch lokalisierte. Zusätzlich wurde ein therapeutisches intravaskuläres Lichtzufuhrsystem entwickelt, dass die empfindlichen Plaques durch das fließende Blut hindurch mit Licht der geeigneten Wellenlänge, Fluenz und Fluenzrate bestrahlte, um den erwünschten therapeutischen Effekt zu erzielen.
  • Ergebnisse
  • Es wurde gezeigt, dass die PDT in der Kaninchenaorta in vivo bei lebenden Kaninchen durch das fließende Blut hindurch möglich war, ohne die Kaninchen unangemessen zu schädigen, und ohne kurzfristige Toxizität. Es wurden die selben Parameter verwendet wie oben (Photosensibilisator-Zusammensetzung, Dosis und Zeitintervall), um in der Lage zu sein, die Behandlungswirkungen mit der zuvor bestimmten Lokalisierung des Farbstoffs in den Plaque-Läsionen in Korrelation zu setzen. Die Tiere (ein arteriosklerotisches und ein normales Kaninchen, die jeweils 24 Stunden zuvor Injektionen mit Mal-BSA-ce6 erhielten; und ein arteriosklerotisches Kaninchen, das keine Injektion erhielt) wurden wie zuvor betäubt, und eine zylindrische, streuende, mit Spitze versehene Faseroptik (Länge der Spitze = 2 cm, Durchmesser = 1 mm) wurde zu einer Position unterwegs entlang der Ballon-verletzten abdominalen Aorta vorwärts bewegt.
  • Die Faser besaß einen SMA-Konnektor am proximalen Ende, der mit einem Diodenlaser verbunden werden kann, der Licht bei etwa 665 nm für Mal-BSA-ce6 emittiert. Das Licht wurde mit einer Fluenzrate von etwa 100 mW/cm aus der streuenden Spitze zugeführt, und es wurde eine Gesamtfluenz von etwa 100 J/cm zugeführt. Am Schluss der Bestrahlung wurde die Faser zurückgezogen, und die Arteriotomie und die darüber liegende Wunde wurden verschlossen. Die Tiere wurden 48 Stunden später getötet. Sie erhielten eine Laparotomie und eine chirurgische Freilegung der Aorta und der umgebenden Gewebe (15A). Die obere Tafel von 15A zeigt die Lichtauslieferung in die abdominale Aorta über einen Katheter mit streuender Spitze, der in die Femoralarterie eingesetzt wurde, was die Machbarkeit der intra-arteriellen Bestrahlung demonstriert. Die mittlere Tafel von 15A zeigt eine arteriosklerotische Aorta, die dick ist, sodass Licht nicht zu Gewebe außerhalb der Aorta durchdringt. Die untere Tafel von 15A zeigt eine normale Aorta, die dünn ist, sodass Licht durchdringt, um einen leichten, jedoch erkennbaren Schaden am Lendenmuskel zu ergeben. Die vollständigen Aorten und Arteriae iliacae wurden aus den PDT-behandelten normalen und arteriosklerotischen Kaninchen und den arteriosklerotischen Kontrollkaninchen (ohne Injektion von Mal-BSA-ce6) entnornmen und unter Verwendung der H&E, Masson Trichrome und Verhoeffschen Färbung histologisch untersucht.
  • Die beiden Kaninchen, die sowohl die Photosensibilisator-Zusammensetzung als auch Licht erhalten hatten, zeigten keine Krankheitseffekte der Behandlung während der zwei Tage ihres Lebens, bevor sie getötet wurden. Bei der Nekroskopie besaß das arteriosklerotische Kaninchen keinen großen Schaden, der in dem bestrahlten Aortenteilstück oder dem umgebenden Gewebe sichtbar gewesen wäre. Im Gegensatz dazu zeigte das normale Kaninchen etwas geringfügigen Schaden, der in para-aortischem Muskel sichtbar war, bestehend aus Hämorrhagie und Purpurs. Ohne sich hier theoretisch festlegen zu wollen, wird angenommen, dass dieser Schaden dadurch verursacht wurde, dass die Dicke der Normalarterie sehr viel geringer war als die der arteriosklerotischen Aorta, und folglich viel von dem Licht durch die Arterie hindurch drang und das umgebende Gewebe bestrahlte. Das arteriosklerotische Kaninchen, das Licht, jedoch kein Konjugat erhielt, wurde zu jedweder Veränderung an der Arterie oder dem umgebenden Gewebe in Relation gesetzt.
  • Die histologische Untersuchung der Arterien (156. Obere Tafel: Histopathologie der mit PDT behandelten arteriosklerotischen Aorta; untere Tafel: Histopathologie der arteriosklerotischen Aorta, die Licht, jedoch kein Konjugat erhielt) zeigte Veränderungen im bestrahlten Teilstück bei dem arteriosklerotischen Kaninchen, das sowohl Konjugat als auch Licht erhielt, was mit den PDT-Effekten im angesteuerten Gewebe konsistent ist. Es gab Anzeichen von Apoptose (pyknotische Zellkerne) und ein entzündliches Infiltrat im Plaque (Figur 15B, linke Tafel), zusammen mit einer gewissen koagulativen Nekrose (15B, mittlere Tafel), sowie aus den Gefäßen ausgetretene Erythrozyten, die aus der Vasa vasorum stammen mögen, und sichtbarem Schaden im Plaque (15B, rechte Tafel). Zusammen zeigen diese histologischen Daten an, dass die Behandlung günstige Modifikationen der Plaque-Histologie und eine verringerte Empfindlichkeit hervorbrachte. Die histologischen Veränderungen wurden nicht bei dem normalen Kaninchen beobachtet, das die Photosensibilisator-Zusammensetzung und Licht erhielt, und ebenso wurden keinerlei Veränderungen bei dem arteriosklerotischen Kaninchen beobachtet, das Licht, jedoch kein Konjugat erhielt.
  • Diese Technologie befriedigt die klare Notwendigkeit einer neuen Therapie, die eine lokalisierte Stabilisierung empfindlicher Plaques in Koronararterien mit dem entsprechend reduzierten Risiko des Bruchs ermöglicht.

Claims (58)

  1. Verwendung einer Photosensibilisator-Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zum Stabilisieren eines empfindlichen Plaque, wobei das Medikament eine therapeutisch wirksame Menge wenigstens einer Photosensibilisator-Zusammensetzung bereitstellt, wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung an dem empfindlichen Plaque lokalisiert werden kann, und wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung zu Lichtaktivierung unter Erzeugung einer phototoxischen Spezies in der Lage ist, so daß der empfindliche Plaque gegen Zerstörung stabilisiert wird, der empfindliche Plaque inflammatorische Komponenten, einen großen Lipidpool und eine dünne faserige Kappe umfaßt, die dünne faserige Kappe weniger als 150 μm dick ist, der empfindliche Plaque einen Makrophagen- und/oder Monozytengehalt von mehr als 10% hat und der Lipidgehalt mehr als 10% beträgt.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die dünne faserige Kappe weniger als 100 μm dick ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die dünne faserige Kappe zwischen 60 und 100 μm dick ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei inflammatorische Komponenten aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus inflammatorischen Zellen, Lipiden, Prokoagulationsmitteln und Mitteln, die die Inhibition der Erzeugung von extrazellulärer Matrix oder den Abbau von extrazellulärer Matrix fördern.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die inflammatorischen Zellen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus glatten Muskelzellen, Leukozyten, Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Schaumzellen, Mastzellen, Endothelzellen, Blutplättchen, Erythrozyten und polymorphonukleären Zellen.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Lymphozyten B-Lymphozyten und T-Lymphozyten umfassen.
  7. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die polymorphonukleären Zellen Granulozyten und Neutrophile umfassen.
  8. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der empfindliche Plaque einen Makrophagen- und/oder Monozytengehalt von mehr als 25% hat.
  9. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Lipidgehalt mehr als 25% beträgt.
  10. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung einen Photosensibilisator umfaßt, der an einen makromolekularen Träger gebunden ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der makromolekulare Träger auf inflammatorische Komponenten zielt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus inflammatorischen Zellen, Lipiden, Prokoagulationsmitteln und Mitteln, die die Inhibition der Bildung von extrazellulärer Matrix oder den Abbau von extrazellulärer Matrix fördern.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die inflammatorischen Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus glatten Muskelzellen, Leukozyten, Lymphozyten (wie z.B. B-Lymphozyten und T-Lymphozyten), Monozyten, Makrophagen, Schaumzellen, Mastzellen, Endothelzellen, Blutplättchen, Erythrozyten und polymorphonukleären Zellen (wie z.B. Granulozyten und Neutrophilen).
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der makromolekulare Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Serumproteinen, Rezeptorliganden, Mikrokügelchen, Liposomen, Antikörpern, Wachstumsfaktoren, Peptiden, Hormonen und Lipoproteinen.
  14. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der makromolekulare Träger an einen Fängerrezeptor bindet.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der makromolekulare Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus maleyliertem Albumin, Daunorubicin, Doxorubicin, oxidiertem Low-Density-Lipoprotein, acetyliertem Low-Density-Lipoprotein, oxidiertem High-Density-Lipoprotein, mit Malondialdehyd behandelten Proteinen, mit Formaldehyd behandeltem Albumin, glykiertem Albumin, Polyinosinsäure, glykierten Lipoproteinen, Dextransulfat, anionischen Phospholipiden, vorzugsweise Phosphatidylserin, Fucoidin, Carrageenan, Polyvinylsulfat und monoklonalen Antikörpern, die CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD16a, CD32 oder CD68 erkennen.
  16. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der makromolekulare Träger die Photosensibilisator-Zusammensetzung auf eine T-Zelle zielen läßt.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der makromolekulare Träger die Photosensibilisator-Zusammensetzung auf ein T-Zellen-Biomolekül zielen läßt, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus IL-10, IL-10-Rezeptor, Monozyten-inflammatorischem Protein-1, Monozyten-inflammatorischem Protein-1-Rezeptor und Transferrin.
  18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, wobei der makromolekulare Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus monoklonalen Antikörpern, die CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD25, CD28, CD44 und CD71 und Transferrin erkennen.
  19. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der makromolekulare Träger die Photosensibilisator-Zusammensetzung auf die Lipide, die den Lipidpool des empfindlichen Plaque bilden, zielen läßt.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei der makromolekulare Träger ein hydrophobes Vehikel umfaßt, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Liposomen, Cremaphor EL, PEG/Lösungsmittel-Gemischen, iodiertem Castoröl, Nanopartikeln und mizellaren Präparaten.
  21. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der makromolekulare Träger die Photosensibilisator-Zusammensetzung auf Makrophagen zielen läßt.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei der makromolekulare Träger die Photosensibilisator-Zusammensetzung auf ein Makrophagen-Biomolekül zielen läßt, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Tenascin C, Gewebefaktor, Gewebeinhibitor von MMP 1, Gewebeinhibitor von MMP 2, oxidiertem LDL-Rezeptor, Hämoxygenase-1, menschlichem Knorpel gp-39, IL-6, IL-6-Rezeptor, IL-10, IL-10-Rezeptor, Lectin-artigem oxidiertem LDL-Rezeptor, Monozyten-inflammatorischem Protein-1, Monozyten-inflammatorischem Protein-1-Rezeptor und Makrophagen chemisch anziehendem Protein-1-Rezeptor.
  23. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der makromolekulare Träger die Photosensibilisator-Zusammensetzung auf Schaumzellen zielen läßt.
  24. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der makromolekulare Träger die Photosensibilisator-Zusammensetzung auf eine Protease, die extrazelluläre Matrix abbaut, vorzugsweise auf eine Metalloproteinase, zielen läßt.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei der makromolekulare Träger ein monoklonaler Antikörper ist, der an ein Epitop an einer Protease bindet.
  26. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Lichtaktivierung der Photosensibilisator-Zusammensetzung zum Erzeugen einer phototoxischen Spezies in einer Menge erfolgt, die ausreichend ist, um eine Apoptose und keine Nekrose der Zellen, die den empfindlichen Plaque bilden, zu induzieren.
  27. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Lichtaktivierung der Photosensibilisator-Zusammensetzung zum Erzeugen einer phototoxischen Spezies weiterhin Querverbindungen in der faserigen Kappe erzeugt.
  28. Verwendung einer fluoreszenten Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zum Detektieren eines empfindlichen Plaque in einem Subjekt, wobei die fluoreszente Zusammensetzung an dem empfindlichen Plaque lokalisiert werden kann, und die fluoreszente Zusammensetzung zu Lichtaktivierung in der Lage ist, um den empfindlichen Plaque so zu beleuchten, daß der empfindliche Plaque identifiziert werden kann, wobei: der empfindliche Plaque inflammatorische Komponenten, einen großen Lipidpool und eine dünne faserige Kappe umfaßt, die dünne faserige Kappe weniger als 150 μm dick ist, der empfindliche Plaque einen Makrophagen- und/oder Monozytengehalt von mehr als 10% hat und der Lipidgehalt mehr als 10% beträgt.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei die fluoreszente Zusammensetzung einen Photosensibilisator umfaßt, der an einen makromolekularen Träger gebunden ist.
  30. Verwendung nach Anspruch 28, wobei die fluoreszente Zusammensetzung einen photoaktiven Farbstoff umfaßt, der an einen makromolekularen Träger gebunden ist.
  31. Verwendung nach Anspruch 28, wobei die fluoreszente Zusammensetzung einen fluoreszenten Farbstoff umfaßt, der an einen makromolekularen Träger gebunden ist.
  32. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 27, 29 oder 30, wobei der Photosensibilisator oder der photoaktive Farbstoff Chlorin es ist.
  33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei das Licht in einer Dosis von 20-500 J/cm aufgebracht wird.
  34. Verwendung nach Anspruch 32, wobei das Licht in einer Dosis von 50-300 J/cm aufgebracht wird.
  35. Verwendung nach Anspruch 32, wobei das Licht in einer Dosis von 100-200 J/cm aufgebracht wird.
  36. Verwendung nach einem der Ansprüche 29 oder 30, wobei der Photosensibilisator oder der photoaktive Farbstoff Chlorin es ist.
  37. Verwendung nach Anspruch 36, wobei das Licht in einer Dosis von weniger als 10 J/cm aufgebracht wird.
  38. Verwendung nach Anspruch 36, wobei das Licht in einer Dosis von weniger als 5 J/cm aufgebracht wird.
  39. Verwendung nach Anspruch 36, wobei das Licht in einer Dosis von weniger als 1 J/cm aufgebracht wird.
  40. Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, wobei der makromolekulare Träger radioaktiv markiert ist, so daß ein radioaktives Signal gemessen werden kann, so daß der empfindliche Plaque identifiziert werden kann.
  41. Vorrichtung zum Detektieren von empfindlichem Plaque in einem Blutgefäß, welche folgendes umfaßt: einen Lichtemitter, der so betreibbar ist, daß er Licht mit einer vorbestimmten ersten Wellenlänge emittiert, und einen Lichtdetektor, der so betreibbar ist, daß er Licht mit einer vorbestimmten zweiten Wellenlänge detektiert, wobei das Licht mit der vorbestimmten ersten Wellenlänge in der Lage ist, eine fluoreszente Zusammensetzung, die an dem empfindlichen Plaque in dem Blutgefäß lokalisiert ist, dazu zu bringen, Licht mit der vorbestimmten zweiten Wellenlänge zu emittieren, wobei: der empfindliche Plaque inflammatorische Komponenten, einen großen Lipidpool und eine dünne faserige Kappe umfaßt, die dünne faserige Kappe weniger als 150 μm dick ist, der empfindliche Plaque einen Makrophagen- und/oder Monozytengehalt von mehr als 10% hat und der Lipidgehalt mehr als 10% beträgt.
  42. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei der Lichtemitter und der Lichtdetektor in einer Sonde enthalten sind.
  43. Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Sonde so betreibbar ist, daß sie in das Blutgefäß eingebracht werden kann.
  44. Vorrichtung nach Anspruch 41, welche weiterhin einen therapeutischen Lichtemitter umfaßt, der so betreibbar ist, daß er Licht mit einer vorbestimmten dritten Wellenlänge emittiert, wobei Licht mit der vorbestimmten dritten Wellenlänge in der Lage ist, eine Photosensibilisator-Zusammensetzung, die an dem empfindlichen Plaque in dem Blutgefäß lokalisiert ist, dazu zu bringen, eine phototoxische Spezies zu erzeugen, die den empfindlichen Plaque stabilisiert.
  45. Vorrichtung nach Anspruch 44, wobei der therapeutische Lichtemitter so betreibbar ist, daß er Licht mit der vorbestimmten dritten Wellenlänge bei einem vorbestimmten Energieniveau emittiert, wobei Licht mit der vorbestimmten dritten Wellenlänge bei dem vorbestimmten Energieniveau die Photosensibilisator-Zusammensetzung dazu bringt, die phototoxische Spezies in einer Menge zu erzeugen, die nicht zu einer Nekrose der Zellen führt, die den empfindlichen Plaque bilden.
  46. Vorrichtung nach Anspruch 44, wobei die vorbestimmte dritte Wellenlänge 405 nm beträgt.
  47. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die vorbestimmte erste Wellenlänge 337 nm beträgt.
  48. Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei die vorbestimmte zweite Wellenlänge zwischen 666 nm und 668 nm beträgt.
  49. Vorrichtung nach Anspruch 41, welche weiterhin einen mit dem Lichtdetektor verbundenen aufblasbaren Behälter beinhaltet, wobei der Lichtdetektor durch Aufblasen des aufblasbaren Behälters in Richtung einer Wand des Blutgefäßes bewegt wird.
  50. Vorrichtung nach Anspruch 49, wobei der aufblasbare Behälter Saline enthält.
  51. Vorrichtung nach Anspruch 49, welche weiterhin eine externe Einheit umfaßt, wobei der aufblasbare Behälter und der Lichtdetektor in die externe Einheit zurückziehbar und aus dieser heraus ausfahrbar sind.
  52. Vorrichtung nach Anspruch 41, welche weiterhin eine externe Einheit umfaßt.
  53. Vorrichtung nach Anspruch 52, welche weiterhin eine elastische Struktur umfaßt, die mit dem Lichtdetektor verbunden ist, wobei die elastische Struktur und der Lichtdetektor in die externe Einheit zurückziehbar und aus dieser heraus ausfahrbar sind, wobei die elastische Struktur den Lichtdetektor in Richtung einer Wand des Blutgefäßes bewegt, wenn er aus der externen Einheit herausbewegt wird.
  54. Vorrichtung zum Detektieren und Behandeln von empfindlichem Plaque in einem Blutgefäß, welche folgendes umfaßt: einen Detektor, der so betreibbar ist, daß er eine Emission von dem empfindlichen Plaque detektiert, und einen Lichtemitter, der so betreibbar ist, daß er Licht mit einer vorbestimmten Wellenlänge emittiert, wobei Licht mit der vorbestimmten Wellenlänge eine Photosensibilisator-Zusammensetzung, die an den empfindlichen Plaque verabreicht und dort lokalisiert ist, unter Erzeugung einer phototoxischen Spezies dazu bringt, den empfindlichen Plaque zu stabilisieren, wobei: der empfindliche Plaque inflammatorische Komponenten, einen großen Lipidpool und eine dünne faserige Kappe umfaßt, die dünne faserige Kappe weniger als 150 μm dick ist, der empfindliche Plaque einen Makrophagen- und/oder Monozytengehalt von mehr als 10% hat und der Lipidgehalt mehr als 10% beträgt.
  55. Vorrichtung nach Anspruch 54, wobei die Emission Wärme beinhaltet.
  56. Vorrichtung nach Anspruch 54, wobei die Emission radioaktive Signale von einer Zusammensetzung beinhaltet, die einen radioaktiv markierten makromolekularen Träger umfaßt, der an den empfindlichen Plaque verabreicht und an diesem lokalisiert ist.
  57. Verwendung eines Produkts bei der Herstellung eines Medikaments zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Verwendung beim Detektieren und Behandeln eines empfindlichen Plaque in einem Subjekt, wobei das Produkt folgendes umfaßt: a) eine detektierbare Menge wenigstens einer fluroeszenten Zusammensetzung, wobei die fluoreszente Zusammensetzung an dem empfindlichen Plaque lokalisiert werden kann, und b) eine therapeutisch wirksame Menge wenigstens einer Photosensibilisator-Zusammensetzung, wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung an einem empfindlichen Plaque lokalisiert werden kann, und wobei die wenigstens eine fluoreszente Zusammensetzung zu Lichtaktivierung in der Lage ist, um eine fluoreszente Spezies zu erzeugen und dadurch den empfindlichen Plaque zu identifizieren, und wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung zu Lichtaktivierung an der Stelle des empfindlichen Plaque in der Lage ist, um eine phototoxische Spezies zu erzeugen, so daß der empfindliche Plaque gegen Zerstörung stabilisiert wird, wobei: der empfindliche Plaque inflammatorische Komponenten, einen großen Lipidpool und eine dünne faserige Kappe umfaßt, die dünne faserige Kappe weniger als 150 μm dick ist, der empfindliche Plaque einen Makrophagen- und/oder Monozytengehalt von mehr als 10% hat und der Lipidgehalt mehr als 10% beträgt.
  58. Verwendung eines Produkts bei der Herstellung eines Medikaments zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Verwendung beim Detektieren und Behandeln eines empfindlichen Plaque in einem Subjekt, wobei das Produkt folgendes umfaßt: a) einen radioaktiv markierten makromolekularen Träger, wobei der radioaktiv markierte makromolekulare Träger an dem empfindlichen Plaque lokalisiert werden kann, und b) eine therapeutisch wirksame Menge wenigstens einer Photosensibilisator-Zusammensetzung, wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung an dem empfindlichen Plaque lokalisiert werden kann, und wobei der radioaktiv markierte makromolekulare Träger in einer Menge vorliegt, die meßbar ist und dadurch den empfindlichen Plaque identifiziert, und wobei die Photosensibilisator-Zusammensetzung zu Lichtaktivierung an der Stelle des empfindlichen Plaque in der Lage ist, um eine phototoxische Spezies zu erzeugen, so daß der empfindliche Plaque gegen Zerstörung stabilisiert wird, wobei: der empfindliche Plaque inflammatorische Komponenten, einen großen Lipidpool und eine dünne faserige Kappe umfaßt, die dünne faserige Kappe weniger als 150 μm dick ist, der empfindliche Plaque einen Makrophagen- und/oder Monozytengehalt von mehr als 10% hat und der Lipidgehalt mehr als 10% beträgt.
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