PT576988E - Isolamento e caracterizacao do receptor da hormona de libertacao da hormona de crescimento - Google Patents

Description

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DESCRICÃO "Isolamento e caracterização do recoptor da hormona da libertação da hormona de crescimento"

ÂMBITO DO INVENTO O presente invento refere-se ao isolamento de receptores hormonais e mais em particular, a métodos e composições úteis para a purificação do receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento e ao isolamento do receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento, purificado.

ANTECEDENTES DO INVENTO A hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH) é segregada pelo hipotálamo e estimula a libertação da hormona de crescimento (GH) da pituitária anterior. A GHRH é um membro de uma família de péptidos homólogos, que inclui o glucagon, secretina, VIP (péptido intestinal vasoactivo), PHI (péptido histidina-isoleucina), PACAP (péptido activador da adenilato-ciclase pituitária), GIP (péptido inibidor gástrico) e helodermina. A GHRH tem sido alvo de um número considerável de estudos, mas sabe-se pouco acerca do receptor da GHRH, o GHRH-R, ao qual a GHRH se liga na pituitária anterior, para induzir a libertação de GH. A produção em grande escala do receptor de GHRH clonado iria permitir a pesquisa de um grande número de análogos de GHRH e facilitaria o desenvolvimento de agonistas e antagonistas melhorados, na terapia clínica de desordens do crescimento. Mais especificamente, a pesquisa de um grande número de análogos e xenobióticos quanto a actividade de GHRH poderia conduzir ao desenvolvimento de agonistas melhorados para utilização em terapia clínica de crianças deficientes em hormona do crescimento, e na terapia clínica de adultos, para melhorar a nutrição e alterar a composição corporal (músculo vs. gordura). Esta pesquisa, possivelmente assistida por modulação em computador, baseada na estrutura do receptor, poderia também conduzir a agonistas de GHRH não peptídicos oralmente activos, que seriam especialmente úteis na prática médica e veterinária, por exemplo, para desenvolver um maior 2 86 466 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ rendimento na produção de leite e um maior rendimento na produção de gado mais magro. A exploração comercial de drogas que interagem com o GHRH-R irá necessitar de uma fonte de uma forma purificada do GHRH-R e de testes de ligação adequados. O isolamento e a clonagem do receptor de GHRH e a sua expressão in vitro irão também conduzir a: (1) Estudos de hibridação in situ para mapear a distribuição de receptores de GHRH em todo o corpo e para analisar o seu potencial papel fisiológico fora da pituitária; isto poderá revelar papéis potenciais para a GHRH no cérebro, gónadas, pâncreas, placenta e intestino, onde se pensa que o péptido está concentrado. (2) Estudos da estrutura do receptor envolvendo receptores mutados ou quiméricos, para explorar relações estrutura/função e interacções de segundo mensageiro na procura de moléculas de agonista/antagonista especificamente talhadas. (3) Uma compreensão da relação evolutiva dos GHRH-R com outros receptores ligados a proteína-G, especialmente os da família glucagon/secretina/VIP. (4) Clonagem de outros membros desta sub-família, que se espera tenham uma sequência semelhante.

Existem outras vias alternativas para a obtenção de clones de receptores funcionais, como: A. Purificação da proteína receptora para obter uma sequência parcial da proteína; esta sequência parcial da proteína poderia então ser utilizada para pesquisar ADN adequado para a sequência nucleotídica correspondente. B. Pesquisa de ADN quanto a semelhanças de sequência com receptores conhecidos, que se pensa estarem relacionados com o receptor de GHRH. C. Pesquisa de ADN que, quando expresso como uma proteína, origina um receptor de GHRH, que seria detectado por ligação a GHRH, actividade biológica, ou por um anticorpo do receptor de GHRH. Note-se que qualquer método de clonagem conceptível necessita de testes de ligação, bem como de testes funcionais com GHRH e péptidos relacionados, de modo a identificar o receptor de GHRH e caracterizar os clones expressos.

Existe assim a necessidade de testes de ligação de GHRH e composições para utilização nestes testes, que ajudem a caracterizar e isolar o receptor de GHRH. Em particular, há a necessidade de métodos que possam caracterizar o receptor de GHRH pituitário em termos de tamanho, glicosilação, solubilidade e 3 06 465 ΕΡ 0 576 988/ΡΤ estabilidade do complexo receptor (GHRH-R) - ligando (GHRH ou análogo de GHRH), de modo a que se possam desenvolver métodos para purificar a proteína receptora e identificar clones de receptores. Há também a necessidade de purificar, ou purificar parcialmente, o GHRH-R e de métodos para obter o mesmo. Por GHRH-R parcialmente purificado entende-se que se forma um isolado de GHRH-R com GHRH-R isolado a partir da maioria da matriz orgânica das células da pituitária anterior. O isolado de GHRH-R tem uma pureza suficiente para permitir a determinação da sequência de GHRH-R, devendo entender-se que isto poderá necessitar de purificação adicional, para remover quaisquer compostos remanescentes que possam interferir com a sequencíação, tais como as proteínas-G. Apesar disto, o isolado de GHRH-R do presente invento, produzido utilizando o método de extracção e isolamento do presente invento, contém GHRH-R, de preferência numa concentração maior do que aquela em que o GHRH-R está naturalmente presente na pituitária anterior, e o isolado de GHRH-R pode ser adicionalmente purificado, se necessário, utilizando SDS-PAGE para remover quaisquer compostos que possam interferir com a sequencíação do GHRH-R. Assim, o presente invento inclui também a produção de GHRH-R de pureza suficiente para realizar a sequencíação, ou para utilização em bioensaios da actividade de ligação do GHRH-R.

Historicamente, tem sido difícil trabalhar com o GHRH-R, pois a GHRH tem uma ligação não específica muito elevada (tornando difícil determinar se a GHRH ou os análogos de GHRH se estão a ligar, ou não, especificamente ao GHRH-R) e o GHRH-R tem uma abundância extremamente baixa. A ligação não específica dos análogos de GHRH a vidro e plástico tem sido um dos principais problemas em trabalhos anteriores, limitando a precisão e a reprodutibilidade dos estudos de ligação ao receptor. Devido à natureza "pegajosa" do péptido GHRH carregado negativamente, a utilização de um teste de ligação do tipo filtração simples tem sido impossível. As contagens não específicas são tão elevadas, que impedem a detecção da ligação específica. Além disso, o agente bloqueador vulgarmente utilizado, a polietilenoimina, que é utilizada para bloquear a ligação não específica de proteínas em filtros de fibra de vidro, é carregada positivamente e irá ligar-se a análogos de GHRH (carregados negativamente) de forma não específica. Além disso, não está ainda disponível nenhuma preparação de receptor solúvel, com uma afinidade de ligação elevada, o que iria melhorar grandemente os esforços para purificar o GHRH-R. 4 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ

Estudos anteriores caracterizaram ο receptor de GHRH ao nível da sua afinidade para sondas, tais como GHRH e péptidos relacionados, e ligação à proteína-G. Também se fizeram tentativas para utilizar agentes de reticulação químicos, não específicos, para marcar o receptor de GHRH. Veja-se, por exemplo, Zysk et al., "Cross-Línking of a Growth Hormone Releasing Factor-Binding Protein in Anterior Pituitary Cells" J. Biol. Chem.. 261:1678 (1986), e Velicelebi, et al., "Covalent Cross-Linking of Growth Hormone-Releasing Factor to Pituitary Receptors", Endocrinoloqy. 118:1278 (1986). Os resultados destes dois estudos sugerem, respectivamente, a presença de um receptor de GHRH de 26 kDa e um de 70 kDa na pituitária anterior. A discrepância entre o peso molecular encontrada nestes dois estudos reforça as dificuldades envolvidas no isolamento e caracterização do GHRH-R e a necessidade de métodos e composições melhorados, úteis para o isolamento e caracterização do GHRH-R.

Pensa-se que a ligação da GHRH à pituitária anterior de rato é influenciada pelo GTP, o qual faz com que o receptor de GHRH reduza a sua afinidade para o GHRH (díz-se que o GTP desacopla o complexo proteína G -receptor de GHRH). Pensa-se que este estado de afinidade elevada do GHRH-R ligado à GHRH, é estabilizado por interacções com uma proteína reguladora do nucleótido guanina, para formar um complexo ternário hormona-receptor-proteína G. Pensa-se que o GTP destabiliza as interacções da proteína-G-receptor, resultando na dissociação do complexo GHRH/GHRH-R-proteína G e na reversão do receptor independente, para um estado de afinidade baixa, enquanto que a proteína G libertada continua a activar o seu sistema de segundo mensageiro. Veja-se Struthers eia/., "Nucleotide Regulation of Growth Hormone-Releasing Factor Binding to Rat Pituitary Receptors", Endocrinoloqy. 124:24-29 (1989).

Verificou-se que em tecidos da pituitária anterior de ovino e bovino, a GHRH e os seus análogos são deslocados por concentrações 500 a 1000 vezes menores de GHRHa, em relação a VIP e PACAP. Esta verificação é complementar às propriedades de ligação verificadas no pâncreas humano (uma fonte de receptores de secretina e VIP), em que a capacidade de estimular a adenilato-ciclase na presença de GTP mostra uma ordem de potências de secretina > helodermina > PHI j> VIP > GHRH(1-27)NHZ. Igualmente, utilizando 125l-secretina, as Kd obtidas foram de 0,8 nM para a secretina, 200 5 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ ηΜ para a helodermina, 250 ηΜ para ΡΗΙ. 0 VIP e GHRH(1-29)-NH2 induzem apenas 20% de inibição a 10 μΜ.

Em doses suprafisiológicas, sabe-se que a GHRH actua em receptores de VIP e, inversamente, o VIP é um agonista de GHRH fraco.

Outros artigos que proporcionam uma informação de antecedentes sobre o isolamento e a caracterização de receptores de hormonas incluem: 0 resumo No. 175248g em Chemical Abstracts 1991, Vol. 115, No. 17, página 135 descreve a caracterização parcial do receptor de GHRH por reticulação de GHRH marcada com 125l em células de timo de rato com substrato dissuccinimidilo, seguido de PAGE e autorradiografia. O resumo No. 35929f em Chemical Abstracts, 1988, Vol. 109, No. 5, página 442, descreve a caracterização das propriedades de ligação do receptor de GHRH da pituitária humana, utilizando o análogo de GHRH marcado radioactivamente 125l-GHRHa como ligando.

Christophe et al., "The VIP/PHI/Secretin-Helodermin/helospectin/GRH Family: Structure-Function Relationship of the Natural Peptides, their Precursors and Synthetic Analogs as Tested in vitro on Receptors and Adenylate Cyclase in a Panei of Tissue Membranes" in Peptide hormones As Prohormones: Processing, Bioloqical Activity, Pharmacology, Ed. Jean Martinez, Pub. Ellis Horwood Lim. 1989, Chichester, England. Baburthe, et a!., "Molecular Analysis of Vasoactive Intestinal Peptide Receptors: A comparison with Receptors for VIP Related Peptides", Ann. NY Acad. Sei.. 527:296-313 (1988). Frohm, et al., "Growth Hormone-Releasing Hormone", Endocr. Rev.. 7:223-253 (1986). Seifert et al., "Growth Hormone-Releasing Factor Binding Sites in Rat Anterior Pituitary Membrane Homogenates: Modulation By Glucocorticoids", Endocrinologv 117:424-426 (1985).

Bilezikjian et al., "Desensitization to Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) is associated with Down-Regulation of GRF-Binding Sites", Endocrinologv 118:2045-2052 (1986). Ishiara, et al., "Functional Expression and Tissue Distribution of a Novel Receptor for Vasoactive Intestinal Polypeptide" Neuron 8:811-819 (1992). Ishihara et al., "Molecular Cloning and Expression of a

86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ cDNA Encoding the Secretin Receptor" EMBO J., 10:1635-1641 (1991). Lin et a!., "Expression Cloning of an Adenylate Cyclase-Coupled Calcitonin Receptor" Science. 254:1022-1024 (1991). Juppner et ai, "A G protein-Linked Receptor for Parathyroid Hormone and Parathyroid Hormone-Related Peptide" Science. 254:1024-1026 (1991). Frohman et ai, "Tissue Distribution and Molecular Heterogeneity of Human Growth Hormone-Releasing Factor in the transgenic mouse", Endocrinoloav. 127:2149-2156 (1990). Paul et ai, "Characterization of Receptors for Vasoactive Intestinal Peptide Solubilized From the Lung" .T Biol. Chem.. 262:158-162 (1987). Guijarro et ai, "Solubilization of Active and Stable Receptors for Vasoactive Intestinal Peptide from Rat Liver” Requlatorv Peptides. 25:37-50 (1989). Cronin et ai, "Biological Activity of a Growth Hormone Releasing Factor Secreted by a Human Tumor, "Am. J. Phvsiol.. 244 (Endocrinol Metab) E346-E353 (1983). Leong et ai, "Enumeration of Lactotropes and Somatropes in Cultured Male and Female Pituitary Cells: Evidence in Favor of a Mammosomatrope Subpopulation" Endocrinoloqy. 116:1371-1378 (1985). Munson, et ai, "Ligand: a Versatile Computerized Approach for Characterization of Ligand-Binding Systems" Anal. Biochem. 107:220-239 (1980). Wessel et ai, "A Method for the Quantitative Recovery of Protein in Dilute Solution in the Presence of Detergents and Lipids" Anal. Biochem. 138:141-143 (1984). Bagnato et ai, "Gonadotropin-lnduced

Expression of Receptors for Growth Hormone Releasing Factor in Cultured Granulosa Cells*", Endocrinoloqy. 128, 2889-2894 (1991) (as composições estudadas por Bagnato et al mostram propriedades de ligação da GHRH que são diferentes das propriedades de ligação de tecidos pituitários). Todos os artigos e outros documentos aqui mencionados são incorporados para referência como se reproduzidos na totalidade, mais à frente.

Apesar dos estudos anteriores terem sido úteis no desenvolvimento de uma compreensão preliminar do comportamento do GHRH-R, permanece a necessidade de um teste sensível e reprodutível para o GHRH-R, que irá permitir uma caracterização adicional do GHRH-R, conduzindo à purificação e clonagem do GHRH-R. Este teste tem que ultrapassar os problemas da ligação não específica de GHRH e análogos de GHRH, e da pouca abundância do receptor de GHRH. A iodação e a purificação de análogos de GHRH, com uma actividade específica elevada resultante, permite melhorar a ligação específica a membranas de pituitária anterior, em bruto. 7 86 >165 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ

Assim, constitui um primeiro objectivo do presente invento, desenvolver um teste sensível e reprodutível para a ligação de GHRHR.

Constitui outro objecto do presente invento desenvolver reagentes para marcar de forma específica e não ambígua o receptor de GHRH.

Constitui ainda outro objecto do presente invento desenvolver um esquema de purificação do receptor de GHRH e obter um isolado de GHRH-R com pureza suficiente, ou capaz de ser facilmente purificado até uma pureza que permita pelo menos a sequenciação parcial do GHRH-R.

Assim, constitui ainda outro objecto do presente invento produzir GHRH-R purificado.

SUMÁRIO DO INVENTO

Estes e outros objectivos do presente invento são conseguidos através de um teste de ligação a GHRH melhorado, que conduz ao isolamento de um extracto de GHRH-R bruto (isolado). O GHRH-R é caracterizado pela utilização de sondas radioiodadas, formadas a partir de análogos de GHRH. Os análogos de GHRH (GHRHa e GHRHb) e outros análogos são iodados, utilizando iodoesferas de fase sólida, e o material monoiodado é purificado por HPLC de fase inversa, para ficar essencialmente isento de transportador. A ligação não específica de análogos de GHRH a vidro e material de plástico durante o fornecimento e diluição foi substancialmente eliminado utilizando solventes orgânicos. Numa concretização preferida, utiliza-se acetonitrilo a cinquenta porcento para a diluição e fornecimento de análogos de GHRH. A ligação específica de GHRH e GHRHa a peletes de membrana de pituitária anterior, brutos, é aumentada por adição de um antibiótico formador de poros. Numa concretização preferida, o antibiótico alameticina (a aproximadamente 0,05 mg/ml) é combinado com peletes de membrana de pituitária anterior homogeneizados, para aumentar a ligação específica de GHRH. Têm-se preparado análogos de GHRH que contêm grupos de reticulação sensíveis a UV (fotossondas ou sondas de fotoafinidade) que demonstram uma reticulação de afinidade elevada específica, sensível a GTP, ao receptor de GHRH. As sondas diferem tanto em localização do grupo fotossensível como no 8 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ comprimento do braço espaçador. As fotossondas preferidas são formadas por acoplamento do análogo de GHRH [His\Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 a N-5-azido-2-nitrobenzoiloxissuccinimida (ANR-NOS) ou a sulfnssιlccinimidil-6-(4.'-azido-2,-nitrofenilamino)hexanoato (sulfo-SANPAH ou SANPAH), seguido de iodação e purificação. De preferência, o acoplamento ao reagente ANB-NOS é direccionado para as lisinas nas posições 12 ou 21; o composto é subsequentemente iodado na tirosina na posição 10 e o produto é purificado por HPLC de fase inversa para formar uma fotossonda, que será designada por 125l-GHRHa-ANB-NS. Numa concretização alternativa, a fotossonda 125l-GHRHa-SANPAH é formada num sistema de solventes de dimetilformamida, por acoplamento do SANPAH direccionado para a histidina terminal de GHRHa, purificação por HPLC de fase inversa, iodação da tirosina na posição 10 da GHRHa e nova purificação por HPLC.

Verificou-se, de forma surpreendente, que utilizando as sondas de fotoafinidade acima mencionadas, é possível produzir um complexo solúvel de GHRHa ligado a GHRH-R; o complexo reticulado de forma covalente é facilmente solúvel numa solução de detergente moderado, contendo de preferência um composto detergente zwiteriónico, capaz de solubilizar proteínas, como o 3-[(3-colamidopropil)dimetilamónio]-1 -propano sulfonato (referido como CHAPS, disponível da Pierce ou da ICN Biomedicals de Irvine, Califórnia) e que a maioria dos contaminantes reticulados de forma não específica, não são solúveis na solução de detergente moderado. Verificou-se então que os complexos não reticulados também eram solubilizados nestas condições. A foto-reticulação foi realizada após solubilização e mostrou que o receptor (GHRH-R) e o ligando (GHRH-sonda) tinham formado um complexo solúvel estável. Numa concretização preferida, isto permite a eliminação de até cerca de 90% do GHRH ligado de forma não específica, por extracção com uma solução contendo CHAPS e remoção do péptido livre com carvão/dextrano. Isto resulta num teste de ligação de GHRH bastante melhorado.

Numa outra concretização, obtém-se um isolado de GHRH, parcialmente purificado através de cromatografia de afinidade, por ligação de uma função a GHRH, ou a um análogo de GHRH, que tem uma afinidade para um composto imobilizado num suporte. Numa concretização preferida, os derivados biotinilados de GHRHa são ligados a GHRH-R, solubilizados e em seguida imobilizados numa coluna de estreptavidina; verificou-se que o complexo GHRH 9 06 465 ΕΡ 0 576 988/ΡΤ ligado/GHRH-R se dissocia a pH 5,0 num tampão, formando assim um isolado de GHRH-R parcialmente purificado, que pode ser utilizado para determinar a sequência de resíduos de aminoácido do GHRH-R que, numa concretização preferida, ocorre após nova purificação do isolado de GHRH-R, utilizando SDS-PAGE para remover compostos, tais como proteínas-G, que iriam interferir na sequenciação, formando assim GHRH-R purificado.

DESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico de barras que demonstra a ligação de 125l-GHRHa a peletes de membrana pituitária de ovino em bruto. As barras indicam a fracção das contagens totais ligadas às peletes após incubação com a sonda sozinha, ou na presença de GHRHa 10 nM, ou GTPyS 50 μΜ. São apresentados quatro casos diferentes (conjuntos de barras). O primeiro caso (membrana) mostra a ligação a uma preparação de peletes de membrana em bruto. O segundo conjunto (congelado), mostra que há pouca ligação específica na mesma preparação de membrana, após esta ter sido congelada e descongelada. O terceiro conjunto (DTT) mostra a ligação a esta mesma preparação (não congelada), mas na presença de DTT ImM. O quarto conjunto (lavagem-ala), mostra um protocolo melhorado do presente invento que inclui o antibiótico formador de poros, alametacina, e um passo de lavagem adicional. As barras de erro indicam o erro padrão da média e N= 3 ou 4 réplicas por ponto. A figura 2 é um gráfico utilizado para análises de ligação de saturação. Os pontos são resultados de testes de ligação realizados na presença de níveis crescentes de GHRHa não marcada. As barras de erro indicam o desvio padrão da média. O gráfico menor inserido mostra os mesmos dados e a curva no sistema de coordenadas Scatchard (base de erro não apresentada no gráfico menor). A figura 3 é uma radiografia de um gel de SDS que demonstra a reticulação por fotoafinidade, do receptor. A reticulação com membranas de pituitária de ovino em bruto, é demonstrada com duas fotossondas diferentes (SANPAH e ANS-NOS), cada uma extraída por dois métodos diferentes (SDS e CHAPS). O efeito das enzimas desglicosilantes é também apresentado em cada caso. Os extractos de CHAPS mostram uma ligação não específica. 10 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ grandemente reduzida. Ambas as fotossondas marcam uma banda de 55 kDa, que se desvia para 45 kDa, por desglicosilação. A figura 4 é uma radiografia de um gel de SDS como na Figura 3, que mostra a reticulação de ANB-NOS extraído com CHAPS, que demonstra a competição por GHRH 10 nM e também mostra a desglicosilação. A Figura 5 é uma radiografia de um gel SDS de reticulação de fotoafinidade, como na Figura 4, que inclui os efeitos de GTPyS e também uma desglicosilação parcial com neuraminidase. A figura 6 demonstra a solubilidade de complexos GHRHa-GHRH-R que foram preparados deixando a GFIRHa radioiodada ligar-se a membranas de pituitária de ovino em bruto, quer na presença, quer na ausência de GHRHa 10 nM não marcados. A figura 7 demonstra a reticulação de fotoafinidade de complexos solúveis, produzidos de acordo com a experiência da Figura 6 com a fotossonda ANB-NOS-GHRHa e a fracção solúvel em detergente foi reticulada por UV, após a extracção. As duas pistas mais à esquerda foram extraídas com CHAPS e as duas pistas à direita foram extraídas com desoxicolato. A Figura 8 demonstra a instabilidade de complexos de GHRHa-GHRH-R tratados com carvão e dextrano, solubilizados em CHAPS, que foram expostos a GTPyS 50 μΜ (Mg++ _+_5 mM), DTT 10 nM, ou Triton X-100 a 1%, durante 30 minutos e em seguida tratados com carvão e dextrano mais uma vez, para quantificar a quantidade de dissociação. A figura 9 demonstra a dissociação de complexos GHRH-GHRH-R solúveis a um pH baixo, com estabilidade de complexos específicos solúveis a vários pH, avaliado como na figura 8. Outros dados indicam que se obtém uma dissociação quase completa a pH 5, ou inferior. A figura 10 demonstra a análise por SDS-PAGE, do eluato que contém GHRH-R purificado, obtido por cromatografia de afinidade do complexo receptor biotinilado GHRHb-GHRH-R, numa coluna de agarose e estreptavidina. 11 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DO INVENTO

Uma abordagem geral à clonagem do receptor de GHRH envolve (1) a caracterização do receptor de GHRH, (2) a utilização do conhecimento das características do receptor de GHRH para isolar o receptor de GHRH (3) a determinação da sequência peptídica do receptor de GHRH (ou uma porção do receptor de GHRH), (4) a determinação da sequência de ADN que é responsável pela produção do receptor de GHRH, utilizando sequências de oligonucleótidos degenerados para pesquisar uma biblioteca de ADNc e (5) a clonagem da sequência de ADN.

CARACTERIZAÇÃO DO GHRH-R

Teste de ligação a GHRH

Num aspecto, o presente invento refere-se a um teste sensível e reprodutível para a ligação de GHRH ao receptor de GHRH, que demonstra uma ligação específica de GHRH de afinidade elevada, reversível, dependente de GTP. Devido à elevada ligação não específica do péptido GHRH carregado negativamente, a utilização de um teste de ligação do tipo filtração mais simples tem sido impossível. Com o teste do presente invento, a ligação específica (definida como o número de contagens de radiação gama, γ, produzida pela ligação de 125l-GHRHa, que são eliminadas das peletes membranares homogeneizadas por GHRHa 10 nM) é 30 a 60% das contagens totais ligadas em peletes de membranas em bruto e até 90% das contagens após extracção com um detergente moderado (por exemplo CHAPS) e tratamento com carvão/dextrano. Uma concretização preferida do teste de ligação do presente invento envolve muitos factores, incluindo um protocolo de iodação em fase sólida suave, purificação por HPLC do radioligando isento de transportador, um sistema de solventes orgânicos para o fornecimento quantitativo de GHRHa, sendo ambos, o teste de células plaqueadas e o teste de placa hemolítica inversa, para confirmar a actividade biológica da sonda e a utilização de cerca de 0,05 mg/ml de alameticina, um antibiótico formador de poros, para aumentar a ligação específica do radioligando a peletes de membranas de pituitária anterior. A alametacina tanto aumenta a ligação específica como diminui as contagens retidas. Uma lavagem decresce as contagens recuperadas, mas melhora ainda mais a quantidade relativa de ligação específica. 12 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ

Um análogo de GHRHa preferido para estudos de ligação ao receptor é [His1,Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 (referido como GHRHa). O análogo de GHRH é um péptido que tem uma boa actividade de ligação a GHRH-R, e difere da sequência humana em comprimento e tem dois aminoácidos, que são alterados para facilitar a sua utilização como substrato de iodação. Uma fonte preferida de GHRHa são os Península Laboratories (Belmont, CA). A preparação de análogos de GHRH iodados de actividade específica e actividade biológica, óptimas, é realizada iodando primeiro os análogos de GHRH (incluindo fotossondas), utilizando iodoesferas de fase sólida (tais como as disponíveis da Pierce) e em seguida o material monoiodado é purificado, essencialmente isento de transportador, por HPLC de fase inversa, de preferência utilizando uma coluna Bio-Series Poli F baseada num fluorocarboneto (disponível da MacMod). A diluição quantitativa e o fornecimento de análogos de GHRH são obtidos utilizando solventes orgânicos, utilizando de preferência uma solução de acetonitrilo a 50% em água, como transportador. Deste modo, evitam-se as diluições imprecisas, ou não reprodutíveis, que surgem com veículos aquosos.

Verificou-se, surpreendentemente, que se obtém um aumento de aproximadamente três vezes na ligação específica, comparado com a metodologia anterior, quando se combina um antibiótico formador de poros com peletes de membrana de pituitária anterior em bruto (veja-se Struthers et a!., Endocrinology. 124:24 (1989). Numa concretização preferida, a adição de cerca de 50 μg/ml do antibiótico alameticina é utilizada para obter uma ligação específica óptima.

Na figura 1, apresenta-se a ligação da sonda 125l-GHRHa a peletes de membrana em bruto, que foram tratadas sob diferentes condições. Há quatro conjuntos de três barras. Cada barra em cada conjunto indica a fracção de contagens totais ligada após incubação com a sonda iodada. Para cada conjunto de três barras, a barra da esquerda indica as contagens totais ligadas após incubação com a sonda iodada sozinha, sem exposição prévia das membranas a GHRH fria, ou outro composto que se sabe competir com GHRHa, ou interferir com a ligação de GHRHa. A barra do centro indica a fracção de contagens totais ligadas após incubação com a sonda iodada, que foi adicionada à incubação, juntamente com GHRHa não marcada 10 nM (que compete para 13 80 400 ΕΡ 0 576 988/ΡΤ locais de ligação específica). A diferença entre a barra mais à esquerda e a barra central, de cada conjunto de barras, indica a ligação específica de GHRH, que representa a quantidade de GHRH-R presente. A barra da direita indica a fracção das contagens totais ligadas após incubação com a sonda-125l, na presença de GTPyS 50 μΜ. Uma vez que se sabe que o GTPyS provoca a dissociação da proteína-G de alguns complexos receptores, resultando numa menor afinidade e menor ligação, o decréscimo na ligação específica quando se utiliza GTPyS é consistente com a presença do complexo GHRH-R-proteína-G. A ligação específica é definida como a diferença na ligação observada com 20 pM de análogo iodado sozinho e a ligação do análogo na presença de 10 nM de GHRHa não iodada. A ligação de saturação, análise de Scatchard; estudos de competição e outros dados discutidos aqui, mostram que estes locais de afinidade elevada, são locais de ligação específica.

Na figura 2, os estudos de ligação de saturação demonstram a ligação do análogo de GHRH [His1, Nle27]-GHRH-(1 -32)-NH2 (GHRHa) a um único local de afinidade com uma Kd de cerca de 160 pM. Algumas barras de erro eram demasiado pequenas para serem apresentadas (N = 6 réplicas por ponto). Este dado foi analisado com o programa de computador Ligand, que determina as constantes de ligação baseadas num ajuste pelo método dos mínimos quadrados, estatisticamente ponderado, à equação de ligação do ligando num sistema de coordenadas não transformadas. O programa refere um único local de ligação com uma Kd = 150_+10 pM e R = 1,5.+.0,09 pmol/g tecido (melhor valor do ajuste = SEM aproximada do ajuste). Os testes estatísticos suportam este modelo de local de ligação único. A linha a tracejado é a curva teórica gerada utilizando estas constantes na equação de ligação. A ligação específica do radioligando GHRHa é reduzida até 65% por GTPy 50 μΜ. Os péptidos relacionados, VIP e PACAP não competiram para este local de ligação em concentrações de 100 nanomolar. Esta ligação representa um GHRH-R ligado a proteína G de alta afinidade. Sabe-se que a ligação de VIP ao receptor de VIP é sensível a agentes redutores de sulfidrilo. Esta ligação específica no teste de GHRH é completamente eliminada por pré-incubação com ditiotreitol 1 mM (DTT, que se sabe que impede a ligação de afinidade elevada a receptores relacionados), suportando portanto a conclusão de que o receptor GHRH-R é o local de ligação. 14 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ

SONDAS DE FOTOAFINIDADE

As sondas de fotoafinidade foram preparadas utilizando agentes de reticulação fotorreactivos; estas sondas diferem tanto na localização do grupo fotossensível como no comprimento do braço espaçador. As sondas são capazes de se ligar a GHRH-R na ausência de radiação UV e de reticulação de GHRH-R sob a influência de radiação UV. Os exemplos não limitantes preferidos de sondas de fotoafinidade e métodos para a sua produção são:

1) 125l-GHRHa-AI\IB-NOS 0 análogo de GHRH de 32 aminoácidos [His\ Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 (GHRHa) foi acoplado ao reagente N-5-azido-2-nitrobenzoiloxissuccinimida (ANB-NOS) direccionado para a lisina 12 ou 21, para formar GHRHa-ANB-NOS. O GHRHa-ANB-NOS foi iodado utilizando iodoesferas para formar o radioligando ("fotossonda” 125l- GHRHa-ANB-NOS ("GHRHa-ANB-NOS quente" ou fotossonda quente") (as iodoesferas preferidas podem ser adquiridas da Pierce, Rockford, IL).

2) l-GHRHa-SANPAH

Num sistema de solventes de dimetilformamida, o análogo de GHRH [His1,Nle27]-GHRH-(1 -32)-NH2 a N-5-azido-2-nitrobenzoiloxissuccinimida (ANB-NOS) foi acoplado a hexanoato de sulfossuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino) (sulfo-SANPAH ou SANPAH), direccionado para a histidina do N-terminal de GHRHa. O material radioiodado foi então purificado essencialmente isento de péptido de partida, por HPLC de fase inversa numa coluna Bio Series Poli F, baseada num fluorocarboneto (disponível da MacMod Analytical, Chadds Ford, PA), utilizando um gradiente fraco de acetonitrilo. A ligação da fotossonda em peletes de membrana de pituitária de ovino foi determinada por contagem yea reticulação induzida por UV foi avaliada por autorradiografia de geles de electroforese em poliacrilamida, com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). A sonda ,25l-GHRHa-ANB-NOS ligou-se com uma afinidade de cerca de um nanomole, nM (comparado com cerca de 160 picomole , pM, para GHRHa). A SDS-PAGE revelou uma banda a cerca de 55 kDa para a pituitária de ovino (na pituitária de ovino, 57 kDa) que foi completamente eliminada na presença de 10 nM de GHRHa; esta banda foi reduzida em mais de 50% por GTPyS 50 μΜ e não foi afectada por 100 nM de 15 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ VIP. Assim, a banda de 55 kDa é devida à foto-reticulação de GHRH-R. A Figura 3 mostra que esta banda de 55 kDa específica é separada da maioria do material reticulado de forma não específica por extracção com CHAPS. A figura 4 demonstra a competição com 10 nM de GHRHa. A figura 5 demonstra o efeito do GTPyS na reticulação. O tratamento do receptor de GHRH reticulado com neuraminidase fez com que a banda de 55 kDa se desviasse para 50 kDa, o que é atribuído à remoção de grupos de ácido siálico terminais, carregados, que diminuem a mobilidade no gel (figura 5). O tratamento do receptor de GHRH reticulado com uma mistura isenta de protease, purificada, de endoglicosidase F e N-glicosidase F (disponível da Boehringer Manheim de Indianapolis, Indiana) provocou um desvio na mobilidade do gel para formar uma banda a 45 kDa (apresentada nas Figura 3 e 4); isto indica que o receptor de GHRH é uma glicoproteína ligada a N (comum entre os receptores ligados a proteína-G) e sugere o tamanho da cadeia da proteína desglicosilada. Este tamanho é consistente com a estrutura dos receptores de VIP e secretina.

Testes realizados com lectinas imobilizadas mostraram não haver nenhuma ligação do receptor de GHRH reticulado com a aglutinina de germe de trigo, ricina, aglutinina de Limulus ou concanavalina A. Isto torna o receptor invulgar e oferece uma abordagem à purificação e isolamento deste receptor em relação a outros receptores que se ligam a estas lectinas. Após tratamento com neuraminidase e β-galactosidase, o receptor ligou-se especificamente a aglutinina de amendoim, proporcionando uma abordagem adicional à separação e purificação do receptor de GHRH.

COMPLEXO GHRH-GHRH-R SOLÚVEL E TESTE DE LIGACÁO MELHORADO A reticulação por fotoafinidade mostrou que os complexos receptor-ligando acoplados de forma covalente são solúveis numa solução de detergente moderado, de preferência uma solução contendo CHAPS. A incubação prévia de GHRH com o receptor, utilizando as condição do teste de ligação a membranas acima referido, permitiu a extracção com CHAPS e a solubilização de um complexo receptor-ligando intacto, mesmo quando não reticulado. Este complexo foi detectado por contagem gama após a extracção com detergente, de membranas incubadas com 125l-GHRHa (GHRHa "quente"), sem reticulação. 16 8Θ 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ A figura 6 mostra que a maioria das contagens específicas observadas na membrana em bruto eram extraídas com CHAPS, na forma de um complexo específico associado ao receptor. Os dados da figura 6 foram obtidos como se segue. Deixou-se a GHRHa radioiodada ligar-se a membranas de pituitária de ovino em bruto, na presença ou na ausência de GHRHa 10 nM não marcada. Em seguida fez-se a extracção com detergente e centrifugação; os sobrenadantes foram então tratados com carvão/dextrano para separar a proteína ligada da GHRHa livre e contou-se o iodo radioactivo em cada fracção. Foi assim possível seguir a GHRHa marcada ligada à membrana em bruto, após tratamento com detergente e caracterizou-se como: (1) insolúvel; (2) solúvel e ligado de forma não específica; (3) ligada de forma específica, mas dissociada pelo detergente; ou (4) solúvel e ligada de forma específica. Como é sabido pela foto-reticulação, a maioria das contagens de ligação não específica não eram solúveis em CHAPS. A extracção com uma mistura de detergente desoxicolato solubilizou ligeiramente mais contagens totais, mas muitas destas eram instáveis e dissociadas, havendo predominância de contagens não específicas. A figura 7 mostra os resultados desta foto-reticulação para confirmar que este complexo continha o receptor. As membranas foram previamente ligadas com a fotossonda (125l-ANB-NOS-GHRHa) no escuro, extraídas com CHAPS e em seguida entrecruzadas com UV. Isto prova que o GHRH permaneceu ligado ao receptor solubilizado. No extracto de CHAPS, a maioria da ligação ocorreu na banda de receptor de 55 kD, enquanto que no caso do desoxicolato, a maioria das bandas eram não específicas. Isto está de acordo com os estudos de ligação apresentados na Figura 6 (embora as fotossondas tenham uma ligação não específica maior) e demonstra que a ligação específica do análogo de GHRH nos complexos solúveis é com o receptor de 55 kDa. Em concordância com a figura 6, o complexo era muito mais estável em CHAPS, do que em desoxicolato. Havia também poucas bandas não específicas (uma ocorre imediatamente abaixo da banda de receptor de 55 kDa) por foto-reticulação do extracto de CHAPS. A Figura 8 demonstra que a extracção de CHAPS conduz a um teste de ligação melhorado, com contagens não específicas grandemente reduzidas e uma sensibilidade aumentada (compare-se com a figura 1). Esta figura mostra também que o complexo é parcialmente dissociado por GTPyS 50 nM, sugerindo que as proteínas-G continuam associadas com o complexo, 17 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ solubilizado numa solução de detergente contendo CHAPS. A figura 1 mostra que o DTT 1mM impediu a ligação específica antes da adição de GHRH. A Figura 8 mostra apenas um efeito parcial de DTT 20 mM, após ter ocorrido a ligação prévia. Este complexo era também bastante estável em NaCI até 1 M, durante a noite, a 4°C, mas era completamente dissociado por Triton X-100 a 1% (tensioactivo). Note-se o baixo ruído de fundo obtido quando se utilizam amostras solúveis em CHAPS, tratadas com carvão e dextrano, num teste de ligação. A estabilidade em função do pH, do complexo receptor-ligando solúvel, é apresentada na figura 9. Há uma transição brusca com o complexo, sendo este instável a pH 5,5 e inferior, estável e capaz de trocar a GHRH ligada por GHRH livre entre pH 5,5 e 6 e muito estável e não permutável a pH 7. A estabilidade deste complexo resulta não só num teste de ligação de GHRH-R melhorado, como na base para uma nova metodologia de purificação do receptor.

ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE GHRH-R

Desenvolveram-se análogos de GHRH biotinilados com o objectivo de purificar o receptor de GHRH como um complexo receptor-ligando que pode ser retido em estreptavidina imobilizada. O primeiro análogo testado foi [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 (GHRHa) biotinilado nas lisinas nas posições 12 e/ou 21, utilizando o reagente N-hidroxissuccinimida NHS-LC-biotina (disponível da Pierce). Este análogo foi iodado na tirosina da posição 10 e foi resolvido como formas mono- e di-biotiniladas em HPLC. Mais de 90% destes produtos ligaram-se a estreptavidina imobilizada, em 30 minutos. A GHRHa monobiotinilada tem uma afinidade de ligação ao receptor reduzida em duas vezes, em comparação com o GHRHa, enquanto que o dibiotinilado tinha uma actividade praticamente nula. O grupo biotina parece estar na bolsa de ligação do receptor, uma vez que a ligação a estreptavidina bloqueou a ligação ao receptor. O análogo seguinte testado foi [His 1, Nle27, Cys33]-GHRH-(1-33)-NH2. Este tem uma forte tendência para dimerizar e nenhuma das espécies que podia deslocar a GHRHa num teste de ligação competitiva era biotinilada.

Verificou-se, surpreendentemente, que o [His 1, Nle27, Biotin-Lys41]-GHRH-(1-41)-NH2 (aqui referido como GHRHb) se liga ao receptor com uma afinidade comparável à do GHRHa (uma fonte preferida para preparar GHRHb é a Nuros Corporation of San Jose, Califórnia). Para demonstrar que este análogo 18 86 46b EP 0 576 988/PT podia ser utilizado na purificação do receptor este foi iodado, incorporou-se um grupo de reticulação fotossensível (ANB-NOS) e o composto foi purificado por HPLC. Esla GHRH iodo-biotinil-fotoactivóvel, 125l-GHRH-AMB-NOS, foi ligada a receptores em membranas de pituitária de bovino em bruto. Os complexos receptor-ligando foram solubilizados em CHAPS, tratados com carvão e dextrano para remover o GHRH livre e ligado a estreptavidina imobilizada.

Para verificar se a estreptavidina desalojava o receptor do complexo, fez-se a reticulação das amostras por UV antes e depois da ligação de estreptavidina e analisou-se por autorradiografia. Isto demonstrou que uma fracção significativa (30%) do receptor que estava disponível para ligação, podia ser retida em esferas de estreptavidina. Estudos da estabilidade do complexo receptor-ligando solúvel (veja-se figura 9) indicam que uma lavagem com uma concentração elevada de sal (NaCI 0,5 M) das esferas de estreptavidina, seguida de uma eluição a pH baixo (pH 5) (de preferência utilizando um fosfato, acetato, citrato, ou outra solução tampão adequada) resulta numa purificação do receptor significativa, para produzir um isolado de GHRH-R. O isolado de GHRH-R obtido tem uma pureza suficiente para permitir a sequenciação do GHRH-R. As proteínas-G e outros contaminantes que interferem são removidos por métodos como, mas não limitados a, electroforese em gel, de modo a obter o GHRH-R com uma pureza pelo menos suficiente para realizar a sequenciação.

A Figura 10 demonstra os resultados da purificação por afinidade, do complexo de receptor biotinilado (GHRHb-GHRH-R) numa coluna de agarose e estreptavidina. As esferas de agarose, com o complexo ligado, foram lavadas em NaCI 0,5 M, para minimizar a ligação não específica e em seguida o receptor foi dissociado do ligando biotinilado a pH 5,0 e eluído da coluna. O eluato foi concentrado por ultrafiltração controlada por centrifugação e analisado por SDS-PAGE. Correu-se em paralelo uma coluna de controlo e tratou-se de forma idêntica, excepto que os complexos de receptor solúveis foram previamente ligados com o análogo GHRHa, não biotinilado. A pista de GHRHb neste gel corado com prata mostra bandas a 52 e 45 kDa que não se observam na pista da GHRHa. A banda de 52 kDa corresponde ao tamanho esperado para o receptor dado que a banda de 55 kDa observada nos estudos de reticulação inclui o péptido de GHRHa de 3,6 kDa, ligado de forma covalente. A banda de 45 kDa é o tamanho referido para a proteína-G 19 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ estimuladora, G8, que se pensa ser uma subunidade do complexo do receptor de GHRH. A eluição simultânea destas duas bandas e a sua ausência na coluna de controlo, confirmam que se preparou um GHRH-R altamente purificado.

MÉTODOS EXPERIMENTAIS E EXEMPLOS

Os exemplos não limitantes seguintes demonstram também o teste de ligação de GHRH melhorado, do presente invento e o método para a purificação do receptor de GHRH, baseado na solubilização de um complexo GHRH/receptor de GHRH intacto. Deve entender-se que se pode utilizar uma variedade de outros materiais além dos aqui especificamente mencionados, para a prática do invento, sem experimentação excessiva.

1. TESTE DE LIGAÇÃO EM PELETES DE MEMBRANA, BRUTOS

PREPARAÇÃO DE TECIDO

Todos os passos foram realizados a 4°C. As pituitárias anteriores de ovino ou bovino congeladas (ovino: aproximadamente 1 g/pituitária obtida do Dr. lain Clarke, Melbourne, Austrália; bovino: aproximadamente 2,5 g/pituitária atenção especial de Pel-Freez, de Rogers, Arkansas) foram lavadas de sangue, limpas de tecido conjuntivo e homogeneizadas (utilizando um homogeneizador Dounce) em tampão HEPES 50 mM, NaCI 100 mM, EDTA 10 mM, EGTA 0,1 μΜ, pH 7,4, com PMSF 0,5 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonilo), leupeptina 10 pg/ml, pepstatina A 10 pg/ml e aprotinina 200 U/ml (unidades/ml). Este tampão é utilizado para remover o GTP endógeno que possa estar ligado a proteínas G e para restabelecer a ligação de afinidade elevada. O homogeneizado foi girado à velocidade máxima numa microcentrífuga e desprezou-se o sobrenadante. A camada superior (membrana) da pelete foi então suavemente ressuspensa em tampão de ligação contendo tampão Tris 50 mM, EGTA 5 mM, MgCI2 5 mM, alametacina 50 pg/ml, bacitracina 30 pg/ml e outros inibidores de proteases, como acima.

CONDIÇÕES DE LIGAÇÃO E ANÁLISE

Incubou-se 1/50 equivalentes de pituitária por tubo em tampão de ligação com aproximadamente 100 000 contagens de sonda iodada num volume de 500 μΙ à temperatura ambiente, durante 1 hora. As contagens totais fornecidas e a percentagem de contagens ligadas para cada tubo, foram determinadas com 20 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ 3 a 6 réplicas por condição experimental. Os perfis de ligação de saturação foram analisados com o programa de computador Ligand, que efectua um ajuste pelo método dos mínimos quadrados, estatisticamente ponderado, à equação exacta de ligação do ligando em coordenadas não transformadas. As medições estatísticas (teste F e teste de operações) indicaram um ajuste bom a um modelo de local de ligação único. IMa Figura 2 apresenta-se uma análise de ligação de saturação representativa.

RESULTADOS O tratamento do tecido com EDTA 10 mM foi essencial para permitir a remoção de GTP endógeno e revelar os locais dependentes de GTP de afinidade elevada. Inicialmente, a ligação não específica foi espantosa e uma grande variedade de agentes bloqueadores não contribuiu com melhorias. Observaram-se sinais de ligação ligeiramente melhores em fracções de membranas purificadas por centrifugação de densidade de sacarose. Para se obterem resultados consistentes, prepararam-se grandes lotes de membrana em bruto a partir de pituitárias congeladas e congelaram-se alíquotas desta membrana, para posterior ensaio. Na Figura 1, observou-se um grande aumento na ligação específica quando as membranas foram testadas directamente após homogeneização. Um mecanismo possível para este efeito de congelamento-descongelamento é a formação de vesículas que interferem com o teste. Ao testar esta possibilidade, verificou-se que o antibiótico formador de poros, alametacina (50 pg/ml) aumentou a razão de ligação específica/ligação total 3 vezes, como é ilustrado graficamente na Figura 1. A maior parte deste aumento era devida a uma queda na ligação não específica, possivelmente devido à libertação da sonda encurralada nas vesículas. Incluiu-se uma lavagem adicional das peletes de membrana por centrifugação, para maximizar o aumento de ligação específica em relação à não específica, apesar da perda na contagem total recuperada. A análise de computador de estudos de ligação de saturação com o programa Ligand indica um único local de ligação com uma Kd = 158.+.13 pM e um número total de locais de ligação específica (RT) de 1,5jL0,09 pmol/g de tecido (melhor valor de ajuste _+. erro padrão da média aproximado (SEM)). Uma vez que a afinidade para GHRHa é proporcional à potência biológica de GHRHa e devido à especificidade para a GHRH em relação a péptidos relacionados 21 86 4Θ5 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ (nenhuma competição para VIP ou PACAP 100 nM) e sensibilidade a GTPyS 50 μΜ e DTT 1,0 mM, esta ligação indica a presença de GHRH-R. A comparação da 125l-GHRHa com uma GHRH humana iodada, comercializada (Amerisham, Arlington Heights, IL) mostrou uma grande semelhança; a 1Z5l-GHRHa apresentou uma ligação específica ligeiramente melhor e um efeito do GTP um pouco mais forte.

AVALIAÇÃO DA LIGAÇÃO DA SONDA DE FOTOAFINIDADE

Prepararam-se duas sondas de fotoafinidade diferentes utilizando agentes de reticulação fotorreactivos, heterobifuncionais, disponíveis da Pierce, como referido acima (Rockford, IL). O SANPAH foi acoplado a GHRHa direccionado para a histidina N-terminal, utilizando um sistema de solventes de DMF. Acoplou-se ANB-NOS a GHRHa direccionado para as lisinas 12 ou 21. Cada produto de grupo de acoplamento-GHRHa foi purificado por HPLC, iodado e novamente purificado. A ligação da fotossonda a membranas foi avaliada com um teste de ligação de membranas em bruto e em seguida analisada por electroforese SDS-PAGE, para identificar os locais de ligação. As fotossondas foram incubadas no escuro, fotolisadas durante 10 minutos com uma lâmpada de UV de onda longa (366 nm) e as amostras foram sedimentadas. As peletes foram contadas e em seguida extraídas, fervendo directamente em tampão de amostra SDS (extractos de SDS totais). Alternativamente, as peletes marcadas foram extraídas numa solução de detergente moderado (CHAPS 5 mM), centrifugadas e os sobrenadantes foram concentrados em clorofórmio/metanol foram desnaturados com tampão SDS (extractos de CHAPS). Estas amostras foram então analisadas por electroforese em géis de SDS e autorradiografadas.

RESULTADOS O teste de ligação revelou que ambas as fotossondas se ligaram a peletes de membrana e podiam ser totalmente desalojadas por GHRHa 10 nM, ou parcialmente desalojadas por GTPyS 50 μΜ. Ambas originaram uma ligação não específica maior do que a Ι-GHRHa. Os geles de extractos de SDS totais das peletes reticuladas de afinidade, apresentaram esta ligação não específica como bandas não afectadas por GHRHRa ou GTPyS. Estas bandas não específicas diferiam um pouco de operação para operação e entre as duas sondas (Figura 22 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ 3). Ο detergente não iónico CHAPS é um solubilizante de proteínas fraco; trabalhos sobre a purificação do receptor demonstraram a capacidade das soluções que contêm CHAPS para solubilizar a actividade de ligação de GHRH. Quando os extractos de peletes reticuladas obtidos utilizando uma solução que contém CHAPS 5 mM foram analisados em geles de SDS, a visualização da reticulação do receptor foi bastante melhorada, dado que a maioria da proteína marcada de forma não específica não estava solubilizada. Nas Figuras 3 e 4, é claramente visível, com ambas as sondas, uma banda de 55 kD, cuja marcação é grandemente afectada por GHRHa ou GTPyS, e que representa GHRH-R. Estas fotossondas não têm valor nas posteriores caracterização, purificação e clonagem do receptor de GHRH.

DESGLICOSILAÇÃO

Uma vez que se sabe que a porção extracelular da maioria dos receptores de membrana ligados a proteína-G contém múltiplos grupos hidrato de carbono, ligados de forma covalente a resíduos arginina (Ligados a N), realizaram-se experiências para confirmar que a banda especificamente fotomarcada nas Figuras 3 e 4, é uma glicoproteína ligada a N. As amostras foram tratadas com uma mistura de endoglicosidase F e N-glicosidase F, isenta de protease, purificada.

As peletes fotomarcadas (extraídas utilizando SDS ou CHAPS) foram fervidas em tampão de amostra de SDS, diluídas e incubadas durante a noite a 37°C, com Nonidet P-40 a 1,25% (um detergente não iónico também conhecido como NP-40), quer em 0,5 unidades de glicosidase, quer no branco. Estas amostras foram então concentradas através de um protocolo de precipitação de clorofórmio-metanol (veja-se Wessel, et a!., Anal. Biochem.. 138:141-143 (1984)) e fez-se a electroforese em géis de SDS.

Nas Figuras 3 e 4 pode-se ver que a mobilidade dos desvios de bandas especificamente fotomarcadas se desvia de aproximadamente 55 kD para aproximadamente 45 kD, apenas na presença de glicosidase. Outras bandas, visíveis nas amostras extraídas com SDS e avaliadas como marcadas de forma não específica por falta de resposta a GHRHa ou GTPyS não são desglicosiladas. Esta constitui a primeira prova de que o GHRH-R é uma glicoproteína e fornece a melhor estimativa do tamanho real da cadeia proteica. Como se pode ver na Figura 5, o tratamento do receptor fotomarcado com 23 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ neuraminidase provocou um desvio na mobilidade no gel para aproximadamente 52 kD. Isto demonstra que o receptor tem um número de grupos ácido siálico terminais nas suas cadeias oligossacarídcas. Estes grupos ácido siálico também afectam o PI do receptor, como se pode ver em géis de focagem isoeléctrica, hidrofobicidade em HPLC e também pelas suas propriedades de ligação à lectina. A desglicosilação é útil em estratégias de purificação e para facilitar a clivagem proteolítica do receptor, para sequenciação.

SOLUBILIZAÇÃO DE COMPLEXOS RECEPTOR-GHRH

As preparações de membrana de pituitária solubilizadas em soluções que contêm CHAPS mostraram apenas locais de baixa afinidade, insensíveis a GTP (Kd de aproximadamente 500 nM), tal como medido por um teste de ligação com carvão-dextrano (adaptado a partir do desenvolvido para VIP por Paul et a/. J. Biol Chem, 262:158-162 (1987)). Outros detergentes conservaram ainda menos ligação, o que indica que o GHRH-R não era estável a esses tratamentos. Os resultados de reticulação de fotoafinidade revelaram que o complexo receptor-ligando acoplado de forma covalente é solúvel numa solução que contém CHAPS. A pré-incubação de GHRH com o receptor, utilizando as condições do teste de ligação de membranas do presente invento, seguido de extracção com uma solução de detergente moderado, contendo de preferência CHAPS, revelou a solubilização de um complexo receptor-ligando intacto. Este complexo solúvel foi detectado por extracção com detergente de membranas incubadas com o análogo 125I-GHRH, ou análogo 125I-GHRH, após tratamento com GHRH 10 nM frio.

GHRH-R PURIFICADO O análogo de GHRH biotinilado foi utilizado em seguida para formar um complexo GHRHb-GHRH-R solúvel e este complexo solúvel, após extracção utilizando CHAPS e purificação com carvão-dextrano, foi corrido numa coluna de estreptavidina. A coluna de estreptavidina foi então lavada com uma solução de NaCI e em seguida, correu-se na coluna uma solução tampão com um pH de 5,0, de modo a produzir um isolado de GHRH-R. O isolado de GHRH-R pode então ser posteriormente purificado por SDS-PAGE. Uma banda que surge a cerca de 52 kDa (correspondendo ao GHRH-R puro) pode ser transferida com uma membrana de PVDF convencional. 0 GHRH-R purificado contido na membrana de PVDF pode ser em seguida digerido

86 46b

EP 0 576 988/PT 24 na membrana e sequenciado para se obter a sequência de resíduos de aminoácido completa, ou parcial, do GHRH-R, após métodos de sequenciação convencionais. A sequência ou sequências de resíduos de aminoácido obtidas a partir do passo de sequenciação, podem ser utilizadas como base para construir sondas degeneradas, para utilização na clonagem do gene responsável pela produção de GHRH-R.

Assim, descreveu-se uma metodologia melhorada para medir a ligação de análogos de GHRH ao receptor de GHRH em membranas de pituitária de ovino e bovino (incluindo métodos para iodação, purificação e fornecimento de análogos de GHRH e a utilização de antibióticos formadores de poros). Isto conduziu ao desenvolvimento de métodos para a fotomarcação de alta afinidade do receptor de GHRH, sensível a GTP, específica de GHRH. Esta marcação deste receptor não foi anteriormente realizada. Isto permitiu caracterizar o tamanho, a glicosilação, a solubilidade, e outras propriedades do receptor. Isto conduziu à observação de que uma solução de detergente moderado, incluindo compostos como o CHAPS, podia extrair o complexo GHRH-receptor de GHRH ligado, numa forma solúvel, estável. A extracção com CHAPS e tratamento com carvão/dextrano (para ligar a GHRH livre) origina um complexo receptor-ligando solúvel, que é purificado a partir da maioria da ligação de GHRH não específica e é, portanto, muito útil como um teste de ligação de GHRH, novo, com baixo ruído de fundo, com uma melhor sensibilidade do que era anteriormente possível e também como ponto de partida para a purificação do receptor. Este complexo receptor-ligando é relativamente estável a lavagens com sal, permuta de GHRH ou tratamento com DTT e GTP, mas não a pH baixo. Foi inventado um análogo de GHRH biotinilado no terminal-C que, quando ligado num complexo de GHRH-R solúvel, permite purificar o receptor de GHRH por retenção numa coluna de estreptavidina imobilizada, seguido de uma lavagem com sal e eluição a pH 5. Esta proteína receptora purificada é adequada para a sequenciação parcial de péptidos receptores e esta informação sobre a sequência é valiosa para a clonagem do ADNc do receptor de GHRH. A partir dos ensinamentos acima descritos, é evidente que são possíveis muitas modificações e variações do presente invento. A título de exemplo não limitativo, é contemplado que outros complexos de GHRH-R em amostras de 25 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ pituitária em bruto se possam ligar a colunas de afinidade, de modo a produzir GHRH-R purificado. Deve portanto entender-se que o invento pode ser praticado de outro modo, que não o especificamcnte descrito.

Lisboa, 31. CUT. cUUl

Por THE UNIVERSITY OF VIRGÍNIA PATENT FOUNDATION - O AGENTE OFICIAL -

Eng." ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind.

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Claims (8)

1. 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ λ 12 REIVINDICAÇÕES 1. Receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento, com pureza suficiente para permitir a sequenciação.
2. 2. Método para a produção de um isolado de receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento, que compreende os passos de imobilizar o receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento complexado, num suporte de cromatografia de afinidade, e dissociação subsequente do referido complexo no referido suporte, para produzir um isolado de receptor de hormona de libertação da hormona de crescimento, em que o referido receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento é complexado com uma hormona de libertação da hormona de crescimento, ou um análogo da hormona de libertação da hormona de crescimento com uma função capaz de se ligar ao referido suporte de cromatografia de afinidade e em que antes da imobilização do referido complexo no referido suporte, o referido complexo é solubilizado numa solução de detergente moderado.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a referida dissociação do referido complexo no referido suporte é realizada baixando o pH.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o referido análogo é biotinilado e o referido suporte cromatográfico inclui funcionalidades de estreptavidina que são capazes de se ligar ao referido análogo biotinilado.
5. 5. Isolado de receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento, produzido pelo método de acordo com a reivindicação 2.
6. 6. Isolado de receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento, produzido pelo método de acordo com a reivindicação 4.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido receptor da hormona de libertação da hormona de crescimento é complexado com a hormona de libertação da hormona de crescimento ou análogo da hormona de libertação da hormona de crescimento na presença de um antibiótico formador de poros. 86 465 ΕΡ Ο 576 988/ΡΤ 2/2
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido antibiótico é a alametacina, presente em cerca de 0,05 mg/ml. Lisboa, Por THE UNIVERSITY OF VIRGÍNIA PATENT FOUNDATION O AGENTE OFICIAL - O ADJUNTO

   Eng." ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Âg. Of. Pr. Ind. 1200-195 LISBOA