KR100329729B1 - 성장호르몬방출호르몬수용체의분리및특성화 - Google Patents
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Abstract
요오드화 GHRH 표지자를 사용하는 독특한 결합 검정법을 사용하여 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH) 수용체 결합을 특성화했다. 광친화성 GHRH 표지자는 수용체의 광라벨링 및 특성화를 위해 구성했다.
게다가, 고 친화성 비오틴화 GHRH 동족체를 구성했다. GHRH-R/GHRH 복합체의 용도 및 온화한 세정액, 이어서 친화 크로마토그래픽를 사용하는 특이적으로 결합된 GHRH의 추출은 실질적으로 정제된 GHRH-R 분리물을 산출했다. GHRH-R 분리물의 전기영동 처리는 수용체의 서열화를 수행하기에 충분한 순도의 GHRH-R을 생성한다.
Description
본 발명은 호르몬 수용체의 분리 및 특성 결정에 관한 것이며, 보다 상세하게는 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체의 정제 및 특성 결정에 유용한 방법 및 조성 물, 그리고 정제된 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체의 분리에 관한 것이다.
성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH)은 시상하부에서 분비되어, 뇌하수체 전엽으로부터의 성장 호르몬(GH)의 방출을 자극한다. GHRH는 글루카곤, 세크레틴, VIP(혈관작용 장내 펩티드), PHI(펩티드 히스티딘 이소루신), PACAP(뇌하수체의 아데닐레이트 시클라제 자극 펩티드), GIP(위 억제 펩티드) 및 헬로더민을 포함하는 동종 펩티드족의 하나이다. GHRH는 많은 연구의 주제가 되어왔으나, GHRH가 GH의 방출유발을 위해 뇌하수체 전엽에서 결합하는 GHRH 수용체, GHRH-R에 관해서는 거의 알려지지 않고 있다.
클로닝된 GHRH 수용체의 대규모 생산으로 다수의 GHRH 동족체의 스크리닝이가능해질 것이고, 성장장애의 임상치료에 있어 개선된 작용물질 및 길항질의 개발이 촉진될 수 있을 것이다. 보다 구체적으로, GHRH 활성에 관한 다수의 동족체 및 생체이물질의 스크리닝은 성장호르몬 결핍아동의 임상치료에서, 및 영양을 개선하고 신체 조성(근육 대 지방)을 변경하는 성인의 임상 치료에서 사용하기 위한 개선된 작용물질의 개발을 유도할 수 있다. 아마도 수용체 구조를 기초로 한 컴퓨터모델링에 의해 보조되어진 상기 스크리닝은 또한, 예컨대, 높은 수율의 우유 생산 및 높은 수율의 기름기 없는 가축의 개발을 위한, 의학 및 수의학 실습에서 특히 유용하게 이용될 구강 활성 비펩티드(non-peptide) GHRH 작용물질을 얻을 수 있게 한다.
GHRH-R과 상호 작용하는 약품의 상업적 이용을 위해서는 정제된 형태의 GHRH-R 공급원 및 적합한 결합 분석법이 요구될 것이다.
GHRH 수용체의 분리 및 클로닝, 및 그의 시험관 내(in vitro) 발현을 통해 하기의 것들을 달성할 것이다:
(1) 신체 전체에 분포된 GHRH 수용체의 분포도를 제작하는 현장 혼성체화 연구 및 뇌하수체 외부에서의 잠재적인 생리학적 역할의 조사; 이것은 펩티드가 집중되어 있는 것으로 여겨지는 뇌, 생식선, 췌장, 태반 및 장에서의 GHRH의 잠재적인 역할을 밝힐 수 있다.
(2) 구조/기능 관계 및 특수 제조된 작용물질/길항질 분자에 관한 탐색에서 이차 전달자 상호작용을 조사하기 위해 돌연변이 또는 키메릭 수용체를 포함하는 수용체 구조의 연구. (3) 다른 G-단백질 결합 수용체, 특히 글루카곤, 세크레틴/VIP 족의 것에 대한 GHRH-R의 진화관계의 이해, (4) 서열 유사성을 갖는 것으로 예상되는 상기 아족의 다른 구성원들의 클로닝.
다음과 같은 기능성 수용체 클론을 얻기 위한 몇몇 대체 경로가 있다:
A. 부분적인 단백질 서열을 얻기 위한 수용체 단백질의 정제; 그 다음 이 부분적인 단백질 서열은 대응 누클레오티드 서열을 갖는 적당한 DNA의 스크리닝에 사용할 수 있다.
B. GHRH 수용체에 관련된 것으로 여겨지는 공지의 수용체와 유사한 서열을 갖는 DNA 스크리닝.
C. 단백질로 발현될 때, GHRH 결합 생물학적 활성에 의해, 또는 GHRH 수용체 항체에 의해 검출되는 GHRH 수용체를 생산하는 DNA의 스크리닝, 생각할 수 있는 임의의 클로닝 방법은 GHRH 수용체를 확인하고 발현된 클론의 특성을 결정하기 위해서 GHRH 및 관련된 펩티드에 의한 기능 분석 뿐 아니라 결합 분석을 필요로 하는데 유의하여야 한다.
이에 따라, GHRH 결합 분석 및 GHRH 수용체의 특성을 결정하고 분리하는데 도움이 될 기기에 사용하기 위한 조성물이 요구된다. 상세하게는, 수용체(GHRH-R)-리간드(GHRH 또는 GHRH 동족체) 복합체의 크기, 글리코실화, 용해도 및 안정성 면에서 뇌하수체 GHRH 수용체의 특성을 결정할 수 있는 방법이 요구되는데 상기 방법으로서 수용체 단백질을 정제하고 수용체 클론을 확인할 수 있는 방법이 개발될 수 있다. 또한 정제되거나 부분적으로 정제된 GHRH-R 및 이를 얻는 방법이 요구된다. 부분적으로 정제된 GHRH-R은, 대부분의 뇌하수체 전엽세포의 유기 세포 간질로부터 분리된 GHRH-R을 갖는 GHRH-R 분리물이 형성됨을 의미한다. GHRH-R 분리물은 GHRH-R 서열을 결정하기에 충분한 순도를 가지며, 이것은 G 단백질과 같이, 서열화를 방해할 임의의 남아있는 화합물을 제거하기 위해 부가의 정제를 필요로 할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 추출 및 분리 방법을 사용하여 얻어진, 본 발명의 GHRH-R 분리물은 바람직하게 GHRH-R이 본래 뇌하수체 전엽에 존재하는 농도보다 큰 농도로 GHRH-R을 함유하며, GHRH-R 분리물은, 필요하면, SDS-PAGE 를 이용한 부가적 정제를 통해 GHRH-R의 서열화를 방해할 임의의 화합물을 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 서열화를 수행하거나, GHRH-R 결합 활성의 생체분석에서 사용하기에 충분한 순도의 GHRH-R 생산을 포함한다.
GHRH는 매우 높은 비특이적 결합을 가지며(이는 GHRH 또는 GHRH 동족체가 GHRH-R에 특이적으로 결합하고 있는지를 결정하기 어렵게 함), GHRH-R은 극히 소량으로 존재하므로, 역사적으로 GHRH-R은 연구하기가 어려웠다. 유리 및 플라스틱 용기에 GHRH 동족체의 비특이적 결합은 수용체 결합연구의 정확성 및 재현성을 제한하는 이전의 연구에서의 주된 문제점이었다. 음으로 하전된 GHRH 펩티드의 "점착"성 때문에, 단순한 여과형의 결합 분석방법의 이용은 불가능했다. 비특이적 총계는 특이적 결합의 탐지를 불가능하게 하도록 높다. 또한, 유리섬유 필터 상에 단백질의 비특이적 결합을 봉쇄하기 위해 사용되는, 통상적으로 사용되는 봉쇄제폴리에틸렌이민은 양으로 하전되어, GHRH 동족체(음으로 하전됨)에 비특이적으로 결합할 것이다. 또한, GHRH-R의 정제의 어려움을 크게 증대시킬 수 있으므로, 고도의 결합 친화성을 갖는 가용성 수용체 조제물은 이용 불가능했다.
종래의 연구는 GHRH 및 관련된 펩티드 같은 표지자에 관한 친화성, 및 G-단백질에 대한 결합성으로 GHRH 수용체의 특성을 결정했다. 또한, 비특이적 화학 가 교제를 사용하여 GHRH 수용체에 라벨링하려는 시도가 있었다. 참조, 예컨대, Zysk일동, "뇌하수체 전엽 세포에서 성장 호르몬 방출 인자-결합 단백질의 가교", J.Biol. Chem., 261:1678(986), 및 Velicelebi 일동, "뇌하수체 수용체에 대한 성장 호르몬-방출 인자의 공유 가교", Endocrinology, 118:1278 (1986). 이들 두 연구의 결과는 뇌하수체 전엽에 각각, 26 KDa 및 70 KDa GHRH-수용체가 존재함을 시사한다. 이들 두 연구에서 밝혀진 분자량간의 불일치는 GHRH-R의 분리 및 특성결정에 관련된 어려움, 및 GHSH-R의 분리 및 특성결정에 유용한 개선된 방법 및 조성 물이 필요함을 강하게 시사하고 있다.
쥐의 뇌하수체 전엽에 대한 GHRH 결합은 GTP의 영향을 받는 것으로 생각되며, 이는 GHRH-수용체의 GHRH에 대한 친화성 감소의 원인이 된다(GTP는 G 단백질 GHRH-수용체 복합체가 분리되게 한다). GHRH에 결합된 GHRH-R의 높은 친화성을 띤 상태는 구아닌 누클레오티드 조절 단백질과의 상호작용에 의해 안정되어 호르몬-수용체-G-단백질 3원 복합체를 형성한다고 여겨진다. GTP는 G-단백질-수용체 상호작용을 불안정하게 하여 GHRH/GHRH-R-G-단백질 복합체를 분리시키고 독립 수용체를 낮은 친화 상태로 전환시키는 것으로 가정되는데, 유리된 G-단백질은 그의 각각의2차 전달자 시스템을 활성화시킨다. 참조. Struthers, 일동, "쥐의 뇌하수체 수용체에 대한 성장호르몬-방출 인자 결합의 누클레오티드 조절", Endocrinology,
124:24-29 (1989).
양 및 소의 뇌하수체 전엽 조직에서, GHRH 및 그의 동족체는 VIP 또는 PACAP보다 500 내지 1,000 배 낮은 농도의 GHRHa에 의해 대체됨이 발견되었다. 이 발견은 GTP 존재 하에서 아데닐레이트 시클라제를 자극하는 능력이 세크레틴>헬로더민>PHI≥VIP>GHRH (1-27) NH2의 순서를 나타내는 사람 췌장(세크레틴 및 VIP 수용체의 공급원)에서 확인된 결합 성질에 보완적이다. 유사하게,125I-세크레틴을 사용하면, 얻어지는 Kd는 세크레틴 0.8nM, 헬로더민 200 nM, PHI 250 nM이었다. VIP 및 GHRH(1-29)-NH2는 10 μM에서 단지 20% 억제를 유도한다.
생리학적 투약량 이상에서, GHRH는 VIP 수용체에 작용하는 것으로 알려졌고,역으로 VIP는 약한 GHRH 작용물질이다.
호르몬 수용체의 분리 및 특성결정에 관한 배경 정보를 제공하는 다른 문헌에는 다음과 같은 것들이 있다: Christophe 일동, "VIP/PHI/세크레틴-헬로더민/헬로스펙틴/GRH 족: 천연 펩티드, 그들의 전구체 및 수용체에 관해 생체 외에서 시험된 바의 합성 동족체의 구조-기능관계 및 조직 막의 패널에서의 아데닐레이트 시클라제", 프로호르몬으로서 펩티드 호르몬: 가공처리, 생물학적 활성, 약학, 편집자 Jean Martinez, Pub. Ellis Horwood Lim. 1989, Chichester, England. Baburthe 일동, "혈관작용 장내 펩티드 수용체의 분자분석: VIP 관련 펩티드에 관한 수용체와의 비교", Ann NY Acad, Sci., 527:296-313 (1989). Frohm 일동, "성장호르몬-방출호르몬", Endocr Rev., 7:223-253 (1986). Seifert 일동, "쥐의 뇌하수체 전엽 막 파쇄액에서 성장호르몬-방출인자 결합 부위: 글루코코르티코이드에 의한 조정", Endocrinology, 117:424-426 (1985). Bilezikjian 일동, "성장 호르몬-방출인자(GRF)에 대한 탈감화는 GRF 결합 부위의 하향 조절과 관련된다."Endocrinology, 118:2045-2052 (1986). Ishihars 일동, "혈관작용 장내 폴리펩티드에 관한 신규의 수용체의 기능 발현 및 조직분포", Neuron, 8:811-819 (1992). Ishihara 일동, "세크레틴 수용체를 암호하는 cDNA의 분자 클로닝 및 발현", EMBO J, 10:1635-1641 (1991). Lin 일동, "아데닐레이트 시클라제 결합된 칼시토닌 수용체의 발현 클로닝", Science, 254:1022-1024 (1991). Juppner 일동, "부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬-관련 펩티드에 관한 G 단백질-결합 수용체", Science, 254:1024-1026 (1991). Frohman 일동, "형질전환 쥐에서 사람 성장 호르몬-방출인자의 조직분포 및 분자의 이중성", Endocrinology, 127:2149-2156 (1990). Paul 일동, "폐로부터의 용해된 혈관작용 장내 펩티드에 관한 수용체의 특성결정", J. Biol. chem., 262:158-162 (1987). Guijarro 일동. "쥐의 간으로부터의 혈관작용 장내 펩티드에 관한 활성이 있는 안정한 수용체의 용해화", Requlatory Peptides, 25:37-50 (1989). Cronin 일동, "사람 종양에 의해 분비된 성장 호르몬 방출인자의 생물학적 활성", Am. J. Physiol., 244 (Endocrinol Metab) E346-E353 (1983). Leong 일동, "배양된 남성 및 여성의 뇌하수체 세포에서락토트로프 및 소마토트로프의 계산: 맘모소마토트로프 부분 모집단을 지지하는 증거", Endocrinology, 116:1371-1378 (1985) Munson 일동, "리간드: 리간드-결합 시스템의 특성결정을 위한 다방면의 컴퓨터화 방법", Anal. Biochem., 107:220-239 (1980). Wessel 일동, "세제 및 지질 존재하에 묽은 용액에서 단백질의 정량적 회수방법", Anal. biochem., 138:141-143 (1984), Bagnato 일동, "배양된 과립세포에서 성장 호르몬 방출 인자에 관한 수용체의 성선 자극 호르몬-유발 발현", Endocrinology, 128, 2889-2894 (1991)(Bagnato 일동에 의해 연구된 조성물은 뇌하수체 조직의 결합성질과 다른 GHRH 결합성질을 나타낸다).
상기 연구들은 GHRH-R의 행동에 관한 예비적 이해를 개발하는데 도움이 되었지만, GHRH-R에 관한 민감하고 재현가능한 분석법이 여전히 요구되며, 이는 GHRH-R의 정제 및 클로닝에 이르는 GHRH-R의 부가적인 특성결정을 가능하게 할 것이다. 상기 분석방법은 GHRH 및 GHRH 동족체의 비특이적 결합, 및 GHRH 수용체가 소량이라는 문제를 극복해야 한다. 결과적인 높은 특이적 활성을 갖는 GHRH 동족체의 요오드화 및 정제를 통해 조 뇌하수체 전엽막에 대한 특이적 결합의 개선이 가능하게된다.
그러므로 GHRH 결합에 대해 민감하고 재현가능한 분석방법을 개발하는 것이 본 발명의 일차 목적이다.
GHRH 수용체를 특이적으로 및 명백하게 라벨링하는 시약을 개발하는 것이 본 발명의 부가의 목적이다.
GHRH-수용체 정제 계획을 개발하고 GHRH-R 의 적어도 부분적 서열화를 가능케할 충분한 순도의, 또는 순도로 쉽게 정제될 수 있는 GHRH-R 분리물을 얻는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.
따라서, 정제된 GHRH-R을 생성하는 것이 본 발명의 부가의 목적이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적은 조 GHRH-R 추출물(분리물)의 특성화 및 분리에 이르는 개선된 GHRH 결합 분석방법을 통하여 수행된다. GHRH-R은 GHRH 동족체로부터 형성된 방사성-요오드화 표지자를 사용함으로써 특성화된다. 바람직한 실시양태에서 GHRH 동족체(GHRHa또는 GHRHb) 및 그외 동족체를 고체상 요오드비이드를 사용하여 요오드화하고, 실질적으로 캐리어가 없도록 하기 위해 역상 HPLC에 의해 일요오드화 물질을 정제한다. 운반 및 희석중 이루어지는 유리 및 플라스틱 제품에의 GHRH 동족체의 비특이 결합은 유기용매를 사용하여 실질적으로 제거했다. 바람직한 실시양태에서, GHRH 동족체의 희석 및 운반을 위해 50% 아세토니트릴을 사용한다. 세공-형성 항생제를 첨가하여 조 뇌하수체 전엽 막펠릿에 대한 GHRH 및 GHRHa의 특이적 결합을 증가시킨다. 바람직한 실시양태에서, 항생제 아라메티신(대략 0.05㎎/㎖)을 균질한 뇌하수체 전엽 막펠릿과 혼합하여 GHRH의 특이적 결합을 증가시킨다.
GHRH-수용체에로의 특이적이고 높은 친화도의, GTP 감수성, 가교를 나타내는, UV 감수성 가교 그룹(광표지자 또는 광친화성표지자)를 함유하는 GHRH 동족체를 제조했다. 표지자는 감광성 기의 위치 및 스페이서 아암의 길이 모두에서 다양하다. 바람직한 광표지자는 GHRH 동족체 [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2를 N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NOS)에로, 또는 설포닐숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트(설포-SANPAH 또는 SANPAH)에로 커플링시키고, 이어서 요오드화하고 정제하여 형성한다. 바람직하게, 시약 ANB-NOS에로의 커플링은 12 또는 21 위치의 리신을 표적으로 하여 이루어지며; 이 화합물을 이어서 10 위치의 티로신 상에서 요오드화하고 역상 HPLC에 의해 생성물을 정제하여125I-GHRHa-ANB-NOS 로 언급되는 광표지자를 형성한다. 다른 실시양태에서, 광표지자125I-GHRHa-SANPAH는 디메틸포름아미드 용매계에서 표적 SANPAH를 GHRHa의 N-말단 히스티딘에로 커플링하고, 역상 HPLC에 의해 정제하고, GHRHa의 10위치의 티로신을 요오드화하고 HPLC 에 의해 재정제하여 형성한다.
놀랍게도, 상기 언급된 광친화성 표지자의 이용에 의해, GHRH-R에 결합된 GHRHa의 가용성 복합체 생성이 가능하고; 이 공유 가교결합 복합체가, 바람직하게 3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸-암모니오]-1-프로판 설포네이트(캘리포니아주 얼빈시의 ICN 바이오케미컬즈로부터 또는 피엘스로부터 구입가능, 이하 CHAPS로 약칭함)와 같은, 단백질을 용해할 수 있는 쯔비터이온성 세정제 화합물을 함유하는 온화한 세정제에 용이하게 용해되고, 대부분의 비-특이적으로 가교결합된 오염물은 온화한 세정액에서 용해되지 않음을 확인했다. 다음 또한 비-가교 복합체가 상기 조건하에서 용해됨을 발견했다. 용해 후에 광가교결합을 수행하고 수용체(GHRH-R) 및 리간드(GHRH-표지자)가 안정한 가용성 복합체를 형성함을 확인했다.
바람직한 실시양태에서, 이는 CHAPS 함유 용액으로 추출하고 목탄/덱스트란으로 자유 펩티드를 제거하여 비-특이적으로 결합된 GHRH의 약 90% 까지 제거할 수 있다. 이는 크게 개선된 GHRH 결합 분석 방법을 제공한다.
부가적인 실시양태에서, 부분적으로 정제된 GHRH 분리물은 GHRH 또는 GHRH 동족체에 대한 관능의 부착에 의한 친화 크로마토그래피를 통하여 얻고, 이는 지지 체상에 고정된 화합물에 대한 친화성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서는, GHRHa의 비오티닐화된 유도체를 GHRH-R에 결합시키고, 용해시킨 다음 스트렙타비딘 컬럼 상에 고정시키며; 결합된 GHRH/GHRH-R 복합체는 pH 5.0의 완충액에서 해리되어 부분적으로 정제된 GHRH-R 분리물을 형성하고, 이를 사용하여 GHRH-R의 아미노산 잔기를 결정할 수 있고, 이는 바람직한 실시양태에서, SDS-PAGE를 사용하여 GHRH-R을 부가적으로 정제하여 서열화를 방해하는 G-단백질같은 화합물을 제거한 후에 발생하고, 이로써 정제된 GHRH-R을 형성함을 발견했다.
제 1 도는 양의 조 뇌하수체 막펠릿에 대한125I-GHRHa의 결합을 나타내는 막대 그래프이다. 막대는 표지자 단독으로 또는 10nM GHRHa또는 50 μM CTPγS의 존재하에 항온처리한 후에 펠릿에 대해 결합된 총 계수의 구획을 나타낸다. 네 개의 상이한 경우(막대의 세트)가 제시된다. 첫 번째 경우(막)는 막 펠릿 제재에 대한 결합을 보인다. 두 번째 세트(동결)는 그것을 동결하고 해동한 후에 동일한 막 제재에서 거의 특이적 결합이 없음을 보인다. 세 번째 세트(DTT)는 1 mM DTT 의 존재를 제외하고 상기와 동일한 제재(동결안함)에 대한 결합을 나타낸다. 네 번째 세트(ala-세척)는 세공 형성 항생제 알라메티신 및 부가적인 세척 단계를 포함하는본 발명의 개선된 프로토콜을 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타내고 매 점마다 N=3 또는 4번 반복한다.
제 2 도는 포화 결합분석을 위해 사용된 그래프이다. 점들은 증가하는 함량의 라벨링하지 아니한 GHRHa의 존재 하에 수행된 결합 분석 결과의 자료이다. 오차막대는 평균의 표준오차를 나타낸다. 삽입물은 Scatchard 조정 시스템에서 동일자료 및 곡선의 플롯을 나타낸다(오차 막대는 삽입물 상에는 제시안됨).
제 3 도는 수용체의 광친화성 가교를 나타내는 SDS 겔의 방사선 사진이다.
조 양 뇌하수체 막에 대한 가교를 두 개의 서로 다른 방법(SDS 및 CHAPS)으로 각각 추출한 두 개의 상이한 광표지자(SANPAH 및 ANS-NOS)를 이용하여 증명한다. 또한 각 경우에서의 탈글리코실화 효소의 효과도 제시한다. CHAPS 추출물은 크게 감소된 비특이적 결합을 나타낸다. 두 개의 광표지자는 함께 탈글리코실화시 45 kDa로 이동하는 55 kDa 밴드를 라벨링한다.
제 7 도에서 세제 용해성 구획은 추출 후 UV 가교된 것이다. 맨 왼쪽 두 개의 레인은 추출된 CHAPS이고 오른쪽상의 두 개의 레인은 추출된 데옥시콜레이트이
다.
제 9 도에서 그외의 자료는 pH 5 이하에서 거의 완전한 해리가 얻어짐을 보
인다.
GHRH-수용체의 클로닝에 대해 전체적으로 개괄하면, (1) GHRH-수용체의 특성을 결정하고, (2) GHRH-수용체의 특징에 대한 지식을 사용하여 GHRH-수용체를 분리하고, (3) GHRH-수용체(또는 GHRH-수용체의 일부)의 펩티드 서열을 결정하고, (4) cDNA-라이브러리를 스크리닝하기 위해 변성된 올리고누클레오티드 서열을 사용함으로써 GHRH-수용체에 대한 DNA 서열을 결정하고, 및 (5) DNA 서열을 클로닝하는 것을 포함한다.
GHRH-R의 특성화
GHRH-결합 분석법
일면에서, 본 발명은 가역 고 친화성 GHRH-특이성, GTP-의존성 결합을 나타내는, GHRH 수용체에의 GHRH 결합에 대한 민감하고 재현가능한 분석 방법에 관한 것이다. 음성으로 하전된 GHRH 펩티드의 비특이 결합 때문에, 보다 단순한 여과형 결합 분석방법의 사용이 불가능하다. 본 발명의 분석 방법으로, 특이적 결합(10 nM GHRHa에 의해 균질화된 막 펠릿으로부터 제거된125I-GHRHa결합에 의해 생산된 감마, γ, 방사선의 계수로서 정의됨)은 조 막펠릿 내 결합된 총 계수의 30-50% 및 순환 세정제(예컨대, CEAPS)로 추출하고 목탄/덱스트란 처리한 후에는 총 계수의 90%에 이른다. 본 발명의 결합 분석 방법의 바람직한 실시양태는 부드러운 고체-상 요오드화 프로토콜, 캐리어 없는 방사성리간드의 HPLC 정제, GHRHa의 정량적 운반을 위한 유기용매 시스템, 표지자의 생물학적 활성을 확증하기 위한 평판된 세포 및 가역성 용혈 혈소판 검정 모두, 및 뇌하수체 전엽 막 펠릿에 결합하는 특이적 방사성리간드를 증가시키기 위한 세공 형성 항생제, 알라메티신 약 0.05㎎/㎖의 사용을 포함하는 많은 요인을 포함한다. 알라메티신은 특이 결합을 증가시키고, 및 잡힌계수를 감소시킨다. 세척으로 회수된 계수가 감소되나, 특이적 결합의 상대량은 한층 더 개선된다.
수용체 결합 연구에 바람직한 GHRHa동족체는 [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2(이하 GHRHa로 약칭함)이다. GHRH 동족체는 우수한 GHRH-R 결합 활성을 가지고, 길이에 있어서 인간 서열과 다르며 두 아미노산을 가지는 펩티드이고, 이는 요오드화 지지체로서의 용도를 쉽게 하기 위해 변형된다. GHRHa의 바람직한 공급원은 Peninsula Laboratories(Belmont, CA)이다.
최적의 특이 활성 및 생물학적 활성을 가진 요오드화 GHRH 동족체의 제조는 고체상 요오드 비드(Pierce로부터 구입 가능한 것과 같은)를 사용하여 첫 번째 요오드화 GHRH 동족체(광표지자를 포함)에 의해 수행되고 나서, 단요오드화 물질은 바람직하게 플루오로탄소 기재 Bio-Series Poly F 컬럼(MacMod로부터 구입가능)을 사용하여, 역상 HPLC에 의해 본질적으로 캐리어없이 정제된다. GHRH 동족체의 정량적 희석 및 운반은 유기 용매를 사용하여 얻어지고, 바람직하게 수용액내 50% 아 세토니트릴이 캐리어로서 사용된다. 이 방법에서, 수성 비히클에 대한 부정확하고 재생불가능한 희석이 회피된다.
놀랍게도, 세공-형성 항생제가 조 뇌하수체 전엽 막펠릿과 결합될 때, 선행방법론과 비교하여, 특이적 결합이 약 3배 증가된다(Struthers 일행, Endocrinology, 124:24, 1989). 바람직한 실시양태에서, 항생제 알라메티신 약 50㎍/㎖의 첨가는 최적의 특이적 결합을 얻는데 이용된다.
제 1 도를 참고로, 다른 조건하에 처리된 조 막 펠릿에 대한125I-GHRHa표지자의 결합이 제공된다. 3개의 막대로 된 4세트가 있다. 하나의 세트내 각 막대는 요오드화된 표지자와 인큐베이션한 후 결합된 총 계수의 구획을 나타낸다. 각 세트의 세 막대에 대해, 왼쪽 막대는 냉각된 GHRH, 또는 GHRHa와 경쟁하거나, GHRHa의 결합을 방해하는 것으로 알려진 또 다른 화합물에 막을 예비 노출하지 아니하고, 요오드화된 표지자와만 인큐베이션한 후에 결합된 총 계수를 나타낸다. 중앙막대는 상기 인큐베이션에 10 nM의 라벨링 없는 GHRHa(특이 결합 자리에 대해 경쟁한다)와 함께 첨가되어 요오드화된 표지자와 인큐베이션한 후 결합된 총 계수의 구획을 가리킨다. 각 세트의 막대의 가장 왼쪽 및 중간 막대 간의 차이로부터 GHRH-R의 존재량을 나타내는 GHRH의 특이적 결합을 알 수 있다. 오른쪽 막대는 50 μM의 GTPγS의 존재하에125I-표지자와 인큐베이션한 후 결합된 총 계수의 구획을 나타낸다. GTPγS는 낮은 친화성 및 감소된 결합을 초래하는 몇몇 수용체 복합체로부터 G-단백질의 해리를 유발하는 것으로 알려져 있으므로, GTPγS를 사용할 때 특이적 결합의 감소는 GHRH-R-G-단백질 복합체의 존재함과 양립하는 것이다.
특이 결합은 20 pM 요오드화 동족체 단독으로 보여지는 결합 및 10 nM 비요 오드화 GHRHa의 존재하에 동족체의 결합에 있어서의 차이로서 정의된다. 포화 결합, Scatcherd 분석; 경쟁 연구, 및 여기서 논의되는 다른 자료에 따르면 이들 고친화성 자리가 특이 결합 자리인 것으로 여겨진다.
제 2 도를 참고로, 포화 결합 연구는 약 160 pM의 Kd를 가진 단일 고 친화성자리에의 GHRH 동족체인 [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2(GHRHa)이 결합함을 보여준다. 몇몇 오차 막대는 너무 작아서 보이지 않는다(N=포인트당 6번 반복함). 이 자료는 컴퓨터 프로그램 리간드로 분석하였는데, 이에 따르면 비변형된 배위 시스템에서 리간드 결합식에 통계학적으로 측정된 최소 제곱법을 기초로 결합 상수를 결정한다. 이 프로그램은 Kd= 150 ±10 pM 및 R = 1.5 ±0.09 p몰/gm 조직을 가진 단일 결합 자리를 보고한다(가장 적당한 최소 제곱치=최소 제곱치의 약 SEM) 통계학적 테스트는 이 단일 결합 자리 모델을 뒷받침한다. 점선은 결합식에서 이들 상수를 사용하여 생성된 이론적 곡선이다.
GHRHa방사성리간드의 특이 결합은 50 μM의 GTPγS에 의해 65% 이하까지 감소된다. 관련된 펩티드 VIP 및 PACAP 는 100 n 몰 농도에서는 상기 결합에 대해 경쟁하지 않았다. 이 결합은 고 친화성 G-단백질이 결합된 GHRH-R을 나타낸다.
VIP 수용체에 대한 VIP 결합이 설프히드릴 환원제에 민감하다는 것이 알려져 있다.
GHRH 분석 방법에 있어서 상기 특이 결합은 1mM 디티오트레이톨(DTT, 관련된 수용체에 대한 고 친화성 결합을 막는 것으로 공지됨)로 예비 인큐베이션함으로써 완전히 제거되어, GHRH-R 수용체가 결합자리라는 결론을 한층 더 뒷받침하고 있다.
광친화성 표지자
광친화성 표지자를 광반응성 교차결합제를 사용하여 제조했다; 이들 표지자들은 광민감성 그룹의 위치 및 스페이서 아암의 길이 모두에 있어서 차이가 있다.
상기 표지자는 UV 방사선의 부재하에 GHRH-R에 대한 결합 및 UV 방사선의 영향하에 GHRH-R에 대한 교차결합이 가능하다. 광친화성 표지자의 바람직한 비제한성 실시예 및 그의 제조 방법은 하기와 같다:
1)125I-GHRHa-ANB-NOS
32개 아미노산 GHRH 동족체 [His', Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2(GHRHa)와 리신 12 또는 21에서 표적시킨 약제 N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NOS)를 커플링시켜 GHRHa-ANB-NOS를 형성했다. GHRHa-ANB-NOS를 요오드비드를 사용하여 요오드화시켜 상기 방사성리간드{"광표지자"125I-GHRHa-ANB-NOS ("뜨거운 GHRHa-ANB-NOS" 또는 "뜨거운 광표지자")}를 형성했다(바람직한 요오드 비드는 Pierce, Rockford, IL로부터 구입가능).
2) 1-GHRHa-SANPAH
디메틸포름아미드 용매 시스템에서, N-5-아지도-2-니트로-벤조일옥시숙신이미드(ANB-NOS)에 대한 GHRH 동족체인 [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2를, GHRHa의 N-말단 히스티딘에서 표적시키는 설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트 (설포-SANPAH 또는 SANPAH)에 커플링시켰다. 그리고 나서, 낮은 구 배의 아세토니트릴을 사용하여 플루오로탄소 기재 Bio Series Poly F 컬럼(Mac-Mod Analyticsl, Chadds Ford, PA 로부터 구입가능)상에서 역상 HPLC에 의해 필수적으로 출발 펩티드 없이 방사성 요오드화 물질을 정제했다.
양 뇌하수체 막 펠릿에서의 광표지자 결합을 γ-계수에 의해 결정하고, UV에의해 유발된 교차 결합을 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE) 겔의 방사선 자동 사진법에 의해 시험했다.125I-GHRHa-ANB-NOS 표지자는 약 1 nM(GHRHa에 대해 약 160 pM에 해당)의 친화성으로 결합했다. SDS-PAGE는 양 뇌하수체에 있어 약 55 kDa에서(소 뇌하수체에서는 57 kDa) 밴드를 나타내는데 이것은 10 nM GHRHa의 존재 하에 완전히 제거되었으며; 이 밴드는 50 μM GTPγS에 의해 약 50% 이상 감소되었고, 100 nM VIP에 의해서는 영향받지 않았다. 그러므로, 55 kDa 밴드는 GHRH-R의 광교차결합으로 인해 형성된다. 제 3 도는 이러한 특정 55 kDa 밴드가 CHAPS 추출에 의해 가장 비특이적으로 교차 결합된 물질로부터 분리됨을 보여주고 있다. 제 4 도는 10 nM GHRHa와 경쟁함을 보여주고 있다. 제 5도는 교차결합에 대한 GTPγS의 효과를 나타내고 있다.
교차결합 GHRH-수용체를 뉴라미니다제로 처리하면 55 kDa 밴드가 50 kDa 밴드로 이동되며, 이는 겔내에서 이동을 감소시키는 하전된 말단 시알산기가 제거됨에 따른 것이다(재 5 도). 엔도글리코시다제 F 및 N-글리코시다제 F(Boehringer Mannheim of Indianapolis, Indiana로부터 구입가능)의 정제된 프로테아제 없는 혼합물로 교차결합 GHRH-수용체를 처리하면 겔내 이동성에 있어 변화가 생겨 45 kDa에서 밴드를 형성하고(제 3 도 및 제 4 도), 이는 GHRH-수용체가 N-연결된 글리코단백질(G-단백질-연결된 수용체 중 일반적)이고, 탈글리코실화 단백질 사슬의 크기를 시사한다. 상기 크기는 VIP 및 세크레틴 수용체의 구조에 대응된다.
고정된 렉틴으로 테스트하는 경우 맥아 응집소, 리신, Limulus 응집소, 또는 콘카나발린 A에 교차결합 GHRH-수용체가 결합하지 않음을 보여주었다. 이는 수용체를 특이하게 하여, 이들 렉틴에 결합하는 다른 수용체로부터 본 발명의 수용체를 정제 및 분리할 수 있게 한다. 뉴라미니다제 및 β-갈락토시다제 처리에 따라, 수용체는 피넛 응집소에 특이하게 결합하고, GHRH 수용체의 분리 및 정제에 대한 부가의 접근을 제공한다.
가용성 GHRH-GHRH-R 복합체 및 개선된 결합 분석
광친화성 가교는 공유적으로 커플링된 수용체-리간드 복합체가 온화한 세제용액, 바람직하게 CHAPS를 함유한 용액에서 가용성임을 제시한다. 전술한 막 결합분석의 조건 하에서, 상기 수용체와 GHRH를 예비 인큐베이션하면, 가교되지 않았을 때 조차 그대로의 수용체-리간드 복합체의 CHAPS 추출 및 가용화가 가능하였다. 가교 없이125I-GHRHa("뜨거운" GHRHa)로 인큐베이션한 막을 세제 추출한 후 감마계수에 의해 상기 복합체를 검출하였다.
제 6 도는 조막에서 보여진 특이 계수의 대부분은 수용체와 관련된 특이적 복합체로서 추출된 CHAPS 였음을 제시한다. 제 6 도에 관한 자료를 하기와 같이 얻었다. 방사성요오드화 GHRHa를 10 nM 라벨링되지 아니한 GHRHa의 존재 또는 부재 하에서 양의 조 뇌하수체 막에 결합시켰다. 다음 세제추출 및 원심분리를 수행하였다 : 그런 다음 상층액을 목탄/덱스트란으로 처리하여 유리된 GHRHa로부터 결합된 단백질을 분리시키고, 각 분획내의 방사성요오드를 계수하였다. 이에 따라, 조 막에 결합된 라벨링된 GHRHa를 세제 처리할 수 있고, (1) 불용성, (2) 가용성 및 비 특이 결합, (3) 특이 결합이지만 세제 해리되지 않은, 또는 (4) 가용성 및 특이 결합에 의해 특징화 할 수 있다. 광가교로부터 알려진 바와 같이, 대부분의 비특이 결합 계수는 CHAPS 가용성이 아니었다. 데옥시클레이트 혼합 세제로 추출한 경우 약간 더 많은 총 계수를 가용화시켰지만, 이 중 많은 것들이 불안정하였고 해리되었으며, 비특이 계수가 우세하였다.
제 7 도는 상기 복합체가 수용체를 함유하였음을 뒷받침하는 상기 광가교의결과를 보여주고 있다. 막을 암실에서 광표지자(125I-ANB-NOS-GHRHa)와 예비결합시키고, CHAPS 추출한 다음, UV에 의해 교차결합시켰다. 상기는 GHRH가 여전히 가용화 수용체에 결합되어 있음을 입증하는 것이다. CHAPS 추출에서, 대부분의 결합은 55 kD 수용체 밴드에 있는 반면, 데옥시콜레이트 경우 대부분의 밴드는 비특이성이었다. 상기는 제 6 도에 나타낸 결합 연구와 잘 조화되고(비록 광표지자는 보다 높은광특이 결합을 갖지만), 가용성 복합체 내 GHRH 동족체의 특이적 결합은 55 kDa 수용체에 대한 것임을 증명한다. 제 6 도에 부합하여, 상기 복합체는 데옥시콜레이트보다 CHAPS에서 더욱 안정하였다. 또한 CHAPS 추출물의 광가교시 비특이 밴드가 거의 없었다(55 kDa 수용체 밴드 바로 아래에 하나의 밴드가 있다).
제 8 도는 (CHAPS 추출이 매우 감소된 비특이 계수 및 증가된 감수성을 지는개선된 결합 분석이 됨을 보여주고 있다(제 1 도와 비교). 또한 상기 도면은 복합체가 50 μM GTPγS에 의해 부분적으로 해리되어 G 단백질이 CHAPS를 함유하는 세제용액에 가용화된 복합체와 여전히 관련됨을 시사하고 있다. 제 1 도는 1 mM DTT가 첨가될 때 GHRH 앞의 특이 결합을 방해함을 보여주고 있다. 제 8 도는 예비결합이 일어난 후 20 mM DTT로부터의 부분적 영향만을 보여주고 있다. 상기 복합체는 또한 밤새 4℃, 1M NaCl에서 매우 안정적이었으나, 1% 트리톤 X-100(계면활성제)에 의해 완전히 해리되었다. 결합 검정을 위해 CHAPS 가용성, 목탄 덱스트란 처리된 시료를 사용할 때 얻어진 낮은 환경에 유의하여야 한다.
가용성 수용체-리간드 복합체의 pH 안정성을 제 9 도에 제시한다. 복합체에 있어서 pH 5.5 이하에선 불안정하고, pH 5.5 및 6 사이에선 안정적이며 결합 GHRH를 유리된 GHRH로 교환할 수 있으며, pH 7에서는 매우 안정하고 교환 불가능한 뚜렷한 전이가 나타난다. 상기 복합체의 안정성은 개선된 GHRH-R 결합 분석 방법, 및 새로운 수용체 정제 방법에 대한 기초를 제공한다.
GHRH-R 분리 및 정제
비오티닐화된 GHRH 동족체를, 고정 스트렙타비딘 상에 보유될 수 있는 수용체-리간드 복합체로서 GHRH 수용체를 정제할 목적으로 개발하였다. 시험된 제 1 동족체는 N-히드록시숙신이미드 시약 NHS-LC-비오틴(Pierce로부터 구입가능)을 사용하여 12 및/또는 21 위치의 리신에서 비오티닐화된 [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2(GHRHa)였다. 상기 동족체를 10 위치의 티로신에서 요오드화하고 HPLC 상에서 모노 및 디비오티닐화된 형태로 분해시켰다. 상기 생성물 중 90% 이상이 30분 내에 고정 스트렙타비딘에 결합되었다. 모노비오티닐화된 GHRHa는 GHRHa에 비해 2배 감소된 수용체 결합 친화성을 가진 반면 디비오티닐화된 GHRHa는 거의 활성이 없었다. 스트렙타비딘에 대한 수용체에 대한 결합을 방해하므로, 비오틴 그룹은 수용체의 결합 포켓 내에 있는 것으로 보여진다. 시험된 다음 동족체는 [His1, Nle27, Cys33]-GHRH-(1-33)-NH2이었다. 그것은 이량체화하는 강한 경향을 가지며 경쟁 결합분석에서 GHRHa를 치환할 수 있었던 종 중 어느 것도 비오티닐화되지 않았다.
의외로 [His1, Nle27, 비오틴-lys41]-GHRH-(1-41)-NH2(이하 GHRHb로 약칭함)은 GHRHa에 필적할 만한 친화성을 갖는 수용체와 결합함을 발견하였다(GHRHb를 제조하기 위한 바람직한 공급원은 캘리포니아주 센 오우제이시의 Nuros Corporation 임). 본 동족체가 수용체 정제시 사용될 수 있음을 증명하기 위해, 이를 요오드화 하고, 광감성 가교 그룹(ANB-NOS)을 혼입하였으며, 상기 화합물을 HPLC에 의해 정제하였다. 상기 요오드-비오티닐-광활성화 GHRH, 즉125I-GHRHb-ANB-NOS를 조 소 뇌하수체 막내 수용체에 결합시켰다. 수용체-리간드 복합체를 CHAPS 가용화하고, 유리된 GHRH를 제거하기 위해 목탄 덱스트란으로 스트리핑하였으며 고정 스트렙타비딘에 결합시켰다.
스트렙타비딘이 복합체에서 수용체를 빼냈는지를 조사하기 위해, 시료를 스트렙타비딘 결합 전후에 UV 가교를 유도하고, 방사선자동사진법에 의해 분석하였다. 상기는 결합에 이용할 수 있는 수용체의 상당한 분획(30%)이 스트렙타비딘비드 상에 보유될 수 있음을 보여주었다. 가용성 수용체-리간드 복합체 안정성(제 9도)에 대한 연구에서는 스트렙타비딘 비드의 고염(0.5 M NaCl) 세척에 이어서 낮은 pH에 의한 용출(pH 5) (바람직하게 포스페이트, 아세테이트, 시트르산염 또는 그밖의 적당한 완충용액 사용)을 통해 GHRH-R 분리물의 생산을 위한 상당한 수용체를 정제하게 됨을 지적하고 있다. 얻어진 GHRH-R 분리물은 GHRH-R의 서열화에 충분한 순도이며; 바람직한 실시예에서 G-단백질 및 그밖의 방해 오염물을, 적어도 서열화를 실행하기에 충분한 순도의 GHRH-R을 얻기 위해 겔 전기영동과 같은 방법에 의해 제거가능한데, 다만 이러한 방법에 한정되는 것은 아니다.
제 10 도는 스트렙타비딘 아가로스 컬럼 상에서 비오티닐화된 수용체 복합체(GHRHb-GHRH-R)의 친화성 정제의 결과를 보여주고 있다. 결합 복합체를 갖는 아가로스 비드를 0.5 m HaCl에서 세척하여 비특이 결합을 최소화한 다음 수용체를 pH 5.0에서 비오티닐화 리간드로부터 해리시켰으며, 컬럼으로부터 용출시켰다. 용출액을 원심분리기-구동 한외여과에 의해 농축시켰고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.대조 표준 컬럼을 병행하여 수행하였고 가용성 수용체 복합체를 비오티닐화된 동족체 GHRHa와 예비 결합시키는 것을 제외하고는 동일하게 처리하였다. 상기 은(silver) 염색 겔 상의 GHRHb레인은 GHRHa레인에서는 나타나지 않은 52 및 45 kDa에서의 밴드를 나타낸다. 가교 연구에서 보여진 55 kDa 밴드는 공유적으로 부착된 3.6 kDa GHRHa펩티드를 포함하기 때문에 52 kDa 밴드는 수용체의 예상 크기에 상응한다. 45 kDa 밴드는 GHRH 수용체 복합체의 서브유니트라고 생각되는 자극제 G-단백질, Gs에 관해 보고된 크기이다. 보조용리 및 대조표준 컬럼에서의 상기 두 밴드들의 부재는 고정제 GHRH-R이 제조되었음을 확실히 하는 것이다.
실험 방법 및 실시예
하기 비-제한 실시예는 본 발명의 개선된 GHRH 결합 분석 방법, 및 그대로의 GHRH/GHRH-수용체 복합체의 가용화를 기준으로 한 GHRH-수용체를 정제하는 방법을 부가 증명한다. 본 명세서에 상세하게 언급된 것들 이외의 각종 다양한 물질이 사용되어 필요이상의 실험없이 발명을 실시할 수 있다.
1. 조 막펠릿 내에서 결합 분석
조직의 준비
모든 단계를 4℃에서 수행하였다. 냉동 양 또는 소의 뇌하수체 전엽(양: 오스트레일리아, 멜보른, Dr. Iain Clarke 로부터 얻은 대략 1 gm/뇌하수체; 소: 알 칸서스주, Rogers의 Pel-Freeze로부터 대략 2.5 gm/뇌하수체 특수 처리)의 혈액을세척하고, 결합 조직을 제거하고, 50 mM HEPES 완충액, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA,0.1 μM EGTA, pH 7.4 내에서 0.5 mM PMSF (페닐 메틸 설포닐 플루오라이드), 10 μg/㎖ 루펩틴(leupeptin), 10 μg/㎖ 펩트타틴 A, 및 200 U/㎖(단위/㎖) 아프로티닌으로 균질화하였다(Dounce 균질기 사용). 상기 완충액은 G 단백질에 결합될 수 있었던 내인성 GTP를 제거하고 고 친화성 결합을 회복하는데 사용한다. 균등질을 마이크로퓨지(Microfuge)의 최고 속도에서 회전시킨 후 상층액은 버렸다. 그 다음 펠릿의 상부(막)층을 50 mM Tris 완충액, 5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 50 μg/㎖ 알라메티신, 30 μg/㎖ 바시트라신 및 상기와 같은 그밖의 프로테아제 저해제를 함유한 결합 완충액에 서서히 재현탁시켰다.
결합 조건 및 분석
튜브 당 l/50 뇌하수체 당량을 실온에서 1 시간 동안 500 ㎕ 부피의 요오드화 표지자 대략 100,000 계수를 지닌 결합 완충액에서 인큐베이션하였다. 총 계수를 전하였고 각 튜브에 결합된 계수의 백분율을 실험 조건 당 3 내지 6 레플리케이트로 결정하였다. 포화 결합 프로필을 좌표변환하지 않은 정확한 리간드 결합 방정식에 대입된 통계학적으로 정량된 최소 제곱법을 수행한 컴퓨터 프로그램 리간드로 분석하였다. 통계학적 측정(F 시험 및 작업 시험)은 단일 결합 부위 모델에 대한 설득력있는 좋은 최소제곱법을 제시하였다. 대표적인 포화 결합 분석을 제 2도에 제공한다.
결과
10 mM EDTA으로 조직을 처리하는 것은 내인성 GTP를 제거하고 고친화성 GTP의존 부위를 발현시키는데 필수적이었다. 초기에는, 비특이성 결합이 압도적이었고, 광범위하게 다양한 저해제는 개선을 나타내지 않았다. 보다 양호한 결합 신호가 수크로스 밀도 원심분리에 의해 정제된 막 분획에서 발견되었다. 일관된 결과를 얻기 위해, 냉동된 뇌하수체로부터 조막의 다량 회분을 제조하고 이 막의 분취량을 다음 분석을 위해 냉동시켰다. 제 1 도를 참고로하여, 균질화 바로 후에 막을 시험했을 때, 특이적 결합이 상당히 증가함이 확인되었다. 이 냉동-해동 효과에 대한 한가지 가능한 메카니즘은 분석을 방해하는 소포의 형성이다. 이 가능성을 시험하면 다공 형성 항생 알라메티신(50 μg/㎖)이 제 1 도에 도식적으로 예시된 바와 같이 특이적 결합/총 결합의 비율을 3배로 증가시켰다는 것이 밝혀졌다. 이 증가의 대부분은 비특이성 결합의 저하, 아마도 소포내 포획되었던 표지자의 방출에 기인한다. 회수된 총 계수의 감소에도 불구하고 비특이성 결합에 대한 특이성 결합의 증가를 최대화시키기 위해 원심 분리에 의한 막 펠릿의 세척을 부가적으로 수행하였다.
프로그램 리간드를 사용한 포화 결합의 컴퓨터 분석 연구는 Kd= 158 ± l3pM을 갖는 단일 결합 부위를 표시하고, 특이성 결합 부위(RT)의 총수가 1.5 ± 0.9 pmoles/gm 조직(최적 최소 제곱법 값 ± 대략적 표준 평균 오차(SEM))임을 지시한다. GHRHa에 대한 친화도가 GHRHa의 생물학적 효능과 부합되고, 관련된 펩티드를능가하는 GHRH에 대한 특이성(100 nM VIP 또는 PACAP 에 의한 경쟁 없음) 및 50μ M OTPrs 및 1.0 mM DTT에 대한 선택성으로 인해, 이 결합은 GHRH-R의 존재를 나타낸다.
125I-GHRHa과 구입 가능한 요오드화된 사람 GHRH(AmeriSham, Arlington Heights, IL)의 비교 결과 상당한 유사성이 확인되었으며;125I-GHRHa는 보다 양호한 특이적 결합성 및 다소 강한 GTP 효과를 나타냈다.
광친화성 표지자 결합의 측정
상기한 바(Rockford, IL)와 같이 Pierce 로부터 구입가능한 이종이중기능의 광반응성 가교제를 사용하여 두가지 상이한 광친화성 표지자를 제조하였다. SANPAH 는 DMF 용매 시스템을 사용하여 N-말단 히스티딘에 표적된 GHRHa에 커플링시켰다. ANB-NOS는 라이신 12 또는 21에 표적된 GHRHa에 커플링시켰다. 각각의 커플 링기-GHRHa생성물을 HPLC로 정제하고 요오드화한 후 재정제하였다.
막에 대한 광표지자의 결합은 결합 부위를 확인하기 위해 조막 결합 분석으로 평가한 후 SDS-PAGE 전기 영동에 의해 더 분석하였다. 광표지자는 암소에서 인큐베이션하고 장파(366 nm) UV 램프로 10 분간 광분해시킨 후, 샘플을 펠릿화하였다. 펠릿을 계수한 후 SDS 샘플 완충액(전체 SDS 추출물) 내에서 직접 가열하여 추출하였다. 대안적으로는, 원심분리된 온화한 계면활성제 용액(5 mM CHAPS) 내에서 라벨링된 펠릿을 추출하고, 클로로포름/메탄올 농축된 상층액을 SDS 완충액(CHAPS 추출물)으로 변성시켰다. 그리고 나서 이들 샘플을 SDS 겔에서 전기 영동시키고 방사선 자동 사진촬영하였다.
결과
결합 분석은 두 광표지자가 막 펠릿에 결합되었고 전체적으로 10 nM GHRHa로 대체하거나 부분적으로 50 μM GTPγS 로 대체할 수 있다는 것을 나타냈다. 둘다 I-GHRHa보다 더 큰 비특이성 결합을 제공하였다. 친화성 가교 펠릿의 총 SDS 추출 물 겔은 이 비특이성 결합을 GHRHa또는 GTPγS 에 의해 영향받지 않는 밴드로 드러냈다. 이들 비특이성 밴드는 실행에 따라 그리고 두 표지자간에 다소 차이가 있었다(제 3 도). 비이온 계면활성제 CHAPS는 단백질의 약한 가용화제이며; 수용체 정제 작업은 CHAPS를 함유하는 용액의 GHRH 결합 활성을 가용화시키는 능력을 입증하였다. 5 mM CHAPS를 함유하는 용액을 사용함으로써 얻어진 가교된 펠릿의 추출물이 SDS 겔상에서 시험되었을 때, 비특이적으로 표지된 단백질 대부분이 용해되지 않았으므로 수용체 가교의 가시화가 훨씬 개선되었다. 제 3 도 및 4 도를 참고로 하여, 이의 표지가 GHRHa또는 GTPγS에 의해 크게 영향받는 55 kD 밴드가 라벨링에 의해 명확히 가시화될 수 있으며, 이는 GHRH-R을 나타낸다. 이들 광표지자는 GHRH-수용체의 부가적 특성화, 정제 및 클로닝에서 높은 가치를 갖는다.
탈글리코실화
대부분의 G 단백질-결합 막 수용체의 세포외 부분이 아르기닌 잔기에 공유적으로 결합(N-결합)된 다중 탄수화물 그룹을 함유하는 것으로 알려져 있으므로 제 3도 및 제 4 도에서 보여진 특이적으로 광표지된 밴드가 N-결합된 당 단백질임을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 샘플을 정제된, 엔도글리코시다제 F 및 N-글리코시다제 F의 프로테아제 없는 혼합물로 처리하였다.
광표지된 펠릿(SDS 또는 CHAPS를 사용하여 추출함)을 SDS 샘플 완충액 내에서 끓이고, 희석시키고, 0.5 단위의 글리코시다제 또는 블랭크 내에서 1.25% Nonidet P-40(또한 NP-40 으로 공지된 비이온성 계면활성제)로 37℃에서 밤새 인큐 베이션하였다. 그리고 나서 이들 샘플을 클로로포름-메탄을 침전 프로토콜(Wessel일동, Anal. Biochem., 138:141-143, 1984)에 의해 농축시키고 SDS 겔 상에서 전기영동하였다.
제 3 도 및 제 4 도를 참고로 할 때, 특이적으로 광표지된 밴드가 글리코시다제만 존재시 대략 55 kD에서 대략 45 kD으로 이동함을 볼 수 있다. SDS 추출된 샘플에서 보여지며, GHRHa또는 GTPγS에 대한 반응의 결여로 비특이적으로 표지될 것으로 여겨지는 다른 밴드들은 탈글리코실화되지 않는다. 이것이 GHRH-R이 당단백질이라는 첫 번째 증거이며 단백질쇄의 실제 크기의 가장 우수한 견적을 제공한다. 제 5 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 뉴라미니다제를 사용한 광표지된 수용체의 처리로 대략 52 kD으로의 겔 유동성의 이동이 유발되었다. 이는 수용체가 이의 올리고당 사슬 상에 다수의 말단 시알산기를 가짐을 나타낸다. 이들 시알산기는 또한 등전 초점 겔 상에서 보는 바와 같이, 수용체의 PI, HPLC 상의 소수성, 및 또한 이의 렉틴 결합 성질에 영향을 준다. 탈글리코실화는 정제 전략 및 서열화를 위한 수용체의 단백질 분해성 분열을 촉진시키는데 유용하다.
수용체 - GHRH 복합체의 가용화
CHAPS를 함유하는 용액내에 용해된 뇌하수체 막 제재는 목탄-덱스트란 결합분석(Paul 일동, J. Biol. Chem., 262 : 158-162, 1987에서 개시된 VIP으로부터 적용된)으로 측정된 바와 같이 GTP 두 감응성 저친화성 부위(Kd대략 500 nM)만을 나타냈다. 다른 계면활성제는 훨씬 적은 결합을 보유하며, 이는 GHRH-R이 이들 처리에 대해 안정하지 않다는 것을 지시한다. 광친화성 가교 결과는 공유적으로 커플 링된 수용체-리간드 복합체가 CHAPS를 함유하는 용액에 대해 가용성임을 보여주었다. 본 발명의 막 결합 분석 조건을 사용하여 수용체를 갖는 GHRH의 예비 인큐베이션하여, 바람직하게 CHAPS를 함유하는 온화한 계면활성제 용액을 사용하여 추출한 경우 그대로의 수용체-리간드 복합체의 가용화가 확인되었다. 이 가용성 복합체는 10 nM의 냉각된 GHRH를 사용하여 처리한 후125I-GHRH 동족체, 또는125I-GHRH 동족체로 인큐베이션된 막의 계면활성제에 의한 추출로 탐지되었다.
정제된 GHRH-R
그리고 나서 비오티닐화된 GHRH 동족체를 이용하여 가용성 GHRHb-GHRH-R 복합체를 형성하였고, CHAPS를 사용한 추출 및 목탄-덱스트란을 사용한 정제 후 이 가용성 복합체를 스트렙타비딘 관 상에 유출시켰다. 그리고 나서, 스트렙타비딘 관을 NaCl 용액으로 세척하고, 이어서 GHRH-R 분리물을 생성하기 위해 pH 5.0의 완충액을 컬럼 상에 유출시켰다.
그리고 나서, GHRH-R 분리물을 SDS-PAGE에 의해 더 정제할 수 있다. 약 52 kDa(순수한 GHRH-R에 해당)에서 나타나는 밴드를 표준 PVDF 막으로 블럿팅할 수 있다. 그리고 나서, 그 위에 정제된 GHRH-R을 갖는 PVDF 막을 막상에서 분해하고 서열화하여, 통상적인 서열화 방법 후 GHRH-R의 완전한 또는 부분적인 아미노산 잔기서열을 얻을 수 있다.
그리고 나서, 서열화 단계로부터 얻어진 아미노산 잔기 서열 또는 서열들은 GHRH-R 생성을 위해 반응성인 유전자의 클로닝에 사용하기 위한 변성된 표지자를 형성하기 위한 주형으로 이용될 수 있다.
그러므로, 양 및 소 뇌하수체 막 내의 GHRH 수용체에 대한 GHRH 동족체의 결합을 측정하기 위한 개선된 방법이 밝혀졌다(GHRH 동족체의 요오드화, 정제 및 수송에 대한 방법, 및 다공 형성 항생제의 사용 포함). 이는 GHRH 수용체의 GTP 감 응성, GHRH 특이성, 고친화성 광-표지에 대한 방법의 개발을 유도하였다. 이 수용체의 상기한 라벨링은 먼저 이루어지지 않았다. 이는 수용체의 크기 특성화, 글리코실화, 용해도 및 다른 성질에 대해 허용하였다. 이는 CHAPS와 같은 화합물을 포함한 온화한 계면 활성제 용액이 결합된 GHRH-GHRH-수용체 복합체를 안정하고 가용성인 형태로 추출할 수 있음을 발견하였다. CHAPS 추출 및 목탄/덱스트란 처리(자유 GHRH를 결합시키기 위한)는 대개의 비특이성 GHRH 결합으로부터 정제되는 가용성 수용체-리간드 복합체를 제공하므로 이미 가능했던 것보다 더 나은 감응성을 갖는 신규하고 낮은 기초 GHRH 결합 분석으로서, 및 또한 수용체 정제를 위한 출발점으로서 매우 유용하다. 이 수용체-리간드 복합체는 염 세척, GHRH 교환 및 GTP 또는 DTT 처리에 대해서는 비교적 안정하나 낮은 pH에 대해서는 안정하지 않다. 가용성 GHRH-R 복합체에 결합되었을 때, 고정된 스트렙타비딘 컬럼 상에 보유 후 염세척, 및 pH 5 용리에 의해 GHRH 수용체의 정제를 허용하는 C-말단 비오틴화된 GHRH 동족체가 제조되었다. 이 정제된 수용체 단백질은 수용체 펩티드의 부분적인 서열화에 적합하고 이 서열정보는 GHRH 수용체 cDNA의 클로닝에 있어 유용하다.
상기 지침으로부터, 본 발명의 다수의 수정 및 변경이 가능함은 물론이다.
비-제한 실시예에 의해, 정제된 GHRH-R을 생성하기 위해 조 뇌하수체 샘플 내 다른 GHRH-R 복합체가 친화 컬럼에 결합될 수 있다는 것이 고려된다. 그러므로 본 발명은 특별히 기재된 것 보다 달리 실행될 수 있음을 이해해야 할 것이다.
제 1 도는 양(ovine)의 조(粗) 뇌하수체 막펠릿에 대한125I-GHRHa의 결합을 나타내는 막대 그래프이고,
제 2 도는 포화 결합 분석을 위해 사용된 그래프이며,
제 3 도는 수용체의 광친화성 가교를 나타내는 SDS 겔의 방사선 사진이며,
제 4 도는 10 nM GHRH에 의한 경쟁을 나타내며 또한 탈글리코실화를 보이는 CHAPS 추출 ANB-NOS 가교를 보여주는 제 3 도와 같은 SDS 겔의 방사선 사진이며,
제 5도는 제 4도와 같은 광친화성 가교의 SDS 겔의 방사선 사진이며, 이는 GTPγS의 효과 및 뉴라미니다제에 의한 부분 탈글리코실화의 효과를 포함한다.
제 6 도는 10 nM 라벨안붙인 GHRHa 존재 또는 부재 하에서, 방사성 요오드화 GHRHa를 양의 조 뇌하수체 막에 결합시켜 제조된 GHRHa-GHRH-R 복합체의 용해도를 나타내며,
제 7 도는 ANB-NOS-GHRHa광표지자에 의한 제 6 도의 실험을 따름으로써 생성된 가용성 복합체의 광친화성 가교를 나타내며,
제 8 도는 50㎛ GTPγS(±5mM Mg++, 10mM DTT, 또는 1% 트리톤 X-100에 30분동안 노출된 다음 분리된 양의 정량을 위해 다시 목탄 덱스트란 처리된, CHAPS 가용화된 목탄 덱스트란 처리 GHRHa-GHRH-R 복합체의 안정성을 나타내며,
제 9 도는 제 8 도에서와 같이 평가되는 여러 가지 pH에서 가용성 특정 복합체의 안정성에 대한 낮은 pH에서 가용성 GHRH-GHRH-R 복합체의 분리 정도를 나타내며,
제 10 도는 스트렙타비딘 아가로스 컬럼 상에서 비오티닐화된 수용체 복합 GHRHb-GHRH-R의 친화 크로마토그래피로부터 얻은, 정제된 GHRH-R을 함유하는 용출액의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
Claims (9)
- 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 측정된 약 55 kDa의 분자량을 가지며, 친화성 크로마토그래피 지지체상에 복합체 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체를 고정시키고, 이어서 상기 지지체 상에서 상기 복합체를 해리시켜 분리 정제된 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체를 얻는 것으로 이루어지는 방법에 의해 생산된, 분리 정제된 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체.
- 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 측정된 약 55 kDa의 분자량을 가지며, 성장 호르몬 방출 호르몬 또는 [His1, Nle27, 비오티닐-Lys41]-GHRH-(1-41)-NH2, GHRHa가 [His1,Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2이고, SANPAH 가 설포숙신이미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트인 GHRHa-SANPAH 및 GHRHa가 [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2이고 ANB-NOS 가 N-S-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드인 GHRHa-ANB-NOS로부터 선택되는 성장 호르몬 방출 호르몬 동족체와 복합체를 이룬 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체를 온화한 세정 용액에서 가용화시키고; 친화성 크로마토그래피 지지체상에 복합체 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체를 고정화시킨 다음; pH를 낮춤으로써 상기 지지체 상에서 상기 복합체를 해리시켜 분리 정제된 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체를 얻는 것으로 이루어지는 방법에 의해 생산된, 분리 정제된 성장호르몬 방출 호르몬 수용체.
- N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드와 GHRH 동족체 [HIS1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2의 커플링 단계로 구성되는 광-친화성 표지자 생성 방법.
- 설포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트를 GHRH 동족체 [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2에 커플링시키는 광-친화성 표지자 생성방법.
- 세공-형성 항생제의 존재하에 조 뇌하수체 전엽 조직과 GHRH의 접촉 단계로 구성되는 조 뇌하수체 전엽 조직에 대한 성장 호르몬 방출 호르몬의 결합 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 항생제가 0.05㎎/㎖로 존재하는 아라메티신인 방법.
- 성장 호르몬 방출 호르몬을 상기 성장 호르몬 방출 호르몬과 요오드화하기에 충분한 요오드화 기질의 접촉 단계로 구성되는 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체 표지자 생성 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 요오드화 성장 호르몬 방출 호르몬을 HPLC를 거쳐상기 요오드화 후에 정제하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 시알산을 절단하는 뉴라미니다제로 처리시 탈글리코실화되는 것을 특징으로 하는 성장 호르몬 방출 호르몬 수용체.
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