ES2323218T3 - Aislamiento y caracterizacion del receptor de la hormona que libera a la hormona del crecimiento. - Google Patents
Aislamiento y caracterizacion del receptor de la hormona que libera a la hormona del crecimiento. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la identificación de complejos receptor-ligando específicos para la hormona que libera la hormona del crecimiento que comprende: a) marcaje del ligando; b) incubación del ligando marcado con pellas de membrana que comprenden el receptor de la hormona que libera la hormona del crecimiento; c) medición del ligando total unido; d) incubación del ligando marcado con pellas de membrana que comprenden el receptor de la hormona que libera la hormona del crecimiento en presencia de ligando no marcado; e) medición del ligando total unido; y f) determinación de la unión específica, caracterizado porque las etapas de incubación b) y d) se llevan a cabo en presencia de un antibiótico formador de poros.
Description
Aislamiento y caracterización del receptor de la
hormona que libera a la hormona del crecimiento.
Esta invención está dirigida al aislamiento de
receptores hormonales y, más particularmente, está dirigida a
métodos y composiciones útiles para purificar el receptor de la
hormona liberadora de la hormona del crecimiento, y al aislamiento
del receptor de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento
purificado.
La hormona liberadora de la hormona del
crecimiento (GHRH) es secretada por el hipotálamo y estimula la
liberación de la hormona del crecimiento (GH) en la pituitaria
anterior. La GHRH es un miembro de una familia de péptidos
homólogos que incluye glucagón, secretina, VIP (péptido intestinal
vasoactivo), PHI (péptido histidina isoleucina), PACAP (péptido
activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria), GIP (péptido
inhibidor gástrico) y helodermina. La GHRH ha sido objeto de un
estudio considerable, pero se sabe poco acerca del receptor de GHRH,
GHRH-R, al cual se une la GHRH en la pituitaria
anterior para inducir la liberación de GH.
La producción a gran escala del receptor de GHRH
clonado permitiría la selección de un gran número de análogos de la
GHRH y facilitaría el desarrollo de agonistas y antagonistas
mejorados para la terapia clínica de trastornos del crecimiento.
Más específicamente, la selección de un gran número de análogos y
xenobióticos por su actividad GHRH conduciría al desarrollo de
agonistas mejorados para ser utilizados en la terapia clínica de
niños deficientes en hormona del crecimiento, y en la terapia
clínica de adultos para mejorar su nutrición y para alterar la
composición corporal (músculo frente a grasa). Tal selección,
asistida posiblemente por modelado mediante ordenador basado en la
estructura de los receptores, podría conducir también a agonistas no
peptídicos de la GHRH oralmente activos que serían especialmente
útiles en la práctica médica y veterinaria, por ejemplo, para
desarrollar ganado con una producción de leche de mayor rendimiento
y ganado más magro con mayor rendimiento.
La explotación comercial de fármacos que
interaccionan con el GHRH-R requerirá una fuente de
una forma purificada de GHRH-R y ensayos de unión
adecuados.
El aislamiento y el clonaje del receptor de la
GHRH y su expresión in vitro conducirían también a: (1)
Estudios de hibridación in situ que mapeen la distribución de
los receptores de la GHRH por todo el organismo y al examen de su
papel fisiológico potencial fuera de la pituitaria; esto podría
revelar funciones potenciales de la GHRH en el cerebro, las
gónadas, el páncreas, la placenta y el intestino, donde se cree que
se concentra el péptido. (2) Estudios de la estructura del receptor
que implican a receptores mutados o quiméricos para explorar las
relaciones estructura/función y las interacciones con el segundo
mensajero en la búsqueda de moléculas agonistas/antagonistas
diseñadas específicamente. (3) Una comprensión de la relación
evolutiva de los GHRH-R con otros receptores unidos
a proteína G, especialmente los de la familia
glucagón/secretina/VIP. (4) El clonaje de otros miembros de esta
subfamilia que se espera que tengan similitud de secuencias.
Existen varias rutas alternativas para obtener
clones de receptores funcionales, tales como: A. Purificación de la
proteína del receptor para obtener una secuencia parcial de la
proteína; esta secuencia parcial de la proteína podría ser
utilizada posteriormente para someter a selección al ADN apropiado
por la secuencia de nucleótidos correspondiente. B. La selección de
ADN por secuencias similares a receptores conocidos que se piensa
que están relacionados con el receptor de la GHRH. C. La selección
de ADN que, cuando se expresa como proteína, produce el receptor de
GHRH, el cual sería detectado por su unión a la GHRH, por su
actividad biológica o por un anticuerpo hacia el receptor de GHRH.
Observar que cualquier método de clonaje concebible requiere
ensayos de unión así como ensayos funcionales con la GHRH y péptidos
relacionados para identificar el receptor de la GHRH y para
caracterizar los clones expresados.
Existe por tanto la necesidad de ensayos de
unión de la GHRH y composiciones para ser utilizadas en los mismos
que ayudarán a caracterizar y a aislar el receptor de la GHRH. En
particular, existe la necesidad de métodos que puedan caracterizar
al receptor de la GHRH de la pituitaria en términos de tamaño,
glicosilación, solubilidad y estabilidad del complejo receptor
(GHRH-R)-ligando (GHRH o análogo de
la GHRH), con el fin de que puedan desarrollarse métodos para
purificar la proteína del receptor e identificar los clones del
receptor. Existe también la necesidad de GHRH-R
purificado o parcialmente purificado y de métodos para obtener el
mismo. Por GHRH-R parcialmente purificado se indica
que se ha formado un aislado de GHRH-R que tiene
GHRH-R aislado de la mayoría de la matriz orgánica
de las células de la pituitaria anterior. El aislado de
GHRH-R tiene una pureza suficiente para permitir la
determinación de la secuencia del GHRH-R,
entendiéndose que esto puede requerir una purificación posterior
para eliminar cualquier compuesto remanente que pudiera interferir
con la secuenciación, tal como las proteínas G. No obstante, el
aislado de GHRH-R de la presente invención,
producido utilizando el método de extracción y aislamiento de la
presente invención, contiene GHRH-R preferiblemente
a una concentración mayor que a la que está presente el
GHRH-R de manera natural en la pituitaria anterior,
y el aislado de GHRH-R puede ser purificado
posteriormente, si es necesario, utilizando SDS-PAGE
para eliminar cualquier compuesto que pudiera interferir con la
secuenciación del GHRH-R. Por tanto, la presente
invención incluye también la producción de GHRH-R
de pureza suficiente para llevar a cabo la secuenciación, o para ser
utilizado en bioensayos de la actividad de unión del
GHRH-R.
Históricamente ha sido difícil trabajar con el
GHRH-R, debido a que la GHRH tiene una unión no
específica muy elevada (haciendo difícil determinar si la GHRH o
los análogos de la GHRH se están uniendo específicamente o no al
GHRH-R), y el GHRH-R tiene una
abundancia extremadamente baja. La unión no específica de los
análogos de la GHRH al material de vidrio y de plástico ha sido un
problema importante en el trabajo anterior, limitando la precisión
y la reproducibilidad de los estudios de unión a receptores. Debido
a la naturaleza "pegajosa" del péptido GHRH cargado
negativamente, ha sido imposible la utilización de un ensayo de
unión de tipo filtración simple. Las cuentas no específicas son tan
elevadas que impiden la detección de la unión específica. Además,
el agente bloqueante polietilenimina comúnmente utilizado, que se
emplea para bloquear la unión no específica de proteínas sobre
filtros de fibra de vidrio, está cargado positivamente, y se unirá
de manera no específica a los análogos de GHRH (cargados
negativamente). Además, no ha estado disponible una preparación de
receptores solubles con afinidad de unión elevada que mejoraría
enormemente los esfuerzos para purificar el
GHRH-R.
Los estudios anteriores han caracterizado el
receptor de GHRH con respecto a su afinidad por sondas, tales como
GHRH y péptidos relacionados, y la unión a proteína G. Se han
realizado también intentos para utilizar entrecruzadores químicos
no específicos para marcar el receptor de GHRH. Ver, por ejemplo,
Zysk y col., "Cross-Linking of a Growth Hormone
Releasing Factor-Binding Protein in Anterior
Pituitary Cells", J. Biol. Chem., 261:1678 (1986) y
Velicelebi et al., "Covalent Cross-Linking
of Growth Hormone-Releasing Factor to Pituitary
Receptors", Endocrinology, 118:1278 (1986). Los resultados
de estos dos estudios sugieren, respectivamente, la presencia de un
receptor de GHRH de 26 kDa y de un receptor de 70 kDa en la
pituitaria anterior. La discrepancia entre el peso molecular
encontrado en estos dos estudios enfatiza las dificultades
implicadas en el aislamiento y caracterización del
GHRH-R, y la necesidad de métodos y composiciones
mejorados útiles para el aislamiento y caracterización del
GHRH-R.
Se cree que la unión de la GHRH a la pituitaria
anterior de rata está influenciada por GTP, que hace que el
receptor de GHRH reduzca su afinidad por la GHRH (se dice que GTP
desacopla el complejo proteína G-receptor de GHRH).
Se cree que el estado de alta afinidad del GHRH-R
unido a GHRH está estabilizado por interacciones con una proteína
reguladora de los nucleótidos de guanina para formar un complejo
ternario hormona-receptor-proteína
G. Se ha hipotetizado que GTP desestabiliza las interacciones
proteína G-receptor, lo cual tiene como resultado
la disociación del complejo
GHRH/GHRH-R-proteína G y la
reversión del receptor independiente a un estado de baja afinidad,
mientras que la proteína G liberada continúa activando su sistema de
segundo mensajero respectivo. Ver Struthers y col., "Nucleotide
Regulation of Growth Hormone-Releasing Factor
Binding to Rat Pituitary Receptors", Endocrinology,
124:24-29 (1989).
Se ha descubierto que, en tejidos de pituitaria
anterior ovina y bovina, la GHRH y sus análogos son desplazados por
concentraciones de GHRH_{a} de 500 a 1.000 veces menores que VIP o
PACAP. Este hallazgo es complementario a las propiedades de unión
observadas en el páncreas humano (una fuente de receptores de
secretina y VIP), en el que la capacidad para estimular adenilato
ciclasa en presencia de GTP muestra un orden de potencia de
secretina > helodermina > PHI \geq VIP >
GHRH(1-27)NH_{2}. De manera similar,
utilizando ^{125}I-secretina, las Kds obtenidas
fueron secretina 0,8 nM, helodermina 200 nM, PHI 250 nM. VIP y
GHRH(1-29)-NH_{2} inducen
solamente un 20% de inhibición a 10 \muM.
A dosis suprafisiológicas, se sabe que la GHRH
actúa en los receptores de VIP, y a la inversa, el VIP es un débil
agonista de GHRH.
Otros artículos que proporcionan información
básica sobre el aislamiento y caracterización de receptores
hormonales incluyen:
El resumen Nº 175248g del Chemical Abstracts,
1991, Vol. 115, Nº 17, página 135, describe la caracterización
parcial del receptor de GHRH mediante entrecruzamiento de GHRH
marcada con ^{125}I con células de timo de rata con el sustrato
disuccinimidilo seguido por PAGE y autorradiografía.
El resumen Nº 35929f del Chemical Abstracts,
1988, Vol. 109, Nº 5, página 442, describe la caracterización de
las propiedades de unión del receptor de GHRH de pituitaria humana,
utilizando como ligando el análogo de GHRH radiomarcado
^{125}I-GHRH_{a}.
Christophe et al., "The
VIP/PHI/secretin-helodermin/helospectin/GRH Family:
Structure-Function Relationship Of The Natural
Peptides, Their Precursors And Synthetic Analogs As Tested in
vitro On Receptors And Adenylate Cyclase In A Panel Of Tissue
Membranes", en Peptide Hormones As Prohormones: Processing.
Biological Activity. Pharmacology, Ed. Jean Martinez, Pub. Ellis
Horwood Lim. 1989, Chichester, Inglaterra. Baburthe y col.,
"Molecular Analysis of Vasoactive Intestinal Peptide Receptors: A
Comparison With Receptors for VIP Related Peptides", Ann. NY
Acad. Sci., 527:296-313 (1988). Frohm y col.,
"Growth Hormone-Releasing Hormone", Endocr.
Rev., 7:223-253 (1986). Seifert y col.,
"Growth Hormone-Releasing Factor Binding Sites In
Rat Anterior Pituitary Membrane Homogenates: Modulation By
Glucocorticoids", Endocrinology,
117:424-426 (1985). Bilezikjian y col.,
"Desensitization To Growth Hormone-Releasing
Factor (GRF) Is Associated With Down-Regulation of
GRF-Binding Sites", Endocrinology,
118:2045-2052 (1986). Ishihara y col., "Functional
Expression and Tissue Distribution of a Novel Receptor for
Vasoactive Intestinal Polypeptide", Neuron.,
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Cloning and Expression of a cDNA Encoding the Secretin Receptor",
EMBO J, 10:1635-1641 (1991). Lin y col.,
"Expression Cloning of an Adenylate
Cyclase-Coupled Calcitonin Receptor",
Science, 254:1022-1024 (1991). Juppner y
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Hormone and Parathyroid Hormone-Related Peptide",
Science, 254:1024-1026 (1991). Frohman y
col., "Tissue Distribution and Molecular Heterogeneity of Human
Growth Hormone-Releasing Factor in the Transgenic
Mouse", Endocrinology, 127:2149-2156
(1990). Paul et al., "Characterization of Receptors for
Vasoactive Intestinal Peptide Solubilized From the Lung", J.
Biol. Chem., 262:158-162 (1987). Guijarro y
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Vasoactive Intestinal Peptide from Rat Liver", Regulatory
Peptides, 25:37-50 (1989). Cronin y col.,
"Biological Activity of a Growth Hormone Releasing Factor Secreted
By a Human Tumor", Am. J. Physiol., 244 (Endocrinol.
Metab.) E346-E353 (1983). Leong y col.,
"Enumeration of Lactotropes and Somatotropes in Cultured Male and
Female Pituitary Cells: Evidence in Favor of a Mammosomatotrope
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116:1371-1378 (1985). Munson y col., "Ligand: a
Versatile Computerized Approach For Characterization of
Ligand-Binding Systems", Anal. Biochem.,
107:220-239 (1980). Wessel y col., "A Method for
the Quantitative Recovery of Protein in Dilute Solution in the
Presence of Detergents and Lipids", Anal. Biochem.,
138:141-143 (1984). Bagnato y col.,
"Gonadotropin-Induced Expression of Receptors for
Growth Hormone Releasing Factor in Cultured Granulosa Cells*",
Endocrinology, 128:2889-2894 (1991) (las
composiciones estudiadas por Bagnato y col. muestran propiedades de
unión de la GHRH que son diferentes de las propiedades de unión de
los tejidos de pituitaria). Todos los artículos y otros documentos
mencionados en la presente son incorporados por referencia como si
fueran reproducidos íntegramente más adelante.
Aunque los estudios precedentes han sido útiles
para desarrollar una comprensión preliminar del comportamiento del
GHRH-R, persiste la necesidad de un ensayo sensible
y reproducible para el GHRH-R que permitiría la
caracterización adicional del GHRH-R, conduciendo a
la purificación y clonaje del GHRH-R. Tal ensayo
debe resolver los problemas de la unión no específica de la GHRH y
de los análogos de GHRH, y de la escasa abundancia del receptor de
GHRH. La yodación y la purificación de análogos de GHRH con una
elevada actividad específica resultante, permite la mejora de la
unión específica a membranas brutas de la pituitaria anterior.
Por tanto, es un objeto primario de la presente
invención desarrollar un ensayo sensible y reproducible para
determinar la unión de GHRH.
Es un objeto adicional de la presente invención
desarrollar reactivos para marcar específicamente e inequívocamente
el receptor de GHRH.
Es otro objeto todavía más de la presente
invención desarrollar un esquema de purificación del receptor de
GHRH y obtener un aislado de GHRH-R de pureza
suficiente, o capaz de ser purificado fácilmente hasta una pureza
suficiente, para permitir al menos la secuenciación parcial del
GHRH-R.
Por tanto, es un objeto más de la presente
invención producir GHRH-R purificado.
Estos y otros objetos de la presente invención
se consiguen mediante un ensayo de unión de GHRH mejorado que
conduce al aislamiento de un extracto bruto de
GHRH-R (aislado). El GHRH-R es
caracterizado mediante la utilización de sondas radioyodadas
formadas a partir de análogos de la GHRH. Los análogos de la GHRH
(GHRH_{a} o GHRH_{b}) y otros análogos son yodados utilizando
yodoesferas en fase sólida, y el material monoyodado es purificado
mediante HPLC de fase reversa con el fin de que esté esencialmente
libre de transportador. La unión no específica de los análogos de
GHRH al material de vidrio y plástico durante el suministro y la
dilución ha sido sustancialmente eliminada mediante la utilización
de solventes orgánicos. En una realización preferida, se utiliza
acetonitrilo al cincuenta por ciento para la dilución y el
suministro de los análogos de GHRH. La unión específica de GHRH y
GHRH_{a} a pellas de membranas de la pituitaria anterior brutas es
incrementada por la adición de un antibiótico formador de poros. En
una realización preferida, el antibiótico alameticina (a 0,05 mg/ml
aproximadamente) es combinado con pellas de membranas de la
pituitaria anterior homogeneizadas para incrementar la unión
específica de la GHRH.
Se han preparado análogos de la GHRH que
contienen grupos de entrecruzamiento sensibles a UV (fotosondas o
sondas de fotoafinidad) que muestran una elevada afinidad
específica, sensibles a GTP, que se entrecruzan con el receptor de
GHRH. Las sondas difieren en la posición del grupo fotosensible y en
la longitud del brazo separador. Las fotosondas preferidas son
formadas acoplando el análogo de GHRH [His^{1},
Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2}
a
N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida
(ANB-NOS), o a hexanoato de
sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)
(sulfo-SANPAH o SANPAH), seguido por yodación y
purificación. Preferiblemente, el acoplamiento al reactivo
ANB-NOS está dirigido a las lisinas en las
posiciones 12 ó 21; el compuesto es yodado posteriormente en la
tirosina de la posición 10, y el producto es purificado mediante
HPLC de fase reversa para formar una fotosonda que será referida
como
^{125}I-GHRH_{a}-ANB-NOS.
En una realización alternativa, la fotosonda
^{125}I-GHRH_{a}-SANPAH es
formada en un sistema de solventes de dimetilformamida por
acoplamiento de SANPAH dirigido hacia la histidina
N-terminal de GHRH_{a}, purificación por HPLC de
fase reversa, yodación de la tirosina en la posición 10 de la
GHRH_{a} y repurificación por HPLC.
Se ha descubierto sorprendentemente que,
mediante la utilización de las sondas de fotoafinidad anteriormente
mencionadas, es posible producir un complejo soluble de GHRH_{a}
unido a GHRH-R; el complejo entrecruzado
covalentemente es fácilmente soluble en una solución de detergente
suave, conteniendo preferiblemente un compuesto detergente
zwitteriónico capaz de solubilizar proteínas, tal como
3-[(3-colamidopropil)-dimetil-amonio]-1-propano
sulfonato (referido como CHAPS, disponible en Pierce o en ICN
Biomedicals, de Irvine, California), y que la mayoría de los
contaminantes entrecruzados de manera no específica no son solubles
en la solución de detergente suave. Se descubrió posteriormente que
los complejos no entrecruzados eran también solubilizados bajo estas
condiciones. El fotoentrecruzamiento fue realizado después de la
solubilización y demostró que el receptor (GHRH-R)
y el ligando (GHRH-sonda) habían formado un complejo
soluble estable. En una realización preferida, esto permite la
eliminación de hasta un 90% aproximadamente de la GHRH unida de
manera no específica mediante la extracción con una solución
conteniendo CHAPS, y la eliminación del péptido libre con carbón
vegetal/dextrano. Esto tiene como resultado un ensayo de unión de la
GHRH enormemente mejorado.
En una realización más, se obtiene un aislado de
GHRH-R parcialmente purificado mediante
cromatografía de afinidad por la unión de una función a GHRH o a un
análogo de GHRH, la cual tiene afinidad por un compuesto
inmovilizado en un soporte. En una realización preferida, derivados
biotinilados de GHRH_{a} son unidos a GHRH-R,
solubilizados y luego inmovilizados en una columna de
estreptavidina. Se ha descubierto que el complejo GHRH
unida/GHRH-R se disocia a pH 5,0 en un tampón,
formando así un aislado de GHRH-R parcialmente
purificado capaz de ser utilizado para determinar la secuencia de
residuos de aminoácidos del GHRH-R, lo cual en una
realización preferida tiene lugar después de la purificación
posterior del aislado de GHRH-R utilizando
SDS-PAGE para eliminar compuestos, tales como las
proteínas G, que interferirían con la secuenciación, y formando con
ello GHRH-R purificado.
La figura 1 es un gráfico de barras que
demuestra la unión de ^{125}I-GHRH_{a} a pellas
de membranas brutas de pituitaria ovina. Las barras indican la
fracción de las cuentas totales unida a las pellas después de la
incubación con la sonda sola o en presencia de GHRH_{a} 10 nM o de
GTP\gammaS 50 \muM. Se muestran cuatro cajas diferentes (grupos
de barras). La primera caja (membrana) muestra la unión a una
preparación de pellas de membranas brutas. El segundo grupo
(congelada) muestra que existe poca unión específica en la misma
preparación de membranas después de que ha sido congelada y
descongelada. El tercer grupo (DTT) muestra la unión a esta misma
preparación (no congelada), pero en presencia de DTT 1 mM. El cuarto
grupo (ala-lavado) muestra un protocolo mejorado de
la presente invención que incluye el antibiótico formador de poros
alameticina y una etapa de lavado adicional. Las barras de error
indican el error estándar de la media y N = 3 ó 4 replicados por
punto.
La figura 2 es una gráfica utilizada para el
análisis de la unión de saturación. Los puntos son datos procedentes
de ensayos de unión realizados en presencia de niveles crecientes
de GHRH_{a} no marcado. Las barras de error indican el error
estándar de la media. La figura insertada muestra la representación
gráfica de los mismos datos y la curva en el sistema de coordenadas
de Scatchard (en la gráfica insertada no se muestran las barras de
error).
La figura 3 es un radiografía de un gel de SDS
que demuestra el entrecruzamiento del receptor con fotoafinidad. Se
demuestra el entrecruzamiento con membranas brutas de pituitaria
ovina con dos fotosondas diferentes (SANPAH y
ANB-NOS), extraída cada una por dos métodos
diferentes (SDS y CHAPS). Se muestra también en cada caso el efecto
de enzimas desglicosiladores. Los extractos de CHAPS muestran una
unión no específica enormemente reducida. Ambas fotosondas marcan
una banda de 55 kDa que se desplaza hasta 45 kDa después de la
desglicosilación.
La figura 4 es una radiografía de un gel de SDS
igual que en la figura 3 que muestra el entrecruzamiento de
ANB-NOS extraído con CHAPS, demostrando la
competición por GHRH 10 nM, y que muestra también la
desglicosilación.
La figura 5 es una radiografía de un gel de SDS
del entrecruzamiento de fotoafinidad igual que en la figura 4, que
incluye los efectos de GTP\gammaS y también la desglicosilación
parcial con neuraminidasa.
La figura 6 demuestra la solubilidad de los
complejos GHRH_{a}-GHRH-R que
fueron preparados permitiendo la unión de GHRH_{a} radioyodado a
membranas brutas de pituitaria ovina, en presencia o ausencia de
GHRH_{a} no marcado 10 nM.
La figura 7 demuestra el entrecruzamiento de
fotoafinidad de los complejos solubles producidos siguiendo el
experimento de la figura 6 con la fotosonda
ANB-NOS-GHRH_{a}, y la fracción
soluble en detergente fue entrecruzada con UV después de la
extracción. Las dos calles más a la izquierda fueron extraídas con
CHAPS y las dos calles de la derecha fueron extraídas con
desoxicolato.
La figura 8 demuestra la estabilidad de los
complejos GHRH_{a}-GHRH-R
solubilizados con CHAPS, tratados con carbón vegetal/dextrano, que
fueron expuestos a GTP\gammaS 50 \muM (\pm Mg^{++} 5 mM),
DTT 10 nM o Triton X-100 al 1% durante 30 minutos y
posteriormente tratados de nuevo con carbón vegetal/dextrano para
cuantificar el nivel de disociación.
La figura 9 demuestra la disociación de los
complejos GHRH-GHRH-R solubles a pH
bajo, con la estabilidad de los complejos solubles específicos a pH
variable evaluada como en la figura 8. Datos adicionales indican que
se obtiene una disociación casi completa a pH 5 o inferior.
La figura 10 demuestra el análisis mediante
SDS-PAGE del eluato, que contiene
GHRH-R purificado, obtenido de la cromatografía de
afinidad del complejo
GHRH_{b}-GHRH-R con el receptor
biotinilado en una columna de estreptavidina agarosa.
Una aproximación global al clonaje del receptor
de GHRH implica (1) la caracterización del receptor de GHRH, (2) la
utilización del conocimiento de las características del receptor de
GHRH para aislar el receptor de GHRH, (3) la determinación de la
secuencia peptídica del receptor de GHRH (o de una porción del
receptor de GHRH), (4) la determinación de la secuencia de ADN que
es responsable de la producción del receptor de GHRH mediante la
utilización de secuencias oligonucleotídicas degeneradas para
someter a selección a una biblioteca de ADNc y (5) el clonaje de la
secuencia de ADN.
En un aspecto, la presente invención está
dirigida a un ensayo sensible y reproducible para determinar la
unión de GHRH al receptor de GHRH, que demuestra una unión
reversible de alta afinidad específica de GHRH, dependiente de GTP.
Debido a la elevada unión no específica del péptido GHRH cargado
negativamente, ha sido imposible la utilización de un ensayo de
unión simple de tipo filtración. Con el ensayo de la presente
invención, la unión específica (definida como las cuentas de
radiación gamma, \gamma, producidas por la unión de
^{125}I-GHRH_{a} que son eliminadas de las
pellas de membranas homogeneizadas por GHRH_{a} 10 nM) es del 30
al 60% de las cuentas totales unidas en pellas de membranas brutas
y hasta el 90% de las cuentas después de la extracción con un
detergente suave (por ejemplo CHAPS) y del tratamiento con carbón
vegetal/dextrano. Una realización preferida del ensayo de unión de
la presente invención implica muchos factores, incluyendo un
protocolo de yodación suave en fase sólida, purificación por HPLC
del radioligando libre de transportador, un sistema de solventes
orgánicos para el suministro cuantitativo de GHRH_{a}, ensayos en
células plaqueadas y ensayos reversos de placas hemolíticas para
confirmar la actividad biológica de la sonda, y la utilización de
0,05 mg/ml aproximadamente de alameticina, un antibiótico formador
de poros, para incrementar la unión específica del radioligando a
pellas de membranas de la pituitaria anterior. La alameticina
incrementa la unión específica y disminuye las cuentas atrapadas.
Un lavado disminuye la cuentas recuperadas pero mejora
posteriormente la cantidad relativa de unión específica.
Un análogo de GHRH preferido para los estudios
de unión a receptores es [His^{1},
Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2}
(referido como GHRH_{a}). El análogo de GHRH es un péptido que
tiene buena actividad de unión a GHRH-R y difiere
de la secuencia humana en longitud, y tiene dos aminoácidos que son
alterados para facilitar su utilización como sustrato para la
yodación. Una fuente preferida de GHRH_{a} es Peninsula
Laboratories (Belmont, CA).
La preparación de análogos de GHRH yodados con
actividad específica y actividad biológica óptimas se realiza
yodando primeramente los análogos de GHRH (incluyendo las
fotosondas) mediante la utilización de yodoesferas en fase sólida
(tales como las disponibles en Pierce), y posteriormente el material
monoyodado es purificado para que esté esencialmente libre de
transportador mediante HPLC de fase reversa utilizando
preferiblemente una columna Poly F de Bio-Series
basada en fluorocarbono (disponible en Mac-Mod). La
dilución cuantitativa y el suministro de los análogos de GHRH se
obtiene utilizando solventes orgánicos; se emplea preferiblemente
como vehículo una solución de acetonitrilo al 50% en agua. De este
modo se evitan las diluciones inexactas y no reproducibles
encontradas con los vehículos acuosos.
Se ha descubierto sorprendentemente que se
obtiene un incremento de tres veces de la unión específica
aproximadamente, en comparación con la metodología anterior, cuando
se combina un antibiótico formador de poros con pellas de membranas
de la pituitaria anterior brutas (ver Struthers y col.,
Endocrinology, 124:24 (1989)). En una realización preferida,
se utiliza la adición de 50 \mug/ml aproximadamente del
antibiótico alameticina para obtener una unión específica
óptima.
Con referencia a la figura 1, se presenta la
unión de la sonda ^{125}I-GHRH_{a} a pellas de
membranas brutas que han sido tratadas bajo diferentes condiciones.
Hay cuatro grupos de tres barras. Cada barra dentro de un grupo
indica la fracción de cuentas totales unida después de la incubación
con la sonda yodada. En cada grupo de tres barras, la barra de la
izquierda indica las cuentas totales unidas después de la incubación
con la sonda yodada sola, sin pre-exposición de las
membranas a GHRH fría o a otro compuesto que sabe que compite con
GHRH_{a} o que interfiere con la unión de GHRH_{a}. La barra del
centro indica la fracción de las cuentas totales unida después de
la incubación con la sonda yodada que ha sido añadida a la
incubación junto con GHRH_{a} no marcada 10 nM (que compite por
los sitios de unión específica). La diferencia entre la barra de la
izquierda y la barra central de cada grupo de barras indica la unión
específica de GHRH, que representa la cantidad de
GHRH-R presente. La barra de la derecha indica la
fracción de las cuentas totales unida después de la incubación con
la ^{125}I-sonda en presencia de GTP\gammaS 50
\muM. Como se sabe que GTP\gammaS causa la disociación de la
proteína G de algunos complejos de receptores resultando en una
afinidad menor y una unión disminuida, la disminución de la unión
específica cuando se utiliza GTP\gammaS es consistente con la
presencia del complejo
GHRH-R-proteína G.
Se define la unión específica como la diferencia
entre la unión observada con análogo yodado 20 pM solo y la unión
del análogo en presencia de GHRH_{a} no yodado 10 nM. La unión de
saturación, el análisis de Scatchard, los estudios de competición y
otros datos discutidos en la presente muestran que estos sitios de
alta afinidad son sitios de unión específica.
Con referencia a la figura 2, los estudios de
unión de saturación demuestran la unión del análogo de GHRH
[His^{1},
Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2}
(GHRH_{a}) a un único sitio de alta afinidad con una Kd de 160 pM
aproximadamente. Algunas barras de error fueron demasiado pequeñas
para poder ser mostradas (N = 6 replicados por punto). Este dato
fue analizado con el programa de ordenador Lingand, que determina
las constantes de unión sobre la base de un ajuste de mínimos
cuadrados ponderado estadísticamente a la ecuación de unión del
ligando en un sistema de coordenadas no transformadas. El programa
informa de un único sitio de unión con una K_{d} = 150 \pm 10
pM y R = 1,5 \pm 0,09 pmoles/g de tejido (mejor valor de ajuste =
ESM aproximado del ajuste). Los análisis estadísticos apoyan este
modelo de un único sitio de unión. La línea discontinua es la curva
teórica generada utilizando estas constantes en la ecuación de
unión.
La unión específica del radioligando GHRH_{a}
es reducida hasta el 65% por GTP\gammaS 50 \muM. Los péptidos
relacionados VIP y PACAP no competían por este sitio de unión a
concentraciones de 100 nanomolar. Esta unión representa un
GHRH-R unido a proteína G de alta afinidad. Se sabe
que la unión de VIP al receptor de VIP es sensible a los agentes
reductores de sulfhidrilo. Tal unión específica en el ensayo de GHRH
es eliminada completamente por la preincubación con ditiotreitol 1
mM (DTT, que se sabe que impide la unión de alta afinidad a
receptores relacionados), apoyando así adicionalmente la conclusión
de que el receptor GHRH-R es el sitio de unión.
Se prepararon sondas de fotoafinidad utilizando
agentes de entrecruzamiento fotorreactivos; estas sondas difieren
en la posición del grupo fotosensible y en la longitud del brazo
separador. Las sondas con capaces de unirse a
GHRH-R en ausencia de radiación UV y de
entrecruzarse con GHRH-R bajo el influjo de
radiación UV. A continuación se citan ejemplos preferidos no
limitantes de sondas de fotoafinidad y métodos para producir las
mismas:
El análogo de GHRH de 32 aminoácidos [His^{1},
Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2}
(GHRH_{a}), fue acoplado al reactivo
N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida
(ANB-NOS) dirigido a la lisina 12 o 21 para formar
GHRH_{a}-ANB-NOS. La
GHRH_{a}-ANB-NOS fue yodada
utilizando yodoesferas para formar el radioligando ("fotosonda"
^{125}I-GHRH_{a}-ANB-NOS,
"GHRH_{a}-ANB-NOS caliente" o
"fotosonda caliente") (las yodoesferas preferidas están
disponibles en Pierce, Rockford, IL).
En un sistema de solventes de dimetilformamida,
el análogo de GHRH [His^{1},
Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2}
en lugar de a
N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida
(ANB-NOS), fue acoplado a hexanoato de
sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)
(sulfo-SANPAH o SANPAH) dirigido a la histidina
N-terminal de GHRH_{a}. El material radioyodado
fue luego purificado para que estuviera esencialmente libre de
péptido de partida mediante HPLC de fase reversa en una columna
Poly F de Bio Series basada en fluorocarbono (disponible en
Mac-Mod Analytical, Chadds Ford, PA) utilizando un
gradiente de acetonitrilo de poca pendiente.
La unión de la fotosonda en pellas de membranas
de pituitaria ovina fue determinada mediante contaje \gamma y se
examinó el entrecruzamiento inducido por UV por autorradiografía de
geles de electroforesis en dodecilsulfato de sodio poliacrilamida
(SDS-PAGE). La sonda
^{125}I-GHRH_{a}-ANB-NOS
se unía con una afinidad de un nanomol aproximadamente, nM (en
comparación con 160 picomoles aproximadamente, pM, para GHRH_{a}).
La SDS-PAGE reveló una banda a 55 kDa
aproximadamente para la pituitaria ovina (57 kDa en pituitaria
bovina), que fue completamente eliminada en presencia de GHRH_{a}
10 nM; esta banda fue reducida más de un 50% por GTP\gammaS 50
\muM, y no se vio afectada por VIP 100 nM. Por tanto, la banda de
55 kDa es debida al fotoentrecruzamiento del
GHRH-R. La figura 3 muestra que esta banda de 55
kDa específica es separada de la mayoría del material entrecruzado
de manera no específica mediante extracción con CHAPS. La figura 4
demuestra la competición con GHRH_{a} 10 nM. La figura 5
demuestra el efecto de GTP\gammaS sobre el entrecruzamiento.
El tratamiento con neuraminidasa del receptor de
GHRH entrecruzado hizo que la banda de 55 kDa se desplazara hasta
50 kDa, lo cual es atribuido a la eliminación de grupos de ácido
siálico terminales cargados que disminuyen la movilidad en el gel
(figura 5). El tratamiento del receptor de GHRH entrecruzado con una
mezcla libre de proteasas, purificada, de endoglicosidasa F y
N-glicosidasa F (disponibles en Boehringer Mannheim
de Indianapolis, Indiana) originó un desplazamiento de la movilidad
en el gel para formar una banda a 45 kDa (mostrado en las figuras 3
y 4); esto indica que el receptor de GHRH es una glicoproteína unida
a N (común entre los receptores unidos a proteína G) y sugiere el
tamaño de la cadena proteica desglicosilada. Este tamaño es
consistente con la estructura de los receptores de VIP y
secretina.
Los ensayos con lectinas inmovilizadas no
mostraron unión del receptor de GHRH entrecruzado a aglutinina de
germen de trigo, ricina, aglutinina de Limulus o concanavalina A.
Esto hace al receptor inusual y ofrece una aproximación para la
purificación y el aislamiento de este receptor a partir de otros
receptores que se unen a estas lectinas. Después del tratamiento
con neuraminidasa y \beta-galactosidasa, el
receptor se unió específicamente a aglutinina de cacahuete,
proporcionando una aproximación adicional a la separación y
purificación del receptor de GHRH.
El entrecruzamiento de fotoafinidad mostró que
los complejos receptor-ligando acoplados
covalentemente son solubles en una solución de un detergente suave,
preferiblemente una solución que contenga CHAPS. La preincubación
de GHRH con el receptor, utilizando las condiciones del ensayo de
unión de membranas mencionado anteriormente, permitió la extracción
con CHAPS y la solubilización de un complejo
receptor-ligando intacto incluso cuando no estaba
entrecruzado. Este complejo fue detectado mediante contaje gamma
después de la extracción con detergente de membranas incubadas con
^{125}I-GHRH_{a} (GHRH_{a} "caliente")
sin entrecruzamiento.
La figura 6 muestra que la mayoría de las
cuentas específicas observadas en la membrana bruta fueron extraídas
con CHAPS como un complejo específico asociado con el receptor. Los
datos para la figura 6 fueron obtenidos según sigue. Se permitió
que GHRH_{a} radioyodado se uniera a membranas brutas de
pituitaria ovina en presencia o ausencia de GHRH_{a} no marcado
10 nM. Esto fue seguido por extracción con detergente y
centrifugación; los sobrenadantes fueron tratados posteriormente
con carbón vegetal/dextrano para separar la proteína unida del
GHRH_{a} libre, y se contó el radioyodo de cada fracción. El
GHRH_{a} marcado unido a la membrana bruta pudo ser de esta forma
seguido después del tratamiento con detergente y caracterizado como:
(1) insoluble, (2) soluble y unido de manera no específica, (3)
unido específicamente pero disociado por el detergente o (4)
soluble y unido específicamente. Como se sabe del
fotoentrecruzamiento, la mayoría de las cuentas unidas de manera no
específica no eran solubles en CHAPS. La extracción con una mezcla
de detergente desoxicolato solubilizó ligeramente más cuentas
totales, pero muchas de ellas eran inestables y se disociaron, y
predominaron las cuentas no específicas.
La figura 7 muestra los resultados de este
fotoentrecruzamiento para confirmar que este complejo contenía el
receptor. Las membranas fueron preunidas con la fotosonda
(^{125}I-ANB-NOS-GHRH_{a})
en la oscuridad, extraídas con CHAPS y luego entrecruzadas con UV.
Esto demuestra que la GHRH estaba todavía unida al receptor
solubilizado. En el extracto de CHAPS, la mayoría de la unión estaba
en la banda del receptor de 55 kDa mientras que en el caso del
desoxicolato la mayoría de las bandas eran inespecíficas. Esto
concuerda bien con los estudios de unión mostrados en la figura 6
(aunque las fotosondas tienen una unión no específica más elevada),
y demuestra que la unión específica del análogo de GHRH en los
complejos solubles es al receptor de 55 kDa. Consistente con la
figura 6, el complejo era mucho más estable en CHAPS que en
desoxicolato. Había también pocas bandas no específicas (una está
justo por debajo de la banda del receptor de 55 kDa) después del
fotoentrecruzamiento del extracto de CHAPS.
La figura 8 demuestra que la extracción con
CHAPS da lugar a un ensayo de unión mejorado con cuentas no
específicas enormemente reducidas y una sensibilidad incrementada
(comparar con la figura 1). Esta figura muestra también que el
complejo es parcialmente disociado por GTP\gammaS 50 \muM,
sugiriendo que las proteínas G están todavía asociadas con el
complejo solubilizado en una solución de detergente conteniendo
CHAPS. La figura 1 muestra que DTT 1 mM impedía la unión específica
antes de que fuera añadida la GHRH. La figura 8 muestra solamente
un efecto parcial de DTT 20 mM después de que hubiera tenido lugar
la preunión. Este complejo era también bastante estable en NaCl
hasta 1 M durante una noche a 4ºC, pero fue disociado completamente
por Triton X-100 al 1% (surfactante). Observar el
bajo fondo obtenido cuando se utilizan muestras solubles en CHAPS,
tratadas con carbón vegetal/dextrano para un ensayo de unión.
La estabilidad respecto al pH del complejo
soluble receptor-ligando se muestra en la figura 9.
Hay una transición brusca con el complejo inestable a pH 5,5 e
inferior, estable y capaz de intercambiar la GHRH unida con GHRH
libre entre pH 5,5 y 6, y muy estable y no intercambiable a pH 7. La
estabilidad de este complejo nos proporciona un ensayo de unión de
GHRH-R mejorado y la base para una nueva metodología
de purificación del receptor.
Se desarrollaron análogos de GHRH biotinilados
con el objetivo de purificar el receptor de GHRH como un complejo
receptor-ligando que puede ser retenido en
estreptavidina inmovilizada. El primer análogo ensayado fue
[His^{1},
Nle^{27}]-GHRH-(1-32)-NH_{2}
(GHRH_{a}) biotinilado en las lisinas de las posiciones 12 y/o 21
utilizando el reactivo con N-hidroxisuccinimida
NHS-LC-Biotina (disponible en
Pierce). Este análogo fue yodado en la tirosina de la posición 10 y
resuelto como formas mono y dibiotiniladas en HPLC. Más de un 90% de
estos productos se unieron a la estreptavidina inmovilizada en 30
minutos. El GHRH_{a} monobiotinilado tenía una afinidad de unión
al receptor reducida dos veces en comparación con GHRH_{a},
mientras que el dibiotinilado tenía una actividad próxima a cero.
El grupo biotina parece estar en la cavidad de unión del receptor,
ya que la unión a estreptavidina bloqueaba la unión al receptor. El
siguiente análogo ensayado fue [His^{1}, Nle^{27},
Cys^{33}]-GHRH-(1-33)-NH_{2}.
Tiene una fuerte tendencia a dimerizarse y ninguna de las especies
que podían desplazar a GHRH_{a} en un ensayo de unión de
competición estaba biotinilada.
Se descubrió sorprendentemente que [His^{1},
Nle^{27},
Biotina-Lys^{41}]-GHRH-(1-41)-NH_{2}
(referido en la presente como GHRH_{b}) se une al receptor con
una afinidad comparable a la de GHRH_{a} (una fuente preferida
para preparar GHRH_{b} es Nuros Corporation de San Jose,
California). Para demostrar que este análogo podía ser utilizado en
la purificación del receptor, fue yodado, se le incorporó un grupo
de entrecruzamiento fotosensible (ANB-NOS) y se
purificó el compuesto mediante HPLC. Esta
yodo-biotinil-fotoactivable GHRH,
^{125}I-GHRH_{b}-ANB-NOS,
fue unida a receptores de membranas brutas de pituitaria bovina.
Los complejos receptor-ligando fueron solubilizados
en CHAPS, tratados con carbón vegetal/dextrano para eliminar la GHRH
libre y unidos a estreptavidina inmovilizada.
\newpage
Con el fin de comprobar si la estreptavidina
separaba el receptor del complejo, las muestras fueron entrecruzadas
con UV antes y después de la unión a estreptavina y analizadas
mediante autorradiografía. Esto demostró que una fracción
significativa (30%) del receptor que estaba disponible para la unión
pudo ser retenida sobre las esferas de estreptavidina. Los estudios
de estabilidad del complejo soluble receptor-ligando
(ver la figura 9) indican que un lavado con una concentración
elevada de sal (NaCl 0,5 M) de las esferas de estreptavidina
seguido por una elución a pH bajo (pH 5) (utilizando preferiblemente
una solución de tampón fosfato, acetato, citrato u otro tampón
adecuado) tiene como resultado una purificación significativa del
receptor para producir un aislado de GHRH-R. El
aislado de GHRH-R obtenido es de pureza suficiente
para permitir la secuenciación del GHRH-R; las
proteínas G y otros contaminantes que interfieren son eliminados
mediante métodos tales como, pero no limitándose a, electroforesis
en gel para obtener GHRH-R de una pureza al menos
suficiente para realizar la secuenciación.
La figura 10 demuestra los resultados de la
purificación por afinidad del complejo del receptor biotinilado
(GHRH_{b}-GHRH-R) en una columna
de agarosa estreptavidina. Las esferas de agarosa, que tenían unido
el complejo, fueron lavadas en NaCl 0,5 M para minimizar la unión
no específica y posteriormente el receptor fue disociado del
ligando biotinilado a pH 5,0 y eluido de la columna. El eluato fue
concentrado por ultrafiltración llevada a cabo en una centrífuga y
analizado por SDS-PAGE. Se procesó una columna
control en paralelo y se trató de manera idéntica excepto en que
los complejos solubles del receptor fueron preunidos al análogo
GHRH_{a} no biotinilado. La calle de GHRH_{b} de este gel
teñido con plata muestra bandas a 52 y 45 kDa que no se ven en la
calle de GHRH_{a}. La banda de 52 kDa corresponde al tamaño
esperado para el receptor, ya que la banda de 55 kDa observada en
los estudios de entrecruzamiento incluye el péptido GHRH_{a} de
3,6 kDa unido covalentemente. La banda de 45 kDa es el tamaño
descrito para la proteína G estimulante G_{g}, que se cree que es
una subunidad del complejo del receptor de GHRH. La coelución de
estas dos bandas y su ausencia en la columna control confirma que
se ha preparado GHRH-R altamente purificado.
Los ejemplos no limitantes siguientes demuestran
adicionalmente el ensayo de unión de GHRH mejorado de la presente
invención y el método para purificar el receptor de GHRH basado en
la solubilización de un complejo GHRH/receptor de GHRH intacto.
Debe comprenderse que puede utilizarse una amplia variedad de otros
materiales distintos de los mencionados específicamente en la
presente para practicar la invención sin una experimentación
excesiva.
Todas las etapas fueron realizadas a 4ºC.
Pituitarias anteriores ovinas o bovinas congeladas (ovina: 1
g/pituitaria aproximadamente obtenida del Dr. Iain Clarke,
Melbourne, Australia; bovina: 2,5 g/pituitaria aproximadamente de
manipulación especial procedente de Pel-Freez, de
Rogers, Arkansas) fueron lavadas de sangre, limpiadas de tejido
conectivo y homogeneizadas (utilizando un homogenizador Dounce) en
tampón HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, EGTA 0,1 \muM, pH
7,4 con PMSF 0,5 mM (fluoruro de fenil metil sulfonilo), leupeptina
10 \mug/ml, pepstatina A 10 \mug/ml y 200 U/ml (unidades/ml) de
aprotinina. Este tampón es utilizado para eliminar el GTP endógeno
que podría estar unido a las proteínas G y para restaurar la unión
de alta afinidad. El homogenado fue centrifugado a velocidad máxima
en una microfuga y se desechó el sobrenadante. La capa superior
(membranas) de la pella fue luego resuspendida suavemente en tampón
de unión que contenía tampón Tris 50 mM, EGTA 5 mM, MgCl_{2} 5
mM, alameticina 50 \mug/ml, bacitracina 30 \mug/ml y otros
inhibidores de proteasas igual que anteriormente.
Se incubaron 1/50 equivalentes de pituitaria por
tubo en tampón de unión con 100.000 cuentas aproximadamente de
sonda yodada en un volumen de 500 \mul a temperatura ambiente
durante 1 hora. Se determinó el total de cuentas suministrado y el
porcentaje de cuentas unido para cada tubo con 3 a 6 replicados por
condición experimental. Se analizaron los perfiles de la unión de
saturación con el programa de ordenador Ligand que realiza un ajuste
de mínimos cuadrados ponderado estadísticamente a la ecuación de
unión del ligando exacta en coordenadas no transformadas. Las
medidas estadísticas (test F y test de rachas) indicaban un ajuste
convincentemente bueno a un modelo de un único sitio de unión. Un
análisis representativo de la unión de saturación se presenta en la
figura 2.
El tratamiento del tejido con EDTA 10 mM fue
esencial para permitir la eliminación de GTP endógeno y para
revelar la alta afinidad de los sitios dependientes de GTP.
Inicialmente, la unión no específica fue abrumadora y una amplia
variedad de agentes bloqueantes no produjeron ninguna mejora. Se
observaron señales de unión ligeramente mejores en las fracciones
de membrana purificadas mediante centrifugación en gradiante de
densidad de sacarosa. Con el fin de obtener resultados
consistentes, se prepararon muestras abundantes de membranas brutas
a partir de pituitarias congeladas y se congelaron alícuotas de esta
membrana para un ensayo posterior. Con referencia a la figura 1, se
observó un gran incremento de la unión específica cuando se
ensayaban las membranas directamente después de la homogeneización.
Un posible mecanismo de este efecto
congelación-descongelación es la formación de
vesículas que interfieren con el ensayo. Al analizar esta
posibilidad, se encontró que el antibiótico formador de poros
alameticina (50 \mug/ml) incrementaba 3 veces la relación unión
específica/unión total, según se ilustra gráficamente en la figura
1. La mayor parte de este incremento era debido a una disminución
de la unión no específica, debido probablemente a la liberación de
sonda atrapada en las vesículas. Se incluyó un lavado adicional de
las pellas de membranas mediante centrifugación para maximizar el
incremento de la unión específica sobre la unión no específica a
pesar de la pérdida de cuentas totales recuperadas.
El análisis mediante ordenador de los estudios
de unión de saturación con el programa Ligand, indica un único
sitio de unión con una Kd = 158 \pm 13 pM y que el número total de
sitios de unión específica (RT) es 1,5 \pm 0,09 pmoles/g de
tejido (mejor valor de ajuste \pm error estándar aproximado de las
medias (ESM)). Debido a que la afinidad por GHRH_{a} se
corresponde con la potencia biológica de GHRH_{a} y debido a que
la especificidad para GHRH sobre los péptidos relacionados (no hay
competición con VIP o PACAP 100 nM) y la sensibilidad a
GTP\gammaS 50 \muM y a DTT 1,0 mM, esta unión indica la
presencia de GHRH-R.
La comparación de
^{125}I-GHRH_{a} con una GHRH humana yodada
comercialmente disponible (Amersham, Arlington Heights, IL) mostró
una elevada similitud; ^{125}I-GHRH_{a} mostró
una unión específica ligeramente mejor y un efecto de GTP algo más
potente.
Se prepararon dos sondas de fotoafinidad
diferentes utilizando agentes de entrecruzamiento fotorreactivos
heterobifuncionales disponibles en Pierce según se discutió
anteriormente (Rockford, IL). SANPAH fue acoplado a GHRH_{a}
dirigido a la histidina N-terminal utilizando un
sistema de solventes de DMF. ANB-NOS fue acoplada a
GHRH_{a} dirigida a las lisinas 12 ó 21. Cada producto grupo de
acoplamiento-GHRH_{a} fue purificado por HPLC,
yodado y repurificado.
La unión de las fotosondas a las membranas fue
evaluada con un ensayo de unión a membranas brutas y luego
analizada posteriormente mediante electroforesis en
SDS-PAGE para identificar los sitios de unión. Las
fotosondas fueron incubadas en la oscuridad, fotolisadas durante 10
minutos con una lámpara UV de onda larga (366 nm), y las muestras
fueron luego aglutinadas. Las pellas fueron contadas y luego
extraídas mediante ebullición directamente en tampón de muestra SDS
(extractos totales en SDS). Alternativamente, las pellas marcadas
fueron extraídas en una solución de detergente suave (CHAPS 5 mM),
centrifugadas y los sobrenadantes concentrados en
cloroformo/metanol desnaturalizados con tampón SDS (extractos en
CHAPS). Estas muestras fueron luego sometidas a electroforesis en
geles de SDS y autorradiografiadas.
El ensayo de unión reveló que ambas fotosondas
se unían a las pellas de membranas, y podían ser desplazadas
totalmente por GHRH_{a} 10 nM, o parcialmente desplazadas por
GTP\gammaS 50 \muM. Ambas daban una unión no específica mayor
que ^{125}I-GHRH_{a}. Los geles de los extractos
totales en SDS de las pellas entrecruzadas por afinidad mostraban
esta unión no específica como bandas no afectadas por GHRH_{a} ni
por GTP\gammaS. Estas bandas no específicas diferían algo de
proceso a proceso y entre las dos sondas (figura 3). El detergente
no iónico CHAPS es un débil solubilizador de proteínas; el trabajo
de purificación de los receptores demostró la capacidad de las
soluciones que contenían CHAPS para solubilizar la actividad de
unión a GHRH. Cuando se examinaron los extractos de las pellas
entrecruzadas obtenidos mediante la utilización de una solución que
contenía CHAPS 5 mM en geles de SDS, la visualización del
entrecruzamiento del receptor mejoró mucho, ya que la mayoría de
las proteínas marcadas de manera no específica no estaban
solubilizadas. Con referencia las figuras 3 y 4, una banda de 55
kDa cuyo marcaje está enormemente afectado por GHRH_{a} o
GTP\gammaS, es claramente visible con ambas sondas y representa
el GHRH-R. Estas fotosondas son inestimables para la
caracterización, purificación y clonaje posteriores del receptor de
GHRH.
Como se sabe que la porción extracelular de la
mayoría de los receptores de membrana unidos a proteína G contiene
múltiples grupos carbohidrato unidos covalentemente a residuos de
arginina (unidos a N), se realizaron experimentos para confirmar
que la banda fotomarcada específicamente en las figuras 3 y 4 es una
glicoproteína unida a N. Las muestras fueron tratadas con una
mezcla de endoglicosidasa F y N-glicosidasa F
purificada, libre de proteasas.
Las pellas fotomarcadas (extraídas utilizando
SDS o CHAPS) fueron hervidas en tampón de muestra SDS, diluidas e
incubadas durante una noche a 37ºC con Nonidet P-40
al 1,25% (un detergente no iónico conocido también como
NP-40) en 0,5 unidades de glicosidasa o en blanco.
Estas muestras fueron luego concentradas mediante un protocolo de
precipitación en cloroformo-metanol (ver Wessel y
col., Anal. Biochem., 138:141-143 (1984)) y
sometidas a electroforesis en geles de SDS.
Con referencia las figuras 3 y 4, puede
observarse que la movilidad de la banda fotomarcada específicamente
se desplaza desde 55 kDa aproximadamente hasta 45 kDa
aproximadamente sólo en presencia de glicosidasa. Otras bandas,
visibles en las muestras extraídas con SDS, y que se consideró que
no estaban marcadas específicamente por la falta de respuesta a
GHRH_{a} o GTP\gammaS, no están desglicosiladas. Ésta es la
primera prueba de que el GHRH-R es una
glicoproteína, y proporciona la mejor estimación del tamaño
verdadero de la cadena proteica. Según se muestra en la figura 5,
el tratamiento del receptor fotomarcado con neuraminidasa produjo
un desplazamiento de la movilidad del gel hasta 52 kDa
aproximadamente. Esto demuestra que el receptor tiene varios grupos
de ácido siálico terminales en sus cadenas oligosacarídicas. Estos
grupos de ácido siálico afectan también al pI del receptor, según
se observa en los geles de enfoque isoeléctrico, en la
hidrofobicidad en HPLC y también en sus propiedades de unión a
lectinas. La desglicosilación es útil en las estrategias de
purificación y para facilitar el corte proteolítico del receptor
para su secuenciación.
Las preparaciones de membranas de pituitaria
solubilizadas en soluciones que contenían CHAPS mostraron solamente
sitios de baja afinidad insensibles a GTP (Kd 500 nM
aproximadamente), según se midió con un ensayo de unión a carbón
vegetal/dextrano (adaptado del desarrollado para VIP por Paul y
col., J. Biol. Chem., 262:158-162 (1987)).
Otros detergentes conservaban incluso menos unión, lo cual indica
que el GHRH-R no era estable a estos tratamientos.
Los resultados del entrecruzamiento de fotoafinidad revelaron que el
complejo receptor-ligando acoplado covalentemente
es soluble en una solución que contenga CHAPS. La preincubación de
GHRH con el receptor utilizando las condiciones del ensayo de unión
en membranas de la presente invención, seguido por extracción con
una solución de detergente suave, conteniendo preferiblemente CHAPS,
reveló la solubilización de un complejo
receptor-ligando intacto. Este complejo soluble fue
detectado mediante la extracción con detergente de membranas
incubadas con el análogo de GHRH marcado con ^{125}I, o con el
análogo de GHRH marcado con ^{125}I después del tratamiento con
GHRH fría 10 nM.
El análogo de GHRH biotinilado fue utilizado
posteriormente para formar un complejo soluble
GHRH_{b}-GHRH-R, y este complejo
soluble, después de la extracción utilizando CHAPS y de purificación
con carbón vegetal/dextrano, fue procesado sobre una columna de
estreptavidina. La columna de estreptavidina fue luego lavada con
una solución de NaCl y posteriormente se corrió por la columna una
solución tampón que tenía un pH de 5,0 con el fin de producir un
aislado de GHRH-R.
El aislado de GHRH-R puede ser
luego purificado adicionalmente mediante SDS-PAGE.
Una banda que aparecía a 52 kDa aproximadamente (correspondiente a
GHRH-R puro) puede ser transferida a una membrana
estándar de PVDF. La membrana de PVDF que tiene sobre ella
GHRH-R purificado puede ser luego digerida sobre la
membrana y secuenciada para obtener la secuencia de residuos de
aminoácidos completa o parcial del GHRH-R siguiendo
métodos de secuenciación convencionales.
La secuencia o secuencias de residuos de
aminoácidos obtenidas de la etapa de secuenciación pueden ser luego
utilizadas como base para producir sondas degeneradas para ser
utilizadas en el clonaje del gen responsable de la producción de
GHRH-R.
Por tanto, se ha descrito una metodología
mejorada para medir la unión de análogos de GHRH al receptor de
GHRH en membranas de pituitaria ovina y bovina (incluyendo métodos
de yodación, purificación y suministro de análogos de GHRH y la
utilización de antibióticos formadores de poros). Esto condujo al
desarrollo de métodos para el fotomarcaje de alta afinidad,
específico de GHRH, sensible a GTP, del receptor de GHRH. Tal
marcaje de este receptor no se había realizado previamente. Esto
permitió la caracterización del tamaño, de la glicosilación, de la
solubilidad y de otras propiedades del receptor. Esto condujo al
descubrimiento de que una solución de detergente suave, incluyendo
compuestos tales como CHAPS, podía extraer el complejo
GHRH-receptor de GHRH unido en una forma estable,
soluble. La extracción con CHAPS y el tratamiento con carbón
vegetal/dextrano (para unir la GHRH libre) produce un complejo
soluble receptor-ligando que es purificado a partir
de la mayoría de la unión de GHRH no específica, y es por tanto muy
útil como un nuevo ensayo de unión de GHRH con bajo fondo y con
mejor sensibilidad de la que había sido posible previamente, y
también como un punto de partida para la purificación del receptor.
Este complejo receptor-ligando es relativamente
estable a los lavados con sal, al intercambio con GHRH y al
tratamiento con GTP o DTT, pero no a la disminución del pH. Se ha
inventado un análogo de GHRH biotinilado en
C-terminal que, cuando está unido en un complejo de
GHRH-R soluble, permite la purificación del
receptor de GHRH por retención en una columna de estreptavidina
inmovilizada, seguido por un lavado con sal y elución a pH 5. Esta
proteína del receptor purificada es adecuada para la secuenciación
parcial de los péptidos del receptor y esta información de la
secuencia es valiosa para el clonaje del ADNc del receptor de
GHRH.
De las descripciones anteriores, es obvio que
son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente
invención. A manera de ejemplo no limitante, se contempla que otros
complejos de GHRH-R en muestras de pituitaria bruta
pueden ser unidos a columnas de afinidad con el fin de producir
GHRH-R purificado. Debe entenderse, por tanto, que
la invención puede ser practicada de otro modo que el
específicamente descrito.
Claims (4)
1. Procedimiento para la identificación de
complejos receptor-ligando específicos para la
hormona que libera la hormona del crecimiento que comprende:
- a)
- marcaje del ligando;
- b)
- incubación del ligando marcado con pellas de membrana que comprenden el receptor de la hormona que libera la hormona del crecimiento;
- c)
- medición del ligando total unido;
- d)
- incubación del ligando marcado con pellas de membrana que comprenden el receptor de la hormona que libera la hormona del crecimiento en presencia de ligando no marcado;
- e)
- medición del ligando total unido; y
- f)
- determinación de la unión específica,
caracterizado porque las etapas de
incubación b) y d) se llevan a cabo en presencia de un antibiótico
formador de poros.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que el ligando es un análogo o fotosonda de la hormona que
libera la hormona del crecimiento.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que el ligando está yodado.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que el antibiótico formador de poros es alameticina.
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