JPH07500614A - 成長ホルモン放出ホルモン受容体の単離およびその特徴づけ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １２、ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯ３（ＧＨＲＨａは［Ｈｉｓ’、ＮＩｅ！７］　 −ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ！　テ、ｉ５す、ＡＮＳ−ＮＯＳはＮ−５−ア ジドー２−二トロペンゾイルオキシスクシンイミドである）である「請求項１０ Ｊの類縁体。

＋３．　Ｎ−５−アジド−２−二トロベンゾイルオキシスクシンイミドをＧＨＲ Ｈ類縁体［Ｈｉｓ’、Ｎｌｅ”コーＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ，とカップリ ングさせる工程からなるホトアフィニティープローブの製造方法。

１４　スルホスクシンイミジル−６−（４’　−アジド−２゛−ニトロフェニル アミノ）ヘキサノエートをＧＨＲＨ類縁体［Ｈｉｓ’、Ｎｌｅ”］　−ＧＨＲＨ −（１−３２）　−ＮＨ２のＮ−末端ヒスチジンにカップリングさせるフォトア フィニティープローブの製造方法。

１５、　ＧＨＲＨを和製下垂体前菜組織と穿孔形成抗生物質の存在下に接触させ る工程からなる粗製下垂体前葉組織に成長ホルモン放出ホルモンを結合させる方 法。

１６、抗生物質は約０．０５ｍｇ／ｍｌ存在するアラメチシンである［請求項１ ５Ｊの方法。

１７、成長ホルモン放出ホルモンまたは成長ホルモン放出ホルモン類縁体を、成 長ホルモン放出ホルモンまたは成長ホルモン放出ホルモン類縁体をヨード化する のに十分なヨード化基質と接触させる工程からなる、成長ホルモン放出ホルモン 受容体プローブの製造方法。

１８、　ヨード化された成長ホルモン放出ホルモンまたは成長ホルモン放出ホル モン類縁体は、ヨード化に続？ＡてＨＰＬＣて精製する［請求項＋７Ｊの方法。

１９、［請求項４」の方法で製造された成長ホルモン放出ホルモン受容体単離体 。

２０、「請求項７」の方法て製造された成長ホルモン放出ホルモン受容体単離体 。

２１、天然に見出されるよりも高濃度で存在する成長ホルモン放出ホルモン受容 体からなる組成物。

明　細　書 本発明は、ホルモン受容体の単離およびその特徴づけを意図するものであり、さ らに特定すれば、成長ホルモン放出ホルモン受容体の精製およびその特徴づけに 作用な方法および組成物、ならびに精製された成長ホルモン放出ホルモン受容体 の単離を意図するものである。

発明の背景 成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）は、視床下部によって分泌され、下垂体 前葉からの成長ホルモン（ＧＨ）の放出を刺激する。ＧＨＲＨは、グルカゴン、 セクレチン、ＶＩＰ　（バソアクティブ・インテステイナル・ペプチド）、ＰＨ １（ペプチド・ヒスチジン・イソロインン）、ＰＡＣＡＰ　（下垂体アデニルサ イクラーゼ活性化ペプチド）、ＧＩＰ（ガストリック・インヒビトリー・ペプチ ド）およびヘロデルミンを包含する同種ペプチドファミリーのｌ員である。ＧＨ ＲＨは、これまてかなりの研究の課題とされてきたが、ＧＨＲＨが下垂体前葉に おいて結合してＧＨの放出を誘導するＧＨＲＨ受容体、ＧＨＲＨ−Ｒについては ほとんと知られていない。

クローン化されたＧＨＲＨ受容体を大規模に製造できれば、多数のＧＨＲＨ類縁 体のスクリーニングが可能になり、成長障害の臨床的治療用の改良されたアゴニ ストおよびアンタゴニストの開発か促進されるものと思われる。さらに詳しくは 、Ｇ　ＨＲ，Ｈ活性について多数の類縁体および生体異物をスクリーニングする ことにより、成長ホルモン欠ｔｍ小児の臨床治療、ならびに栄養の改善および体 組成（筋肉対脂肪比）の変化のための成人の臨床治療に使用する改良アゴニスト の開発を導くことか可能と思われる。このようなスクリーニングからは、多分受 容体構造に基づくコンピューターモデリングの支援を受けて、経口的に活性な非 ペプチドＧＨＲＨアゴニストを誘導することも可能であろう。これらは医学およ び獣医学の領域において、たとえば乳汁産生率の高い、また脂肪分の少ない肉の 収率の高い家畜の開発などに、とくに作用と考えられる。

ＧＨＲＨ−Ｒと相互作用する薬剤の工業的開発には、ＧＨＲＨ−Ｒの精製梨原体 と適当な結合アッセイが要求されることになる。

ＧＨＲＨ受容体の単離およびクローニング、ならびにそのｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現 はまた、（１）　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーション研究にょるＧＨＲＨ受 容体の生体内全体における分布地図の作成、ならびに下垂体外におけるそれらの 生理的役割の可能性の検討、これは、このペプチドが濃縮されていると考えられ る脳、生殖腺、膵臓、胎盤および消化管におけるＧＨＲＨの役割を明らかにする がもじれない、（２）特別に設計されるアゴニスト／アンタゴニスト分子をめて 構造／機能相関および第二メツセンジャー相互作Ｉｎを検討するための、突然変 異またはキメラ受容体を含めた受容体構造の研究、（３）池のＧ−蛋白結合受容 体、とくにグルカゴン／セクレチン／ＶＩＰファミリーにおける受容体に対する ＧＨＲＨ−Ｈの進化論的関係の理解、（４）配列に類似性をもっことが期待され るこのサブファミリーの池のメンバーのクローニング、を可能にするものと思わ れる。

機能的受容体クローンの獲得に対してはいくつかの別ルートがある。たとえば、 Ａ１部分蛋白配列を得るための受容体蛋白の精製：この部分蛋白配列はついで相 当するヌクレオチド配列についての適当なりＮＡのスクリーニングに使用できる ものと思われる、Ｂ、ＧＨＲＨ受容体に関連すると考えられる既知の受容体に類 似の配列についてのＤＮＡのスクリーニング、Ｃ１蛋白として発現した場合に、 ＧＨＲＨ結合、生物学的活性、もしくはＧＨＲＨ受容体抗体によって検出される ＧＨＲＨ受容体を生しるＤＮＡのスクリーニングである。考えられるクローニン グ法はいずれも、ＧＨＲＨ受容体を同定し、発現クローンを特徴づけるために、 ＧＨＲＨおよび関連ペプチドとの結合アッセイならびに機能的アッセイを要求す ることに注目すべきである。

したがって、ＧＨＲＨ受容体の特徴づけおよび単離に役立つＧＨＲＨ結合アッセ イならびにそれに用いられる組成物か要求される。とくに、受容体蛋白の精製お よび受容体クローンの同定のための方法の開発力可能になるように、大きさ、グ リコンレーション、溶鼾性および受容体（ＧＨＲＨ−Ｒ）−リガンド（Ｃ；ＨＲ ＨまたはＧＨＲＨ類縁体）複合体の安定性に関して、下垂体ＧＨＲＨ受容体を特 徴づけることができる方法が必要である。また、精製または部分精製ＧＨＲＨ− Ｒならびにそれらを得るための方法が必要である。部分精製ＧＨＲＨ−Ｈの語は 、ＧＨＲＨ−Ｒ単離体が、下垂体前葉細胞の大部分の器質性マトリックスから単 離されて形成されていることを意味する。ＧＨＲＨ−Ｒ単離体はＧｆ（ＲＨ−Ｒ の配列の決定を可能にする十分な純度を有するが、これは、配列決定を妨害する 可能性がある残存化合物たとえばＧ−蛋白を除去するために、さらに精製を必要 とする場合もあることを理解すべきである。しかしながら、本発明の抽出および ＃ｉ醸方法をＩｎいて製造される本発明のＧＨＲＨ−Ｒ単離体は、好ましくはＧ ＨＲＨ−Ｒが天然に下垂体前葉中に存在する濃度よりも高濃度にＧＨＲ，Ｈ−Ｒ を含有し、このＧＨＲＨ−Ｒ単離体は、ＧＨＲＨ−Ｒの配列決定を妨害する可能 性のある化合物を除去するために、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、必要に応しさら に精製することができる。すなわち、本発明はまた、配列決定の実施またはＧＨ ＲＨ−Ｒ結合活性の生物学的検定における使用に十分な純度のＧＨＲＨ−Ｒの製 造を包含する。

歴史的にいえば、ＧＨＲＨ−Ｒは極めて高い非特異的な結合を存しくＧＨＲＨま たはＧ　ＨＲＨ類縁体がＧＨＲＨ−Ｈに特異的に結合するが否かの測定を困難に する）、またＧＨＲＨ−Ｒの存在量が極めて低いので、ＧＨＲＨ−Ｒについての 研究は困難であった。ＧＨＲＨ−Ｒ類縁体のガラスまたはプラスチック器具への 非特異的結合は、従来の研究の大きな問題点てあり、受容体結合の研究の正確さ 、および再現性には限界があった。陰性に荷電したＧＨＲＨペプチドの本質であ る「粘着性」のために、単純な濾過型の結合アッセイの使用は不可能であった。

非特異的なカウントか極めて高いので、特異的結合の検出が妨げられる。しかも 、ガラスｌ＆維フィルターに対する蛋白の非特異的結合の遮断に一般的に用いら れる遮断剤のポリエチレンイミンは陽性に荷電していて、これもＧＨＲＨ類縁体 （陰性に荷電している）を非特異的に結合することになる。さらに、ＧＨＲＨ− Ｒの精製効果を著しく増進させることが期待できる、高結合親和性を有する可溶 性受容体ブレノルーンヨンもＩＩＪられてぃない。

以ｍ１の研究から、ＧＨＲ’Ｈ受容体については、プローブたとえばＧＨＲＨお よび関連ペブ刊・・＼の親和性ならひにＧ−蛋白・＼の結合に関する特性が明ら かにされている。また、ＧＨＲＨ受容体を標識するために、非特異的化学架橋剤 の使用も試みられている。たとえば、ｚｙｓｈらごＣｒｏｓｓ−Ｌｉｎｌｋｉｎ ｇ　ｏｆ　ａ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｌｌｏｒｍｏｎｅＲｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔ ｏｒ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ａｎｔｅｒｉｏｒ　Ｐｉｔｕｉ ｔａｒｙ　Ｃｅ１ｌｓ’、ＪAＢｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、　２６１　＋　１６７８（＋９８６）、ならびにＶｅｌｉｃｅｌ ｅｂｉ　らごＣｏｖａｌｅｎｔ　Ｃｒｏｓｓ−いｎｋｉｎｇ盾■ Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　ｔｏ　Ｐ ｉｔｕｉｔａｒｙ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ１′、Ｅｎｄｏｃｒ奄獅盾撃盾■凵@。

＋１８・＋２７８（１９８６）参照。これらの２つの研究の結果は、それぞれ、 下垂体前葉における２６ＫＤａおよび７０ＫＤａのＧＨＲＨ−受容体の存在を示 唆している。これらの２つの研究で見出された分子量間の不一致は、ＧＨＲＨ− Ｒの単離および特徴づけに関連する困難性、そしてまたＧＨＲＨ−Ｒの単離およ び特性解明に有用な、改良された方法および組成物の必要性を強調するものであ る。

ラット下垂体前葉へのＧＨＲＨ結合は、ＧＴＰによって影響されると考えられて いる。ＧＴＰは、ＧＨＲＨ−受容体のＧＨＲＨへの親和性の低下を引き起こす（ ＧＴＰはＧ−蛋白ＧＨＲＨ−受容体複合体を解離させるといわれる）。

ＧＨＲＨに結合したＧＨＲＨ−Ｒの高親和性状態は、グアニンヌクレオチド調節 蛋白との相互作用によって安定化され、ホルモン−受容体−Ｇ−蛋白の三者複合 体を形成すると考えられている。ＧＴＰはＧ−蛋白−受容体相互作用を不安定化 し、その結果、ＧＨＲＨ／ＧＨＲＨ−Ｒ−Ｇ−蛋白複合体の解離ならびに独立し た受容体の低親和性状態への復帰を生じ、一方、遊離したＧ−蛋白はそのそれぞ れの二次メソセンジャー系の活性化へ移行することになる。５ｔｒｕｔｈｅｒｓ ら、＋Ｎｕｃｌｅｏｊｉｄｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈ ｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉ獅■@ｔｏ　Ｒ ａｔ Ｐｉｔｕｉ　１ａｒｙ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 　、　＋４：２４−２９（１９８９）参照。

ヒツジおよびランの下垂体前葉組織において、Ｇ　ＨＲＨおよびその類縁体は、 ｖｒｐまたはＰＡＣＡＰよりも５００〜１．０００倍低濃度（７）ＧＨＲＨａで 置換されることが発見されている。この所見は、ＧＴＰの存在下でのアデニレー トノクラーセの刺激能の強さはセクレチン〉へロデルミン＞ＰＨＩ≧ＶＩＰ＞Ｇ ＨＲＨ（１２７）ＮＨ２の順序であることを示すヒト膵［１（セクレチンおよび ＶＩＰ受容体のソース）で認められた結合性を補足するものである。同様に、　 １′Ｉ−セクレチンを用いて得られたＫｄは、セクレチン０．ａｎＭ、へロデル ミン２００ｎＭ、ＰＰＨ１２５０ｎであった。ＶＩＰおよびＧＨＲＨ（＋−２９ ）−ＮＨ，は、１０μＭでわずか２０％の阻害を誘導するのみである。

超生理学的用凰ては、ＧＨＲＨはＶＩＰ受容体に作用し、逆にＶＩＰは弱いなが らＧ　ＨＲＨのアゴニストであることが知られている。

ホルモン受容体の単離および特徴づけに関しての背景情報を提供する他の文献は 次の通りである。

Ｃｈｒｉｓｊｏｐｈｅら、　”Ｔｈｅ　ＶＩＰ／ＰＨＩ／ｓｅｃｒｅｊｉｎ−ｈ ｅｌｏｄｅｒｍｉｎ／ｈｅｌｏｓｐｅｃｔｉｎ／ＧＨＲＦａ高奄撃凵F ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ｒｅ１ａｔｉｏｎｓｂｉｐ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｔｈｅｉｒ　Ｐ窒■モ浮窒唐盾窒■ ａｎｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｎａｌｏ（Ｂｓ　ａｓ　Ｔｅ５ｔｅｄ　ｉｎ　 ｖ目ｒｏ　ｏｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｄｅｎｙ撃≠狽■@Ｃｙｃ− １ａｓｅ　ｉｎ　ａ　Ｐａｎｅｌ　ｏｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、 ”ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａｓ　Ｐｒｏ■盾窒高盾獅■刀F Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ、　Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌｏｇｙ、　Ｊｅａｎ　Ｍａｒｊｉｎｅｚ編、Ｅh　Ｉ　ｉｓ １４ｏｒｗｏｏｄ　Ｌｉｎ刊、　１９８９．　Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｅｎｇ ｌａｎｄ。

Ｂａｂｕｒｔｈｅら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｖａｓｏ ａｃｔｉｖｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｃｅｐｔｏｒｓ：　 Ａ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ＶＩＰ　 Ｒｅ１ａｔｅｄ　ＰｅｐｔｉｄｅｓA”　Ａｎｎ、Ｎ。

Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　５２７：　２９６−３１３　（１９８８）。

Ｆｒｏｈｍ　ら、　”Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｈ ｏｒｍｏｎｅ、−Ｅｎｄｏｃｒ　Ｒｅｖ、、７：２２３−２T３（１９ ８６）。

５ｅｉｆｅｒｔ　ら、”Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−ＲｅＩｅａｓＩｎｇ　 Ｆａｃｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅｓ　ｉｎ　ＲａｔＡｎｔｅｒｉｏｒ　 Ｐｉｔｕｉ　ｔａｒｙ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ＋　Ｍｏｄ ｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ＧｌｕｃｏｃｏRｃｏｉｄｓ、” Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　、１１７：　４２４−４２６　（＋９８５）。

Ｂ１１ｅｚｊｋｊｉａｎら、−Ｄｅｓｅｎｓ山ｚａｔ】ｏｎ　ｔｏ　Ｇｒｏｗｔ ｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌｅａｓｊｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＲＦ）ｉｓ　Ａｓ ５ｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｄｏｗｎ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＲＦ −ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅｓ、”Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　、　１１８：　 ２０４５−２０５２　（１９８６）。

ｌ５ｈｉｈａｒａら、”ＦｕｎｃｔＩｏｎａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ 　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｊｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｎ盾魔■■ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆａｒ　Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｐ ｏ１ｙｐｅｐ＋ｉｄｅ、−Ｎｅｕｒｏｎ、８：８１１−８１X（１９９２）。

ｌ５ｈｉｈａｒａ　ら、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ@ｔｈｅ Ｓｅｃｒｅｒｉｎ　Ｒｅｃｅｐ＋ｏｒ、　−ＥＭＢＯＪ、、　ｌＯ：ｌ６３５− １６４１　（１９９１）。

Ｌｉｎ　らごＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａｎ　Ａｄｅｎｙ ｌａｊｅ　Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｃａ１ｃｉｔ盾獅奄■ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、−５ｃｉｅｎｃｅ、　２５４：　１０２２−１０２４　（１ ９９１）。

Ｊｕｐｐｎｅｒ　ら、”Ａ　Ｇ　Ｐｒｏｔｅｌｎ−Ｌｌｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐ！ ｏｒ　ｆｏｒ　Ｐａｒａ（ｈｙｒｏＩｄ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　≠獅■ Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ、 ”５ｃｉｅｎｃｅ、　２５４：　１０２４−１０２６　（１X９１）。

Ｆｒｏｈｍｎ　らごＴｉ５ｓｕｅ　Ｄｌｓｔｒｉｂｕｔｌｏｎ　ａｎｄ　Ｍｏｚ ｅｃｕ（ａｒ　Ｈｅｔｅｒａｇｅｎｅｉ　ｒｙ　ｏｆ　Ｈｕ高≠■ Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔ ｈｅ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｍｏｕｓｅ、”　Ｅｎｄｏｃ窒奄獅盾撃盾■凵B １２７二　２＋４９−２１５６　（１９９０）。

Ｐａｕｌら、”Ｃｈａｒａｃｊｅｒｊｚａｊｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ 　ｆｏｒ　Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　oｅｐ− ｔｉｄｅ　５ｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｌｕｎｇ、”Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ　、、２６２：　１５８−１６２　（１９８V）。

Ｇｕｉ　ｊａｒｒｏらご５ｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｃｔｉｖｅ　 ａｎｄ　５ｔａｂｌｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｖａ唐潤| ａｃｊｉｖｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍ　Ｒａｔ　Ｌ ｉｖｅｒ、　”Ｒｅｇｕｌａｒｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、@２５：３７−５０ （１９８９）。

ＣｒｏｎｉｎらごＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａ　Ｇｒｏ ｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔｏ■ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｂｙ　ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ、　”　Ａｌ１１．　Ｊ 、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、２４４（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍ■狽≠ａj：ε３４ ６− ε３５３　（１９８３）。

Ｌｅｏｎｇ　らごＥｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｊｒｏｐｅｓ　ａ ｎｄ　Ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｅｓ　ｉｎ　ＣｕｌｔｕｒｅｄＭａｌｅ　ａｎｄ　 Ｆｅｍａｌｅ　Ｐｉｊｕｉｉａｒｙ　Ｃｅｌ　Ｉｓ：　ＥｖＩｄｅｎｃｅ　ｉｎ 　Ｆａｖｏｒ　ｏｆ　ａ　Ｍａｒｔｔｎ盾唐盾高≠狽盾狽窒盾垂■ Ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、”Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１６°　１ ３７１−１３７８　（＋９８５）。

ＭｕｎｓｏｎらごＬｉｇａｎｄ：　Ａ　Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｉｚｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｆｏｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ奄■＝| ｔｊｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄ−ＢＪｎｄｒｎｇ　Ｓｙｓｊｅｍｓ、　”Ａｎａ ｌ、　ＢＩｏｃｈｅｍ、　、　１０７：　２２０−２３９　i＋９８０）。

ＷｅｓｓｅｌらごＡ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖ ｅ　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｄｉ撃浮狽■ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎ ｔｓ　ａｎｄ　Ｌｉｐｉｄｓ、”Ａｎａｌ、ＢｉｏｃｈｅｍA、１３８： １４＋−１４３（１９ｇ４）。

Ｂａｇｎａｔｏ　ら、−Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｇｒｏ翌狽■ Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　Ｃｕｌ　ｔｕｒｅ ｄ　Ｇｒａｎｕｌｏｓａ　Ｃｅ１ｌｓ、”Ｅｎｄｏｃｒｉｎ盾撃盾gｙ　。

１２８：２Ｂ８９−２８９４Ｃ１９９１）、　（ＦＪａｇｎａｒｏらによって研 究された組成物は下垂体ｔｉｎｓの結合特性とは異なるＧＨＲＨ結合特性を示し ている）。すへての文献および本明細書において言及した池の報告は、その全文 を参考として本明細書に導入する。

上述の研究はＧＨＲＨ−Ｒの挙動の予備的な理解の形成には役立ってはきたが、 ＧＨＲＨ−Ｒの精製およびクローニングを導＜ＧＨＲＨ−Ｒの更なる特徴づけを 可能にする、ＧＨＲＨ−Ｒの高感度で再現性のあるアッセイの必要性はまだ解決 されていない。このようなアッセイはＧＨＲＨおよびＧＨＲＨ類縁体の非特異的 結合、およびＧＨＲＨ−受容体の低い存在量という問題を克服するものでなけれ ばならない。ＧＨＲＨ＊縁体のヨード化および精製により得られる高い比活性が 、粗製下垂体前葉膜への特異的結合の改良を可能にする。

したがって、本発明の一次的な目的は、ＧＨＲＨ結合についての高感度で再現性 あるアッセイを開発することである。

本発明の池の目的は、ＧＨＲＨ−受容体を特異的かつ明瞭に標識する試薬を開発 することである。

本発明のさらに池の目的は、ＧＨＲＨ−受容体の精製体系を開発し、ＧＨＲＨ− Ｒの少なくとも部分配列の決定を可能にする十分な純度の、またはその純度に容 易に精製できるＧＨＲＨ−Ｒ単離体を得ることにあるしたがって、本発明のさら に他の目的は精製されたＧＨＲＨ−Ｒを製造するこ本発明のこれらのおよび他の 目的は、粗製ＧＨＲＨ−Ｒ抽出物（単離体）の特徴づけおよび単離に通しる改良 されたＧＨＲＨ結合アッセイによって達成される。

ＧＨＲ，Ｈ−ＲはＧＨＲＨ類縁体から形成される放射性ヨード化プローブの使用 によって特徴づけられる。ＧＨＲＨ類縁体（ＧＨＲＨａまたはＧＨＲＨｂ）およ び他の類縁体は、好ましい実施態様においては、固相ヨードビーズを用いてヨー ド化され、モノヨード化物質は実質的に担体を含まないように逆相ＨＰＬＣによ つ１　て精製される。ＧＨＲＨ類縁体の分配および希釈時におけるガラスおよび プラスチック器具への非特異的結合は、有機溶媒を１１１　ｕ　することによっ て実質的に俳除された。好ましい実施態様においては、ＧＨＲ，Ｈ類縁体の希釈 および分配には５０％のアセトニトリルをか使用される。粗製下垂体前葉膜ペレ ットに対するＧ　ＨＲＨおよびＧＨＲＨａの特異的結合は、穿孔形成抗生物質の 添加によって増大する。好ましい実施態様においては、抗生物質アラメチシン（ 約０．０５ｍｇ／ｍｌ）をホモノナイズした下垂体前菜膜ベレットと混合してＧ ＨＲＨ特異的結合を増大させる。

特異的な高親和性、ＧＴＰ感受性を有し、ＧＨＲＨ−受容体に架橋するＵＶ感受 性架橋基を含むＧＨＲＨ類縁体（フォトプローブまたは光親和性プローブ）を調 製した。プローブは光感受性基の位置およびスペーサー腕部の長さの両者で相違 する。好ましいフォトプローブは、ＧＨＲＨ類縁体［Ｈｉｓ’、Ｎｌｅ’）］　 −ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ，のＮ−５−アジド−２−二トロペンゾイルオ キシスクシンイミド（ＡＮＳ−ＮＯ３）またはスルホスクシンイミジル−６−（ ４’　−アジド−２゛−二トロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−５Ａ ＮＰＡＨまたは５ＡＮＰＡＨ）へのカップリング、ついでヨード化および精製に よって形成される。好ましくは、試薬ＡＮＢ−ＮＯ３へのカップリングは１２ま たは２１位置のリジンに標的化される。ついて化合物を１０位置におけるチロシ ンでヨード化し、生成物を逆相ＨＰＬＣて精製すると、　”’Ｉ−ＧＨＲＨａ− ＡＮＢ−ＮＯ３と呼ぶフォトプローブが形成される。別の実施態様では、フォト プローブ、”５Ｉ−ＧＨＲＨａ−３ＡＮＰＡＨが、ジメチルホルムアミド溶媒系 中、ＧＨＲＨａのＮ−末端ヒスチジンに標的化された５ＡＮＰＡＨのカップリン グ、逆相ＨＰＬＣによる精製、ＧＨＲＨａの１０位置のチロシンのヨートイｈお よび４　凡くへきことに、上述の光親和性プローブの使用により、ＧＨＲＨ−Ｒ に結合したＧＨＲＨａの可溶性複合体が製造できること、すなわちこの共有結合 で架橋された複合体は緩和な界面活性剤、好ましくは蛋白質を可溶化できる両イ オン性界面活性剤たとえば３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチル−ア ンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳと呼ばれ、Ｐｉｅｒｃｅか らまたはＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｉｒｖｉｎｅ、　Ｃａｌ　１ｆｏ ｒｎｉａから入手できる）を含有する溶液中に容易に溶解すること、また非特異 的架橋夾雑物の大部分はこの緩和な界面活性剤には溶解しないことが発見された のである。ついで、非架橋複合体もこれらの条件下で可溶化されることが発見さ れた。光架橋は可溶化後に実施して、受容体（ＧＨＲＨ−Ｒ）とリガント（ＧＨ ＲＨ−プローブ）は安定な可溶性複合体を形成していたことか明らかにされた。

好ましい実施！！！！様においては、これは、ＣＨＡＰＳ含有溶液による抽出、 および成木／デキストランによる遊離ペプチドの除去により、非特異的に結合し たＧＨＲＨの約９０％までの除去を可能にする。

これは、ＧＨＲＨ結合アッセイの著しい改良をもたらすものである。

他の実施態様においては、部分精製ＧＨＲＨ単離体が、支持体上に固定化された 化合物に対する親和性を存する官能基をＧＨＲＨまたはＧＨＲＨ類縁体に付着さ せることにより、アフィニティークロマトグラフィー法で得られる。好ましい実 施態様においては、ＧＨＲＨａのビオチン化誘導体をＧＨＲＨ−Ｒに結合させ、 可溶化し、ついてストレプトアビノンカラム上に固定される。結合したＧＨＲＨ ／ＧＨＲＨ−Ｒ複合体は緩衝液中ｐＨ５，０て解離し、したがってＧＨＲＨ−Ｒ のアミノ酸残基配列の決定に使用できる部分精製ＧＨＲＨ−Ｒ単離体が形成され ることを発見したのである。配列決定は、好ましい実施ｇ３様においては、配列 決定を妨げる可能性がある化合物、たとえばＧ−蛋白を除去するために、５ＤＳ −ＰＡＧＥを用いてさらにＧＨＲＨ−Ｒ単離体を精製し、精製ＧＨＲＨ−Ｒを形 成させたのちに行われる。

図面の説明 図１は、粗製ヒツジ下垂体膜ペレットへの”’Ｉ−ＧＨＲＨａの結合を示す棒グ ラフである。バーは、プローブ単１虫と、またはＩ　ＯｎＭＧＨＲＨａもしくは ５０μ〜ＩＧＴＰＴＳの存在下にインキュベーション後ペレットに結合した総カ ウントの分画を示す。４つの異なる場合（バーのセット）を示す。第１の場合（ 膜）は粗製膜ベレットのプレバレージョンに対する結合を示す。第２のセット（ 凍結）は同し膜プレバレージョンで、凍結および解凍後には、はとんど特異的結 合かないことを示す。第３のセラｌ−（ＤＴＴ）はこの同じプレバレージョン（ 凍結していない）へのＩｍＭＤＴＴの存在下における結合を示す。第４のセット （ａｌａ−洗浄）は、穿孔形成抗生物質アラメチシンと付加的洗浄工程を含む本 発明の改良プロトコールを示す。誤差線は、各点についてＮ＝３または４の反復 実験の平均の標準誤差を指示する。

図２は飽和結合分析に使用したグラフである。各点は、非標識ＧＨＲＨａの濃度 を増加させていって実施した結合アッセイからのデータである。誤差線は平均の 標準誤差を示す。挿入図は同じデータのプロット、および５ｃａｔｃｈａｒｄ座 標系における曲線を示す（誤差線は示していない）。

図３は、受容体の光親和性架橋を示すＳＤＳゲルのラジオグラフである。

粗製のヒツジ下垂体膜への架橋は２つの異なるフォトプローブ（ＳＡＮＰＡＨお よびＡＮＳ−ＮＯ５）を用い、それぞれ異なる２つの方法（ＳＤＳおよびＣＨＡ ＰＳ）によって抽出して証明する。各場合について、脱グリコジル化酵素の影響 も示す。ＣＨＡＰＳ抽出物では非特異的結合は著しく低下する。いずれのフォト プローブも、脱グリコジル化で４５ｋＤａにシフトする５５ｋＤａバンドを標識 する。

１　図４は、図３の場合と同しＳＤＳゲルのラジオグラフであり、ＣＨＡＰＳ抽 出されたＡＮＳ−ＮＯ３架橋を示す。Ｉ　ＯｎＭＧＨＲＨによる競合が明らかで あり、同様に脱グリコンレージ３ンを示している。

図５は、図４の場合と同し光親和性架橋のＳＤＳゲルのラジオグラフであり、Ｇ ＴＰγＳの影響、またニューラミニダーゼによる部分脱グリコシレージョンを包 含する。

図６は、放射性ヨード化ＧＨＲＨａを、ＩＯｎＭ非標識ＧＨＲＨａの存在下また は不存在下に、粗製ヒツジ下垂体膜に結合させて調製したＧＨＲＨａ−ＧＨＲＨ −Ｒ複合体の溶解性を示す。

図７は、図６の実験に従い、ＡＮＢ−ＮＯ３−ＧＨＲＨａフォトプローブで作成 した可溶性複合体の光親和性架橋を示し、界面活性剤可溶性分画は抽出後にＵＶ 架橋した。最左端の２つのレーンはＣＨＡＰＳ抽出、右側の２つのレーンはデオ キシコレート抽出であった。

図８は、ＣＨＡＰＳ可溶（ｌＺ、成木デキストラン処理ＧＨＲＨａ−ＧＨＲＨ− Ｒ複合体を、５０μＭＧＴＰγＳ（±５ｍＭＭｇ”）、Ｉ　ＯｎＭＤＴＴまたは １％ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００に３０分間暴露し、ついで解離量を定量するため に再び成木デキストラン処理した場合の安定性を示す。

図９は、可溶性ＧＨＲＨ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体の低ｐＨにおける解離を、ｐＨを 変動させた場合の可溶性特異的複合体の安定性として図８の場合と同様に評価し て示す。これらのデータもｐＨ５またはそれ以下でほぼ完全な解離が達成される ことを示している。

図］０は、ビオチン化受容体複合体ＧＨＲＨｂ−ＧＨＲＨ−Ｒのストレプトアビ ジンアガロースカラム上てのアフィニティークロマトグラフィーから得られた、 精製ＧＨＲＨ−Ｒ含存溶出液の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

ＧＨＲ）！−受容体のクローニングに至る全アプローチには、（１）ＧＨＲＨ− ４容体の特徴づけ、（２）ＧＨＲＨ−受容体の特性に関する知識を用いたＧＨＲ Ｈ−受容体の単離、（３）ＧＨＲＨ−受容体（あるいはＧＨＲＨ−受容体の部分 ）のペプチド配列の決定、（４）縮重オリゴヌクレオチド配列を使用したｃＤＮ ＡライブラリーのスクリーニングによるＧＨＲＨ−受容体の産生に関与するＤＮ Ａ配列の決定、ならびに（５）ＤＮＡ配列のクローニングが包含される。

−態様においては、本発明は、可逆性の高親和性ＧＨＲＨ−特異的、ＧＴＰ依存 性結合を示す、ＧＨＲＨ受容体へのＧＨＲＨ結合の高感度で再現性あるアッセイ を意図するものである。陰性に荷電したＧＨＲＨペプチドの高い非特異的結合に より、単純な濾過型の結合アッセイの使用は不可能であった。本発明のアッセイ によれば、特異的結合（ホモノナイズされた膜ベレットから１０％ＭＧＨＲＨａ によって除去される＋２’１−ＧＨＲＨａが生成するガンマ、γ、照射線のカウ ントとして定義された）は、粗製膜ベレットに結合した総カウントの３０〜６０ ％であり、緩和な界面活性剤（たとえばＣＨＡＰＳ）による抽出および成木／デ キストラン処理後には、そのカウントの９０％まてである。本発明の結合アッセ イの好ましい実施態様には多くの因子が関与する。たとえば、温和な固相ヨード 化プロトコール、担体を含まない放射性リガントのＨＰＬＣ精製、ＧＨＲＨａの 定量的分配のための有機溶媒系、プローブの生物学的活性を確認するための平板 培養細胞および復帰溶血プラークの両アッセイ、下垂体前葉膜ペレットへの特異 的放射性リガン］・の結合を増大させる穿孔形成抗生物質、アラメチシン約０． ０５ｍｇ／ｍｌの使用である。アラメチノンは特異的結合を増大させると同時に トラップされるカウントを減少させる。洗浄は回収されるカウントを低下させる が、特異的カウントの相対量をさらに改善する。

受容体結合試験に好ましいＧＨＲＨａ類縁体は、［Ｈｉｓ’、Ｎｌｅ”］　−Ｇ ＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ２（以下、ＧＨＲＨａという）である。このＧＨＲ Ｈ類縁体は、良好なＧＨＲＨ−Ｒ結合活性を有し、ヒトの配列とは長さが相違し 、ヨード化の基質としての使用か容易なように変化させた２つのアミノ酸を有す るペプチドである。ＧＨＲＨａの好ましいノースはＰｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　（Ｂｅｌｍｏｎｔ、　ＣＡ　）である。

至適の比活性および生物活性をもつヨード化Ｇ　ＨＲＨ類縁体の調製は、最初に Ｇ　ＨＲＨ類縁体（）オドプローブを含む）を固相ヨードビーズ（たとえばＰｉ ｅｒｃｅから入手可能）の使用によりヨード化し、次にモノヨード化物質を逆相 ＨＰＬＣにより、好ましくはフルオロカーボンベースのＢｌｏ−５ｅｒｉｅｓ　 Ｐｏ１ｙ　Ｆカラムを用いて（ＭａｃＭｏｄから入手可能）、実質的に担体を含 まないように精製する。ＧＨＲＨ類縁体の定量的な希釈および分配は、担体とし て有機溶媒、好ましくは５０％アセトニトリル水溶液を用いて達成される。この 方法では、水性ビヒクルの場合に遭遇する不正確な、再現性のない希釈は回避さ れる。

穿孔形成抗生物質を粗製下垂体前菜膜ベレットと混合した場合には、篤くべきこ とに、従来の方法と比較して、特異的結合は約３倍に増加することが発見された ［５ｔｒｕｔｈｅｒｓら、ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇＹ　、　１２４：２４（１ ９８９）参照］。好ましい実施態様においては、至適の比結合を得るために、約 ５０μｇ／ｍｌの抗生物質、アラメチシンの添加が採用される。

図１は、異なる条件下に処理した粗製膜ペレットへの”’Ｉ−ＧＨＲＨａプロー ブの結合を示す。３つの棒グラフが４セツトある。セット中の各棒グラフはヨー ド化プローブとインキュベーション後に結合した総カウントの分画を示している 。３つの棒グラフの各セットについては、左側が、膜を予めコールドのＧ　ＨＲ ＨまたはＧＨＲＨａと競合するかもしくはＧＨＲＨａの結合を妨害することか知 られている他の化合物に暴露することなく、ヨード化プローブ単独とインキュベ ーションたのちの結合部カウントを示す。中央の棒グラフはｌＯｎＭの非標識Ｇ ＨＲＨａ（特異的結合部位で競合する）とともにヨード化プローブをインキュベ ーション液に加えてインキュベートしたのちの結合部カウントの分画を示す。捧 グラフの各セットの左端および中央のバーの間の差は、ＧＨＲＨの特異的結合を 指示し、これはＧＨＲＨ−Ｒの存在量を表す。右側の棒グラフは、５０７１ＭＧ ＴＰγＳの存在下に、　′２５Ｉ−プローブとインキュベートしたのちの結合部 カウントの分画を示す。ＧＴＰγＳはある種の受容体複合体からＧ−蛋白の解離 を起こさせ、親和性の低下および結合の減少を生しることが知られていることか ら、ＧＴＰγＳを用いた場合の特異的結合の低下はＧＨＲＨ−Ｒ−Ｇ−蛋白複合 体の存在と矛盾しない。

特異的結合は、２０ＪＭヨード化類縁体単独で認められた結合とＩＯｎＭ非ヨー ド化ＧＨＲＨａの存在下の類縁体の結合の差として定義される。飽和結合、５ｃ ａｔｃｈｅｒｄ分析：競合試験、および本明細占に記載の他のデータは、これら の高親和性部位が特異的結合部位であることを示している。

図２に示すように、飽和結合試験によれば、Ｃ１；ＨＲＨ類縁体［Ｈｉｓ’、Ｎ Ｉｅ”］　−ＧＨＲＨ（１−３２）ＮＨ２（ＧＨＲＨａ）の約１６０ｐＭのＫｄ での単一の高親和性部位への結合か明らかである。誤差線の一部は小さくて表示 できなかった（各点につき反復試験、Ｎ＝６）。このデータは、非変形座標系に おいてリガント結合式への統計的加重最小二乗フィッティングに基づく結合定数 を決定するコンピュータープログラム１ｇａｎｄで分析した。このプログラムで は、Ｋ、ｄ＝１５０±ｌｏｐＭおよびＲ＝１．５±０．０９Ｊｍｏｌｅ／ｇ組織 の単一結合部位（最高フィツト値＝約ＳＥＭのフィツト）が報告される。統計的 テストはこの単一結合部位モデルを支持する。点線はこれらの定数を結合式に当 てはめて発生させた理論曲線である。

ＧＨＲＨａ放射性リガントの特異的結合は５０ＪＭＧＴＰγＳによって６５％ま で低下する。関連ペプチドのＶＩＰおよびＰＡＣＡＰは１１００ｎの濃度でこの 結合部位に競合しなかった。この結合は高親和性Ｇ−蛋白結合ＧＨＲＨ−Ｒを表 している。ＶＩ　ＰのＶＩＰ受容体への結合はスルフヒドリル還元剤に感受性を 示すことか知られている。このようなＧＨＲＨアッセイにおける特異的結合は１ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ、関連受容体への高親和性結合を妨げることが 知られている）でブレインキュベートすると完全に消失し、ＧＨＲＨ−Ｒ受容体 か結合部位であるとの結論をさらに支持するものである。

光親和性プローブ 光親和性プローブは光反応性架橋剤を用いて調製された。これらのプローブは、 光感受性基の位置およびスペーサー腕部の長さの両者が相違する。これらのプロ ーブは、ＵＶ照射を行わなくてもＧＨＲＨ−Ｒへの結合か可能で、ＵＶ照射の影 響下にＧＨＲＨ−Ｒに架橋てきる。好ましい光親和性プローブの非限定的な例お よびそれらの作成方法を以下に示す。

１）　１２’Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳ３２アミノ酸のＧＨＲＨ類縁体で ある［１−１ｉｓ’、Ｎｌｅ”コーＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨｚ　（ＧＨＲ Ｈａ）を、試薬Ｎ−５−アジド−２−二トロベンゾイルオキシスクシンイミド（ ＡＮＳ−ＮＯ３）へ、リジン１２または２Ｉに標的化してカップリングさせるこ とにより、ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯ３を形成させた。

ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳは、ヨードビーズを用いてヨード化し、放射性リガ ンド（「フォトプローブＪ　■２Ｊ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯ３、「ホット」 ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳまたは「ホットフォトプローブ」）を形成させた（ 好ましいヨードビーズはＰｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬから入手で きる）。

２）　Ｉ−ＧＨＲＨａ−３ＡＮＰＡＨ ジメチルホルムアミド溶媒系中、Ｎ−５−アジド−２−二トロペンゾイルオキシ スクシンイミド（ＡＮＳ−ＮＯ３）　へのＧＨＲＨ類縁体［Ｈｉｓ’、Ｎｌｅ！ ７］　−ＧＨＲＨ−（＋−３２）−ＮＨ２を、スルホスクシンイミジル−６−（ ４°　−アジド−２゛　−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−３ ＡＮＰＡＨまたは５ＡＮＰＡＨ）へ、ＧＨＲＨａのＮ−末端ヒスチジンを標的と してカップリングさせた。放射性ヨード化物質を次に、フルオロカーボンベース のＢｉｏ　５ｅｒｉｅｓＰｏｌｙ　Ｆカラム（ＭａｃＭｏｄ　Ａｎａｌｙｔｉｃ ａｌ、　Ｃｈａｄｄｓ　Ｆｏｒｄ、　ＰＡより入手）上アセトニトリルの緩やか な勾配を用い逆相ＨＰＬＣて精製した。

ヒツジ下垂体膜ベレット中におけるフォトプローブ結合をγ−力ウつティングに より測定し、ＵＶて誘導された架橋をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ ド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルのす一トラジオグラフィーによって調べた。

１２Ｊ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯ３は約１ナノモル、ｎＭの親和性で結合した （ＧＨＲＨａの場合の約１６０ピコモル、ｐＭと比較）、５ＤＳ−ＰＡＧＥによ り、ヒツジ下垂体では約５５ｋＤａのバンド（ウシ下垂体の場合は５７ｋＤａ） が認められ、これはＩ　ＯｎＭＧＨＲＨａの存在下に完全に消失した。このバン ドは、５０ＪＭのＧＴＰ７Ｓによって５０％以上減少し、１００ｎ１００ｎでは 影譬されなかった。すなわち、５５ｋＤａのバンドはＧＨＲＨａの光架橋による ものである。図３はこの特異的な５５ｋＤａバンドがＣＨＡＰＳ抽出により大部 分の非特異的架橋物質から分離されることを示す。図４は１０ｎＭＧＨＲＨａと の競合を示す。図５は架橋に対するＧＴＰγＳの影響を示している。

架橋されたＧＨＲＨ−受容体をニューラミニダーゼで処理すると、５５ｋＤａバ ンドの５０ｋＤａへのシフトを生じる。これは、ゲル中での移動度を低下させる 荷電した末端シアル酸基の除去によるものである（図５）。架橋されたＧＨＲＨ −受容体を、プロテアーゼを含まない、精製されたエンドグリコシダーゼおよび Ｎ−グリコシダーゼＦの混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　 Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。

［ｎｄ　１ａｎａから入手可能）て処理すると、ゲル移動度にシフトを生じて、 ４５ｋＤａのバンドが形成される（図３および４に示す）。これはＧＨＲＨ−受 容体がＮ−結合糖蛋白質（Ｇ蛋白結合蛋白に共通する）であることを指示し、脱 グリコジル化された蛋白鎖のサイズか示唆される。このサイズはＶＩＰおよびセ クレチン受容体の構造とよく一致する。

固定化レクチンによる試験では、架橋ＧＨＲＨ−受容体は小麦胚アグルチニン、 リシン、カブトガニアグルチニン、またはフンカナバリンＡには結合を示さなか った。これは受容体に通常ではなく、この受容体の、これらのレクチンに結合す る他の受容体からの精製および単離に対し、一つのアプローチを提供するもので ある。ニューラミニダーゼおよびガラクトシダーゼ処理後、この受容体は落花生 アグルチニンに特異的に結合し、ＧＨＲＨ受容体の分離および精製へのさらに別 のアプローチを与える。

可溶性ＧＨＲＨ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体および改良結合アッセイ光親和性架橋によ り、共存結合でカップリングした受容体−リガント複合体は緩和な界面活性剤溶 液、好ましくはＣＨＡＰＳを含有する溶液に可溶性であることか明らかにされた 。上述の膜結合アッセイの条件を用いてＧＨＲＨを受容体とブレインキュベート すると、架橋されなくても無傷の受容体−リガント複合体のＣＨＡＰＳ抽出およ び可溶化が可能になった。この複合体は、　１２１１−ＧＨＲＨａ　（ｒホット 」ＧＨＲＨａ）とインキュベートした膜の界面活性剤抽出後、架橋しないで、γ カウンティングにより検出された。

図６は、粗製の膜中に認められる特異的カウントの大部分が受容体に会合した特 異的複合体としてＣＨＡＰＳ抽出されたことを示している。図６のデータは次の ようにして得られた。放射性ヨード化ＧＨＲＨａを、１０ｎＭ非標識ＧＨＲＨａ の存在下または不存在下に、粗製ヒツジ下垂体膜に結合させた。ついで界面活性 剤抽出および遠心分離を行い、上溝を次に成木／デキストラン処理して、結合し た蛋白質を遊離ＧＨＲＨａから分離し、各分画における放射性ヨードをカウント した。粗製の膜中に結合した標識ＧＨＲＨａは続いて界面活性剤処理し、（１） 不溶性、（２）可溶性で非特異的に結合、（３）特異的に結合、ただし界面活性 剤で解離、または（４）可溶性で特異的に結合、として特徴づけることができた 。光架橋かられかるように、大部分の非特異的結合カウントはＣＨＡＰＳに可溶 性ではなかった。デオキシコーレート界面活性剤ミックスによる抽出では可溶化 された総カウントはわずかに多がったが、この多くは不安定で解離され、非特異 的カウントが優位であった。

図７は、この光架橋の結果から、この複合体は受容体を含むことが確認されるこ とを示している。膜はフォトプローブ（１２’Ｉ−ＡＮＢ−ＮＯ３−ＧＨＲＨａ ）と暗所で予め結合させ、ＣＨＡＰＳ抽出し、ついでＵＶにより架橋した。これ から、ＧＨＲＨはなお、可溶化された受容体に結合していたことがわかる。ＣＨ ＡＰＳ抽出においては、大部分の結合が５５ｋＤ受容体バンド中にあったが、一 方、デオキソコーレートの場合には大部分のバンドは非特異的であった。これは 、図６に示した結合試験とよく一致しくフォトプローブはより高い非特異的結合 を有するが）、可溶性複合体中のＧＨＲＨ類縁体の特異的結合は５５ｋＤａ受容 体にであることを示している。図６の場合と同様に、複合体は、デオキシヨーレ ート中よりもＣＨＡＰＳ中ではるかに安定であった。ＣＨＡＰＳ抽出物の光架橋 においては、非特異的バンドも殆と認められなかった（１つのバンドが５５ｋＤ ａ受容体バンドのすぐ下にある）。

図８は、ＣＨＡＰＳ抽出が改良結合アッセイそのものであり、非特異的カウント の著しい低下と感度の上昇を伴う（図１と比較）ことを示している。この図はま た、複合体が５０μＭＧＴＰγＳによって一部解離され、Ｇ蛋白はＣＨＡＰＳ含 有界面活性剤溶液中に可溶化された複合体とまだ会合していることを示唆するも のである。図Ｉは１ｍＭＤＴＴをＧＨＲＨの前に添加すると特異的結合を妨害す ること示している。図８は、予め結合させたのちには２０ｍＭＤＴＴでも部分的 効果しか生しなかったことを示している。この複合体はまた、ＩＭまでのＮａＣ １中４℃において一夜全く安定であったが、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（界面 活性剤）によって完全に解離した。結合アッセイにＣＨＡＰＳ可溶性、成木デキ ストラン処理サンプルを使用した場合に得られる低いバックグランドに注目すべ きである。

図９には可溶性受容体−リガント複合体のＰＨ安定性を示す。複合体は、ｐｔ− ｉ５．５およびそれ以下で不安定、ｐＨ５，５〜６では安定で結合ＧＨＲＨは遊 離ＧＨＲＨと交換可能、ｐＨ７では極めて安定て非交換性と、鋭敏な遷移を示す 。

この複合体の安定性は、改良されたＧＨＲＨ−Ｒ結合アッセイと同時に、新規な 受容体精製法の基盤を提供するものである。

ＧＨＲＨ−Ｒの単離および精製 ビオチン化ＧＨＲＨ類縁体は、ＧＨＲＨ受容体を精製する目的で、固定化ストレ プトアビジン上に保持てきる受容体−リガント複合体として開発された。最初に 試験した類縁体は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド試薬ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン （Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）を用いて、１２および／または２１位のリジンで ビオチン化した［Ｈｉｓ’、Ｎｌｅ”］−ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ，（Ｇ ＨＲＨａ）であった。

この類縁体は１０位のチロノンでヨード化し、ＨＰＬＣ上てモノおよびジビオチ ン化型として分割した。これらの生成物の９０％以上が３０分以内に固定化スト レプトアビノンに結合した。モノヒオチン化ＧＨＲＨａては受容体結合親和性は ＧＨＲ，Ｈａに比較して２分の１に低下し、一方、ノビオチン化体の活性は０に 近かった。ストレプトアビノンへの結合が受容体への結合を遮断したことから、 ビオチン基は受容体の結合ポケット内にあるものと思われた。次に試験した類縁 体は［Ｈｉｓ’、Ｎｌｅ”、Ｃｙｓ”］　−ＧＨＲＨ−（１−３３）−ＮＨ２で あった。それには強い二量体化傾向があって、競合結合アッセイにおいてＧＨＲ Ｈａを置換できる種でビオチン化されたしのはなかった。

篤くへきことに、［Ｈｉｓ’、ＮＩｅ”、ビオチン−Ｌｙｓ”　］　−ＧＨＲＨ −（１−４１）−ＮＨ２（以下、ＧＨＲＨｂという）は、ＧＨＲＨａに匹敵する 親和性をもって受容体に結合することか見出されたのである（ＧＨＲＨｂの調製 の好ましいソースはＮｕｒｏｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　ｏ　：：の類縁体が受容体の精製に使用できることを 証明するために、それをヨード化し、光感受性架橋基（ＡＮＢ−ＮＯ３）を導入 し、その化合物をＨＰＬＣで精製した。このヨード−ビオチニル−光活性化可能 なＧＨＲＨ，”’Ｉ−ＧＨＲＨｂ−ＡＮＢ−ＮＯ３を粗製ウシ下垂体膜中の受容 体に結合させた。受容体−リガント複合体をＣＨＡＰＳで可溶化し、成木デキス トラン処理して遊離ＧＨＲＨを除去し、固定化ストレプトアビジンに結合させた 。

ストレプトアビジンが複合体から受容体を駆逐するか否かを試験するために、サ ンプルをストレプトアビジンに結合させる前後にＵＶで架橋し、オートラジオグ ラフィーで分析した。これにより、結合に利用された受容体の存意な分画（３０ ％）がストレプトアビジンビーズ上に保持できたことが明らかにされた。可溶性 受容体−リガント複合体の安定性試験（図９参照）においては、ストレプトアビ ジンビーズの高温（０，５ＭＮａＣ１）洗浄ついで低ｐＨ（ｐＨ５）溶出（好ま しくはリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩または他の適当な緩衝溶液を使用）により 存意な受容体の精製が達成され、ＧＨＲＨ−Ｒ単離体を生成することが示された 。冴られたＧＨＲＨ−Ｒ単離体は、ＧＨＲＨ−Ｒの配列決定を可能にする十分な 純度を存する。好ましい実施態様においては、Ｇ−蛋白および他の妨害夾雑物を 、それに限定されるものではないがたとえばゲル電気泳動のような方法によって 除去し、少なくとも配列決定の実施に十分な純度のＧＨＲＨ−Ｒを得る。

図１０は、ビオチン化受容体複合体（ＧＨＲＨｂ−ＧＨＲＨ−Ｒ）のストレプト アビジンアガロースカラム上アフィニティー精製の結果を示す。複合体が結合し ているアガロースビーズを０．５ＭＮａＣｌ中で洗浄して非特異的結合を最小限 とし、ついてビオチン化リガンドからｐＨ５，０で受容体を解離させ、カラムか ら溶出した。溶出液を遠心分離下で限外濾過して濃縮し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分 析した。対照カラムを平行して流し、可溶性受容体複合体を非ビオチン化類縁体 ＧＨＲＨａと予め結合させた以外は同様に処理した。この銀染色ゲル上ＧＨＲＨ ｂレーンては５２ｋＤａおよび４５ｋＤａにバンドを示し、これらはＧＨＲＨａ レーンには見られない。架橋研究で認められた５５ｋＤａバンドは共有結合で付 着した３、６ｋＤａのＧＨＲＨａペプチドを包含することから、５２ｋＤａバン ドは受容体に期待されるサイズに相当する。４５ｋＤａバントは、ＧＨＲＨ受容 体複合体のサブユニットであると考えられるステイミュレータ−Ｇ−蛋白、Ｇｓ について報告されているサイズである。これらの２つのバンドの共溶出およびそ れらか対照カラムにはないことは、高度に精製されたＧＨＲＨ−Ｒが製造された ことを確証するものである。

実験方法および実施例 以下の非限定的実施例により、本発明の改良ＧＨＲＨ結合アッセイおよび無傷の ＧＨＲＨ／ＧＨＲＨ−受容体複合体の可溶化を基盤としたＧＨＲＨ−受容体の精 製方法をさらに説明する。本発明の実施に際しては、本明細書に特定的に言及し た以外の広範囲の材料が、煩雑な実験を行うことなく使用できるものであること を理解すべきである。

１、粗製膜ペレットにおける結合アッセイ組織プレパレーソ？ン すべての工程は４°Ｃて実施した。凍結したヒツジまたはウシ下垂体前葉（ヒツ ジ：　［ａｉｎ　Ｃ１ａｒｋｅ博士、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、　Ａｕ５ｔｒａｌ　 ｉａから約１ｇｍの下垂体を入手：ウシ：　Ｐｅ１−Ｆｒｅｅｚ、　Ｒｏｇｅｒ ｓ、　Ａｒｋａｎｓａｓからの特殊処理下垂体約２．５ｇｍ）は血液を洗い流し 、結合織を取り除き、５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｉ　００ｍＭＮａ　ＣＩ、１ ０ｍＭＥＤＴＡ、０．１１１ＭＥＧＴΔ、ｐＨ’７．　４中、０．５ｍＭＰＭＳ Ｆ（フェニルメチルスルホニルフルオ’Ｊ　Ｆ）　、ｌ　Ｏｕ　ｇ／ｍ１ロイペ プチン、１０／ｊｇ／ｍ！ペプスタチンＡ、および２００　Ｕ／ｍｌ　（単位／ ｍ１）アプロチニンとともにホモジナイズした。この緩衝液は、Ｇ蛋白に結合す る可能性がある内因性ＧＴＰを除去して高親和性結合を回復させるために使用さ れる。ホモシネ−１・をマイクロフユーシのトノブスビー１ζて回転し、上清は 捨てた。ベレットの上層（膜）をついて５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、５ｍＭＥＧＴ Ａ、５ｍＭＭｇＣ１２，５０７ｚｇ／ｍｌアラメチソン、３０μｇ／ｍｌバシト ラノンおよび上述の他のプロテアーゼインヒヒターを含有する結合緩衝液中に静 かに再懸濁した。

結合条件および分析 各チューブあたり１１５０下垂体当量を結合緩衝液中において、容１１５００Ｉ ｌｌ中ヨード化プローブ約１００，０００カウントとともに、室温で１時間イン キュベー１−Ｌ、た。分配した総カウントおよび各チューブについての結合カウ ント％を、各実験条件につき３〜６回反復して測定した。飽和結合像を、非変形 座標において精密リガンド結合式への統計的加重最小二乗フィツトを実施するコ ンピュータープログラムＬｉｇａｎｄによって分析した。統計的処理（Ｆ検定お よびランテスト）により単一結合部位モデルを確信させる良好なフィ・升が指示 された。代表的な飽和結合分析の結果を図２に示す。

結果 １０ｍＭＥＤＴＡによる組織の処理は、内因性ＧＴＰの除去を可能にし、高親和 性ＧＴＰ依存性部位を明らかにするために必須であった。初期には、非特異的結 合が圧倒的で、広範囲の遮断剤によっても改善されながった。スクロース密度遠 心分離によって精製した膜分画に、わずかに良好な結合シグナルが観察された。

一定した結果を得るために、粗製の膜の大量のバッチを凍結下垂体から調製し、 このアリコートをその後の使用のために凍結した。図１に示すように、膜をホモ シネ−ジョン後直ちに試験した場合には、特異的結合の著しい増加が認められた 。

この凍結−解凍効果の考えられる機構の一つには、アッセイを妨害する小胞の形 成かある。この可能性について調へたところ、穿孔形成抗生物質、アラメチシン （５０μｇ／ｍｌ）は、１図１にグラフによって例示するように、特異的結合／ 膜結合の比を３倍に上昇させることが見出された。この上昇の大部分は、非特異 的結合の低下によるもので、これは多分、小胞中にトラップされたプローブの放 出によるものと考えられた。膜べｌノットを遠心分離でさらに洗浄すると、回収 される総カウントにはロスかあるものの、非特異的結合を超える特異的結合の増 加を最大にすることもてきた。

飽和結合試験をプログラム１、ｉｇａｎｄによりコンピューターで分析すると、 Ｋｄ＝１５８±１３９Ｍの単一結合部位、および特異的結合部位の総数（ＲＴ） は１、　５±０．　０９　ｐｍｏｌ　／ｇｍ組織［最高フィンＩ・値上平均の標 準誤差概数（ＳＥＭ）］であることか指示された。ＧＨＲＨａに対する親和性は ＧＨＲＨａの生物学的効力に対応することがら、また関連ペプチドを超えるＧＨ ＲＨに対する特異性（１００ｎＭＶｌＰまたはＰＡＣＡＰは競合しない）および ５ｏμＭＧＴＰ７Ｓおよび１．ＯｍＭＤＴＴに対する感度がら、この結合はＧＨ ＲＨ−Ｒの存在を指示するものである。

１２’１−ＧＨＲＨａを市販のヨード化ヒトＧＨＲＨ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒ ｌｉｎｇｔｏｎＨｅＡｒｌｌｎ、　ＩＩ）と比較すると、極めて類似し、　”’ ｒ−ＧＨＲＨａはわずかに優れた特異的結合および若干強力なＧＴＰ効果を示し た。

光親和性プローブ結合の評価 ２つの異なる光親和性プローブを、上述のようにＰｉｅｒｃｅ　（Ｒｏｃｋｆｏ ｒｄ、　ＩＩ　）から入手できるヘテロニ官能性、光反応性架橋剤を用いて調製 した。５ＡＮＰＡ、ＨはＤＭＦ溶媒系を用いてＮ−末端ヒスチジンに標的化して ＧＨＲＨａにカップリングさせた。ＡＮＢ−ＮＯ３はリジン１２または２１に標 的化してＧＨＲＨａにカップリングさせた。各カップリング基−ＧＨＲＨａ生成 物はＨＰＬＣで精製し、ヨー）・化し、再精製した。

膜へのフォトプローブの結合は粗製膜結合アッセイて評価し、ついで５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥｔ気泳動によって分析して結合部位を確認した。フォトプローブを暗所で インキュベートし、長波長（３６６ｎｍ）　ＩＪＶランプで１０分間光分解し、 次にサンプルをベレット化した。ベレットのカウントを測定し、ついでＳＤＳサ ンプル緩衝液中で直接煮沸して抽出した（総ＳＤＳ抽出物）。あるいは、標識ベ レットを緩和な界面活性剤溶液（５ｍＭＣＩＡＰＳ）中に抽出し、遠心分離し、 クロロホルム／メタノール濃縮上清をＳＤＳ緩衝液で変性した（ＣＨＡＰＳ抽出 ）。

次に、これらのサンプルについてＳＤＳゲル中で電気泳動を行い、オートラジオ グラフィーに付した。

結果 結合アッセイは、両フォトプローブか膜ベレットに結合し、Ｉ　ＯｎＭＧＨＲＨ ａによって完全に置換され、あるいは５０μＭＧＴＰγＳによって部分的に置換 されることを明らかにした。いずれもＴ　ＧＨＲＨａよりも高い非特異的結合を 与えた。アフィニティー架橋ベレットの総ＳＤＳ抽出物のゲルでは、この非特異 的結合かＧＨＲＨａまたはＧＴＰγＳによって影響されないノくンドとして認め られた。これらの非特異的バントは、試行毎にまた２つのプローブ間で、ある程 度相違した（図３）。非イオン界面活性剤ＣＨＡＰＳは蛋白質の弱い可溶化剤で ある。受容体精製実験では、ＣＨＡＰＳ含有溶液にはＧＨＲＨ結合活性を可溶化 する能力か認められた。５ｍＭＣＨＡＰＳを含有する溶液を用いて得られた架橋 ベレットの抽出物をＳＤＳゲルて調べたところ、大部分の非特異的標識蛋白質は 可溶化されなかったので、受容体架橋の可視化が著しく改善された。図３および ４に示すように、その標識がＧＨＲＨａまたはＧＴＰγＳによって著しく影響さ れる５５ｋＤのバンドはいずれのプローブによっても明瞭に可視化され、ＧＨＲ Ｈ−Ｒを明示する。これらのフォトプローブはＧＨＲＨ−Ｒをさらに特徴づけ、 精製し、クローニングするために極めて貴重である。

脱グリコリル化 大部分のＧ蛋白結合膜受容体の細胞外部分はアルギニン残基に共存結合（Ｎ−結 合）した多重炭水化物基を含有することか知られているので、図３および４にお いて光標識されたバンドがＮ−結合糖蛋白質であることを確認するための実験を 行った。サンプルは、精製された、プロテアーゼを含まないエンドグリコシダー ゼＦおよびＮ−グリコンダーゼＦの混合物で処理した。

光標識ベレット（ＳＤＳまたはＣＨＡＰＳを用いて抽出）をＳＤＳサンプル緩衝 液中で煮沸し、希釈し、０．５単位のグリコシダーゼまたはブランク中、１、　 ２５９６Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０としても知られた非イオン界面 活性剤）とともに３７°Ｃて一夜インキユベートした。これらのサンプルはつい でクロロホルム−メタノール沈殿プロトコール［Ｗｅｓｓｅｌら、Ａｎａｌ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１３８：１４１−１４３（１９８４）参照］によって濃 縮し、ＳＤＳゲル上電気泳動に付した。

図３および４から明らかなように、特異的に光標識されたバンドの移動度はグリ コンダーゼが存在した場合のみ、約５５ｋＤから約４５ｋＤにシフトすることか 明らかにされた。ＳＤＳ抽出サンすル中に可視化され、ＧＨＲＨａまたはＧＴＰ γＳへの応答を欠くことから非特異的に標識されたと判断される他のバンドは脱 グリコジル化されない。これは、ＧＨＲＨ−Ｒが糖蛋白質であることを初めて証 明するものであり、この蛋白質鎖の真実のサイズの最も確かな評価を提供するも のである。図５に示すように、光標識受容体をニューラミニダーゼで処理すると 、ゲル移動度の約５２ｋＤへのシフトが生じた。これは、受容体がそのオリゴ糖 鎖上に多数の末端シアル酸基をもつことを示している。これらのシアル酸基はま た、等電点電気泳動ゲルて認められるような受容体のｐ　Ｌ　ＨＰＬＣにおける 疎水性、およびそのレクチン結合性にも影響する。脱グリコジル化は清製戦略に おいて、また配列決定のために受容体の蛋白分解的切断を容易にするために、有 用である。

受容体−ＧＨＲＨ複合体の可溶化 ＣＨＡＰＳ含存溶液中に可溶化した下垂体膜プレバレージョンは、歳末−デキス トラン結合アッセイ［ＶＩＰにつきＰａｕｌら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ　 、　２６２：　１５８−１６２（１９８７）によって開発されたアッセイを適用 ］で測定して、ＧＴＰ非感受性低親和性部位（Ｋｄ約５００ｎＭ）を示すのみで あった。その他の界面活性剤では結合の保存はさらに低く、ＧＨＲＨ−Ｒはこれ らの処理に不安定であることが指示された。

光親和性架橋の結果から、共有結合でカップリングした受容体−リガント複合体 は、ＣＨＡＰＳ含有溶液に可溶性であることが明らかにされた。Ｃ；ＨＲＨを、 本発明の膜結合アッセイの条件を用いて受容体とブレインキュベートし、ついで 緩和な界面活性剤溶液、好ましくはＣＨＡＰＳ含存溶液含油溶液たところ、無傷 の受容体−リガント複合体力何名化されることがわかった。この可溶性複合体は 、…Ｉ−ＧＨＲＨ類縁体またはｌＯｎＭのコールドＧＨＲＨで処理後の１！Ｉ　 １−ＧＨＲＨとインキュベートした膜の界面活性剤抽出によって検出された。

精製Ｇ）ＩＲＨ−Ｒ ビオチン化ＧＨＲＨ類縁体はついて可溶性ＧＨＲＨｂ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体の形 成に利用し、この可溶性複合体を、ＣＨＡＰＳを用いて抽出し成木−デキストラ ンで精製後、ストレプトアビジンカラム上に流した。ストレプトアビジンカラム をついでＮａＣ］溶液で洗浄し、続いてＧＨＲＨ−Ｒ単離体を製造するために、 ｐＨ５，０の緩衝液をカラムに流した。

ＧＨＲＨ−Ｒ単離体はついで、５ＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに精製できる。

約５２ＫＤａに現れるバンド（純粋なＧＨＲＨ−Ｒに相当）は標準ＰＶＤＦ膜で プロットできる。ＰＶＤＦ膜の表面に付着した精製ＧＨＲＨ−Ｒをついで膜」二 で消化し、慣用の配列決定法で配列決定を行ってＧＨＲＨ−Ｒの完全または部分 アミノ酸残基配列を得ることができる。

配列決定工程で得られた１または複数個のアミノ酸残基配列はついでＧＨＲＨ− Ｒの産生に関与する遺伝子のクローニングに用いる縮重プローブの形成のベース として利用てきる。

以上、ヒツジおよびウシ下垂体膜におけるＧＨＲＨ受容体へのＧＨＲＨ類縁体の 結合を測定するための改良方法が開示された（ヨードイヒ精製およびＧＨＲＨ類 縁体の分配、ならびに穿孔形成抗生物質の使用を包含する）。これによって、Ｇ ＨＲＨ受容体のＧＴＰ惑受性、ＧＨＲＨ特異性、高親和性のフォト標識のための 方法か開発された。この受容体のこのような標識は、これまで達成されたことが ない。これは、受容体のサイズ、グリコシルイし溶解性および他の性質の特徴づ けを可能にする。これは、ＣＨＡＰＳのような化合物を含む緩和な界面活性剤溶 液により、結合したＧＨＲＨ−ＧＨＲＨ−受容体複合体を、安定な可溶性の型で 抽出できることの発見をもたらした。ＣＨＡＰＳ抽出および成木／デキストラン 処理（遊離ＧＨＲＨを結合する）は、大部分の非特異的ＧＨＲＨ結合から精製さ れた可溶性受容体−リガント複合体を与え、したがって、新規な、低バツクグラ ンドの、従来可能であったより良好な感度を示すＧＨＲＨ結合アッセイとして、 また受容体精製の出発点として、極めて有用である。この受容体−リガント複合 体は塩洗浄、ＧＨＲＨ交換およびＧＴＰまたはＤＴＴ処理に対して比較的安定で あるが、低いｐＨには不安定である。Ｃ−末端ビオチン化ＧＨＲＨ類縁体は、可 溶性のＧＨＲＨ−Ｒ複合体中に結合させた場合、固定化ストレプトアビジンのカ ラム上への保持、ついで塩洗浄、およびｐＨ５での溶出により、Ｃ；ＨＲＨ受容 体の精製を可能にすることが発見された。この精製受容体蛋白質は受容体ペプチ ドの部分配列決定に適当で、この配列情報はＧＨＲＨ受容体ｅＤＮＡのクローニ ングに価値がある。

上述の教示から、本発明には多くの修飾および改変が可能なことが明らかである 。非限定的実施例の方法により、粗製下垂体サンプル中のＧＨＲＨ−Ｒの他の複 合体を、精製ＧＨＲＨ−Ｒの製造のために親和性カラムに結合できることが推測 される。すなわち、本発明は、特定的に記述した以外の様式でも実施できるもの であることを理解すべきである。

−（／、４朝ル伺ζ包岬尉 −＋　−十、＋　、十　−グリコシダーゼーー＋　＋　１０ｎＭＧＲＦａ （ｔＯＴ）（／：ρｑ １０ｎＭＧＲＦａ　−＋　−＋ ■　（（／：μ）オ浸露目睨ｍ−１１ −崎　４−５２ｋＤａ −−４５ｋＤａ ＧＨＲＨｂ　ＧＨＲＨａ 補正書の写しく翻訳文）提出書（需沫４８４条の７＠１組平成　６年　２月２２ 日＼］自ム

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．配列決定を可能にする十分な純度の成長ホルモン放出ホルモン受容体。
2. ２．成長ホルモン放出ホルモン受容体単離体。
3. ３．単離体は成長ホルモン放出ホルモン受容体の配列決定を可能にする十分な純 度を有する「請求項２」の単離体。
4. ４．複合体化された成長ホルモン放出ホルモン受容体をアフィニティークロマト グラフィー支持体上に固定化する工程、およびついで支持体上の複合体を解離さ せて成長ホルモン放出ホルモン受容体単離体を生成させる工程からなる成長ホル モン放出ホルモン受容体単離体の製造方法。
5. ５．成長ホルモン放出ホルモン受容体は成長ホルモン放出ホルモンまたは成長ホ ルモン放出ホルモン類縁体と複合体化し、複合体を支持体上に固定化する前にさ らに複合体を緩和な界面活性剤溶液中に可溶化する工程を設け、支持体上に固定 化された複合体はｐＨを低下させることによって解離させる「請求項４」の方法 。
6. ６．受容体は成長ホルモン放出ホルモン類縁体に結合させ、その類縁体はアフィ ニティークロマトグラフィー支持体に結合可能な官能基を有する「請求項５」の 方法。
7. ７．離縁体はビオチン化され、クロマトクラフィー支持体はビオチン化類縁体に 結合できるストレプトアビジン官能基を包含する「請求項６」の方法。
8. ８．成長ホルモン放出ホルモン受容体に結合可能で、またアフィニティークロマ トグラフィー支持体にも結合可能である成長ホルモン放出ホルモン離縁体。
9. ９．類縁体は［Ｈｉｓ′、ＮＩｅ２７、ビオチニルーＬｙｓ４１］−ＧＨＲＨ− （１−４１）−ＮＨ２である「請求項８」の離縁体。
10. １０．ＵＶ照射の不存在下に成長ホルモン放出ホルモン受容体に結合可能であり 、ＵＶ照射の存在下に成長ホルモン放出ホルモン受容体に架橋可能である成長ホ ルモン放出ホルモン類縁体。
11. １１．ＧＨＲＨａ−ＳＡＮＰＡＨ｛ＧＨＲＨａは［Ｈｉｓ′、ＮＩｅ２７］−Ｇ ＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ２であり、ＳＡＮＰＡＨはスルホスクシンイミジル −６−（４′−アジド−２′−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートである｝ である「請求項１０」の類縁体。
12. １２．ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳ｛ＧＨＲＨａは［Ｈｉｓ′、Ｎｌｅ２７］− ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ２であり、ＡＮＳ−ＮＯＳはＮ−５−アジド−２ −ニトロベンゾイルオキシスクシンイミドである｝である「請求項１０」の類縁 体。
13. １３．Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミドをＧＨＲＨ 類縁体［Ｈｉｓ′、ＮＩｅ２７］−ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ２とカップリ ングさせる工程からなるホトアフィニティープローブの製造方法。
14. １４．スルホスクシンイミジル−６−（４′ーアジド−２′−ニトロフェニルア ミノ）ヘキサノエートをＧＨＲＨ類縁体［Ｈｉｓ′、ＮＩｅ２７］−ＧＨＲＨＫ （ｌ−３２）−ＮＨ２のＮ一末端ヒスチジンにカップリングさせるフオトアフイ ニテイープローブの製造方法。
15. １５．ＧＨＲＨを粗製下垂体前葉組織と穿孔形成抗先物質の存在下に接触させる 工程からなる粗製下垂体前葉組織に成長ホルモン放出ホルモンを結合させる方法 。
16. １６．抗生物質は約０．０５ｍｇ／ｍｌ存在するアラメチシンである請求項１５ 」の方法。
17. １７．成長ホルモン放出ホルモンまたは成長ホルモン放出ホルモン類縁体を、成 長ホルモン放出ホルモンまたは成長ホルモン放出ホルモン類縁体をヨード化する のに十分なヨード化基質と接触させる工程からなる、成長ホルモン放出ホルモン 受容体プローブの製造方法。
18. １８．ヨード化された成長ホルモン放出ホルモンまたは成長ホルモン放出ホルモ ン類縁体は、ヨード化に続いてＨＰＬＣで精製する「請求項１７」の方法。
19. １９．「請求項４」の方法で製造された成長ホルモン放出ホルモン受容体単離体 。
20. ２０．「請求項７」の方法で製造された成長ホルモン放出ホルモン受容体単離体 。
21. ２１．天然に見出されるよりも高濃度で存在する成長ホルモン放出ホルモン受容 体からなる組成物。