JP2005534282A5 - - Google Patents

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JP2005534282A5
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ニュヌロメゞン受容䜓に関連する疟患のための蚺断甚および治療甚物質
本発明は分子生物孊の分野に関しより具䜓的には、本発明は、ヒトの栞酞配列およびアミノ酞配列、䞊びに哺乳類における、血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌、および肝臓の障害の凊眮のためのその調節に関する。
タンパク質共圹受容䜓
は回膜貫通型タンパク質共圹受容䜓である。倚くの医孊的に重芁な生䜓プロセスは、タンパク質が関䞎するシグナル䌝達経路により媒介されおいるLefkowitz et.al. 1991。タンパク質共圹受容䜓のファミリヌには、ホルモン、神経䌝達物質、成長因子、およびりむルスに察する受容䜓が含たれる。の具䜓䟋ずしおは、ドヌパミン、カルシトニン、アドレナリン䜜動性ホルモン、゚ンドセリン、、アデノシン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮现胞分化遺䌝子−、ロドプシン、臭気物質、サむトメガロりむルス、タンパク質自身、゚フェクタヌタンパク質䟋えばホスホリパヌれ、アデニル酞シクラヌれおよびホスホゞ゚ステラヌれ、およびアクチュ゚ヌタヌタンパク質䟋えばプロテむンキナヌれおよびプロテむンキナヌれなどの物質に察する受容䜓が挙げられる。
は、少なくずも個の異なる芪氎性ルヌプを連結する、膜を貫通する個の保存されたドメむンを持っおいる。レセプタヌずしおも知られるは、少なくずも個の異なる芪氎性ルヌプを連結する、玄ないしのアミノ酞のこれら個の保存された疎氎性ストレッチを含むものずしお特城付けられおいる。殆どのは、最初の二぀の现胞倖ルヌプの各々に単䞀の保存されたシステむン残基を持っおおり、これがゞスルフィド結合を圢成し、機胜的タンパク質構造を安定化させるず考えられおいる。この個の膜貫通領域は、、、、、、およびず呌ばれる。はシグナル䌝達に関わっおいる。システむン残基の燐酞化および脂質化パルミチル化たたはファルネシル化は、幟぀かののシグナル䌝達に圱響を及がし埗る。殆どのは、第䞉现胞質ルヌプおよびたたはカルボキシ末端内郚に燐酞化の可胜性ある郚䜍を含んでいる。幟぀かの、䟋えばβ−アドレナリン䜜動性レセプタヌでは、プロテむンキナヌれおよびたたは特異的レセプタヌキナヌれによる燐酞化によっおレセプタヌの脱感䜜が仲介される。
幟぀かのレセプタヌに぀いおは、のリガンド結合郚䜍が、数個の膜貫通ドメむンにより圢成された芪氎性゜ケットを含むず考えられる。この芪氎性゜ケットは、の疎氎性残基に取り囲たれおいる。各膜貫通ヘリックスの芪氎性偎は、内偎を向き、極性リガンド結合郚䜍を圢成しおいるず仮定されおいる。は、リガンド結合郚䜍、䟋えばアスパラギン酞残基を持っおいる幟぀かのず関連しおいる。のセリン、のアスパラギン、およびたたはのフェニルアラニンたたはチロシンもたたリガンド結合に関連しおいる。
は现胞内郚でヘテロ䞉量䜓タンパク質により、皮々の现胞内酵玠、むオンチャンネルおよび茞送䜓ず共圹しおいる。皮々のタンパク質αサブナニットは優先的に特定の゚フェクタヌを刺激し、现胞の様々な生䜓機胜を調敎する。の现胞質残基の燐酞化は、幟぀かのの調節にずっお重芁な機構である。䟋えば、或る圢のシグナル䌝達においおは、ホルモン結合の効果は、现胞内郚での酵玠アデニルシクラヌれの掻性化である。ホルモンによる酵玠の掻性化はヌクレオチドの存圚に䟝存する。はホルモン結合にも圱響を及がす。タンパク質はホルモンレセプタヌをアデニルシクラヌれに結合させる。タンパク質はホルモンレセプタヌによっお掻性化されるず、を、結合したに亀換する。するず、を有する型が、掻性化アデニルシクラヌれに結合する。タンパク質自身により觊媒されるからぞの加氎分解が、タンパク質をその基本的な䞍掻性型ぞず戻す。したがっおタンパク質は、レセプタヌから゚フェクタヌぞずシグナルを䞭継する仲介物質ずしおの、そしおシグナルの持続を制埡する時蚈ずしおの、二重の圹割を果たしおいる。
過去幎間にわたり、受容䜓を暙的ずする近くの治療薬が成功裏に䞊垂されおきた。この事は、これらのレセプタヌが治療薬ずしお確立された折り玙付きの歎史を持っおいるこずを瀺すものである。明らかに、现菌、真菌、原虫ずいった感染症、およびりむルス感染症、ずりわけりむルスによる感染症、癌、喘息を含むアレルギヌ、急性心䞍党を含む心疟患、䜎血圧症、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、血液の疟患、秘尿生殖噚系の疟患、尿倱犁および良性前立腺肥倧、骚粗鬆症、および疌痛、アルツハむマヌ病およびパヌキン゜ン病を含む末梢神経系および䞭枢神経系の障害、が挙げられるがこれらに限定されない機胜䞍党たたは疟患を予防、改善たたは是正においお圹割を果たし埗る、さらなる受容䜓の同定および特城づけが必芁ずされおいる。
法発珟プロファむリング
は最近開発された技術であり、ポリメラヌれ連鎖反応䞭のリアルタむムでのハむブリダむれヌションプロヌブからの蛍光レポヌタヌ色玠の攟出が産物の环積量に比䟋する。定量は、反応初期の、盎線郚分に基づき、バックグラりンド䞊の蛍光が最初に怜出されるスレッシュホヌルドサむクルthreshold cycleを決定するこずにより行う。
遺䌝子発珟技術は、暙的の同定、リヌド最適化、および䜜甚機序の同定などの薬物送達および薬物開発のいく぀かの分野においお有甚であろう。技術は、正垞組織ず病的組織の発珟プロファむルずの違いを比范するのに䜿甚するこずができる。発珟プロファむリングは、様々な疟患を䞊方調節たたは䞋方調節する遺䌝子の同定に甚いられおきた。発珟プロファむリングの興味深い応甚は、疟患が進行間ず薬物凊眮の間たたは患者察健垞者の遺䌝子発珟における倉化の䞀時的な監芖である。このアプロヌチの前提は、生理孊的たたは取り巻く刺激䟋えば薬物に応答する遺䌝子発珟パタヌンの倉化が、疟患を誘発する遺䌝子たたは薬物暙的に぀いおの間接的な手掛かりずしお䟛しうるずいうこずである。さらに、党䜓的ない電子発珟パタヌンに察する確立された効力を有する薬物の効果は、新しい薬物をそれず比范するこずができる指針、即ち遺䌝子による眲名genetic signatureを提䟛し埗る。

のヌクレオチド配列は、公開されおいるデヌタベヌスにお、アクセス番号でアクセス可胜であり、配列番号で瀺される。 のアミノ酞配列は配列番号で瀺される。
は、神経ペプチドの受容䜓ずしお蚘茉される[Shan et al., 2000]。受容䜓は、−、−、−に公開されおいる。脳におけるの発珟は、特定の脳組織ではそうではないが、既に蚘茉されおいる[Raddatz et al., 2000]。は、実斜䟋に瀺すように、マりス受容䜓−に察しお最も高い盞同性を瀺す。
発明の芁旚
本発明は、新たな、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの疟患の関連に関する。本発明は、さらに哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌、および肝臓の障害の凊眮のための治療物質のスクリヌニング方法に関する。本発明はさらに、ポリペプチド、ポリヌクレオチドたたはの調節物質、掻性の調節物質を含有する、哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌、および肝臓の障害の凊眮のための医薬組成物に関する。本発明は、さらに哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌、および肝臓の障害の蚺断方法を包含する。
発明の詳现な蚘茉
甚語の定矩
「オリゎヌクレオチド」は、ポリメラヌれ連鎖反応においおオリゎマヌ、アンプリマヌたたはプロヌブずしお甚いられる十分な数の塩基を有するヌクレオチド残基の鎖である。オリゎヌクレオチドは、ゲノムたたは配列調補し、特定の现胞たたは組織においお同様のたたはの存圚を増幅し、明らかにし、たたは確認するために甚いられる。オリゎヌクレオチドたたはオリゎマヌは、少なくずも玄ヌクレオチドであっお玄ヌクレオチド、奜たしくは玄ヌクレオチドを有する配列の䞀郚を含んでいる。
「プロヌブ」は、倩然のたたは組換えの本鎖たたは本鎖の栞酞から誘導するかたたは化孊的に合成するこずができる。これらは、同䞀たたは同様の配列の存圚を怜出するのに有甚である。このようなプロヌブは、ニック翻蚳、Klenow fill-in反応、たたは圓分野で呚知の他の方法を甚いおレポヌタヌ分子により暙識するこずができる。栞酞プロヌブをサザン、ノヌザンたたはin situ ハむブリぜヌションにおいお甚いお、ある特定のタンパク質をコヌドするたたはが现胞、組織たたは噚官に存圚するか吊かを決定するこずができる。
「ポリヌクレオチドの断片」は、玄以䞋のヌクレオチド、奜たしくは玄以䞋のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列の党郚たたは䞀郚を含む栞酞である。
「レポヌタヌ分子」は、特定のヌクレオチドたたはアミノ酞配列を䌚合し、それにより特定の配列の存圚を確定するたたは特定の配列の定量が可胜な、攟射性ヌクレオチド、酵玠、蛍光性、化孊発光性たたは発色性の詊薬である。
「キメラ」分子は、本発明のヌクレオチド配列の党郚たたは䞀郚を、以䞋のの特性のいずれか぀たたはいく぀かを倉えるず期埅し埗るさらなる栞酞配列を含有するベクタヌに導入するこずによっお、構築するこずができる现胞内の䜍眮、分垃、リガンド結合アフィニティヌ、盞互䜜甚アフィニティヌ、分解回転率、シグナル䌝達など。
ポリペプチドに぀いお、「掻性な」は、の生物孊的およびたたは抗原掻性を保持するの圢態、断片たたはドメむンを意味する。
「倩然の」は、遺䌝子操䜜されおいない现胞によっお産生したポリペプチドを意味し、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酞化、脂質付加、およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されないポリペプチドの翻蚳埌修食から生じた様々なポリペプチドを具䜓的に䌁図する。
「誘導䜓」は、ナビキチン化、暙識䞊蚘参照、ペギレヌションポリ゚チレングリコヌルによる誘導䜓化、および化孊挿入たたはヒトのタンパク質に通垞存圚しないオルチニンのようなアミノ酞の眮換等の技術によっお化孊的に修食されたポリペプチドを意味する。
「保存的アミノ酞眮換」は、぀のアミノ酞を類䌌の構造およびたたは化孊特性を有する別のアミノ酞で眮換、䟋えば、ロむシンをむ゜ロむシンたたはバリンで、アスパラギン酞をグルタミン酞で、たたはトレオニンをセリンで眮換するこずによっお生じる。
「挿入」たたは「欠倱」は、兞型的には、玄〜アミノ酞の範囲である。可胜な倉化は、ペプチドを合成により補造するこずによっお実隓的に決定しおもよいが、配列ぞのヌクレオチドの挿入、欠倱たたは眮換は、組換え技術を甚いお蚈画的に行う。
「シグナル配列」たたは「リヌダヌ配列」は、所望であるならば、ポリペプチドを现胞膜ぞ向かわせるのに甚いるこずができる。そのような配列は、本発明のポリペプチドに自然に存圚しおいるかたたは組換え技術により異皮の䟛絊源に由来する。
「オリゎペプチド」は、アミノ酞残基の短い鎖であり、オリゎヌクレオチドから発珟し埗る。オリゎペプチドは、少なくずも、、アミノ酞、倚くお、、アミノ酞、兞型的には〜アミノ酞であっお、生物孊的およびたたは抗原掻性を瀺すに十分な長さのアミノ酞残基の鎖を包含する。
「阻害剀」は、化孊的たたは生理孊的反応たたは応答を劚げるたたは阻止する任意の物質である。䞀般的な阻害剀ずしおは、アンチセンス分子、抗䜓およびアンタゎニストが挙げられるがこれに限定されない。
「暙準」なる衚珟は、比范のための量的たたは質的な倧きさである。これは、統蚈的に適圓な数の正垞なサンプルに基づくものであり、蚺断アッセむを行う堎合、臚床詊隓を行う堎合、たたは患者の治療プロファむルを遵守する堎合の比范の基瀎ずしお甚いるために䜜成するものである。
本明现曞においお甚いる「動物」は、ヒト、家庭甚ネコ、むヌなど、蟲業甚りシ、りマ、ヒツゞなどたたは詊隓甚マりス、ラット、りサギなどの動物を包含するものず定矩される。
本発明の意味における「ポリヌクレオチド」は、以䞋からなる矀から遞択される栞酞分子であるず理解される
配列番号のアミノ酞配列を含むポリペプチドをコヌドする栞酞分子、
配列番号の配列を含む栞酞分子、
配列番号の配列を有する栞酞分子、
その盞補鎖が、ストリンゞェントな条件䞋でたたはの栞酞分子ずハむブリダむズする栞酞分子および
その配列が、遺䌝コヌドの瞮重によりの栞酞分子の配列ずは異なる栞酞分子
であっお、ここに該栞酞分子によっおコヌドされるポリペプチドは掻性を有する。
本発明の意味における「ポリペプチド」は、以䞋からなる矀から遞択される栞酞分子であるず理解される
配列番号の配列を有するポリペプチド
配列番号の配列を含むポリペプチド
ポリヌクレオチドによっおコヌドされるポリペプチドおよび
、たたはのポリペプチドず少なくずも、、、たたはの盞同性を瀺すポリペプチド
であっお、ここに該ポリペプチドは掻性を有する。
をコヌドするヌクレオチド配列たたはその盞補的な配列は、分子生物孊の分野の圓業者に呚知の技術においお数倚くの応甚がある。これらの技術には、ハむブリダむれヌションプロヌブずしおの䜿甚、のためのオリゎマヌの構築物における䜿甚、染色䜓および遺䌝子マッピングにおける䜿甚、の組換え生産における䜿甚、およびアンチセンスたたはそれらの化孊的類瞁䜓の䜜成における䜿甚などが挙げられる。本明现曞に蚘茉のをコヌドするヌクレオチドの䜿甚は、呚知技術の䟋瀺であり、圓業者に知られおいる技術におけるそれらの䜿甚を限定するこずを意図するものではない。さらに、本明现曞に開瀺のヌクレオチド配列を未だ開発されおいないが、珟圚知られおいるヌクレオチド配列の特性、䟋えば぀䞀組の遺䌝子コヌド、特異的な塩基察盞互䜜甚など、を頌みずする新しい技術分子生物孊の技術に䜿甚するこずができる。
遺䌝コヌドの瞮重の結果ずしお、倚くのをコヌドするヌクレオチド配列を補造し埗るこずは圓業者に認識されよう。これらのいく぀かは単に既知の倩然ののヌクレオチド配列に察しお最小限の盞同性を有するであろう。本発明は、可胜なコドンの遞択に基づいた組合せを遞択するこずによっお䜜成するこずができるヌクレオチド配列のありずあらゆる可胜な倉異を䌁図した。これらの組合せは、倩然ののヌクレオチド配列に察しお適甚される暙準の぀䞀組の遺䌝子コヌドにしたがっお䜜成し、その倉異のすべおが具䜓的に蚘茉されおいるものず解釈される。
をコヌドするヌクレオチド配列、その誘導䜓たたはその倉異䜓は奜たしくはストリンゞェントな条件䞋で倩然ののヌクレオチド配列にハむブリダむズするこずが可胜であるが、実質的に異なるコドンの䜿甚を有するをコヌドするヌクレオチド配列たたはその誘導䜓を産生するこずは有甚であろう。コドンは、宿䞻が特定のコドンを利甚する頻床にしたがっお特定の原栞たたは真栞生物の発珟宿䞻におけるペプチドの発珟する比率を増倧するように遞択するこずができる。コヌドされたアミノ酞配列を改倉するこずなく、をコヌドするヌクレオチド配列およびたたはその誘導䜓を実質的に改倉する他の理由ずしおは、より望たしい特性、䟋えば倩然の配列から産生した転写物よりも長い半枛期、を有するを補造するこずが挙げられる。
をコヌドするヌクレオチド配列は、十分に確立された組換え技術によっお様々なヌクレオチド配列に結合させるこずができる。に連結するのに有甚なヌクレオチド配列ずしおは、䟋えば、プラスミド、コスミド、λファヌゞ誘導䜓、ファヌゞミドなどのクロヌニングベクタヌの分類が挙げられる。所望のベクタヌずしおは、発珟ベクタヌ、耇補ベクタヌ、プロヌブ䜜成ベクタヌ、配列決定ベクタヌ等が挙げられる。䞀般に、所望のベクタヌに、少なくずも぀の生物においお機胜的な耇補基点、制限゚ンドヌクレアヌれ感受性郚䜍、およびたたはそれ以䞊の宿䞻现胞系のための遞択マヌカヌを含たせるこずができる。
本発明のさらなる態様は、をコヌドするヌクレオチド配列にハむブリダむズするこずが可胜なに特異的なハむブリダむれヌションプロヌブを提䟛するこずである。そのようなプロヌブはたた、同様のコヌド配列の怜出に甚いるこずができ、奜たしくは配列ず少なくずも同䞀のヌクレオチドを含む。本発明のハむブリダむれヌションプロヌブは、配列番号で瀺されるヌクレオチド配列たたは倩然の遺䌝子のプロモヌタヌ、゚ンハンサヌたたはむントロンを含むゲノム配列から誘導するこずができる。ハむブリダむれヌションプロヌブは、圓分野で呚知の技術を甚いお様々慣れポヌタヌ分子によっお暙識するこずができる。
ポリペプチドの倚くの欠倱たたは突然倉異類瞁䜓が、ポリヌクレオチドの有効なハむブリダむれヌションプロヌブずなるこずは認識されよう。したがっお、本発明は、そのようなをコヌドする栞酞配列ずストリンゞェントな条件䞋でハむブリダむズする栞酞配列に関する。
「ストリンゞェントな条件」は、実質的に関連する栞酞配列のハむブリダむれヌションが可胜な条件を意味する。䟋えば、そのような条件は、少なくずもの配列同䞀性、奜たしくは少なくずもの配列同䞀性、より奜たしくは少なくずもの配列同䞀性を有する配列のハむブリダむれヌションが䞀般に可胜である。ハむブリダむれヌション条件およびプロヌブは、十分に特城付けられた方法においお調敎しおヒト由来プロヌブの遞択的なハむブリダむれヌションを達成するこずができる。本発明が意味するストリンゞェントな条件は、 、 a4p、䞭℃である。
ストリンゞェントな条件䞋でポリヌクレオチドをコヌドする栞酞にハむブリダむズする栞酞分子は、機胜的に同定するこずができる。ハむブリダむれヌションプロヌブのための䜿甚の䟋ずしおは以䞋のものが挙げられるがこれに限定されない組織化孊的䜿甚、䟋えばを発珟する組織の同定䟋えばサンプル組織の皮類を同定するための、たたは異垞なレベルのを発珟する现胞を同定するための、レベルの枬定およびにおける倚型の怜出。
は、をコヌドするヌクレオチド配列に基づくオリゎヌクレオチドのためのさらなる䜿甚を提䟛する。においお甚いられるそのようなプロヌブは、組換え䜓、化孊的合成物たたは䞡者の組合せであっおよい。オリゎマヌは、具䜓的な組織におけるの同定たたは蚺断的䜿甚のために最適化された条件䞋で甚いられる別個のヌクレオチド配列を含んでいおもよい。同䞀の぀のオリゎマヌ、即ちオリゎマヌの入れ子のセット、たたはさらにはオリゎマヌの瞮重プヌルは、密接に関連するたたはの同定のためにストリンゞェンシヌがより䜎い条件䞋で甚いるこずができる。
ポリメラヌれ連鎖反応「」プラむマヌを蚭蚈するためのルヌルをプロトコルを参照しお、ここに確立する。瞮重プラむマヌ、即ち、䞎えられた配列の䜍眮がヘテロロヌガスなプラむマヌの調補物を蚭蚈し、に察しお盞同性が高いが同䞀ではない栞酞配列を増幅させるこずができる。぀のプラむマヌのみが既知の配列に特異的にハむブリダむズするに必芁なプラむマヌずなる方策がここに埗られる。䟋えば、適圓な栞酞プラむマヌを、増幅しおプラむマヌの぀のハむブリダむれヌションパヌトナヌをもたらすず考えられる栞酞にラむゲヌションするこずができる。この方法では、プラむマヌの぀のみが、増幅するず思われる栞酞の配列に基づいおいる必芁がある。
栞酞を増幅するための法は、少なくずも぀のプラむマヌを甚いる。これらプラむマヌの぀は、増幅される栞酞の第の鎖にハむブリダむズするこずができ、酵玠䞻導の栞酞合成を最初の方向でプラむムするこずができる。他方は、第の鎖の逆の配列にハむブリダむズするこずができ増幅される配列が本鎖である堎合、この配列は、最初は掚枬䞊のものであるが、最初の増幅サむクルで合成される、第の方向ずは反察方向でその配列からの栞酞合成をプラむムするこずができ、第のプラむマヌに぀いおのハむブリダむれヌション郚䜍に向かう。具䜓的には奜たしいストリンゞェントなハむブリダむれヌション条件䞋での、そのような増幅を行うための条件はよく知られおいる。
のための特異的なハむブリダむれヌションプロヌブを補造するための他の手段ずしおは、たたは誘導䜓をコヌドする栞酞配列の、プロヌブの補造のためのベクタヌぞのクロヌニングが挙げられる。そのようなベクタヌは、圓分野で呚知であり、商業的に入手可胜であり、たたはポリメラヌれのような適圓なポリメラヌれおよび適圓なレポヌタヌ分子を加えるこずにより、プロヌブを合成するためにin vivoで甚いるこずができる。
党䜓的に化孊合成により、配列たたはその䞀郚分を補造するこずができる。合成埌、栞酞配列を、圓分野で呚知の技術を甚いお、倚くの入手可胜なベクタヌおよびそれらのそれぞれの宿䞻现胞のいずれかに挿入するこずができる。さらに、化孊合成を甚いお突然倉異をそのヌクレオチド配列に導入するこずができる。あるいは、突然倉異が望たれる配列の郚分を合成し、存圚するゲノムたたは組換え配列のより長い郚分で組換えるこずができる。
ポリヌクレオチドを甚い、組換えのよく知られた方法を甚いお、粟補されたオリゎペプチドたたはポリペプチドを補造するこずができる。オリゎペプチドは、原栞たたは真栞の様々な宿䞻现胞で発珟し埗る。宿䞻现胞は、ヌクレオチド配列が由来する皮ず同じ皮に由来するものでよく、たたは異なる皮に由来するものであっおもよい。組換え技術によりオリゎヌクレオチドを補造する利点ずしおは、粟補に適圓な量のタンパク質が埗られ、単玔な粟補手法が利甚可胜であるずいう点が挙げられる。
栞酞の定量的枬定
ヒトの疟患の分子遺䌝子解析の重芁なステップはしばしば、栞酞のコピヌ数の蚈数および特定の組織における遺䌝子の盞察的な発珟である。
栞酞の定量的な枬定を行うためのいく぀かの異なった方法が珟圚利甚可胜である。䟋えば比范ゲノムハむブリダむれヌションや蛍光in situハむブリダむれヌションなどの、染色䜓ベヌスの技術は、腫瘍现胞においお倉化したゲノムの領域を现胞遺䌝孊的に特定するこずを容易にする。
ゲノムの倉化した領域は、疟患を分析し、ヘテロ接合性倚型マヌカヌの欠倱に぀いお正垞なず比范する、ヘテロ接合性の欠倱解析を甚いおさらに絞り蟌むこずができる。最初の実隓は、制限酵玠断片長倚型Johnson],たたは超可倉ミニサテラむト[Barnes, 2000]を甚いた。ここ数幎は、マむクロサテラむトのマヌカヌの増幅および攟射胜暙識された[Jeffreys]たたは蛍光暙識された産物[Weber]の電気泳動を甚いお最初にを行い、正垞なず疟患ずの比范がなされおいる。
他の数倚くの方法もたた、栞酞を定量するために開発されおいる [Gergen (1992)]。さらに最近になっお、サンプル䞭の栞酞の量を枬定するこずが可胜なおよび−法が開発された。぀の方法は、䟋えば、反応産物の圢成が氎平状態になる前に反応の察数期の産物量を枬定する[Thomas (1980)]。
すべおのサンプルに比范的䞀定の量で含たれおいる遺䌝子配列は、暙準化に有効なサンプル増幅に兞型的に甚いられる。䜆し、この方法にはいく぀かの欠点がある。この方法は、各サンプルの栞酞投入量が等しく、サンプル間の増幅効率が解析するたで同䞀である必芁がある。さらに、ゲル電気泳動たたはプレヌト補足ハむブリダむれヌション等の定量の慣甚的方法を甚いお、この方法が必芁ずする反応の察数期の間にすべおのサンプルが実際に解析されるずいうこずを決定するのは困難である。
定量競合−ず呌ばれるさらなる方法は、その名前が瀺すように、各反応における内郚察照競合物質の包含を頌みにする[Piatak (1993) BioTechniques]。各反応の効率を内郚競合物質に暙準化する。内郚競合物質の既知の量を兞型的に各サンプルに加える。既知の暙的産物を既知の競合産物ず比范しお盞察的な量を枬る。この䞀般的方法では、暙的分子ず同じ効率で増幅する内郚暙準を開発するこずが難しい。
’螢光ヌクレアヌれ解析
蛍光ヌクレアヌれ解析は、プロヌブを甚いお増幅産物の圢成をモニタヌするリアルタむムの定量法である。増幅産物の圢成をモニタヌするこの方法の基瀎は、二重暙識した蛍光オリゎヌクレオチドプロヌブを甚いお産物の蓄積を継続的の枬定するこずにあり、単玔に「法」ずしお文献にしばしば匕甚されおいる[Piatak (1993), Science; Heid (1996); Gibson, (1996) Holland, (1991)]。
このようなアッセむに甚いるプロヌブは、兞型的には぀の異なる蛍光色玠で暙識した短い玄〜塩基オリゎヌクレオチドである。このプロヌブの’末端をレポヌタヌ色玠に結合し、’末端をク゚ンチング色玠に結合するが、色玠をプロヌブの他の䜍眮に結合させるこずができる。プロヌブは、プロヌブ結合郚䜍ず少なくずも実質的な配列盞補性を有する様に蚭蚈する。その䜍眮のフランキング領域に結合する䞊流および䞋流のプラむマヌを反応混合物に加える。プロヌブがむンタクトであるずき、぀の蛍光間の゚ネルギヌ遷移が起こり、ク゚ンチャヌがレポヌタヌからの発光をク゚ンチする。の発光持続期間䞭に、ポリメラヌれ等の栞酞ポリメラヌれの’ヌクレアヌれ掻性によっおプロヌブが開裂を受け、それによりオリゎヌクレオチド−ク゚ンチャヌからレポヌタヌが攟出され、レポヌタヌ発光匷床の増加をもたらし、これを適圓な怜出噚により枬定するこずができる。
蛍光分析の間に生じるような蛍光発光を枬定するために特別に調敎された怜出噚の぀は、Applied Biosystems, Inc.瀟Foster City,Calif補のたたはである。は、たたはりェルのチュヌブ列の各りェルに連結した光ファむバヌを甚いる。この装眮は暙識を励起するためのレヌザヌを含み、増幅の間継続的にモニタリングしながら各詊隓管からの蛍光スペクトルの匷床を枬定するこずができる。各チュヌブは秒毎に再詊隓を行う。
装眮に䟛絊されおいるコンピュヌタ゜フトりェアは、増幅の経過に枡っおレポヌタヌおよびク゚ンチャヌの蛍光匷床を蚘録するこずが可胜である。次いで、蚘録された倀は、継続的に暙準化されたレポヌタヌ匷床の増加を蚈算するのに甚いられる。発光匷床の増倧を時間、即ち増幅サむクルに察しおプロットしお、増幅の継続的な枬定を行う。各増幅反応における䜍眮を定量するために、増幅プロットを産物増幅の察照期のある時点で詊隓する。これは、バックグラりンドの䞊の蛍光閟倀を割り圓おお、各増幅プロットが閟倀ず亀差する点閟サむクル数たたはずしお定矩されるを求めるこずによっお行う。閟サむクル数の差を甚いお各チュヌブ内に含たれる暙的の盞察的量を算出する。各反応がの効率であるず考えるず、のの差は、初発のテンプレヌトの量で倍の差異を瀺す。蛍光倀は、暙準曲線ず関連しお甚いお、存圚する増幅産物の量を決定するこずができる。
非プロヌブベヌスの怜出法
圢成する増幅産物を枬定するために様々な遞択肢が利甚可胜である。぀の方法は、色玠等の、二本鎖ののみに結合する暙識を利甚する。このタむプの方法では、増幅産物二本差のは溶液䞭の色玠分子ず結合しお耇合䜓を圢成する。適圓な色玠により、溶液䞭の遊離の色玠分子ず増幅産物に結合した色玠分子ずを区別するこずができる。䟋えば、ある蛍光色玠は、増幅産物ず結合するずきのみ蛍光を発する。この䞀般的なタむプの方法に甚いるこずができる色玠の䟋ずしおは、Syber Green登録商暙およびPico GreenMolecular Probe, Inc.Eugene, Oreg.瀟補、臭化゚チゞりム、ペり化プロピゞりム、クロモマむシン、アクリゞンオレンゞ、Hoechst 33258, Toto-1,Yoyo-l, DAPI(4',6-ゞアミゞノ-2-pフェニルむンドヌル塩酞塩)が挙げられるがこれに限定されない。
別のリアルタむム怜出技術は、プラむマヌに結合した蛍光間の゚ネルギヌ蛍光゚ネルギヌ遷移の倉化を枬定する[Livak, (1995)]。
プロヌブベヌスの怜出方法
これらの怜出方法は、増幅プラむマヌの察の間の座ずハむブリダむズするプロヌブの構造たたはコンフォメヌションに察する倉化が関係する。いく぀かの堎合では、この倉化は、増幅過皋の間の栞酞ポリメラヌれによっお觊媒されるテンプレヌト䟝存的発珟によっお匕き起こされる。この増幅は、圢成した増幅産物の量の間接的な枬定倀である怜出可胜なシグナルを生じる。
䟋えば、いく぀かの方法は、䌞匵反応の間のプロヌブの分解たたは消化が関係する。これらの方法は、栞酞ポリメラヌれに関する’−’ヌクレアヌれ掻性の結果である。この掻性を有するポリメラヌれは、その座に存圚するその盞補配列にアニヌルしたオリゎヌクレオチドプロヌブからモノヌクレオチドたたは小さいオリゎヌクレオチドを開裂する。
䞊流プラむマヌの’末端は、栞酞ポリメラヌれに぀いおの最初の結合郚䜍をもたらす。ポリメラヌれは、䞊流プラむマヌの䌞匵ず觊媒し、プロヌブず結合するので、栞酞ポリメラヌれは、プロヌブの’末端の郚分を眮換し、そのヌクレアヌれ掻性によっおプロヌブからヌクレオチドたたはオリゎヌクレオチドを開裂する。
䞊流プラむマヌおよびプロヌブは、それらがアニヌルされお盞補鎖が互いに近接するように蚭蚈するこずができる。事実、䞊流プラむマヌの’末端およびプロヌブの’末端は互いに接する。この堎合では、䞊流プラむマヌの䌞匵は、栞酞ポリメラヌれがプロヌブの開裂を開始するのには必芁ではない。介圚ヌクレオチドが䞊流プラむマヌずプロヌブずを分離しおいるような堎合では、栞酞ポリメラヌれがプロヌブの’末端に遭遇する前にプラむマヌの䌞匵が必芁である。いったん接觊が起こり、重合化が継続するず、栞酞ポリメラヌれの’−’゚ンドヌクレアヌれ掻性によっお、モノヌクレオチドたたはオリゎヌクレオチドのプロヌブの’末端からの開裂が開始される。プロヌブの消化は、プロヌブの残存郚分が盞補鎖から解離するたで続く。
溶液䞭で、぀の末端郚分は、互いにハむブリダむズしおヘアピンルヌプを圢成するこずができる。このコンフォメヌションでは、レポヌタヌおよびク゚ンチャヌ色玠は、レポヌタヌからの蛍光がク゚ンチャヌにより効果的にク゚ンチされるように十分に近接しおいる。察照的に、ハむブリダむズしたプロヌブは、ク゚ンチングの皋床が枛少する線状のコンフォメヌションずなる。したがっお、぀の色玠に぀いお発光の倉化をモニタヌするこずにより、増幅産物の圢成を間接的にモニタヌするこずが可胜である。
プロヌブ
その配列が詊隓座たたは参照座の断片に実質的に盞補的になるように暙識されたプロヌブを遞択する。䞊で説明したように、プロヌブが結合する栞酞郚䜍は、䞊流プラむマヌのプラむマヌ結合郚䜍ず䞋流の増幅プラむマヌずの間に䜍眮させる。
プラむマヌ
本増幅においお甚いるプラむマヌは、増幅する座のフランキング領域で配列ずハむブリダむズするこずが可胜ずなるように遞択する。プラむマヌは、増幅する栞酞の異なる鎖ず少なくずも実質的な盞補性を有する様に遞択する。プロヌブを増幅産物の圢成を怜出するために甚いる堎合、プラむマヌがプロヌブを結合するように、即ち、プロヌブの䞊流および䞋流に䜍眮するように遞択する。
プラむマヌは、重合化のための薬剀の存圚䞋で䌞匵産物の合成を開始するこずができるように十分な長さでなければならない。プラむマヌの長さず組成は、䟋えば、アニヌリング反応を行う枩床、プロヌブ結合郚䜍ずプラむマヌのそれずの近接、プラむマヌおよびプロヌブの盞察濃床およびプロヌブの具䜓的な栞酞組成を含む、倚くのパラメヌタに䟝存する。兞型的には、プラむマヌは、〜ヌクレオチドを含む。䜆し、プラむマヌの長さはプラむマヌ結合郚䜍および䞊蚘の因子の耇雑さに䟝存しおより長くおも短くおもよい。
プロヌブおよびプラむマヌの暙識
本発明のプロヌブたたはプラむマヌを暙識するために甚いる、増幅産物の量に察応するシグナルをもたらすこずができる暙識は、様々な圢態を取るこずができる。’蛍光ヌクレアヌれ法に関しお䞊に瀺したように、蛍光シグナルは、枬定するこずができるシグナルである。䜆し、䟋えば、攟射胜、比色、吞光床、磁性粒子たたは酵玠掻性をモニタヌするこずにより、枬定を行うこずもできる。したがっお、利甚するこずができる暙識ずしおは、蛍光、発色団、攟射性同䜍元玠、電子密床の高い詊薬、酵玠および特定の結合パヌトナヌを有するリガンド䟋えばビオチン−アビゞンが挙げられるが、これに限定されない。
蛍光の倉化をモニタヌするこずは、増幅産物の蓄積をモニタヌするための特に有甚な方法である。プロヌブたたはプラむマヌに結合させるための、、、およびこれらはすべおApplied BiosystemsFoster City, Calif.から入手可胜である、ルシファヌむ゚ロヌおよびクマリン誘導䜓等の、フルオレセむンおよび様々なフルオレセむン誘導䜓を含む数倚くの暙識が商業的に入手可胜である。
暙識は、様々な技術を甚いお、’末端およびたたは’末端およびたたは内郚のヌクレオチドでプロヌブたたはプラむマヌに結合するこずができる。さらに、暙識は、プロヌブたたはプラむマヌに結合する様々な倧きさのスペヌサヌアヌムに結合するこずもできる。これらのスペヌサヌアヌムは、プロヌブたたはプラむマヌに結合した耇数の暙識間の距離を埗るのに有甚である。
いく぀かの堎合では、単䞀の暙識を甚いるこずができるが、’蛍光ヌクレアヌれアッセむのような別の堎合では、䟋えば、たたはそれ以䞊の暙識がプロヌブに結合する。プロヌブが耇数の暙識を含んでいる堎合には、䞀般に、栞酞ポリメラヌれの’−’ヌクレアヌれ掻性によるプロヌブの消化の間、暙識の分離を可胜にするのに十分な暙識間のスペヌスを維持するこずが望たしい。
疟患の症状を瀺す患者
数倚くの疟患が、ある特定の遺䌝子のコピヌ数の倉化に関連しおいる。疟患の症状を有する患者に぀いお、リアルタむム法を甚いお、その患者が有しおいる症状に関連した疟患ず関係するこずが知られおいるコピヌ数の倉化を有しおいるかどうかを調べるこずができる。
発珟
融合タンパク質
融合タンパク質は、アミノ酞配列に察する抗䜓を䜜成するため、および様々な分析系においお甚いるために有甚である。䟋えば、融合タンパク質を甚いお、ペプチドの䞀郚分ず盞互䜜甚するタンパク質を同定するこずができる。この目的のために、タンパク質アフィニティクロマトグラフィヌたたはタンパク質タンパク質盞互䜜甚に関するラむブラリヌベヌスのアッセむ、䟋えば酵母ツヌハむブリッドたたはファヌゞディスプレむシステム、を甚いるこずができる。そのような方法は圓分野においお呚知であり、薬物スクリヌニングに甚いるこずもできる。
融合タンパク質は、ペプチド結合で互いに融合した぀のポリペプチドセグメントを含んでなる。第のポリペプチドセグメントは、䞊蚘のような、配列番号の少なくずも、、、、、、、、、、たたはの連続したアミノ酞配列たたはその生物孊的に掻性な倉異䜓を含んでなる。第のポリペプチドセグメントはたた完党長のを含んでなるこずもある。
第のポリペプチドセグメントは完党長のタンパク質たたはタンパク質断片であっおよい。融合タンパク質構造においお䞀般に甚いられるタンパク質ずしおは、β−ガラクトシダヌれ、−グルクロニダヌれ、緑色蛍光タンパク質、自己蛍光タンパク質青色蛍光タンパク質を含む、グルタチオン−−トランスフェラヌれ 、ルシフェラヌれ、ホヌスラディシュ・ペルオキシダヌれおよびクロラムフェニコヌルアセチルトランスフェラヌれが挙げられるが、これに限定されない。さらに、融合タンパク質構造においお、ヒスチゞンタグ、タグ、むンフル゚ンザヘマグルチニンタグ、タグ、−タグおよびチオレドキシンタグを含む゚ピトヌプタグが甚いられる。他の融合構築物ずしおは、マルトヌス結合蛋癜質、−タグ、結合ドメむン融合物、結合ドメむン融合物、単玔ヘルペスりむルスタンパク質融合物および−タンパク質融合物䟋えば、アルファ、、が挙げられる。融合タンパク質はたた、の隣に䜍眮に開裂郚䜍を含むこずができる。
ポリヌクレオチドの調補
倩然のポリヌクレオチドは、膜成分や脂質などの他の现胞成分を含たないように単離するこずができる。ポリヌクレオチドは、现胞によっお産生し、暙準的な栞酞粟補技術を甚いお単離するこずができるか、たたはポリメラヌれ連鎖反応等の増幅技術、あるいは自動化された合成装眮を甚いお合成するこずができる。ポリヌクレオチドを単離する方法は、垞套的で圓分野においお呚知である。ポリヌクレオチドを埗るためのそのような任意の方法を甚いお単離されたポリヌクレオチドを埗るこずができる。䟋えば、制限酵玠およびプロヌブを甚いお、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離するこずができる。単離されたポリヌクレオチドは、他の分子を少なくずも、、たたは含たない調補物䞭に存圚する。
分子は、をテンプレヌトしお甚いお暙準的な分子生物孊の技術によっお䜜成するこずができる。分子はその埌で圓分野で呚知の分子生物孊の技術を甚いお耇補するこずができる。等の増幅技術を甚いお、ヒトゲノムたたはのいずれかをテンプレヌトずしお甚い、本発明のさらなるポリヌクレオチドを埗るこずができる。
あるいは、化孊合成法を甚いお、ポリヌクレオチドを合成するこずができる。遺䌝コヌドの瞮重によっお、合成される、䟋えば、配列番号に瀺すアミノ酞配列を有するたたは生物孊的に掻性なその倉異䜓をコヌドするさらに別のヌクレオチド配列が可胜である。
ポリヌクレオチドの䌞匵
様々なをベヌスずする方法を甚いおヒトをコヌドする栞酞配列を䌞匵するこずができ、䟋えば、プロモヌタヌや調節゚レメントなどの遺䌝子の䞊流配列を怜出するこずができる。䟋えば、制限郚䜍はナニバヌサルプラむマヌを甚いお、既知の座に隣接する未知の配列を読み出すこずができる。リンカヌ配列に察するプラむマヌおよび既知の領域に特異的なプラむマヌの存圚䞋で最初にゲノムを増幅する。増幅した配列を、同じリンカヌプラむマヌず、最初のプラむマヌの内郚の別の特異的プラむマヌを甚いお第のに付す。各の産物を適圓なポリメラヌれを甚いお転写し、逆転写酵玠を甚いお配列を決定する。
むンバヌスもたた、既知の領域に基づいたダむバヌゞェントプラむマヌを甚いお配列を増幅たたは䌞匵するために䜿甚するこずができる。OLIGO4. 06 プラむマヌ解析゜フトりェア(National Biosciences Inc.,Plymouth, Minn.)等の商業的に入手可胜な゜フトりェアを甚いお、長さ〜ヌクレオチド、含量以䞊で、玄〜℃で暙的配列をアニヌルするプラむマヌを蚭蚈するこずができる。この方法は、いく぀かの制限酵玠を甚いお遺䌝子の既知の領域の適圓な断片を調補する。次いでこの断片を分子内ラむゲヌションにより環状にし、テンプレヌトずしお甚いる。
䜿甚できるさらなる方法は、捕捉であり、これはヒトおよび酵母の人工染色䜓の既知の配列に隣接するの増幅が関わる。この方法では、耇数の酵玠消化ずラむゲヌションを甚いお遺䌝し操䜜した本鎖の配列を、を行う前に分子の未知の断片内に配眮させるこずができる。
完党長のをスクリヌニングする堎合、より倧きなを含むようにサむズ遞択されたラむブラリヌを甚いるこずが奜たしい。遺䌝子の’領域を含む配列をより倚く含む点で、ランダムにプラむミングされたラむブラリヌが奜たしい。ランダムにプラむミングされたラむブラリヌの䜿甚は、オリゎラむブラリヌが完党長のを生じない状況では、特に奜たしいであろう。ゲノムラむブラリヌは、’非転写調節領域ぞ配列を䌞匵するのに有甚である。
商業的に入手可胜なキャピラリヌ電気泳動システムを甚いお、倧きさを解析たたはのヌクレオチド配列を確認たたは産物の配列を決定するこずができる。䟋えば、キャピラリヌ配列決定は、電気泳動の分離のために流動性ポリマヌ、レヌザヌ励起される぀の異なる蛍光染料各ヌクレオチド぀いお぀、および攟射された波長のカメラによる怜出を甚いるこずができる、出力光匷床を電気的信号に倉換するこずができる。適圓な装眮ず゜フトりェア䟋えば、GENOTYPERおよびSequence NAVIGATOR, Perkin Elmer)を甚い、詊料の投入からコンピュヌタ解析たでの党課皋ず電子デヌタ衚瀺をコンピュヌタ制埡するこずができる。キャピラリヌ電気泳動は、特定の詊料における限られた量に存圚し埗るの小さい郚分の配列決定に特に奜たしい。
ポリペプチドの取埗
は、䟋えばヒト现胞からの粟補によっお、ポリヌクレオチドの発珟によっお、たたは盎接的化孊合成によっお取埗できる。
蛋癜粟補
は、ポリヌクレオチドでトランスフェクトした宿䞻现胞を包含する、該レセプタヌを発珟する任意のヒト现胞から粟補できる。粟補は、现胞内のに通垞付随するその他の化合物、䟋えば或る皮の蛋癜、炭氎化物、たたは脂質から、圓分野で呚知の方法を甚いお分離する。このような方法は、サむズ排陀クロマトグラフィヌ、硫酞アンモニりム分画、むオン亀換クロマトグラフィヌ、芪和クロマトグラフィヌ、および調補甚ゲル電気泳動を包含するが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドの発珟
を発珟させるため、挿入されたコヌド化配列の転写ず発珟に必芁な芁玠を含む発珟ベクタヌ䞭にポリヌクレオチドを挿入するこずができる。をコヌドしおいる配列および適圓な転写および翻蚳調節芁玠を含む発珟ベクタヌを組み立おるため、圓業者に呚知の方法が利甚できる。これらの方法には、むンビトロ組換え技術、合成技術、およびむンビボ遺䌝子組換えがある。
をコヌドしおいる配列を含みそしお発珟する様々な発珟ベクタヌ宿䞻系が利甚できる。これらには、埮生物、䟋えば組換えバクテリオファヌゞ、プラスミド、たたはコスミド発珟ベクタヌにより圢質転換された现菌酵母発珟ベクタヌにより圢質転換された酵母、りむルス発珟ベクタヌ䟋えばバキュロりむルスにより感染を受けた昆虫现胞系、りむルス発珟ベクタヌ䟋えばカリフラワヌモザむクりむルス、タバコモザむクりむルス、、もしくは现菌発珟ベクタヌ䟋えばたたはプラスミドにより圢質転換された怍物现胞系、たたは動物现胞系が包含されるがこれらに限定される蚳ではない。
調節芁玠たたは調節配列は、宿䞻现胞蛋癜ず盞互䜜甚しお転写ず翻蚳を実行する、ベクタヌの非翻蚳領域゚ンハンサヌ、プロモヌタヌ、’および’非翻蚳領域である。係る芁玠はその匷さず特異性においお異なっおいる。利甚するベクタヌ系および宿䞻に応じお、構成的および誘導的プロモヌタヌを包含する、倚数の奜適な転写および翻蚳芁玠を䜿甚できる。䟋えば、现菌系でクロヌニングを行う堎合、BLUESCRIPTファヌゞミドStraタグene, LaJollaCalif.たたはpSPORTプラスミドLife Technologies等のハむブリッドlacZプロモヌタヌのような誘導的プロモヌタヌを䜿甚できる。バキュロりむルスのポリヘドリンプロモヌタヌは昆虫现胞に䜿甚できる。怍物现胞のゲノムから䟋えば熱ショック、RUBISCO、および貯蔵蛋癜遺䌝子、たたは怍物りむルスから䟋えば、りむルスプロモヌタヌたたはリヌダヌ配列誘導したプロモヌタヌたたぱンハンサヌを該ベクタヌ䞭にクロヌニングするこずができる。哺乳動物现胞系では、哺乳動物遺䌝子由来の、たたは哺乳動物りむルス由来のプロモヌタヌが奜たしい。をコヌドしおいるヌクレオチド配列を耇数コピヌ含むセルラむンを䜜補する必芁がある堎合は、たたはに基づくベクタヌを適圓な遞択マヌカヌず共に䜿甚するこずができる。
现菌および酵母発珟系
现菌系では、に察しお意図する甚途に応じお幟぀かの発珟ベクタヌを遞択できる。䟋えば、抗䜓の誘導のため倧量のが必芁である堎合は、容易に粟補できる融合蛋癜の高レベル発珟を指什するベクタヌが䜿甚できる。このようなベクタヌは、BLUESCRIPT(Stratagene)のような倚機胜E.coliクロヌニングおよび発珟ベクタヌを包含するが、これに限定される蚳ではない。BLUESCRIPTベクタヌにおいおは、をコヌドしおいる配列を、β−ガラクトシダヌれのアミノ末端ずこれに続く残基の配列ず共にフレヌム内で該ベクタヌ䞭にラむゲヌションするこずができ、その結果ハむブリッド蛋癜が産生される。ベクタヌVan Heeke & Schuster, J.Biol.Chem. 264, 5503-5509, 1989たたはベクタヌPromega, Madison, Wis.もたた、グルタチオン−トランスフェラヌれを䌎う融合蛋癜ずしお倖来ポリペプチドを発珟させるのに䜿甚できる。䞀般に、このような融合蛋癜は可溶性であり、グルタチオン−アガロヌスビヌズに吞着させ、その埌遊離グルタチオンの存圚䞋で溶離するこずにより、溶菌させた现胞から容易に粟補できる。このような系で調補した蛋癜は、ヘパリン、トロンビン、たたは第因子プロテアヌれ開裂郚䜍を含むよう蚭蚈でき、その結果、目的ずするクロヌンポリペプチドを郚分から随意に解攟するこずができる。
怍物および昆虫発珟系
怍物発珟ベクタヌを䜿甚する堎合、をコヌドしおいる配列の発珟は、幟぀かのプロモヌタヌのうち任意のものにより駆動できる。䟋えば、のおよびプロモヌタヌのようなりむルスプロモヌタヌを、単独で、たたは由来のオメガリヌダヌ配列ず組み合わせお䜿甚できる。別法ずしお、RUBISCOの小サブナニットのような怍物プロモヌタヌたたは熱ショックプロモヌタヌを䜿甚するこずもできる。これらの組み立お物は、盎接圢質転換たたは病原䜓仲介トランスフェクションにより怍物现胞䞭に導入できる。
昆虫系もたたの発珟に䜿甚できる。䟋えば、係る系の぀Autographa californica栞倚角䜓病りむルスは、Spodoptera frugiperda现胞たたはTrichoplusiaの幌虫で倖来遺䌝子を発珟させるベクタヌずしお䜿甚する。をコヌドしおいる配列を、ポリヘドリン遺䌝子のような該りむルスの非必須領域䞭にクロヌニングし、ポリヘドリンプロモヌタヌの調節䞋に眮くこずができる。をうたく挿入するず、ポリヘドリン遺䌝子は䞍掻性化し、コヌト蛋癜を欠く組換えりむルスが生成する。次いでこの組換えりむルスをS.frugiperda现胞たたはTrichoplusiaの幌虫ぞの感染に䜿甚し、そこでを発珟させるこずができる。
哺乳動物発珟系
りむルスに基づく倚くの発珟系を甚いお哺乳動物宿䞻现胞でを発珟させるこずができる。䟋えば、発珟ベクタヌずしおアデノりむルスを䜿甚する堎合、をコヌドしおいる配列は、埌期プロモヌタヌおよび郚に分かれたリヌダヌ配列を含むアデノりむルス転写翻蚳耇合䜓䞭にラむゲヌションできる。該りむルスゲノムの非必須たたは領域における挿入を甚いお、感染宿䞻现胞においおを発珟できる生存りむルスを取埗できるEngelhard et al.(1994)]。所望によりラりス肉腫りむルス゚ンハンサヌのような転写゚ンハンサヌを甚いお哺乳動物宿䞻现胞での発珟を増倧させるこずができる。
ヒト人工染色䜓もたた、プラスミドが内包し発珟する断片よりも倧きな断片の運搬に䜿甚できる。ないしのを組み立お、垞套的デリバリヌ法により现胞に到達させる䟋えば、リポ゜ヌム、ポリカチオンアミノポリマヌ、たたは小胞。さらに、をコヌドしおいる配列の、より効率的な翻蚳を達成するために、特異的開始シグナルを䜿甚できる。係るシグナルは開始コドンおよび連続配列を包含するKozak配列。をコヌドしおいる配列、その開始コドン、および䞊流配列を適圓な発珟ベクタヌ䞭に挿入した堎合、さらなる転写たたは翻蚳調節シグナルは必芁ないであろう。しかしながら、コヌド化配列たたはその断片のみを挿入した堎合は、倖因性の翻蚳調節シグナル開始コドンを包含するを䟛絊すべきである。開始コドンは挿入物党䜓を確実に翻蚳させるために、正しいリヌディングフレヌムになければならない。倖因性翻蚳芁玠および開始コドンは倩然および合成䞡者の様々な起源であっおよい。
宿䞻现胞
宿䞻现胞菌株は、挿入した配列の発珟を調節する胜力たたは発珟されたを所望の方法で凊理できる胜力を目的ずしお遞択できる。該ポリペプチドのこのような修食には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酞化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻蚳埌プロセシングもたた、正しい挿入、折り畳み、およびたたは機胜を促進するために䜿甚できる。翻蚳埌掻性のための特異的な现胞機構および特城的メカニズムを持぀異なる宿䞻现胞䟋えば、、、、およびが、American Type Culture Collection10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209から入手でき、倖来蛋癜の正しい修食およびプロセシングを確実ずするために遞択できる。
組換え蛋癜の、長期高収量産生のために、安定な発珟が奜たしい。䟋えば、を安定に発珟するセルラむンは、りむルス耇補起点およびたたは内因性発珟芁玠、および同じたたは別のベクタヌ䞊にある遞択マヌカヌ遺䌝子を含む発珟ベクタヌを䜿甚しお、トランスフェクトされ埗る。該ベクタヌの導入に続いお、现胞を匷化培地で−日間生育させた埌、培地を遞択培地に亀換するこずができる。遞択マヌカヌの目的は遞択に察する抵抗性を付䞎するこずであり、その存圚が、導入された配列をうたく発珟する现胞の生育ず回収を可胜にする。安定に圢質転換された现胞の耐性クロヌンは、その现胞型にずっお適圓な組織培逊技術を甚いお増殖させるこずができる。幟぀かの遞択系を甚いお、圢質転換されたセルラむンを回収できる。これらには、それぞれ-たたは-现胞で䜿甚できる単玔ヘルペスりむルスチミゞンキナヌれLogan, (1984)]およびアデニンホスホリボシルトランスフェラヌれ[Wigler, (1977)]遺䌝子が包含されるがこれらに限定される蚳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、たたは陀草剀耐性を遞択の基準に甚いるこずができる。䟋えば、dhfrはメ゜トレキサヌト[Lowy, (1980)]に察する耐性を付䞎し、nptはアミノグリコシド、ネオマむシンおよび−に察する耐性を付䞎し、G-418 [Wigler, (1980)]、そしおalsおよびpatはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラヌれに察する耐性を付䞎する[Colbere-Garapin et al., (1981) ]。さらなる遞択遺䌝子が蚘茉されおいる。䟋えば、trpBは现胞がトリプトファンの代わりにむンドヌルを利甚するようにさせ、hisDは现胞がヒスチゞンの代わりにヒスチノヌルを利甚するようにさせる[Murray,(1992)]。アントシアニンのような可芖マヌカヌ、β−グルクロニダヌれずその基質、およびルシフェラヌれずその基質ルシフェリンは、圢質転換䜓を同定し、特異的ベクタヌ系に垰すこずのできる䞀過性たたは安定な蛋癜発珟の量を定量するために䜿甚できる。
ポリペプチド発珟の怜出
マヌカヌ遺䌝子発珟の存圚はポリヌクレオチドもたた存圚するこずを瀺唆しおいるが、その存圚ず発珟は確認する必芁がある。䟋えば、もしをコヌドしおいる配列がマヌカヌ遺䌝子配列内郚に挿入されるならば、をコヌドしおいる配列を含む圢質転換された现胞は、マヌカヌ遺䌝子機胜の䞍圚によっお同定できる。これに代わり、マヌカヌ遺䌝子は、単䞀のプロモヌタヌの調節䞋にをコヌドしおいる配列ずタンデムに䞊べお䜍眮させるこずもできる。誘導たたは遞択に応答したマヌカヌ遺䌝子の発珟は、通垞、ポリヌクレオチドの発珟を瀺す。
これずは別に、ポリヌクレオチドを含みを発珟する宿䞻现胞は、圓業者に知られる様々な方法によっお同定できる。これらの方法には、−たたは−ハむブリダむれヌションおよび蛋癜生怜たたはむムノアッセむ技術栞酞たたは蛋癜の怜出およびたたは定量のための膜、溶液、たたはチップに基づく技術を包含するが包含されるがこれらに限定されない。䟋えば、をコヌドしおいるポリヌクレオチド配列の存圚は、プロヌブたたは断片たたはをコヌドしおいるポリヌクレオチドの断片を䜿甚する−たたは−ハむブリダむれヌションたたは増幅によっお怜出できる。栞酞増幅に基づく怜定は、ポリヌクレオチドを含む圢質転換䜓を怜出するための、をコヌドしおいる配列から遞択されるオリゎヌクレオチドの䜿甚を含む。
に察し特異的なポリクロヌナルたたはモノクロヌナル抗䜓のいずれかを䜿甚しお該ポリペプチドの発珟を怜出および枬定するための様々なプロトコルが圓分野で知られおいる。䟋ずしお、酵玠結合むムノ゜ルベント怜定、ラゞオむムノアッセむ、および蛍光掻性化セル゜ヌティングがある。䞊の個の非干枉性゚ピトヌプに反応するモノクロヌナル抗䜓を甚いる、郚䜍のモノクロヌナルに基づくむムノアッセむが䜿甚でき、たたは、競合的結合怜定を䜿甚するこずができる。
倚岐にわたる暙識およびコンゞュゲヌション技術が圓業者に知られおおり、様々な栞酞およびアミノ酞怜定に䜿甚できる。をコヌドしおいるポリヌクレオチドに関連する配列を怜出するための暙識化ハむブリダむれヌションたたはプロヌブを調補する手段は、暙識したヌクレオチドを䜿甚する、オリゎ暙識化、ニック翻蚳、末端暙識化、たたは増幅を包含する。これずは別に、をコヌドしおいる配列を、プロヌブの産生のためのベクタヌ䞭にクロヌニングするこずもできる。このようなベクタヌは圓分野で既知であり、垂販品が入手でき、暙識化ヌクレオチドおよび適圓なポリメラヌれ、䟋えば、、たたはを添加するこずによりむンビトロでのプロヌブの合成に䜿甚するこずができる。これらの方法は、垂販の様々なキットを甚いお実斜できるAmersham Pharmacia Biotech、 Promega、およびUS Biochemical。怜出を容易にするために䜿甚できる適圓なリポヌタヌ分子たたは暙識には、攟射性栞皮、酵玠、および蛍光、化孊ルミネセント、たたは色玠生成物質、ならびに基質、補助因子、むンヒビタヌ、磁性粒子などが包含される。
ポリペプチドの発珟および粟補
をコヌドしおいるヌクレオチド配列で圢質転換させた宿䞻现胞は、発珟ず、现胞培逊からの蛋癜の回収に適した条件䞋で培逊できる。圢質転換现胞により産生されたポリペプチドは、その配列およびたたは䜿甚したベクタヌに応じお分泌されたたは现胞内に貯留され埗る。圓業者には理解できるであろうが、をコヌドしおいるポリヌクレオチドを含む発珟ベクタヌは、原栞たたは真栞现胞膜を通った可溶性の分泌を指什する、たたは膜結合の、膜挿入を指什する、シグナル配列を含むよう蚭蚈できる。
䞊に論じたように、他の組み立お物を甚いお、をコヌドしおいる配列を、可溶性蛋癜の粟補を促進するポリペプチドドメむンをコヌドしおいるヌクレオチド配列ず結合させるこずができる。このような粟補促進ドメむンは、金属キレヌト化ペプチド、䟋えば固定化金属䞊での粟補を可胜にするヒスチゞン−トリプトファンモゞュヌル、固定化免疫グロブリン䞊での粟補を可胜にする蛋癜ドメむン、および䌞長芪和粟補系で利甚するドメむンが包含されるが、これらに限定されないImmunex Corp., Seattle, Wash.。粟補ドメむンずずの間に開裂可胜リンカヌ配列、䟋えば第因子たたぱンテロキナヌれに特異的なリンカヌ配列を入れるこずInvitrogen, San Diego, CAもたた、粟補を促進するために利甚できる。このような発珟ベクタヌの぀は、ず、チオレドキシンたたぱンテロキナヌれ開裂郚䜍に先立぀個のヒスチゞン残基ずを含む融合蛋癜の発珟を提䟛する。このヒスチゞン残基は固定化金属むオン芪和クロマトグラフィヌMaddox et al., (1983)による粟補を促進し、䞀方゚ンテロキナヌれ開裂郚䜍は融合蛋癜からのの粟補手段を提䟛する。融合蛋癜を含むベクタヌはPorath et al., (1992)に開瀺されおいる。
化孊合成
をコヌドしおいる配列は、その党䜓たたは䞀郚を、圓分野で呚知の化孊的方法を甚いお合成できる。これずは別に、自身を、そのアミノ酞配列を合成するための化孊的方法、䟋えば固盞技術を甚いる盎接ペプチド合成を甚いお調補できる。蛋癜合成は手動技術たたはオヌトメヌションを甚いお実斜できる。自動化合成は、䟋えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機Perkin Elmerを甚いお達成できる。所望により、の断片を別々に合成し、化孊的方法を甚いお合しお完党長の分子を調補するこずもできる。
新たに合成したペプチドは、調補甚高速液䜓クロマトグラフむヌにより実質的に粟補できる。合成の組成はアミノ酞分析たたは配列決定により確認できる。さらに、盎接合成䞭にのアミノ酞配列の任意の郚分を改倉させ、そしおたたは化孊的方法を甚いお他の蛋癜由来の配列ず合しお、倉異䜓ポリペプチドたたは融合蛋癜を調補するこずができる。
改倉の調補
圓業者には理解できるであろうが、倩然に存圚しないコドンを有するコヌド化ヌクレオチドを調補するこずは有利であり埗る。䟋えば、特定の原栞たたは真栞宿䞻が奜むコドンを遞択しお、蛋癜発珟の速床を増倧させ、たたは所望の性質、䟋えば倩然に存圚する配列から産み出される転写物の半枛期より長い半枛期を持぀転写物を調補するこずができる。
本明现曞に開瀺するヌクレオチド配列は、圓分野で䞀般的に知られる方法を甚いお、該ポリペプチドたたは産物のクロヌニング、プロセシング、およびたたは発珟を修食する改倉を包含する䜆しこれらに限定される蚳ではない様々な理由で、コヌド化配列を改倉させるように蚭蚈できる。無䜜為断片化によるシャフリングず遺䌝子断片および合成オリゎヌクレオチドの再集合を甚いおヌクレオチド配列を蚭蚈できる。䟋えば、䜍眮指定突然倉異誘発を甚いお、新たな制限郚䜍を挿入し、グリコシル化パタヌンを倉え、コドンの優先性を倉え、スプラむス倉異䜓を調補し、突然倉異を導入する等を実斜できる。
抗䜓
圓分野で知られおいるいかなる型の抗䜓も、の゚ピトヌプに特異的に結合するよう䜜補できる。
本明现曞で䜿甚する「抗䜓」ずは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、䟋えば、’2、およびを包含し、これらはの゚ピトヌプに結合できる。兞型的には、゚ピトヌプを圢成するためには少なくずも、、、たたはの連続するアミノ酞が必芁である。しかしながら、非連続アミノ酞を含む゚ピトヌプはより倚くの、䟋えば少なくずも、、たたはのアミノ酞を必芁ずするかも知れない。の゚ピトヌプに特異的に結合する抗䜓は治療に䜿甚でき、そしお免疫化孊怜定、䟋えばりェスタンブロット、、ラゞオむムノアッセむ、免疫組織化孊怜定、免疫沈降、たたはその他の圓分野で既知の免疫化孊的怜定に䜿甚できる。所望の特異性を有する抗䜓の同定のため、様々なむムノアッセむが䜿甚できる。競合的結合たたは免疫攟射怜定のための倚数のプロトコルが圓分野でよく知られおいる。このようなむムノアッセむは兞型的には、免疫原ず、その免疫原に特異結合する抗䜓ずの間の耇合䜓圢成の枬定を含んでいる。
兞型的には、に特異的に結合する抗䜓は、免疫化孊怜定に䜿甚する時、他の蛋癜が提䟛する怜出シグナルより少なくずも、、たたは倍高い怜出シグナルを提䟛する。奜たしくは、に特異結合する抗䜓は、免疫化孊怜定で他の蛋癜を怜出せず、を溶液から免疫沈降させるこずができる。
は、哺乳動物、䟋えばマりス、ラット、りサギ、モルモット、サル、たたはヒトを免疫しおポリクロヌナル抗䜓を産生させるのに䜿甚できる。所望により、は、担䜓蛋癜、䟋えば牛血枅アルブミン、チログロブリン、およびスカシガむヘモシアニンずコンゞュゲヌトさせるこずができる。宿䞻の皮に応じお、免疫孊的反応を増倧させるために皮々のアゞュバントを䜿甚できる。このようなアゞュバントは、フロむントアゞュバント、鉱物性ゲル䟋えば氎酞化アルミニりム、および界面掻性物質䟋えばリゟレシチン、プルロニックポリオヌル、ポリアニオン、ペプチド、油性゚マルゞョン、スカシガむヘモシアニン、およびゞニトロフェノヌルを包含するがこれらに限定されない。ヒトに䜿甚するアゞュバントの䞭ではbacilli Calmette-GuerinおよびCorynebacterium parvumが特に有甚である。
に特異的に結合するモノクロヌナル抗䜓は、培逊䞭の連続的セルラむンにより抗䜓分子の産生を提䟛する任意の技術を甚いお調補できる。これらの技術には、ハむブリドヌマ技術、ヒト现胞ハむブリドヌマ技術、および−ハむブリドヌマ技術があるがこれらに限定されないRoberge et al., (1995)。
さらに、マりス抗䜓遺䌝子をヒト抗䜓遺䌝子にスプラむシングしお適圓な抗原特異性ず生物掻性を持぀分子を埗る、「キメラ抗䜓」の産生のために開発された技術が利甚できる。モノクロヌナルおよびその他の抗䜓はたた、これを治療に䜿甚した堎合に患者が該抗䜓に察する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」するこずができる。このような抗䜓は、治療に盎接䜿甚できるほど配列が充分ヒトに類䌌しおいるかも知れず、たたは幟぀かの重芁残基の倉曎を必芁ずするかも知れない。霧歯類の抗䜓ずヒト配列の間の配列盞違は、個々の残基の䜍眮指定突然倉異誘発により、たたは盞補性決定領域党䜓のにより、ヒト配列内の残基ず盞違する残基を眮き換えるこずによっお最小化するこずができる。に特異的に結合する抗䜓は、米囜特蚱第号に開瀺のように、郚分的たたは完党にヒト化した抗原結合郚䜍を含むこずができる。
これに代わり、圓分野で既知の方法を甚いお、䞀本鎖抗䜓の調補のために蚘茉した技術を適合させ、に特異結合する䞀本鎖抗䜓を調補するこずができる。関連する特異性を持぀が別個のむディオタむプ組成を有する抗䜓を、無䜜為組み合わせ免疫グロブリンラむブラリヌから鎖シャフリングによっお調補するこずができる。䞀本鎖抗䜓はたた、ハむブリドヌマを鋳型に甚いお、のような増幅法を甚いお組み立おるこずができる。䞀本鎖抗䜓は単䞀たたは二重特異性であり埗、たた、二䟡たたは四䟡であり埗る。四䟡二重特異性䞀本鎖抗䜓の組み立おは教瀺されおいる。二䟡二重特異性䞀本鎖抗䜓の組み立おは教瀺されおいる。䞋蚘のように、䞀本鎖抗䜓をコヌドしおいるヌクレオチド配列を手動たたは自動ヌクレオチド合成を甚いお組み立お、暙準的組換え法を甚いお発珟組み立お物䞭にクロヌニングし、そしお现胞䞭に導入しおコヌド化配列を発珟させるこずができる。別法ずしお、䞀本鎖抗䜓を、䟋えば糞状ファヌゞ技術を甚いお盎接調補するこずもできる。
に特異結合する抗䜓はたた、リンパ球集団においおむンビボ産生を誘導するこずによっお、たたは、文献に開瀺されおいる極めお特異的な結合詊薬のパネルたたは免疫グロブリンラむブラリヌをスクリヌニングするこずによっお調補するこずもできる。その他の型の抗䜓を、本発明方法においお組み立お、治療に䜿甚するこずができる。䟋えば、に開瀺のように、キメラ抗䜓を組み立おるこずができる。免疫グロブリンから誘導され倚䟡䞔぀倚重特異的である結合蛋癜、䟋えばに蚘茉の「diabodies」もたた調補できる。
本発明に係る抗䜓は圓分野で呚知の方法により粟補できる。䟋えば、抗䜓は、が結合しおいるカラムを通過させるこずにより芪和粟補できる。次いで、結合した抗䜓を、高い塩濃床の緩衝液を甚いおカラムから溶出するこずができる。
アンチセンスオリゎヌクレオチド
アンチセンスオリゎヌクレオチドは、特定のたたは配列に察し盞補的なヌクレオチド配列である。いったん现胞䞭に導入されるずこの盞補的ヌクレオチドは、該现胞が産生した倩然配列ず結合しお耇合䜓を圢成し、転写たたは翻蚳のいずれかを遮断する。奜たしくはアンチセンスオリゎヌクレオチドは少なくずもヌクレオチド長であるが、少なくずも、、、、、、、、もしくはたたはそれ以䞊のヌクレオチド長であっおもよい。より長い配列もたた䜿甚できる。アンチセンスオリゎヌクレオチド分子を組み立お物に提䟛し、䞊蚘のように现胞䞭に導入しお、その现胞における遺䌝子産物のレベルを䜎䞋させるこずができる。
アンチセンスオリゎヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、たたはこの䞡者の組み合わせであっおよい。オリゎヌクレオチドは、぀のヌクレオチドの’末端を、アルキルホスホネヌト、ホスホロチオ゚ヌト、ホスホロゞチオ゚ヌト、アルキルホスホノチオ゚ヌト、アルキルホスホネヌト、ホスホロアミデヌト、燐酞゚ステル、カルバメヌト、アセトアミデヌト、カルボキシメチル゚ステル、カルボネヌト、および燐酞トリ゚ステルずいった非ホスホゞ゚ステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの’末端ず共有結合させるこずにより、手動で、たたは自動合成機によっお合成できる。
遺䌝子の制埡、’、たたは調節領域ず二本鎖を圢成するアンチセンスオリゎヌクレオチドを蚭蚈するこずにより、遺䌝子発珟の修食が埗られる。転写開始郚䜍、䟋えば開始郚䜍から−および䜍の間から誘導されるオリゎヌクレオチドが奜たしい。同様に、「䞉重らせん」塩基察合法を甚いお阻害を達成できる。䞉重らせん察合は、二重らせんがポリメラヌれ、転写因子たたはシャペロンの結合に足るほど開く胜力の阻害を惹起するため、有甚である。䞉本鎖を甚いる治療䞊の進歩が文献に蚘茉されおいるNicholls, (1993)。転写物がリボ゜ヌムに結合するのを防ぐこずによりの翻蚳を遮断するアンチセンスオリゎヌクレオチドもたた蚭蚈できる。
アンチセンスオリゎヌクレオチドずポリヌクレオチドの盞補配列ずの間に奜結果の耇合䜓を圢成させるためには、正確な盞補性は必芁ない。䟋えばポリヌクレオチドに察し正確に盞補的である、、、もしくはたたはそれ以䞊の長さの連続するヌクレオチドであっお、その各々が、隣接するヌクレオチドずは盞補的ではない連続するある長さのヌクレオチドによっお隔おられおいるものを含有するアンチセンスオリゎヌクレオチドは、に察する充分な暙的化特異性を提䟛できる。奜たしくは、盞補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少なくずも、、、もしくはたたはそれ以䞊のヌクレオチド長である。非盞補的な介圚配列は、奜たしくは、、、たたはヌクレオチド長である。圓業者は、アンチセンス−センスの察の算出融点を容易に䜿甚しお、特定のアンチセンスオリゎヌクレオチドず特定のポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの皋床を決定できるであろう。アンチセンスオリゎヌクレオチドは、ポリヌクレオチドずハむブリダむズする胜力に圱響を及がすこずなく修食できる。これらの修食は該アンチセンス分子の内郚、たたは䞀端もしくは䞡端である。䟋えば、ヌクレオシド間の燐酞結合は、アミノ基ず末端リボヌスの間にいろいろな数の炭玠残基を有するコレステリルたたはゞアミン郚分を加えるこずによっお修食できる。修食された塩基およびたたは糖、䟋えばリボヌスの代わりのアラビノヌス、たたは’ヒドロキシ基たたは’燐酞基が眮換されおいる’、’−眮換オリゎヌクレオチドもたた修食アンチセンスオリゎヌクレオチドに䜿甚できる。これらの修食オリゎヌクレオチドは圓分野で呚知の方法により調補できる。
リボザむム
リボザむムは觊媒掻性を有する分子であるUhlmann, (1987)。圓分野で知られるように、リボザむムは、配列を開裂するこずにより遺䌝子機胜を阻害するのに䜿甚できる。リボザむムの䜜甚機構は、盞補的暙的に察するリボザむム分子の配列特異的ハむブリダむれヌションず、その埌のendonucleolyticな開裂を含む。䟋には、特異的ヌクレオチド配列のendonucleolyticな開裂を特異的䞔぀効果的に觊媒できる、蚭蚈されたハンマヌヘッドモチヌフリボザむム分子がある。ポリヌクレオチドのコヌド化配列を甚いお、ポリヌクレオチドから転写されたに特異結合するリボザむムを䜜補できる。他のトランスの分子を極めお配列特異的に開裂できるリボザむムを蚭蚈し組み立おる方法が開発され、圓分野で蚘茉されおいる。䟋えば、リボザむムの開裂掻性は、別個の「ハむブリダむれヌション」領域を該リボザむム䞭に組み入れるこずによっお、特定のを暙的ずさせるこずができる。このハむブリダむれヌション領域は暙的に察し盞補的な配列を含んでおり、したがっおその暙的ず特異的にハむブリダむズする。暙的内郚の特異的リボザむム開裂郚䜍は、この暙的分子を、以䞋の配列、、およびを包含するリボザむム開裂郚䜍に぀いおスキャンするこずにより同定できる。同定できたならば、該開裂郚䜍を含む暙的の領域に察応する、およびの間のリボヌクレオチドを有する短い配列を、暙的を非機胜的にし埗る二次構造の特城に぀いお評䟡できる。さらに、候補の暙的の適合性を、リボヌクレアヌれ防護怜定を甚いお盞補的オリゎヌクレオチドずのハむブリダむれヌションに察する利甚可胜性を詊隓するこずによっお評䟡できる。配列番号に瀺すヌクレオチド配列およびこれらの盞補物は、適圓なハむブリダむれヌション領域配列の䟛絊源を提䟛する。より長い盞補配列を甚いお、暙的に察するハむブリダむれヌション配列の芪和性を増倧させるこずができる。リボザむムのハむブリダむズおよび開裂する領域は、盞補領域を介しお暙的にハむブリダむズする時、リボザむムの觊媒領域が暙的を開裂し埗るずいったように、完党に盞関しおいる。
リボザむムは組み立お物の䞀郚ずしお现胞内に導入できる。マむクロ泚入、リポ゜ヌム仲介トランスフェクション、電気穿孔、たたは燐酞カルシりム沈殿ずいった機械的方法を甚いお、発珟の䜎䞋が望たれる现胞䞭にリボザむム含有組み立お物を導入するこずができる。これずは別に、现胞が組み立お物を安定的に保持するこずが望たれる堎合は、該組み立お物をプラスミド䞊で䟛絊し、圓分野で知られるように、別個の芁玠ずしお維持するか、たたは现胞のゲノム䞭に組み蟌むこずができる。リボザむムコヌド化組み立お物は、现胞䞭のリボザむムの転写を調節するために、プロモヌタヌ芁玠、゚ンハンサヌたたは芁玠、および転写タヌミネヌタヌシグナルずいった転写調節芁玠を含み埗る米囜特蚱。リボザむムはたた、远加レベルの調節を提䟛するよう蚭蚈でき、その結果、の砎壊はリボザむムず暙的遺䌝子の䞡者が现胞に誘導された時にのみ起こる。
スクリヌニングスクリヌニングアッセむ
調節物質
本明现曞においお甚いられる調節物質は、in vivoたたは in vitroでの掻性に圱響を及がす化合物を意味する。調節物質は、ポリペプチドのアゎニストたたはアンタゎニストであり、発珟を介しお、翻蚳埌修食を介しおたたはその他の手段によっお掻性に察するその圱響を発揮する化合物である。のアゎニストは、に結合したずきにの掻性を増倧たたは長匕かせる分子である。のアゎニストずしおは、タンパク質、栞酞、炭化氎玠、小分子たたはを掻性化する任意の他の分子が挙げられる。のアンタゎニストは、ず結合したずきに、の掻性の量たたは持続を枛少させる分子である。アンタゎニストずしおは、タンパク質、栞酞、炭化氎玠、抗䜓、小分子たたはの掻性を枛少させる任意の他の分子が挙げられる。
甚語「調節」は、本明现曞に瀺されるように、の掻性の倉化を意味する。䟋えば、調節によっお、のタンパク質掻性、結合特性たたは任意の他の生物孊的、機胜的たたは免疫孊的特性の増倧たたは枛少を匕き起こしうる。
本明现曞においお甚いられおいるずおり、甚語「特異的な結合」たたは「特異的に結合する」は、タンパク質たたはペプチドずアゎニスト、抗䜓たたはアンタゎニストずの間の盞互䜜甚を意味する。本発明は、結合する分子によっお認識されるタンパク質の特定の構造即ち、抗原決定基たたぱピトヌプの存圚に䟝存する。䟋えば、抗䜓が゚ピトヌプに特異的である堎合、フリヌの暙識されたず抗䜓を含む反応物における、゚ピトヌプを含むポリペプチドの存圚たたはフリヌの暙識されたの存圚は、抗䜓ず結合する暙識されたの量を枛少するであろう。
本発明は、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、、喘息、生殖泌尿系の疟患および炎症性疟患の凊眮に䜿甚するこずができる化合物を同定するための方法本明现曞では「スクリヌニングアッセむ」ずもいうを提䟛する。本方法は、に結合する、およびたたはの生物孊的掻性たたはその発珟に察しお刺激たたは阻害効果を有する候補化合物たたは詊隓化合物たたは詊薬䟋えば、ペプチド、ペプチド暡擬物、小分子、たたは他の分子を同定し、次いで、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、、喘息、生殖泌尿系の疟患および炎症性疟患に関する症状たたは障害に察しお効果を有する化合物の発珟を枬定するこずを必芁ずする。
に結合する、およびたたはの掻性たたは発珟に察しお刺激たたは阻害効果を有する、候補たたは詊隓化合物たたは詊薬は、现胞衚面にを発珟する现胞を甚いるアッセむ现胞ベヌスのアッセむか、たたは単離されたを甚いたアッセむ现胞䞍含アッセむのいずれかにおいお同定する。様々なアッセむには様々なの倉異䜓䟋えば、完党長の、の生物孊的に掻性な断片たたはの党郚たたは䞀郚分を含む融合タンパク質を甚いるこずができる。さらに、は、任意の適圓な哺乳類䟋えば、ヒト、ラットたたはマりスに由来し埗る。アッセむは、詊隓化合物たたはに察する既知のリガンドの結合の間接的たたは盎接的な枬定を䌎う結合アッセむであっおよい。アッセむはたた、の掻性の盎接的たたは間接的枬定を䌎う掻性分析であり埗る。このアッセむはたた、たたはタンパク質の発珟の盎接的たたは間接的枬定を䌎う発珟アッセむであり埗る。様々なスクリヌニングアッセむを、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、、喘息、生殖泌尿系の疟患および炎症性疟患の症状に察する詊隓化合物の効果の枬定を䌎うin vivoアッセむず組み合わせる。
぀の態様では、本発明は、の膜に結合した现胞衚面で発珟した圢態に結合たたはその掻性を調節する候補化合物たたは詊隓化合物をスクリヌニングするためのアッセむを提䟛する。そのようなアッセむは、完党長の、の生物孊的に掻性な断片たたはの党郚たたは䞀郚分を含む融合タンパク質を甚いるこずができる。以䞋により詳现に蚘茉するように、詊隓化合物を任意の適圓な手段によっお、䟋えば、慣甚の化合物ラむブラリヌから埗るこずができる。の膜結合圢態に結合する詊隓化合物の胜力の枬定は、䟋えば、䟋えば、詊隓化合物ずを発珟しおいる现胞ずの結合が、耇合䜓における暙識化合物の怜出によっお枬定するこずができるように、攟射青銅元玠たたは酵玠暙識ずをカップリングさせるこずにより行うこずができる。䟋えば、詊隓化合物を、125、35、14たたは3で、盎接的たたは間接的に暙識し、攟射胜攟射の盎接的蚈枬により、たたはシンチレヌション蚈枬により攟射性同䜍元玠を怜出するこずができる。あるいは、詊隓化合物を、䟋えばホヌスラディッシュ・ペルオキシダヌれ、アルカリホスファタヌれ、たたはルシフェラヌれで酵玠的に暙識し、酵玠暙識を適圓な基質の生成物ぞの倉換を枬定するこずにより怜出するこずができる。
競合結合方匏では、アッセむは、を発珟しおいる现胞を、に結合し分析混合物を圢成する既知の化合物に接觊させ、その分析混合物を詊隓化合物ず接觊させお、詊隓化合物がを発珟しおいる现胞ず盞互䜜甚する胜力を枬定するこずを含み、ここで、を発珟しおいる现胞ず盞互䜜甚する胜力の枬定は、を発珟しおいる现胞に優先的に結合する詊隓化合物の既知の化合物ず比范した胜力を枬定するこずを含む。
さらなる態様では、アッセむは、现胞衚面に発珟したの膜結合圢態䟋えば、完党長、の生物孊的に掻性な断片たたはの党郚たたは䞀郚分を含む融合タンパク質を発珟しおいる现胞を詊隓化合物ず接觊させるこず、およびの膜結合圢態の掻性をを調節する䟋えば、刺激たたは阻害する詊隓化合物の胜力を枬定するこずを含む、现胞ベヌスのアッセむである。の膜結合圢態の掻性を調節する詊隓化合物の胜力の枬定は、の掻性を枬定するのに適圓な方法、䟋えばタンパク質共圹受容䜓たたは他の回膜貫通型受容䜓の掻性の枬定にお適圓な任意の方法以䞋により詳现に蚘茉によっお行うこずができる。回膜貫通型受容䜓は、数倚くの方法任意の䞎えられた受容䜓に適圓な方法がこれらのすべおではないによっお枬定するこずができる。掻性の枬定のなかには以䞋のものがある现胞内2+濃床の倉化、ホスホリパヌれの掻性化、现胞内むノシトヌル䞉リン酞3濃床の倉化、现胞内ゞアシルグリセロヌル濃床の倉化、および现胞内アデノシンサむクリック’、’−䞀リン酞濃床の倉化。
の掻性を調節する詊隓化合物の胜力の枬定は、䟋えば、暙的分子に結合たたは盞互䜜甚するの胜力を枬定するこずによっお行うこずができる。暙的分子は、が珟実に結合するたたは盞互䜜甚する分子、䟋えば、を発珟しおいる现胞の衚面䞊の分子、第の现胞の衚面䞊の分子、现胞倖の環境の分子、现胞膜の内郚衚面に䌚合しおいる分子たたは现胞質の分子であり埗る。暙的分子は现胞倖シグナル䟋えば、リガンドの結合によっお生じる现胞膜を介する现胞ぞのシグナルの䌝達を助長するシグナル䌝達経路を構成するものであっおよい。暙的分子は、䟋えば、觊媒掻性を有する第の现胞内タンパク質たたは䞋流のシグナル䌝達分子ずずの䌚合を促進するタンパク質であっおよい。
暙的分子ず結合たたは盞互䜜甚するの胜力の枬定は、盎接的な結合に぀いお䞊蚘した方法の぀によっお行うこずができる。぀の態様では、暙的分子ず結合するたたは盞互䜜甚する本発明のポリペプチドの胜力の枬定は暙的分子の掻性を枬定するこずによっお行うこずができる。䟋えば、暙的分子の掻性は、暙的の现胞の第のメッセンゞャヌ䟋えば、现胞内2+、ゞアシルグリセロヌル、3などの誘導を怜出するこず、適圓な基質に察する暙的の觊媒酵玠掻性を怜出するこず、レポヌタヌ遺䌝子䟋えば、怜出可胜なマヌカヌ䟋えばルシフェラヌれをコヌドする栞酞に䜜動可胜な様に連結した本発明のポリペプチドに応答する調節゚レメントの誘導を怜出するこず、たたは现胞の応答を怜出するこずによっお枬定するこずができる。
本発明は、さらに现胞䞍含のアッセむを含む。そのようなアッセむは、の圢態の䟋えば、完党長の、生物孊的に掻性なの断片たたはのすべおたたは䞀郚を含む融合タンパク質ず詊隓化合物ずの接觊、およびに結合する詊隓化合物の胜力の枬定を䌎う。に察する詊隓化合物の結合は、䞊蚘のように盎接的たたは間接的に枬定するこずができる。぀の態様では、アッセむは、ずに結合する既知の化合物ず接觊させおアッセむ混合物を圢成し、アッセむ混合物を詊隓化合物ず接觊させ、およびず盞互䜜甚する詊隓化合物の胜力の枬定するこずを含み、ず盞互䜜甚する詊隓化合物の胜力の枬定は、既知の化合物ず比范しお、に優先的に結合する詊隓化合物の胜力を枬定するこずを含む。
本発明の现胞䞍含アッセむは、の膜結合圢態を甚いるかたたは可溶性の断片を甚いるかに圱響を受けやすい。ポリペプチドの膜結合圢態を甚いる现胞䞍含アッセむでは、可溶化剀を甚いお、ポリペプチドの膜結合圢態を溶液䞭に維持するこずが望たしいであろう。そのような可溶化剀の䟋ずしおは、非むオン界面掻性剀、䟋えば−オクチルグルコシド、−ドデシルグルコシド、−ドデシルマルトシド、オクタノむル−−メチルグルカミド、デカノむル−−メチルグルカミド、TritonX-100、TritonX-114、Thesit、む゜トリデシポリ゚チレングリコヌル゚ヌテル、−−コラミドプロピルゞメチルアミノ−−プロパンスルホネヌト、−−コラミドプロピルゞメチルアミノ−−ヒドロキシ−−プロパンスルホネヌト、たたは−ドデシル、−ゞメチル−−アンモニオ−−プロパンスルホネヌトが挙げられる。
本発明の䞊蚘アッセむ法の様々な態様では、たたは暙的分子を固定化しお、぀のたたは䞡方のタンパク質の、耇合䜓を圢成しおいない圢態からの耇合䜓の分離を容易にし、䞊びにそのアッセむを自動化に適応させるこずが望たしいであろう。候補化合物の存圚䞋および非存圚䞋でのに察する詊隓化合物の結合、ず暙的分子ずの盞互䜜甚は、詊薬を入れるのに適圓な任意の容噚内で行うこずができる。そのような容噚の䟋ずしおは、マむクロタむタヌプレヌト、詊隓管およびマむクロ遠心チュヌブが挙げられる。぀の態様では、融合タンパク質は、䞀方たたは䞡方のタンパク質がマトリックスに結合するこずが可胜なドメむンを付加しお提䟛される。䟋えば、グルタチオン−−トランスフェラヌれ融合タンパク質たたはグルタチオン−−トランスフェラヌれ融合タンパク質をグルタチオンセファロヌスビヌズSigma Chemical; St. Louis, Mo.)たたはグルタチオン誘導マむクロタむタヌプレヌト䞊に吞着させた埌、それを詊隓化合物、たたは詊隓化合物および吞着させおいない暙的タンパク質たたはのいずれかず混合し、その混合物を耇合䜓圢成を匕き起こす条件䞋䟋えば、塩およびに぀いおの生理孊的条件でむンキュベヌションさせるこずができる。むンキュベヌションした埌、ビヌズたたはマむクロタむタヌプレヌトのりェルを掗浄しお、結合しなかった成分を陀去し、耇合䜓圢成を盎接的たたは間接的に、䟋えば䞊蚘のように枬定する。あるいは、耇合䜓をマトリックスから解離させ、結合のレベルたたはの掻性を暙準的な技術を甚いお枬定するこずができる。
タンパク質をマトリックス䞊に固定化するその他の技術も本発明のスクリヌニングアッセむに甚いるこずができる。䟋えば、たたはその暙的分子のいずれかをビオチンおよびストレプタビゞンのコンゞュゲヌションを甚いお固定化するこずができる。本発明のビオチン化されたポリペプチドたたは暙的分子は、圓分野に呚知の技術を甚いおビオチン−−ヒドロキシ−サクシンむミドから調補するこずができ䟋えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals; Rockford, 111.、ストレプタビゞンをコヌティングしたプレヌトPierce Chemicalのりェルにおいお固定化するこずができる。あるいは、たたは暙的分子ず反応するが、本発明のポリペプチドずその暙的分子ずの結合に干枉しない抗䜓をプレヌトのりェルに誘導し、結合しなかった暙的たたは本発明のポリペプチドを抗䜓結合によっおりェルにおいおトラップするこずができる。固定化耇合䜓に぀いお䞊蚘した方法に加えお、そのような耇合䜓を怜出する方法ずしおは、たたは暙的分子ず反応する抗䜓を甚いた耇合䜓の免疫怜出、䞊びにたたは暙的分子に関連する酵玠掻性を怜出するこずによる酵玠結合アッセむが挙げられる。
スクリヌニングアッセむはたた、の発珟のモニタリングを䌎う。䟋えば、の発珟の調節物質を、现胞を候補化合物ず接觊させ、タンパク質たたは现胞内のを枬定する方法においお同定するこずができる。候補化合物存圚䞋でのタンパク質たたはの発珟のレベルを、候補化合物非存圚䞋でのタンパク質たたはの発珟のレベルず比范する。次いで、この比范に基づき、候補化合物をの発珟の調節物質ずしお同定するこずができる。䟋えば、候補化合物の存圚䞋で非存圚䞋よりもタンパク質たたはの発珟がより倧きい実質的に有意に倧きい堎合、候補化合物をタンパク質たたは発珟の刺激物質ずしお同定する。あるいは、候補化合物の存圚䞋で非存圚䞋よりもタンパク質たたはの発珟がより小さい実質的に有意に小さい堎合、候補化合物をタンパク質たたは発珟の阻害物質ずしお同定する。现胞におけるタンパク質たたは発珟のレベルを、以䞋に蚘茉の方法によっお枬定するこずができる。
結合怜定
結合怜定に぀いおは、被隓化合物は奜たしくは、の掻性郚䜍に結合しおこれを占有し、それにより基質がリガンド結合郚䜍に接近できなくさせ、その結果正垞な生物掻性が劚げられるような小分子である。このような小分子の䟋は小ペプチドたたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される蚳ではない。本発明に係るポリペプチドに結合する可胜性あるリガンドは、既知のの倩然リガンドおよびその類䌌䜓たたは誘導䜓を包含するが、これらに限定されない。
結合怜定では、被隓化合物たたはのいずれかが怜出可胜な暙識、䟋えば蛍光、攟射性同䜍元玠、化孊ルミネセント、たたは酵玠暙識䟋えば西掋ワサビペルオキシダヌれ、アルカリホスファタヌれ、たたはルシフェラヌれを含むこずができる。そこで、に結合しおいる被隓化合物の怜出は、䟋えば攟射胜の攟出を盎接蚈数するこずにより、たたはシンチレヌション蚈数により、たたは怜出可胜産物ぞの適圓な基質の倉換を枬定するこずにより、達成できる。別法ずしお、ぞの被隓化合物の結合を、反応䜓のいずれをも暙識せずに枬定するこずができる。䟋えば、マむクロフィゞオメヌタヌを甚いお、被隓化合物ずずの結合を怜出できる。マむクロフィゞオメヌタヌ䟋えばサむトセンサヌずは、现胞がその環境を酞性化する速床を光アドレッサブル電䜍差センサヌを甚いお枬定する分析機噚である。この酞性化速床の倉化は、被隓化合物ずの盞互䜜甚の指暙ずしお䜿甚できるHaseloff, (1988)]。
被隓化合物がに結合する胜力の枬定はたた、リアルタむム生物分子盞互䜜甚解析のような技術を甚いお達成できる[McConnell et al. (1992), Sjolander & Urbaniczky (1991)]。は、いかなる反応䜓をも暙識せずに、生䜓特異的盞互䜜甚を実時間で研究するための技術である䟋えばBIAcore(登録商暙)。光孊的珟象衚面プラズモン共鳎の倉化を、生䜓分子間の実時間反応の指暙に䜿甚できる。
本発明のさらに別の態様では、を二ハむブリッド怜定たたは䞉ハむブリッド怜定䟋えば、Szabo et al., (1995); Zervos et al. (1993); Madura et al. (1993); Bartel et al. (1993)];米囜特蚱第5,283,317における「おずり蛋癜」ずしお䜿甚し、に結合たたはこれず盞互䜜甚しおその掻性を調節する他の蛋癜を同定するこずができる。
二ハむブリッド系は殆どの転写因子のモゞュヌル的性栌に基づくものであり、それは、分離可胜な結合および掻性化ドメむンから成っおいる。簡朔に述べるず、この怜定は二皮の異なる組み立お物を利甚する。䟋えば、䞀方の組み立お物においおは、をコヌドしおいるポリヌクレオチドが、既知の転写因子の結合ドメむンをコヌドしおいるポリヌクレオチドに融合できる䟋えば−。別の組み立お物においおは、未同定蛋癜「逌」たたは「詊料」をコヌドしおいる配列が、既知の転写因子の掻性化ドメむンをコヌドしおいるポリヌクレオチドに融合できる。もし「おずり」および「逌」蛋癜がむンビボで盞互䜜甚しお蛋癜䟝存耇合䜓を圢成できたならば、該転写因子の結合および掻性化ドメむンは極めお近䜍に招来される。この近䜍性が、転写因子に応答する転写調節郚䜍ず機胜的に結合しおいるリポヌタヌ遺䌝子䟋えばの転写を可胜にする。リポヌタヌ遺䌝子の発珟が怜出でき、機胜的転写因子を含む现胞コロニヌを単離し、ず盞互䜜甚する蛋癜をコヌドしおいる配列取埗に䜿甚するこずができる。
反応䜓の䞀方たたは䞡方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そしお怜定の自動化の䟿宜を図るため、たたはポリヌクレオチドたたは被隓化合物のいずれかを固定化するこずが望たしいかも知れない。したがっお、たたはポリヌクレオチドたたは被隓化合物のいずれかを固䜓支持䜓に結合させるこずができる。奜適な固䜓支持䜓は、ガラスたたはプラスチックスラむド、組織培逊プレヌト、埮量定量りェル、管、シリコンチップ、たたはビヌズラテックス、ポリスチレン、たたはガラスビヌズを包含するがこれらに限定されないのような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吞収、たたはそれぞれポリペプチドたたはポリヌクレオチドたたは被隓化合物に付着させた結合郚分ず固䜓支持䜓の察、の䜿甚を包含する、圓分野で既知の任意の方法を甚いおたたはポリヌクレオチドたたは被隓化合物を固䜓支持䜓に付着させるこずができる。被隓化合物は奜たしくは敎列しお固䜓支持䜓に結合させ、その結果個々の被隓化合物の䜍眮を远跡するこずができる。たたはポリヌクレオチドぞの被隓化合物の結合は、反応䜓を入れるのに適した任意の容噚で達成できる。係る容噚の䟋には埮量定量プレヌト、詊隓管、および埮量遠沈管がある。
䞀぀の態様においお、は、を固䜓支持䜓に結合させるドメむンを含む融合蛋癜である。䟋えば、グルタチオン−−トランスフェラヌれ融合蛋癜をグルタチオンセファロヌスビヌズSigma Chemical, St.Louis, Mo.䞊たたはグルタチオン誘導䜓化埮量定量プレヌト䞊に吞着させ、次いでこれを被隓化合物たたは被隓化合物および非吞着に合し次にこの混合物を耇合䜓圢成が行われる条件䞋でむンキュベヌトする䟋えば、塩およびに関しお生理的条件。むンキュベヌションの埌、ビヌズたたは埮量定量プレヌトのりェルを掗浄しお未結合成分を陀去する。反応䜓の結合は䞊蚘のように盎接的たたは間接的に枬定できる。別法ずしお、耇合䜓を固䜓支持䜓から解離させた埌に結合を枬定するこずもできる。
本発明に係るスクリヌニング怜定には、蛋癜たたはポリヌクレオチドを固䜓支持䜓䞊に固定化するためのその他の技術を䜿甚するこずもできる。䟋えば、たたはをコヌドするポリヌクレオチドたたは被隓化合物のいずれかを、ビオチンずストレプトアビゞンのコンゞュゲヌションを利甚しお固定化できる。圓分野で呚知の技術䟋えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford,Ill.を甚いお、ビオチニル化したたたはポリヌクレオチドたたは被隓化合物をビオチン−−ヒドロキシスクシンむミドから調補し、ストレプトアビゞン被芆したりェルプレヌトPierce Chemicalのりェルに固定化できる。別法ずしお、、ポリヌクレオチド、たたは被隓化合物に特異的に結合するが、所望の結合郚䜍、䟋えばの掻性郚䜍に干枉しない抗䜓をプレヌトのりェルに誘導䜓化するこずができる。未結合の暙的たたは蛋癜が抗䜓コンゞュゲヌションによりりェル䞭に捕捉できる。−固定化耇合䜓に぀いお䞊に蚘茉した方法に加え、このような耇合䜓を怜出する方法には、たたは被隓化合物に特異結合する抗䜓を甚いる、耇合䜓の免疫怜出、の掻性怜出ぞず匕き継がれる酵玠結合怜定、および非還元条件䞋でのゲル電気泳動がある。
たたはポリヌクレオチドに結合する被隓化合物を求めるスクリヌニングは、無傷の现胞で実斜するこずもできる。たたはポリヌクレオチドを含む任意の现胞が、现胞に基づく怜定系で䜿甚できる。ポリヌクレオチドは现胞䞭に倩然に存圚し、たたは䞊蚘のような技術を甚いお導入できる。たたはポリヌクレオチドに察する被隓化合物の結合は、䞊蚘のように枬定する。
機胜怜定
の生物孊的効果を増倧たたは䜎䞋させる胜力に぀いお被隓化合物を詊隓できる。の掻性は、䞋蚘の具䜓的実斜䟋に蚘茉の機胜怜定を甚いお枬定できる。掻性は、粟補した、现胞膜調補物、たたは無傷の现胞を被隓化合物ず接觊させた埌に実斜できる。掻性を少なくずも玄、奜たしくは玄、より奜たしくは玄、、たたは䜎䞋させる被隓化合物を、掻性を䜎䞋させる可胜性ある物質ずしお同定する。の掻性を少なくずも玄、奜たしくは玄、より奜たしくは玄、、たたは増倧させる被隓化合物を、掻性を増倧させる可胜性ある物質ずしお同定する。
このようなスクリヌニング方法の぀は、を発珟するようトランスフェクトしたメラニン保有现胞の䜿甚を含む。係るスクリヌニング技術は幎月日公開のに蚘茉されおいる。したがっお、䟋えばこのような怜定を䜿甚しお、該レセプタヌを含むメラニン保有现胞を、レセプタヌリガンドず、スクリヌニングされる被隓化合物の䞡者に接觊させるこずにより、レセプタヌポリペプチドの掻性化を阻害する化合物を求めるスクリヌニングができる。リガンドが生成するシグナルの阻害は、被隓化合物がそのレセプタヌに぀いおの可胜性あるアンタゎニストであるこず、即ち該レセプタヌの掻性化を阻害するこずを瀺す。このスクリヌニングは、係る现胞をスクリヌニングすべき化合物ず接觊させるこずにより、レセプタヌを掻性化する被隓化合物を同定するために、そしお各被隓化合物がシグナルを生成するかどうか、即ちレセプタヌを掻性化するかどうかを決定するために䜿甚できる。
その他のスクリヌニング技術は、レセプタヌ掻性化により惹起される现胞倖倉化を枬定する系においおヒトを発珟する现胞䟋えば、トランスフェクトされた现胞を䜿甚するこずを包含するIwabuchi, (1993)。䟋えば、化合物を本発明の受容䜓ポリペプチドを発珟する现胞に接觊させ、二次メッセンゞャヌ反応、䟋えばシグナル䌝達たたは倉化を枬定しお、被隓化合物が該レセプタヌを掻性化するか阻害するかを決定できる。別のこのようなスクリヌニング技術は、をコヌドしおいるをXenopus卵母现胞内に導入し、該レセプタヌを䞀過性発珟させるこずを含む。次いでトランスフェクトさせた卵母现胞をレセプタヌリガンドおよびスクリヌニングすべき被隓化合物に接觊させ、その埌、該レセプタヌの掻性化を阻害するず思われる被隓化合物に぀いおスクリヌニングする堎合は、カルシりムシグナルの掻性化たたは阻害の怜出を行う。
別のスクリヌニング技術は、レセプタヌがホスホリパヌれたたはに結合しおいる现胞でを発珟させるこずを含む。このような现胞には、内皮现胞、平滑筋现胞、胚性腎现胞などがある。スクリヌニングは䞊蚘のように、ホスホリパヌれ掻性の倉化から該レセプタヌの掻性化皋床を定量するこずにより達成できる。
遺䌝子発珟
別の態様では、遺䌝子の発珟を増倧たたは枛少させる被隓化合物を同定する。本明现曞においお甚いられる「ポリヌクレオチドの発珟に関連する」なる語は、ノヌザン解析たたはリアルタむムによる、をコヌドする栞酞配列そのものたたはそれに関連する栞酞の存圚の怜出がサンプル内のをコヌドする栞酞の存圚の指暙ずなり、それによっおをコヌドするポリヌクレオチドからの転写の発珟ず関連があるこずを瀺す。本明现曞においお甚いられる「マむクロアレむ」は、玙、ナむロンたたは任意の他のタむプの膜、フィルタヌ、チップ、スラむドガラスたたは任意の他の適圓な固䜓の支持䜓等の基材䞊に䞊べられた個々のポリヌクレオチドたたはオリゎヌクレオチドの䞊びを意味する。ポリヌクレオチドを被隓化合物ず接觊させ、たたはポリヌクレオチドのポリペプチド産物の発珟を枬定する。被隓化合物存圚䞋での適圓なたたはポリペプチドの発珟レベルを、該被隓化合物䞍圚䞋でのたたはポリペプチドの発珟レベルず比范する。するず被隓化合物が、この比范に基づく発珟のモゞュレヌタヌずしお同定できる。䟋えば、たたはポリペプチドの発珟が、被隓化合物の䞍圚時よりも存圚時により倧きい堎合は、この被隓化合物を、該たたはポリペプチド発珟の刺激物質たたは増匷物質ず同定する。そうではなく、たたはポリペプチドの発珟が、被隓化合物の䞍圚時よりも存圚時により小さい堎合は、この被隓化合物を、該たたはポリペプチド発珟のむンヒビタヌず同定する。
现胞におけるたたはポリペプチド発珟のレベルは、たたはポリペプチドを怜出するための圓分野で呚知の方法により決定できる。定性たたは定量的方法のいずれかが䜿甚できる。ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存圚は、䟋えばラゞオむムノアッセむのような免疫化孊的方法、り゚スタンブロッティング、および免疫組織化孊を包含する、圓分野で呚知の様々な技術を甚いお決定できる。別法ずしお、ポリペプチド合成は、内ぞの暙識アミノ酞の取り蟌みを怜出するこずにより、むンビボで、现胞培逊で、たたはむンビトロ翻蚳系で決定できる。
このようなスクリヌニングは、無现胞怜定系たたは無傷の现胞のいずれかで実斜できる。ポリヌクレオチドを発珟するいかなる现胞も现胞に基づく怜定系で䜿甚できる。ポリヌクレオチドは现胞内に倩然に存圚するか、たたは䞊蚘のような技術を甚いお導入するこずができる。䞀次培逊たたは確立されたセルラむンのいずれかを䜿甚できる。
被隓化合物
本発明のスクリヌニング解析においお甚いるための適圓な被隓化合物は、任意の適圓な䟛絊源、䟋えば慣甚の化合物ラむブラリヌから入手するこずができる。詊隓化合物は、生物孊的ラむブラリヌ、空間的アドレス特定可胜な䞊行固盞たたは液盞ラむブラリヌ、デコンボルヌションを芁する合成ラむブラリヌ法、「䞀ビヌズ䞀化合物」ラむブラリヌ法、および芪和クロマトグラフィヌ遞択を甚いる合成ラむブラリヌ法を包含する䜆しこれらに限定される蚳ではない圓分野で既知の数倚くの組み合わせラむブラリヌ法のいずれかを甚いお取埗できる。生物孊的ラむブラリヌアプロヌチはポリペプチドラむブラリヌに限定されおいるが、他の皮のアプロヌチはペプチド、非ペプチドオリゎマヌ、たたは化合物の小分子ラむブラリヌに適甚できる。Lam, (1997)。分子ラむブラリヌの合成法は圓分野でよく知られおいる。化合物のラむブラリヌは溶液でたたはビヌズ、チップ、现菌たたは胞子、プラスミドたたはファヌゞ䞊に提䟛できる。
調節物質のモデリング
コンピュヌタモデリングおよびサヌチ技術よっお、化合物の同定、たたは発珟たたは掻性を調節するこずができる既に同定されおいる化合物の改良が可胜である。そのような化合物たたは組成物が同定されおいれば、掻性郚䜍たたは領域が同定される。そのような掻性郚䜍は兞型的には、に察するリガンドの盞互䜜甚ドメむンのようなリガンド結合であろう。掻性郚䜍は、䟋えば、ペプチドのアミノ酞配列から、栞酞のヌクレオチド配列から、たたは関連する化合物たたは組成物ずその倩然リガンドずの耇合䜓の研究から、圓分野で呚知の方法を甚いお同定するこずができる。埌者の堎合、化孊的たたは線結晶孊的方法を甚いお、その因子においお耇合䜓化したリガンドが認められる堎所を芋぀けるこずにより掻性郚䜍を芋぀けるこずができる。
次に、掻性郚䜍の次元幟䜕構造を決定する。これは、完党な分子構造を決定するこずができる、線結晶孊を含む圓分野においお呚知の方法によっお行うこずができる。他方、固盞たたは液盞を甚いお特定の分子内距離を決定するこずができる。他の任意の構造決定の実隓方法を甚いお郚分的たたは完党な幟䜕構造を埗るこずができる。幟䜕構造は、倩然たたは人工の、決定された掻性郚䜍の粟床を増し埗る耇合䜓化したリガンドを甚いお枬定するこずができる。
粟床の䞍完党なたたは䞍十分な構造を決定する堎合、コンピュヌタベヌスの数倀モデリングの方法を甚いお構造を比范たたは粟床を改善するこずができる。タンパク質たたは栞酞のような具䜓的な生物高分子に察しお特異的なパラメヌタヌ化されたモデル、分子運動の蚈算に基づく分子動力孊モデル、熱集団thermal ensembleに基づく統蚈力孊モデル、たたは組合せモデルを含む、認識されおいる任意のモデリング方法を甚いるこずができる。倧郚分のタむプのモデルずしおは、構成原子ず基ずの間の力を瀺す暙準分子力堎、を必芁ずし、物理化孊においお知られおいる力堎から遞択するこずができる。䞍完党たたは粟床の䜎い、実隓で埗られた構造は、これらのモデリング方法によっお蚈算される完党なそしおより粟床の高い構造に察する制玄ずしお䟛する。
最埌に、掻性郚䜍の構造が決定されれば、実隓的に、モデリングによりたたは組合せにより、候補の調節化合物をその分子構造に関する情報ず共に含むデヌタベヌスを怜玢するこずにより同定するこずができる。そのような怜玢は、決定された掻性郚䜍の構造ず合臎し、掻性郚䜍を定矩する基ず盞互䜜甚する構造を有する化合物を探す。このような怜玢は、手動でもよいが、コンピュヌタを䜿甚するものであるこずが奜たしい。この怜玢から芋いだされたこれらの化合物は、可胜性のある調節化合物である。
あるいは、これらの方法を甚いお既に知られおいる調節化合物たたはリガンドから改善された調節化合物を同定するこずができる。既知の化合物の組成物を修食し、実隓的なおよび新たな組成物に適甚された䞊蚘のコンピュヌタモデリング法を甚いお修食の構造䞊の効果を決定するこずができる。次いで、倉化した構造を化合物の掻性郚䜍の構造ず比范しお、改善された適合かたたは盞互䜜甚の結果かを決定する。このやり方では、䟋えば様々な偎鎖基による、組成における䜓系的な倉化を迅速に評䟡しお修食された調節化合物たたは改善された掻性たたは特異性を有するリガンドを埗るこずができる。
治療䞊の適応および方法
本願によりが様々なヒト組織においお発珟するこずが分かった。
䞭枢神経系障害
障害は、䞭枢神経系の障害䞊びに末梢神経系の障害を包含する。
障害には、脳損傷、脳血管疟患およびその垰結、パヌキン゜ン病、倧脳皮質基底栞倉性症、運動ニュヌロン疟患、を含む痎呆、倚発性硬化症、倖傷性脳損傷、脳卒䞭、脳卒䞭埌、倖傷埌脳損傷、および小血管脳血管疟患などが含たれる。たた、アルツハむマヌ病、血管性痎呆、レビ小䜓を䌎う痎呆、番染色䜓に連鎖する前頭偎頭型痎呆およびパヌキン゜ニズム、ピック病を含む前頭偎頭型痎呆、進行性栞性麻痺、倧脳皮質基底栞倉性症、ハンチントン病、芖床倉性症、クロむツフェルトダコブ痎呆、痎呆、痎呆を䌎う粟神分裂病、およびコルサコフ粟神病などの痎呆も、本発明の意味においお障害であるずされる。
同様に、軜床認知障害、加霢性蚘憶障害、加霢性認知䜎䞋、血管性認知障害、泚意欠陥障害、泚意欠陥倚動障害、および孊習障害を䌎う小児における蚘憶障害などの認識関連障害もたた障害ず考えられる。
本発明の意味においお、疌痛もたた障害に関連するず考えられる。疌痛は、倚発性硬化症、脊髄損傷、坐骚神経痛、倱敗した腰郚手術failed back surgery症候矀、倖傷性脳損傷、癲癇、パヌキン゜ン病、脳卒䞭埌、及び脳や脊髄における血管砎壊䟋えば、梗塞、出血、血管新生異垞等の障害ず関連しうる。非䞭枢神経因性疌痛には、乳房切陀術埌疌痛、幻芚、反射性亀感神経性ゞストロフィヌ、䞉叉神経痛ラゞオキュロパシヌtrigeminal neuralgiaradio-culopathy、術埌の疌痛、関連疌痛、癌疌痛、代謝神経痛䟋えば、糖尿病性神経障害、結合組織疟患に察する第の血管炎神経障害、䟋えば肺癌、癜血病、リンパ腫、前立腺、倧腞若しくは胃の癌皮、䞉叉神経痛及び疱疹埌神経痛ず関連する腫瘍随䌎性倚発神経障害が挙げられる。疌痛は、末梢神経の損傷、䞭枢性疌痛即ち、脳虚血に起因する、および様々な慢性疌痛、即ち腰痛、背痛腰痛low back pain、炎症性およびリりマチ痛、ず関連する。頭痛䟋えば前兆を䌎う片頭痛、前兆を䌎わない片頭痛、および他の片頭痛障害、偶発性及び慢性緊匵性頭痛、緊匵型様頭痛、矀発性頭痛や慢性発䜜性片頭痛も障害である。膵臓炎、膀胱炎、月経困難、過敏性倧腞症候矀、クヌロン病、胆石疝痛、尿管疝痛、心筋梗塞および骚盀腔の疌痛症候矀、䟋えば䌚陰郚痛、粟巣痛、尿道症候矀およびprotatodynia等の内臓の疌痛もたた障害である。䟋えば、術埌疌痛や倖傷埌疌痛等の急性疌痛もたた、神経系の障害であるず考えられる。
は、様々な脳組織においお高床に発珟する。脳組織における発珟は、ず神経系の疟患ずの関連を瀺唆しおいる。アルツハむマヌ状態の脳における受容䜓の発珟は、健康な脳における発珟の倍高い。は神経系の疟患を凊眮たたは蚺断するために䜿甚するこずができる。
心疟患
心䞍党ずは、心機胜の異垞が、代謝しおいる組織の芁求に盞応じた速床で心臓が血液を送り出せないこずに起因する、病態生理孊的状態ずしお定矩される。これは、基瀎原因に関わりなく、䟋えば高拍出量および䜎拍出量、急性および慢性、右偎および巊偎、収瞮期および拡匵期ずいったような党おの型のポンプ䞍党を包含する。
心筋梗塞は䞀般に、冠血流の突然の䜎䞋ず、これに続き既に動脈硬化によっお狭隘化しおいた冠動脈が血栓により閉塞するこずにより惹起される。予防䞀次および二次的防止、ならびにの急性期治療および合䜵症の防止が包含される。
虚血性疟患は、冠血流が制限され、その結果、心筋の酞玠芁求を満たすに充分でない灌流ずなる状態である。この矀の疟患には、安定アンギナ、䞍安定アンギナ、および無症候性虚血がある。
䞍敎脈ずは党おの圢の心房性および心宀性頻脈心房性頻脈、心房性粗動、心房性现動、心房−心宀リ゚ントリヌ頻脈、早期興奮症候矀、心宀性頻脈、心宀性粗動、および心宀性现動、および埐脈型の䞍敎脈を包含する。
高血圧性血管疟患は、原発性および党おの皮の二次性動脈性高血圧症腎性、内分泌性、神経性、その他を包含する。ここに開瀺する遺䌝子およびその産物は、高血圧症の治療および心疟患から生じる党合䜵症の防止のための薬物暙的ずしお䜿甚できる。
末梢血管疟患ずは、動脈およびたたは静脈血流が枛少し、その結果、血液䟛絊ず組織の酞玠芁求の間に䞍均衡が生じおいる血管疟患ずしお定矩する。これには、慢性末梢動脈閉塞疟患、急性動脈血栓症および塞栓症、炎症性血管疟患、レむノヌ珟象、および静脈疟患が包含される。
アテロヌム性動脈硬化症は、血管の壁が改造リモデリングされ、血管の内匵が脅かされる心疟患である。アテロヌム硬化のリモデリング過皋には、血管の内膜における、平滑筋现胞ず単球マクロファヌゞ炎症现胞の䞡方の集積を䌎う。これらの现胞は、埪環血ず同様、脂質を取蟌み、成熟したアテロヌム性動脈硬化病倉を圢成する。これら病倉の圢成は、慢性過皋であり、成人のヒトの人生の数十幎にわたっお起こり、アテロヌム性動脈硬化症の病的状態の倧郚分は、病倉が砎断し、血栓圢成の砎片が遊離し、動脈がすぐに閉塞する堎合に起きる。そのような急性の事象が冠状動脈においお起こるずき、結果ずしお心筋梗塞が起こり埗、最悪の堎合に死に至る。
アテロヌム性動脈硬化症の病倉の圢成は、遊走、脂質の蓄積、炎症现胞の動員、血管平滑筋现胞の増殖および现胞倖マトリックスの沈積のような、぀の重耇する段階においお起こるず考えられる。これら過皋はそれぞれ、ヒトおよびアテロヌム性動脈硬化症の動物モデルにおいお起きるこずを瀺すこずができるが、病理および病倉の臚床的意味に察するそれぞれの関連する寄䞎は明らかではない。
したがっお、アテロヌム性動脈硬化症や冠状動脈疟患に関連する他の状態などの心疟患の病状を凊眮するための治療方法や治療剀に察する必芁性がある。
心疟患ずしおは、心臓および血管系の以䞋の障害が挙げられるがこれらに限定されない鬱血性心䞍党、心筋梗塞、心臓の虚血性疟患、様々な心房および心宀䞍敎脈高血圧血管障害、末梢血管の疟患、およびアテロヌム性動脈硬化症。
は、心膜、冠動脈平滑筋现胞等の心臓血管に関連する組織においお高床に発珟する。䞊蚘組織における発珟は、ず心疟患ずの間の関連を瀺唆しおいる。心疟患を凊眮たたは蚺断するためにを調節するこずができる。
血液疟患
血液疟患には、血液およびその成分のすべおの障害、䞊びに血液の産生たたは分解に関わる臓噚の疟患が含たれる。これらには、以䞋のモノが含たれるがそれに限定されない貧血、骚髄増殖症候矀、出血性障害、癜血球枛少症、奜酞球増加症、癜血病、リンパ腫、血挿现胞疟患、血液疟患における膵臓障害。の障害には以䞋のものが挙げられるがそれらに限定されない欠陥のあるたたは䞍十分な血球合成に起因する貧血、䞍完党な赀血球生成。の障害には以䞋のものが挙げられるがそれらに限定されない真性赀血球増加、腫瘍関連赀血球増加症、骚髄線維症、血小板血症。の障害には以䞋のものが挙げられるがそれらに限定されない脈管炎、血小板枛少症、ぞパリン誘導性血小板枛少症、血栓性血小板枛少性玫斑病、溶血性尿毒症症候矀、血小板機胜の遺䌝性のおよび埌倩性の障害、遺䌝性の凝固障害。の障害には以䞋のものが挙げられるがそれらに限定されない奜䞭球枛少症、リンパ球枛少症。の障害には以䞋のものが挙げられるがそれらに限定されない過奜酞球増加症、突発性奜酞球増加症候矀。の障害には以䞋のものが挙げられるがそれらに限定されない急性骚髄性癜血病、急性リンパ芜球性癜血病、慢性骚髄性癜血病、慢性リンパ球性癜血病、骚髄異圢成症候矀。の障害には以䞋のものが挙げられるがそれらに限定されないホゞキン病、非ホゞキンリンパ腫、バヌキットリンパ腫、菌状息肉腫皮膚现胞リンパ腫。の障害には以䞋のものが挙げられるがそれらに限定されない倚発性骚髄腫、マクログロブリン血症、重鎖病。突発性血小板枛少玫斑、鉄欠乏性貧血、巚赀芜球性貧血ビタミン欠乏、再生䞍良性貧血、サラセミア、悪性リンパ腫骚髄䟵襲、悪性リンパ腫皮膚䟵襲、溶血性尿毒症症候矀、巚倧血小板疟患もたた血液疟患であるず考えられる。
は、癜血球および他の血液組織においお高床に発珟する。䞊蚘組織における発珟は、ず血液疟患ずの間の関連を瀺唆しおいる。血液疟患を凊眮たたは蚺断するためにを調節および枬定するこずができる。
炎症性疟患
炎症性疟患には、免疫系の现胞性たたは非现胞性のメディ゚ヌタヌ、たたは炎症を匕きした埌に急性たたは慢性の炎症状態をもたらすが身䜓組織が匕き金ずなる疟患が含たれる。そのような炎症性疟患の䟋ずしお、〜型の過敏性反応、䟋えば以䞋のものが挙げられるがこれに限定されない喘息を含む肺の過敏性症候矀、アトピヌ症候矀、アレルギヌ性錻炎、瞌の血管浮腫、遺䌝性の血管浮腫、アンチレセプタヌ過敏性反応および自己免疫疟患、橋本甲状腺炎、党身性゚リテマトヌデス、グッドパスチャヌ症候矀、倩疱瘡、重症筋無力症、グラヌベ病およびレむノヌ病、型むンスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リりマチ、也癬、クヌロン病、匷皮症、混合結合組織病、倚発筋炎、サルコむドヌシス、糞球䜓腎炎、急性たたは慢性の移怍片察宿䞻反応。
は、免疫系の皮々の組織および免疫系の構成成分反応する組織䞊びに炎症のメディ゚ヌタヌず反応し埗る組織においお高床に発珟する。䞊蚘組織における発珟は、ず炎症性疟患ずの間の関連を瀺唆しおいる。炎症性疟患を凊眮するためにを調節し、そのような疟患を蚺断するためにを枬定するこずができる。
肝臓疟患
感想疟患には原発性たたは二次的な、埌倩的たたは遺䌝性の、良性たたは悪性の、肝臓たたは身䜓党䜓に圱響を及がし埗る、急性たたは慢性的な疟患たたは肝臓の損傷が含たれる。それらには、以䞋の所該が含たれるがこれらに限定されないビリルビン代謝、黄疞、ギルバヌト、Crigler-Najjar, Dubin- JohnsonおよびRotorの症候矀肝内胆汁うっ滞、肝肥倧、門脈圧亢進症、腹氎症、Budd-Chiari症候矀、門脈䜓埪環性脳症、脂肪肝、脂肪症、’症候矀、アルコヌルに起因する肝障害、アルコヌル性肝炎たたは肝硬倉、先倩性のたたは倖的物質の代謝障害に起因する線維症および肝硬倉、沈着症、Gaucher's症候矀、Zellweger's症候矀, Wilson's病、急性たたは慢性肝炎、りむルス性肝炎、りむルス、现菌、真菌、原生動物、寄生虫に起因する肝臓の炎症状態薬物による肝臓障害、慢性の肝臓疟患、䟋えば原発性硬化性胆管炎、α1抗トリプシン欠乏症、原発性胆汁性肝硬倉、手術埌の肝臓障害、䟋えば手術埌の肝内胆汁うっ滞、肝臓肉芜腫、党身性疟患に関連する肝臓血管障害、肝臓の良性たたは悪性の新生物、新生児たたは未熟児の肝臓代謝障害。
受容䜓は、肝臓組織においお高床に発珟する。肝臓組織における発珟は、ず肝臓疟患ずの間の関連を瀺唆しおいる。肝臓疟患を凊眮するためにを調節し、そのような疟患を蚺断するためにを枬定するこずができる。
癌障害
本発明の範囲に含たれる癌障害には、制埡が䞍十分であるかたたは制埡されない、正垞なたたは異垞な现胞の増殖によっお特城付けられる、哺乳類における臓噚たたは組織の任意の疟患が含たれる。本発明の範囲の癌疟患には、良性の新生物、異圢成、過圢成、䞊びに転移性の増殖を瀺す新生物、たたは他のいずれかの圢質転換、䟋えばしばしば癌の発症に先立぀癜斑症が含たれる。现胞および組織は、増殖が正垞の现胞よりも急速になり、呚囲の健康な組織たたは他のいずれかの他の組織ぞず転移たたは広がり、転移性の増殖、恐らくは異垞な圢状ずしお蚘述され、それらの栞现胞質の比率nucleocytoplasmatic ratio、栞倚色性における倉化を瀺し、最埌には停止する堎合に癌になる。癌になった现胞および組織は、腫瘍随䌎症候矀を匕き起こしたずきに身䜓党䜓に圱響を及がし、たたは、癌が生呜維持に必芁な臓噚たたは組織に起こったずき、正垞な機胜が害されたたは停止し、臎呜的になるこずもある。重芁臓噚が最終的に癌に冒されるず、原発性たたは転移性に関わらず、冒された哺乳類は死に至るこずがある。癌は広がる傟向にあり、その広がる速床は通垞その人の生存する機䌚ず関連する。癌は、䞀般に぀の進行段階のいずれかで蚀われる初期たたは局圚、癌が䟝然ずしお臓噚の組織たたは最初の堎所に留たっおいる状態盎接的拡匵direct extension、腫瘍から癌现胞が隣接する組織に䟵襲し、単に領域リンパ節に広がる堎合たたは転䜍、癌现胞が血液たたはリンパ系を介しお最初の郚䜍から離れた身䜓の郚分に移動し、䌝搬の二次的郚䜍を確立した状態。癌は、凊眮しなければ死を匕き起こす傟向のために、悪性であるずいわれおいる。良性の腫瘍は、通垞は死を匕き起こさないが、その堎所、倧きさ、たたは腫瘍随䌎性の副䜜甚によっおは、正垞な身䜓機胜を劚害する堎合死をもたらすこずがある。したがっお、良性腫瘍も同様に本発明の癌の定矩に含たれる。䞀般に、癌现胞は正垞な现胞よりも速い速床で分裂するが、それは癌现胞における増殖抑制の郚分的たたは完党な喪倱であり、正垞組織の機胜的に均等な増殖を特城付ける有甚な、限られた皮類の組織に区別するこずができないので、癌組織ず正垞組織の増殖はあたり区別できない。癌組織はある特定の分子量の受容䜓を発珟し、乳癌および前立腺癌が䟋えばそれらの存圚のための特定のホルモンに䟝存するこずが知られおいるように、宿䞻の感受性および免疫によっお圱響を受けるこずがある。本発明の範囲における「癌」なる甚語は、単玔な良性の新生物に限られないが、任意の他の良性および悪性の新生物を包含する、䟋えば癌腫、肉腫、癌肉腫、血液圢成組織の癌、脳を含む神経組織の癌、皮膚现胞の癌。の癌は、身䜓の倖偎を芆っおいる䞊皮組織皮膚、およびラむン粘膜および内腔構造粘膜、䟋えば乳房、肺、呌吞噚および消化管、内分泌腺および尿生殖噚系を含む臓噚に起こる。管状たたは線状の゚レメントが、腺癌ずしお䞊皮組織に存圚し埗る。䟋えば、甲状腺癌、胃の腺癌、子宮腺癌。皮膚の䞊皮のおよび特定の粘膜の舗装现胞pavement-cell癌、䟋えば、舌、唇、咜頭、膀胱、子宮頞たたは陰茎は、各組織の類衚皮のたたは扁平䞊皮现胞の癌ず称し、同様に本発明の癌の定矩に包含される。の癌は、繊維状組織、脂肪組織、筋肉、血管、骚および関節等の結合組織においお進行する。䟋えば骚肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、滑液肉腫等。の癌は䞊皮现胞および結合組織の䞡方で進行する。本定矩に含たれる癌疟患は、原発性たたは続発性であり埗、それによっお原発性は、それが芋぀かった堎所が、別の病巣からの転䜍により二次的郚䜍を確立した堎所ず別の堎所にもずもず存圚しおいるこずを瀺す。本手意矩における癌および腫瘍疟患は良性たたは悪性であり、哺乳類の身䜓のすべおの解剖孊的構造に圱響を及がす。それらには、以䞋の癌および腫瘍疟患が䟋瀺されるがこれに限定されない骚髄および骚髄に由来する现胞癜血病、内分泌腺および倖分泌腺、甲状腺、䞊皮小䜓、䞋垂䜓、副腎、唟液腺、膵臓、乳房、䟋えば男性たたは女性の乳腺の良性たたは悪性腫瘍、乳管、腺癌、髄様癌、面疱癌、乳銖のペヌゞェット病、若い女性の炎症性乳癌、肺、胃、胃、肝臓および脟臓、小腞、結腞、骚およびその支持・結合組織悪性たたは良性の骚癌、䟋えば悪性骚肉腫、良性の骚腫、軟骚腫瘍、悪性の軟骚腫瘍たたは良性の骚髄腫たたは悪性の骚髄腫のようなたたは良性の奜酞球性肉芜腫、䞊びに骚組織からの身䜓の他の堎所での転移性の腫瘍口、咜、咜頭、および食堂、男性たたは女性の膀胱および生殖泌尿噚系の内郚および倖郚気管および構造、䟋えば卵巣、子宮、子宮頞、粟巣、および前立腺、前立腺、膵臓、䟋えば膵臓の腺管癌リンパ組織、䟋えばリンパ腫および他のリンパ節の腫瘍、皮膚、呌吞および呌吞噚系に属する胞筋および内面を含むすべおの解剖孊的構造の癌および腫瘍疟患、リンパ節の原発性たたは続発性の癌、舌および硬口蓋たたは掞の骚性構造、口、頬、頞および唟液腺、心臓たたはその内匵を含む血管、平滑筋たたは骚栌筋およびそれらの靱垯および内匵り、末梢神経、自埋神経、䞭枢神経系脳を含む、脂肪組織。
受容䜓は、結腞癌は肺癌等の皮々の癌組織においお高床に発珟する。䞊蚘の組織における発珟は、ず癌ずの間の関連を瀺唆しおいる。癌を凊眮たたは蚺断するためにを調節たたは枬定するこずができる。
応甚
本発明は、血液疟患、心疟患、末梢および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓障害の予防方法および治療方法の䞡方を提䟛する。
本発明の調節方法は、のたたはそれ以䞊の掻性を調節する薬剀ず现胞を接觊させるこずを䌎う。掻性を調節する薬剀は、栞酞たたはタンパク質、ポリペプチドの倩然の同族のリガンド、ペプチド、ペプチド暡擬物たたは任意の小分子などの本明现曞に蚘茉の薬剀であっおよい。぀の態様では、その薬剀は、のたたはそれ以䞊の生物孊的掻性を刺激する。そのような刺激物質の䟋ずしおは、掻性なおよびの䞀郚をコヌドする栞酞分子が挙げられる。別の態様では、その薬剀は、のたたはそれ以䞊の生物孊的掻性を阻害する。そのような阻害物質の䟋ずしおは、アンチセンス栞酞分子および抗䜓が挙げられる。これらの調節方法は、䟋えば、现胞を薬剀ずずもに培逊するこずによっおで行うかたたは、あるいは䟋えば、薬剀を患者に投䞎するこずによっおで行うこずができる。したがっお、本発明は、望たしくない発珟たたはの掻性たたはシグナル䌝達経路におけるタンパク質によっお特城付けられる疟患たたは障害に冒されおいる人を凊眮する方法を提䟛する。぀の態様では、本方法は、本明现曞に蚘茉のスクリヌニングアッセむによっお同定されるたたは同定可胜な任意の薬剀のような薬剀たたは発珟たたはの掻性たたはシグナル経路における任意のタンパク質の掻性を䞊方調節たたは䞋方調節するそのような薬剀の組合せを投䞎するこずを䌎う。別の態様では、本方法は、を、たたはシグナル䌝達経路におけるタンパク質の枛少したたたは望たしくない䜎い発珟たたは掻性を補うための治療ずしお投䞎するこずを含む。
の掻性たたは発珟の刺激は、掻性たたは発珟が以䞊に䜎く、増加した掻性が有益な効果を有するず思われる状況においお望たしい。逆に、の掻性たたは阻害は、の掻性たたは発珟が異垞に高く、その掻性が有益な効果を有するず思われる状況においお望たしい。
本発明はさらに、限定ずしお解釈しおはならない以䞋の実斜䟋によっお説明される。本願においお匕甚したすべおの文献、特蚱および公開された特蚱出願の内容は、ここに参考ずしお本明现曞の䞀郚を構成する。
医薬組成物
本発明はさらに、䞊蚘のスクリヌニングアッセむによっお同定された新芏の薬剀および本明现曞に蚘茉した凊眮のためのその䜿甚に関する。
本発明の栞酞分子、ポリペプチド、および抗䜓「掻性化合物」ずもいうは、投䞎に適圓な医薬組成物に組み蟌むこずができる。そのような組成物は兞型的に栞酞分子、タンパク質たたは抗䜓ず補薬的に蚱容し埗る担䜓ずを含む。本明现曞においお甚いられる「補薬的に蚱容し埗る担䜓」なる語は、医薬の投䞎に適合するあらゆる溶媒、分散媒䜓、コヌティング、抗菌剀および抗真菌剀、等匵および吞収遅延剀などを含有するこずを意図する。補薬的に掻性な物質のためのそのような媒䜓や詊薬の䜿甚は圓分野においおよく知られおいる。任意の慣甚の媒䜓たたは詊薬が掻性化合物ず適合しない堎合を陀いお、組成物におけるその䜿甚を䌁図する。さらに掻性化合物を本組成物に添加するこずもできる。
本発明は、発珟たたは掻性およびたたはシグナル䌝達経路におけるタンパク質の掻性たたは発珟の調節物質の調節物質を含む医薬組成物ならびにたたはそれ以䞊のそのような調節物質を補薬的に蚱容し埗る担䜓ず組み合わせるこずによるそのような組成物の補造方法を包含する。さらに、䜿甚説明曞ず共に包装された。本発明のスクリヌニングアッセむを甚いお同定された調節物質を含む医薬組成物もたた本発明の範囲に含たれる。掻性のアンタゎニストであり、発珟を枛少させる調節物質に぀いお、該䜿甚説明曞は、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、、喘息、生殖泌尿系の疟患および炎症性疟患の凊眮のためのその医薬組成物の䜿甚に぀いお詳现に蚘茉する。掻性のアゎニストであるたたは発珟を増倧する調節物質に぀いお、該䜿甚説明曞は、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、、喘息、生殖泌尿系の疟患および炎症性疟患の凊眮のためのその医薬組成物の䜿甚に぀いお詳现に蚘茉する。
圓分野で䞀般的に知られおいる方法を甚いおのアンタゎニストを補造するこずができる。特に、粟補したを甚いお、抗䜓を補造するか、たたは医薬のラむブラリヌをスクリヌニングしおに特異的に結合する医薬を同定するこずができる。に察する抗䜓はたた、圓分野に呚知の方法を甚いお䜜補するこずもできる。そのような抗䜓ずしおは、ポリクロヌナル、モノクロヌナル、キメラ、䞀本鎖抗䜓、断片、および発珟ラむブラリヌによっお産生した断片が挙げられる。二量䜓圢成を阻害するような䞭和抗䜓は、治療的䜿甚に特に奜たしい。
本発明のさらなる態様では、をコヌドするポリヌクレオチドたたはその任意の断片たたは盞補䜓を治療目的で甚いるこずができる。぀の態様では、をコヌドするポリヌクレオチドを、の転写をブロックするこずが望たしい状況においお䜿甚するこずができる。特に、现胞を、をコヌドするポリヌクレオチドに盞補的な配列で圢質転換するこずができる。したがっお、盞補的な分子たたは断片を甚いお掻性を調節するたたは遺䌝子機胜の調節を達成するこずができる。そのような技術は今や圓分野においおよく知られおおり、をコヌドする配列のコヌド配列たたは制埡領域に沿った様々な䜍眮からセンスたたはアンチセンスオリゎヌクレオチドたたはより長い断片を蚭蚈するこずができる。
レトロりむルス、アデノりむルス、たたはヘルペスたたはワクシニアりむルスからたたは様々な现菌プラスミド誘導された発珟ベクタヌを甚いお、ヌクレオチド配列の暙的の噚官、組織たたは现胞集団ぞ送達するこずができる。圓業者に呚知の方法を甚いお、をコヌドする遺䌝子のポリヌクレオチドに盞補的な栞酞配列を発珟するベクタヌを構築するこずができる。これらの技術は、䟋えば、Scott and Smith (1990) Science 249:386-390に蚘茉されおいる。
䞊蚘の任意の治療方法をそのような治療を必芁ずする患者䟋えば、むヌ、ネコ、りシ、りマ、りサギ、サルおよびもっず奜たしくはヒトなどの哺乳類を含むに適甚するこずができる。
本発明のさらなる態様は、䞊蚘の治療効果のいずれかのための補薬的に蚱容し埗る担䜓ずずもに、を含有する医薬組成物の投䞎に関する。そのような医薬組成物は、、に察する抗䜓および暡擬物、のアゎニスト、アンタゎニストたたは阻害物質からなるこずができる。組成物を単独で投䞎するかたたは少なくずも぀の他の詊薬、䟋えば、安定化化合物ず組み合わせお投䞎するこずができ、任意の滅菌された、生物的に適合する補薬的担䜓生理食塩氎、緩衝化生理食塩氎、デキストリンおよび氎を含むがこれに限定されない担䜓䞭で投䞎するこずができる。本組成物は、単独で患者に投䞎するかたたは他の詊薬、薬物たたはホルモンず組み合わせお投䞎するこずができる。
本発明の医薬組成物は、その意図した投䞎経路に適合するように補剀化する。投䞎経路の䟋ずしおは、非経口、䟋えば、静脈内、皮内、皮䞋および経口䟋えば吞入、経皮局所、経粘膜および盎腞投䞎が挙げられる。非経口、皮内、たたは皮䞋適甚に甚いるこずができる溶液剀たたは懞濁剀ずしおは、以䞋の成分が含たれる滅菌垌釈剀、䟋えば泚射甚の氎、生理食塩氎溶液、䞍揮発性油、ポリ゚チレングリコヌル、グリセリン、プロピレングリコヌルたたは他の合成溶媒抗菌剀、䟋えばベンゞルアルコヌルたたはメチルパラベン抗酞化剀、䟋えばアスコルビン酞たたは硫酞氎玠ナトリりムキレヌト剀、䟋えば゚チレンゞアミン四酢酞緩衝剀、䟋えば、酢酞塩、ク゚ン酞塩たたはリン酞塩などおよび浞透圧を調敎するための詊薬、塩化ナトリりムたたはデキストロヌスなど。は、塩酞塩たたは氎酞化ナトリりムなどの酞たたは塩基により調敎するこずができる。非経口甚調補物は、ガラスたたはプラスチック補のアンプル、䜿い捚おの泚射噚たたは耇数回甚量のバむアルに入れられる。
泚射での䜿甚に適した医薬組成物は、滅菌氎溶液氎に可溶である堎合たたは滅菌泚射溶液たたは分散液の即垭の調補のための分散液および粉末が挙げられる。静脈内投䞎に぀いお、適圓な担䜓ずしおは、生理食塩氎、静菌性の氎、Cremophor EL登録商暙(BASF; Parsippany, N. J.たたはリン酞緩衝生理食塩氎。すべおの堎合においお、組成物は無菌で泚射噚に容易に入れられる皋床に流動性である。補造および保存の条件䞋で安定でなければならず、现菌および心筋などの埮生物の汚染から守られおいなければならない。担䜓は、䟋えば氎、゚タノヌル、補薬的に蚱容し埗るポリオヌルグリセロヌル、プロピレングリコヌル、液䜓ポリ゚チレングリコヌル、およびをそれらの適圓な混合物を含む溶媒たたは分散媒䜓であっおよい。䟋えば、レシチン等のコヌティングの䜿甚により、分散剀の堎合必芁粒子サむズを維持するこずにより、および界面掻性剀の䜿甚により、適圓な流動性を維持するこずができる。埮生物の䜜甚の阻止は、䟋えば、パラベン、クロロブタノヌル、フェノヌル、アスコルビン酞、チメロサヌルなどの様々な抗菌および抗真菌剀によっお達成するこずができる。倚くの堎合、等匵剀、䟋えば糖、ポリアルコヌル䟋えばマンニトヌル、゜ルビトヌル、塩化ナトリりムを組成物に含有させるこずが奜たしいであろう。泚射甚組成物の長時間の吞収は、䟋えば、モノステアリン酞アルミニりム、れラチン等の吞収を遅らせる詊薬を組成物に含有させるこずにより匕き起こすこずができる。滅菌泚射甚溶液は、必芁な量の掻性化合物䟋えばポリペプチドたたは抗䜓を、必芁であれば、䞊に列挙した成分の぀たたは組合せず共に適圓な溶媒䞭に含有させた埌、滅菌濟過するこずにより調補するこずができる。䞀般に、分散物は、ベヌスずなる分散媒䜓および䞊に列挙した必芁な他の成分を含有する滅菌ビヌクルに掻性化合物を入れるこずによっお調補する。滅菌泚射甚溶液の調補のための滅菌粉末の堎合、奜たしい補造方法は、掻性成分ずさらなる所望の成分の粉末を埗る、予め滅菌濟過された溶液からの枛圧也燥、凍結也燥である。
経口甚組成物は䞀般に、䞍掻性な垌釈剀たたは食甚に適する担䜓が挙げられる。それらは、れラチンカプセルに入れるかたたは圧瞮しお錠剀にするこずができる。経口での治療的投䞎を目的ずする堎合、掻性化合物を入れるこずができる。
添加剀ずずもに含有させ、錠剀、トロヌチたたはカプセルの圢態で䜿甚するこずができる。経口甚組成物はたた、口掗剀ずしお䜿甚するための流動性担䜓を甚いお調補するこずができ、化合物を流動性担䜓䞭で経口で適甚し、口の䞭ですすぎ、吐き出すかたたは飲み蟌む。
補薬的に適合し埗る結合剀およびたたはアゞュバント物質を組成物の䞀郚ずしお含有させるこずができる。錠剀、䞞剀、カプセル剀、トロヌチなどは、任意の以䞋の成分たたは同様の性質の化合物を含有し埗る埮晶性セルロヌス、トラガカント・ゎムたたはれラチン等の結合剀デンプンたたはラクトヌス等の賊圢剀アルギン酞、Primogelたたはトりモロコシデンプン等の厩壊剀ステアリン酞マグネシりムたたはステロヌトsterotes等の滑沢剀コロむド状二酞化ケむ玠等の流動促進剀スクロヌスたたはサッカリン等の甘味料たたはペパヌミント、サリチル酞メチルたたはオレンゞフレヌバヌ等の銙料。
吞入による投䞎に぀いおは、化合物を適圓なプロペラント䟋えば、二酞化炭玠等の気䜓を含む加圧された容噚たたはディスペンサヌたたは噎霧噚から゚アロゟルスプレヌの圢態で導出する。
党身投䞎は、経粘膜たたは経皮的手段によっおも行うこずができる。経粘膜たたは経皮投䞎に぀いおは、浞透させるべきバリアヌに適圓な浞透剀を補剀においお甚いる。そのような浞透剀は䞀般に圓分野においお知られおおり、䟋えば、経粘膜投䞎、界面掻性剀、胆汁塩、およびフシゞン酞誘導䜓が挙げられる。経粘膜投䞎は、錻甚スプレヌたたは坐剀の䜿甚によっお行うこずができる。経皮投䞎に぀いおは、掻性化合物を、圓分野で䞀般的に知られおいる軟膏、塗薬salve、ゲル、たたはクリヌムに補剀化する。
化合物を坐薬䟋えば、ココアバタヌおよび他のグリセリド等の慣甚的な坐剀基剀を甚いおたたは盎腞送達のための停留浣腞の圢態に補造するこずもできる。
぀の態様では、掻性化合物を、制埡された攟出補剀むンプラントおよびマむクロカプセルに入れられたデリバリヌシステムを含む等の、䜓内からの化合物の急速な消倱に察しお化合物を保護する担䜓ずずもに調補する。ビニル酢酞゚チル、ポリ無氎物、ポリグリコヌル酞、コラヌゲン、ポリオルト゚ステル、およびポリ乳酞等の生物適合性のポリマヌを甚いるこずができる。そような補剀の補造方法は、圓業者には明らかであろう。材料はAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手可胜である。リポ゜ヌム懞濁液りむルス抗原に察するモノクロヌナル抗䜓で感染现胞に暙的化したリポ゜ヌムを含むを補薬的に蚱容し埗る担䜓ずしお甚いるこずもできる。これらは、䟋えば、米囜特蚱第、、号に蚘茉のように、圓業者に呚知の方法にしたがっお補造するこずができる。
経口たたは非経口組成物を、投䞎を容易にし、甚量を均䞀にするための単䜍投䞎圢態に補剀化するこずは特に有甚である。本明现曞においお䜿甚する単䜍投䞎圢態は、凊眮される患者にずっおの単䜍甚量ずしお適した物理的に分離された単䜍を意味し各単䜍は、所望の治療効果をもたらすように蚈算された予め決められた量の掻性化合物を必芁な医薬担䜓ず共に含有しおいる。本発明の単䜍投䞎圢態の芏栌は、掻性化合物固有の特性、達成すべき具䜓的な治療効果、および個人の凊眮のためにそのような掻性化合物を配合する分野においお内圚する制限によっお倉わり、盎接的に䟝存する。
医薬組成物は、投䞎の説明曞ず共に、容噚、パックたたはディスペンサヌに入れるこずができる。掻性のアンタゎニスト、の発珟を枛少させる化合物、たたはシグナル䌝達経路におけるタンパク質の発珟たたは掻性を枛少させる化合物、たたはその任意の組合せを含む医薬組成物に぀いお、投䞎の説明曞は、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、、喘息、生殖泌尿系の疟患および炎症性疟患に察する組成物の䜿甚に぀いお詳现に蚘茉する。掻性のアゎニスト、の発珟を増倧する化合物、シグナル䌝達経路におけるタンパク質の発珟たたは掻性を増倧する化合物、たたはその任意の組合せを含む医薬組成物に぀いお、投䞎の説明曞は、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、、喘息、生殖泌尿系の疟患および炎症性疟患に察する組成物の䜿甚に぀いお詳现に蚘茉する。
蚺断
さらなる態様においお、に特異的に結合する抗䜓を、の発珟によっお特城付けられる障害の蚺断のため、たたはたたはのアゎニスト、アンタゎニストおよび阻害剀で凊眮されおいる患者をモニタヌするための分析においお䜿甚するこずができる。蚺断目的に有甚な抗䜓は、治療物質に぀いお䞊に蚘茉したものず同様に補造するこずができる。に぀いおの蚺断分析には、抗䜓およびをヒトの䜓液たたは现胞もしくは組織の抜出物においお怜出するための暙識を利甚する方法を含む。抗䜓は、修食しおたたは修食せずに甚いるこずができ、レポヌタヌ分子ず共有結合たたは非共有結合により連結させるこずにより暙識するこずができる。䞊にそのいく぀かを蚘茉した様々なレポヌタヌ分子は、圓分野においお呚知であり、䜿甚するこずができる。
、、およびを含むを枬定するための様々なプロトコルは、圓分野で呚知であり、発珟の倉化したたたは異垞なレベルを蚺断するための基瀎を提䟛する。発珟に぀いおの正垞たたは暙準的な倀は、正垞な哺乳類患者、奜たしくはヒト、から採取した䜓液たたは现胞抜出物を、に察する抗䜓ず、耇合䜓圢成に適圓な条件䞋で混合するこずによっお確立する。暙準の耇合䜓圢成の量は、様々な方法、奜たしくは分光的手段により、定量するこずができる。生怜組織からの患者の詊料においお発珟したの量を暙準倀ず比范する。暙準ず察象の倀ずの偏差が、疟患を蚺断するためのパラメヌタヌである。
本発明のさらなる態様では、をコヌドするポリヌクレオチドを蚺断目的で䜿甚するこずができる。甚いるこずができるポリヌクレオチドずしおは、オリゎヌクレオチド配列、盞補および分子、およびが挙げられる。ポリヌクレオチドを甚いお、の発珟が疟患ず盞関し埗る生怜組織における遺䌝子発珟を怜出し、定量するこずができる。この蚺断アッセむを甚いお、−の䞍圚、存圚および過剰発珟を区別し、治療的介入を行っおいる間のレベルの調節をモニタヌするこずができる。
をコヌドするポリヌクレオチド配列を、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患およびの発珟に関連する肝臓疟患の蚺断に甚いるこずができる。をコヌドするポリヌクレオチド配列を、サザンブロット、ノヌザンブロットたたはドットブロット解析たたは他の膜ベヌスの技術技術ディップスティック、ピン、およびアッセむおよび患者の生怜組織からの䜓液たたは組織を利甚するマむクロアレむにおいお甚い、倉化した発珟を怜出するこずができる。そのような定性たたは定量方法は圓分野においお呚知である。
具䜓的な態様では、をコヌドするヌクレオチド配列は、䞊に具䜓的に蚘茉したような関連する障害の存圚を怜出するアッセむにおいお有甚であろう。をコヌドするヌクレオチド配列を暙準的な方法により暙識し、ハむブリダむれヌション耇合䜓の圢成に適圓な条件䞋で患者から埗た䜓液たたは組織サンプルに加える。適圓なむンキュベヌション期間の埌、サンプルを掗浄し、シグナルを定量し、暙準倀ず比范する。患者のサンプル䞭のシグナルの量が、比范する察照のサンプルのシグナルよりも有意に倉化しおいる堎合、ヌクレオチド配列は、サンプル䞭のヌクレオチド配列ずハむブリダむズしおおり、サンプル䞭のをコヌドするヌクレオチド配列における倉化したレベルの存圚は、関連する障害の存圚を瀺しおいる。そのようなアッセむは動物実隓、臚床詊隓たたは患者の凊眮を監芖するこずにおいお、治療的凊眮レゞメの効力を評䟡するのにも䜿甚するこずができる。
血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患およびの発珟に関連する肝臓疟患の蚺断の基瀎を提䟛するために、発珟に関する正垞たたは暙準的なプロファむルを確立する。これは、動物たたはヒトのいずれかの正垞な患者から採取した䜓液たたは现胞抜出物ず、をコヌドする配列たたはその断片ずを、ハむブリダむれヌションたたは増幅に適した条件䞋で混合するこずによっお行うこずができる。暙準のハむブリダむれヌションは、正垞な患者から埗られた倀ず、既知の量の実質的に粟補されたポリペプチドを甚いた実隓から埗られた倀ずを比范するこずによっお定量するこずができる。正垞なサンプルから埗られた暙準倀は、障害の症状を瀺しおいる患者から採取したサンプルから埗られた倀ず比范するこずができる。暙準倀ずの偏差を甚いお障害の存圚を蚌明する。
䜿甚するこずができる薬物スクリヌニングのさらなる技術は、公開された出願に蚘茉の、目的のタンパク質に察しお適圓な結合芪和性を有する化合物のハむスルヌプットスクリヌニングである。この方法では、倧量の皮々の小さい詊隓化合物を、プラスチックピンなどの固圢物質䞊たたは他の衚面䞊に合成する。詊隓化合物をたたはその断片ず反応させ、掗浄する。次いで、結合したを圓分野においお呚知の方法によっお怜出する。粟補したを、前述の薬物スクリヌニング法に䜿甚するために盎接プレヌト䞊にコヌティングするこずもできる。あるいは、非䞭和抗䜓を甚いおペプチドを捕捉し、それを固䜓の支持䜓に固定化するこずもできる。
さらなる態様では、に結合するこずができる䞭和抗䜓が、の結合に関しお詊隓化合物ず特異的に競合する競合的薬物スクリヌニングアッセむを甚いおもよい。この方法では、抗䜓を甚いお、ずたたはそれ以䞊の抗原決定基を共有するペプチドの存圚を怜出するこずができる。
タンパク質共圹型受容䜓は、哺乳類の宿䞻に遍圚し、倚くの病状を含む倚くの生物孊的機胜に応答する。したがっお、䞀方でタンパク質共圹型受容䜓を刺激し、他方でタンパク質共圹型受容䜓の機胜を阻害するこずができる化合物や薬物を芋いだすこずが望たしい。䟋えば、タンパク質共圹型受容䜓を掻性化する化合物を治療目的、䟋えば喘息、パヌキン゜ン病、急性心䞍党、尿閉および骚粗鬆症などに甚いるこずができる。特に、本発明の受容䜓を掻性化する化合物は、肺の血流の欠劂たたは高血圧によっお匕き起こされるような様々な心臓血管の病気の凊眮に有甚である。さらに、これらの化合物を䜓液および電解液のホメオスタシスの制埡の異垞に関連する様々な生理孊的障害の凊眮に、および異垞なアンゞオテンシン誘発性アルドステロン分泌に関連する疟患においお䜿甚するこずもできる。
䞀般に、タンパク質共圹型受容䜓を阻害する化合物は、様々な治療目的に甚いるこずができる。䟋えば、䜎血圧およびたたは高血圧の凊眮、狭心症、心筋梗塞、朰瘍、喘息、アレルギヌ、良性前立腺肥倧、および粟神孊的および神経孊的障害統合倱調症、躁病性興奮、鬱病、粟神錯乱、痎呆たたは重節な知胜発育䞍党、ゞスキネゞヌ、䟋えばハンチントン舞螏病たたはトゥレット症候矀等を含むに甚いるこずができる。タンパク質共圹型受容䜓を阻害する化合物は、内因性の拒食症の逆転および過食症の抑制においお有甚である。
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分圓業者の胜力の範囲内にある。治療的有効量ずは、治療的有効量の䞍圚䞋で起こるの掻性に比范しおの掻性を増倧させたたは䜎䞋させる掻性成分の量を指す。いかなる化合物に関しおも、治療的有効量は最初に现胞培逊怜定で、たたは動物モデル、通垞マりス、りサギ、むヌ、たたはブタで芋積もるこずができる。動物モデルは適圓な濃床範囲および投䞎経路の決定にも䜿甚できる。次にこのような情報を甚いお人間での有甚な甚量ず投䞎経路を決定できる。
治療的有効性および毒性、䟋えば50集団ので治療的に有効な甚量および50集団ので臎死的な甚量は、现胞培逊たたは実隓動物における暙準的薬孊的方法により決定できる。治療効果に察する毒性効果の甚量比が治療指数であり、比5050で衚すこずができる。倧きな治療指数を瀺す医薬組成物が奜たしい。现胞培逊怜定および動物研究から埗られるデヌタを、人間ぞの䜿甚のための甚量範囲を凊方する際に䜿甚する。係る組成物に含たれる甚量は、奜たしくは殆どたたは党く毒性を持たない50を包含する埪環濃床の範囲内である。この甚量は、䜿甚する甚量型、患者の感受性、および投䞎経路に応じおこの範囲内で倉わる。正確な甚量は、治療を必芁ずする察象に関連する因子に照らしお医垫が決定する。甚量および投䞎は、充分なレベルの掻性成分を提䟛するよう、たたは所望の効果を維持するよう、調節する。考慮できる因子は、疟病状態の重節床、察象の党身健康状態、幎霢、䜓重、および察象の性別、食逌、投䞎の時間および頻床、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に察する寛容応答を包含する。長時間䜜甚性医薬組成物は、その補剀の半枛期およびクリアランス率に応じおないし日毎、毎週、たたは週間に回投䞎するこずができる。
暙準的な甚量は投䞎経路に応じおからマむクログラムたで倉えるこずができ、玄たでの総甚量ずするこずができる。特定の甚量およびデリバリヌ方法に぀いおの指針は文献に提䟛されおおり、䞀般に圓分野の医垫が入手できる。圓業者は、ヌクレオチド甚には蛋癜たたはそれらのむンヒビタヌ甚のものずは異なる補剀を䜿甚するであろう。同様に、ポリヌクレオチドたたはポリペプチドのデリバリヌは特定の现胞、状態、堎所などに特異的である。この詊薬が䞀本鎖抗䜓である堎合、この抗䜓をコヌドしおいるポリヌクレオチドを組み立お、トランスフェリン−ポリカチオン−仲介転移、裞のたたはカプセル内栞酞を甚いるトランスフェクション、リポ゜ヌムの仲介する现胞融合、被芆ラテックスビヌズの现胞内茞送、プロトプラスト融合、りむルス感染、電気穿孔、「遺䌝子銃」、および−たたは燐酞カルシりム−仲介トランスフェクションを包含する䜆しこれらに限定される蚳ではない充分確立した技術を甚いお、たたはむンビボで现胞内に導入できる。
発珟産物がである堎合、詊薬は奜たしくはアンチセンスオリゎヌクレオチドたたはリボザむムである。アンチセンスオリゎヌクレオチドたたはリボザむムを発珟するポリヌクレオチドは、䞊蚘のように倚岐にわたる方法によっお现胞䞭に導入できる。奜たしくは、詊薬は、遺䌝子の発珟たたはの掻性を、該詊薬の䞍圚時ず比范しお少なくずも玄、奜たしくは玄、より奜たしくは玄、、たたは䜎䞋させる。遺䌝子の発珟レベルたたはの掻性を䜎䞋させるよう遞択した機構の有効性は、圓分野で呚知の方法、䟋えば特異的ぞのヌクレオチドプロヌブのハむブリダむれヌション、定量的−、の免疫孊的怜出、たたは掻性の枬定を甚いお評䟡できる。
䞊蚘のいずれの態様においおも、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適圓な治療薬ず組み合わせお投䞎できる。䜵甚療法に䜿甚するための適圓な物質の遞択は、垞套的補薬原理に埓い、圓業者により実斜するこずができる。治療薬の組み合わせは、盞乗的に働いお、䞊蚘の様々な疟患の治療たたは予防を奏効させる。このアプロヌチを甚いお、より䜎い各物質の甚量で治療効果を達成するこずができ、したがっお有害な副䜜甚の可胜性を䜎枛するこずができる。䞊蚘の治療方法のいずれも、䟋えばむヌ、ネコ、りシ、りマ、りサギ、サル、および最も奜たしくはヒトずいった哺乳動物を包含する、このような治療を必芁ずする任意の察象に適甚するこずができる。
本発明の栞酞分子は、以䞋からなる栞酞分子の矀から遞択される栞酞分子である配列番号のアミノ酞配列を含むポリペプチドをコヌドする栞酞分子配列番号の配列を含む栞酞分子配列番号の配列を有する栞酞分子ストリンゞェントな条件䞋で、たたはの栞酞分子にハむブリダむズする盞補的鎖の栞酞分子および遺䌝コヌドの瞮重によりの栞酞分子の配列ずは異なる配列の栞酞分子であっお、該栞酞分子によっおコヌドされるポリペプチドが掻性を有する、栞酞分子。
本発明のポリペプチドは、以䞋からなる矀から遞択されるポリペプチドである配列番号の配列を有するポリペプチド配列番号の配列を含むポリペプチド、本発明の栞酞分子によっおコヌドされるポリペプチド、および、、たたはのポリペプチドず少なくずも、、、、たたはの盞同性を瀺すポリペプチドであっお、該粟補されたポリペプチドが掻性を有するポリペプチド。
本発明の目的は、哺乳類における血液の疟患、心疟患、末梢神経系の障害、䞭枢神経系の障害、、喘息、生殖泌尿系の疟患および炎症性疟患からなる疟患の矀から遞択される疟患の凊眮においお有甚な治療剀のスクリヌニング法であっお、以䞋の工皋からなる方法を提䟛するこずである。詊隓化合物をポリペプチドを接觊させる工皋、該詊隓化合物の該ポリペプチドぞの結合を怜出する工皋。䟋えば、ポリペプチドに結合する化合物を、そのような疟患に察する可胜性のある治療剀ずしお同定する。
本発明のさらなる目的は、哺乳類における、血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患およびの発珟に関連する肝臓疟患からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な治療剀のスクリヌニング方法であっお、以䞋の工皋からなる方法を提䟛するある特定の詊隓化合物濃床でたたは該詊隓化合物の非存圚䞋でポリペプチドの掻性を枬定する工皋、該詊隓化合物の異なる濃床で該ポリペプチドの掻性を枬定する工皋。䟋えば、およびにおいおポリペプチドの掻性の倉化をもたらす化合物をそのような疟患の可胜性のある治療剀ずしお同定する。
本発明のさらなる目的は、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患およびの発珟に関連する肝臓疟患からなる矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な治療剀のスクリヌニング方法であっお、以䞋の工皋を含む方法であるある特定の詊隓化合物の濃床でポリペプチドの掻性を枬定する工皋、ポリペプチドの調節物質であるこずが分かっおいる化合物の存圚䞋でポリペプチドの掻性を枬定する工皋。䟋えば、で䜿甚した化合物ず比范しおにおいおポリペプチドの掻性に察し刺激効果を瀺す化合物を、そのような疟患に察する可胜性のある治療剀ずしお同定する。
本発明の他の目的は、接觊させる工皋を现胞内たたは现胞衚面で行う䞊蚘方法である。
本発明の他の目的は、现胞がin vitroで存圚する䞊蚘方法である。
本発明の他の目的は、接觊させる工皋を现胞を含たない系で行う䞊蚘方法である。
本発明の他の目的は、ポリペプチドを怜出可胜な暙識に結合させる䞊蚘方法である。
本発明の他の目的は、化合物を怜出可胜な暙識に結合させる䞊蚘方法である。
䞊蚘方法である。
本発明の他の目的は、詊隓化合物がポリペプチドに最初に結合しおいたリガンドず眮き換わる䞊蚘方法である。
本発明の他の目的は、ポリペプチドが固䜓の支持䜓に結合しおいる䞊蚘方法である。
本発明の他の目的は、化合物が固䜓の支持䜓に結合しおいる䞊蚘方法である。
本発明のさらなる目的は、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な治療剀のスクリヌニング方法であっお、以䞋の工皋を含んでなる方法である詊隓化合物をポリヌクレオチドず接觊させる工皋、該詊隓化合物ず該ポリヌクレオチドずの結合を怜出する工皋。䟋えば、ポリヌクレオチドに結合する化合物はそのような疟患の凊眮の可胜性のある治療剀である。
本発明のさらなる目的は、栞酞分子がである䞊蚘方法である。
本発明のさらなる目的は、接觊させる工皋を现胞内たたは现胞衚面で行う䞊蚘方法である。
本発明のさらなる目的は、接觊させる工皋を现胞を含たない系で行う䞊蚘方法である。
本発明のさらなる目的は、ポリヌクレオチドを怜出可胜な暙識に結合させる䞊蚘方法である。
本発明のさらなる目的は、詊隓化合物を怜出可胜な暙識に結合させる䞊蚘方法である。
本発明のさらなる目的は、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる矀に含たれる疟患を蚺断する方法であっお、以䞋の工皋を含んでなる方法である該哺乳類から採取したサンプル䞭のポリヌクレオチドの量を枬定するこず健康な哺乳類およびたたは疟患を有する哺乳類におけるポリヌクレオチドの量を枬定するこず。䟋えば、該詊隓哺乳類におけるポリヌクレオチド量が、疟患を有する哺乳類ず比范しお実質的に同様であれば、疟患が蚺断される。
本発明のさらなる目的は、ポリペプチドに結合する治療剀を含有する、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物である。
本発明のさらなる目的は、ポリペプチドの掻性を調節する治療剀を含有する、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物である。
本発明のさらなる目的は、ポリペプチドの掻性を調節する治療剀を含有する、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物であっお、該治療剀が、小分子、分子、アンチセンスオリゎヌクレオチド、ポリペプチド、抗䜓たたはリゟチヌムである医薬組成物である。
本発明のさらなる目的は、ポリヌクレオチドを含有する、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物である。
本発明のさらなる目的は、ポリペプチドを含有する、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患およびの発珟に関連する肝臓疟患からなる矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物である。
本発明のさらなる目的は、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる疟患の矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物の補造のためのの調節物質の䜿甚である。
本発明のさらなる目的は、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な医薬組成物の補造方法であっお、以䞋の工皋を含む補造方法であるの調節物質を同定する工皋、該調節物質が、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる疟患の矀に含たれる疟患の症状を改善するかどうかを調べる工皋および該調節物質を蚱容し埗る補薬的担䜓ず組み合わせる工皋。
本発明のさらなる目的は、哺乳類における血液疟患および心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患および肝臓疟患からなる疟患の矀に含たれる疟患を有する哺乳類における掻性の調節のための、の調節物質の䜿甚である。
本発明を説明するために以䞋の実斜䟋を蚘茉する。これらの実斜䟋は、説明するために蚘茉するものであっお、本発明を限定する目的で蚘茉するものではない。
実斜䟋
公開された配列デヌタベヌスの盞同的配列の怜玢
盞同性の皋床を容易に蚈算するこずができる。盞同性を決定するための奜たしい方法は、詊隓した配列間の最も倧きな䞀臎を䞎える様に蚭蚈する。盞同性を決定するための方法は、、、および等の公に入手可胜なコンピュヌタプログラムにより䜓系化される。プログラムはからむンタヌネットで公に入手可胜である。
に぀いお、アルゎリズムAltschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ; Nucleic Acids Res 1997 Sep 1 ; 25 (17): 3389-402および以䞋のパラメヌタの組を甚いお既知の配列に察する以䞋のヒットを同定した
マトリックスおよび䜎耇雑床フィルタヌ。以䞋のデヌタベヌスを怜玢した非重耇配列および芪デヌタベヌス(Geneseq)。
以䞋のヒットが芋぀かった
> NA2001: AAD08007 AadO8007 ヒト タンパク質共圹型受容䜓、SNORF62、cDNA. 8/2001、長さ 1318、゜ヌス 2403 bits (1212)、期埅倀 0.0、同䞀性 1212/1212()、フレヌム +1

> NA2000 : AAA30663 Aaa30663 ヒト タンパク質共圹型受容䜓 MIGcDNA.
8/2000;長さ1212 ;゜ヌス 2403 bits (1212),期埅倀 0.0; 同䞀性 1212/1212(100%) ; フレヌム +1

> gbAF272362.1AF272362 ホモ・サピ゚ンス ニュヌロメゞン受容䜓(NMUR1)mRNA, 完党; 長さ1318; ゜ヌス 2403 bits(1212), 期埅倀 0.0 ; 同䞀性 1212/1212 (100%) ; フレヌム +1

> refNM_006056. 1ホモ・サピ゚ンス タンパク質共圹型受容䜓 66(GPR66), mRNA ; 長さ1212; ゜ヌス 2403 bits(1212), 期埅倀0.0 ; 同䞀性 1212/1212() ; フレヌム +1

> NA2001: AAF76231 Aaf76231 ヒト タンパク質共圹型受容䜓 FM-3cDNA. 6/2001; 長さ1209; ゜ヌス 2397 bits(1209), 期埅倀 0.0 ; 同䞀性 1209/1209(100%) ; フレヌム +1

> NA2001: AAH45072 Aah45072 ヒト FM-3 コヌド配列. 9/2001; 長さ1209;゜ヌス 2397 bits (1209), 期埅倀 0.0 ; 同䞀性 1209/1209(100%) ; フレヌム +1

> NA2000: AAA30739 Aaa30739 DNA コヌド ヒト 突然倉異タンパク質共圹型受容䜓 MIG (T273K). 8/2000; 長さ1212;゜ヌス 2387 bits(1204), 期埅倀 0.0 ; 同䞀性 1210/1212(99%) ; フレヌム +1

> NA2000: AAZ49707 Aaz49707 ヒト 成長ホルモン分泌促進関連受容䜓DNA. 4/2000; 長さ1212 ;゜ヌス 2379 bits(1200), 期埅倀 0.0 ; 同䞀性 1209/1212(99%) ; フレヌム +1

> gbAC017104.8ホモ・サピ゚ンス染色䜓クロヌンRP11-562I5, 完党配列; 長さ168880; ゜ヌス 1643 bits(829), 期埅倀 0.0 ; 同䞀性 829/829(100%) ; フレヌム : +1

> gbAF044600.1HSOGPCR1 ホモ・サピ゚ンス オヌファンタンパク質共圹型受容䜓遺䌝子、第コヌド゚ク゜ン長さ828; ゜ヌス 1641 bits(828), 期埅倀 0.0; 同䞀性 828/828(100%) ; フレヌム +1

> gbAF044601.1HSOGPCR2 ホモ・サピ゚ンスオヌファンタンパク質共圹型受容䜓遺䌝子、第コヌド゚ク゜ンおよび完党; 長さ384; ゜ヌス 761 bits(384), 期埅倀 0.0 ; 同䞀性 384/384(100%) ; フレヌム +1

> NA2001: AAH45073 Aah45073 マりスFM-3コヌド配列. 9/2001; 長さ1215; ゜ヌス 317 bits(160), 期埅倀 8e-84; 同䞀性 499/612(81%) ; フレヌム +1

> NA2000: AAZ49706 Aaz49706 マりス成長ホルモン分泌促進関連受容䜓DNA. 4/2000; 長さ1526; ゜ヌス 317 bits(160), 期埅倀 8e-84; 同䞀性 499/612 (81%); フレヌム : +1
実斜䟋
発珟プロファむリング
぀の暙準的方法グアニゞンむ゜チオシアネヌト塩化セシりム密床募配遠心Kellogg,(1990)たたは補造業者の説明曞に埓うTri-Reagentプロトコル(Molecular Research Center, Inc. , Cincinatti, Ohioの぀によっお现胞から党现胞を単離した。Tri-Reagentプロトコルにより調補した党をaseIで凊理しおゲノム汚染を陀去した。
の分垃の盞察的定量に぀いお、各现胞たたは組織由来の党をたず逆転写した。最終容量ΌL䞭、Όmoleのランダムヘキサマヌプラむマヌ、各Όの、、、およびQiagen, Hilden, Germany、のRnaseQutInvitrogen, Groningen, Netherlandsを甚いおΌgの党を逆転写した。第鎖の合成緩衝液およびOmniscript逆転写酵玠ΌLはQiagen, Hilden, Germanyから入手した。反応物を℃にお分間むンキュベヌションし、氷冷した。䜓積を氎でΌに調節し、初発の最終濃床をΌずした。
现胞および組織におけるの分垃の盞察的定量に぀いおは、Perkin Elmer ABI Prism RTM.7700配列決定システムたたはBioradiCyclerを取り扱い説明曞ずプロトコルにしたがっお䜿甚した。反応をおよびハりスキヌピング遺䌝子ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラヌれ、グリセルアルデヒド−−ホスフェヌトデヒドロゲナヌれ、β−アクチンなどを定量するよう蚭定した。に察するフォワヌドおよびリバヌスプラむマヌおよびプロヌブを、Perkin Elmer ABI Primer Express登録商暙゜フトりェアを甚いお蚭蚈し、TibMolBiol (Berlin, Germany)によっお合成した。フォワヌドプラむマヌ配列は以䞋の通りであるプラむマヌ配列番号。リバヌスプラむマヌはプラむマヌ配列番号である。レポヌタヌ色玠ずしおカルボキシフルオレセむニミゞル゚ステル、ク゚ンチャヌずしおカルボキシテトラメチルロヌダミンで暙識したプロヌブ配列番号をに぀いおのプロヌブずしお甚いた。以䞋の詊薬を調補しお総䜓積Όずした×緩衝液、 2、の、、および、の 、のおよびプロヌブ配列番号、各のフォワヌドおよびリバヌスプラむマヌ、の−暙識プロヌブおよびΌLのテンプレヌト。枩床サむクルパラメヌタヌは℃で分、℃で分、次いで℃で秒間をサむクルおよびアニヌリング䌞匵を℃で分間であった。
補正された倀の蚈算
「栞酞の定量枬定」の節に蚘茉のずおり閟倀サむクル倀を蚈算する。以䞋のようにしお倀閟倀サむクル補正のための係数を蚈算する
反応をセットアップしお、各サンプルに぀いおハりスキヌピング遺䌝子を定量する
HKG-倀ハりスキヌピング遺䌝子に぀いおの閟倀サむクルを、「栞酞の定量枬定」の節に蚘茉のずおり蚈算する。
各に぀いおすべおののHKG−平均倀぀のに぀いお詊隓したすべおのの平均倀を蚈算するの数
HKG-n平均倀HKG1倀HKG2倀...HKG-n倀
pannel平均倀詊隓したすべおのにおけるすべおのの平均倀
HKG1平均倀HKG2平均倀HKG-y平均倀
の数
cDNA-n( に぀いおの補正係数pannel平均倀−HKG-n平均倀
cDNA-n( に぀いお詊隓した遺䌝子の倀eDNA-nに぀いおの補正係数cor-cDNA-nに察する遺䌝子に぀いおの補正倀
盞察的発珟の蚈算
定矩最も高いcor-cDNA-n≠をcor-cDNA[high]ず定矩する
盞察的発珟(CTcor-cDNA[high]-CTcor-cDNA-n)
組織
の発珟を以䞋の組織においお調べた脳、党アルツハむマヌ脳、胎児脳、小脳、脊髄、心臓、胎児心臓、心膜、末梢血、冠状平滑筋现胞、现胞、甲状腺、甲状腺癌、脟臓、脟臓肝硬倉、胞腺、骚髄、肺、胎児肺、肺癌、肝臓、胎児肝臓、肝臓肝硬倉、现胞、膵臓、膵臓肝硬倉、胃、小腞、結腞、結腞癌、腎臓、现胞、骚栌筋、现胞、乳癌、乳腺、现胞、粟巣、気管、副腎、唟液腺、膀胱、前立腺、胎盀、子宮、脂肪。
発珟プロファむル
の定量発珟プロファむルの結果を以䞋の衚に瀺す。
衚
様々なヒト組織におけるの盞察的発珟
脳 24,45
党アルツハむマヌ脳 276,44
胎児脳 18,45
小脳 38,77
脊髄 8,26
心臓 2,18
胎児心臓 64,26
心膜 160,25
末梢血 1318,79
冠状平滑筋现胞 802,95
现胞 973,81
甲状腺 307,44
甲状腺癌 42,44
脟臓 61,62
脟臓肝硬倉 146,27
胞腺 53,48
骚髄 89,88
肺 54,13
胎児肺 97,06
肺癌 469,23
肝臓 759,64
胎児肝臓 17,97
肝臓肝硬倉 897,13
HEP G2现胞 622,03
膵臓 72,15
膵臓肝硬倉 9,90
胃 161,13
小腞 290,89
結腞 314,08
結腞癌 195,70
腎臓 402,87
HEK293现胞 230,32
骚栌筋 10,63
HeLa现胞 1,00
乳癌 198,43
乳腺 136,87
MDA MB 231现胞 31,83
粟巣 115,11
気管 186,88
副腎 57,67
唟液腺 10,21
膀胱 162,77
前立腺 207,52
胎盀 156,74
子宮 285,97
脂肪 156,77
実斜䟋アンチセンス解析
をコヌドする、正しい、完党な配列の知芋は、遺䌝子機胜の研究においおアンチセンス技術のためのツヌルずしお甚いるこずが可胜である。をコヌドするポリヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む、オリゎヌクレオチド、たたはゲノム断片を、in vitro たたは in vivoのいずれかで、の翻蚳を阻害するために䜿甚する。そのような技術はいたや呚知であり、ヌクレオチド配列䞊の様々な座でアンチセンス分子を蚭蚈するこずができる。现胞たたは詊隓動物党䜓をそのようなアンチセンス配列で凊理するこずにより、目的の遺䌝子を有効に抑えるこずができる。しばしば、遺䌝子の機胜は、现胞内、现胞、組織たたは生物レベルでの振る舞いを芳察するこずによっお確かめられる䟋えば、臎死性、分化した機胜の喪倱、圢質の倉化など。
構築した配列を甚いお特定のオヌプンリヌディングフレヌムに分断するこずに加えお、むントロン領域、プロモヌタヌ゚ンハンサヌ゚レメントたたはさらにはトランス䜜甚調節遺䌝子に察するアンチセンス配列を蚭蚈するこずによっお遺䌝子発珟を修食するこずができる。
実斜䟋
の発珟
の発珟は、を適圓な発珟ベクタヌにサブクロヌニングし、このベクタヌを倧腞菌等の発珟宿䞻にトランスフェクトするこずにより行う。具䜓的な堎合では、ベクタヌを操䜜しお、クロヌニング郚䜍の䞊流にβ−ガラクトシダヌれのためのプロモヌタヌ、続いおアミノ末端のメチオニンおよびそれに続くβ−ガラクトシダヌれの぀の残基を含む配列を導入する。これら残基のすぐ䞋流は、人工的なプラむミングず転写およびクロヌニングのための倚くの独特な゚ンドヌクレアヌれ制限郚䜍を生じるのに有甚な、遺䌝子操䜜されたバクテリオファヌゞプロモヌタヌである。
暙準な方法を甚いおむ゜プロピル−β−−チオガラクトピラノシドを甚いお単離した、トランスフェクトされた现菌株の誘導により、β−ガラクトシダヌれの最初の残基、玄残基の「リンカヌ」および内でコヌドされたペプチドを含む融合タンパク質を産生する。クロヌン挿入物は、本質的にランダムな過皋で䜜補されるので、適切な翻蚳のために正しいリヌディングフレヌムでが導入される可胜性はである。が適切なリヌディングフレヌムにない堎合は、in vitro突然倉異誘発、゚キ゜ヌクレアヌれIIIたたは緑豆ヌクレアヌれによる消化、たたは適圓な長さのオリゎヌクレオチドリンカヌの導入などの呚知の方法を甚いお、適圓な数の塩基を欠倱させるかたたは挿入するこずによっお埗られる。
を、特定の宿䞻におけるタンパク質の発珟に有甚であるず知られおいる他のベクタヌにシャトルする。クロヌニング郚䜍䞊びに暙的の䞡端で鎖を加氎分解するのに十分な長さのの断片玄塩基を含むオリゎヌクレオチドプラむマヌを暙準的な方法により化孊的に合成する。次いで、これらのプラむマヌを甚いお所望の遺䌝子断片をにより増幅する。埗られた遺䌝子断片を暙準的な条件䞋で適圓な制限酵玠で消化し、ゲル電気泳動により単離する。あるいは、適圓な制限酵玠を甚いたの消化により同様の遺䌝子断片を補造する。適圓なプラむマヌを甚いお、以䞊の遺䌝子に由来するコヌド配列を共に連結し、適圓なベクタヌにクロヌニングする。そのようなキメラ配列の構築によっお発珟を最適化するこずが可胜である。
このようなキメラ分子の適圓な発珟宿䞻ずしおは、チャむニヌズハムスタヌ卵巣、ヒト现胞等の哺乳類现胞、现胞等の昆虫现胞、Saccharomyces cerevisiae等の酵母现胞、倧腞菌等の现菌が挙げられるがこれに限定されない。これら现胞系のそれぞれに぀いお、有甚な発珟ベクタヌはさらに现菌における増殖を可胜にする耇補起点、および现菌におけるプラスミド遞択を可胜にするためのβ−ラクタマヌれ耐性遺䌝子等の遞択マヌカヌを含む。さらに、ベクタヌは、ネオマむシンホスホトランスフェラヌれ遺䌝子等のトランスフェクトされた真栞宿䞻现胞における遞択を可胜にする第の遞択マヌカヌを含むこずができる。真栞発珟宿䞻においお䜿甚するためのベクタヌは、目的のの䞀郚ずしお存圚しおいなければ、’ポリアデニル化配列などのプロセシング゚レメントが必芁である。
さらに、ベクタヌは、遺䌝子発珟を増倧させるプロモヌタヌたたぱンハンサヌを含む。そのようなプロモヌタヌは、宿䞻に特異的であり、现胞に察しおは、、およびメタロチオネむンプロモヌタヌ现菌宿䞻に察しおは、、、およびプロモヌタヌそしお酵母に察しおは、アルファ因子、アルコヌルオキシダヌれおよびプロモヌタヌが挙げられる。哺乳類现胞宿䞻においおは、ラりス肉腫りむルス゚ンハンサヌ等の転写゚ンハンサヌを甚いる。暙準的な培逊法により組換え现胞の均䞀な培逊现胞が埗られたら、組換えで産生した倧量のを、ならし培地から回収し、圓分野で呚知のクロマトグラフィヌ法を甚いお解析する。䟋えば、本明现曞においお䟋瀺するように、を発珟ベクタヌにクロヌニングするこずができる。生成物を甚いお、圓分野における暙準的な方法により、䟋えばたたはを圢質転換する。具䜓的には、䟋えば、リポフェクタミンGibco BRL catolog no. 18324-020介圚の遺䌝子導入を甚いる。
実斜䟋組換えの単離
を、付加したたたはそれ以䞊のさらなるポリペプチドドメむンず共にキメラタンパク質ずしお発珟させお、タンパク質の粟補を容易にする。そのような粟補を容易にするドメむンずしおは、固定化された金属䞊での粟補が可胜なヒスチゞン−トリプトファンモゞュヌル等の金属キレヌトペプチドAppa Rao, 1997、および䌞匵アフィニティヌ粟補システムにおいお甚いられるドメむンImmunex Corp., Seattle, Washingtonが挙げられるがこれに限定されない。粟補ドメむンず配列ずの間の、因子たたぱンテロキナヌれInvitrogen, Groningen, The Netherlands等の開裂可胜なリンカヌ配列の導入は、の発珟を促進するのに有甚である。
実斜䟋キメラの詊隓
新しいアむ゜フォヌムの现胞倖の受容配列を、詊隓目的で既知の同䜍䜓の膜貫通および现胞内領域ず組み合わせるこずにより、機胜的なを構築する。この抂念は、段階的に増倧させた量のα−膜貫通配列をβ−に挿入するこずにより䞀連のキメラα−βアドレナリン䜜動性受容䜓を䜜補した、Kobilka ら (1988), Science 240: 1310-1316により実蚌された。既知のアンタゎニストの結合掻性は、βコンフォメヌションよりもαコンフォメヌションを倚く有するずころからシフトした分子ずしお倉化し、䞭間䜓構築物は組み合わされた特異性を瀺した。䜆し、アンタゎニストの結合の特異性は、ドメむンの䟛絊源ず関連しおいた。ドメむンの重芁性は、぀の酵母α因子受容䜓を甚いおキメラにおいお認められ、酵母受容䜓はその他の受容䜓ず分類されおいるので有意である。したがっお、特異的ドメむンの機胜的圹割はカテゎリヌに関係なくファミリヌにおいお保存されおいるようである。
平行しお、特定のアむ゜フォヌムに由来する内郚領域たたは现胞質ドメむンを、既知のの同様のドメむンず亀換し、䞉量䜓タンパク質に察する受容䜓の結合の原因である構造的な決定因子を同定する。β−からドメむン、および现胞内連結ルヌプがα−に眮換されたキメラ受容䜓は、α−特異性でもっおリガンドに結合するが、β−ず同様にアデニル酞サむクラヌれを刺激するこずが瀺された。このこずは、アドレナリン䜜動性受容䜓に぀いお、タンパク質認識がドメむン、およびそれらの連結ルヌプに存圚するこずを瀺しおいる。α−の−ルヌプでβ−においお察応するドメむンを眮換したキメラに぀いお、これず正反察の状況が予想され、芳察され、埗られた受容䜓は、β―特異性でもっおリガンドず結合し、α−ず同様に、タンパク質介圚のホスファチゞルむノシトヌル代謝回転を掻性化した。最埌に、ムスカリン様受容䜓から構築したキメラはたた、−ルヌプがタンパク質掻性の特異性に぀いおの䞻芁な決定因子であるこずを瀺した。
现胞倖および膜貫通領域においお眮換を含むキメラたたは修食は、受容䜓のこれらの䜍眮がリガンド結合特異性を決定しおいるこずを瀺した。䟋えば、すべおのアドレナリン䜜動性およびカテコヌルアミンのドメむンに保存されおいる぀のセリン残基は、匷力なアゎニスト掻性に必芁である。これらのセリンは、結合郚䜍内でアゎニストのカテコヌル郚分ず氎玠結合を圢成するず考えられおいる。同様に、生物由来のアミンず結合するすべおののドメむンに存圚する残基は、結合郚䜍におけるリガンドアミン基ずむオン察を圢成するず考えられおいる。
機胜的な、クロヌニングされたは、ヘテロロヌガスな発珟系においお発珟し、それらの生物孊的掻性が評䟡される。぀のヘテロロヌガスな発珟系は、哺乳類の遺䌝子ず哺乳類タンパク質を酵母现胞に導入する。は適圓なリガンド特異性ず芪和性を有し、酵母现胞の生物孊的掻性化成長阻止および圢質の倉化の匕き金ずなるこずが分かっおいる。
キメラ受容䜓を詊隓するための別の方法は、プリン受容䜓を甚いる方法に基づいおいる。2受容䜓を欠いおいるので培逊したヒト癜血病现胞においお機胜が容易に枬定される。现胞を、正垞なたたはキメラ2のいずれかを含む発珟ベクタヌで圢質転換し、fura-a、++のための蛍光プロヌブを導入する。现胞倖たたはによる、適切に構築され機胜的な2受容䜓の掻性化により、−ず反応し、分光光床蚈により枬定される现胞内++が移動する。
䞊蚘のず同様に、いずれかの新芏のポリペプチドの现胞倖受容領域の配列を、既知の2分子の膜貫通および现胞内領域をコヌドするヌクレオチドず組み合わせるこずにより、キメラ遺䌝子を䜜補する。適圓なリガンドを含むマむクロりェルにお现胞を䞀床にトランスフェクトしお、結合を匕き起こし、分子の゚フェクタヌを芏定する蛍光掻性を生じさせる。リガンドおよび機胜が確立されれば、2系は、結合をブロックし、そのような蛍光反応を阻止するアンタゎニストたたは阻害剀を定矩するのに有甚である。
実斜䟋特異的抗䜓の産生
぀の方法をに察する抗䜓を惹起するための利甚し、それらの方法は、それぞれポリクロヌナルたたはモノクロヌナル抗䜓のいずれかを惹起するために有甚である。぀の方法では、逆盞分離によっお倉性タンパク質がたでの量で埗られる。この倉性タンパク質は、暙準的なプロトコルを甚いお免疫するのに甚いられ、マりスの免疫に぀いおは玄Όが適圓であり、りサギをの免疫にはたでを䜿甚する。マりスハむブリドヌマの同定に぀いおは、倉性タンパク質を攟射胜暙識しお甚い、可胜性のあるマりス现胞を抗䜓を産生するものずしおスクリヌニングする。この方法は、少量のタンパク質しか必芁ずせず、数千のクロヌンのスクリヌニングにはで十分である。
第の方法では、の翻蚳から掚定される、適圓なドメむンのアミノ酞配列を解析しお抗原性の高い領域を解析する。適圓な芪氎性の領域を含むオリゎペプチドを合成しお、適圓な免疫化のプロトコルにおいお甚いお抗䜓を惹起させる。免疫化に最適なアミノ酞配列は、通垞、そのタンパク質が自然のコンフォヌメヌションで存圚しおいるずきに倖郚の環境に露出しおいるず思われるポリペプチドの末端、末端およびその間に存圚する芪氎性の領域に存圚する。
兞型的には、玄残基の長さの遞択されたペプチドを、化孊反応を甚い、Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model431Aを甚いお合成し、−マレむミドベンゟむル−−ヒドロキシサクシンむミド゚ステル、ずの反応によっおキヌホヌルリンペットモシアニンSigma, St. Louis, MOず結合させる。芁すれば、システむンをペプチドの末端に導入しおずの結合を可胜にする。りサギを、完党フロむントアゞュバント䞭、ペプチド−耇合䜓で免疫する。ペプチドをプラスティックず結合させ、りシ血枅アルブミンでブロックし、抗血枅ず反応させ、掗浄し、暙識攟射胜たたは蛍光されアフィニティヌ粟補された特異的なダギ抗りサギず反応させるこずによっお、埗られた抗血枅を抗ペプチド掻性に぀いお詊隓する。
暙準的な技術を甚いおハむブリドヌマを調補し、スクリヌニングする。目的のハむブリドヌマを、暙識によるスクリヌニングによっお怜出しお、所望の特異性を有するモノクロヌナル抗䜓を生じる融合物を同定する。兞型的なプロトコルでは、プレヌトのりェルBecton-Dickinson, Palo Alto, CAを、むンキュベヌションの間、アフィニティヌ粟補された、特異的りサギ抗マりスたたは適圓な抗特異物質antispecies抗䜓をで甚いおコヌティングする。コヌティングしたりェルをりシ血枅アルブミンでブロックし、掗浄し、ハむブリドヌマの䞊枅ずむンキュベヌションする。掗浄埌、りェルをの暙識したずむンキュベヌションする。特異的な抗䜓を有する䞊枅は、怜出可胜なバックグラりンドよりも暙識されたにより結合する。次いで、特異的抗䜓を産生するクロヌンを培逊し、垌釈率を限定したサむクルのクロヌニングに付する。クロヌニングしたハむブリオヌマをプリスタン凊理したマりスに泚射し腹氎症を生じさせ、モノクロヌナル抗䜓を、プロテむンでのアフィニティヌクロマトグラフィヌにより、マりスの腹氎から粟補する。暙準的な方法によっお、少なくずも8-1の芪和性、奜たしくは9〜10-1たたはそれ以䞊、を有するモノクロヌナル抗䜓が兞型的に䜜補される。
実斜䟋特異的抗䜓を甚いた蚺断詊隓
特定の抗䜓は、シグナル䌝達の研究、およびたたは掻性なシグナル䌝達のカスケヌドの䞋流の生成物の量たたは分垃の違いによっお特城付けられる感染性のたたは遺䌝的な状態の蚺断に有甚である。
の蚺断詊隓ずしおは、ヒトの䜓液、膜、现胞、組織たたはそれらの抜出物におけるを怜出するための抗䜓および暙識を甚いる方法が挙げられる。本発明のポリペプチドおよび抗䜓は、修食するかたたは修食しないで甚いる。しばしば、ポリペプチドおよび抗䜓は、それらを共有結合たたは非共有結合により、怜出可胜なシグナルを生じる物質ず連結するこずによっお暙識する。様々な暙識およびコンゞュゲヌション法が知られおおり、孊術文献ず特蚱文献の䞡方においお広く報告されおいる。適圓な暙識ずしおは、攟射性栞皮、酵玠、基質、コファクタヌ、阻害物質、蛍光物質、化孊ルミネセンス物質、発光物質、磁性物質などが挙げられる。
圓分野においお、タンパク質に特異的なポリクロヌナルたたはモノクロヌナル抗䜓のいずれかを甚いる、可胜性たたは膜結合型のを枬定するための様々なプロトコルが知られおいる。䟋ずしおは、酵玠結合免疫吞着分析、ラゞオむムノアッセむおよび蛍光暙瀺匏现胞分取が挙げられる。䞊の぀の非干枉゚ピトヌプに反応するモノクロヌナルを甚いる、郚䜍モノクロヌナルベヌスのむムノアッセむが奜たしいが、競合結合アッセむも甚いるこずができる。
実斜䟋特異的な抗䜓を甚いる倩然の粟補
倩然たたは組換えを、に特異的な抗䜓を甚いるむムノアフィニティヌクロマトグラフィヌにより粟補する。䞀般に、むムノアフィニティヌカラムは、抗抗䜓を、掻性化したクロマトグラフィヌ暹脂に共有結合させるこずにより構築する。
ポリクロヌナル免疫グロブリンは、硫酞アンモニりムによる沈殿たたは固定化したプロテむンPharmaciaLKB Biotechnology, Piscataway N.J.での粟補により、免疫血枅から調補する。同様に、モノクロヌナル抗䜓を、硫酞アンモニりムによる沈殿たたは固定化したプロテむンでのクロマトグラフィヌによりマりス腹氎から調補する。特定の粟補した免疫グロブリンを、−掻性化セファロヌスPharmacia LKB Biotechnology等のクロマトグラフィヌ暹脂に共有結合させる。抗䜓を暹脂に結合させ、暹脂をブロックし、埗られた暹脂を補造業者の取扱説明曞にしたがっお掗浄する。
このようなむムノアフィニティヌカラムは、可溶性の圢態でを含む现胞から画分を調補するこずによっおの粟補に甚いる。この調補物は、党现胞のたたは分画遠心界面掻性剀を添加するたたは添加しないにより埗られた现胞成分の画分を可溶化するこずによっお、あるいは圓分野においお呚知の他の方法によっお埗られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶性のを、その现胞を培逊しおいる培地䞭に有甚な量で分泌させる。
可溶性のを含有する調補物をむムノアフィニティヌカラムに通し、の遞択的に吞着が可胜な条件䞋䟋えば、界面掻性剀の存圚䞋での高いむオン匷床の緩衝液でそのカラムを掗浄する。次いで、抗䜓タンパク質結合を切断する条件䞋䟋えば、〜、たたは尿玠たたはチオシアン酞むオン等の攪乱物質chaotropeの高い濃床の緩衝液でカラムを溶出し、を回収する。
実斜䟋薬物スクリヌニング
本発明は、たたはその結合断片を、様々な薬物スクリヌニング法のいずれかにおいお甚いるこずにより、治療化合物のスクリヌニングに特に有甚である。はタンパク質共圹型受容䜓であるので、圓分野においお䞀般的に甚いられる方法はいずれもリガンドを同定するために䜿甚するこずができる。䟋えば、等のタンパク質共圹型受容䜓の掻性を、受容䜓の掻性化によっおアデニル酞サむクラヌれ、グアニリルサむクラヌれ、カルシりム移動たたはむノシトヌルリン酞加氎分解等のいく぀かのセカンドメッセンゞャヌ系のレベルにおける芳察可胜な倉化がもたらされる、様々な適圓な機胜解析のいずれかを甚いお枬定するこずができる。あるいは、そのような詊隓おいお甚いられるポリペプチドたたは断片は。溶液䞭に遊離しおいるか、固䜓の支持䜓に固定されおいるか、现胞衚面に存圚するかたたは现胞内に存圚する。薬物スクリヌニングの぀の方法は、ポリペプチドたたは断片を発珟する組換え栞酞によっお安定に圢質転換された真栞たたは原栞宿䞻现胞を甚いる。生きおいるたたは固定されおいるそのような现胞を暙準的な結合アッセむに甚いる。
䟋えば、ず詊隓物質ずの間の耇合䜓の圢成を枬定する。あるいは、詊隓物質によっお匕き起こされた、ずリガンドずの間の耇合䜓圢成の枛少を調べる。
したがっお、本発明は、シグナル䌝達に倉化を及がす薬物候補、薬物、たたは他のいずれかの物質をスクリヌニングするための方法を提䟛する。圓分野においお呚知のこれらの方法は、そのような物質をポリペプチドたたはその断片ず接觊させ、その物質ずポリペプチドたたは断片ずの間の耇合䜓の存圚、たたはポリペプチドたたは断片ず现胞ずの間の耇合䜓の存圚に぀いお分析するこずを含む。このような結合分析では、兞型的にはポリペプチドたたは断片を暙識する。
適切にむンキュベヌションした埌、遊離のポリペプチドたたは断片を、結合した圢態で存圚しおいるポリペプチドず分離し、遊離たたは耇合䜓を圢成しおいない暙識の量は、具䜓的な物質がに結合するたたは−物質耇合䜓ず盞互䜜甚する胜力の指暙ずなる。
薬物スクリヌニングの別の技術は、ポリペプチドに察する適切な結合芪和性を有するハむスルヌプットスクリヌングを提䟛する。簡朔に蚀えば、倧量の異なった小さいペプチド詊隓化合物を、プラスチック補のピンたたは他の衚面などの固䜓の物質䞊に合成する。ペプチド詊隓化合物をポリペプチドず反応させ、掗浄する。結合したポリペプチドを圓分野で呚知の方法により怜出する。粟補したは、䞊蚘の薬物スクリヌニング技術においお䜿甚するため、盎接プレヌトにコヌティングするこずができる。さらに、非䞭和抗䜓を甚いおペプチドを捕捉し、それを固䜓の支持䜓に固定化する。
本発明はさらに、ず結合するこずができる䞭和抗䜓が、ポリペプチドたたはその断片に察する結合に぀いお詊隓化合物ず特異的に競合する、競合薬物スクリヌニングアッセむの䜿甚を意図する。このようにしお、抗䜓を甚いお、ずたたはそれ以䞊の抗原結合基を共有するペプチドの存圚を怜出する。
実斜䟋合理的薬物蚭蚈
合理的薬物蚭蚈の目的は、所望の生物孊的に掻性なポリペプチドの構造的類瞁䜓たたはそれらが盞互䜜甚する小分子、アゎニスト、アンタゎニストを提䟛するこずである。これらの䟋はいずれも。ポリペプチドのより掻性なたたは安定な圢態、たたはin vivoでポリペプチドの機胜を増倧たたは盞互䜜甚する薬物を蚭蚈するために甚いられる。
぀の方法ずしおは、目的のタンパク質、タンパク質−阻害物質耇合䜓の次元構造を線結晶孊により、コンピュヌタモデリングにより、たたは最も兞型的にはその぀の方法の組合せによっお決定する。ポリペプチドの圢状および電荷の䞡方を解明し、その分子の構造を明らかにし、掻性郚䜍を決定しなければならない。頻繁ではないが、ホモロヌガスなタンパク質に基づくモデリングによっおポリペプチドに関する有甚な情報が埗られる。䞡方の堎合においお、関連する構造の情報を甚いお有効な阻害剀を蚭蚈する。合理的薬物蚭蚈の有甚な䟋ずしおは、倩然のペプチドの、改善された掻性たたは安定性を有するたたは阻害剀、アゎニストたたはアンタゎニストずしお䜜甚する分子が挙げられる。
䞊蚘のように、機胜的分析によっお遞択された、暙的に特異的な抗䜓を単離し、その結晶構造を解明するこずも可胜である。この方法によっお、原則的に、埌に薬物蚭蚈がそれに基づいお行われるファヌマコアpharmacoreが埗られる。機胜的な、補薬的に掻性な抗䜓に察する抗むディタむプ抗䜓anti-idsを䜜補するこずによっお、タンパク質結晶孊をすべお省略するこずが可胜である。鏡像の鏡像のように、抗の結合郚䜍は、もずの受容䜓の類瞁䜓であるず期埅される。次いで、この抗を甚いお、化孊的たたは生物孊的に補造されたペプチドのバンクからペプチドを同定し単離する。単離されたペプチドはファヌマコアずしお䜜甚する。
本発明によっお、十分な量のポリペプチドを䜜補しお、線結晶孊ずしおそのような分析実隓を行うこずを可胜にする。さらに、本明现曞においお提䟛されるアミノ酞配列の知芋は、線結晶孊の代わりずしおたたはそれに加えおコンピュヌタモデリング技術を甚いるための指針を䞎える。
実斜䟋シグナル䌝達耇合䜓の他のメンバヌの同定
本発明の粟補されたは、関係するタンパク質たたは他のシグナル䌝達経路のタンパク質の同定、キャラクタリれヌションおよび粟補のための怜玢ツヌルである。攟射胜暙識を、圓分野で呚知の様々な方法により、遞択したドメむンに導入しお甚い、盞互䜜甚する分子を捕捉する。奜たしい方法ずしおは、125 Bolton-Hunter詊薬による、における第䞀玚アミン基の暙識である。この詊薬は、付随する生物孊的掻性の消倱なしに様々な分子を暙識するために甚いられおいる。
暙識したはそれが盞互䜜甚する分子の粟補のための詊薬ずしお有甚である。アフィニティヌ粟補の぀の態様では、膜結合を共有結合によりクロマトグラフィヌカラムに結合させる。滑液现胞から埗られた無现胞抜出液たたは掚定の暙的现胞をカラムに通し、適圓な芪和性を有する分子をに結合させる。耇合䜓をカラムから回収し、を結合したリガンドを解離させ末端タンパク質配列決定に付する。次いで、アミノ酞配列の情報を甚いお、捕捉された分子を同定するかたたは適圓なラむブラリヌから関連の遺䌝子をクロヌングするための瞮重オリゎヌクレオチドプロヌブを蚭蚈する。
別の方法においおは、に察する抗䜓、特にモノクロヌナル抗䜓、を惹起させる。モノクロヌナル抗䜓をスクリヌニングしお、暙識されたの結合を阻害する抗䜓を同定する。次いで、これらのモノクロヌナル抗䜓を治療に甚いる。
実斜䟋抗䜓、阻害剀たたはアンタゎニストの䜿甚および投䞎
シグナル䌝達の抑制剀であるの抗䜓、阻害剀たたはアンタゎニストたたは他の治療物質および化合物は、治療的に投䞎した堎合に皮々の効果をもたらす。は、奜たしくは玄〜、より奜たしくは〜の、非毒性の、䞍掻性な補薬的に蚱容し埗る氎性担䜓媒䜓䞭で圢成されるが、は圢成する抗䜓、阻害剀たたはアンタゎニストの特性および凊眮される状態にしたがっお倉曎するこずができる。の特性ずしおは、分子の可溶性、その半枛期および抗原性免疫原性が挙げられる。これらのおよびその他の特性は、有効な担䜓を芏定するずきの助けずなる。倩然のヒトタンパク質は、ずしお奜たしいが、薬物スクリヌニングからスクリヌニングされた有機たたは合成分子は、特定の状況においおは同様に有効である。
は、局所クリヌムおよびゲル経粘膜スプレヌおよび゚アゟヌル経皮パッチおよびバンデヌゞ、泚射甚、静脈甚および掗浄液補剀および特に胃酞ず酵玠に耐えるように補剀化された経口投䞎液剀および䞞剀が挙げられるがこれに限定されない、既知の投䞎経路によっお送達するこずができる。具䜓的な補剀、詳现な甚量および投䞎経路は、䞻治医が決定し、それぞれの具䜓的な状況にしたがっお倉化する。
そのような決定は、凊眮される状態、投䞎される、および具䜓的なの薬理孊的プロフィヌル、によっおなされる。さらに、疟患の状態の重節床、患者の幎霢、䜓重、性別および食習慣、投䞎の時間ず頻床、他の薬物の可胜性のある組合せ、反応感受性、および治療に察する蚱容床応答を含むさらなる芁玠も考慮に入れる。長期間䜜甚する補剀は、具䜓的なの半枛期およびクリアランス速床によっお、〜日毎、週間毎、たたは週間毎に投䞎するこずができる
通垞の適量量は、投䞎経路に䟝存しお〜5Όの範囲で、総甚量玄たで、倉曎するこずができる。送達の具䜓的甚量および方法に関する指針は文献に蚘茉されおいる米囜特蚱第,,,,,,号公報参照。圓業者は、異なるに察しお異なる公匏を甚いる。神経现胞のような现胞ぞの投䞎は、血管内皮现胞等の他の现胞ずは異なった手段で行われる。
掻性を誘発する異垞なシグナル䌝達、倖傷を誘発する疟患がにより治療可胜であるず考えられる。これらの状態たたは疟患は、䞊に論議される詊隓によっお特異的に蚺断され、そのような詊隓は、りむルス、现菌、真菌感染、アレルギヌの応答、倖傷を䌎う機械的損傷、遺䌝性の病気、リンパ腫、癌、神経組織の遺䌝子を掻性化するその他の状態が疑われる堎合に行われる。
実斜䟋非ヒトトランスゞェニック動物の䜜補
の生理孊的および行動に察する圹割を解明する動物モデル系を、様々な技術により、の掻性が増加たたは枛少しおいる、あるいは発珟したのアミノ酞配列が倉化しおいる非ヒトトランスゞェニック動物を䜜出するこずによっお䜜成する。これらの技術の䟋ずしおは、トランスゞェニック動物を䜜補するための、をコヌドするの正垞な圢態たたは突然倉異䜓の、マむクロむンゞェクション、゚レクトロポレヌション、レトロりむルストランスフェクションたたは圓分野で呚知の他の技術による適圓な受粟胚ぞの挿入、たたはトランスゞェニック動物においお、突然倉異䜓のたたは正垞な、ヒトたたは動物のこれら遺䌝子を、倩然の遺䌝子座に぀いお盞同的組換えを行い、これら配列の発珟調節たたは構造を倉化させるこずが挙げられる。盞同的組換えの技術は圓分野においお呚知である。倩然の遺䌝子を挿入遺䌝子で眮換し、そのため倩然のを発珟するこずができないが、䟋えば、組換えによっおその動物のゲノムにおいお倩然から眮き換わり、そのトランスポヌタヌの発珟䜎䞋をもたらす挿入された突然倉異䜓を発珟する動物の䜜出に有甚である。マむクロむンゞェクションはゲノムに遺䌝子を远加し、遺䌝子は陀去されず、その技術は、もずもずのそしお远加されたを発珟し、の過剰発珟をもたらす動物の䜜出に有甚である。
䟋えばマりスに぀いお、トランスゞェニック動物を䜜補するために利甚できる手段は次の通りである雌性マりスを亀尟させお埗られた受粟卵を卵管から採取する。受粟卵を塩化セシりム培地等の適切な媒䜓で保存する。をコヌドするたたはを圓業者に呚知の方法によりベクタヌから粟補する。導入プロモヌタヌをのコヌド領域に融合しお、導入遺䌝子の調節するための実隓手段を提䟛するこずができる。あるいはたたはさらに、組織特異的調節゚レメントをコヌド領域に融合し、導入遺䌝子の組織特異的発珟を可胜にするこずができる。適切に緩衝化された溶液䞭で、をマむクロ泚射針に吞い蟌みpiper pullerを甚いおキャピラリヌチュヌブから䜜補しおもよい、泚入する卵を凹みを付けたスラむドに眮く。針を卵の生殖栞に挿入し、溶液を泚入する。次いで、泚入された卵を停劊嚠マりスの卵管に移し、停劊嚠を維持するために適切なホルモンによっおマりスを刺激し、卵を子宮ぞず進たせ、着床させ、期間がくるたで生育させる。䞊に蚘茉したように、マむクロむンゞェクションは卵にを挿入するための唯䞀の方法でなく、ここでは単に䟋瀺的な目的で甚いる。
参考文献
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囜際特蚱出願公開第84/03564号公報
囜際特蚱出願公開第92/01810号公報
囜際特蚱出願公開第93/03151号公報
囜際特蚱出願公開第94/13804号公報
囜際特蚱出願公開第01/04297号公報
囜際特蚱出願公開第200140797号公報
囜際特蚱出願公開第200125269号公報
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受容䜓ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列配列番号である。 受容䜓ポリペプチドのアミノ酞配列配列番号である。 本発明に有甚なプラむマヌのヌクレオチド配列配列番号である。 本発明に有甚なプラむマヌのヌクレオチド配列配列番号である。 本発明のタンパク質を怜出するためのプロヌブずしおヌクレオチド配列配列番号である。

Claims (26)

  1. 哺乳類における、血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な治療剀のスクリヌニング方法であっお、
    詊隓化合物をポリペプチドず接觊させる工皋、
    該詊隓化合物の該ポリペプチドぞの結合を怜出する工皋
    を含んでなる方法。
  2. 哺乳類における、血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な治療剀のスクリヌニング方法であっお、
    詊隓化合物の特定の濃床でたたは該詊隓化合物の非存圚䞋でポリペプチドの掻性を枬定する工皋、
    該詊隓化合物の異なる濃床で該ポリペプチドの掻性を枬定する工皋
    を含んでなる方法。
  3. 哺乳類における、血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な治療剀のスクリヌニング方法であっお、
    詊隓化合物の特定の濃床でポリペプチドの掻性を枬定する工皋、
    ポリペプチドの調節物質であるこずが分かっおいる化合物の存圚䞋でポリペプチドの掻性を枬定する工皋
    を含んでなる方法。
  4. 接觊させる工皋を现胞内たたは现胞衚面で行う請求項〜のいずれかに蚘茉の方法。
  5. 现胞がむンビトロで存圚する請求項〜のいずれかに蚘茉の方法。
  6. 接觊させる工皋を现胞を含たない系で行う請求項〜のいずれかに蚘茉の方法。
  7. ポリペプチドを怜出可胜な暙識に結合させる請求項〜のいずれかに蚘茉の方法。
  8. 化合物を怜出可胜な暙識に結合させる請求項〜のいずれかに蚘茉の方法。
  9. 詊隓化合物がポリペプチドに最初に結合しおいたリガンドず眮き換わる請求項〜のいずれかに蚘茉の方法。
  10. ポリペプチドが固䜓の支持䜓に結合しおいる請求項〜のいずれかに蚘茉の方法。
  11. 化合物が固䜓の支持䜓に結合しおいる請求項〜のいずれかに蚘茉の方法。
  12. 哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な治療剀のスクリヌニング方法であっお、
    詊隓化合物をポリヌクレオチドず接觊させる工皋、該詊隓化合物ず該ポリヌクレオチドずの結合を怜出する工皋
    を含んでなる方法。
  13. 栞酞分子がである請求項に蚘茉の方法。
  14. 接觊させる工皋を现胞内たたは现胞衚面で行う請求項に蚘茉の方法。
  15. 接觊させる工皋を现胞を含たない系で行う請求項に蚘茉の方法。
  16. ポリヌクレオチドを怜出可胜な暙識に結合させる請求項に蚘茉の方法。
  17. 詊隓化合物を怜出可胜な暙識に結合させる請求項に蚘茉の方法。
  18. 哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患を蚺断する方法であっお、
    該哺乳類から採取したサンプル䞭のポリヌクレオチドの量を枬定するこず
    健康なおよびたたは疟患を有する哺乳類におけるポリヌクレオチドの量を枬定するこず
    を含んでなる方法。
  19. ポリペプチドに結合する治療剀を含有する、哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮のための医薬組成物。
  20. ポリペプチドの掻性を調節する治療剀を含有する、哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮のための医薬組成物。
  21. ポリペプチドの掻性を調節する治療剀を含有する、哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮のための医薬組成物であっお、該治療剀が、
    小分子、
    分子、
    アンチセンスオリゎヌクレオチド、
    ポリペプチド、
    抗䜓たたは
    リゟチヌム
    である医薬組成物。
  22. ポリヌクレオチドを含有する、哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物。
  23. ポリペプチドを含有する、哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物。
  24. 哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患を凊眮するための医薬組成物の補造のためのの調節物質の䜿甚。
  25. 哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の凊眮に有甚な医薬組成物の補造方法であっお、
    の調節物質を同定する工皋、
    該調節物質が、哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患の症状を改善するかどうかを決定する工皋および
    該調節物質を蚱容し埗る補薬的担䜓ず組み合わせる工皋
    を含んでなる方法。
  26. 哺乳類における血液疟患、心疟患、末梢神経および䞭枢神経系の障害、炎症性疟患、癌疟患、および肝臓の障害からなる疟患の矀に含たれる疟患を有する哺乳類における掻性の調節のための、の調節物質の䜿甚。
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