PT591697E - Clonagem e caracterizacao do receptor da hormona de libertacao da hormona do crescimento - Google Patents

Clonagem e caracterizacao do receptor da hormona de libertacao da hormona do crescimento Download PDF

Info

Publication number
PT591697E
PT591697E PT93114519T PT93114519T PT591697E PT 591697 E PT591697 E PT 591697E PT 93114519 T PT93114519 T PT 93114519T PT 93114519 T PT93114519 T PT 93114519T PT 591697 E PT591697 E PT 591697E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
ghrh
receptor
binding
quot
seq
Prior art date
Application number
PT93114519T
Other languages
English (en)
Inventor
John Ronald Zysk
Bruce David Gaylinn
Jeffrey Keith Harrison
Michael Oliver Thorner
Kevin R Lynch
Original Assignee
American Cyanamid Co
Univ Virginia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/946,232 external-priority patent/US5591641A/en
Priority claimed from US07/947,672 external-priority patent/US5612470A/en
Application filed by American Cyanamid Co, Univ Virginia filed Critical American Cyanamid Co
Publication of PT591697E publication Critical patent/PT591697E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pathology (AREA)

Description

DESCRIÇÃO "Clonagem e caracterização do receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à clonagem de um gene que codifica para um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento ou seus fragmentos biologicamente activos, a uma linha de células vivas possuindo ADN recombinante que codifica para um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento ou seus fragmentos biologicamente activos, e a métodos para a produção de receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento e seus fragmentos biologicamente activos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A hormona de libertação da hormona do crescimento (GHRH) é segregada pelo hipotálamo, e estimula a libertação de hormona do crescimento (GH) a partir da pituitária anterior. A GHRH é um membro de uma família de péptidos homólogos que inclui o glucagon, a secretina, VIP (péptido intestinal vasoactivo), PHI (péptido de histidina e isoleucina), PACAP (péptido activador da adenilato-ciclase pituitária), GIP (péptido inibitório gástrico), e helodermina. A GHRH tem sido o objecto de estudos consideráveis, mas pouco se conhece acerca do receptor de GHRH, GHRH-R, ao qual a GHRH se liga na pituitária anterior para induzir a libertação de GH. A produção em larga escala do receptor de GHRH clonado permitiria a pesquisa de grandes números de análogos de GHRH, e facilitaria o desenvolvimento de agonistas e antagonistas melhorados na terapia clínica de desordens do crescimento. Mais especificamente, a pesquisa de grandes números de análogos e xenobióticos quanto a actividade de GHRH poderia conduzir ao desenvolvimento de agonistas melhorados para utilização em terapia clínica de crianças deficientes em hormona do crescimento, e em terapia clínica de adultos para melhorar a nutrição e para alterar a composição corporal (músculo vs. gordura). Esta pesquisa, possivelmente assistida por modelação em computador baseada na estrutura do receptor, poderia também conduzir a agonistas de GHRH não peptídicos oralmente activos que seriam especialmente úteis na prática médica e veterinária, por exemplo, para desenvolver maior
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ rendimento na produção de leite e maior rendimento na produção de gado mais magro. A exploração comercial de drogas que interactuam com o GHRH-R requererá uma fonte de uma forma purificada de GHRH-R e ensaios de ligação adequados. O isolamento e a clonagem do receptor de GHRH e a sua expressão in vitro conduzirá também a: (1) Estudos de hibridação in situ para mapear a distribuição de receptores de GHRH em todo o corpo e para examinar o seu potencial papel fisiológico fora da pituitária; isto pode revelar potenciais papéis pata a GHRH no cérebro, nas gónadas, no pâncreas, na placenta, e no intestino, onde se pensa que o péptido está concentrado. (2) Estudos da estrutura do receptor envolvendo receptores mutados ou quiméricos para explorar relações de estrutura/função e ínteracções com segundos mensageiros na procura de moléculas de agonistas/antagonistas especificamente talhados. (3) Um entendimento da relação evolutiva dos GHRH-R com outros receptores ligados a proteína G, especialmente os da família glucagon/secretina/VIP. (4) Clonagem de outros membros desta sub-família que se espera terem semelhança de sequências.
Existem várias vias alternativas no sentido da obtenção de clones de receptores funcionais, tais como: A. Purificação da proteína receptora para obter uma sequência parcial da proteína; esta sequência parcial da proteína pode então ser utilizada para preparar sondas para a pesquisa de ADN apropriado para a sequência nucleotídica correspondente. B. Pesquisa de ADN quanto a sequências semelhantes a receptores conhecidos que se pense estarem relacionados com o receptor de GHRH. C. Pesquisa de ADN que, quando expresso na forma de proteína, origine um receptor de GHRH, que seria detectado por ligação de GHRH, actividade biológica, ou por um anticorpo para o receptor de GHRH. Note-se que qualquer método de clonagem conceptível requer ensaios de ligação bem como ensaios funcionais com GHRH e péptidos relacionados de modo a identificar o receptor de GHRH e a caracterizar clones expressos.
Em EP-A-0576988 descreve-se o isolamento e a caracterização do receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
Infelizmente, a purificação de receptores da pituitária é muito difícil devido à escassez de tecido, bem como aos problemas envolvidos na solubilização dos receptores na forma activa, e no desenvolvimento de um método de purificação eficiente. Mesmo que a proteína receptora possa ser isolada, a concentração do receptor no tecido pituitário é tão baixa que é excepcionalmente difícil gerar uma quantidade suficientemente grande de receptor para realizar uma sequenciação parcial da proteína suficiente para gerar sondas de ADN para o gene que codifica para o receptor GHRH-R.
Adicionalmente, uma vez que se acredita que o receptor GHRH-R é glicosilado, pode não ser possível para as bactérias expressar o receptor ou seus fragmentos, biologicamente activos.
Existe assim uma necessidade de ensaios de ligação a GHRH e de composições para utilização nos mesmos, que ajudem a caracterizar e isolar o receptor de GHRH. Em particular, existe uma necessidade de métodos que possam caracterizar o receptor de GHRH pituitário em termos de tamanho, glicosilação, solubilidade e estabilidade do complexo receptor (GHRH-R) -ligando (GHRH ou análogo de GHRH), de modo a poderem ser desenvolvidos métodos para purificar a proteína receptora e identificar clones dos receptores. Existe também uma necessidade de GHRH-R purificados ou parcialmente purificados e métodos para a obtenção dos mesmos. Por GHRH-R parcialmente purificado, entenda-se que se forma um isolado de GHRH-R com um isolado de GHRH-R a partir da maior parte da matriz orgânica das células da pituitária anterior. O isolado de GHRH-R tem uma pureza suficiente para permitir a determinação da sequência do GHRH-R, entendendo-se com isto que pode ser necessária a purificação adicional para remover quaisquer compostos remanescentes que poderiam interferir com a sequenciação, tais como proteínas G. Apesar disto, o isolado de GHRH-R da presente invenção, produzido utilizando o método de extracção e isolamento da presente invenção, contém GHRH-R, preferivelmente numa concentração superior àquela a que o GHRH-R está naturalmente presente na pituitária anterior, e o isolado de GHRH-R pode ser adicionalmente purificado, se necessário, utilizando SDS-PAGE para remover quaisquer compostos que interfeririam com a sequenciação do GHRH-R. Assim, a presente invenção também inclui a produção de GHRH-R de pureza suficiente para conduzir a sequenciação, ou para utilização em bioensaios de actividade de ligação de GHRH-R.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 4
Existe ainda uma necessidade de um método para a clonagem de um gene que codifique para o GHRH-R ou seus fragmentos biologicamente activos, e de uma sequência ou sequências de ácido nucleico isoladas, purificadas, que codifiquem um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento e seus fragmentos biologicamente activos. Existe também uma necessidade de um vector, uma célula hospedeira, ou organismos hospedeiros compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ou polipéptidos com a actividade de GHRH-R.
Historicamente, tem sido difícil que o GHRH-R funcione uma vez que a GHRH tem uma ligação não específica muito elevada (tornando difícil determinar se GHRH ou análogos de GHRH se ligam ou não especificamente ao GHRH-R), e o GHRH-R tem uma abundância extremamente baixa. A ligação não específica de análogos de GHRH a utensílios de vidro e de plástico tem sido um dos principais problemas nos trabalhos anteriores, limitando a precisão e a reprodutibilidade dos estudos de ligação ao receptor. Devido à natureza "pegajosa" do péptido GHRH carregado negativamente, a utilização de um ensaio de ligação do tipo filtração simples tem sido impossível. As contagens não específicas são tão elevadas que impedem a detecção da ligação específica. Em adição, o agente bloqueador usualmente utilizado, polietilenimina, que é utilizado para bloquear a ligação não específica de proteínas a filtros de fibra de vidro, é carregado positivamente, e ligará análogos de GHRH (carregados negativamente) de modo não específico. Adicionalmente, não há disponível uma preparação de receptor solúvel com elevada afinidade de ligação, que aumentaria vastamente os esforços para purificar o GHRH-R.
Estudos anteriores caracterizaram o receptor de GHRH em relação à sua afinidade para sondas, tais como GHRH e péptidos relacionados, e ligação a proteína G. Foram também feitas tentativas para utilizar reticulantes químicos não específicos para marcar o receptor de GHRH. Veja-se, por exemplo, Zysk, et ai, "Cross-Linking of a Growth Hormone Releasing Factor-Binding Protein in Anterior Pituitary Cells," J. Biol. Chem,. 261:1678 (1986), e Velicelebi, et ai, "Covalent Cross-Linking of Growth Hormone-Releasing Factor to Pituitary Receptors," Endocrinoloqy. 118:1278 (1986). Os resultados destes dois estudos sugerem, respectivamente, a presença de um receptor de GHRH de 26 kDa e um de 70 kDa, na pituitária anterior. A discrepância entre o peso molecular encontrado neste dois estudos enfatiza as dificuldades envolvidas no
86 046
EP 0 591 697/PT 5 isolamento e caracterização do GHRH-R, e a necessidade de métodos e composições melhorados úteis para o isolamento e caracterização do GHRH-R.
Crê-se que a ligação de GHRH à pituitária anterior de rato é influenciada por GTP, que faz com que o receptor de GHRH reduza a sua afinidade para com a GHRH (diz-se que GTP desacopla o complexo de proteína G e receptor de GHRH). Crê-se que o estado de elevada afinidade de GHRH-R ligado a GHRH é estabilizado por interacções com uma proteína reguladora do nucleótido guanina para formar um complexo ternário de hormona-receptor-proteína G. Colocou-se a hipótese de que o GTP destabiliza as interacções proteína G-receptor, resultando na dissociação do complexo de GHRH/GHRH-R/proteína G e na inversão do receptor independente para um estado de baixa afinidade, enquanto a proteína G libertada continua a activar o seu respectivo sistema de segundo mensageiro. Veja-se Struthers, et al., "Nucleotide Regulation of Growth Hormone-Releasing Factor Binding to Rat Pituitary Receptors," Endocrinology, 124:24-29 (1989).
Verificou-se que, em tecidos de pituitária anterior de ovino e de bovino, a GHRH e seus análogos são deslocados por concentrações 500 a 1 000 vezes mais baixas de um análogo de GHRH, a GHRHa (cuja preparação é descrita mais tarde) do que VIP ou PACAP. Esta verificação é complementar às propriedades de ligação encontradas no pâncreas humano (uma fonte de receptores de secretina e VIP) onde a capacidade para estimular adenilato-ciclase na presença de GTP apresenta uma ordem de potências de secretina > helodermina > PHI > VIP > GHRH(1-27)NH2. De modo semelhante, utilizando 125l-secretina, os Kd obtidos foram, para secretina 0,8 nM, helodermina 200 nM, PHI 250 nM. VIP e GHRH(1-29)-NH2 induzem apenas 20% de inibição a 10 μΜ.
Em doses suprafisiológicas, sabe-se que a GHRH actua em receptores de VIP, e em oposição, o VIP é um fraco agonista de GHRH.
Outros artigos que proporcionam informação sobre antecedentes relativamente ao isolamento e caracterização de receptores de hormonas incluem: Christopher, etal., "The VIP/PHI/secretin-helodermin/ helospectin/GRH Family: Structure-Function Relationship Of The Natural Peptides, Their Precursors And Synthetic Analogs As Tested in vitro On Receptors And Adenylate Cyclase In A Panei Of Tissue Membranes," em Peptide Hormones As
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
Prohormones: Processing, Bioloqical Activitv. Pharmacoloqy. Ed. Jean Martinez, Pub. Ellis Horwood Lim., Chichester, Inglaterra, 1989, Chichester, Inglaterra. Laburthe, et ai, "Molecular Analysis of Vasoactive Intestinal Peptide Receptors: A Comparison With Receptors for VIP Related Peptides," Ann NY Acad. Sei.. 527:296-313 (1988). Frohm, et a!., "Growth Hormone-Releasing Hormone," Endocr Rev., 7:223-253 (1986). Seifert, et ai, "Growth Hormone-Releasing Factor Binding Sites In Rat Anterior Pituitary Membrane Homogenates: Modulation By Glucocorticoids," Endocrinolqy. 117:424-426 (1985). Bilezikjian, et ai, "Desensitization To Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) Is Associated With Down-Regulation of GRF-Binding Sites," Endocrinoloqy. 118:2045-2052 (1986). Ishihara, et ai, "Functional Expression and Tissue Distribution of a Novel Receptor for Vasoactive Intestinal Polypeptide," Neuron. 8:811-819 (1992). Ishihara, et ai, "Molecular Cloning e Expression of a cDNA Encoding the secretin Receptor," EMBO J, 10:1635-1641 (1991). Lin, et ai, "Expression Cloning of an Adenylate Cyclase-Coupled Calcitonin Receptor," Science. 254:1022-1024 (1991). Juppner, et ai, "A G Protein-Linked Receptor For Parathyroid Hormone e Parathyroid Hormone-Related Peptide," Science, 254:1024-1026 (1991). Frohman, et ai, "Tissue Distribution and Molecular Heterogeneity of Human Growth Hormone-Releasing Factor in The Transgenic mouse," Endocrinoloqy, 127:2149-2156 (1990). Paul et ai, "Characterization of Receptors for Vasoactive Intestinal Peptide Solubilized From the Lung," .T Biol. Chem., 262:158-162 (1987). Guijarro et ai, "Solubilization of Active and Stable Receptors for Vasoactive Intestinal Peptide from Rat Liver," Requlatorv Peptides. 25:37-50 (1989). Cronin et ai, "Biological Activity of a Growth Hormone Releasing Factor Secreted By a Human Tumor," Am. J. Physiol., 244 (Endocrinol Metab) E346-E353 (1983). Leong et ai, "Enumeration of Lactotropes and Somatotropes in Cultured Male and Female Pituitary Cells: Evidence in Favor of a Mammosomatotrope Subpopulation," Endocrinoloqy. 116:1371-1378 (1985). Munson, et ai, "Ligand: a Versatile Computerized Approach For Characterization of Ligand-Binding Systems," Anal. Biochem.. 107:220-239 (1980). Wessel, et ai, "A Method for the Quantitative Recovery of Protein in Dilute Solution in the Presence of Detergents e Lipids," Anal. Biochem., 138:141-143 (1984). Bagnato et ai, "Gonadotropin-lnduced
Expression of Receptors for Growth Hormone Releasing Factor in Cultured Granulosa Cells*," Endocrinoloqy· 128, 2889-2894 (1991) (composições estudadas por Bagnato et ai apresentam propriedades de ligação a GHRH que são diferentes das propriedades de ligação de tecidos pituitários). Todos os
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 7 artigos e outros documentos aqui mencionados são incorporados por referência como se reproduzidos na sua totalidade.
Embora os estudos anteriores tenha ajudado a desenvolver um entendimento preliminar do comportamento do GHRH-R, permanece uma necessidade de um ensaio sensível e reprodutível para o GHRH-R, que será capaz de caracterizar adicionalmente o GHRH-R conduzindo à purificação e clonagem do GHRH-R. Um tal ensaio tem que ultrapassar os problemas da ligação não específica de GHRH e análogos de GHRH, e da baixa abundância do receptor de GHRH. A iodação e purificação de análogos de GHRH com uma resultante elevada actividade específica permite o melhoramento de ligação específica a membranas de pituitária anterior em bruto.
Apesar da multiplicidade de caminhos que podem ser tentados para clonagem e sequenciação do receptor GHRH-R, têm que ser ultrapassados obstáculos substanciais independentemente da via seguida. Um exemplo destes problemas é observado em esforços para clonar e expressar o receptor de VIP; as reivindicações iniciais de clonagem e expressão do receptor de VIP foram repudiadas em publicações posteriores, e isto serviu para desencaminhar os esforços para clonar e expressar outros receptores. Veja-se Sreedharan et a!., "Cloning and Expression of the Human Vasoactive Intestinal Peptide Receptor," Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88: 4986-4990, (1990); Cook et ai, "Characterization of the RDC1 Gene Which Encodes the Canine Homolog of a Proposed Human VIP Receptor," FEBS Lett.. 300: 149-152, (1991). Em relação à clonagem e expressão do GHRH-R, a escassa quantidade de GHRH-R presente em organismos mamíferos torna difícil reunir uma quantidade suficiente de receptor purificado para determinar o suficiente da sequência de resíduos de aminoácido para construir sondas oligonucleotídicas específicas para o GHRH-R, que podem então ser utilizadas na pesquisa de uma biblioteca de ADNc. Adicionalmente, é necessário encontrar uma biblioteca de ADNc que contenha suficientes genes de GHRH-R para se obter um sinal suficientemente forte para que seja distinguível de genes homólogos que possam também hibridar com a sonda. Finalmente, a expressão e clonagem, que envolvem a pesquisa repetida de células transformadas quanto à expressão de um receptor, não é prática para a clonagem de GHRH-R, uma vez que as técnicas existentes não são suficientemente sensíveis para serem utilizadas em pesquisas iniciais de GHRH-R; isto deve-se à ligação não específica e à muito pequena quantidade de
86 046
EP 0 591 697/PT 8 receptor. Assim, permanece uma necessidade de um método para a clonagem e expressão do gene que codifica para GHRH-R e seus fragmentos biologicamente activos, bem como uma necessidade de uma linha de células vivas possuindo ADN recombinante que codifica para GHRH-R ou seus fragmentos biologicamente activos. Existe ainda uma necessidade de ensaios de pesquisa que utilizem GHRH-R ou seus fragmentos biologicamente activos para testar compostos que possam interactuar com o GHRH-R ou seus fragmentos. Uma vez que o GRF tem que ser administrado através de injecção, estes ensaios são críticos na pesquisa de compostos que possam ser administrados oralmente e que interactuem com o GHRH-R ou seus fragmentos. Estes ensaios são também críticos para encontrar outros compostos que interactuem como agonistas ou antagonistas de GHRH-R ou seus fragmentos. É portanto um objectivo principal da presente invenção desenvolver um ensaio, sensível e reprodutível, à ligação de GHRH ao receptor. É um outro objectivo da presente invenção desenvolver reagentes para marcar, especificamente e sem ambiguidade, o receptor de GHRH. É ainda outro objectivo da presente invenção desenvolver um esquema de purificação do receptor de GHRH e para obter um isolado de GHRH-R com pureza suficiente, ou capaz de ser prontamente purificado até uma pureza que permita peio menos a sequenciação parcial do GHRH-R. É um objectivo adicional da presente invenção produzir GHRH-R purificado. É ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para a clonagem de um gene que codifica para GHRH-R ou seus fragmentos biologicamente activos. É um outro objectivo da presente invenção proporcionar uma sequência de ácido nucleico isolada, purificada, que codifica um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento ou seus fragmentos biologicamente activos. É ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor da
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ hormona de libertação da hormona do crescimento, ou seus fragmentos biologicamente activos. E ainda um objectivo adicional da presente invenção proporcionar uma célula ou linha de células hospedeiras vivas compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento ou um seu fragmento biologicamente activo. É ainda um objectivo da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica compreendendo GHRH-R ou seus fragmentos biologicamente activos, e um método terapêutico para administração de uma quantidade eficaz dos mesmos a um organismo, para se ligar a GHRH endógena, ou para eliciar anticorpos que se ligam ao receptor e assim induzem ou bloqueiam actividade.
Adicionalmente, é um outro objectivo da presente invenção proporcionar GHRH-R recombinante suficiente para permitir uma pesquisa em larga escala de péptidos e xenobióticos quanto à capacidade de ligação ao receptor GHRH-R.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Este e outros objectivos da presente invenção são conseguidos através de um ensaio de ligação ao GHRH melhorado que conduz à caracterização e ao isolamento de um extracto de GHRH-R bruto (isolado). A presente invenção proporciona a clonagem do gene que codifica para um GHRH-R e seus fragmentos biologicamente activos, e proporciona as sequências de aminoácidos de um GHRH-R e seus fragmentos biologicamente activos, bem como de sondas ou iniciadores oligonucleotídicos que podem hibridar com um gene que codifica GHRH-R ou seus fragmentos. A presente invenção também proporciona organismos recombinantes e sua progénie compreendendo um gene que codifica para um GHRH-R e seus fragmentos biologicamente activos, não expressando o referido organismo recombinante ("transformado") o GHRH-R acima do nível de ruído de fundo ou não contendo o referido gene que codifica o GHRH-R antes da transformação. O GHRH-R em membranas de pituitária ou em organismos transformados ou transfectados é caracterizado através da utilização de sondas radio-iodadas formadas a partir de análogos de GHRH. Os análogos de GHRH (GRFa, GHRHa, ou GHRHb) e outros análogos são iodados numa concretização preferida utilizando contas de iodo em fase sólida, e o material mono-iodado purificado por HPLC de fase inversa de modo a ficar 10 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ essencialmente livre de transportador. A ligação não específica de análogos de GHRH a material de vidro e de plástico durante a entrega e a diluição foi substancialmente eliminada utilizando solventes orgânicos. Numa concretização preferida, utiliza-se acetonitrilo a cinquenta porcento para a diluição e entrega de análogos de GHRH. A ligação específica de GHRH e GHRHa a peletes de membrana pituitária anterior em bruto é aumentada por adição de um antibiótico formador de poros. Numa concretização preferida, combina-se o antibiótico alameticina (a aproximadamente 0,05 mg/ml) com peletes de membrana de pituitária anterior homogeneizada para aumentar a ligação específica de GHRH.
Prepararam-se análogos de GHRH contendo grupos de reticulação sensíveis aos UV (fotossondas ou sondas de fotoafinidade) que demonstram alta afinidade específica, sensíveis a GTP, que reticulam com o receptor de GHRH. As sondas diferem tanto na localização do grupo fotossensitivo como no comprimento do braço espaçador. As fotossondas preferidas são formadas por acoplamento do análogo de GHRH [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 a N-5-azido-2-nitrobenzoiloxissuccinimida (ANB-NOS), ou a sulfossuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)-hexanoato (sulfo-SANPAH ou SANPAH), seguido por iodação e purificação. Preferivelmente, o acoplamento ao reagente ANB-NOS é direccionado para as lisinas nas posições 12 ou 21; o composto é subsequentemente iodado na tirosina na posição 10, e o produto é purificado por HPLC de fase inversa para formar uma fotossonda que será referida como 125l-GHRHa-ANB-NOS. Numa concretização alternativa, a fotossonda 125l-GHRHa-SANPAH é formada num sistema de solventes de dimetilformamida por acoplamento de SANPAH direccionado para a histidina do terminal N de GHRHa, purificação por HPLC de fase inversa, iodação da tirosina na posição 10 da GHRHa, e repurificação por HPLC.
Verificou-se surpreendentemente que, por utilização das supramencionadas sondas de fotoafinidade, é possível produzir um complexo solúvel de GHRHa ligada a GHRH-R; o complexo covalentemente reticulado é prontamente solúvel numa solução de detergente moderado, preferivelmente contendo um composto detergente zwiteriónico capaz de solubilizar proteínas, tal como sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamónio]-1 -propano (referido como CHAPS, disponível de Pierce ou de ICN Biomedicals, de Irvine, Califórnia), e que a maior parte dos contaminantes reticulados, não especificamente, não são solúveis na solução de detergente moderado. Verificou-se então que
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 11 complexos não reticulados também eram solubilizados nestas condições. A foto-reticulação foi realizada após a solubilização e provou que o receptor (GHRH-R) e o ligando (GHRH-sonda) tinham formado um complexo solúvel estável. Numa concretização preferida, isto permite a eliminação de até cerca de 90% da GHRH não especificamente ligada por extracção com uma solução contendo CHAPS, e a remoção de péptido livre com carvão/dextrano. Isto resulta num ensaio de ligação da GHRH grandemente melhorado.
Numa concretização adicional, obtém-se um isolado de GHRH parcialmente purificado através de cromatografia de afinidade por fixação de uma função a GHRH ou um análogo de GHRH, que tenha afinidade para um composto imobilizado sobre um suporte. Numa concretização preferida, ligam-se derivados biotinilados de GHRHa a GHRH-R, solubilizam-se, e depois imobilizam-se numa coluna de estreptavidina; verificou-se que o complexo GHRH/GHRH-R ligado se dissocia a pH 5,0 num tampão, formando assim um isolado de GHRH-R parcialmente purificado, capaz de ser utilizado para determinar a sequência de resíduos de aminoácido do GHRH-R, que numa concretização preferida ocorre após purificação adicional do isolado de GHRH-R utilizando SDS-PAGE para remover compostos, tais como proteínas G, que interfeririam na sequenciação, e formando assim GHRH-R purificado.
Em ainda outra concretização, a presente invenção proporciona a clonagem de um gene que codifica para um GHRH-R e seus fragmentos biologicamente activos.
Preferivelmente, um gene que codifica para uma proteína ou polipéptido com actividade de GHRH-R é isolado e ligado a um vector de ADN para formar um ADN recombinante; o vector de ADN incluindo o referido gene é capaz de replicar numa célula procariótica ou eucariótica. O gene que codifica para uma proteína ou polipéptido com actividade de GHRH-R está localizado a jusante de um promotor no vector, e replica como parte do vector. O ADN recombinante é então incorporado numa célula hospedeira, que não continha anteriormente o referido gene, para formar uma linha celular transformada ou transfectada capaz de expressar GHRH-R ou seus fragmentos biologicamente activos.
Numa concretização preferida, pesquisa-se uma biblioteca de ADNc, preparada a partir de um tumor pituitário que segrega hormona do crescimento 12 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ de um acromegálico humano inserido no vector λςΐ10, em condições de baixo rigor, com uma sonda baseada no ADNc de receptor de secretina de rato, RS-R. Verificou-se surpreendentemente que sondas baseadas no ADNc de receptor de secretina de rato hibridarão com pelo menos uma porção da sequência nucleotídica que codifica para um receptor GHRH-R, ainda que clones representando o receptor de secretina humano não sejam encontrados em quantidade significativa na biblioteca de tumor de pituitária acromegálica humana, HAP. Esta verificação surpreendente (e.g., maiores quantidades de ADN que codifica para proteínas ou polipéptidos com actividade de GHRH-R do que as encontradas em tecido de pituitária normal, sem actividade de competição substancial, a partir de secretina ou outros receptores relacionados) permitiu a clonagem bem sucedida de um gene que codifica para uma proteína ou polipéptidos com actividade de GHRH-R. Teve grande significado a surpreendente verificação de que o cerebelo de rato continha suficiente receptor de secretina para ser amplificado utilizando PCR para produzir a sonda RS-R aqui utilizada, apesar de uma publicação que ensina que o receptor de secretina não foi detectável no cerebelo de rato. Veja-se Ishihara et a/., EMBO. J.. 10:1635-1641 (1991).
Preferivelmente, a purificação por formação de placas de fagos que hibridam com a sonda RS-R é seguida por excisão do gene clonado a partir do 7gt10, e por inserção no plasmídeo pGEM7Zf( +) que é então utilizado para transformar E. coli. O gene inserido é então sequenciado pelo método da terminação da cadeia com didesoxi após a replicação do plasmídeo (amplificação) em E. coli e purificação. Prepara-se então uma sonda oligonucleotídica marcada a partir de sequência(s) parcial(ais) que se assemelham ao ADNc do receptor, e utiliza-se para pesquisa em condições de alto rigor, de uma segunda biblioteca de ADNc de tumor de pituitária acromegálica, HAP, no vector XBluemid, em que as inserções estão contidas no plasmídeo pBluescript (que é capaz de transportar, para fins de clonagem, inserções tão grandes quanto o tamanho previsto teoricamente do gene completo que codifica para GHRH-R). Isto permitiu a clonagem e a sequenciação do GHRH-R completo. Numa concretização preferida, o gene que codifica para GHRH-R é inserido num vector de expressão eucariótico, e o GHRH-R é expresso numa linha de células de mamífero. 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 13
Assim, a presente invenção refere-se a uma proteína substancialmente pura e seus fragmentos biologicamente activos possuindo actividade de receptor de hormona de libertação da hormona do crescimento (GHRH). O receptor é purificado pelo menos 10 000 vezes em relação ao receptor ligado à membrana. Por "fragmentos biologicamente activos" entendam-se porções naturais ou sintéticas do receptor de comprimento completo que são capazes de ligar ligandos específicos do receptor, ou que são capazes de eliciar, num animal hospedeiro, anti-soros específicos de GHRH-R ou uma resposta a um segundo mensageiro enquanto ainda conjugados a um transportador ou numa forma não conjugada. Numa concretização preferida, o receptor é derivado de uma fonte humana, mas receptores homólogos são também derivados de espécies de vertebrados, tais como, mas se lhes limitando, piscícolas, avícolas, ovinos, caprinos, bovinos, porcinos, murinos, equinos, caninos, e felinos. A invenção é também dirigida a composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz do receptor puro ou seus fragmentos, ou proteínas e polipéptidos com actividade de GHRH-R em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável, e proporciona um método para a utilização terapêutica de tais composições farmacêuticas. O receptor e os fragmentos do receptor (proteínas e polipéptidos com actividade de ligação ao ligando de GHRH-R ou imunológica) são úteis em métodos de pesquisa para a identificação de análogos de GHRH, bem como na identificação de compostos que podem actuar como antagonistas de GHRH no local do receptor. São também úteis para criar anticorpos específicos de GHRH-R; estes anticorpos podem, bloqueando o local do receptor, evitar eficazmente a ligação de GHRH e portanto bloquear o crescimento. Podem ser utilizados outros anticorpos para activar o receptor GHRH-R (e.g., anticorpos estimulantes da tiróide, tais como os que causam a Doença de Graves). Podem-se utilizar composições farmacêuticas contendo o receptor ou fragmentos de segmentos para tratar desordens que resultam de, ou estão associadas a um excesso de GHRH em circulação. Tais composições podem ser empregues para administração in vivo para ligar o GHRH em circulação, evitando assim a sua ligação ao receptor endógeno.
Numa concretização preferida, a invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica um receptor de GHRH, vectores recombinantes incluindo a referida sequência e células hospedeiras contendo a
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 14 referida sequência úteis na produção de um receptor de GHRH ou seus fragmentos biologicamente activos (incluindo proteínas e polipéptidos com actividade de GHRH-R).
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico de barras que demonstra a ligação de 125l-GHRHa a peletes de membrana de pituitária de ovino em bruto. As barras indicam a fracção das contagens totais ligadas a peletes após incubação com sonda sozinha ou na presença de GHRHa 10nM ou GTPyS 50 μΜ. São mostrados quatro casos diferentes (conjuntos de barras). O primeiro caso (membrana) mostra a ligação a uma preparação de peletes de membrana em bruto. O segundo conjunto (congelada) mostra que existe pouca ligação específica na mesma preparação de membrana após esta ter sido congelada e descongelada. O terceiro conjunto (DTT) mostra a ligação a esta mesma preparação (não congelada), mas na presença de DTT 1 mM. O quarto conjunto (ala-lavagem) mostra um protocolo melhorado da presente invenção que inclui o antibiótico formador de poros alameticina e um passo de lavagem adicional. As barras de erro indicam o erro padrão da média, eN = 3 ou 4 réplicas por ponto. A Figura 2 é um gráfico utilizado para análise de ligação de saturação. Os pontos são dados de ensaios de ligação realizados na presença de níveis crescentes de GHRHa não marcada. As barras de erro indicam o erro padrão da média. O gráfico apenso mostra uma representação dos mesmos dados e da curva no sistema de coordenadas Scatchard (base de erro não mostrada no gráfico apenso). A Figura 3 é uma radiografia de um gel de SDS que demonstra reticulação de fotoafinidade do receptor. A reticulação a membranas de pituitária de ovino em bruto é demonstrada com duas fotossondas diferentes (SANPAH e ANS-NOS), cada uma extraída por dois métodos diferentes (SDS e CHAPS). O efeito de enzimas de desglicosilação is também mostrado em cada caso. Os extractos de CHAPS mostram uma ligação não específica grandemente reduzida. Ambas as fotossondas marcam uma banda de 55 kDa que se desvia para 45 kDa após desglicosilação.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ A Figura 4 é uma radiografia de um gel de SDS gel como na Figura 3, que mostra reticulação de ANB-NOS extraídos com CHAPS que demonstra competição por GHRH 10 nM e mostra também desglicosilação. A Figura 5 é uma radiografia de um gel de SDS de reticulação de fotoafinidade como na Figura 4, que inclui os efeitos de GTPyS e também desglicosilação parcial com neuraminidase. A Figura 6 demonstra a solubilidade de complexos GHRHa-GHRH-R que foram preparados deixando que GHRHa radio-iodada se ligasse a membranas de pituitária de ovino em bruto, quer na presença quer na ausência de GHRHa 10 nM não marcada. A Figura 7 demonstra reticulação de fotoafinidade de complexos solúveis produzidos seguindo a experiência da Figura 6 com fotossonda ANB-NOS-GHRHa, e a fracção solúvel em detergente foi reticulada com UV após a extracção. As duas pistas mais à esquerda foram extraídas com CHAPS e as duas pistas à direita foram extraídas com desoxicolato. A Figura 8 demonstra a estabilidade de complexos GHRHa-GHRH-R tratados com dextrano e carvão, solubilizados por CHAPS que foram expostos a GTPyS 50 μΜ (± 5 mM de Mg'"), DTT 10 nM, ou Triton X-100 a 1% durante 30 minutos e depois novamente tratados com dextrano e carvão para quantificar a quantidade de dissociação. A Figura 9 demonstra a dissociação de complexos GHRH-GHRH-R solúveis a pH baixo sendo a estabilidade de complexos específicos solúveis a vários pH avaliada como na Figura 8. Dados adicionais indicam que se obtém uma dissociação praticamente completa a pH 5 ou inferior. A Figura 10 demonstra a análise por SDS-PAGE do eluado, contendo GHRH-R purificado, obtido por cromatografia de afinidade do complexo do receptor biotinilado GHRHb-GHRH-R numa coluna de agarose com estreptavidina. A Figura 11 demonstra o comportamento de desglicosilação de receptor de GHRH purificado como se pode observar pela mobilidade sobre um gel de b
86 046
EP 0 591 697/PT 16 SDS. Correram-se sete amostras que correspondem a sete pistas sobre o gel. (Os sinais de adição (+) indicam a presença de 125l-receptor purificado, receptor foto-reticulado, N-glicosidase, ou GRFa 10 nM). A pista mais à esquerda ilustra a banda produzida por receptor purificado iodado, enquanto que a pista adjacente mostra a banda produzida por tratamento do receptor purificado iodado com N-glicosidase, resultando um peso molecular de aproximadamente 42 kDa. A terceira pista a partir da esquerda ilustra que GRFa 10 nM competiu com um análogo de GRF iodado capaz de reticulação com o receptor, de modo que não se observa nenhuma banda. As quarta e quinta pistas ilustram o efeito de N-glicosidase sobre receptor purificado iodado e receptor foto-reticulado iodado, respectivamente. Um análogo de GHRH iodado foto-reticulado a GHRH-R e um receptor purificado iodado são corridos nas pistas 6 e 7, respectivamente. Note-se que o receptor foto-reticulado tem maior peso molecular, e que as amostras tratadas com N-glicosidase têm menores pesos moleculares. A Figura 12 é um diagrama de fluxos de um procedimento seguido para a preparação de um plasmídeo útil na expressão de um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento numa linha de células de mamífero. A Figura 1 3 é uma representação do plasmídeo pBluescript, ilustrando a inserção de HAP, vários locais de restrição, e outras características do plasmídeo. A Figura 14 é uma representação do plasmídeo CDM8 ilustrando a inserção de HAP, as localizações relativas de vários locais de restrição, e outras características do plasmídeo. A Figura 15 é um gráfico de barras que demonstra a ligação de 125l-GHRHa a células COS transfectadas com vectores contendo angiotensina AT, ou HAP. As barras indicam as contagens totais ligadas às células após incubação com 125l-GHRHa ou na presença de quantidades gradualmente crescentes de GRF não iodado. A incubação das células COS com 125l-GHRHa na presença de VIP 100 nM não teve efeito sobre as contagens ligadas de GHRHa. A Figura 16 ilustra a ligação de GHRHa iodada a membranas de células transfectadas com pCDM8 contendo o ADNc de HAP 7 ou o gene que codifica
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 17 para ο receptor de angiotensina de rato. É mostrada a ligação na presença de concentrações crescentes de péptidos competidores. Os círculos a cheio representam a ligação na presença de GHRH não iodada a membranas formadas a partir de células transfectadas com um gene (HAP 7) que codifica um GHRH-R. Os quadrados representam ligação na presença de GHRH não iodada a membranas formadas a partir de células transfectadas com um gene que codifica para receptor de angiotensina de rato. Os triângulos a cheio representam a ligação na presença de PACAP a membranas formadas a partir de células transfectadas com um gene (HAP 7) que codifica um GHRH-R, os triângulos a branco representam a ligação na presença de VIP, e os círculos a branco representam a ligação na presença de secretina. Cada ponto representa um N de 6 ± o erro padrão. A ligação não específica foi de 20-30% das contagens totais em membranas de células COS, e de 40-60% em membranas de pituitária em bruto. A Figura 17 ilustra a ligação de 125l-GHRHa em pituitária de ovino na presença de concentrações gradualmente crescentes de péptidos competidores. Os círculos a cheio representam GHRHa, os triângulos a cheio representam PACAP, e os triângulos a branco representam VIP. A Figura 18 é uma representação hidropática da sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:8; S indica o péptido de sinal putativo, e 1-7 indicam hélices de transposição transmembranar putativas. A Figura 19 é uma representação hidropática da sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 10; S indica o péptido de sinal putativo, e 1-7 indicam hélices de transposição transmembranar putativas.
DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Uma abordagem global à clonagem do receptor de GHRH envolve (1) a caracterização do receptor de GHRH, (2) a utilização do conhecimento das características do receptor de GHRH para isolar o receptor de GHRH, (3) a determinação da sequência peptídica do receptor de GHRH (ou de uma porção do receptor de GHRH), (4) a determinação da sequência de ADN que é responsável pela produção do receptor de GHRH através da utilização de sequências oligonucleotídicas degeneradas (que podem ser de receptores que se
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 18 crêem homólogos ao GHRH-R) para pesquisar uma biblioteca de ADNc, e (5) a clonagem da sequência de ADN.
CARACTERIZAÇÃO DO GHRH-R
Ensaio de ligação a GHRH.
Num aspecto, a presente invenção é dirigida a um ensaio sensível e reprodutível à ligação de GHRH ao receptor de GHRH, que demonstre ligação de alta afinidade, reversível, específica de GHRH, dependente de GTP. Devido à elevada ligação não específica do péptido GHRH carregado negativamente, a utilização de um ensaio de ligação do tipo de uma filtração mais simples tem sido impossível. Com o ensaio da presente invenção, a ligação específica (definida como as contagens de radiação gama, y, produzida por ligação de 125l-GHRHa que são eliminadas de peletes de membrana homogeneizada por GHRHa 10nM) é de 30 a 60% das contagens totais ligadas em peletes de membrana em bruto e até 90% das contagens após extracção com um detergente moderado (por exemplo CHAPS) e tratamento com carvão/dextrano. Uma concretização preferida do ensaio de ligação da presente invenção envolve muitos factores, incluindo um protocolo de iodação em fase sólida moderado, purificação por HPLC do radioligando isento de transportador, um sistema de solventes orgânicos para a entrega quantitativa de GHRHa, ensaios tanto em células plaqueadas como em placas hemolíticas inversas, para confirmar a actividade biológica da sonda, e a utilização de cerca de 0,05 mg/ml de alameticina, um antibiótico formador de poros, para aumentar a ligação específica do radioligando às peletes de membrana de pituitária anterior. A alameticina aumenta a ligação específica e diminui as contagens aprisionadas. Uma lavagem diminui as contagens recuperadas mas aumenta adicionalmente a quantidade relativa de ligação específica.
Um análogo de GHRHa preferido para estudos de ligação ao receptor é o [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 (referido como GHRHJ. O análogo de GHRH é um péptido que tem boa actividade de ligação a GHRH-R, e difere da sequência humana no comprimento, e tem dois aminoácidos, que são alterados para facilitar a sua utilização como substrato de iodação. Uma fonte preferida de GHRHa é Península Laboratories (Belmont, CA).
A preparação de análogos de GHRH iodados de actividade específica e actividade biológica óptimas é realizada iodando primeiro os análogos de GHRH
86 046
EP 0 591 697/PT 19 (incluindo fotossondas) utilizando contas de iodo em fase sólida (tais como as disponíveis de Pierce), e depois o material mono-iodado é purificado até ficar essencialmente isento de transportador, por HPLC de fase inversa, utilizando preferivelmente uma coluna Bio-Series Poly F à base de fluorocarbonetos (disponível de MacMod). A diluição e entrega quantitativas de análogos de GHRH é obtida utilizando solventes orgânicos, preferivelmente utiliza-se como transportador acetonitrilo a 50% em solução aquosa. Deste modo, evitam-se as diluições imprecisas e não reprodutíveis encontradas com veículos aquosos.
Verificou-se surpreendentemente que se obtém um aumento de aproximadamente três vezes na ligação específica, em comparação com a metodologia anterior, quando se combina um antibiótico formador de poros com peletes de membrana de pituitária anterior em bruto (Veja-se Struthers, et a/., Endocrinoloqy, 124:24 (1989). Numa concretização preferida, utiliza-se a adição de cerca de 50 pg/ml do antibiótico alameticina para obter a ligação específica óptima.
Com referência à Figura 1, apresenta-se a ligação de sonda 125l-GHRHa a peletes de membrana em bruto que tinham sido tratadas sob diferentes condições. Existem quatro conjuntos de três barras. Cada barra num conjunto indica a fracção de contagens totais ligadas após incubação com sonda iodada. Para cada conjunto de três barras, a barra da esquerda indica as contagens totais ligadas após incubação com sonda iodada sozinha, sem pré-exposição das membranas a GHRH fria ou outro composto que se saiba competir com GHRHa ou interferir com a ligação de GHRHa. A barra do centro indica a fracção das contagens totais ligadas após incubação com sonda iodada que foram adicionadas à incubação juntamente com GHRHa 10 nM não marcada (que compete para os locais de ligação específica). A diferença entre a barra mais à esquerda e a barra do centro de cada conjunto de barras indica a ligação específica de GHRH, que representa a quantidade de GHRH-R presente. A barra da direita indica a fracção das contagens totais ligadas após incubação com 125l-sonda na presença de GTPyS 50 μΜ. Como se sabe que o GTPyS causa dissociação de proteína G de alguns complexos de receptores resultando uma afinidade diminuída e ligação diminuída, a diminuição na ligação específica quando se utiliza GTPyS é consistente com a presença de complexo GHRH-R-proteína G.
J
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ A ligação específica é definida como a diferença na ligação observada com 20 pM de análogo iodado sozinho e a ligação do análogo na presença de GHRHa 10 nM não iodada. Ligação de saturação, análise de Scatchard; estudos de competição, e outros dados aqui discutidos, mostram que estes locais de alta afinidade são locais de ligação específica.
Com referência à Figura 2, estudos de ligação de saturação demonstram a ligação do análogo de GHRH [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 (GHRHa) a um único local de alta afinidade com um Kd de cerca de 160 pM. Algumas barras de erro eram demasiado pequenas para serem mostradas (N = 6 réplicas por ponto). Estes dados foram analisados com o programa de computador Ligand, que determina as constantes de ligação com base num ajustamento estatisticamente ponderado de mínimos quadrados à equação de ligação ao ligando num sistema de coordenadas não transformadas. O programa reporta-se a um único local de ligação com um Kd=150±10 pM e R=1,5±0,09 pmol/g de tecido (valor do melhor ajustamento = SEM aproximado do ajustamento). Os testes estatísticos suportam este modelo de único local de ligação. A linha a ponteado é a curva teórica gerada utilizando estas constantes na equação de ligação. A ligação específica de radioligando GHRHa é reduzida até 65% por GTPyS 50 μΜ. Os péptidos relacionados VIP e PACAP não competiram para este local de ligação a concentrações de 100 nanomolar. Esta ligação representa uma proteína G de alta afinidade ligada a GHRH-R. Sabe-se que a ligação de VIP ao receptor de VIP é sensível a agentes redutores de sulfidrilo. Esta ligação específica no ensaio da GHRH é completamente eliminada por pré-incubação com ditiotreitol 1 mM (DTT, que se sabe evitar a ligação de alta afinidade a receptores relacionados), e assim suporta adicionalmente a conclusão de que o receptor GHRH-R é o local de ligação.
SONDAS DE FOTOAFINIDADE
Prepararam-se sondas de fotoafinidade utilizando agentes de reticulação fotorreactivos; estas sondas diferem tanto na localização do grupo fotossensitivo como no comprimento do braço espaçador. As sondas são capazes de ligação a GHRH-R na ausência de radiação UV e de reticulação a GHRH-R sob a influência de radiação UV. Os exemplos preferidos não limitantes de sondas de fotoafinidade e métodos para as preparar são os seguintes:
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 21
1) 125l-GHRHa-ANB-NOS Ο análogo de GHRH de 32 aminoácidos [His\ Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 (GHRHa) foi acoplado ao reagente N-5-azido-2-nitrobenzoiIoxissuccinimida (ANB-NOS) direccionado para a lisina 12 ou 21 para formar GHRHa-ANB-NOS. O GHRHa-ANB-NOS foi iodado utilizando contas de iodo para formar o radioligando ("fotossonda" 125l-GHRHa-ANB-NOS, "GHRHa-ANB-NOS quente" ou "fotossonda quente" (as contas de iodo preferidas estão disponíveis de Pierce, Rockford, IL).
2) l-GHRHa-SANPAH
Num sistema de solventes de dimetilformamida, o análogo de GHRH [His\ Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 a N-5-azido-2-nitrobenzoiloxissuccinimida (ANB-NOS), foi acoplado a sulfossuccinimidil-6-(4’-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato (sulfo-SANPAH ou SANPAH) direccionado para a histidina do terminal N de GHRHa. O material radio-iodado foi então purificado até essencialmente isento do péptido de partida, por HPLC de fase inversa, numa coluna Bio Series Poly F à base de fluorocarbonetos (disponível de Mac-Mod Analytical, Chadds Ford, PA) utilizando um gradiente ligeiro de acetonitrilo. A ligação de fotossondas em peletes de membrana pituitária de ovino foi determinada por contagem yea reticulação induzida por UV foi examinada por autorradiografia de geles de electroforese em poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). A sonda 125l-GHRHa-ANB-NOS ligou-se com uma afinidade de cerca de uma nanomole, nM (em comparação com cerca de 160 picomoles, pM, para GHRHJ. A SDS-PAGE revelou uma banda a cerca de 55 kDa para pituitária de ovino (para a pituitária de bovino, 57 kDa), que foi completamente eliminada na presença de GHRHa 10 nM; esta banda foi reduzida em mais de 50% por GTPyS 50 μΜ, e não foi afectada por VIP 100 nM. Assim, a banda de 55 kDa deve-se a foto-reticulação do GHRH-R. A Figura 3 mostra que esta banda específica de 55 kDa é separada da maior parte do material reticulado não especificamente por extracção com CHAPS. A Figura 4 demonstra a competição com GHRHa 10 nM. A Figura 5 demonstra o efeito de GTPyS sobre a reticulação. 0 tratamento do receptor de GHRH reticulado com neuraminidase fez com que a banda de 55 kDa se desviasse para 50 kDa, o que é atribuído à remoção de grupos ácido siálico terminais carregados que diminuem a 22 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ mobilidade no gel (Figura 5). O tratamento do receptor de GHRH reticulado com uma mistura purificada, isenta de proteases, de endoglicosidase F e N-glicosidase F (disponível de Boehringer Mannheim de Indianapolis, Indiana) provocou um desvio na mobilidade no gel para formar uma banda a 45 kDa (mostrada nas Figuras 3 e 4); isto indica que o receptor de GHRH é uma glicoproteína ligada a N (comum entre receptores ligados a proteína G) e sugere o tamanho da cadeia da proteína desglicosilada. Este tamanho é consistente com a estrutura de receptores de VIP e de secretina.
Testes com lectinas imobilizadas não apresentaram ligação do receptor de GHRH reticulado a aglutinina de gérmen de trigo, ricina, aglutinina de límulo, ou concanavalina A. Isto torna o receptor invulgar e oferece uma abordagem à purificação e isolamento deste receptor de outros receptores que se ligam a estas lectinas. Após tratamento com neuraminidase e β-galactosidase, o receptor ligou-se especificamente a aglutinina de amendoim, proporcionando uma abordagem adicional à separação e purificação do receptor de GHRH.
COMPLEXO GHRH-GHRH-R SOLÚVEL E ENSAIO DE LIGAÇÃO MELHORADO A reticulação de fotoafinidade mostrou que os complexos receptor-ligando covalentemente acoplados são solúveis numa solução de detergente moderado, preferivelmente numa solução contendo CHAPS. A pré-incubação de GHRH com o receptor, utilizando as condições do ensaio de ligação a membranas supramencionado, permitiu a extracção com CHAPS e a solubilização de um complexo receptor-ligando intacto mesmo quando não reticulado. Este complexo foi detectado por contagem gama após a extracção com detergente de membranas incubadas com 125l-GHRHa (GHRHa "quente") sem reticulação. A Figura 6 mostra que a maioria das contagens específicas observadas na membrana em bruto foram extraídas com CHAPS na forma de um complexo específico associado ao receptor. Os dados da Figura 6 foram obtidos como se segue. Deixou-se que GHRHa radio-iodada se ligasse a membranas de pituitária de ovino em bruto quer na presença quer na ausência de GHRHa 10 nM não marcada. A isto seguiu-se extracção com detergente e centrifugação; trataram-se os sobrenadantes com carvão/dextrano para separar a proteína ligada da GHRHa livre, e contou-se o radio-iodo de cada fracção. A GHRHa marcada ligada na membrana em bruto pôde assim ser seguida após tratamento com detergente e caracterizada como: (1) insolúvel, (2) solúvel e não especificamente ligada, (3) especificamente ligada mas dissociada do
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ detergente, ou (4) solúvel e especificamente ligada. Como se sabe da foto-reticulação, a maioria das contagens não especificamente ligadas não eram solúveis em CHAPS. A extracção com uma mistura detergente com desoxicolato solubilizou ligeiramente mais contagens totais, mas muitas destas eram instáveis e estavam dissociadas, e predominavam as contagens não específicas. A Figura 7 mostra os resultados desta foto-reticulação para confirmar que este complexo continha o receptor. As membranas foram pré-ligadas com fotossonda (125l-ANB-NOS-GHRHa) no escuro, extraídas com CHAPS, e depois reticuladas com UV. Isto prova que a GHRH continuava ainda ligada ao receptor solubilizado. No extracto de CHAPS, a maior parte da ligação estava na banda do receptor de 55 kD enquanto que no caso do desoxicolato a maior parte das bandas eram não específicas. Isto está em boa concordância com os estudos de ligação apresentados na Figura 6 (apesar de as fotossondas terem maior ligação não específica), e demonstra que a ligação específica do análogo de GHRH nos complexos solúveis é ao receptor de 55 kDa. De forma consistente com a Figura 6, o complexo era muito mais estável em CHAPS do que em desoxicolato. Havia também algumas bandas não específicas (Uma imediatamente abaixo da banda do receptor de 55 kDa) após foto-reticulação do extracto de CHAPS. A Figura 8 demonstra que a extracção com CHAPS se eleva a um ensaio de ligação melhorado com contagens não específicas grandemente reduzidas e sensibilidade aumentada (Compare-se com a Figura 1). Esta figura também mostra que o complexo é parcialmente dissociado por GTPyS 50 μΜ, sugerindo que as proteínas G estão ainda associadas ao complexo solubilizado numa solução detergente contendo CHAPS. A Figura 1 mostra que DTT 1mM evitou a ligação específica perante a GHRH quando adicionado. A Figura 8 mostra apenas um efeito parcial de DTT 20 mM após a ocorrência de pré-ligação. Este complexo foi também bastante estável em NaCI até 1M durante a noite a 4°C, mas foi completamente dissociado por Triton X-100 a 1% (tensioactivo). Note-se o fraco ruído de fundo obtido quando se utilizam amostras solúveis em CHAPS, tratadas com carvão e dextrano, num ensaio de ligação. A estabilidade ao pH do complexo receptor-ligando solúvel é mostrada na Figura 9. Existe uma transição marcada com o complexo instável a pH 5,5 e inferior, estável e capaz de permutar a GHRH ligada com a GHRH livre entre pH 5,5 e 6, e muito estável e não permutável a pH 7. A estabilidade deste
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 24 complexo dá-nos tanto um ensaio de ligação a GHRH-R melhorado, como a base para uma nova metodologia de purificação do receptor.
ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE GHRH-R
Desenvolveram-se análogos de GHRH biotinilados com o objectivo de purificar o receptor de GHRH na forma de um complexo receptor-ligando que pudesse ser retido em estreptavidina imobilizada. O primeiro análogo testado foi a [His1, Nle27]-GHRH-(1-32)-NH2 (GHRHJ biotinilada nas lisinas nas posições 12 e/ou 21 utilizando o reagente de N-hidroxissuccinimida, NHS-LC-Biotin (disponível de Pierce). Este análogo foi iodado na tirosina da posição 10 e foi resolvido nas formas mono e dibiotiniladas em HPLC. Mais de 90% destes produtos ligaram-se a estreptavidina imobilizada em 30 minutos. A GHRHa monobiotinilada tinha uma afinidade de ligação ao receptor duas vezes reduzida em comparação com a GHRHa enquanto a dibiotinilada tinha uma actividade praticamente nula. O grupo biotina parece estar na bolsa de ligação do receptor, uma vez que a ligação a estreptavidina bloqueou a ligação ao receptor. O análogo seguinte testado foi a [His 1, Nle27, Cys33]-GHRH-(1-33)-NH2. Tinha uma forte tendência para dimerizar e nenhuma das espécies que podiam deslocar a GHRHa num ensaio de ligação de competição estava biotinilada.
Verificou-se surpreendentemente que a [His 1, Nle27, Biotin-Lys41]-GHRH-(1 -41 )-NH2 (referida aqui como GHRHb) se liga ao receptor com uma afinidade comparável com a da GHRHa (uma fonte preferida para a preparação de GHRHb é Nuros Corporation de San Jose, Califórnia). Para provar que este análogo pode ser utilizado na purificação do receptor, foi iodado, foi-lhe incorporado um grupo de reticulação fotossensitivo (ANB-NOS), e o composto foi purificado por HPLC. Esta GHRH-iodo-biotinil-fotoactivável, 125l-GHRHb-ANB-NOS, foi ligada a receptores em membranas de pituitária de bovino em bruto. Os complexos receptor-ligandos foram solubilizados em CHAPS, extraídos com carvão e dextrano para remover a GHRH livre e ligados a estreptavidina imobilizada.
Para testar se a estreptavidina desalojava o receptor do seu complexo, reticularam-se amostras com UV antes e depois da ligação a estreptavidina e analisaram-se por autorradiografia. Isto demonstrou que uma fracção significativa (30%) do receptor que estava disponível para ligação podia ser retido em contas de estreptavidina. Estudos de estabilidade do complexo
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ receptor-ligando solúvel (veja-se Figura 9) indicam que uma lavagem com solução de alto teor de salinidade (NaCI 0,5M) das contas de estreptavidina seguida por uma eluição a pH baixo (pH 5) (preferivelmente utilizando uma solução tampão de fosfato, acetato, citrato ou outro tampão adequado) resulta numa purificação significativa do receptor para produzir um isolado de GHRH-R. O isolado de GHRH-R obtido tem pureza suficiente para permitir a sequenciação do GHRH-R; numa concretização preferida removem-se proteínas G e outros contaminantes interferentes, por métodos tais como, mas não se lhes limitando, electroforese em gel, para obter GHRH-R com pureza pelo menos suficiente para realizar a sequenciação. A Figura 10 demonstra os resultados de purificação por afinidade do complexo do receptor (GHRHb-GHRH-R) biotinilado numa coluna de agarose com estreptavidina. As contas de agarose, possuindo o complexo ligado, foram lavadas com NaCI 0,5 m para minimizar a ligação não específica e depois o receptor foi dissociado do ligando biotinilado a pH 5,0, e eluído da coluna. O eluado foi concentrado por ultrafiltração impulsionada por centrífuga, e analisado por SDS-PAGE. Correu-se uma coluna de controlo em paralelo e tratou-se de modo idêntico com a excepção de que os complexos de receptor solúveis foram pré-ligados ao análogo de GHRHa não biotinilado. A pista da GHRHb neste gel corado com prata mostra bandas a 52 e 45 kDa que não são observadas na pista da GHRHa. A banda de 52 kDa corresponde ao tamanho esperado para o receptor pois a banda de 55 kDa observada em estudos de reticulação inclui o péptido de GHRHa de 3,6 kDa covalentemente ligado. A banda de 45 kDa é o tamanho reportado para a proteína G estimuladora, Gs, que se pensa ser uma subunidade do complexo do receptor de GHRH. A coeluição destas duas bandas e a sua ausência na coluna de controlo confirmam que se preparou GHRH-R altamente purificado. A confirmação do GHRH-R também é provada por iodação da proteína purificada que corresponde à banda produzida num gel de SDS possuindo um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, e subsequente desglicosilação desta proteína com endoglicosidase F, o que desvia a banda até corresponder a uma proteína com um peso molecular de aproximadamente 42 kDa. Este desvio reflecte a mesma diminuição de peso molecular para o receptor marcado por fotoafinidade.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
Com referência à Figura 11, a electroforese em gel de SDS ilustra o comportamento de desglicosilação do receptor de GHRH purificado. Na pista mais à esquerda, pode-se observar uma banda que corresponde ao receptor iodado purificado, possuindo um peso molecular de aproximadamente 52 kDa (para auxiliar a leitura da legenda da Figura 11, o sinal de adição ( + ) indica a presença do composto listado à esquerda, enquanto o sinal de subtracção (-) indica que o composto à esquerda não está presente). Na segunda pista, mostra-se uma única banda, que reflecte uma proteína com o peso molecular de cerca de 42 kDa; esta banda resultou do tratamento de receptor iodado purificado com N-glicosidase. A terceira pista ilustra a competição entre GHRHa 10 nM ("GRFa") e GHRHa iodada possuindo um grupo de foto-reticulação, que é capaz de foto-reticulação ao receptor; uma vez que não se observa qualquer banda, é evidente que a GHRHa desloca a 125I-GHRH. A quarta pista mostra o efeito da N-glicosidase sobre o receptor foto-reticulado a GRF iodada. A amostra na quinta pista é idêntica à amostra na segunda pista, e nota-se que a quarta pista mostra que a proteína que produz a banda tem um peso molecular ligeiramente superior ao da proteína na quinta pista, reflectindo o peso molecular aumentado devido ao grupo de foto-reticulação no complexo do receptor GHRHa. A sexta pista apresenta a banda de maior peso molecular para receptor foto-reticulado a GHRHa iodada. A amostra na sétima pista é idêntica à amostra na primeira pista. Assim, a Figura 11 ilustra conclusivamente que o GHRH-R foi purificado e isolado. A presente invenção abrange as proteínas e polipéptidos produzidos por qualquer meio, quer sinteticamente, recombinantemente, ou por purificação da proteína nativa, que tenham a actividade de GHRH-R ou seus fragmentos (isto inclui GHRH-R de vertebrado e seus fragmentos biologicamente activos). A sequência da proteína obtida a partir de GHRH-R purificado pode ser utilizada para conceber sondas oligonucleotídicas que são utilizadas para pesquisar bibliotecas de ADNc a partir de células que expressam GHRH-R. As sondas podem também ser baseadas em receptores que se acredite serem homólogos ao GHRH-R. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:4 na listagem de sequências apresentada imediatamente antes das reivindicações mostram, como exemplos não limitantes, sequências oligonucleotídicas de iniciadores úteis para a formação de sondas, através da metodologia da reacção em cadeia com polimerase, PCR; estas sondas são baseadas no receptor de secretina de rato publicado, RS-R, e são úteis para sondar uma biblioteca de
86 046
EP 0 591 697/PT 27 ADNc contendo genes que codifiquem para proteínas homólogas. A hibridação de sondas com a biblioteca identifica o clone ou os clones que contêm os genes homólogos ou suas porções. 0 gene ou fragmentos do gene são isolados dos clones, o gene completo é reconstruído, e depois é ligado a um vector apropriado.
Numa concretização, as sondas acima mencionadas, formadas a partir dos iniciadores em SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:4 baseados no ADNc do receptor de secretina de rato, são utilizadas para pesquisar, em condições de baixo rigor, uma biblioteca de ADNc preparada a partir de um tumor de pituitária que segrega hormona do crescimento de um humano acromegálico, no vector Xgt10 (tal como o disponível de Clontech, de Paio Alto, Califórnia, #HL 1097a, iniciado aleatoriamente e com oligo(dt)) (um exemplo não limitante de condições de baixo rigor inclui uma lavagem final a 42°C com um tampão contendo NaCI 30 mM e SDS a 0,5%). Pensa-se que este tipo de tumor é derivado de forma monoclonal de somatotrofos de pituitária, e é normalmente responsivo a GHRH, indicando a presença de receptores de GHRH funcionais e sugerindo que este é uma fonte enriquecida de ARNm de receptor de GHRH. Veja-se Ikuyama et ai, "Characterization of Growth Hormone-Releasing Hormone Receptor and Pituitary Adenomas from Patients with Acromegaly," J. Clin. Endocrinol. Metab.. 66: 1265-1271 (1988). Para métodos de clonagem molecular específicos e técnicas laboratoriais veja-se Sambrook et ai ("Maniatis," Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Outros artigos que proporcionam informação sobre hormonas peptídicas, purificação de proteínas, e clonagem de genes incluem Rosselin, "The Receptors of the VIP Family Peptides (VIP, Secretin, GRF, PHI, PHM, GIP, Glucagon and Oxyntomodulin). Specificities and Identity," Peptides 7: Supl. 1, 89-100, (1986); Masu, et ai, "Sequence of expression of a Metabotropic Glutamate Receptor," Nature, 349: 760-765, (1991); Houamad et ai, "Cloning, Expression, and Gene Structure of a G-Protein-Coupled Glutamate Receptor from Rat Brain," Science. 252: 1318-1320, (1991); Tanabe et ai, "A Family of Metabotropic Glutamate Receptors," Neuron. 8: 169-179; Abou-Samra et ai, "Expression Cloning of a Receptor for Parathyroid Hormone-Related Peptide from Rat Osteoblast-like Cells: A Single Receptor Stimulates Intracellular Accumulation of Both CAMP and Inositol Trisphosphates and Increases Intracellular Free Calcium," Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89: 2732-2736, (1992); Libert et ai, "Selective Amplification and
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
Cloning of Four New Members of the G Protein-Coupled Receptor Family," Science, 244: 569-572, (1989); McFarland et a/., "Lutropin-Choriogonadotropin Receptor: An Unusual Member of the G Protein-Coupled Receptor Family," Science, 245: 494-499, (1989); Battey et a!., "Molecular Cloning of the Bombesin/ Gastrin-Releasing Peptide Receptor from Swiss 3T3 Cells," Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 88: 395-399, (1991); Hulmes et ai, "Partial Amino Acid Sequence of a Somatostatin Receptor Isolated from G^C, Pituitary Cells," Biochem. Biophvs. Res. Comm. 184: 131-136, (1992); Masu et ai, "cDNA Cloning of Bovine Substance-K Receptor Through Oocyte Expression System," Nature, London, 329: 836-838, (1987); Spindel et ai, "Cloning and Functional Characterization of a Complementary DNA Encoding the Murine Fibroblast Bombesin/Gastrin-Releasing Peptide Receptor," Mol. Endocrinol.. 4: 1956-1963, (1990); Straub et ai, "Expression Cloning of a cDNA Encoding the Mouse Pituitary Thyrotropin-Releasing Hormone Receptor," Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 9514-9518, (1990); Sasaki et ai, "Cloning and Expression of a
Complementary DNA Encoding a Bovine Adrenal Angiotensin II Type-1 Receptor," Nature, 351: 230-233, (1991); White, et al., "Expression of Functional Pituitary Somatostatin Receptors in Xenopus Oocytes," Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 133-136, (1990); Abou-Samra et al., "The PTH/PTHrp Receptor Activates Adenylate Cyclase and Phospholipase C Through Two Distinct Molecular Domains," Endocrine Societv 74th Meetinq. Resumo 836, (1992).
Os clones obtidos a partir da pesquisa de bibliotecas em condições de baixo rigor foram sequenciados através do método da terminação da cadeia com didesoxi, e utilizaram-se os clones que incluíam sequências parcial semelhantes ao ADNc do receptor para produzir sonda(s) oligonucleotídica(s) de pituitária acromegálica humana, HAP,, "sondas(s) de HAP". Num exemplo não limitante, as sequências oligonucleotídicas em SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6 foram hibridadas uma com a outra (note-se que há uma sobreposição de 10 pb), e utilizou-se o fragmento de Klenow de ADN-polimerase para preencher as secções não emparelhadas com nucleótidos marcados radioactivamente. Estas sondas de HAP, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, foram então utilizadas para pesquisa em condições de alto rigor de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de ARNm de tumor de pituitária acromegálica que tinha sido completamente desnaturado por hidróxido metilmercúrico para optimizar o prolongamento a 5' dos ADNc (disponível de Clontech, 5' Stretch HL 1097v) 29 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ (um exemplo não limitante de condições de alto rigor inclui uma lavagem final a 65°C com um tampão aquoso contendo NaCI 30 mM e SDS a 0,5%). Este ADNc foi iniciado com oligo(dt), seleccionado por tamanho (> 500 pb), e clonado direccionalmente no vector XBluemid. Este vector facilita a sequenciação uma vez que estão inserções no plasmídeo pBluescript e não necessita de ser subclonado. A pesquisa desta biblioteca com sonda(s) de HAP conduziu à identificação de clones contendo um gene de receptor de GHRH ou suas porções [tal como aqui definido, genes que codificam proteínas ou polipéptidos com actividade de ligação a GHRH, específica, de alta afinidade, como pode ser determinado pelos ensaios da presente invenção, são considerados como sendo um gene de GHRH-R ou suas porções]. SEQ ID NO:7 proporciona a cadeia de codificação da sequência de nucleótidos de 1257 pb de um ADNc que codifica para a proteína que possui actividade de GHRH-R, e SEQ ID NO:9 proporciona a cadeia de codificação da sequência de nucleótidos de 1272 pb de um ADNc que codifica para a proteína que possui actividade de GHRH-R; a sequência inclui um codão de terminação, TGA (A representa ácido desoxiadenílico, G representa ácido desoxiguanílico, C representa ácido desoxicitidílico, e T representa ácido desoxitimidílico). SEQ ID NO:8 apresenta a sequência de 418 resíduos de aminoácido de uma proteína com actividade de GHRH-R, correspondente à sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:7. SEQ ID NO: 10 apresenta a sequência de 423 resíduos de aminoácido de uma proteína com actividade de GHRH-R, correspondente à sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:9. 0 gene incluído em SEQ ID N0:7 e SEQ ID N0:9, ou seus fragmentos, foi isolado a partir dos clones, o gene completo foi reconstruído, e depois foi ligado a um vector de expressão. Infelizmente, a E. coli não pôde ser utilizada rotineira ou facilmente como célula hospedeira para produzir a proteína glicosilada. Portanto, foi necessário encontrar um vector de expressão adequado no qual inserir um gene GHRH para permitir a expressão numa célula de mamífero. Numa concretização preferida, utiliza-se o vector de expressão CDM8, disponível de Invitrogen, de San Diego, Califórnia, e o gene é expresso em células COS (uma linha de células de macaco transformada com genoma virai de SV40 contendo uma origem de replicação virai defeituosa. Quando introduzido nas células COS, o ADNc inserido em pCDM8 dirige a produção de ARNm que são traduzidos em proteína). A invenção abrange qualquer e todas as células hospedeiras transformadas ou transfectadas com genes que codificam para GHRH-R ou suas
86 046
EP 0 591 697/PT 30 porções, bem como vectores de expressão utilizados para conseguir esta transformação. Está contemplado que possam ser criados animais transgénicos, compreendendo receptores mutados, ARNm com sentido e anti-sentido que alterem a função do receptor in vivo.
Isolamento de Subtipos de Receptores Homólogos Não Humanos
Podem-se preparar como se segue receptores homólogos de outros tipos de tecido ou de outras espécies. Sondam-se bibliotecas de ADNc preparadas a partir de ARNm do tipo de tecido ou espécie específicos de interesse, com ADNc de HAP radioactivamente marcado e lava-se em condições de rigor médio (e.g., 1xSSC, SDS a 0,1 %, 55°C). As placas fágicas que parecem positivas são novamente pesquisadas para verificar a autenticidade. As placas fágicas positivas são então utilizadas na recuperação de plasmídeo de acordo com técnicas conhecidas na arte. Os plasmídeos recuperados são purificados, cortados com enzimas de restrição apropriadas, e analisados num gel de agarose corado com brometo de etídio. O segundo gel é transferido para um filtro de nitrocelulose, sondado com HAP marcado, lavado sequencialmente, em condições de rigor médio, e depois de alto rigor (0,1 x SSC, SDS 0,1%, a 65°C), e exposto a uma película de raios-x. As inserções que hibridam fortemente com HAP sob condições de alto rigor representam provavelmente candidatos a ADNc de receptores. A confirmação adicional da identidade destes receptores putativos pode ser realizada segundo os protocolos descritos nos exemplos que se seguem, ou de acordo com técnicas de rotina conhecidas na arte. Assim, a invenção abrange não apenas as sequências de nucleótidos e de aminoácidos representadas na listagem de sequências como também sequências de nucleótidos que hibridam, sob condições de médio ou alto rigor, com a sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 ou a sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, bem como as proteínas biologicamente activas ou fragmentos por elas codificados.
Concepção e Utilidade da Pesquisa.
As pesquisas utilizam o receptor purificado ou recombinante em fase sólida ou fase líquida ou numa célula hospedeira. A expressão na pesquisa é medida pela ligação ao ligando, função do segundo mensageiro, secreção do produto, ou por outros meios. Os ensaios em fase sólida podem envolver o receptor fixado num suporte sólido, química ou imunologicamente, em conjunto
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ com, ou sem, proteínas de transdução. Estes ensaios podem ser ligados a um repórter tal como um anticorpo, um composto químico biológico (e.g., biotina), ou uma proteína de ligação ou enzima, que expressarão um sinal radioactivo, químico, calorimétrico ou luminescente. As pesquisas que envolvem células hospedeiras podem empregar células bacterianas ou células superiores (e.g., de levedura, insecto, mamífero). As células hospedeiras de mamífero ideais incluem linhas de células de tumor de pituitária que segregam GHRH, e linhas de células que segregam outros produtos em resposta a estimulação do GHRH-R transfectado.
Utilidade Terapêutica do GHRH-R O GHRH-R pode ser aplicado ao tratamento de deficiência clínica do crescimento em crianças e adultos, pode restabelecer a resistência e composição normais do corpo (músculo vs. gordura), e retardar ou inverter alguns aspectos do envelhecimento do corpo relacionados com a composição corporal e a resistência muscular, pode melhorar o controlo do sono, e pode ser utilizado para aumentar o crescimento em gado doméstico, bem como aumentar a lactação em animais produtores de leite, e melhorar as funções imunitárias, o controlo do apetite, a eficiência da alimentação e nutrição.
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS COM RECEPTOR DE GHRH A técnica da análise da hidrofilia de informação primária sobre as sequências tem sido vulgarmente utilizada para identificar tanto domínios de transposição de membranas potencialmente hidrófobos como locais antigénicos hidrófilos. A análise do receptor de GHRH clonado pelo método de Hopp e Woods, vejam-se as Figuras 18 e 19 (Hopp, T.P., e Woods, K.R., Proc. Natl. Acad., 78:3824 (1981) indica sete domínios ricos em resíduos hidrófobos; esta é uma propriedade comum na família de receptores ligados a proteína G, Wang, H., Lipfert, L., Malbon, C., e Bahouth, B., J. Biol. Chem.. 264:14424 (1989). Este modelo apresenta quatro regiões extracelulares que são alvos potenciais para a ligação de anticorpos anti-receptor; três voltas extracelulares (EC-1, EC-2, EC-3) e um terminal N que contêm locais para glicosilação ligada a asparagina. A fim de produzir anticorpos que bloqueiam ou activam o receptor, preferem-se fragmentos de voltas extracelulares, particularmente aqueles que não contêm locais de glicosilação em N (o hidrato de carbono pode interferir
86 046 ΕΡ Ο 591 697/ΡΤ estereoquimicamente com a ligação do anticorpo). Contudo, as voltas intracelulares (IC) são também úteis na produção de anticorpos que podem ser utilizados para ligação em fase sólida da proteína receptora em pesquisas e outros ensaios. Um estudo recente de anticorpos dirigidos contra as três voltas EC do receptor de tirotropina indica uma heterogeneidade nas suas actividades biológicas, incluindo a indução de anticorpos bloqueadores utilizando a volta EC-3 como antigénio. Veja-se Ohmori, M., et a!., Biochem. Biophvs. Res. Comm., 174:399 (1991). Portanto, prepara-se um amplo painel de anticorpos anti-péptido e anti-receptor e avalia-se cuidadosamente de modo a determinar os epítopos necessários para a indução de anticorpos bloqueadores ou activadores.
Os péptidos são produzidos por síntese em fase sólida convencional, clivados com HF, e purificados por HPLC (van Regenmortal, M.H., em Svnthetic Peptides as Antiaens. Elsevier, New York, páginas 41-93 (1988). Os péptidos são acoplados a um imunogénio transportador tal como hemocianina de lapa do género Fissurela (KLH) ou ovalbumina através de glutaraldeído, por procedimentos convencionais, e estes conjugados são utilizados para imunizar ratinhos e coelhos. Veja-se Coligan, Jl et a/., em Current Protocols in Immunoloav. Voi. 1, Wiley-lnterscience, New York (1991). Dá-se aos animais a primeira imunização de péptido conjugado com Adjuvante de Freunds Completo e três semanas mais tarde dão-se semanalmente imunizações de reforço com péptido conjugado em Adjuvante de Freunds Incompleto. Os anticorpos específicos anti-péptido são detectados através da sua ligação ao péptido num ensaio ELISA ou RIA. Nos casos em que os péptidos não aderem ao plástico, e portanto não são tratáveis por ensaio directo, então o péptido é conjugado com uma proteína transportadora não relacionada que então adere à placa. A especificidade dos anticorpos é também avaliada pela técnica de Western Blotting. Veja-se Towbin, It. et a!., PNAS USA, 76:4350 (1979). Os anticorpos específicos reorganizam-se numa proteína de 55 kDa em preparações de membrana em bruto, em glicoproteínas eluídas com WGA, ou em eluados de estreptavidina. Membranas de uma linha de células desprovidas de receptor servem como controlo negativo. Este procedimento também dá informação sobre o grau de reactividade cruzada dos anticorpos com subtipos de receptores de outras linhas de células e tecidos (cérebro, pituitária) e obvia a necessidade de purificação dos receptores provenientes de cada fonte. É benéfico para obter
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 33 tanto anticorpos específicos dos tecidos para estudos fisiológicos como anticorpos com reactividade cruzada para possível utilização em purificação do receptor proveniente de vários tecidos utilizando cromatografia de imunoafinidade.
Os anticorpos monoclonais para o receptor de GHRH são preparados utilizando métodos convencionais. Veja-se Harlow, H., e Lane, D., em Antibodies: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Lab, New York, páginas 139-240 (1988). Os antigénios utilizados para imunização incluem (1) conjugados KLH-péptido que correspondem às regiões extracelulares conforme acima descrito, (2) receptor purificado a partir de membranas de pituitária anterior de ovino ou bovino, (3) receptor purificado desglicosilado com neuraminidase ou N-glicosidase e repurificado por SDS-PAGE e electroeluição, (4) receptor purificado a partir de fontes recombinantes, tais como células CHO transfectadas, ou baculovírus testado quanto a reactividade para com o imunogénio peptídico por ELISA ou imunogénio proteínico por Western Blot. Aqueles que apresentam anticorpos em circulação para o receptor ou os seus péptidos são utilizados para a preparação de hibridomas. Em resumo, removem-se células de baço e fundem-se na presença de polietilenoglicol com células de mieloma SP2/D que são deficientes na enzima hipoxantina-guanina fosforribosilaminopterina-timidina, que selecciona os híbridos verdadeiros de ambos os tipos de células uma vez que as células do baço não crescem em cultura. Os hibridomas no sobrenadante são pesquisados quanto ao anticorpo para o receptor por (1) Western Blot de receptor purificado ou glicoproteínas eluídas com WGA, (2) ELISA utilizando inibição de ligação de ligandos marcados radioactivamente a membranas. Os hibridomas que são positivos são propagados e novamente clonados por diluição limitante ou crescidos em ágar mole; isto assegura a sua natureza monoclonal. Os clones positivos são utilizados para induzir tumores em ratinhos e acumulam o anticorpo em fluido de ascitos.
Tanto os anticorpos IgG monoclonais como os policlonais são purificados por precipitação convencional com sulfato de amónio e cromatografia de Proteína A. veja-se Harlow, supra. Os anticorpos são analisados quanto à sua capacidade para bloquear ou activar a ligação de radioligandos a membranas no ensaio de ligação Standard descrito acima. 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 34
Os anticorpos que se apresentam promissores para bloquear ou activar ligandos são testados in vivo utilizando por exemplo um modelo de rato, e.g., utilizando cateteres venosos permanentes em ratos para monitorizar os níveis de GH após administração de anticorpo anti-receptor de GHRH. Veja-se Miell, J., et ai, J. Endocrinol. 131:75 (1991). Os anticorpos que apresentam a maior actividade in vivo neste ponto são examinados para definir os seus epítopos (se não já determinados) sobre o receptor. Os epítopos representam fragmentos antigénicos do receptor que, quando utilizados como imunogénios, induzem anticorpos possuindo o efeito fisiológico desejado de alterar os níveis de produção de GH.
MÉTODOS EXPERIMENTAIS E EXEMPLOS
Os seguintes exemplos não limitantes demonstram adicionalmente o ensaio de ligação a GHRH melhorado da presente invenção, e o método de purificação do receptor de GHRH com base na solubilização de um complexo GHRH/receptor de GHRH intacto. Os exemplos não limitantes de clonagem de genes e expressão de proteínas que se seguem referem-se a exemplos de sequências de nucleótidos e de aminoácidos, SEQ ID NO:1 a SEQ ID N0:10. Contudo, deve-se entender que a invenção não está limitada somente a estas sequências, mas abrange também sequências biologicamente equivalentes. Estão também contempladas modificações à sequência, tais como deleções, inserções, ou substituições na sequência que produzam alterações silenciosas na molécula de proteína resultante ou suas porções. Estão contempladas por exemplo, alterações na sequência do gene que reflectem a degenerescência do código genético, ou que resultam na produção de um resíduo ou resíduos de aminoácido quimicamente equivalentes numa dada localização na proteína. Em particular, a invenção contempla as sequências de ADN que são suficientemente duplicativas da sequência especificamente revelada de modo a permitir a sua hibridação sob condições padrão de hibridação de Southern de rigor médio a alto rigor, bem como as proteínas biologicamente activas assim produzidas. A sequência de ácido nucleico, ou suas porções, aqui reveladas podem facilmente ser empregues em procedimentos de hibridação de Southern para identificar e isolar GHRH-R em células a partir de várias espécies e tipos de tecido; tais células hospedeiras e seus derivados podem ser utilizados na produção recombinante de todo ou de uma porção de um GHRH-R.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
Deve entender-se que podem ser utilizados uma vasta variedade de outros materiais que não os aqui especificamente mencionados, para a prática da invenção, sem experimentação indevida.
ENSAIO DE LIGAÇÃO EM PELETES DE MEMBRANA EM BRUTO
PREPARAÇÃO DE TECIDO
Todos os passos foram realizados a 4°C. Lavaram-se pituitárias anteriores congeladas de ovino ou bovino (ovino: aproximadamente 1 g/pituitária obtida do Dr. lan Clarke, Melbourne, Australia; bovino: aproximadamente 2,5 g/pituitária manuseamento especial de Pel-Freez, de Rogers, Arkansas) para remover o sangue, limparam-se para remover tecido conjuntivo e homogeneizaram-se (utilizando um homogeneizador Dounce) em tampão HEPES 50 mM, NaCI 100 mM, EDTA 10 mM, EGTA 0,1 μΜ, pH 7,4 com PMSF 0,5 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonilo), leupeptina 10 pg/ml, pepstatina A 10 pg/ml, e aprotinina 200 U/ml (unidades/ml). Este tampão é utilizado para remove GTP endógena que pode ser ligada a proteínas G e para restabelecer a ligação de alta afinidade. O homogeneizado foi centrifugado na velocidade máxima da microcentrífuga e o sobrenadante foi rejeitado. A camada superior (membrana) da pelete foi então cuidadosamente ressuspensa em tampão de ligação contendo tampão Tris 50 mM, EGTA 5 mM, MgCI2 5 mM, alameticina 50 pg/ml, bacitracina 30 μg/ml e outros inibidores de protease como anteriormente.
CONDICÕES DE LIGAÇÃO E ANÁLISE
Incubou-se 1/50 de equivalente de pituitária por tubo em tampão de ligação com aproximadamente 100 000 contagens de sonda iodada num volume de 500 μΙ à temperatura ambiente durante 1 hora. Determinaram-se as contagens totais entregues e a percentagem de contagens ligadas para cada tubo com 3 a 6 réplicas por condição experimental. Analisaram-se os perfis de ligação de saturação com o programa de computador Ligand que realiza um ajustamento estatisticamente ponderado de mínimos quadrados à equação de ligação de ligandos exacta em coordenadas não transformadas. As medições estatísticas (teste F e teste de ciclos) indicaram um ajustamento convincentemente bom a um modelo de um único local de ligação. É apresentada na Figura 2 uma análise de ligação de saturação representativa. 36 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
RESULTADOS Ο tratamento do tecido com EDTA 10 mM foi essencial para permitir a remoção de GTP endógeno e revelar os locais de alta afinidade dependentes de GTP. Inicialmente, a ligação não específica foi esmagadora e a vasta variedade de agentes de bloqueio não ofereceu qualquer melhoramento. Observaram-se sinais de ligação ligeiramente melhores em fracções de membrana purificadas por centrifugação de densidade de sacarose. Para obter resultados consistentes, prepararam-se grandes lotes de membrana em bruto a partir de pituitárias congeladas e congelaram-se alíquotas desta membrana para ensaio posterior. Com referência à Figura 1, notou-se um grande aumento na ligação específica quando as membranas foram testadas directamente após homogeneização. Um mecanismo possível para este efeito de congelação-descongelação é a formação de vesículas que interferem com o ensaio. Testando esta possibilidade, verificou-se que o antibiótico formador de poros, alameticina (50 pg/ml) aumentou 3 vezes a razão de ligação específica/ ligação total, como se ilustra graficamente na Figura 1. A maior parte deste aumento foi devido a uma queda na ligação não específica, possivelmente devido à libertação de sonda aprisionada em vesículas. Uma lavagem adicional das peletes de membrana por centrifugação foi incluída para maximizar o aumento de ligação específica em relação à ligação não específica apesar da perda nas contagens totais recuperadas. A análise em computador dos estudos de ligação de saturação com o programa Ligand indica um único local de ligação com um Kd = 158 ± 13 pM e que o número total de locais de ligação específica (RT) é de 1,5 ±0,09 pmol/g de tecido (valor do melhor ajustamento ± erro padrão aproximado da média (SEM). Uma vez que a afinidade para GHRHa está comensurada com a potência biológica de GHRHa, e devido à especificidade para GHRH relativamente a péptidos relacionados (sem competição por VIP ou PACAP 100 nM) e à sensibilidade relativamente a GTPyS 50 μΜ e DTT 1,0 mM, esta ligação indica a presença de GHRH-R. A comparação da 125l-GHRHa com uma GHRH humana iodada disponível no comércio (Amerisham, Arlington Heights, IL) mostrou muita semelhança; a 125l-GHRHa apresentou uma ligação específica ligeiramente melhor e um efeito de GTP algo mais forte.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 37
AVALIAÇÃO DE LIGAÇÃO DE SONDAS DE FOTOAFINIDADE
Prepararam-se duas sondas de fotoafinidade diferentes utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais fotorreactivos disponíveis de Pierce como discutido acima (Rockford, IL). Acoplou-se SANPAH a GHRHa direccionado para a histidina do terminal N utilizando um sistema de solventes de DMF. Acoplou-se ANB-NOS a GHRHa direccionado para as lisinas 12 ou 21. Cada produto grupo de acoplamento-GHRHa foi purificado por HPLC, iodado e de novo purificado.
Avaliou-se a ligação de fotossondas a membranas com um ensaio de ligação a membrana em bruto e depois analisou-se adicionalmente por eiectroforese em SDS-PAGE para identificar os locais de ligação. Incubaram-se as fotossondas no escuro, fotolisaram-se durante 10 minutos com um lâmpada de UV de onda longa (366 nm), e depois formaram-se peletes com as amostras. Contaram-se as peletes e depois extractaram-se por ebulição directamente em tampão da amostra de SDS (extractos de SDS totais). Alternativamente, extractaram-se as peletes marcadas numa solução de detergente moderado (CHAPS 5 mM), centrifugou-se, e desnaturaram-se os sobrenadantes concentrados de clorofórmio/metanol com tampão de SDS (extractos de CHAPS). Submeteram-se então estas amostras a eiectroforese em geles de SDS e autorradiografaram-se.
RESULTADOS O ensaio de ligação revelou que ambas as fotossondas se ligaram a peletes de membrana, e podiam ser totalmente deslocadas por GHRHa 10 nM, ou parcialmente deslocadas por GTPyS 50 μΜ. Ambas originaram ligação não específica maior que Ι-GHRHa. Os geles de extractos totais de SDS das peletes reticuladas por afinidade apresentaram esta ligação não específica na forma de bandas não afectadas por GHRHa ou GTPyS. Estas bandas não específicas diferiram um pouco de operação para operação e entre as duas sondas (Figura 3). O detergente não iónico CHAPS é um fraco soiubilizador de proteínas; o trabalho de purificação do receptor demonstrou a capacidade de soluções contendo CHAPS para solubilizar actividade de ligação a GHRH. Quando os extractos de peletes reticuladas obtidos utilizando uma solução contendo CHAPS 5mM foram examinados em geles de SDS, a visualização de reticulação do receptor foi muito melhorada, pois a maioria da proteína não especificamente marcada não foi soiubilizada. Com referência às Figuras 3 e 4, uma banda de
86 046 ΕΡ Ο 591 697/ΡΤ 38 55 kD, cuja marcação é grandemente efectuada por GHRHa ou GTPyS, é claramente visível com ambas as sondas, e representa o GHRH-R. Estas fotossondas são inestimáveis na caracterização, purificação e clonagem posteriores do receptor de GHRH.
DESGLICOSILACÃO
Uma vez que se sabe que a porção extracelular da maior parte dos receptores de membranas ligados a proteína G contêm múltiplos grupos hidrato de carbono covalentemente ligados a resíduos arginina (ligados a N), realizaram-se experiências para confirmar que a banda especificamente fotomarcada nas Figuras 3 e 4 é uma glicoproteína ligada a N. Trataram-se as amostras com uma mistura purificada, isenta de protease, de endoglicosidase F e N-glicosidase F.
Colocaram-se em ebulição as peletes fotomarcadas (extractadas utilizando SDS ou CHAPS) em tampão de amostra de SDS, diluíram-se, e incubaram-se durante a noite a 37°C com Nonidet P-40 a 1,25% (um detergente não iónico também conhecido como NP-40) em 0,5 unidades de glicosidase ou branco. Estas amostras foram então concentradas através de um protocolo de precipitação com clorofórmio-metanol (veja-se Wessel, et a!., Anal. Biochem., 138:141-143 (1984)) e submetidas a electroforese em geles de SDS.
Com referência às Figuras 3 e 4, pode-se observar que a mobilidade da banda especificamente fotomarcada se devia de aproximadamente 55 kD para aproximadamente 45 kD apenas na presença de glicosidase. Outras bandas, visíveis nas amostras extractadas com SDS, e consideradas como sendo não especificamente marcadas pela falta de resposta a GHRHa ou GTPyS, não são desglicosiladas. Esta é a primeira prova de que o GHRH-R é uma glicoproteína, e proporciona a melhor estimativa do verdadeiro tamanho da cadeia da proteína. Tal como mostrado na Figura 5, o tratamento do receptor fotomarcado com neuraminidase provocou um desvio na mobilidade no gel para aproximadamente 52 kD. Isto demonstra que o receptor tem um número de grupos ácido siálico terminais sobre as suas cadeias oligossacarídeas. Estes grupos ácido siálico também afectam o pl do receptor, como observado nos geles de focagem isoeléctrica, na hidrofobicidade em HPLC, e também nas suas propriedades de ligação a lectinas. A desglicosilação é útil em estratégias de purificação e para facilitar a clivagem proteolítica do receptor para sequenciação.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 39
SOLUBILIZACÃO DE COMPLEXOS RECEPTOR-GHRH
As preparações de membrana pituitária solubilizadas em soluções contendo CHAPS apresentaram apenas locais de baixa afinidade insensíveis a GTP (Kd de aproximadamente 500 nM), como medido com um ensaio de ligação com carvão-dextrano (adaptado do que foi desenvolvido para VIP por Paul, et al., J. Biol. Chem., 262:158-162 (1987)). Outros detergentes conservaram mesmo menos ligação, o que indica que o GHRH-R não era estável em face destes tratamentos. Os resultados da reticulação de fotoafinidade revelaram que o complexo receptor-ligando covalentemente acoplado é solúvel numa solução contendo CHAPS. A pré-incubação de GHRH com o receptor utilizando as condições do ensaio de ligação a membranas da presente invenção, seguido por extracção com uma solução de detergente moderado, preferivelmente contendo CHAPS, revelou a solubilização de um complexo receptor-ligando intacto. Este complexo solúvel foi detectado por extracção com detergente de membranas incubadas com análogo de 125I-GHRH, ou análogo de125l-GHRH após tratamento com GHRH 10 nM fria.
GHRH-R PURIFICADO
Utilizou-se então análogo de GHRH biotinilado para formar um complexo GHRHb-GHRH-R solúvel, e este complexo solúvel, após extracção utilizando CHAPS, e purificação com carvão-dextrano, foi corrido numa coluna de estreptavidina. A coluna de estreptavidina foi então lavada com uma solução de NaCI, e subsequentemente correu-se uma solução tampão com um pH de 5,0 na coluna para produzir um isolado de GHRH-R. 0 isolado de GHRH-R pode então ser adicionalmente purificado por SDS-PAGE. Uma banda que aparece a cerca de 52 KDa (correspondente a GHRH-R puro) pode ser transferida para uma membrana de PVDF Standard. A membrana de PVDF com o GHRH-R purificado pode então ser digerida sobre a membrana e sequenciada para obter a sequência completa ou parcial de resíduos de aminoácido do GHRH-R após métodos de sequenciação convencionais. A sequência ou sequências de resíduos de aminoácido obtidas a partir do passo de sequenciação podem então ser utilizadas como uma base para formar
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 40 sondas degeneradas para utilização na clonagem do gene responsável pela produção de GHRH-R.
Assim, foi revelada uma metodologia melhorada para a medição da ligação de análogos de GHRH ao receptor de GHRH em membranas de pituitária de ovino e bovino (incluindo métodos para iodação, purificação e entrega de análogos de GHRH, e a utilização de antibióticos formadores de poros). Isto conduziu ao desenvolvimento de métodos para a fotomarcação sensível a GTP, específica para GHRH, de alta afinidade, do receptor de GHRH. Esta marcação deste receptor não foi anteriormente conseguida. Isto permite a caracterização do tamanho, glicosilação, solubilidade e outras propriedades do receptor. Isto conduziu à verificação de que uma solução de detergente moderado, incluindo compostos tais como CHAPS, podia extrair o complexo GHRH ligado - receptor de GHRH numa forma estável, solúvel. A extracção com CHAPS e o tratamento com carvão/dextrano (para ligar GHRH livre) origina um complexo receptor-ligando solúvel que é purificado da maioria da ligação não específica de GHRH, e assim é muito útil como um novo ensaio de ligação a GHRH, com baixo ruído de fundo, com melhor sensibilidade do que era anteriormente possível, e também como um ponto de partida para a purificação do receptor. Este complexo receptor-ligando é relativamente estável em face de lavagens com sais, troca de GHRH e tratamento com GTP ou DTT, mas não à diminuição de pH. Foi inventado um análogo de GHRH biotinilado no terminal C que, quando ligado num complexo solúvel de GHRH-R, permite a purificação do receptor de GHRH por retenção numa coluna de estreptavidina imobilizada, seguida por uma lavagem com sais, e eluição a pH 5. Esta proteína receptora purificada é adequada para a sequenciação parcial de péptidos receptores e esta informação sobre a sequência é valiosa para a clonagem do ADNc do receptor de GHRH.
VECTORES
Os exemplos não limitantes de vectores adequados para utilização na realização da presente invenção incluem os vectores representados nas Figuras 13 e 14. Com referência à Figura 13, é representado o fagemídeo pBluescript® II KS +.0 fagemídeo pBluescript é um fagemídeo de 2961 pares de bases derivado de pUC19. A designação KS indica que o poliligante está orientado de modo a que a transcrição de lacZ prossiga de Κρη I para Sac I. O fagemídeo pBluescript está disponível de Stratagene, La Jolla, Califórnia. A informação específica sobre pBluescript pode ser obtida a partir de Stratagene e
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 41 está disponível em catálogos publicados (tais como o Catálogo de Produtos "Stratagene 1991 Product Catalog"). O plasmídeo pBluescript® II é mostrado contendo uma inserção de 1,6 kpb de ADNc de HAP (será definido adiante), que codifica para um GHRH-R. As enzimas de restrição que cortam antes da extremidade 5' de HAP incluem Saci, BstX, Notl, Xbal, Smal, Pstl, EcoRI. As enzimas que cortam na extremidade 3' do ADNc de HAP incluem Hindlll, Clal, Sall, Xhol, Apal. As enzimas que cortam dentro do ADNc de HAP incluem Ncol e EcoRI.
Com referência à Figura 14, está representado o vector CDM8, disponível de Invitrogen de San Diego, Califórnia. O pCDM8 é um vector de expressão eucariótico multifuncional de 4,5 kb desenvolvido por B. Seed para a clonagem e análise de ADNc em E. Coli e sistemas eucarióticos. Veja-se Nature 32: 840-842, (1987). O plasmídeo CDM8 é mostrado contendo uma inserção de ADNc de HAP. Os locais de restrição para Hind III, Ncol, e Xhol mostrados não foram reformados após ligação em extremidades lisas da inserção no plasmídeo.
Deve-se entender que podem ser utilizados outros vectores para a clonagem de todo ou porções do gene que codifica para um GHRH-R ou seus fragmentos biologicamente activos (tais como, a título de exemplo não limitante, um vector de expressão propriedade de Merck Company designado por pRJB2).
SONDAS OLIGONUCLEOTÍDICAS
Numa concretização, produziu-se uma primeira sonda, baseada em ADNc de receptor de secretina de rato. Sintetizaram-se quatro oligonucleótidos mostrados em SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:4 de modo a corresponder a porções da sequência das cadeias da sequência do receptor de secretina de rato revelada por Ishihara et a/., in "Molecular Cloning and Expression of a cDNA Encoding the Secretin Receptor," EMBO. J.. 10: 1635-1641 (1991). Dois destes oligonucleótidos, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, foram então utilizados na realização do método da reacção em cadeia com polimerase, PCR, com ADNc de cerebelo de rato para amplificar toda a região de codificação do ADNc do receptor de secretina de rato. A PCR foi conduzida como se segue utilizando um ciclizador térmico: o ciclo de temperaturas foi de 94°F, 55°F, e 72°F para a desnaturação, a hibridação de iniciadores, e o prolongamento dos iniciadores, respectivamente, e o ciclo de tempos foi de aproximadamente 1, 1,5, e 2,5 42 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ minutos, respectivamente, para estas temperaturas durante cada ciclo. Foram utilizados um total de 30 ciclos. Utilizou-se Polimerase Taq em tampão de PCR Standard. Infelizmente, a reacção PCR utilizando os dois iniciadores iniciais (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) não originou amplificação suficiente. Para ultrapassar este problema, realizou-se uma segunda reacção PCR utilizando um segundo conjunto de iniciadores, SEQ ID NO:3 e SEQ ID N0:4 alojados internamente no primeiro conjunto. O produto foi um "núcleo hidrófobo" de 812 pares de bases do receptor de secretina, que se prolonga desde o primeiro segmento transmembranar, até imediatamente após o sétimo segmento transmembranar, nucleótidos 639-1450 (o receptor de secretina, tal como certos receptores ligados a proteína G, GCR, transpõem a membrana celular, e tem múltiplos segmentos transmembranares formados por agrupamentos de aminoácidos hidrófobos, e origina uma assinatura de hidropatia como a dos GCR de Rodopsina). O mapeamento com endonucleases de restrição com Pst I e Xba I confirmou a identidade deste material. O produto de PCR foi purificado na forma de uma banda de um gel de agarose por electroforese em dietilaminoetilo, DEAE, papel, seguindo-se eluição com sais e precipitação com etanol. PESQUISA DE BIBLIOTECAS EM CONDIÇÕES DE BAIXO RIGOR 0 fragmento de ADNc do receptor de secretina produzido acima foi então radiomarcado por iniciação aleatória, e utilizado como uma sonda para a pesquisa de cerca de 1,5x1 O6 clones que tinham sido plaqueados a partir da biblioteca de ADNc em λgt10, de pituitária acromegáiica humana, e levantados sobre filtros de nitroceiulose. Numa concretização preferida, a marcação de sondas é conduzida utilizando um estojo Prime-a-Gene disponível de Promega de Madison, Wisconsin (genericamente, as condições de baixo rigor compreendem elevada força iónica e/ou temperatura diminuída; as condições de alto rigor compreendem força iónica diminuída e/ou temperatura aumentada). Os filtros foram lavados a 42°C com um tampão contendo NaCI 30 mM em dodecilsulfato de sódio, SDS, a 0,5%, antes da autorradiografia. Os fagos que hibridaram com a sonda foram purificados por formação de placas, ligados em bandas com CsCI, as inserções no λgt10 foram excisadas com EcoRI, subclonadas em pGEM7Zf( + ) (disponível de PROMEGA de Madison, Wisconsin), e cultivadas em E. coli. As inserções clonadas em pGEM7Zf( + ) foram então sequenciadas pelo método da terminação de cadeias com didesoxi de Sanger et al., em "DNA Sequencing with Chain Termination Inhibitors," Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74: 5463-5467 (1977). Encontraram-se vários 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 43 clones pequenos (<400 pb) e três clones maiores. Dois destes clones maiores (1,0 e 1,1 kb) incluíam, cada um, sequências parciais que se assemelhavam com o ADNc do receptor (sequência HAP), e uma secção que não de codificação a 3' que terminava numa cauda poli A. Estes clones continham sequências idênticas onde se sobrepunham, mas diferiam no comprimento da região de codificação que abrangia 200 pb, e demonstraram dois locais de poliadenilação diferentes a 3' distanciados de 300 pb. Verificou-se surpreendentemente que não se encontraram clones representando o receptor de secretina humano, o que seria prontamente detectado pela sonda de secretina de rato utilizada, na biblioteca de tumor acromegálico, HAP. [Isto é particularmente significativo, uma vez que o GHRH-R está presente em' concentrações extremamente baixas no somatotrofo da pituitária, e a presença de quantidades mesmo relativamente pequenas do gene que codifica para o receptor de secretina humano na biblioteca de ADNc tornaria difícil a clonagem do GHRH-R por este método]. PESQUISA DE BIBLIOTECAS EM CONDIÇÕES DE ALTO RIGOR Uma sonda oligonucleotídica de HAP de 50 pb marcada, feita a partir dos dois 30meros complementares apresentados em SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, que se sobrepõem em 10 pb; os meros hibridados foram marcados através da reacção de preenchimento com fragmento de Klenow (estes meros foram preparados com base na sequência obtida da pesquisa da biblioteca em condições de baixo rigor). Utilizou-se a sonda de HAP de 50 pb para pesquisar a biblioteca de ADNc acromegálico humano Clontech #HL 1097a discutida acima, bem como para pesquisar uma biblioteca Clontech 5' Stretch HL 1097v especialmente preparada a partir de ARNm de tumor de pituitária acromegálica, HAP, que tinha sido completamente desnaturado por hidróxido metilmercúrico para optimizar o prolongamento a 5’ dos ADNc; este ADNc foi iniciado com oligo(dt), seleccionado por tamanhos (>500 pb), e clonado de modo dirigido no vector XBluemid. Este vector facilita a sequenciação uma vez que as inserções estão contidas no plasmídeo pBluescript e não necessita de ser subclonado como teria que ser feito se utilizando o vector 7gt10 anterior. Ambas as bibliotecas foram pesquisadas como anteriormente, mas utilizou-se uma lavagem final em condições de alto rigor dos levantamentos do filtro de nitrocelulose a 65°C para remover todos os que concordavam menos os que concordavam mais estreitamente. Uma biblioteca que utiliza o vector λgt10 produziu 152 sinais que foram confirmados por levantamentos em duplicado.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ A pesquisa da segunda biblioteca "5' Stretch" com levantamentos em duplicado revelou 64 sinais de correspondência, 58 dos quais foram purificados por formação de placas; destes, sugeriu-se, por PCR, que o 7o, designado HAP 7, continha a região que codifica a proteína completa para um GHRH-R. Mais especificamente, utilizando iniciadores de PCR para o vector fágico que contém o local de clonagem e também utilizando iniciadores específicos para uma sequência de HAP, foi possível medir tanto o tamanho total de cada inserção como o seu comprimento a 5' da sequência de HAP conhecida, utilizando PCR. Os resultados sugerem que o ADNc de HAP é abundante em ambas as bibliotecas de tumor e que foi produzido um clone de comprimento completo. O fago HAP 7 foi cortado com a endonuclease de restrição Notl para remover o plasmídeo pBluescript contendo a inserção de ADNc. Este plasmídeo foi então utilizado para transformar E. coli e as células transformadas foram seleccionadas por resistência a ampicilina; uma das colónias designada Escherichia Coli HAP 7.3, DH5a foi depositada na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A., em 25 de Agosto, 1992, e foi-lhe atribuído o Número de Acesso ATCC 69058. A Figura 12 ilustra os passos seguidos para inserir a sequência de ADNc de HAP 7.3 no plasmídeo pCDM8 para utilização em transfecção de células COS. Este esquema tira vantagem do local de restrição para Ncol contendo o codão de iniciação (ATG) e das diferentes resistências a antibióticos dos plasmídeos pBluescript® e pCDM8. A sequenciação de clones de HAP pode ser realizada pelo método da terminação de cadeias com didesoxi de Sanger utilizando um estojo disponível no comércio, ou num sequenciador de ADN automático. A sequência de nucleótidos para o ADNc de HAP 7.3 que codifica um GHRH-R é ilustrada em SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:9, e as suas correspondentes sequências de aminoácidos são apresentadas em SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 10, respectivamente. Uma busca em computador (FASTAst GenBank Release 71) mostra que, para além dos receptores da família da secretina, a sequência de GHRH-R não tem semelhança significativa com outras proteínas conhecidas.
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
EXPRESSÃO DE ADNc DE HAP 7,3 NUMA LINHA DE CÉLULAS DE MAMÍFERO O ADNc de HAP 7 contém estrutura de leitura aberta (ORF) de tradução prolongada que se inicia com o codão de metionina (Met) que está conforme com a sequência de consenso do codão de iniciação proposto por Kozak. Veja-se "An Analysis of 5'-Noncoding Sequences From 699 Messenger RNAs,” Nucleic Acids Res., 15:8125-8148 (1988). O ADNc de HAP 7 contém 80 pares de bases a 5' deste codão de iniciação putativo, e está desprovido dos codãos ATG ou de codãos de terminação enquadrados. A ORF prolonga-se por 1 269 pb, e assim codifica uma proteína de 423 aminoácidos (peso molecular previsto de aproximadamente 45 kDa). O ADNc de HAP 7.3 foi subclonado no vector de expressão pCDM8 tirando vantagem do local de restrição para a endonuclease Nco1 que contém o codão de iniciação putativo.
Transfectaram-se células Cos-1 com o vector formado unindo o pCDM8 e o ADNc de HAP, e prepararam-se as membranas das células Cos-1 72 horas mais tarde. As células Cos-1 foram transfectadas utilizando 10 ,ug de ADN plasmídico por 6x105 células numa placa de 100 mm utilizando o método do DEAE-dextrano descrito por Cullen. Veja-se "Use of Eukaryotic Expression Technology and the Functional Analysis of Cloned Genes," Methods Enzvmol.. 152:684-704 (1987). Transfectaram-se em paralelo culturas de células COS com pCDM8 contendo um ADNc que codifica o receptor de angiotensina II de rato, AT,. As membranas de células COS transfectadas com ADNc de HAP, mas não as células COS transfectadas com ADNc de receptores angiotensina, apresentaram ligação específica de alta afinidade de His1, 125l-Tyr10, Nle27 GHRH(1-29)NH2 humana. Com referência às Figuras 15 e 16, ilustram-se a ligação de GHRH iodada a membranas de células COS transfectadas com pCDM8 contendo o ADNc de HAP 7, e a ligação de GHRH iodada a membranas transfectadas com pCDM8 contendo um ADNc que codifica o receptor de angiotensina II de rato, e compara-se esta ligação com a ligação de GHRHa na presença de várias concentrações de péptidos competidores. A Figura 15 é baseada num número mais baixo de amostras, e devido a um alto ruído de fundo, parece que o GRF 2 nM desloca uma maior quantidade de 125I-GRF do que GRF 10 nM. Contudo, o maior número de amostras reflectidas em cada ponto de dados na Figura 16 mostra uma correlação directa entre a concentração de péptido competidor adicionado e a diminuição das contagens totais ligadas de análogo de GRF iodado.
86 046
EP 0 591 697/PT 46 A Figura 16 ilustra que o PACAP competiu para a ligação com GHRH iodada, embora a concentrações muito superiores (Ki de aproximadamente 30 nM). A ligação de GHRH iodada não foi afectada por 100 nM de outros péptidos, incluindo VIP, secretina, glucagon, calcitonina, galanina, hormona paratiróide, péptido gastrointestinal, PHM, e somatostatina, ou um μΜ de péptido de libertação da hormona do crescimento. Uma vez que a GHRH não se liga às células COS de controlo transfectadas com o gene que codifica para angiotensina, é evidente que a ligação de GHRH nas células COS transfectadas com pCDM8 contendo o ADNc de HAP 7 é devida à expressão de proteína pelo ADNc de HAP 7. Adicionalmente, a actividade de ligação específica de GHRH demonstrada nas Figuras 1 5 e 1 6 ilustra que a proteína produzida por expressão do gene de HAP 7 tem todas as caracteíísticas de ligação de um GHRH-R. A Figura 1 7 mostra a ligação e o deslocamento do mesmo análogo de GHRH em membranas de pituitária de ovino. Estes dados deram um KD para a ligação de GHRH na pituitária de 0,2 nM. A comparação com a Figura 16 sugere que é induzido um local de alta afinidade comparável nas células COS transfectadas, mas que alguns dos locais podem ter menor afinidade. Isto é esperado porque a abundância de proteínas G em células transfectadas é provavelmente insuficiente para permitir o completo acoplamento do receptor, mas isto pode também ser devido a alguns outros factores no sistema de expressão artificial de células COS. O PACAP, mas não o VIP, apresentou um deslocamento significativo de GHRH em pituitária de ovino a 500 nM e 1 M.
Existem várias evidências que confirmam que foi clonado um gene de GHRH-R: O peso molecular da proteína codificada pelo gene clonado concorda estreitamente com os resultados de reticulação de fotoafinidade do receptor de GHRH de pituitária de ovino, que apresentava um tamanho de cerca de 42 kDa após desglicosilação. A sequência de aminoácidos do receptor apresentada como SEQ ID N0:10 inclui 423 resíduos de aminoácido. Se os primeiros 22 resíduos de aminoácido forem um péptido de sinal que é removido por processamento na célula, isto deixa uma proteína de 401 aminoácidos com um peso molecular de aproximadamente 44 kDa, o que concorda estreitamente com o tamanho determinado na reticulação de fotoafinidade nos estudos de desglicosilação anteriores. 47 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ A sequência da proteína codificada pelo gene clonado inclui possíveis domínios de transposição da membrana que exibem uma assinatura de hidropatia de um receptor ligado a proteína G. Por exemplo, a Figura 18 é uma representação da hidropatia da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e a Figura 19 uma representação da hidropatia da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, ambas possuindo sete possíveis regiões transmembranares. Os gráficos são preparados determinando a média dos ciclos das polaridades de 9 resíduos de aminoácido; os pontos abaixo da linha central horizontal reflectem porções polares ou hidrófilas da proteína, enquanto as porções acima da linha indicam porções não polares ou hidrófobas da proteína que servem provavelmente como segmentos transmembranares. A Tabela 1 que se segue ilustra a percentagem de identidade de resíduos de aminoácido encontrada em sequências de receptores que se crê serem semelhantes a GHRH-R (e.g., de VIP e de secretina) através de um algoritmo de correspondência em computador, conhecido como FASTA. Veja-se Pearson et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA.. 85:2444-2448 (1988)
TABELA I
PERCENTAGEM DE IDENTIDADE DE AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS RECEPTORAS SELECCIONADAS COM HAP 7.3 EM REGIÃO DE SOBREPOSIÇÃO SELECCIONADA POR COMPUTADOR VIP Secretina Calcitonina PTH HAP 7.3 47% 42% 35% 28%
Sobreposição 387 pb 388 pb 262 pb 367 pb
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
TABELA II
PERCENTAGEM DE IDENTIDADE DE RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS EM RECEPTORES QUE SE CRÊEM SER SEMELHANTES A GHRH-R
Transmembranas de receptor TM5, TM6 e TM7 PTH SEC VIP HAP CTR 49% 43% 45% 45% PTH 52% 60% 57% SEC 73% 68% VIP 73% A Tabela II demonstra que o gene clonado a partir de HAP é ligeiramente mais semelhante ao receptor de VIP do que o receptor de secretina, e menos semelhante aos receptores de PTH e calcitonina (e.g., tem homologia significativa com outros receptores ligados a proteína G).
Do precedente, é evidente que um gene que codifica para uma proteína com actividade de GHRH-R foi clonado e expresso.
Assim, a presente invenção envolve a solubilização, a purificação, e a sequenciação proteica de um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento e seus fragmentos biologicamente activos, e também envolve a clonagem de um gene que codifica para um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento e seus fragmentos biologicamente activos. Numa concretização preferida, a sequência de nucleótidos do receptor obtida a partir de uma biblioteca de ADNc de tumor de pituitária acromegálica humana, é inserida num vector, tal como, mas não se lhe limitando, um plasmídeo pBluescript; este plasmídeo é utilizado para transformar uma célula hospedeira adequada, tais como bactérias numa cultura viável; por exemplo, as bactérias depositadas na American Type Culture Collection em Rockville, Maryland com o Número de Acesso ATCC 69058. As bactérias depositadas na ATCC podem ser obtidas, a sequência de nucleótidos para um receptor de GHRH pode ser excisada do plasmídeo bacteriano utilizando endonucleases de restrição, por exemplo, mas sem limitação, Xbal e Xhol, e a sequência de nucleótidos pode 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 49
ser utilizada para expressar a proteína noutro organismo ou linha de células, tais como, mas não se lhes limitando, células COS. Assim, as bactérias transformadas depositadas na ATCC (com o Número de Acesso 69058) são úteis para posterior clonagem da sequência de nucleótidos que codifica um receptor de GHRH, e a sequência de nucleótidos que codifica um receptor de GHRH pode ser utilizada para expressar a proteína, que pode ser utilizada para a pesquisa de várias drogas que interagem com receptores ligados a proteína G, tais como o GHRH-R, e pode também ser utilizada para os tratamentos terapêuticos supramencionados. A partir dos ensinamentos anteriores, é aparente que são possíveis muitas modificações e variações da presente invenção. Como exemplo não limitante, está contemplado que outros complexos de GHRH-R em amostras de pituitária em bruto se possam ligar a colunas de afinidade de modo a produzir GHRH-R purificado. Entende-se portanto que a invenção pode ser colocada em prática de um modo que não o especificamente descrito. (Segue Listagem de Sequências)
86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 50
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Thorner, Michael O.
Gaylinn, Bruce D.
Lynch, Kevin R.
Harrison, Jeffrey K.
(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO, E SEQUENCIAÇÃO PROTEICA DO RECEPTOR DE HORMONA DE LIBERTAÇÃO DA HORMONA DO CRESCIMENTO E CLONAGEM DE UM GENE QUE CODIFICA PARA O RECEPTOR DA HORMONA DE LIBERTAÇÃO DA HORMONA DO CRESCIMENTO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:
(A) ENDEREÇO: MASON, FENWICK & LAWRENCE (B) RUA: 1225 I Street, N.W., Suite 1000 (C) CIDADE: Washington (D) ESTADO: D.C. (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 20005 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete
(B) COMPUTADOR: Compatível com PC IBM
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MA-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDOS ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: us 07/902 826 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 23 de Junho de 1992
(viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: 0'Shaughnessy, Brian P. (B) NÚMERO DE REGISTO: 32 747 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/DOSSIER: 1084/81-1365 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 202-289-1200 (B) TELEFAX: 202-289-6674 (C) TELEX: 248516 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: GCAACAGTGG GCGGAGCATG CTCAGC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: GGCGCCTTGC TGCAGCCTCA GATGAT 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: AAGGTCATGT ACACTGTAGG CTA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:4: AGCGGGAACT CTTGAAGGTG CCA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: 30
CCAATACTGA GACTGGGTAT GGAGGCTGCC
(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: GGAAACTGGA GCCAGCTCAG GGCAGCCTCC 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1257 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: ATGGACCGCC GGATGTGGGG GGCCCACGTC TT CTGCGTGT TGAGCCCGTT ACCGACCGTA 5G TTGGGCCACA TGCACCCAGA ATGTGACTTC ATCACCCAGC 7GAGAGAGGA TGAGAGTGCC 120 TGTCTACAAG CAGCAGAGGA % O n n $ o ACCACCCTGG GCTGCCCTGC GACCTGGGAT . 130 GGGCTGCTGT GCTGGCCAAC GGCAGGCTCT GGCGAGTGGG TCACCCTCCC CTGCCCGGAT 240 TTCTTCTCTC ACTTCAGCTC AGAGTCAGGG GC7GTGAAAC GGGATTGTAC TATCACTGGC 300 TGGTCTGAGC TTACCCTGTG GCCTGCCCTG TGCCTCTGGA gctgctggct 360 i 1 CrTACTTCTC CACAGTGAAG 1 1 CCGTGGGCCA TAGCATCTCT 420 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 54
CATCACCATC CTGGTTGCTC GCTGTTCACC ACTTTTATCC CCACAGGGAC GACACTGACC CGCCTCCCAT TTCGCCACCA WUUW·
TCAGGAGGCT CCACTGCCCC TCAAGGCGGG AGCTGTGTTC ACTGCAGCTT CICCACTGTT TGACCAACTT CAGCTGGCTG CCTCCCCCAG CTCAAGGAGA TGCTCTTCAC TGGCACGTGG
ATTGTAGCCC TCTTCGTGGC CGGAACTACG TCCACACCCA CTGAAGGATG CTGCCCTTTT CTATGCAAGG TCTCTGTGGC TTGGCAGAAG CCGTCTACCT GCCTTCTGGT GGCTGGTTCT GTGAGCTGCA TACTGGTGGA CTCAATATTA ÍV.WCW1* L» w « CAGTCTCAGT λ n^mz·* Λ - - -w. CACTACATCA (2AACrnm GAGCTGGGAC r,GGG'^mC^'T,rn CAAGAGGT GA uuaU — — GCCTGGAGGA Lvw<J. -J^-ΛΛ
CGAGGAGATC GCGTGCTGGG GCCCATTGTC CTCTCGGTCG GGTGAGGAAA CTGSAGCCAG CTCCAAGTCG ACACTTTTCC CCTGCCAGAC AATGCTGGCC CCAGGGCTTC ATTG7TGCCA CTCACGGAAG TGGCAGGGCC
W « w<w A
w ^ usjàL <jA CACCTCCCCC GGGTGAACTT TGGGCTTTTT CTCAGGGCAG CCTCCATACC ‘^SAm C /-rCACT’ CTTTGGAATT • ^USJWi.UwU CCTCCCCCTG CTTCCTCAAC ATGACCCTGA GCTTCTGCCA GTGCTGA 430 540 500 550 720 73 G 340 300 = 50 10 2 0 1030 114 0 1200 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 418 pares de bases (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:
Met « Asp Arg Arg Meu 5 Tm Gly Ala His vai 10 Phe cys Vai Leu Ser 15 Pro Leu Pro Thr Vai 20 Leu Gly His Met His 25 Pro Glu Cys Asp Phe 30 Ile Thr Gin Leu Arg 35 Glu Asp Glu Ser Ala 40 Cys Leu Glu Ala Ala 45 Glu Glu Het ?ro Asn 50 Thr Thr Leu Gly Cys 55 Pro Ala Thr Trp Aso 60 Gly Leu Leu Cys Trp 55 Pro Thr Ala Gly Ser Gly 70 Glu Trp Vai Thr 75 Leu Pro Cys Pro ASO 30 ?he ?he Ser His Phe 35 Ser Ser Glu Ser Gly 90 Ala Vai Lys Arg Asp 95 cys 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 55 ΤΪ1Γ XLe mu-*- Gly iOÔ TrO Ser Glu Pro Pro Vii Pro 115 Lau GlU Ala 120 Vai Lys 12 0 Ila Ila Tyr Thr Vai 135 Gly ?ha Vai Ala Ile mu -*· Ile Lau Vai 150
Arg Asn Tyr Vai His Thr -Gin Lau 155
Gly Ala vai Phe 130 Lau Lvs Asp Ala Asp His Cys 135 Ser Phe Ser Vai 200 3ar His 210 Phe Ala Thr He” mu — 215 Asn vai Tyr 225 Lau Asn •Cvs Lau 220 Lau Ala Ala Phe — | -1 t Irp Lau Vai 245 Lau Ala Thr Gly nv- Trp 2 50 Vai Ser CVS _y s Trp Asp Lau 275 Asp Asp Thr Ser Pro 230 Ila Vai 250 Lau Ser Val Gly Val 255 Asn Arg Ila 305 Lau Vai Arg Lys 310 Lau Glu Gin Ser Gin Tyr Tm Arg 325 Lau Ser Leu Phe Gly Ile 340 His Tyr Ile Ile Glv Lau Gly 355 Ile Arg Leu Pro Leu 360 Gly Phe 370 lie Vai Ala lie Leu 375 Thr Glu 335 Ile Ser Arg Lys 390 Trp His
Phe 105 ?ro Pro Tyr Pro Vai Ala 110 Cys Glu Glu Glu Sar Tyr 125 Pha Ser Thr His Ser Ila Sar Ile 140 Vai Ala Lau Ala Lau Arg 15 5 Arg Lau His Cys Pro 150 Phe íJIU — 170 — Phe Ile Lau Lys 175 Ala Ala 135 Lau ?hs His Ser Asp Asp ISO Thr Lau CVS Lys Val Ser 205 Val Ala Ala Pha Ser Trp Lau Lau 220 Ala Glu Ala 3 ar mu — Sar 22- Pro Sar Sar Arg > —— 240 Gly m—» Giy Leu Pro Val Lau pHô 2=0 255 lau 255 Ala Phe Glu Asp Ila 27 0 Ala Cys Tyr Trp Tm Ile Ile 235 Lys Gly Pro Pha Gly Lau Phe 300 Lau Asn Ila Ile Pro Ala Gin 315 Gly Ser Leu His Thr 320 Lys Ser 320 Thr Leu Phe Leu Ila 335 Pro Phe 345 Asn Phe Leu Pro Asp 350 Asn Ala Glu Leu Gly Leu Gly 365 Ser Phe Gin Cys Phe Leu Asn 380 Gin Glu Val Arg Gly His Asp 395 Pro Glu Leu Leu Pro 400 56 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
Ala Trp Arg Thr Arg Ala Lys Trp Thr Thr ?ro Ser Arg Ser Ala Gin 405 * 410 415
Arg Cys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1272 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: Λ-. ~ w ^iUUVJU £· λ λ/*#·· y«· « jn^v-w—. ACCGACCGTA 50 r*Λ _ aVJV7V,'«AWl TGCACCCAGA ATCACCCAGC TGAGAGAGGA TGAGAGTGCC 120 CAGCAC-AGGA ^ m >* ^ » ^ \^Λ— «JUwvAAU .nLs^i^ww«uvj λ λ wv» GACCTGGGAT j. 3 G GGGCTGCTGT GCTGGCCAAC Z^ Z· Z«* % Z» ^ ΛίΤΙ/ IW · V* _ *aUw>.· Ww CTGCCCGGAT :tu ,-πγπ ^ ACTTCAGCTC R Z» ^ Z* z· GCTGTGAAAC /·* — 'nS-AU T GAC*^ GGC 2 00 mr* ^ _ V» i-rrm> £z^z^m/~^^ L-Uv-w·'»*.- J· '«JS» « « USJV. ^ 250 ^ m Lr CAtli« .λ* ^ ^ y<· ·—Λ » Λ Λ T ώ «, W « — w«7 i» ;>JV7V. zr·^ m £ zr ^ mz·*-nmr ^fnzR « «Ljv· « w mr*·* ^ Λ. f*** '“'Ti « W^WVJnbNJS» « ^.S^AW « * 2 Λ *τ Ο ν U ^ CAA U «. A V» «J TCGACACCCA z^zr - sj — - <-*AW <·. TCAAGGCGGG ^GC^G^G^111 *C Ζ vJ w · jaaWua. -j CTGCCGTTTT wWlUlW^^AÍ GACACTGACC ACTGCAGCTT W*Uwit*J4· 5CC TATGCAAGG ζ·»ζ^ f*r*rr\r+** ^ * m Luv«w· ^ ^ ^ «-· ^ 0 ^ ^ TGACCAACTT LaIJV» ·. S3V7N· « 550 TTGGCAGAAG > /—ws/* uÀAU. w . w CTGGCCTCCA CTGAAGGAGA 720 f>JV»w- · W _ «*V7 « GGCTGGTTCT •JSJUW· s»*J TGCTCTTCAC TGGCACGTGG 730 GTGAGCTGCA AACTGGCCTT CGAGGACATC GCGTGCTGGG ACCTGGACGA CACCTCCCCC 340 TACTGGTGGA TCATCAAAGG GCCCATTGTC CTCTCGGTCG GGGTGAACTT TGGGCTTTTT 900 CTCAATATTA TCCGCATCCT GGTGAGGAAA CTGGAGCCAG CTCAGGGCAG CCTCCATACC 950 CAGTCTCAGT ATTGGCGTCT CTCCAAGTCG ACACTTTTCC TGATCCCAC7 CTTTGSAATT 1020 GACTACATCA TCTTCAACTT CCTGCCAGAC AATGCTGGCC TGGGCATCCG CCTCCCCCTG 1030 GAGCTGGGAC TGGGTTCCTT CCAGGGCTTC ATTGTTGCCA TCCTCTACTG CTTCCTCAAC 1140 CAAGAGGTGA GGACTGAGAT CTCACGGAAG TGGCATGGCC ATGACCCTGA GCTTCTGCCA 1200 12 57 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
GCCTGGAGGA CCCGTGCTAA GTGGACCACG CCTTCCCGCT CGGCGGCAAA GGTGCTGACA TCTATGTGCT AG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 423 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:
Hat: As? Arg Arg ver 5 Gly Ala His Vai 10 Phe Cys Vai Leu Ser Pro leu Pro m.» Vai 20 Leu Glv His Me~ His 4 2 Pro Glu Cys As? phe 30 lie •τα,·— Gin Leu Arg 5 S Glu As? Glu Ser Ala 40 Cys Leu Gin Ala Ala 45 GlU Glu Heu Pro Asn 50 Tlir Leu t* vxy Cys Pro Ala Ti*—, _ w As? 50 Gly Leu Leu Cys Pro ·τιν·« Ala Gly Ser 70 Gly Glu Iro Vai mu·»· Leu Pro Cys Pro As? 30* Pha Phe Ser His Phe 35 Ser Ser Glu ca>- Gly 90 Ala vai Lys Arg Aso 95* Cys TTU — lie Thr Gly 100 Ir? Ser Glu Pro Phe 105 Pro Pro Tyr Pro Vai 110 Ala Cys Pro Vai Pro 115 Leu GiU Leu Leu Ala 120 GiU Glu Glu Ser ""yr 125 Phe Ser Thr Vai Lys 13 0 Ile lie Thr Vai Gly His Ser Ile Ser 140 Ile Vai Ala Leu Phe 145 Vai Ala Ile Τ1ΐ2Γ Ile 150 Leu Vai Ala Leu Arg Arg 155 Leu His Cys Pro 160 Arg· Asn Tyr Vai His 165 Thr Gin Leu Phe Thr 170 Thr Phe Ile Leu Lys 175 Ala Glv Ala Vai Phe ISO Leu Lys As? Ala Ala 135 Leu Phe His Ser As? 190 As? Thr As? His Cys 195 Ser Phe Ser Thr Vai 200 Leu Cys Lys' Vai Ser 205 Vai Ala Ala Ser His 210 Phe Ala Thr Met 21w Asn Phe Ser Tr? Leu 220 Leu Ala Glu Ala ί 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ
Vai 225 Tyr Leu Asn Cys Leu 220 Leu Aia Ser Thr Ser 22 5 Pro Ser Ser Arç Arg 240 Ala Phe Tm Ti"3 Leu 245 Vai Leu Aia Giy Tm 250 Giy Leu Pro Val Leu 255 Phe Thr Giy Tíir Trp 2 50 Vai Ser Cys Lys Leu 255 Ala Phe Giu Asp Tle 270 Ala Cys Trp Asp Leu 275 Asp Asp Thr Ser Pro 230 Tyr Trp Trp lie lie 235 Lys Giy Pro lie Vai 290 leu Ser Vai Giy Vai 295 Asn Phe Giy Leu Phe 200 Leu Asn. lie lie λΓ^ 305 lie Leu Vai Arg Lys 210 Leu Giu Pro Aia Gin Giy Ser Leu His Thr 320 Gin Ser Gin Tvr m-***m, 225 Arg Leu Ser Lys Ser 230 Leu Phe Leu Tle 225 Pro Leu ?he Giy lie 240 His lie XXâ Phe “i A 2? Asn Pile Leu Asp 350 Asn Aia ! C-iy Leu Giy lie Arg Leu Leu 260 Giu Leu Giy Leu ± 7 3 65 Ser Phe Giy Phe 370 Vai Ai a X Lâ Leu Tvr Cys Phe Leu Asn 330 Gin uiU Val Aro TTU, * 235 Giu lie Ser Arg Lys 3 90 —, ·,Ί- His Giy His Asp 3 35 Pro Giu Leu Leu Pro 400 Ai a Tm Arg Arg 405 Ai a Lys Trp Tíir À4A*· 410 Pro Ser Arg Ser Ala 415 Aia Lys Vai Leu 'Thr Ser Mer Cys 420
Lisboa, ?» » 2001
Por The University of Virgínia Patent Foundation e American Cyanamid Company
O ADJUNTO - O AGENTE OFICIAL-
Eng.° ANTÓNIO JO&O DA CUNHA FERREIRA Ag. 0|. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.® 1200-195 LISBOA

Claims (12)

  1. 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico isolada e purificada, que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.
  2. 2. Molécula de ácido nucleico isolada e purificada possuindo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:7 que codifica um receptor da hormona de libertação da hormona do crescimento.
  3. 3. Vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico possuindo a sequência de acordo com a reivindicação 2.
  4. 4. Célula hospedeira compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 3.
  5. 5. Célula hospedeira compreendendo uma molécula de ácido nucleico possuindo a sequência de acordo com a reivindicação 2.
  6. 6. Molécula de ácido nucleico isolada e purificada que codifica um polipéptido possuindo actividade biológica de receptor de hormona de libertação da hormona do crescimento possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8, em que a referida actividade é a ligação de hormona de libertação da hormona do crescimento.
  7. 7. Vector de expressão compreendendo a molécula da ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, em que a referida molécula de ácido nucleico está presente num vector capaz de se propagar numa célula procariótica ou eucariótica.
  8. 8. Escherichia coli compreendendo o vector de expressão de acordo com a reivindicação 7.
  9. 9. Célula de macaco transformada com SV-40 compreendendo o vector de expressão de acordo com a reivindicação 7.
  10. 10. Método para produzir de forma recombinante um receptor de hormona de libertação da hormona do crescimento possuindo a sequência de 86 046 ΕΡ 0 591 697/ΡΤ 2/2 aminoácidos de SEQ ID NO:8, compreendendo a transfecção do vector de expressão de acordo com a reivindicação 7 para uma célula hospedeira, a cultura da célula hospedeira transfectada sob condições que permitam a expressão do receptor e a recuperação do receptor.
  11. 11. Células DH5a transfectadas depositadas na American Type Culture Collection e a que foi atribuído o Número de Acesso ATCC 69058.
  12. 12. Sonda de ADN isolada e purificada para utilização na pesquisa de moléculas de ácido nucleico que codificam para polipéptidos possuindo actividade de ligação à hormona de libertação da hormona do crescimento, seleccionada de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6. Lisboa, AGOL 2001 Por The University of Virgínia Patent Foundation e American Cyanamid Company m\mo - O AGENTE OFICIAL/^
    Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA
PT93114519T 1992-09-15 1993-09-09 Clonagem e caracterizacao do receptor da hormona de libertacao da hormona do crescimento PT591697E (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/946,232 US5591641A (en) 1992-06-23 1992-09-15 Nucleic acid encoding the growth hormone releasing hormone receptor
US07/947,672 US5612470A (en) 1992-06-23 1992-09-18 Nucleic acid encoding the growth hormone releasing hormone receptor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT591697E true PT591697E (pt) 2001-11-30

Family

ID=27130233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT93114519T PT591697E (pt) 1992-09-15 1993-09-09 Clonagem e caracterizacao do receptor da hormona de libertacao da hormona do crescimento

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0591697B8 (pt)
JP (1) JP3393159B2 (pt)
KR (1) KR100342153B1 (pt)
AT (1) ATE202141T1 (pt)
AU (1) AU673188B2 (pt)
DE (1) DE69330329T2 (pt)
DK (1) DK0591697T3 (pt)
ES (1) ES2159512T3 (pt)
GR (1) GR3036486T3 (pt)
IL (1) IL106860A (pt)
NZ (2) NZ272688A (pt)
PT (1) PT591697E (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2634926B2 (ja) * 1990-04-19 1997-07-30 シャープ株式会社 かな漢字変換装置
US5852187A (en) * 1992-06-23 1998-12-22 The University Of Virginia Patent Foundation Molecular cloning of the ovine pituitary growth hormone releasing hormone receptor
US5973114A (en) * 1992-06-23 1999-10-26 The University Of Virginia Patent Foundation Isolation and characterization of the growth hormone releasing hormone receptor
AU2003238032A1 (en) * 2002-06-24 2004-01-06 Bayer Healthcare Ag Regulation of human growth hormone-releasing hormone receptor

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ238748A (en) * 1990-06-29 1993-09-27 Hoffmann La Roche Growth hormone releasing factor (grf) analogues
US5288621A (en) * 1990-12-14 1994-02-22 Cornell Research Foundation, Inc. Pituitary TRH receptor
US5225543A (en) * 1991-03-28 1993-07-06 American Cyanamid Company Receptors method for purification of g protein-linked
US5973114A (en) * 1992-06-23 1999-10-26 The University Of Virginia Patent Foundation Isolation and characterization of the growth hormone releasing hormone receptor
WO1994007915A1 (en) * 1992-09-28 1994-04-14 Northwestern University New growth hormone releasing hormone receptor protein

Also Published As

Publication number Publication date
EP0591697B8 (en) 2001-11-14
KR940007181A (ko) 1994-04-26
NZ248602A (en) 1996-06-25
DE69330329D1 (de) 2001-07-19
DE69330329T2 (de) 2002-01-03
EP0591697B1 (en) 2001-06-13
DK0591697T3 (da) 2001-08-27
KR100342153B1 (ko) 2002-11-22
IL106860A (en) 1999-08-17
JP3393159B2 (ja) 2003-04-07
EP0591697A3 (en) 1994-11-23
NZ272688A (en) 1997-07-27
ES2159512T3 (es) 2001-10-16
JPH0769916A (ja) 1995-03-14
AU4734093A (en) 1994-03-24
GR3036486T3 (en) 2001-11-30
IL106860A0 (en) 1993-12-08
AU673188B2 (en) 1996-10-31
ATE202141T1 (de) 2001-06-15
EP0591697A2 (en) 1994-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5874243A (en) OLRCC15 receptor
Ohki-Hamazaki et al. Cloning and expression of the neuromedin B receptor and the third subtype of bombesin receptor genes in the mouse
US5583010A (en) Nucleic acid molecule encoding the porcine growth hormone receptor
WO1992017602A1 (en) Parathyroid hormone receptor and dna encoding same
JP2000060578A (ja) 新規ｇ―タンパク質結合レセプタ―（ｈｆｇａｎ７２ｘ）
JPH10327889A (ja) 新規ｇ−タンパク質結合レセプター（ｈｆｇａｎ７２ｙ）
JPH1156377A (ja) Ｇタンパク質共役型受容体ｈｆｉａｏ４１
US5591641A (en) Nucleic acid encoding the growth hormone releasing hormone receptor
JP2003524370A (ja) ヒト受容体ｇｐｒ１４、並びにヒトおよびラットｇｐｒ１４に対するアゴニストおよびアンタゴニストの探索方法
JPH11169187A (ja) 新規化合物
US5852187A (en) Molecular cloning of the ovine pituitary growth hormone releasing hormone receptor
PT591697E (pt) Clonagem e caracterizacao do receptor da hormona de libertacao da hormona do crescimento
US6965013B2 (en) Intermedin and its uses
EP0576988B1 (en) Isolation and characterization of the growth hormone releasing hormone receptor
US5612470A (en) Nucleic acid encoding the growth hormone releasing hormone receptor
US5644046A (en) Cloning of a gene encoding for the growth hormone releasing hormone receptor
JPH09509066A (ja) Ｃｒｆ受容体のクローニングと組換え体産生
WO2000058462A1 (fr) Nouvelles proteines de recepteur couplees aux proteines de liaison a la guanosine triphosphate (gtp), bg3
JPH1175866A (ja) マウスＦｒｉｚｚｌｅｄ−６ 遺伝子に類似したヒト７ＴＭ受容体
US20050142135A1 (en) Agents and methods for modulating interactions between gonadotropin hormones and receptors
EP0604224A1 (en) Porcine GRF receptor
Bullock Molecular characterization of a constitutively active mutant dopamine D2 receptor and two prokineticin receptors
Davis Characterization of the mouse prolactin receptor and its interaction with wildtype and mutant hormones
US20090018071A1 (en) Epididymis-specific receptor protein