JPH0769916A - 成長ホルモン放出ホルモン - Google Patents

成長ホルモン放出ホルモン

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JPH0769916A JP5263175A JP26317593A JPH0769916A JP H0769916 A JPH0769916 A JP H0769916A JP 5263175 A JP5263175 A JP 5263175A JP 26317593 A JP26317593 A JP 26317593A JP H0769916 A JPH0769916 A JP H0769916A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、成長ホルモン放出ホルモンリセプ
ターの精製と性状解析に有用な方法と組成物、および成
長ホルモン放出ホルモンリセプターをコードする遺伝子
のクローニングに関する。 【構成】 成長ホルモン放出ホルモンリセプター（ＧＨ
ＲＨ）は、ヨード化ＧＨＲＨプローブを用いるユニーク
な結合測定法により性状解析される。ＧＨＲＨ−Ｒ／Ｇ
ＨＲＨ複合体の可溶化と特異的に結合したＧＨＲＨの強
くない界面活性剤溶液による抽出の後、親和性クロマト
グラフィーにより、精製されたＧＨＲＨ−Ｒ単離物を
得、これを電気泳動して、配列決定に充分な純度のＧＨ
ＲＨ−Ｒを得る。 ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子を、細菌性宿主を用いてクロー
ニングし、クローン化した遺伝子を哺乳動物細胞株中で
発現する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は米国特許出願０７／９０２，８２
６号（１９９２年６月２３日出願）の一部継続出願であ
る。
【０００２】
【発明の分野】本発明はホルモンリセプターの単離、性
状解析および産生に関し、さらに詳しくは成長ホルモン
放出ホルモンリセプターの精製と性状解析に有用な方法
と組成物、精製された成長ホルモン放出ホルモンリセプ
ターの単離と配列決定、成長ホルモン放出ホルモンリセ
プターまたは生物活性のあるその断片をコードする遺伝
子のクローニング、成長ホルモン放出ホルモンリセプタ
ーまたは生物活性のあるその断片をコードする組換えＤ
ＮＡを有する生きている細胞株、および成長ホルモン放
出ホルモンリセプターまたは生物活性のあるその断片を
産生する方法に関する。
【０００３】
【発明の背景】成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）
は視床下部から分泌され、下垂体前葉からの成長ホルモ
ン（ＧＨ）の放出を刺激する。ＧＨＲＨは、グルカゴ
ン、セクレチン、ＶＩＰ（血管作動性小腸ペプチド）
ＰＨＩ（ペプチドヒスチジンイソロイシン）、ＰＡＣＡ
Ｐ（下垂体性アデニレートサイクラーゼ活性化ペプチ
ド）、ＧＩＰ（胃抑制ペプチド）、およびヘロデルミン
（ｈｅｌｏｄｅｒｍｉｎ）を含む同族ペプチドのファミ
リーの一員である。ＧＨＲＨは広く研究されているがＧ
ＨＲＨリセプター（ＧＨＲＨ−Ｒ）（ＧＨＲＨは下垂体
前葉でＧＨＲＨ−Ｒに結合してＧＨの放出を誘導する）
についてはほとんど知られていない。
【０００４】クローン化ＧＨＲＨリセプターの大規模製
造は多数のＧＨＲＨ類似体のスクリーニングを可能に
し、成長疾患の臨床的治療における改良されたアゴニス
トやアンタゴニストの開発を促進するであろう。さらに
詳しくはＧＨＲＨ活性に対する多数の類似体や生体異物
のスクリーニングは、成長ホルモン欠損児童の臨床的治
療や、成人の栄養状態の改善や身体組成（筋肉対脂肪）
を変化させるための臨床治療に使用される、改良された
アゴニストの開発につながる。おそらくはリセプターの
構造に基づくコンピューターモデルに支援されるこのよ
うなスクリーニングはまた、例えばミルクの産生増加法
や脂肪の少ない家畜の収率増加法を開発するなどの、医
学や獣医学分野で特に有用な、経口的に活性のある非ペ
プチド性ＧＨＲＨアゴニストの開発を可能にするであろ
う。
【０００５】ＧＨＲＨ−Ｒと相互作用する薬剤の商業的
利用法では、純粋な型のＧＨＲＨ−Ｒのソースや適切な
結合測定法が必要である。
【０００６】ＧＨＲＨリセプターの単離とクローニング
およびそのインピトロでの発現により、（１）体内のＧ
ＨＲＨリセプターの分布をマッピングするためのｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究、および下垂体以
外でのその生理学的意義の可能性の試験（これはこのペ
プチドが濃縮されていると考えられている脳、生殖器、
膵臓、胎盤および消化管中のＧＨＲＨの役割の可能性を
明らかにするかも知れない）、（２）特異的に調整され
たアゴニスト／アンタゴニスト分子の追跡のための、構
造／機能相関や第２のメッセンジャー相互作用を調べる
ための突然変異したリセプターまたはキメラリセプター
に関するリセプター構造の研究、（３）特にグルカゴン
／セクレチン／ＶＩＰファミリーにおける、他のＧ−蛋
白結合リセプターに対するＧＨＲＨ−Ｒの進化適関係の
理解、（４）配列類似性を有すると考えられるこのサブ
ファミリーの他のメンバーのクローニングを可能にす
る。
【０００７】機能性リセプタークローンを得るには、以
下のようないくつかの経路がある。Ａ．部分的蛋白配列
を得るためのリセプター蛋白の精製；この部分的蛋白配
列は次に、対応するヌクレオチド配列に適切なＤＮＡを
スクリーニングするためのプローブを作成するのに使用
される。Ｂ．ＧＨＲＨリセプターに関連すると考えられ
る既知のリセプターに類似の配列についてＤＮＡのスク
リーニング。Ｃ．蛋白として発現された時ＧＨＲＨリセ
プターを生成するＤＮＡのスクリーニング（このＧＨＲ
Ｈリセプターは、ＧＨＲＨ結合、生物活性、またはＧＨ
ＲＨリセプター抗体により検出されるであろう）。ＧＨ
ＲＨリセプターを同定し発現されたクローンを性状解析
するのに、いかなる考え得るクローニング法においても
ＧＨＲＨと関連ペプチドを用いる結合測定法や機能的測
定法が必要であることに注意しなければならない。
【０００８】残念ながら下垂体性リセプターの精製は、
組織中の量が少ないこと、そしてリセプターを活性型で
可溶化し、効率的な精製法の開発が難しいことなどによ
り、非常に困難である。たとえリセプター蛋白が単離さ
れても、下垂体組織中の濃度が低く、ＧＨＲＨ−Ｒリセ
プターをコードする遺伝子のＤＮＡプロープを産生する
のに充分な部分的蛋白配列決定を実施するための多量の
リセプターを充分に産生させることは、きわめて難し
い。さらにＧＨＲＨ−Ｒリセプターはグリコシル化され
ている考えられているため細菌が生物活性のあるリセプ
ターまたはその断片を発現することは不可能かも知れな
い。
【０００９】従ってＧＨＲＨ結合測定法に対するニーズ
や、その測定法中で使用される、ＧＨＲＨリセプターを
性状解析し単離するのに有用な組成物に対するニーズが
存在する。特にリセプター蛋白を精製しリセプタークロ
ーンを同定する方法が開発できるように、リセプター
（ＧＨＲＨ−Ｒ）−リガンド（ＧＨＲＨまたはＧＨＲＨ
類似体）複合体のサイズ、グリコシル化、可溶性および
安定性の点で下垂体性ＧＨＲＨリセプターを性状解析す
ることができる方法に対するニーズがある。また精製さ
れたまたは部分的に精製されたＧＨＲＨ−Ｒに対するニ
ーズおよびこれを得るための方法に関するニーズがあ
る。部分的に精製されたＧＨＲＨ−Ｒとは、下垂体前葉
細胞の多くの有機マトリックスから単離されたＧＨＲＨ
−Ｒを有するＧＨＲＨ−Ｒ単離物が形成されることを意
味する。このＧＨＲＨ−Ｒ単離物はＧＨＲＨ−Ｒ配列の
決定を可能にする純度を有するが、これにはスクリーニ
ングを妨害するであろう任意の残存化合物（例えばＧ−
蛋白）を除去するというさらなる精製操作が必要である
ことを理解すべきである。しかし本発明の抽出法や単離
法により産生される本発明のＧＨＲＨ−Ｒ単離物は、下
垂体前葉に自然に存在する濃度より高い濃度でＧＨＲＨ
−Ｒを含有し、このＧＨＲＨ−Ｒは、必要な場合はＧＨ
ＲＨ−Ｒの配列決定を妨害するであろう任意の化合物を
除去することにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてさらに
精製することができる。本発明はまた、ＧＨＲＨ−Ｒの
配列決定、またはＧＨＲＨ−Ｒの結合活性のバイオアッ
セイに使用するのに充分な純度のＧＨＲＨ−Ｒの産生を
包含する。
【００１０】さらにＧＨＲＨ−Ｒまたは生物活性のある
その断片をコードする遺伝子のクローニング法、そして
成長ホルモン放出ホルモンリセプターおよび生物活性の
あるその断片をコードする、単離され精製された核酸配
列に対するニーズがある。またＧＨＲＨ−Ｒの活性を有
する蛋白またはポリペプチドをコードする核酸配列より
なるベクター、宿主細胞、または宿主生物に対するニー
ズがある。
【００１１】ＧＨＲＨは非特異的結合が強く（ＧＨＲＨ
またはＧＨＲＨ類似体が特異的にＧＨＲＨ−Ｒに結合し
ているか否かを決定することが困難になる）、またごく
わずかにしか存在しないため、ＧＨＲＨ−Ｒを扱うこと
は歴史的に困難であった。従来の作業ではＧＨＲＨ類似
体のガラスやプラスチックへの非特異的結合が大きな問
題であり、リセプター結合に関する研究の正確性や再現
性が制限されてきた。陰性に荷電したＧＨＲＨペプチド
の「粘性」のため、単純な濾過タイプの結合測定法は不
可能であった。非特異カウントがあまりにも高すぎ特異
的結合の検出が困難である。さらに一般に使用されるブ
ロッキング剤であるポリエチレニミン（Ｐｏｌｙｅｔｈ
ｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（グラスファイバーフィルターへ
の蛋白の非特異的結合をブロッキングする）は陽性に荷
電しており、ＧＨＲＨ類似体（陰性に荷電している）に
非特異的に結合する。さらにＧＨＲＨ−Ｒを精製するた
めの作業を大きく促進する高結合活性を有する可溶性リ
セプター調整物は入手できない。
【００１２】これまでの研究では、ＧＨＲＨ−Ｒをその
プローブ（例えばＧＨＲＨや関連ペプチド）に対する親
和性、およびＧ−蛋白に対する結合性に関して性状解析
してきた。ＧＨＲＨリセプターを標識するのに非特異的
化学架橋剤を使用することも試みられてきた。例えばザ
イスク（Ｚｙｓｋ）ら、「下垂体前葉細胞における成長
ホルモン放出因子結合蛋白の架橋」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６１：１６７８（１９８６），およびベリ
セレビ（Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｉ）ら、「成長ホルモン放
出因子の下垂体性リセプターへの共有架橋」、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１８：１２７８（１９８６）を
参照。これらの２つの結果はそれぞれ、下垂体前葉に２
６ｋＤａと７０ｋＤａのＧＨＲＨ−リセプターが存在す
ることを示唆している。これらの２つの研究で見いださ
れた分子量の差は、ＧＨＲＨ−Ｒを単離し性状解析する
ことのむずかしさと、ＧＨＲＨ−Ｒを単離し性状解析す
るのに有用な改良された方法と組成物が必要であること
を強調している。
【００１３】ラットの下垂体前葉へのＧＨＲＨの結合
は、ＧＴＰに影讐され、これがＧＨＲＨリセプターのＧ
ＨＲＨへの親和性を低下させる（ＧＴＰはＧ−蛋白ＧＨ
ＲＨ−リセプター複合体の結合をはずすと言われてい
る）。ＧＨＲＨに結合したＧＨＲＨ−Ｒの高親和性状態
は、グアニンヌクレオチド制御蛋白との相互作用で、ホ
ルモン−リセプター−Ｇ−蛋白三重複合体を形成して安
定化されると考えられている。ＧＴＰはＧ−蛋白−リセ
プター相互作用を不安定化させ、ＧＨＲＨ／ＧＨＲＨ−
Ｒ−Ｇ−蛋白複合体の解離を引き起こし、独立したリセ
プターを低親和性状態に戻し、放出されたＧ−蛋白はそ
の第２のメッセンジャー系を活性化するという仮説があ
る。ストルザース（Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ）ら、「ラット
の下垂体リセプターへの成長ホルモン放出因子の結合の
ヌクレオチドによる制御」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ、１２４：２４−２９「１９８９）を参照。
【００１４】ヒツジやウシの下垂体前葉組織では、ＧＨ
ＲＨとその類似体はＶＩＰまたはＰＡＣＡＰより５００
から１，０００倍低濃度のＧＨＲＨ類似体のＧＨＲＨａ
（この調整法は後述）により置換されることが、発見さ
れている。この知見は、ヒトの膵臓（セクレチンとＶＩ
Ｐリセプターのソース）での、ＧＴＰの存在下でアデニ
レートサイクラーゼを刺激する能力はセクレチン＞ヘロ
デルミン＞ＰＨＩ≧ＶＩＰ＞ＧＨＲＨ（１−２７）ＮＨ
２の順である、結合性に相補的なものである。同様に
１２５Ｉ−セクレチンを用いて得られたＫｄは、セクレ
チン０．８ｎＭ、ヘロデルミン２００ｎＭ、ＰＨＩ２５
０ｎＭであった。ＶＩＰとＧＨＲＨ（１−２９）−ＮＨ
２は１０μＭでわずかに２０％の阻害を誘導するのみで
ある。
【００１５】生理学的投与量以上ではＧＨＲＨはＶＩＰ
リセプターとして作用することが知られており、逆にＶ
ＩＰは弱いＧＨＲＨアゴニストである。
【００１６】ホルモンリセプターの単離と性状解析につ
いて背景的情報を与える論文としては以下のものがあ
る。クリストフアー（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ）ら、
「ＶＩＰ／ＰＨＩ／セクレチン−ヘロデルミン／ヘロス
ペクチン／ＧＲＨファミリー：組織膜のパネル中のリセ
プターとアデニレートサイクラーゼに対する、インビト
ロで試験した天然のペプチド、その前駆体および合成類
似体の構造機能相関」、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎ
ｅｓ Ａｓ Ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅｓ： Ｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｎｇ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ジーン・マルチネ（Ｊ
ｅａｎ Ｍａｒｔｉｎｅｚ）編、エリス・ホーウッド・
リン（Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｉｍ。）出版、
チチェスター（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）、英国、１９８
９、チチェスター（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）、英国。ラ
ブルセ（Ｌａｂｕｒｔｈｅ）ら、「血管作動性小腸ペプ
チドリセプターの分子学的解析：ＶＩＰ関連ペプチドの
リセプターとの比較」、ＡｎｎＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．、５２７：２９６−３１３（１９８８）。フローム
（Ｆｒｏｈｍ）ら、「成長ホルモン放出ホルモン」、Ｅ
ｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ．、７：２２３−２５３（１９８
６）。サイフェルト（Ｓｅｉｆｅｒｔ）ら、「ラットの
下垂体前葉膜のホモゲネート中の成長ホルモン放出因子
結合部位：グルココルイコイドによる調節」、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１７：４２４−４２６（１９８
５）。ビレジクジアン（Ｂｉｌｅｚｉｋｊｉａｎ）ら、
「成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）に対する脱感作はＧ
ＲＦ−結合部位のダウンレギュレーションに関連してい
る」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１８：２０４５
−２０５２（１９８６）。イシハラ（Ｉｓｈｉｈａｒ
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セプターの機能性発現と組織分布」、Ｎｅｕｒｏｎｎ、
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プターの発現クローニング」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５
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ｎ）ら、「ヒトの腫瘍から分泌される成長ホルモン放出
因子の生物活性」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２４
４（ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ）Ｅ３４６−Ｅ３
５３（１９８３）。レオン（Ｌｅｏｎｇ）ら、「培養し
たオスおよびメスの下垂体細胞のラクトトロープ（Ｌａ
ｃｔｏｔｏｒｐｅｓ）とソマトトロープ（Ｓｏｍａｔｏ
ｔｒｏｐｅｓ）の数：マモソマトトロープ（Ｍａｍｍｏ
ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｅｓ）の亜集団の証明」、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１６：１３７１−１３７８
（１９８５）。ムンソン（Ｍｕｎｓｏｎ）ら、「リガン
ド：リガンド結合系の性状解析用の多用なコンピュータ
ーアプローチ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０
７：２２０−２３９（１９８０）。ウェッセル（Ｗｅｓ
ｓｅｌ）ら 「界面活性剤と脂質の存在下での希薄溶液
中の蛋白の定量的回収法」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、１３８：１４１−１４３（１９８４）。バグナト
（Ｂａｇｎａｔｏ）ら、「培養したグラニュローサ（Ｇ
ｒａｎｕｌｏｓａ）細胞中の成長ホルモン放出因子のリ
セプターのゴナドトロピン誘導発現」、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、１２８、２８８９−２８９４（１９９
１）（バグナト（Ｂａｇｎａｔｏ）らが研究した組成物
は、下垂体組織の結合性とは異なるＧＨＲＨ結合性を示
している）。ここに記載したすべての論文および他の資
料は参考のため本明細書中に引用されている。
【００１７】前述の研究はＧＨＲＨ−Ｒの挙動の初歩的
理解に有効ではあるが、ＧＨＲＨ−Ｒのさらなる性状解
析を可能にしＧＨＲＨ−Ｒの精製とクローニングを可能
にする、ＧＨＲＨ−Ｒの高感度で再現性のある測定法に
対するニーズが存在する。このような測定法はＧＨＲＨ
とＧＨＲＨ類似体の非特異的結合の問題を克服しなけれ
ばならない。ＧＨＲＨ類似体の高い比活性の得られるヨ
ード化と精製により、粗下垂体前葉膜に対する特異的結
合が改良される。
【００１８】ＧＨＲＨ−Ｒリセプターのクローニングと
配列決定に対する多くの経路が可能であるが、使用する
経路にかかわらず相当の障害を克服しなければならな
い。そのような問題の１つの例は、ＶＩＰリセプターの
クローニングと発現作業に見られる。ＶＩＰリセプター
をクローン化し発現したという最初の主張は、後の文献
で拒絶され、このため他のリセプターのクローン化と発
現が間違った方向に進んでしまった。スリーダラン（Ｓ
ｒｅｅｄｈａｒａｎ）ら、「ヒト血管作動性小腸ペプチ
ドリセプターのクローニングと発現」、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：４９８６−４
９９０（１９９０）；クック（Ｃｏｏｋ）ら、「提唱さ
れたヒトＶＩＰリセプターのイヌの同族体をコードする
ＲＤＣ１遺伝子の性状解析」 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、
３００：１４９−１５２（１９９１）。ＧＨＲＨ−Ｒの
クローニングと発現については、哺乳動物中に存在する
ＧＨＲＨ−Ｒの量が微量であるため、充分な量の純粋な
リセプターを集めてアミノ酸配列を決定しＧＨＲＨ−Ｒ
に特異的なオリゴヌクレオチドプロープ（これは次にｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用される）を
作成することが困難である。さらにプローブにもハイブ
リダイズする同族の遣伝子と区別できる充分に強いシグ
ナルを与える充分なＧＨＲＨ−Ｒ遺伝子を含むｃＤＮＡ
ライブラリーを見つける必要がある。最後に、現在の技
術はＧＨＲＨ−Ｒの最初のスクリーニングに使用される
ほど感度が高くないため（これはリセプターの非特異的
結合と微量のためである）、リセプターの発現のための
形質転換細胞のスクリーニングの繰り返しが必要な発現
クローニングは、ＧＨＲＨ−Ｒのクローニングには非現
実的である。従ってＧＨＲＨ−Ｒと生物活性のあるその
断片をコードする遺伝子のクローニングと発現方法に対
するニーズ、およびＧＨＲＨ−Ｒまたは生物活性のある
その断片の組換えＤＮＡを有する生きている細胞株に対
するニーズがある。またＧＨＲＨ−Ｒまたはその断片と
相互作用する化合物を試験するためのＧＨＲＨ−Ｒまた
は生物活性のあるその断片を利用するスクリーニング法
に対するニーズがある。ＧＲＦは注射により投与される
必要があるため、そのような測定法は経口投与が可能で
ＧＨＲＨ−Ｒまたはその断片と相互作用する化合物を探
索することが極めて重要である。そのような測定法は、
またアゴニストとしてまたはＧＨＲＨ−Ｒまたはその断
片のアンタゴニストとして相互作用する他の化合物を見
つけるためにも極めて重要である。従って本発明の主目
的は、リセプターに結合するＧＨＲＨの感度のよい再現
性のある測定法を開発することである。
【００１９】本発明のさらなる目的は、ＧＨＲＨ−リセ
プターを特異的かつ正確に標識する試薬を開発すること
である。
【００２０】本発明のさらに別の目的は、ＧＨＲＨ−リ
セプターの精製方法を開発することと、ＧＨＲＨ−Ｒの
少なくとも部分的配列決定を可能にする充分な純度を有
するかまたはその純度に容易に精製されることができる
ＧＨＲＨ−Ｒ単離物を得ることである。
【００２１】本発明のさらに別の目的は、精製されたＧ
ＨＲＨ−Ｒを産生することである。
【００２２】本発明のさらに別の目的は、ＧＨＲＨ−Ｒ
または生物活性のあるその断片をコードする遺伝子のク
ローニング法を与えることである。
【００２３】本発明のさらに別の目的は、成長ホルモン
放出ホルモンリセプターまたは生物活性のあるその断片
をコードする、単離され精製された核酸配列を与えるこ
とである。
【００２４】本発明のさらに別の目的は、成長ホルモン
放出ホルモンリセプターまたは生物活性のあるその断片
をコードする核酸配列よりなるベクターを与えることで
ある。
【００２５】本発明のさらに別の目的は、成長ホルモン
放出ホルモンリセプターまたは生物活性のあるその断片
をコードする核酸配列よりなる宿主細胞または生きてい
る細胞株を与えることである。
【００２６】本発明のさらに別の目的は、ＧＨＲＨ−Ｒ
または生物活性のあるその断片よりなる薬剤組成物、お
よび内因性ＧＨＲＨに結合するようにまたはリセプター
に結合して活性を誘導またはブロックする抗体を産生す
るように、該薬剤組成物の有功量を投与する方法を与え
ることである。
【００２７】さらに別の本発明の目的は、ＧＨＲＨ−Ｒ
リセプター結合活性のためのペプチドと生体異物の大規
模のスクリーニングを可能にするのに充分な組換えＧＨ
ＲＨ−Ｒを与えることである。
【００２８】
【発明の要約】本発明のこれらおよび他の目的は、粗Ｇ
ＨＲＨ−Ｒ抽出物（単離物）の性状解析と単離を可能に
する、改良されたＧＨＲＨ結合測定法により達成され
る。本発明はＧＨＲＨ−Ｒまたは生物活性のあるその断
片をコードする遺伝子のクローニングを与え、ＧＨＲＨ
−Ｒまたは生物活性のあるその断片のアミノ酸配列、お
よびＧＨＲＨ−Ｒまたはその断片をコードする遣伝子に
ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプ
ローブまたはプライマーを与える。本発明はまた、ＧＨ
ＲＨ−Ｒおよび生物活性のあるその断片をコードする遺
伝子よりなる組換え生物およびその子孫を与え、該組換
え（「形質転換」）生物は形質転換前は、バックグラン
ドレベル以上にＧＨＲＨ−Ｒを発現せず、ＧＨＲＨ−Ｒ
をコードする遺伝子を含まない。下垂体膜または形質転
換またはトランスフェクションした生物中のＧＨＲＨ−
Ｒは、ＧＨＲＨ類似体から形成される放射能標識プロー
ブを用いて性状解析される。ＧＨＲＨ類似体（ＧＲＦ
ａ、ＧＨＲＨａ、またはＧＨＲＨｂ）および他の類似体
は、固相ヨードビーズを用いる好適な実施態様によりヨ
ード化され、モノヨード化物質は逆相高速液体クロマト
グラフィーで精製されて基本的に担体フリー（担体を含
まない）になる。分注や希釈中のＧＨＲＨ類似体のガラ
スやプラスチックへの非特異的結合は、有機溶媒を用い
ることにより実質的に排除されている。好適な実施態様
においては、ＧＨＲＨ類似体の希釈と分注のために５０
％アセトニトリルが使用される。粗下垂体前葉膜ペレッ
トへのＧＨＲＨとＧＨＲＨａの特異的結合は、細孔形成
性抗生物質を添加することにより増加している。好適な
実施態様においては、ＧＨＲＨ特異的結合を増加させる
ために抗生物質アラメチシン（ａｌａｍｅｔｈｉｃｉ
ｎ）（約０．０５ｍｇ／ｍｌ）はホモゲネートした下垂
体前葉膜ベレットと組合される。
【００２９】ＧＨＲＨ−リセプターに対して特異的高親
和性、ＧＴＰ感受性、架橋性を示す紫外線感受性架橋基
（光プローブまたは光親和性プローブ）が調製されてい
る。プローブは光感受性基の位置とスペーサーアームの
長さの両方により異なる。好適な光プローブは、ＧＨＲ
Ｈ類似体である［Ｈｉｓ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲＨ−
（１−３２）−ＮＨ２を、Ｎ−５−アジド−２−ニトロ
ベンゾイルオキシサクシニミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）また
はスルホサクシニミジル−６−（４’−アジドー２’−
ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−ＳＡ
ＮＰＡＨまたはＳＡＮＰＡＨ）と結合させ、ヨード化と
精製をすることにより形成される。好ましくはＡＮＢ−
ＮＯＳへの結合は、１２または２１位のリジンを標的と
する。この化合物は次に１０位のチロシンでヨード化さ
れ、生成物は逆相高速液体クロマトグラフィーにより精
製されて、１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳと呼
ぶ光プローブが形成される。別の実施態様においては、
ＧＨＲＨａのＮ−末端ヒスチジンを標的にしてＳＡＮＰ
ＡＨを結合させ、逆相高速液体クロマトグラフィーで精
製し、ＧＨＲＨａの１０位のチロシンをヨード化し、高
速液体クロマトグラフィーで再精製することにより 光
プローブ１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＳＡＮＰＡＨが形成さ
れる。
【００３０】前述の光親和性プローブを用いて、ＧＨＲ
Ｈ−Ｒに結合したＧＨＲＨａの可溶性複合体を産生する
ことが可能であることが、驚くべきことに発見された；
共有結合的に加養した複合体は、強くない界面活性剤溶
液（好ましくは蛋白を可溶化できる両性イオン性界面活
性剤を含み、このような界面活性剤として、例えば３−
［（３−コラミドプロピル）−ジメチル−アモニオ］−
１−プロパンスルホネートがあり、これはＣＨＡＰＳと
呼ばれ、カリホルニア州アービン（Ｉｒｖｉｎｅ）のピ
アス（Ｐｉｅｒｃｅ）社またはＩＣＮパイオメディカル
ズ社から入手できる）中で容易に可溶化され、非特異的
に架橋した汚染物質はこの強くない界面活性剤溶液中に
溶解されない。次に非架橋複合体はまたこれらの条件下
で可溶化されることが発見された。光架橋は可溶化の後
に行われ、リセプター（ＧＨＲＨ−Ｒ）とリガンド（Ｇ
ＨＲＨ−プローブ）は安定な可溶性複合体を形成してい
ることがわかった。好適な実施態様において、これはＣ
ＨＡＰＳ含有溶液による抽出で非特異的結合したＧＨＲ
Ｈの約９０％の排除と、活性炭／デキストランにより遊
離のペプチドの除去を可能にする。これによりＧＨＲＨ
結合測定法は大いに改善される。
【００３１】別の実施態様においてＧＨＲＨまたはＧＨ
ＲＨ類似体への官能基の結合による親和性クロマトグラ
フィーにより部分的に精製されたＧＨＲＨ単離物が得ら
れ、これは支持体上に固定化された化合物に対して親和
性がある。好適な実施態様においては、ＧＨＲＨａのビ
オチン化誘導体はＧＨＲＨ−Ｒに結合され、可溶化さ
れ、次にストレプトアビジンカラムに固定化される。結
合したＧＨＲＨ／ＧＨＲＨ−Ｒ複合体は緩衝液中でｐＨ
５．０で解離し、こうしてＧＨＲＨ−Ｒのアミノ酸配列
を決定するのに使用することができる部分的に精製され
たＧＨＲＨ−Ｒ単離物を生成することが発見されてい
る。ＧＨＲＨ−Ｒは好適な実施態様においてはＳＤＳ−
ＰＡＧＥを用いてＧＨＲＨ−Ｒ単離物をさらに精製し
て、配列決定を妨害するような化合物（例えばＧ−蛋
白）を除去して、精製ＧＨＲＨ−Ｒを生成することによ
り得られる。
【００３２】さらに別の実施態様において本発明は、Ｇ
ＨＲＨ−Ｒまたは生物活性のあるその断片をコードする
遺伝子のクローニングを与える。
【００３３】好ましくはＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白
またはペプチドをコードする遺伝子を単離し、ベクター
ＤＮＡと結合させて組換えＤＮＡを作成する。該遺伝子
を含有するベクターＤＮＡは、原核性または真核性細胞
中で複製することができる。ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する
蛋白またはポリペプチドをコードする遺伝子はベクター
中でプロモーターの顆粒に存在し、ベクターの一部とし
て複製される。次に組換えＤＮＡは、あらかじめ該遺伝
子を有してはいない宿主細胞中に挿入され、ＧＨＲＨ−
Ｒまたは生物活性のあるその断片を発現することができ
る形質転換またはトランスフェクションされた細胞株を
生成する。
【００３４】好適な実施態様において、ベクターλｇｔ
１０中に挿入されたヒト末端巨大症からの成長ホルモン
分泌性下垂体腫瘍から調整されたｃＤＮＡライブラリー
は、ラットセクレチンリセプター（ＲＳ−Ｒ）ｃＤＮＡ
に基づくプローブで低緊縮性でスクリーニングされる。
驚くべきことに、ラットのセクレチンリセプターのｃＤ
ＮＡに基づくプローブは、ＧＨＲＨ−Ｒリセプターをコ
ードするヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリ
ダイズするが、ヒトセクレチンリセプターのクローンは
ヒトの末端巨大症の下垂体（ＨＡＰ）腫瘍ライブラリー
中には有意な量見いだされないことが発見された。この
驚くべき発見（例えばＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白ま
たはポリペプチドをコードするＤＮＡは正常な下垂体組
織よりも多量に見いだされ、セクレチンまたは他の関連
リセプターからの実質的な競合活性は存在しない）は、
ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白またはポリペプチドをコ
ードする遺伝子のクローニングの成功を可能にした。特
に重要なことは、ラットの小脳中にはセクレチンリセプ
ターは検出されないという報告にもかかわらず、ラット
の小脳はＰＣＲを用いて増幅して本明細書中で使用され
るＲＳ−Ｒプローブを産生するのに充分なセクレチンを
含有していたという驚くべき発見である。イシハラ（Ｉ
ｓｈｉｈａｒａ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：１６３５
−１６４１（１９９１）を参照。
【００３５】好ましくは、ＲＳ−Ｒプローブにハイブリ
ダイズするファージのプラーク精製の後に、λｇｔ１０
からクローン化した遺伝子を切取り、プラスミッドｐＧ
ＥＭ７Ｚｆ（＋）に挿入し、次にこれを用いて大腸菌を
形質転換する。挿入された遺伝子はジデオキシ鎖停止法
により配列決定をした後、大腸菌中でプラスミッドを複
製（増幅）し精製する。次にリセプターｃＤＮＡに似て
いる部分配列から標識したオリゴヌクレオチドプローブ
を調製し、ベクターλＢｌｕｅｍｉｄ中の末端巨大症下
垂体（ＨＡＰ）腫瘍ｃＤＮＡライブラリーの高緊縮性ス
クリーニングに使用される。ベクターλＢｌｕｅｍｉｄ
中では挿入体はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミッド
（これはクローニングの目的のためにＧＨＲＨ−Ｒをコ
ードする全遺伝子の理論的サイズの大きさの挿入体を運
搬することができる）中に含有される。これにより全Ｇ
ＨＲＨ−Ｒのクローニングと配列決定が可能になった。
好適な実施態様において、ＧＨＲＨ−Ｒをコードする遺
伝子は真核性発現ベクター中に挿入され、ＧＨＲＨ−Ｒ
は哺乳動物細胞株中で発現される。
【００３６】本発明は成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨ
ＲＨ）リセプター活性を有する実質的に純粋な蛋白およ
び生物活性のあるその断片に関する。このリセプターは
膜結合リセプターに対して少なくとも１０，０００倍精
製される。「生物活性のある断片」とは、リセプター特
異的リガンドに結合することができるか、または担体へ
結合した状態または非結合状態でも宿主動物中にＧＨＲ
Ｈ−Ｒ特異的抗血清または第２のメッセンジャー応答を
誘導することができる全長のリセプターの天然または合
成部分を意味する。好適な実施態様において、リセプタ
ーはヒトのソースから得られるが、同族のリセプターは
また脊椎動物（例えばサカナ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウ
シ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、およびネコがあるが、
これらに限定されるものではない）からも得られる。
【００３７】本発明はまた、薬剤として許容される担体
とともに有功量の純粋なリセプターまたはその断片、ま
たはＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白およびポリペプチド
よりなる薬剤組成物に関し、そのような薬剤組成物の治
療上の使用法を与える。リセプターとリセプター断片
（ＧＨＲＨ−Ｒリガンド結合活性または免疫学的活性を
有する蛋白やポリペブチド）は、ＧＨＲＨ類似体を同定
するためのスクリーニング法や、リセプター部位でＧＨ
ＲＨアンタゴニストとして作用する化合物を同定するた
めのスクリーニング法として有用である。これらはま
た、ＧＨＲＨ−Ｒ特異的抗体を作るのに有功であり、こ
れらの抗体はリセプター部位をプロッキングすることに
よりＧＨＲＨ結合を有功に防ぎ、これにより増殖を阻止
する。ＧＨＲＨ−リセプターを活性化するのに他の抗体
（例えばパセドウ病を引き起こすような甲状腺刺激抗
体）を使用することもできる。リセプターまたはセグメ
ントの断片を含む薬剤組成物は、過剰の循環ＧＨＲＨに
起因するかまたは関連する疾患の治療に使用することも
できる。そのような組成物は、循環ＧＨＲＨに結合し
て、内因性リセプターに結合するのを防ぐように、イン
ビボ投与して使用される。
【００３８】好適な実施態様において、本発明はＧＨＲ
Ｈリセプターをコードする単離された核酸配列、該配列
を含む組換えベクター、およびＧＨＲＨ−リセプターま
たは生物活性を有するその断片（ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有
する蛋白やポリペプチドを含む）の産生に有用な該配列
を有する宿主細胞を与える。
【００３９】ＧＨＲＨ−リセプターのクローニングの全
体的なアプローチは、（１）ＧＨＲＨ−リセプターの性
状解析、（２）ＧＨＲＨ−リセプターを単離するための
ＧＨＲＨ−リセプターの特徴に関する情報の利用、
（３）ＧＨＲＨ−リセプター（またはＧＨＲＨ−リセプ
ターの一部）のペプチド配列の決定、（４）ｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするための縮重オリゴヌク
レオチド配列（これはＧＨＲＨ−リセプターと同族のリ
セプターに由来するかも知れない）の使用によるＧＨＲ
Ｈ−リセプターの産生に関与するＤＮＡ配列の決定、そ
して（５）ＤＮＡ配列のクローニングよりなる。
【００４０】ＧＨＲＨ−Ｒの性状解析 ＧＨＲＨ結合測定法 １つの面において本発明は、高親和性のＧＨＲＨ特異的
でＧＴＰ依存性結合を示す、ＧＨＲＨ−リセプターに対
するＧＨＲＨ結合の、高感度で再現性のある測定法に関
する。陰性に荷電したＧＨＲＨペプチドの強い非特異的
結合のため、単純な瀘過タイプの結合測定法は不可能で
あった。本発明の測定法では特異的結合（１０ｎＭのＧ
ＨＲＨａによるホモゲナイズした膜ペレットから除去さ
れる１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ結合により産生されるガン
マ、γ線のカウントと定義される）は粗膜ペレットに結
合した総カウントの３０から６０％であり、強くない界
面活性剤（例えばＣＨＡＰＳ）や活性炭／デキストラン
処理による抽出の後のカウントの９０％までである。本
発明の結合測定法の好適な実施態様は、穏やかな固相ヨ
ード化法、担体フリーのリガンドの高速液体クロマトグ
ラフィー精製、ＧＨＲＨａの定量的分注のための有機溶
媒系、プローブの生物活性を確認するための平板細胞測
定用および逆溶血プラーク測定法、約０．０５ｍｇ／ｍ
ｌのアラメチシンの使用、下垂体膜ペレットへの特異的
放射能リガンドの結合を増加させるための細孔形成性抗
生物質などの多くの因子よりなる。アラメチシンは特異
的結合を増加させ、捕捉されるカウントを減少させる。
洗浄により回収されるカウントが減少し、特異的結合の
相対量を増加させる。
【００４１】リセプター結合研究の好適なＧＨＲＨａ類
似体は［ＨｉＳ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲＨ−（１−３
２）−ＮＨ２（ＧＨＲＨａと呼ぶ）である。ＧＨＲＨ類
似体は良好なＧＨＲＨ−Ｒ結合能を有するペプチドであ
り、長さはヒトの配列とは異なり、２つのアミノ酸を有
し、これらはヨード化の基質としての使用を促進するよ
うに変更されている。ＧＨＲＨａの好適なソースはペニ
ンシュララボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕ１ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ベルモント、カリホルニア州）
である。
【００４２】最適の比活性と生物活性を有するヨード化
ＧＨＲＨ類似体を調製するには、まず固相ヨードビーズ
（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手できるようなもの）
を用いてＧＨＲＨ類似体（光プローブを含む）をヨード
化し、次にモノヨード化物を逆相高速液体クロマトグラ
フィー（好ましくはフルオロカーボンを基礎にしたバイ
オシリーズ（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｉｅｓ）ポリＦカラム（マ
クモッド（ＭａｃＭｏｄ）より入手出来る））で基本的
に担体フリーにする。有機溶媒（好ましくは水溶液中の
５０％のアセトニトリル）を担体として用いて、定量的
希釈と分注がなされる。こうして水性ビヒクル（ｖｅｈ
ｉｃｌｅｓ）を用いることによる不正確で再現性の悪い
希釈は避けられる。
【００４３】細孔形成性抗生物質を粗下垂体前菓膜ベレ
ットと組合せると、驚くべきことに特異的結合が約３倍
上昇するということが発見された（例えばストルザース
（Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ、１２４：２４（１９８９）を参照）。好適な実施態
様においては、最適の比活性を得るために５０μｇ／ｍ
ｌの抗生物質アラメチシンが使用される。
【００４４】図１に関して、異なる条件下で処理されて
きた粗膜ベレットに対する１２５Ｉ−ＧＨＲＨａプロー
ブの結合が提供される。４組の３つの棒がある。１つの
組の各棒は、ヨード化プローブとインキュベートした後
に結合した総カウントの割合を示す。３つの各組につい
て、左の棒は、冷ＧＨＲＨまたはＧＨＲＨａと競合する
かまたはＧＨＲＨａ結合を妨害することが既知の別の化
合物に対してあらかじめ膜を接触させることなく、ヨー
ド化プローブとのみインキュベートした後に結合した総
カウントを示す。中央の棒は１０ｎＭの非標識ＧＨＲＨ
ａ（これは特異的結合物質に競合する）とともにインキ
ュベートに加えたヨード化プローブとのインキュベート
後に結合した総カウントの割合を示す。各組の棒の最も
左の棒と中央の棒の差は、ＧＨＲＨの特異的結合（これ
は存在するＧＨＲＨ−Ｒの量を示す）を示す。右側の棒
は５０μＭのＧＴＰγＳの存在下で１２５Ｉ−プローブ
とインキュベートした後に結合した総カウントの割合を
示す。ＧＴＰγＳはあるリセプター複合体からＧ−蛋白
の解離を起こすことが知られているため、ＧＴＰγＳを
使用している時の特異的結合の減少はＧＨＲＨ−Ｒ−Ｇ
−蛋白複合体の存在に一致している。
【００４５】特異的結合は２０ｐＭのヨード化類似体の
みで見られる結合と、１０ｎＭの非ヨード化ＧＨＲＨａ
の存在下での類似体の結合との差であると定義される。
飽和結合、スキャッチャード解析；競合研究およびここ
で検討した他のデータは、これらの高親和性部位は特異
的結合部位であることを示している。
【００４６】図２に関して、飽和結合研究はＫｄが約１
６０ｐＭの、単一高親和性部位へのＧＨＲＨ類似体［Ｈ
ｉＳ１、 Ｎ１ｅ２７］−ＧＨＲＨ−（１−３２）−Ｎ
Ｈ２（ＧＨＲＨａ）の結合を示す。いくつかの誤差棒は
小さ過ぎ示すことができない（各点につき繰り返し数は
Ｎ＝６である）。このデータはコンピュータープログラ
ムリガンドで解析され、これは非変換座標軸系でリガン
ド結合式に対して統計的重みづけ最小自乗適合をもとに
して結合定数を求める。このプログラムは、Ｋｄ＝１５
０±１０ｐＭおよびＲ＝１．５±０．０９ピコモル／ｇ
ｍ組織（最も適合する値＝適合のおよそのＳＥＭであ
る）の単一結合部位を報告する。統計的検定はこの単一
結合部位モデルを支持している。点線は結合式中のこれ
らの定数を用いて得られた理論曲線を示す。放射能標識
したＧＨＲＨａの特異的結合は、５０μＭのＧＴＰγＳ
により６５％まで減少される。関連するペプチドのＶＩ
ＰとＰＡＣＡＰは、１００ナノモル濃度でこの結合部位
と競合しなかった。この結合は高親和性Ｇ−蛋白結合Ｇ
ＨＲＨ−Ｒを示す。ＶＩＰリセプターのＶＩＰ結合はス
ルフヒドリル還元剤に感受性があることは公知である。
１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ、関連リセプター
への高親和性結合を防ぐことが知られている）とプレイ
ンキュベートすることによりＧＨＲＨ測定法の中でその
ような特異的結合は完全に排除され、これはＧＨＲＨ−
Ｒリセプターが結合部位であることをさらに支持する結
論である。
【００４７】光親和性プローブ 光親和性プローブは光反応性架橋剤を用いて調製され
た。これらのプローブは光感受性基の位置とスペーサー
アームの長さの両方が異なる。プローブは紫外線照射な
しでＧＨＲＨ−Ｒに結合することができ、紫外線照射の
影響でＧＨＲＨ−Ｒに架橋することもできる。光親和性
プローブの好適な非限定例およびその製造方法は以下の
通りである：
【００４８】１）１２５Ｉ−ＧＨＲＨ−Ｒ−ＡＮＢ−Ｎ
ＯＳ ３２個のアミノ酸の［Ｈｉｓ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲ
Ｈ−（１−３２）−ＮＨ２（ＧＨＲＨａ）を、リジン１
２または２１を標的にして試薬Ｎ−５−アジドー２−ニ
トロベンゾイルオキシサクシニミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）
に結合させて、ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳを作成し
た。ヨードビーズを用いてＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳ
をヨード化して放射能リガンド（「光プローブ」１２５
Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳ、「ホットＧＨＲＨａ
−ＡＮＢ−ＮＯＳ」または「ホット光プローブ」（好適
なヨードビーズはピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォ
ード、オリノイ州から入手出来る）を作成した。
【００４９】２）Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＳＡＮＰＡＨ ジメチルホルムアミド溶媒系で、ＧＨＲＨ類似体［Ｈｉ
ｓ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ２
からＮ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシサク
シニミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）を、ＧＨＲＨａのＮ−末端
ヒスチジンを標的にして、スルホサクシニミジル−６−
（４，−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサ
ノエート（スルホーＳＡＮＰＡＨまたはＳＡＮＰＡＨ）
に結合させた。放射能標識した物質を次に、アセトニト
リルの浅い勾配を用いて、フルオロカーボンを基礎にし
たバイオシリーズ（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｉｅｓ）ポリＦカラ
ム上の逆相高速液体クロマトグラフィー（マックモッド
・アナリティカル（Ｍａｃ−Ｍｏｄ Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ） チャッズフォード（Ｃｈａｄｄｓ Ｆｏｒ
ｄ）、ペンシルベニア州）より入手出来る）により、出
発物質を基本的にフリーになるように精製した。
【００５０】γ線計測によりヒツジの下垂体膜ベレット
中の光プローブ結合を測定し、ドデシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ゲルのオートラジオグラフィーにより紫外線誘導架橋を
測定した。１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳプロ
ーブは、親和性約１ナノモルで結合した（ＧＨＲＨａの
約１６０ピコモルに比較して）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはヒ
ツジの下垂体について約５５ｋＤａでバンドを示し（ウ
シの下垂体では５７ｋＤａ）、これは１０ｎＭのＧＨＲ
Ｈａの存在下で完全に排除された；このバンドは５０μ
ＭのＧＴＰγＳにより５０％以上減少し、１００ｎＭの
ＶＩＰにより影響を受けなかった。すなわち５５ｋＤａ
バンドはＧＨＲＨａの光架橋によるものである。図３
は、この特異的５５ｋＤａバンドが、ＣＨＡＰＳ抽出に
より分離されることを示している。図４は、１０ｎＭの
ＧＨＲＨａによる競合を証明している。図５は架橋に対
するＧＴＰγＳの影響を示す。
【００５１】架橋したＧＨＲＨ−リセプターをノイラミ
ニダーゼで処理すると５５ｋＤａバンドが５０ｋＤａに
移動し、これは荷電した末端のシアール酸が除去されて
ゲル上の移動度が低下したことに起因する（図５）。架
橋したＧＨＲＨ−リセプターを精製した、エンドグリコ
シダーゼＦとＮ−グリコシダーゼ（インディアナ州、イ
ンディアナポリスのベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）より入手出来る）の
プロテアーゼを含まない混合物で処理すると、ゲルの移
動度が移動して４５ｋＤａでバンドを形成した（図３と
図４に示されている）。これはＧＨＲＨ−リセプターが
Ｎ−結合糖蛋白（Ｇ−蛋白結合リセプターでは一般的で
ある）であることを示し、脱グリコシル化蛋白鎖のサイ
ズを示唆している。このサイズはＶＩＰとセクレチンリ
セプターの構造に一致する。
【００５２】固定化レクチンによる試験は、架橋したＧ
ＨＲＨ−リセブターはコムギ胚芽凝集素、リシン、リム
ルス凝集素、 またはコンカナバリンＡに結合しないこ
とを示していた。 これはこのリセプターの特異性を示
しており、これらのレクチンに結合する他のリセプター
からこのリセプターの精製と単離へのアプローチを提供
する。ノイラミニダーゼとベータガラクトシダーゼの処
理の後、このリセプターはピーナッツの凝集素に結合
し、ＧＨＲＨ−リセプターの分離と精製に対する別のア
プローチを提供している。
【００５３】可溶性ｇｒｈ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体および
改良された結合測定法 光親和性架橋は、共有結合したリセプター−リガンド複
合体は、強くない界面活性剤（好ましくはＣＨＡＰＳを
含む溶液）中で可溶性であることを証明した。前述の膜
結合測定法の条件を用いてＧＨＲＨをリセプターととも
にプレインキュベートすると、インタクトのリセプター
−リガンド複合体が架橋していない時でも抽出された。
この複合体は、架橋のない１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ（「ホ
ット」ＧＨＲＨａ）でインキュベートした膜の界面活性
剤による抽出の後、γ線計測により検出された。図６
は、粗膜中で見られる特異的カウントの大部分は、リセ
プターに関連した特異的複合体としてのＣＨＡＰＳで抽
出されたものであった。図６のデータは以下のようにし
て得られた。放射能標識したＧＨＲＨａを、１０ｎＭの
非標識ＧＨＲＨａの存在下または非存在下でヒツジの粗
下垂体膜に結合させた。次に界面活性剤で抽出し遠心分
離した；次に上澄液を活性炭／デキストランで処理し
て、遊離のＧＨＲＨａから蛋白を分離し各画分の放射性
ヨードを計測した。
【００５４】粗膜中の結合した標識されたＧＨＲＨａは
界面活性剤処理により（１）不溶性、（２）可溶性およ
び非特異的に結合、（３）特異的に結合するがしかし界
面活性剤で解離される、または（４）可溶性および特異
的に結合と性状解析された。光結合からわかるように、
非特異的結合カウントの大部分はＣＨＡＰＳ可溶性では
なかった。デオキシコレート界面活性剤混合物による抽
出は、わずかに多くの総カウントを可溶化したが、この
ほとんどは不安定であり解離され、非特異的結合カウン
トがほとんどであった。図７はこの複合体がリセプター
を含んでいることを確認するためのこの光架橋の結果を
示す。膜は暗所で光プローブ（１２５Ｉ−ＡＮＢ−ＮＯ
Ｓ−ＧＨＲＨａ）にあらかじめ結合され、ＣＨＡＰＳで
抽出され、次に紫外線で架橋された。これはＧＨＲＨが
可溶化されたリセプターにまだ結合していたことを示し
ている。ＣＨＡＰＳ抽出物では結合の多くは５５ｋＤリ
セプターバンドにあるが、デオキシコレートの場合はバ
ンドの多くは非特異的であった。これは（光ブローブは
非特異的結合が強いが）図６に示す結合研究と一致し、
可溶性複合体中のＧＨＲＨ類似体の特異的結合は５５ｋ
Ｄａリセプターに対することを証明している。図６に一
致して、この複合体はデオキシコレートよりもＣＨＡＰ
Ｓ中ではるかに安定であった。またＣＨＡＰＳ抽出物を
光架橋すると非特異的結合バンドはほとんどなかった
（５５ｋＤａリセプターバンドのすぐ下に１つあっ
た）。
【００５５】図８は、ＣＨＡＰＳ抽出により結合測定法
が改良され、非特異的カウントが大幅に減少し感度が上
昇することを示す（図１と比較）。この図はまた、この
複合体は５０μＭのＧＴＰγＳにより部分的に解離され
ることを示しており、Ｇ−蛋白はＣＨＡＰＳを含有する
界面活性剤溶液中で可溶化された複合体にまだ会合して
いることを示唆している。図１はＧＨＲＨの前に添加さ
れる時１ｍＭのＤＴＴは特異的結合を妨害したことを示
す。図８は、プレ結合の後に２０ｍＭのＤＴＴから部分
的な影響が起きたことを示す。この複合体はまた、４℃
で一晩１ＭのＮａＣｌまで安定であったが、１％のトリ
トンＸ−１００（界面活性剤）により完全に解離され
た。結合測定法のためのＣＨＡＰＳ可溶性の活性炭デキ
ストラン処理した試料を用いて得られた低いバックグラ
ンドに注意すべきである。
【００５６】可溶性リセプター−リガンド複合体のｐＨ
安定性を図９に示す。複合体はｐＨで顕著な変化があ
り、複合体はｐＨ５．５およびそれ以下で不安定であ
り、ｐＨ５．５と６の間で安定であり、結合ＧＨＲＨと
遊離ＧＨＲＨの間で交換可能であり、ｐＨ７では極めて
安定で交換不可能である。この複合体の安定性は、改良
されたＧＨＲＨａ結合測定法を与え、新規のリセプター
精製法の基礎を与える。
【００５７】ＧＨＲＨａの単離と精製 固定化ストレプトアビジン上で保持されるリセプター−
リガンド複合体としてＧＨＲＨ−リセプターを精製する
ことを目的として、ビオチン化ＧＨＲＨ類似体を開発し
た。試験した最初の類似体は、Ｎ−ヒドロキシサクシニ
ミド試薬ＮＨＳ−ＬＳ−ビオチン（ピアス（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）から入手出来る）を用いて１２および／または２１
位のリジンでビオチン化した［Ｈｉｓ１、Ｎｌｅ２７］
−ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ２（ＧＨＲＨａ）であ
る。この類似体は１０位のチロシンでヨード化し、 高
速液体クロマトグラフィーでモノビオチン化およびジビ
オチン化型として分別した。これらの生成物の９０％以
上は３０分以内に固定化ストレプトアビジンに結合し
た。モノビオチン化ＧＨＲＨａはＧＨＲＨａに比較して
２倍低いリセプター結合親和性を有し、一方ジビオチン
化物の活性はほとんどゼロであった。ストレプトアビジ
ンへの結合がリセプターへの結合をブロックしたため、
ビオチン基はリセプターの結合ポケットにあるようであ
る。次に試験した類似体は［ＨｉＳ１、ＮＩｅ２７、Ｃ
ｙｓ３３］−ＧＨＲＨ−（１−３３）−ＮＨ２である。
これは２量体化する傾向が強く、競合結合測定法でＧＨ
ＲＨａを排除することもできるどの分子種もビオチン化
されなかった。
【００５８】驚くべきことに［ＨｉＳ１、ＮＩｅ２７、
ビオチン−Ｌｙｓ４１］−ＧＨＲＨ−（１−４１）−Ｎ
Ｈ２（ここではＧＨＲＨｂと呼ぶ）は、ＧＨＲＨａに匹
敵する親和性でリセプターに結合することが発見された
（ＧＨＲＨｂを調製するための好適なソースはカリホル
ニア州サンホセのニューロスコーポレーション（Ｎｕｒ
ｏｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である）。この類似体
がリセプター精製に使用できることを証明するために、
ヨード化し、光感受性架橋基（ＡＮＢ−ＮＯＳ）を取り
込み、化合物を高速液体クロマトグラフィーで精製し
た。このヨードービオチニル−光活性化可能なＧＨＲＨ
（１２５Ｉ−ＧＨＲＨｂ−ＡＮＢ−ＮＯＳ）をウシ粗下
垂体膜中でリセプターに結合させた。このリセプター−
リガンド複合体をＣＨＡＰＳで可溶化し、活性炭デキス
トランで遊離のＧＨＲＨを除去し、固定化ストレプトア
ビジンに結合させた。
【００５９】ストレプトアビジンが複合体からリセプタ
ーを排除したか否かを試験するために、ストレプトアビ
ジン結合の前と後に試料を紫外線で架橋し、オートラジ
オグラフィーで分析した。この結果、結合に利用できる
リセプターのかなりの部分（３０％）がストレプトアビ
ジンビーズ上に保持された。可溶性リセプター−リガン
ド複合体複合体安定性の研究（図９を参照）は、ストレ
プトアビジンビーズを高塩濃度（０．５ＭのＮａＣｌ）
で洗浄し、低ｐＨで溶出（ｐＨ５）（好ましくはリン酸
塩、酢酸塩、クエン酸塩または他の適切な緩衝液溶液）
すると、リセプターがかなり精製されＧＨＲＨ−Ｒ単離
物が産生されることを示している。この得られたＧＨＲ
Ｈ−Ｒ単離物はＧＨＲＨ−Ｒの配列決定をするのに充分
な純度がある。好適な実施態様において、Ｇ−蛋白およ
び他の妨害する汚染物質は、少なくとも配列決定をする
のに充分な純度のＧＨＲＨ−Ｒを得るために、ゲル電気
泳動などの方法（しかしこれに限定されるものではな
い）で除去される。
【００６０】図１０は、ストレプトアビジンアガロース
カラム上のビオチン化リセプター複合体（ＧＨＲＨｂ−
ＧＨＲＨ−Ｒ）の親和性精製の結果を示す。非特異的結
合を最小にするために、結合複合体を有するアガロース
ビーズを０．５ｍのＮａＣｌ中で洗浄し、次にｐＨ５．
０でリセプターをビオチン化リガンドから解離させ、カ
ラムから溶出した。この溶出液を超遠心分離で濃縮し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。平行して対照カラムを流
し、 可溶性リセプター複合体を非ビオチン化類似体Ｇ
ＨＲＨａであらかじめ結合させた以外は同様に処理し
た。この銀染色ゲル上のＧＨＲＨｂレーンは、ＧＨＲＨ
ａレーンで見られない５２ｋＤａと４５ｋＤａのバンド
を示している。架橋研究で見られる５５ｋＤａバンドは
共有結合した３．６ｋＤａＧＨＲＨａペプチドを含有す
るため、この５２ｋＤａのバンドは前駆体で予想される
サイズに対応する。４５ｋＤａバンドは刺激物質Ｇ−蛋
白であるＧＳ（これはＧＨＲＨ−リセプター複合体のサ
ブユニットであると考えられている）について報告され
ているサイズである。これらの２つのバンドの共溶出と
これらが対照カラム中に存在しないことは、高度に精製
されたＧＨＲＨ−Ｒが調製されたことを確認している。
【００６１】約５２ｋＤａの分子量を有するＳＤＳゲル
上で得られたバンドに対応する精製された蛋白をヨード
化し、この蛋白をエンドグリコシダーゼＦで脱グリコシ
ル化（これはバンドを約４２ｋＤａの分子量を有する蛋
白に対応するように移動させる）することによっても、
ＧＨＲＨ−Ｒは確認される。この移動は光親和性標識リ
セプターの分子量の同様の減少を反映する。
【００６２】図１１に関して、ＳＤＳゲル電気泳動は、
精製されたＧＨＲＨリセプターの脱グリコシル化挙動を
例示している。最も左のレーンでは分子量約５２ｋＤａ
のヨード化された精製されたリセプターが見られる（図
１１の凡例の読み方を助けるために、プラス（＋）記号
は左に示した化合物が存在することを示し、マイナス
（−）記号は左の化合物が存在しないことを示す）。２
番目のレーンでは、約４２ｋＤａの分子量の蛋白を反映
する単一のバンドが示されている。このバンドはヨード
化された精製されたリセプターをＮ−グリコシダーゼで
処理することにより得られた。３番目のレーンは、１０
ｎＭのＧＨＲＨａ（「ＧＲＦａ］）と光架橋基を有する
ヨード化されたＧＨＲＨａ（これはリセプターに光架橋
することができる）との競合を例示する。バンドは全く
見られないため、ＧＨＲＨａが１２ ５Ｉ−ＧＨＲＨを排
除していることは明らかである。４番目のレーンはヨー
ド化されたＧＲＦに光架橋したリセプターに対するＮ−
グリコシダーゼの影響を示す。
【００６３】５番目のレーンの試料は２番目のレーンの
試料と同じであり、４番目のレーンはリセプターＧＨＲ
Ｈａ複合体中の光架橋基による分子量の増加の反映し
て、５番目のレーンの蛋白より４番目のレーンの蛋白は
分子量の少し大きいバンドを有すことに注目すべきであ
る。６番目のレーンはヨード化されたＧＨＲＨａに光架
橋されたリセプターの最も大きい分子量を示している。
７番目のレーンの試料は１番目のレーンの試料と同じで
ある。すなわち図１１はＧＨＲＨａが精製され単離され
たことを結論的に示している。
【００６４】本発明は、合成法であれ組換え法であれ任
意の方法で産生された、ＧＨＲＨ−Ｒまたはその断片
（これは脊椎動物ＧＨＲＨ−Ｒおよび生物活性を有する
その断片を含む）の活性を有する蛋白およびポリペプチ
ドを包含する。精製されたＧＨＲＨ−Ｒから得られた蛋
白配列は、ＧＨＲＨ−Ｒを発現する細胞からのｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングするのに使用されるオリ
ゴヌクレオチドプローブを設計するのに使用することが
できる。プローブはまた、ＧＨＲＨ−Ｒに相同性がある
リセプターに基づくこともできる。特許請求の範囲の前
のリストに示された配列中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３、およ
びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、非限定的な例として、ポ
リメラーゼチエイン反応（ＰＣＲ）方法によりプローブ
を作成するのに有用なプライマーのオリゴヌクレオチド
配列を示す。これらのプローブは発表されているラット
のセクレチンリセプター（ＲＳ−Ｒ）に基づいており、
同族の蛋白をコードする遺伝子を含有するｃＤＮＡライ
ブラリーをプローブ試験するのに有用である。プローブ
のライブラリーとのハイブリダイゼーションは、同族の
遺伝子またはその一部を含有するクローンを同定するこ
とができる。この遺伝子または遺伝子断片はクローンか
ら単離され、全遺伝子が再構成され、次に適当なベクタ
ーに結合される。
【００６５】ある実施態様において、ラットのセクレチ
ンリセプターのｃＤＮＡに基づくＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４までのプライマーから作
成される上記のプローブは、ベクターλｇｔ１０（例え
ばカリホルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）の
クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得られるような
もの、＃１０９７ａ、オリゴ（ｄｔ）およびランダムに
プライミングされたもの）中のヒトの末端巨大症からの
成長ホルモン分泌性下垂体腫瘍から調製されたｃＤＮＡ
ライブラリーを、低緊縮性でスクリーニングするのに使
用される（低緊縮性条件の非限定例は、 ３０ｍＭのＮ
ａＣｌおよび０．５％のＳＤＳを含有する緩衝液中で４
２℃で最後の洗浄を含む）。この腫瘍型は下垂体のソマ
トトローフからモノクローナル的に得られるものである
と考えられており、普通ＧＨＲＨに応答し、機能性ＧＨ
ＲＨリセプターの存在を示しており、これはＧＨＲＨ−
リセプターｍＲＮＡの濃縮ソースであることを示唆して
いる。イクヤマ（Ｉｋｕｙａｍａ）ら、「成長ホルモン
放出ホルモンリセプターの性状解析および末端巨大症患
者の下垂体腺腫」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ．Ｍｅｔａｂ．、６６：１２６５−１２７１（１９８
８）を参照。具体的な分子クローニング法と実験室法に
ついては、 サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（マ
ニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、「モレキュラークロ
ーニング：実験室マニュアル第２版」、コールドスプリ
ングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプ
リングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク（１９８９）。ペプチドホルモン、
蛋白精製および遺伝子クローニングに関する情報を与え
る他の論文は、ロゼリン（Ｒｏｓｓｅｌｉｎ）、「ＶＩ
Ｐファミリーペプチド（ＶＩＰ、セクレチン、ＧＲＦ、
ＰＨＩ、ＰＨＭ、ＧＩＰ、グルカゴンおよびオキシント
モジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ））のリセプ
ター。 特異性と同定」、ペプチド、７：Ｓｕｐｐｌ．
１、８９−１００（１９８６）；マス（Ｍａｓｕ）ら、
「メタボトロピツクグルタメートリセプターの発現の順
序（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ａ Ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ Ｇｌｕｔａｍａ
ｔｅＲｅｃｅｐｔｏｒ）」、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：７
６０−７６５（１９９１）；ホウアマッド（Ｈｏｕａｍ
ａｄ）ら、「ラットの脳からのＧ−蛋白結合グルタメー
トリセプターのクローニング、発現および遺伝子構
造」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１３１８−１３２０
（１９９１）；タナベ（Ｔａｎａｂｅ）ら、「メタボト
ロピックグルタメートリセプターのファミリー」、Ｎｅ
ｕｒｏｎ、８：１６９−１７９；アボウ−サムラ（Ａｂ
ｏｕ−Ｓａｍｒａ）ら、「ラットの骨芽細胞様細胞化ら
の副甲状腺ホルモン関連ペプチドのリセプターの発現ク
ローニング：単一のリセプターはＣＡＭＰとイノシトー
ル３リン酸を刺激し細胞内遊離カルシウムを増加させ
る」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８９：２７３２−２７３６（１９９２）；リベルト
（Ｌｉｂｅｒｔ）ら、「Ｇ蛋白結合リセプターファミリ
ーの４つのメンバーの選択的増幅とクローニング」、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２４４：５６９−５７２（１９８９）；
マクファーランド（ＭａｃＦａｒｌａｎｄ）ら、「黄体
形成ホルモン放出ホルモン−絨毛性ゴナドトロピンリセ
プター：Ｇ蛋白結合リセプターファミリー」、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２４５：４９４−４９９（１９８９）；バッテ
イ（Ｂａｔｔｅｙ）ら、「ボンベシン（Ｂｏｍｂｅｓｉ
ｎ）の分子クローニング／スイス３Ｔ３細胞からのガス
トリン放出ペプチドリセプター」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：３９５−３９９
（１９９１）；フルメス（Ｈｕｌｍｅｓ）ら、「ＧＨ４
Ｃ１下垂体細胞から単離されたソマトヌタチンリセプタ
ーの部分的アミノ酸配列」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１８４：１３１−１３６
（１９９２）；マス（Ｍａｓｕ）ら、「卵母細胞発現系
によるウシサブスタンスーＸリセプターのｃＤＮＡクロ
ーニング」、Ｎａｔｕｒｅ、ロンドン、３２９：８３６
−８３８（１９８７）；スピンデル（Ｓｐｉｎｄｅｌ）
ら、「ネズミの繊維芽細胞ボンベシン／ガストリン放出
ペプチドリセプターをコードする相補的ＤＮＡのクロー
ニングと機能的性状解析」、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｃｒｉｎｏ
ｌ．、４：１９５６−１９６３（１９９０）；ストラウ
ブ（Ｓｔｒａｕｂ）ら、「マウスの下垂体甲状腺刺激ホ
ルモン放出ホルモンリセプターをコードするｃＤＮＡの
発現クローニング」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：９５１４−９５１８（１９９
０）；ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら、「ウシの副腎アンギ
オテンシンＩＩタイプ１リセプターをコードする相補的
ＤＮＡの発現とクローニング」、Ｎａｔｕｒｅ、３５
１：２３０−２３３（１９９１）；ホワイト（Ｗｈｉｔ
ｅ）ら、「アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵
母細胞中の機能性下垂体ソマトスタチンリセプターの発
現」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８７：１３３−１３６（１９９０）；アボウーサム
ラ（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ）ら、「ＰＴＨ／ＰＴＨｒｐ
リセプターは２つの異なる分子ドメインを介してアデニ
レートサイクラーゼとホスホリパーゼＣを活性化す
る」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ７４ｔｈ
Ｍｅｅｔｉｎｇ、抄録８３６。
【００６６】低緊縮性ライブラリースクリーニングから
得られたクローンをジデオキシ鎖停止法により配列決定
し、リセプターｃＤＮＡに類似の部分配列を含有するク
ローンを用いて、ヒト末端巨大症下垂体（ＨＡＰ）オリ
ゴヌクレオチドプローブ（「ＨＡＰプローブ」）を産生
した。非限定例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のオリゴヌクレオチド配列を互い
にハイブリダイズし（１０塩基対の重複がある）、ＤＮ
Ａポリメラーゼのクレノウ断片を放射能標識ヌクレオチ
ドを、対になっていない部分をうめるのに用いた。次に
これらのＨＡＰプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を、ｃＤＮＡの５，延長（クロ
ンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より入手出来る、５’ス
トレッチ（Ｓｔｒｅｔｃｈ）ＨＬ１０９７ｖ）を最適化
するために水酸化メチル水銀で完全に変性させておいた
末端巨大症下垂体腫瘍ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡラ
イブラリーの高緊縮性スクリーニングに使用した（高緊
縮条件の非限定例は、３０ｍＭのＮａＣｌと０．５％Ｓ
ＤＳを含む緩衝液中で６５℃で最後の洗浄を含む）。ｃ
ＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）でプライミングされ、サイズは
選択され（＞５００塩基対）、ベクターλＢｌｕｅｍｉ
ｄ中に方向を決めてクローン化された。挿入体はｐＢｌ
ｕｅｓｅｒｉｐｔプラスミッド中に含有されサブクロー
ニングされないため、このベクターは配列決定を促進す
る。このライブラリーをＨＡＰプローブでスクリーニン
グすると、ＧＨＲＨ−リセプター遺伝子またはその一部
を含有するクローンが同定される（ここで、本発明の測
定法で決定される高親和性特異的ＧＨＲＨ結合活性を有
する蛋白またはポリペプチドをコードする遺伝子は、Ｇ
ＨＲＨ−Ｒ遺伝子またはその一部であると考えられ
る）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、ＧＨＲＨ−Ｒ活性を
有する蛋白をコードするｃＤＮＡの１２５７塩基対のヌ
クレオチド配列のコード鎖を与え、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：９は、ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白をコードする
ｃＤＮＡの１２７２塩基対のヌクレオチド配列のコード
鎖を与える。この配列は停止コドン、ＴＧＡを含む（Ａ
はデオキシアデニル酸、Ｇはデオキシグアニル酸、Ｃは
デオキシシチジル酸、そしてＴはデオキシチミジル酸を
意味する）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７のヌクレオチド配列に対応して、ＧＨＲＨ−
Ｒ活性を有する蛋白の４１８アミノ酸残基配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
のヌクレオチド配列に対応して、ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有
する蛋白の４２３アミノ酸残基配列を示す。ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に含まれる遺伝
子、またはその断片はクローンから単離され、全遺伝子
を再構成し、次に発現ベクターに結合させた。不幸にも
大腸菌は、宿主細胞としてグリコシル化蛋白の産生にル
ーチンにまたは容易に使用することはできなかった。従
ってＧＨＲＨ遺伝子を挿入して哺乳動物細胞中で発現を
可能にする適当な発現ベクターを見つける必要があっ
た。好適なＧ−蛋白においては、発現ベクターＣＤＭ８
（カリホルニア州サンジエゴのインビトロゲン（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）より入手出来る）が使用され、遺伝子
はＣＯＳ細胞中で発現された（ウイルス複製の欠陥のあ
る開始点を含むＳＶ４０ウイルスゲノムで形質転換した
サルの細胞株。ＣＯＳ細胞中に導入された時、ｐＣＤＭ
８中に挿入されたｃＤＮＡはｍＲＮＡの産生を指令し、
これが翻訳されて蛋白になる）。
【００６７】本発明は、ＧＨＲＨ−Ｒまたはその部分を
コードする遺伝子により形質転換またはトランスフェク
ションされた任意およびすべての宿主細胞、そしてこの
形質転換をさせるのに使用される発現ベクターを含む。
インビボでのリセプター機能を変更するために突然変異
したリセプター、センス、またはアンチセンスｍＲＮＡ
よりなるトランスジェニック動物を作成することもでき
ることは考えられている。
【００６８】非ヒトの同族のリセプターサブタイプの単
離 他の組織型または他の種から、同族のリセプターが以下
のようにして調製できる。目的の特定の組織型または種
からのｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーを放
射能標識したＨＡＰｃＤＮＡとプローブ結合させ、中程
度の緊縮性下で洗浄する（例えば１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ、５５℃）。陽性のプラークを再スクリーニング
して正しいか否かを確認する。次に当該分野で公知の方
法に従いプラスミッドレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）で陽
性のプラークを用いる。レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）し
たプラスミッドを精製し適当な制限酵素で切断し、臭化
エチジウムで染色したアガロースゲルで分析する。第２
のゲルをニトロセルロースフィルターに移し、標識ＨＡ
Ｐとプローブ結合させ、中程度次に高緊縮性（０．１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で順に洗浄しＸ線フ
ィルムに露光する。高緊縮条件下でＨＡＰに強くハイブ
リダイズする挿入体は、リセプターｃＤＮＡ候補である
可能性がある。以下の例に記載する方法に従いまたは当
該分野の公知の技術に従い、これらのリセプターと推定
されるものの本体をさらに確認する。すなわち本発明は
配列リスト中に記載したヌクレオチドやアミノ酸配列の
みでなく、中程度または高緊縮条件下で、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列、およびこれらにコードされ
る生物活性のある蛋白またはその断片とハイブリダイズ
するヌクレオチド配列を包含する。
【００６９】スクリーニングの設計と利用法 スクリーニングは固相または液相または宿主細胞中で、
精製されたまたは組換えリセプターを用いる。スクリー
ニングの中の発現はリガンド結合、第２のメッセンジャ
ー機能、生成物分泌または他の方法により測定する。固
相測定法は、形質導入ありまたはなしで化学的にまたは
免疫学的に固相支持体に結合したリセプターを用いる。
これらの測定法は、放射能、化学的、カロリメトリー的
または発光シグナルを表す抗体、生物学的薬品（例えば
ピオチン）、または結合蛋白または酵素などのレポータ
ーに結合することもできる。宿主細胞を用いるスクリー
ニングは細菌細胞または高等細胞（例えば酵母、昆虫、
哺乳動物）を用いることもできる。理想的な哺乳動物宿
主細胞は、ＧＨＲＨを分泌する腫瘍細胞株、およびトラ
ンスフェクションしたＧＨＲＨ−Ｒの刺激に応答して他
の生成物を分泌する細胞株である。
【００７０】ＧＨＲＨ−Ｒの治療上の有功性 ＧＨＲＨ−Ｒは小児や成人の臨床的発育不全の治療に適
用することができ、正常な体の強度や組成（筋肉対脂
肪）を回復することができ、体の構成や筋肉の強さに関
連する体の老齢化のある面を遅延させたり逆転させたり
することができ、睡眠調節を改善することができ、家畜
の成長を増加させるのに使用することもでき、乳産生動
物の乳汁分泌を増加させたり、免疫機能を改善したり、
食欲をコントロールしたり、有効な食餌や栄養を与えた
りすることができる。
【００７１】ＧＨＲＨリセプターによる抗体の産生 一次配列情報の親水性解析の方法は、疎水性のおそらく
膜を通過している（ｍｅｍｂｒａｎ−ｓｐａｎｎｉｎ
ｇ）ドメインと親水性の抗原性部位の両方を同定するの
に一般的に使用されてきている。ホップとウッズ法（図
１８と図１９を参照、Ｈｏｐｐ， Ｔ．Ｐ．， ａｎｄ
Ｗｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ。、７８：３８２４（１９８１））によるクローン化
したＧＨＲＨリセプターの解析は、７つのドメインが疎
水性残基に富んでいることを示す。これはＧ−蛋白結合
リセプターファミリーでは一般的である、ワング、リプ
フェルト、マルボンおよびバホウス（Ｗａｎｇ，Ｈ．，
Ｌｉｐｆｅｒｔ，Ｌ．，Ｍａｌｂｏｎ，Ｃ．，ａｎｄ
Ｂａｈｏｕｔｈ，Ｂ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．２６４：１４４２４（１９８９）。このモデルは、
抗リセプター抗体の結合の標的の可能性のある４つの細
胞外領域、３つの細胞外ループ（ＥＣ−１、ＥＣ−２、
ＥＣ−３）、特にアスパラギン結合グリコシル化の部位
を含むＮ−末端を記載する。
【００７２】リセプターをブロックまたは活性化する抗
体を産生する目的には、細胞外ループ断片特にＮ−グリ
コシル化部位を含まないもの（炭水化物は立体的に抗体
結合を妨害する可能性がある）が好ましい。しかし細胞
内ループ（ＩＣ）は、スクリーニングや他の測定法のリ
セプター蛋白の固相結合に使用される抗体の産生にも有
用である。甲状腺刺激ホルモンリセプターの３つのＥＣ
ループに対する抗体の最近の研究は、抗原としてＥＣ−
３ループを使用するブロッキング抗体の誘導を含むそれ
らの生物活性の不均一性を示している。オーモリ（Ｏｈ
ｍｏｒｉ，Ｍ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１７４：３９９（９１９１）を参
照。従ってブロッキング抗体または活性化抗体の誘導に
必要なエピトープを決めるために、広いパネルの抗ペプ
チド抗体および抗リセプター抗体が調製され、注意深く
評価される。
【００７３】ペプチドは通常の固相重合法で産生され、
ＨＦで切断され、高速液体クロマトグラフィーで精製さ
れる（バン・レーゲンモルタール（ｖａｎ Ｒｅｇｅｎ
ｍｏｒｔａｌ，Ｍ．Ｈ．）、「抗原としての合成ペプチ
ド」中、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨー
ク、４１−９３頁（１９８８））。ペプチドは従来法に
よりグルタールアルデヒドを介してキーホールリンペッ
トヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオパルミン（ｏｖａｌ
ｍｉｎ）のような担体免疫原に結合され、これらの結合
体はマウスやウサギを免疫するのに使用される。コリガ
ン（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｊｌ）ら、「免疫学の現代の方
法」中、第１巻、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉ
ｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク
（１９９１）を参照。動物にフロイントの完全アジュバ
ントを用いて結合体ペプチドの第１回目の免疫を行い、
３週間後にフロイントの不完全アジュバントを用いて結
合体ペプチドで毎週追加免疫を行う。特異的抗ペプチド
抗体はＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ測定法でペプチドに対す
るそれらの結合により検出される。ペプチドがプラスチ
ックに付着しない場合、従って直接法が不可能な場合、
プレートに付着する無関係の担体蛋白にペプチドを結合
させる。
【００７４】抗体の特異性はまたウェスタンブロッティ
ング法によっても評価される。トウビン（Ｔｏｗｂｉ
ｎ、ｌｔ．）ら、 ＰＮＡＳ ＵＳＡ、７６：４３５０
（１９７９）を参照。特異抗体は、粗膜調製物、ＷＧＡ
溶出糖蛋白、またはストレプトアビジン溶出液中の５５
ｋＤａの蛋白を認識する。リセプターのない細胞株から
の膜は陰性対照として役に立つ。この方法はまた他の細
胞株や組織（脳、下垂体）からのリセプターサブタイプ
との抗体の交差反応性の程度について情報を与え、各ソ
ースからのリセブター精製の必要性をなくする。生理学
的研究のための組織特異抗体を得ることや、免疫親和性
を用いて種々の組織からのリセプターを精製するための
交差反応性抗体を得ることも有用である。
【００７５】ＧＨＲＨリセプターに対するモノクローナ
ル抗体は、従来法を用いて調製される。ハーローとレー
ン（Ｈａｒｌｏｗ，Ｈ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．）、
「抗体：実験室マニュアル」中、コールドスプリングハ
ーパーラボ（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂ）、ニューヨーク、１３９−２４０頁（１９８
８）。免疫に使用される抗原には、（１）前述したよう
に細胞外領域に対応するＫＬＨ−ペプチド結合体、
（２）ヒツジまたはウシの下垂体前葉膜からの精製され
たリセプター、（３）ノイラミニダーゼまたはＮ−グリ
コシダーゼで脱グリコシル化されＳＤＳ−ＰＡＧＥや電
子溶出により精製されたリセプター、（４）トランスフ
ェクションされたＣＨＯ細胞、またはＥＬＩＳＡでペプ
チド免疫原に対する反応性をまたはウェスタンブロッテ
ィング法で蛋白免疫原に対する反応性を試験されたバキ
ュロウイルスなどの組換えソースから精製されたリセプ
ターなどがある。リセプターまたはそのペプチドに対し
て循環抗体を示すものは、ハイブリドーマの調製に使用
される。簡単には脾臓細胞を取り、ポリエチレングリコ
ールの存在下で酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリ
ルアミノプテリン−チミジンの欠損しているＳＰ２／Ｄ
ミエローマ細胞と融合される。牌臓細胞は培養で増殖し
ないため、これで両細胞型の真のハイブリッドが選択さ
れる。ハイブリドーマ上澄液は、（１）精製されたリセ
プターまたはＷＧＡ溶出された糖蛋白のウェスタンブロ
ット、（２）膜に対する放射能標識リガンド結合の阻害
を用いるＥＬＩＳＡにより、リセプターに対する抗体を
スクリーニングする。陽性のハイブリドーマは増殖さ
せ、限界希釈法または軟寒天中の増殖により再クローニ
ングされる；これでモノクローナル性が確保される。陽
性のクローンを用いてマウスに腫瘍を誘導し、腹水中に
抗体を蓄積させる。
【００７６】ポリクローナルＩｇＧ抗体およびモノクロ
ーナルＩｇＧ抗体とも通常の硫酸アンモニウム沈澱法と
プロテインＡクコマトグラフィーにより精製される。ハ
ーロー（Ｈａｒｌｏｗ）（前述）参照。前述の標準的結
合測定法により膜に対する放射能リガンドの結合をブロ
ックまたは活性化する能力について抗体を解析する。
【００７７】リガンドブロッキングまたは活性化で見込
みのある抗体は、例えばラットを用いるインビボで試験
される。例えば抗ＧＨＲＨリセプター抗体の投与後のＧ
Ｈレベルを追跡するために、ラットに対し静脈内挿入カ
テーテルを用いる。ミエル（Ｍｉｅｌｌ、Ｊ．）ら、
Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３１：７５（１９
９１）。ここで最も高いインビボ活性を示す抗体を試験
して、リセプター上のそれらのエピトープ（まだ決定さ
れていない場合は）を規定する。これらのエピトープは
リセプターの抗原断片であり、免疫原として使用された
場合、成長ホルモン産生レベルを変化させる所期の生理
学的効果を有する抗体を誘導する。
【００７８】
【実験法と例】以下の非限定例により本発明の改良され
たＧＨＲＨ結合測定法、およびインタクトのＧＨＲＨ／
ＧＨＲＨ−Ｒリセプター複合体の可溶化に基づ＜ＧＨＲ
Ｈリセプターを精製する方法をさらに説明する。以下の
非限定遺伝子クローニングおよび蛋白発現例は、例とし
てのヌクレオチドアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０までについて記載す
る。しかし本発明はこれらの配列にのみ限定されるので
はなく、生物学的に同等の配列を包含することは理解す
べきである。配列に対する変更、例えば得られる蛋白分
子またはその一部に変化を与える配列の欠失、挿入、ま
たは置換は包含される。例えば遺伝子コードの縮重を反
映する遺伝子配列中の変更、または蛋白中の特定の位置
の化学的に同等のアミノ酸残基が産生されるような変更
は包含される。特に本発明は、標準的な中緊縮性から高
緊縮性サザンハイブリダイゼーション条件下でハイブリ
ダイゼーションが起きるように、特異的に開示された配
列の充分に複製可能なＤＮＡ配列、及びそこで産生され
た生物活性のある蛋白を包含する。ここに開示された核
酸配列またはその一部は、種々の種および組織型からの
細胞中のＧＨＲＨ−Ｒを同定し単離するためのサザンハ
イブリダイゼーション法で容易に使用される。そのよう
な宿主細胞およびそれらの誘導はＧＨＲＨ−Ｒのすべて
または一部の組換え産生に使用することができる。
【００７９】不要な実験をすることなく本発明を実施す
るのに、ここに具体的に記載したものとは異なる広範囲
の他の物質が使用可能であることは理解すべきである。
【００８０】
【粗膜ペレット中の結合測定法】
【００８１】組織調製 すべて工程は４℃で行った。凍結したヒツジまたはウシ
の下垂体前葉（ヒツジ：カルシウム１グラム／下垂体
は、イアン・クラーク博士（Ｄｒ．Ｉａｎ Ｃｌａｒｋ
ｅ）、メルボルン、オースオラリアから得られた；ウ
シ：約２．５グラム／下垂体はベエルフリーズ（Ｐｅｌ
−Ｆｒｅｅｚ）（ロジャース、アーカンサス）からの特
別の手配である）を、血液を洗浄し、結合組織を除き、
５０ＭｍのＨＥＰＥＳ緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、
１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１μＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．
４で０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニル
フルオリド）、１０μｇ／ｍｌのリューペプチン（ｌｅ
ｕｐｅｐｔｉｎ）、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンａ、
そして２００Ｕ／ＭＬ（単位／ＭＬ）のアプロチニン中
でホモゲナイズした。この緩衝液は、Ｇ蛋白に結合して
いるかも知れない内因性ＧＴＰを除去するため、および
高親和性結合を回復するために使用した。ホモゲネート
はマイクロフージ中で最高の速度で遠心分離し、上澄液
を捨てた。次にベレットの上（膜）層を、５０ｍＭのト
リス緩衝液、５ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭの塩化マグネシ
ウム、５０μｇ／ｍｌのアラメチシン、３０μｇ／ｍｌ
のバシトラシンおよび前述の他のプロテアーゼインヒビ
ターを含む結合緩衡液中に、静かに再懸濁した。
【００８２】結合条件と解析 試験管当り１／５０の下垂体当量を、結合緩衝液中で、
５００μｌの容量中の約１００，０００カウントのヨー
ド化プローブとともに室温で１時間インキュベートし
た。分注した総カウントと各試験管に結合したカウント
の割合を、実験条件当り３から６重の測定で求めた。飽
和結合プロフィールは、コンピュータープログラムのリ
ガンド（Ｌｉｇａｎｄ）で解析した。これは非変換座標
軸中で正確なリガンド結合式への統計的重みづけ最小自
乗適合を行う。統計的方法（Ｆ検定およびランズ（ｒｕ
ｎｓ）検定）は、単一結合部位モデルに対して充分に良
好な適合を示した。代表的飽和結合測定法を図２に示
す。
【００８３】結果 内因性ＧＴＰを除去し、高親和性ＧＴＰ依存性部位を明
らかにするために、組織を１０ｍＭのＥＤＴＡで処理す
ることは必須であった。最初は非特異的結合が大きすぎ
て、種々のブロッキング剤でも改良は見られなかった。
ショ糖密度遠心分離により精製した膜画分中に、わずか
に良好な結合シグナルが見られた。一貫性のある結果を
得るために、凍結下垂体から大きいバッチの粗膜を調製
し、この膜の分画を後の測定のために凍結した。図１に
関して、ホモゲナイズ後膜を直接試験すると、特異的結
合の大幅な増加が観察された。この凍結融解効果の１つ
の可能性のある機構は、測定法を妨害するベシクル（ｖ
ｅｓｉｃｌｅｓ）の形成である。この可能性を試験する
と、細孔形成性抗生物質のアラメチシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）は特異的結合／総結合の比を３倍増加させた（図１
にグラフで示してある）。この増加のほとんどは非特異
的結合の減少に起因し、おそらくベシクル中に捕捉され
たプローブの放出によるのであろう。回収される総カウ
ントは減少するが、非特異的結合に対する特異的結合の
増加を最大にするために、膜ベレットを遠心分離により
さらに１回洗浄した。
【００８４】プログラムリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）によ
る飽和結合試験のコンピューター解析は、Ｋｄ＝１５８
±１３ｐＭの単一結合部位を示し、特異的結合部位（Ｒ
Ｔ）の総数は１．５±０．０９ピコモル／グラム組織
（最適値±平均の近似標準誤差（ＳＥＭ））であること
を示している。ＧＨＲＨａの親和性はＧＨＲＨａの生物
学的力価に釣りあっているため、そして関連ペプチドよ
りも優れたＧＨＲＨの特異性（１００ｎＭのＶＩＰまた
はＰＡＣＡＰにより競合はない）と５０μＭのＧＴＰγ
Ｓと１．０ｍＭのＤＴＴに対する感度のため、この結合
はＧＨＲＨ−Ｒ存在を示す。
【００８５】１２５−ＧＨＲＨａを市販のヨード化ヒト
ＧＨＲＨ（アマシャム（Ａｍｅｒｉｓｈａ）、アーリン
トンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ）、
イリノイ州））と比較すると同様のことが証明された；
１２５Ｉ−ＧＨＲＨａはわずかに優れた特異性を示し、
わずかに強いＧＴＰ効果を示した。
【００８６】光親和性プローブ結合の評価 前述したようにピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォー
ド、イリノイ州）から入手したヘテロ機能性光親和性架
橋剤を用いて、２つの異なる光親和性プローブを調製し
た。ＤＭＦ溶媒系を用いてＳＡＮＰＡＨをＮ−末端ヒス
チジンの位置でＧＨＲＨａに結合した。リジン１２また
は２１でＡＮＢ−ＮＯＳをＧＨＲＨａに結合した。各結
合基一ＧＨＲＨａ生成物を高速液体クロマトグラフィー
で精製しヨード化し再精製した。
【００８７】膜に対する光プローブ結合を粗膜結合測定
法で評価し、次にさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解
析して結合部位を同定した。光プローブを暗所でインキ
ュベートし、長波長（３６６ｎｍ）紫外線ランプで光分
解し、次に試料をベレットにした。このベレットを計測
し、次にＳＤＳ試料緩衝液中で直接沸騰させて抽出した
（総ＳＤＳ抽出物）。あるいは標識したベレットを強く
ない界面活性剤溶液（５ｍＭのＣＨＡＰＳ）中で抽出
し、遠心分離し、クロロホルム／メタノールで濃縮した
上澄液をＳＤＳ緩衝液で変性させた（ＣＨＡＰＳ抽出
物）。これらの試料を次にＳＤＳゲル中で電気泳動し、
オートラジオグラフィーを行った。
【００８８】結果 結合測定法により、両光プローブとも膜ベレットに結合
し、１０ｎＭのＧＨＲＨａで完全に置換され、５０μＭ
のＧＴＰγＳで部分的に置換されることが証明された。
いずれもＩ−ＧＨＲＨａよりは非特異的結合が大きかっ
た。親和性架橋ベレットの総ＳＤＳ抽出物のゲルは、こ
のバンドとしての非特異的結合はＧＨＲＨａまたはＧＴ
ＰγＳに影響されないことを示していた。これらの非特
異的結合バンドは実験毎にやや異なり、２つのプローブ
の間でも異なっていた（図３）。非イオン性界面活性剤
であるＣＨＡＰＳは蛋白の弱い可溶化剤である；リセプ
ター精製は、ＣＨＡＰＳを含む溶液がＧＨＲＨ結合活性
を可溶化できることを示していた。５ｍＭのＣＨＡＰＳ
を含む溶液を用いて得られた架橋ペレットの抽出物をＳ
ＤＳゲル上で観察した時、非特異的に標識された蛋白は
可溶化されないためリセプター架橋の視認性ははるかに
改良されていた。図３と４に関しては、その標識がＧＨ
ＲＨａまたはＧＴＰγＳに大きく影響される５５ｋＤの
バンドは、両プローブで明瞭に見ることができ、ＧＨＲ
Ｈ−Ｒを示している。これらの光プローブは、ＧＨＲＨ
リセプターをさらに性状解析、精製およびクローニング
するのに重要である。
【００８９】脱グリコシル化 多くのＧ−蛋白−結合膜リセプターの細胞外部分はアル
ギニン残基に結合した（Ｎ−結合）多くの炭水化物基を
含有することは公知であるので、図３と４の特異的に光
標識されたバンドはＮ−結合糖蛋白であるか否かを確認
するために実験を行った。試料を、精製した、エンドグ
リコシダーゼＦとＮ−グリコシダーゼＦのプロテアーゼ
を含まない混合物で処理した。
【００９０】光標識ペレット（ＳＤＳまたはＣＨＡＰＳ
を用いて抽出した）をＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰し希釈
して、０．５単位のグリコシダーゼ有りまたはなしで、
１．２５％のノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０としても
知られている非イオン界面活性剤）で３７℃で一晩イン
キュベートした。次にこれらの試料をクロロホルム−メ
タノール沈澱方法（ウェッセル（Ｗｅｓｓｅｌ）ら、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８：１４１−１４３
（１９８４）を参照）により濃縮し、ＳＤＳゲル上で電
気泳動した。
【００９１】図３と４に関して、特異的に光標識された
バンドの移動度の約５５ｋＤから約４５ｋＤへの移動
は、グリコシダーゼの存在下でのみ起きることがわか
る。ＳＤＳ抽出された試料中に見られ、ＧＨＲＨａまた
はＧＴＰγＳがないために非特異的に標識されていると
判断される他のバンドは、脱グリコシル化されていな
い。これはＧＨＲＨ−Ｒが糖蛋白であるという最初の証
明であり、この蛋白鎖の真のサイズの最も正しい推定値
を与える。図５に示すように、光標識したリセプターを
ノイラミニダーゼで処理すると、ゲルの移動度が５２ｋ
Ｄに移動する。これはリセプターがそのオリゴサッカラ
イド鎖の上にいくつかの末端シアル酸を有することを示
している。等電点電気泳動ゲル、高速液体クロマトグラ
フィーでの疎水性およびレクチン結合性からわかるよう
に、これらのシアル酸基はリセプターのｐＩに影響を与
える。脱グリコシル化は精製方法および配列決定のため
のリセプターの光分解性切断を促進するのに有用であ
る。
【００９２】リセプター−ＧＨＲＨ複合体の可溶化 活性炭−デキストラン結合測定法で測定されるように
（ポール（Ｐａｕｌ）らによりＶＩＰについて開発され
たものから応用された、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
６２：１５８−１６２（１９８７））、ＣＨＡＰＳを含
有する溶液中で可溶化された下垂体膜調製物は、ＧＴＰ
に非感受性の低い親和性部位（Ｋｄは約５００ｎＭ）を
示したのみである。他の界面活性剤では保持される結合
はさらに少なく、ＧＨＲＨ−Ｒはこれらの処理に安定で
ないことを示している。光親和性架橋の結果は、共有結
合したリセプター−リガンド複合体はＣＨＡＰＳを含有
する溶液中で可溶性であることを示していた。本発明の
膜結合測定法の条件を用いてＧＨＲＨをリセプターとプ
レインキュベートし、次に強くない界面活性剤溶液（好
ましくはＣＨＡＰＳ）で抽出すると、インタクトのリセ
プター−リガンド複合体が可溶化された。１２５Ｉ−Ｇ
ＨＲＨ類似体でインキュベート、または１２５Ｉ−ＧＨ
ＲＨ類似体でインキュベートのあと１０ｎＭの冷ＧＨＲ
Ｈで処理を行うと、膜の界面活性剤抽出によりこの可溶
性複合体が検出された。
【００９３】精製されたＧＨＲＨ−Ｒ 次にビオチン化ＧＨＲＨ類似体を用いて可溶性ＧＨＲＨ
ｂ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体を形成し、この可溶性複合体を
ＣＨＡＰＳを用いて抽出し、活性炭−デキストランで精
製して、ストレプトアビジンカラムに通した。次にスト
レプトアビジンカラムをＮａＣｌ溶液で洗浄し、グリコ
シル化ＧＨＲＨ−Ｒ単離物を生成させるためにｐＨ５．
０の緩衝液をカラムに流した。
【００９４】次にこのＧＨＲＨ−Ｒ単離物をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでさらに精製した。約５２ｋＤに現れるバンド
（純粋なＧＨＲＨ−Ｒに対応する）は標準ＰＶＤＦ膜で
ブロッキングできる。その上に精製されたＧＨＲＨ−Ｒ
を有するこのＰＶＤＦ膜を次に膜上で消化し、通常の配
列決定法によりＧＨＲＨ−Ｒの完全なまたは部分的アミ
ノ酸配列を得るために配列決定をした。
【００９５】次に配列決定工程から得られたアミノ酸配
列を、ＧＨＲＨ−Ｒの産生に関与している遺伝子のクロ
ーニングに使用される縮重プローブを作成するための基
礎に用いた。
【００９６】すなわちヒツジまたはウシの下垂体膜中の
ＧＨＲＨリセプターに対するＧＨＲＨ類似体の結合を測
定するための改良された方法が開示された（ＧＨＲＨ−
Ｒのヨード化、精製および分注、および細孔形成性抗生
物質の使用を含む）。これにより、ＧＨＲＨリセプター
のＧＴＰ感受性のＧＨＲＨ特異的な高親和性光標識法が
開発された。このリセプターのそのような標識は以前は
実現されなかった。これはリセプターのサイズ、グリコ
シル化、可溶性および他の性質の性状解析を可能にし
た。これにより、ＣＨＡＰＳのような化合物を含む、強
くない界面活性剤溶液は、結合したＧＨＲＨ−ＧＨＲＨ
−リセプター複合体を安定で可溶性の型で抽出できるこ
とが発見された。ＣＨＡＰＳ抽出や活性炭／デキストラ
ン処理（遊離のＧＨＲＨを結合するため）は、多くの非
特異的ＧＨＲＨ結合から精製される可溶性リセプター−
リガンド複合体を与え、従ってこれまでよりも良好な感
度の測定法として、またリセプター精製の出発点として
非常に有用である。このリセプター−リガンド複合体は
塩による洗浄、ＧＨＲＨ交換およびＧＴＰまたはＤＴＴ
処理に比較的安定であるが、低ｐＨにはそうではない。
Ｃ−末端でビオチン化されたＧＨＲＨ類似体が発明さ
れ、これは可溶性ＧＨＲＨ−Ｒ複合体中で結合している
時、固定化ストレプトアビジンのカラムに保持され、塩
で洗浄し、ｐＨ５で溶出して、ＧＨＲＨリセプターを精
製することを可能にする。この精製されたリセプター蛋
白はリセプターペプチドの部分的配列決定に適してお
り、この配列情報はＧＨＲＨリセブターｃＤＮＡのクロ
ーニングに有用である。
【００９７】ベクター 本発明の実施での使用に適したベクターの非限定例は、
図１３および１４に示したベクターを含む。図１３につ
いては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋ｐｈａｇ
ｅｍｉｄが示される。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐ
ｈａｇｅｍｉｄはｐＵＣ１９由来の２９６１塩基対のｐ
ｈａｇｅｍｉｄである。ＫＳはｌａｃｚ転写がＫｐｎｌ
からＳａｃｌの方向に進むようにポリリンカー配向して
いることを示す。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐｈａｇｅ
ｍｉｄはストラタジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリ
ホルニア州ラホイア）から入手出来る。ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔはストラタジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から
得られ、発行されるカタログ中にある（例えばストラタ
ジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１９９１プロダクトカタ
ログ）。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩプラスミッド
は、ＧＨＲＨ−ＲをコードするＨＡＰｃＤＮＡ（ここで
さらに定義される）からの１．６キロ塩基対の挿入体を
含むことが示されている。ＨＡＰの５’末端の前で切断
する制限酵素にはＳａｃｌ、ＢｓｔＸ、ＮｏｔＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩなどがある。Ｈ
ＡＰのｃＤＮＡの３’末端で切断する制限酵素には、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＡＰａ
Ｉなどがある。ＨＡＰのｃＤＮＡの内側で切断する酵素
には、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩがある。
【００９８】図１４では、インヴィトロゲン（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）（カリホルニア州サンジエゴ）から入手
出来るベクターＣＤＭ８が再び示されている。ｐＣＤＭ
８はｃＤＮＡクローニングや大腸菌および真核系での解
析用にシード（Ｂ．Ｓｅｅｄ）により開発された、多機
能性真核性発現ベクターである。Ｎａｔｕｒｅ、３２：
８４０−８４２（１９８７）を参照。このプラスミッド
ＣＤＭ８は、ＨＡＰｃＤＮＡ挿入体を含むことが証明さ
れている。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、およびＸｈｏＩ
制限部位は、挿入体のプラスミッドへの平滑末端結合の
後に再形成されなかった。
【００９９】ＧＨＲＨ−Ｒまたは生物活性を有するその
断片をコードする遺伝子のすべてまたは一部をクローニ
ングするのに、他のベクターを使用することもできるこ
とを理解すべきである（例えば、非限定例としでは、ｐ
ＲＪＢ２と命名されたメルク社（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）の専売の発現ベクター）。
【０１００】オリゴヌクレオチドプローブ １つの実施態様において、ラットセクレチンリセプター
のｃＤＮＡに基づく最初のプローブが産生された。ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す
４つのオリゴヌクレオチドを、イシハラ（Ｉｓｈｉｈａ
ｒａ）らが開示したラットセクレチンリセプターの配列
の鎖の配列の部分にマッチするように、作成した（「セ
クレチンリセプターをコードするｃＤＮＡの分子クロー
ニングと発現」、ＥＭＢＯ．Ｊ．、１０：１６３５−１
６４１（１９９１））。次にこれらのヌクレオチドの２
つ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２）を用いて、ラットセクレチンリセプターのｃＤＮＡ
の全コード配列を増幅するためにラットの小脳からのｃ
ＤＮＡを用いてポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を
行った。サーマルサイクラーを用いてＰＣＲは以下のよ
うに行った：サイクル温度は変性、プライマーアニーリ
ング、およびプライマー伸張についてそれぞれ９４°
Ｆ、５５°Ｆ、７２°Ｆであり、サイクル時間は各サイ
クルでこれらの温度につきそれぞれ約１、１．５、およ
び２．５分であった。全部で３０サイクル行った。標準
ＰＣＲ緩衝液中のポリメラーゼを使用した。残念ながら
最初の２つのプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を用いるＰＣＲ反応では充分な
増幅は得られなかった。この問題を克服するために２回
目のＰＣＲ反応は、最初のセットの内部に折り畳まれて
いたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
を用いた。その生成物はセクレチンリセプターの８１２
塩基対の「疎水性核」であり、 これは最初の膜透過部
分から７番目の膜透過部分の後まで（ヌクレオチド６３
９−ヌクレオチド１４５０）延びていた（ある種のＧ蛋
白結合リセプター（ＧＣＲＳ）のようにセクレチンリセ
プターは細胞膜を通過しており、疎水性アミノ酸の核か
ら構成された複数の膜透過性部分を有し、ロドプシン
（Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）ＧＣＲｓのようにヒドロパシー
曲線を示す）。ＰｓｔＩとＸｂａＩによる制限エンドヌ
クレアーゼマッピングによりこの物質の本体が確認され
た。このＰＣＲ生成物を、ジエチルアミノエチル、ＤＥ
ＡＥ、紙上で電気泳動し、塩溶出とエタノール沈澱によ
り、アガロースゲルからバンドとして精製した。
【０１０１】低緊縮性ライブラリースクリーニング 次に前に産生したセクレチンリセプターのｃＤＮＡ断片
をランダムプライミングにより放射標識し、ヒト末端巨
大症の下垂体からのλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーか
らの平板にまき、ニトロセルロースフィルターに取り上
げた約１．５×１０６クローンをスクリーニングするた
めのプコーブとして使用した。好適な実施態様におい
て、プローブの標識はウイスコンシン州マジソンのプロ
メガ（Ｐｒｏｍｅｔａ）から入手出来るプライマジーン
（ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ）キットを用いて行った
（一般的に緊縮性条件は増強したイオン強度および／ま
たは低下させた温度よりなり；高い緊縮条件は低下した
イオン強度および／または上昇した温度よりなる）。フ
ィルターはオートラジオグラフィーの前に０．５％のド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中の３０ｍＭのＮａＣ
ｌを含む緩衝液中で４２℃で洗浄した。プローブにハイ
ブリダイズしたファージをプラーク法で精製し、ＣｓＣ
ｌ法で分染し、λｇｔ１０中の挿入体をＥｃｏＲＩで切
断し、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（ウイスコンシン州マジソ
ンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｔａ）から入手出来る）中に
サブクローニングした。次にｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中の
クローン化挿入体をランガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（「鎖
停止インヒビターによるＤＮＡ配列決定法」、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４
６３−５４６７（１９７７））のジデオキシ鎖停止法に
より配列決定した。いくつかの小さい（＜４００塩基
対）クローンと３つの大きいクローンが見いだされた。
これらの大きいクローンのうちの２つ（１．０と０．１
キロ塩基）はそれぞれリセプターｃＤＮＡに似た部分配
列（ＨＡＰ配列）を含んででおり、ポリＡテイルで終る
非コード３’画分を含んでいた。これらのクローンはそ
こで重複している同じ配列を含有していたが、２００塩
基対により誘導されるコード領域の長さは異なっており
３００塩基対離れた２つの異なるポリアデニル化部位を
示している。驚くべきことに、使用されるラットのセク
レチンプローブに容易に検出されるはずのヒトのセクレ
チンリセプターを代表するどのクローンも末端巨大症腫
瘍（ＨＡＰ）ライブラリー中に見いだされないことが発
見された。（ＧＨＲＨ−Ｒは下垂体ソマトトローフ中に
は極めて低濃度で存在し、ｃＤＮＡライブラリー中のヒ
トのセクレチンリセプターをコードする遺伝子が比較的
少量存在することは、この方法によるＧＨＲＨ−Ｒのク
ローニングを困難にするため、これは特に意義があ
る）。
【０１０２】１０塩基対だけ重複するＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す２つの相補的３
０量体から作成された標識した５０塩基対のＨＡＰオリ
ゴヌクレオチドプローブ；ハイブリダイズした多量体は
クレノウ断片フィルイン反応（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）で標識
した（これらの多量体は低緊縮性ライブラリースクリー
ニングから得られた配列に基づき調製された）。この５
０塩基対ＨＡＰプローブを用いて、前述のクロンテック
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）＃ＨＬヒト末端巨大症ｃＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングに、そしてｃＤＮＡの５’
末端延長部分を最適化するために水酸化メチル水銀で完
全に変性した末端巨大症化下垂体（ＨＡＰ）腫瘍ｍＲＮ
Ａから特別に調製したクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）５’ストレッチ（Ｓｔｒｅｔｃｈ）ＨＬ１９５７ｖ
ライブラリーのスクリーニングに使用した。このｃＤＮ
Ａはオリゴ（ｄｔ）−プライミングされ、サイズ選択さ
れ（＞５００塩基対）、そしてベクターλＢｌｕｅｍｉ
ｄ中に方向をそろえてクローン化した。このベクターは
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミツドに挿入体が含有さ
れているため配列決定を促進し、前述のベクターλｇｔ
１０を用いる時のようにサブクローニングする必要がな
い。両方のライブラリーを前述のようにスクリーニング
したが、最もマッチしていると考えられるもの以外を除
くために、ニトロセルロースフィルターリフトの６５℃
での高緊縮性の最後の洗浄を行った。λｇｔ１０ベクタ
ーを用いるライブラリーは、１５２個のシグナルを産生
し、これは二重リフトにより確認した。
【０１０３】二重リフトによる２番目の「５’ストレッ
チ」のスクリーニングにより６４個のマッチするシグナ
ルが現れ、このうち５８個はプラーク法で精製され、こ
のうち７番目のもの（ＨＡＰ７と命名した）は、ＧＨＲ
Ｈａの完全な蛋白コード領域を含有することがＰＣＲに
より示唆された。さらに詳しくはクローニング部位を含
むファージベクターに対するＰＣＲプライマーの使用、
およびＨＡＰ配列に特異的なプライマーの使用により、
ＰＣＲを用いて既知のＨＡＰ配列に対して５’の各挿入
体全体の大きさとその長さを測定することができた。そ
の結果はこれらの両方の腫瘍ライブラリーにＨＡＰｃＤ
ＮＡは豊富に存在し、全長クローンが産生されたことを
示唆している。
【０１０４】ＨＡＰ７ファージを制限エンドヌクレアー
ゼＮｏｔＩで切断して、ｃＤＮＡ挿入体を含むプラスミ
ッドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを取り出した。次にこのプ
ラスミッドを用いて大腸菌を形質転換し、形質転換した
細胞をアンピシリンに対する耐性で選択した；大腸菌Ｈ
ＡＰ７．３と命名したクローンの１つである、ＤＨ５α
を、１９９２年８月２５日にアメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１ パー
クローンドライブ、ロックビル、メアリーランド州２０
８５２、米国（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉ
ｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託
し、寄託番号ＡＴＣＣ６９０５８を与えられた。
【０１０５】図１２はＣＯＳ細胞のトランスフェクショ
ンに使用するために、ｐＣＤＭ８中にＨＡＰ７．３ｃＤ
ＮＡ配列を挿入する工程を例示する。この図は、開始コ
ドン（ＡＴＧ）を含むＮｃｏＩの制限部位とｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔとｐＣＤＭ８プラスミッドの異なる抗生物
質耐性を利用している。
【０１０６】市販のキット、または自動化ＤＮＡシーケ
ンサーを用いて、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らジデオキ
シ鎖停止法により、ＨＡＰクローンの配列決定を行っ
た。
【０１０７】ＧＨＲＨ−ＲをコードするＨＡＰ７．３の
ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤＮＯ：７とＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：９に示し、その対応するアミノ酸配列はＳＥ
ＱＩＤ ＮＯ：８とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す。
コンピューター検索（ＦＡＳＴＡｓｔ ＧｅｎＢａｎｋ
Ｒｅｌｅａｓｅ ７１）は、セクレチンファミリーの
リセプター以外に、ＧＨＲＨ−Ｒ配列は他の公知の蛋白
に対して有意な類似性を示さないことを示している。
【０１０８】哺乳動物細胞株でのＨＡＰ７．３ｃＤＮＡ
の発現 ＨＡＰ７．３ｃＤＮＡは、コザック（Ｋｏｚａｋ）によ
り提唱された開始コドンコンセンサス配列に一致するメ
チオニン（Ｍｅｔ）コドンで始まる、伸張翻訳オープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。「６９９
メッセンジャーＲＮＡｓからの５’非コード配列の解
析」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：
８１２５−８１４８（１９８８）を参照。ＨＡＰ７．３
ｃＤＮＡはこの推定上の開始コドンの５’に８０塩基対
を含み、ＡＴＧまたはフレームない停止コドンを欠如し
ている。ＯＲＦは１，２６９塩基対伸張しており、４２
３個のアミノ酸の蛋白をコードする（予想される分子量
は約４５ｋＤａ）。ＨＡＰ７．３ｃＤＮＡは、この推定
上の開始コドンを含有するＮｃｏｌ制限エンドヌクレア
ーゼ部位を利用してｐＣＤＭ８発現ベクター中にサブク
ローニングされた。
【０１０９】Ｃｏｓ−１細胞は、ｐＣＤＭ８とＨＡＰ
ｃＤＮＡをスプライスして作成したベクターでトランス
フェクションしＣｏｓ−１細胞膜は７２時間後に調製し
た。Ｃｏｓ−１細胞は、クレン（Ｃｕｌｌｅｎ）の記載
するＤＥＡＥ−デキストラン法を用いて、１００ｍｍの
皿（ｄｉｓｈ）中で６×１０５細胞につき１０μｇのプ
ラスミッドＤＮＡを用いてトランスフェクションした。
「真核発現技術の利用とクローン化遺伝子の機能的解
析」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：６
８４−７０４（１９８７）を参照。Ｃｏｓ細胞培養物
は、ラットのＡＴ１アンギオテンシンＩＩリセプターを
コードするｃＤＮＡを含有するｐＣＤＭ８と平行してト
ランスフェクションされた。ＨＡＰ ｃＤＮＡでトラン
スフェクションしたＣＯＳ細胞膜は、Ｈｉｓ１、１２５
Ｉ−Ｔｙｒ１０、Ｎｌｅ２７ヒトＧＨＲＨ（１−２９）
ＮＨ２の特異的高親和性結合を示したが、アンギオテン
シンリセプターｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣ
ＯＳ細胞はこれを示さなかった。図１５と１６では、Ｈ
ＡＰ７ｃＤＮＡを含有するｐＣＤＭ８でトランスフェク
ションしたＣＯＳ細胞膜へのヨード化ＧＨＲＨの結合、
およびラットのアンギオエンシンＩＩリセプターをコー
ドするｃＤＮＡを含有するロＣＤＭ８でトランスフェク
ションした膜に対するヨード化ＧＨＲＨの結合が示さ
れ、この結合は種々の濃度の競合ペプチドの存在下での
ＧＨＲＨａ結合に匹敵していた。
【０１１０】図１５は少ない数の試料に基づいており、
ノイズが高いため２ｎＭのＧＲＦは１０ｎＭのＧＲＦよ
り多量の１２５Ｉ−ＧＲＦを排除しているように思われ
る。しかし図１６の各データの点に反映されているより
多くの数の試料は、添加した競合ペプチドの濃度とヨー
ド化ＧＲＦ類似体の総結合カウントの減少の間の正相関
を示している。
【０１１１】図１６は、はるかに高濃度（Ｋｉは約３０
ｎＭ）ではあるが、ＰＡＣＡＰはヨード化ＧＨＲＨ結合
に競合することを示している。ヨード化ＧＨＲＨの結合
は、１００ｎｍの他のペプチド（ＶＩＰ、セクレチン、
グルカゴン、カルシトニン、ガラニン（ｇａｌａｎｉ
ｎ）、副甲状腺ホルモン、胃腸ペプチド、ＰＨＭ、およ
びソマトスタチンなどを含む）、または１μＭの成長ホ
ルモン放出ホルモンに影響されなかった。ＧＨＲＨはア
ンギオテンシンをコードする遺伝子でトランスフエクシ
ョンしたＣＯＳ対照細胞に結合しなかったため、ＨＡＰ
７ｃＤＮＡを含有するｐＣＤＭ８でトランスフェクショ
ンしたＣＯＳ細胞中のＧＨＲＨ結合は、ＨＡＰ７ｃＤＮ
Ａによる蛋白の発現に起因することは明らかである。さ
らに図１５と１６に示したＧＨＲＨ特異的結合活性は、
ＨＡＰ７遺伝子の発現により産生された蛋白はＧＨＲＨ
−Ｒのすべての結合特性を有していることを示してい
た。
【０１１２】図１７はヒツジの下垂体膜中の同じＧＨＲ
Ｈ類似体の結合と置換を示す。このデータは０．２ｎＭ
の下垂体中でＧＨＲＨ結合のＫＤを与えた。図１６との
比較により、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞には
匹敵する高親和性部位が誘導されるが、これらの部位の
いくつかは低い親和性を有することを示唆している。ト
ランスフェクションされた細胞中の豊富なＧ蛋白はおそ
らく完全なリセプター結合をするには不充分であるため
これは予想されることであるが、これはまた人工的なＣ
ＯＳ細胞発現系中の他の因子に起因するのかも知れな
い。ＰＡＣＡＰは５００ｎＭと１Ｍのヒツジの下垂体中
でＧＨＲＨの有意な置換を起こしたが、ＶＩＰはこれを
起こさなかった。
【０１１３】ＧＨＲＨ−Ｒ遺伝子がクローン化されたこ
とを確認するいくつかの証拠がある：クローン化遺伝子
によりコードされる蛋白の分子量は、ヒツジの下垂体Ｇ
ＨＲＨリセプターの光親和性架橋からの結果（脱グリコ
シル化後約４２ｋＤａのサイズを示す）によく一致す
る。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列は４
２３個のアミノ酸残基を示す。もし最初のアミノ酸残基
が細胞中の処理により除かれるシグナルペプチドなら、
これにより分子量が約４４ｋＤａの４０１個のアミノ酸
の蛋白が残り、これは前述の脱グリコシル化試験での光
親和性架橋で求められたサイズに非常によく一致する。
【０１１４】クローン化遺伝子によりコードされる蛋白
配列は、Ｇ−蛋白結合リセプターのハイドロパシー曲線
を示す膜通過ドメインの可能性のある部分を含む。例え
ば図１８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列
のハイドロパシープロットであり、図１９はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１０のアミノ酸配列のハイドロパシープロッ
トである。これらのグラフは、９涸のアミノ酸配列残基
の極性の移動平均を求めることにより作成した；水平の
線の下の点は蛋白の極性すなわち親水性部分を示し、こ
の線の上の部分は膜透過部分となると考えられる蛋白の
非極性すなわち疎水性部分を示す。
【０１１５】下記の表１は、コンピューターマッチング
アルゴリズム（ＦＡＳＴＡとして知られている）によ
る、ＧＨＲＨ−Ｒに類似と考えられるリセプター配列中
に見いだされるアミノ酸残基の割合を示す。ピアソン
（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８（１９
８８）。
【表１】
【表２】
【０１１６】表２はＨＡＰからクローン化された遺伝子
はセクレチンリセプターよりもややＶＩＰリセプターに
似ており、ＰＴＨやカルシトニンリセプターには似てい
ないことを示す（例えば他のＧ−蛋白結合リセプターに
有意の相同性を有する）。
【０１１７】以上より、ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白
をコードする遺伝子はクローン化され発現されたことは
明らかである。
【０１１８】すなわち本発明は、成長ホルモン放出ホル
モンおよび生物活性のあるその断片の可溶化、精製およ
び蛋白の配列決定に関し、また成長ホルモン放出ホルモ
ンリセプターおよび生物活性のあるその断片をコードす
る遺伝子のクローニングに関する。好適な実施態様にお
いて、ヒト末端巨大症下垂体腫瘍ｃＤＮＡラットから得
られたリセプターヌクレオチド配列がｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔプラスミッド（しかしこれに限定されるものでは
ない）のようなベクターに挿入される；このプラスミッ
ドを用いて適当な宿主細胞（例えば生育可能な培養液中
の細菌）を形質転換する；例えばメアリーランド州ロッ
クビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションの寄
託番号ＡＴＣＣ６９０５８として保存されている細
菌）。ＡＴＣＣで保存されているこの細菌は入手可能で
あり、ＧＨＲＨリセプターのヌクレオチド配列は制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて（非限定的な例としてのＸｂ
ａＩとＸｈｏＩを用いて）細菌プラスミッドから切断さ
れ、このヌクレオチド配列を用いて他の生物または細胞
株（例えばＣＯＳ細胞があるが、これに限定されない）
中で蛋白が発現される。すなわちＡＴＣＣで保存されて
いる形質転換された細菌（寄託番号６９０５８）は、Ｇ
ＨＲＨリセプターをコードするヌクレオチド配列のさら
なるクローニングに有用であり、このＧＨＲＨリセプタ
ーをコードするヌクレオチド配列は蛋白を発現するのに
使用され、この蛋白はＧ−蛋白結合リセプター（例えば
ＧＨＲＨ−Ｒ）と相互作用する種々の薬剤のスクリーニ
ングに使用され、前述の治療に使用することもできる。
【０１１９】以上の説明より本発明の多くの変更や変法
が可能であることは明らかである。非限定的な例とし
て、粗下垂体試料中のＧＨＲＨ−Ｒの他の複合体は、精
製されたＧＨＲＨ−Ｒを産生するために親和性カラムに
結合されることができることが考えられる。従って本発
明はここに具体的に記載したもの以外にも実施されるこ
とを理解すべきである。
【０１２０】配列表 （１）一般情報 （１）出願人：ソーナー、ミシェル・オー ゲイリン、ブルース・ディー リンチ、ケビン・アール ハリソン、ジェフリー・ケー （２）発明の名称：成長ホルモン放出ホルモンリセプタ
ーの単離、性状解析、および蛋白配列決定と、成長ホル
モン放出ホルモンリセプターをコードする遺伝子のクロ
ーニング （３）配列の数：１０ （４）連絡住所： （Ａ）受信人：メーソン、フェヌイック・アンド・ロー
レンス （Ｂ）ストリート：１２２５ ストリート、エヌ．ダブ
リュー．、スイート１０００ （Ｃ）市：ワシントン （Ｄ）州：ディー・シー （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：２０００５ （５）コンピューターに読めるフォーム （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピユーター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．
０、バージョン＃１．２５ （６）現在の申請データ （Ａ）申請番号： （Ｂ）申請日： （Ｃ）分類： （７）先行申請データ （Ａ）申請番号：ＵＳ０７／９０２，８２６ （Ｂ）申請日：１９９２年６月２３日 （８）弁理士／エージェント情報 （Ａ）名前：オー・ショーネッシー、ブライアン・ピー （Ｂ）登録番号：３２，７４７ （Ｃ）参照／処理番号：１０８４／８１−１３６５ （９）通信情報 （Ａ）電話：２０２−２８９−１２００ （Ｂ）ファックス：２０２−２８９−６６７４ （Ｃ）テレックス：２４８５１６
【０１２１】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧ ＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧ ＣＴＣ
ＡＧＣ
【０１２２】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＧＧＣＧＣＣＴＴＧＣ ＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡ ＧＡＴ
ＧＡＴ
【０１２３】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＡＡＧＧＴＣＡＴＧＴ ＡＣＡＣＴＧＴＡＧＧ ＣＴＡ
【０１２４】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＡＧＣＧＧＧＡＡＣＴ ＣＴＴＧＡＡＧＧＴＧ ＣＣＡ
【０１２５】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＣＣＡＡＴＡＣＴＧＡ ＧＡＣＴＧＧＧＴＡＴ ＧＧＡ
ＧＧＣＴＧＣＣ
【０１２６】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡ ＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧ ＧＧＣ
ＡＧＣＣＴＣＣ
【０１２７】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：１２５７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
【０１２８】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：４１８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：蛋白 （１１）配 列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
【０１２９】（２）ＳＩＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：１２７２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
【０１３０】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：４２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：蛋白 （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒツジ下垂体の粗膜ペレットに対し
て１２５Ｉ−ＧＨＲＨａの結合を示す棒グラフである。
棒は、プローブのみとまたは１０ｎＭのＧＨＲＨａまた
は５０μＭのＧＴＰγＳの存在下でインキュベートした
後のベレットに結合した総カウントの割合を示す。４つ
の異なるケース（棒のセット）が示されている。最初に
ケース（膜）は粗膜ベレットの調製物に対する結合を示
す。第２のセット（凍結）は、凍結融解の後は同じ膜調
製物中に特異的結合がほとんどないことを示す。第３の
セット（ＤＴＴ）は、１ｍＭのＤＴＴの存在下での同じ
調製物（凍結されていない）に対する結合を示す。第４
のセット（ａｌａ洗浄）は、細孔形成抗生物質アラメチ
シン（ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ）と追加の洗浄工程を含
む本発明の改良した試験法を示す。誤差捧は平均値の標
準誤差を示し、各点の繰り返しのＮ＝３または４であ
る。
【図２】 図２は、飽和結合解析に使用されるグラフで
ある。点は、レベルの増加している非標識ＧＨＲＨａの
存在下で実施された結合測定法からのデータである。誤
差棒は平均値の標準誤差である。囲み部分の中は、スキ
ャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）座標軸中の同じデ
ータと曲線である（囲み部分の中では誤差は示してな
い）。
【図３】 図３は、リセプターの光親和性架橋を示すＳ
ＤＳゲルの放射能図である。ヒツジの粗下垂体膜への架
橋は２つの異なる光プローブ（ＳＡＮＰＡＨとＡＮＳ−
ＮＯＳ）で示されており それぞれ２つの異なる方法で
抽出された（ＳＤＳとＣＨＡＰＳ）。各ケースに脱グリ
コシル化酵素の影響も示してある。ＣＨＡＰＳ抽出物は
非特異的結合が大きく減少していることを示している。
いずれの光プローブも、脱グリコシル化で４５ｋＤａに
移動する５５ｋＤａのバンドを標識している。
【図４】 図４は、１０ｎＭのＧＨＲＨによる競合と脱
グリコシル化を示すＡＮＢ−ＮＯＳ架橋をＣＨＡＰＳが
抽出したことを示す、図３中のようなＳＤＳゲルの放射
能図である。
【図５】 図５は、ＧＴＰγＳの影響とノイラミニダー
ゼによる部分的脱グリコシル化の影響を含む図４のよう
な光親和性架橋のＳＤＳゲルの放射能図である。
【図６】 図６は、１０ｎＭの非標識ＧＨＲＨａの存在
下または非存在下で、ヨード標識ＧＨＲＨａをヒツジの
粗下垂体膜へ結合させて調製したＧＨＲＨａ−ＧＨＲＨ
−Ｒ複合体の溶解度を示す。
【図７】 図７は、ＡＮＢ−ＮＯＳ−ＧＨＲＨａ光プロ
ーブを用いて図６の実験をして産生された可溶性複合体
の光親和性架橋を示し、界面活性剤可溶性画分は抽出の
後紫外線架橋された。最も左の２つのレーンはＣＨＡＰ
Ｓで抽出したものであり、右の２つのレーンはデオキシ
コレートで抽出したものである。
【図８】 図８はＣＨＡＰＳで可溶化し、活性炭デキス
トランで処理したＧＨＲＨａ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体で、
５０μＭＧＴＰγＳ（±５ｍＭのＭｇ＋＋）、１０ｎＭ
のＤＴＴ、または１％のトリトンＸ−１００に３０分間
接触させた後、解離の量を定量するために再び活性炭デ
キストランで処理したものの安定性を示す。
【図９】 図９は、低ｐＨでの可溶性ＧＨＲＨ−ＧＨＲ
Ｈ−Ｒ複合体の解離を示し、異なるｐＨでの可溶性特異
的複合体の安定性は図８のように評価した。別のデータ
はｐＨ５またはそれ以下でほぼ完全な解離が得られるこ
とを示している。
【図１０】 図１０は、ストレプトアビジンカラム上で
のビオチン化リセプター複合体ＧＨＲＨｂ−ＧＨＲＨ−
Ｒの親和性クロマトグラフィーにより得られた、精製さ
れたＧＨＲＨ−Ｒを含有する溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析を示す。
【図１１】 図１１は、ＳＤＳゲル上の移動で見られる
精製されたＧＨＲＨ−リセプターの脱グリコシル化挙勤
を示す。ゲル上の７つのレーンに対応して７つの試料を
流した。（プラス（＋）記号は１２５Ｉ−精製リセプタ
ー、光架橋リセプター、Ｎ−グリコシダーゼ、または１
０ｎＭのＧＲＦａの存在を示す）。最も左のレーンはヨ
ード化した精製されたリセプターのバンドを示し、その
隣のレーンはヨード化した精製されたリセプターをＮ−
グリコシダーゼで処理したもののバンドを示し、その分
子量は約４２ｋＤａである。左から３つ目のレーンは、
１０ｎＭのＧＲＦａはリセプターに架橋できるヨード化
したＧＲＦ類似体と競合することを示しており、従って
バンドは全く見られない。４番目と５番目のレーンは、
それぞれヨード化され精製されたリセプターとヨード化
され光架橋されたリセプターに対するＮ−グリコシダー
ゼの影響を示す。レーン６と７はそれぞれ、ＧＨＲＨ−
Ｒに光架橋したヨード化したＧＨＲＨ類似体とヨード化
され精製されたリセプターを流した。光架橋したリセプ
ターは分子量が大きく、Ｎ−グリコシダーゼで処理した
試料は分子量が小さいことに注目すべきである。
【図１２】 図１２は、哺乳動物細胞株での成長ホルモ
ン放出ホルモンリセプターの発現に有用なプラスミッド
を調製するための操作法のフローチャートである。
【図１３】 図１３は、ＨＡＰ挿入体、種々の制限部位
およびプラスミッドの他の特徴を示す、プラスミッドｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔを表している。
【図１４】 図１４は、ＨＡＰ挿入体、種々の制限部位
の相対的位置およびプラスミッドの他の特徴を示す、プ
ラスミッドＣＤＭ８を表している。
【図１５】 図１５は、アンギオテンシンＡＴｌまたは
ＨＡＰ含有ペクターでトランスフェクションしたＣＯＳ
細胞への１２５Ｉ−ＧＨＲＨａの結合を示す捧グラフで
ある。棒は、１２５Ｉ−ＧＨＲＨａと、または徐々に増
加する濃度の非ヨード化ＧＲＦの存在下でインキュベー
トした後の細胞に結合した総カウントを示す。１００ｎ
ＭのＶＩＰの存在下での１２５Ｉ−ＧＨＲＨａとＣＯＳ
細胞とのインキュベートは、ＧＨＲＨａの結合カウント
に何の影響もなかった。
【図１６】 図１６は、ＨＡＰ７ｃＤＮＡ、またはラッ
トのアンギオテンシンリセプターをコードする遣伝子を
含有するｐＣＤＭ８でトランスフェクションした細胞膜
に対する、ヨード化ＧＨＲＨａの結合を示す。増加する
涜度の競合ペプチドの存在下での結合が示されている。
黒丸は、ＧＨＲＨ−Ｒをコードする遺伝子（ＨＡＰ７）
でトランスフェクションした細胞から形成した膜に対す
る、非ヨード化ＧＨＲＨの存在下での結合を示す。四角
は、ラットのアンギオテンシンリセプターをコードする
遺伝子でトランスフェクションした細胞から形成した膜
に対する非ヨード化ＧＨＲＨの存在下での結合を示す。
黒三角は、ＧＨＲＨ−Ｒをコードする遺伝子（ＨＡＰ
７）でトランスフェクションした細胞から形成した膜に
対するＰＡＣＡＰの存在下での結合を示し、白三角はＶ
ＩＰ存在下での結合を示し、白丸はセクレチンの存在下
での結合を示す。非特異的結合はＣＯＳ細胞膜中の総カ
ウントの２０−３０％であり、粗下垂体膜では４０−６
０％であった。
【図１７】 図１７は、徐々に増加する濃度の競合ペプ
チドの存在下でのヒツジの下垂体中の１２５Ｉ−ＧＨＲ
Ｈａの結合を示す。黒丸はＧＨＲＨａを示し、黒三角は
ＰＡＣＡＰを示し、そして白三角はＶＩＰを示す。
【図１８】 図１８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す
アミノ酸配列のハイドロパシープロットを示す。 Ｓは
推定されるシグナルペプチドを示し、１−７は推定され
るトランスメンブランスパニングらせん（ｔｒａｎｓｍ
ｅｍｂｒａｎｅｓｐａｎｎｉｎｇ ｈｅｌｉｃｓ）を示
す。
【図１９】 図１９は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示
すアミノ酸配列のハイドロパシープロットを示す。Ｓは
推定されるシグナルペプチドを示し、１−７は推定され
るトランスメンブランスパニングらせん（ｔｒａｎｓｍ
ｅｍｂｒａｎｅｓｐａｎｎｉｎｇ ｈｅｌｉｃｓ）を示
す。
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 成長ホルモン放出ホルモン
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は米国特許出願０７／９０２，８２
６号（１９９２年６月２３日出願）の一部継続出願であ
る。
【０００２】
【発明の分野】本発明はホルモンリセプターの単離、性
状解析および産生に関し、さらに詳しくは成長ホルモン
放出ホルモンリセプターの精製と性状解析に有用な方法
と組成物、精製された成長ホルモン放出ホルモンリセプ
ターの単離と配列決定、成長ホルモン放出ホルモンリセ
プターまたは生物活性のあるその断片をコードする遺伝
子のクローニング、成長ホルモン放出ホルモンリセプタ
ーまたは生物活性のあるその断片をコードする組換えＤ
ＮＡを有する生きている細胞株、および成長ホルモン放
出ホルモンリセプターまたは生物活性のあるその断片を
産生する方法に関する。
【０００３】
【発明の背景】成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）
は視床下部から分泌され、下垂体前葉からの成長ホルモ
ン（ＧＨ）の放出を刺激する。ＧＨＲＨは、グルカゴ
ン、セクレチン、ＶＩＰ（血管作動性小腸ペプチド）、
ＰＨＩ（ペプチドヒスチジンイソロイシン）、ＰＡＣＡ
Ｐ（下垂体性アデニレートサイクラーゼ活性化ペプチ
ド）、ＧＩＰ（胃抑制ペプチド）、およびヘロデルミン
（ｈｅｌｏｄｅｒｍｉｎ）を含む同族ペプチドのファミ
リーの一員である。ＧＨＲＨは広く研究されているがＧ
ＨＲＨリセプター（ＧＨＲＨ−Ｒ）（ＧＨＲＨは下垂体
前葉でＧＨＲＨ−Ｒに結合してＧＨの放出を誘導する）
についてはほとんど知られていない。
【０００４】クローン化ＧＨＲＨリセプターの大規模製
造は多数のＧＨＲＨ類似体のスクリーニングを可能に
し、成長疾患の臨床的治療における改良されたアゴニス
トやアンタゴニストの開発を促進するであろう。さらに
詳しくはＧＨＲＨ活性に対する多数の類似体や生体異物
のスクリーニングは、成長ホルモン欠損児童の臨床的治
療や、成人の栄養状態の改善や身体組成（筋肉対脂肪）
を変化させるための臨床治療に使用される、改良された
アゴニストの開発につながる。おそらくはリセプターの
構造に基づくコンピューターモデルに支援されるこのよ
うなスクリーニングはまた、例えばミルクの産生増加法
や脂肪の少ない家畜の収率増加法を開発するなどの、医
学や獣医学分野で特に有用な、経口的に活性のある非ペ
プチド性ＧＨＲＨアゴニストの開発を可能にするであろ
う。
【０００５】ＧＨＲＨ−Ｒと相互作用する薬剤の商業的
利用法では、純粋な型のＧＨＲＨ−Ｒのソースや適切な
結合測定法が必要である。
【０００６】ＧＨＲＨリセプターの単離とクローニング
およびそのインビトロでの発現により、（１）体内のＧ
ＨＲＨリセプターの分布をマッピングするためのｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究、および下垂体以
外でのその生理学的意義の可能性の試験（これはこのペ
プチドが濃縮されていると考えられている脳、生殖器、
膵臓、胎盤および消化管中のＧＨＲＨの役割の可能性を
明らかにするかも知れない）、（２）特異的に調整され
たアゴニスト／アンタゴニスト分子の追跡のための、構
造／機能相関や第２のメッセンジャー相互作用を調べる
ための突然変異したリセプターまたはキメラリセプター
に関するリセプター構造の研究、（３）特にグルカゴン
／セクレチン／ＶＩＰファミリーにおける、他のＧ−蛋
白結合リセプターに対するＧＨＲＨ−Ｒの進化適関係の
理解、（４）配列類似性を有すると考えられるこのサブ
ファミリーの他のメンバーのクローニングを可能にす
る。
【０００７】機能性リセプタークローンを得るには、以
下のようないくつかの経路がある。Ａ．部分的蛋白配列
を得るためのリセプター蛋白の精製；この部分的蛋白配
列は次に、対応するヌクレオチド配列に適切なＤＮＡを
スクリーニングするためのプローブを作成するのに使用
される。Ｂ．ＧＨＲＨリセプターに関連すると考えられ
る既知のリセプターに類似の配列についてＤＮＡのスク
リーニング。Ｃ．蛋白として発現された時ＧＨＲＨリセ
プターを生成するＤＮＡのスクリーニング（このＧＨＲ
Ｈリセプターは、ＧＨＲＨ結合、生物活性、またはＧＨ
ＲＨリセプター抗体により検出されるであろう）。ＧＨ
ＲＨリセプターを同定し発現されたクローンを性状解析
するのに、いかなる考え得るクローニング法においても
ＧＨＲＨと関連ペプチドを用いる結合測定法や機能的測
定法が必要であることに注意しなければならない。
【０００８】残念ながら下垂体性リセプターの精製は、
組織中の量が少ないこと、そしてリセプターを活性型で
可溶化し、効率的な精製法の開発が難しいことなどによ
り、非常に困難である。たとえリセプター蛋白が単離さ
れても、下垂体組織中の濃度が低く、ＧＨＲＨ−Ｒリセ
プターをコードする遺伝子のＤＮＡプローブを産生する
のに充分な部分的蛋白配列決定を実施するための多量の
リセプターを充分に産生させることは、きわめて難し
い。さらにＧＨＲＨ−Ｒリセプターはグリコシル化され
ている考えられているため細菌が生物活性のあるリセプ
ターまたはその断片を発現することは不可能かも知れな
い。
【０００９】従ってＧＨＲＨ結合測定法に対するニーズ
や、その測定法中で使用される、ＧＨＲＨリセプターを
性状解析し単離するのに有用な組成物に対するニーズが
存在する。特にリセプター蛋白を精製しリセプタークロ
ーンを同定する方法が開発できるように、リセプター
（ＧＨＲＨ−Ｒ）−リガンド（ＧＨＲＨまたはＧＨＲＨ
類似体）複合体のサイズ、グリコシル化、可溶性および
安定性の点で下垂体性ＧＨＲＨリセプターを性状解析す
ることができる方法に対するニーズがある。また精製さ
れたまたは部分的に精製されたＧＨＲＨ−Ｒに対するニ
ーズおよびこれを得るための方法に関するニーズがあ
る。部分的に精製されたＧＨＲＨ−Ｒとは、下垂体前葉
細胞の多くの有機マトリックスから単離されたＧＨＲＨ
−Ｒを有するＧＨＲＨ−Ｒ単離物が形成されることを意
味する。このＧＨＲＨ−Ｒ単離物はＧＨＲＨ−Ｒ配列の
決定を可能にする純度を有するが、これにはスクリーニ
ングを妨害するであろう任意の残存化合物（例えばＧ−
蛋白）を除去するというさらなる精製操作が必要である
ことを理解すべきである。しかし本発明の抽出法や単離
法により産生される本発明のＧＨＲＨ−Ｒ単離物は、下
垂体前葉に自然に存在する濃度より高い濃度でＧＨＲＨ
−Ｒを含有し、このＧＨＲＨ−Ｒは、必要な場合はＧＨ
ＲＨ−Ｒの配列決定を妨害するであろう任意の化合物を
除去することにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてさらに
精製することができる。本発明はまた、ＧＨＲＨ−Ｒの
配列決定、またはＧＨＲＨ−Ｒの結合活性のバイオアッ
セイに使用するのに充分な純度のＧＨＲＨ−Ｒの産生を
包含する。
【００１０】さらにＧＨＲＨ−Ｒまたは生物活性のある
その断片をコードする遺伝子のクローニング法、そして
成長ホルモン放出ホルモンリセプターおよび生物活性の
あるその断片をコードする、単離され精製された核酸配
列に対するニーズがある。またＧＨＲＨ−Ｒの活性を有
する蛋白またはポリペプチドをコードする核酸配列より
なるベクター、宿主細胞、または宿主生物に対するニー
ズがある。
【００１１】ＧＨＲＨは非特異的結合が強く（ＧＨＲＨ
またはＧＨＲＨ類似体が特異的にＧＨＲＨ−Ｒに結合し
ているか否かを決定することが困難になる）、またごく
わずかにしか存在しないため、ＧＨＲＨ−Ｒを扱うこと
は歴史的に困難であった。従来の作業ではＧＨＲＨ類似
体のガラスやプラスチックへの非特異的結合が大きな問
題であり、リセプター結合に関する研究の正確性や再現
性が制限されてきた。陰性に荷電したＧＨＲＨペプチド
の「粘性」のため、単純な濾過タイプの結合測定法は不
可能であった。非特異カウントがあまりにも高すぎ特異
的結合の検出が困難である。さらに一般に使用されるブ
ロッキング剤であるポリエチレニミン（Ｐｏｌｙｅｔｈ
ｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（グラスファイバーフィルターへ
の蛋白の非特異的結合をブロッキングする）は陽性に荷
電しており、ＧＨＲＨ類似体（陰性に荷電している）に
非特異的に結合する。さらにＧＨＲＨ−Ｒを精製するた
めの作業を大きく促進する高結合活性を有する可溶性リ
セプター調整物は入手できない。
【００１２】これまでの研究では、ＧＨＲＨ−Ｒをその
プローブ（例えばＧＨＲＨや関連ペプチド）に対する親
和性、およびＧ−蛋白に対する結合性に関して性状解析
してきた。ＧＨＲＨリセプターを標識するのに非特異的
化学架橋剤を使用することも試みられてきた。例えばザ
イスク（Ｚｙｓｋ）ら、「下垂体前葉細胞における成長
ホルモン放出因子結合蛋白の架橋」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６１：１６７８（１９８６），およびベリ
セレビ（Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｉ）ら、「成長ホルモン放
出因子の下垂体性リセプターへの共有架橋」、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１８：１２７８（１９８６）を
参照。これらの２つの結果はそれぞれ、下垂体前葉に２
６ｋＤａと７０ｋＤａのＧＨＲＨ−リセプターが存在す
ることを示唆している。これらの２つの研究で見いださ
れた分子量の差は、ＧＨＲＨ−Ｒを単離し性状解析する
ことのむずかしさと、ＧＨＲＨ−Ｒを単離し性状解析す
るのに有用な改良された方法と組成物が必要であること
を強調している。
【００１３】ラットの下垂体前葉へのＧＨＲＨの結合
は、ＧＴＰに影響され、これがＧＨＲＨリセプターのＧ
ＨＲＨへの親和性を低下させる（ＧＴＰはＧ−蛋白ＧＨ
ＲＨ−リセプター複合体の結合をはずすと言われてい
る）。ＧＨＲＨに結合したＧＨＲＨ−Ｒの高親和性状態
は、グアニンヌクレオチド制御蛋白との相互作用で、ホ
ルモン−リセプター−Ｇ−蛋白三重複合体を形成して安
定化されると考えられている。ＧＴＰはＧ−蛋白−リセ
プター相互作用を不安定化させ、ＧＨＲＨ／ＧＨＲＨ−
Ｒ−Ｇ−蛋白複合体の解離を引き起こし、独立したリセ
プターを低親和性状態に戻し、放出されたＧ−蛋白はそ
の第２のメッセンジャー系を活性化するという仮説があ
る。ストルザース（Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ）ら、「ラット
の下垂体リセプターへの成長ホルモン放出因子の結合の
ヌクレオチドによる制御」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ、１２４：２４−２９（１９８９）を参照。
【００１４】ヒツジやウシの下垂体前葉組織では、ＧＨ
ＲＨとその類似体はＶＩＰまたはＰＡＣＡＰより５００
から１，０００倍低濃度のＧＨＲＨ類似体のＧＨＲＨａ
（この調整法は後述）により置換されることが、発見さ
れている。この知見は、ヒトの膵臓（セクレチンとＶＩ
Ｐリセプターのソース）での、ＧＴＰの存在下でアデニ
レートサイクラーゼを刺激する能力はセクレチン＞ヘロ
デルミン＞ＰＨＩ≧ＶＩＰ＞ＧＨＲＨ（１−２７）ＮＨ
２の順である、結合性に相補的なものである。同様に
１２５Ｉ−セクレチンを用いて得られたＫｄは、セクレ
チン０．８ｎＭ、ヘロデルミン２００ｎＭ、ＰＨＩ２５
０ｎＭであった。ＶＩＰとＧＨＲＨ（１−２９）−ＮＨ
２は１０μＭでわずかに２０％の阻害を誘導するのみで
ある。
【００１５】生理学的投与量以上ではＧＨＲＨはＶＩＰ
リセプターとして作用することが知られており、逆にＶ
ＩＰは弱いＧＨＲＨアゴニストである。
【００１６】ホルモンリセプターの単離と性状解析につ
いて背景的情報を与える論文としては以下のものがあ
る。クリストファー（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ）ら、
「ＶＩＰ／ＰＨＩ／セクレチン−ヘロデルミン／ヘロス
ペクチン／ＧＲＨファミリー：組織膜のパネル中のリセ
プターとアデニレートサイクラーゼに対する、インビト
ロで試験した天然のペプチド、その前駆体および合成類
似体の構造機能相関」、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎ
ｅｓ Ａｓ Ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅｓ： Ｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｎｇ， ＢｉｏｌｏｇｉＣａｌ Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ジーン・マルチネ（Ｊ
ｅａｎ Ｍａｒｔｉｎｅｚ）編、エリス・ホーウッド・
リン（Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｉｍ。）出版、
チチェスター（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）、英国、１９８
９、チチェスター（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）、英国。ラ
ブルセ（Ｌａｂｕｒｔｈｅ）ら、「血管作動性小腸ペプ
チドリセプターの分子学的解析：ＶＩＰ関連ペプチドの
リセプターとの比較」、ＡｎｎＮＹ Ａｃａｄ・Ｓｃ
ｉ．、５２７：２９６−３１３（１９８８）。フローム
（Ｆｒｏｈｍ）ら、「成長ホルモン放出ホルモン」、Ｅ
ｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ．、７：２２３−２５３（１９８
６）。サイフェルト（Ｓｅｉｆｅｒｔ）ら、「ラットの
下垂体前葉膜のホモゲネート中の成長ホルモン放出因子
結合部位：グルココルイコイドによる調節」、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１７：４２４−４２６（１９８
５）。ビレジクジアン（Ｂｉｌｅｚｉｋｊｉａｎ）ら、
「成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）に対する脱感作はＧ
ＲＦ−結合部位のダウンレギュレーションに関連してい
る」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１８：２０４５
−２０５２（１９８６）。イシハラ（Ｉｓｈｉｈａｒ
ａ）ら、「血管作動性小腸ポリペプチドに対する新規リ
セプターの機能性発現と組織分布」、Ｎｅｕｒｏｎｎ、
８：８１１−８１９（１９９２）。イシハラ（Ｉｓｈｉ
ｈａｒａ）ら、「セクレチンリセプターをコードするＣ
ＤＮＡの分子クローニングと発現」、ＥＭＢＯ Ｊ、１
０：１６３５−１６４１（１９９１）。リン（Ｌｉｎ）
ら、「アデニレートサイクラーゼ共役カルシトニンリセ
プターの発現クローニング」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５
４：１０２２−１０２４（１９９１）。ジュップナー
（Ｊｕｐｐｎｅｒ）ら、「副甲状腺ホルモンのＧ蛋白結
合リセプターと副甲状腺ホルモン関連ペプチド」、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２５４：１０２４−１０２６（１９９
１）。フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎｎ）ら、「トランス
ジェニックマウスにおけるヒト成長ホルモン放出因子組
織分布と分子不均一性」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ、１２７：２１４９−２１５６（１９９０）。パウル
（Ｐａｕｌ）ら、「肺から可溶化された血管作動性小腸
ペプチドのリセプターの性状解析」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．、２６２：１５８−１６２（１９８７）。ギジ
ャロ（Ｇｕｉｊａｒｒｏ）ら、「ラット肝からの血管作
動性小腸ペプチドの活性で安定なリセプターの可溶
化」、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２
５：３７−５０（１９８９）。クロニン（Ｃｒｏｎｉ
ｎ）ら、「ヒトの腫瘍から分泌される成長ホルモン放出
因子の生物活性」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２４
４（ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ）Ｅ３４６−Ｅ３
５３（１９８３）。レオン（Ｌｅｏｎｇ）ら、「培養し
たオスおよびメスの下垂体細胞のラクトトロープ（Ｌａ
ｃｔｏｔｏｒｐｅｓ）とソマトトロープ（Ｓｏｍａｔｏ
ｔｒｏｐｅｓ）の数：マモソマトトロープ（Ｍａｍｍｏ
ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｅｓ）の亜集団の証明」、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１１６：１３７１−１３７８
（１９８５）。ムンソン（Ｍｕｎｓｏｎ）ら、「リガン
ド：リガンド結合系の性状解析用の多用なコンピュータ
ーアプローチ」、Ａｎａｌ・Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０
７：２２０−２３９（１９８０）。ウェッセル（Ｗｅｓ
ｓｅｌ）ら、「界面活性剤と脂質の存在下での希薄溶液
中の蛋白の定量的回収法」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、１３８：１４１−１４３（１９８４）。バグナト
（Ｂａｇｎａｔｏ）ら、「培養したグラニュローサ（Ｇ
ｒａｎｕｌｏｓａ）細胞中の成長ホルモン放出因子のリ
セプターのゴナドトロピン誘導発現」、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、１２８、２８８９−２８９４（１９９
１）（バグナト（Ｂａｇｎａｔｏ）らが研究した組成物
は、下垂体組織の結合性とは異なるＧＨＲＨ結合性を示
している）。ここに記載したすべての論文および他の資
料は参考のため本明細書中に引用されている。
【００１７】前述の研究はＧＨＲＨ−Ｒの挙動の初歩的
理解に有効ではあるが、ＧＨＲＨ−Ｒのさらなる性状解
析を可能にしＧＨＲＨ−Ｒの精製とクローニングを可能
にする、ＧＨＲＨ−Ｒの高感度で再現性のある測定法に
対するニーズが存在する。このような測定法はＧＨＲＨ
とＧＨＲＨ類似体の非特異的結合の問題を克服しなけれ
ばならない。ＧＨＲＨ類似体の高い比活性の得られるヨ
ード化と精製により、粗下垂体前葉膜に対する特異的結
合が改良される。
【００１８】ＧＨＲＨ−Ｒリセプターのクローニングと
配列決定に対する多くの経路が可能であるが、使用する
経路にかかわらず相当の障害を克服しなければならな
い。そのような問題の１つの例は、ＶＩＰリセプターの
クローニングと発現作業に見られる。ＶＩＰリセプター
をクローン化し発現したという最初の主張は、後の文献
で拒絶され、このため他のリセプターのクローン化と発
現が間違った方向に進んでしまった。スリーダラン（Ｓ
ｒｅｅｄｈａｒａｎ）ら、「ヒト血管作動性小腸ペプチ
ドリセプターのクローニングと発現」、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：４９８６−４
９９０（１９９０）；クック（Ｃｏｏｋ）ら、「提唱さ
れたヒトＶＩＰリセプターのイヌの同族体をコードする
ＲＤＣｌ遺伝子の性状解析」、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、
３００：１４９−１５２（１９９１）。ＧＨＲＨ−Ｒの
クローニングと発現については、哺乳動物中に存在する
ＧＨＲＨ−Ｒの量が微量であるため、充分な量の純粋な
リセプターを集めてアミノ酸配列を決定しＧＨＲＨ−Ｒ
に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（これは次にＣ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用される）を
作成することが困難である。さらにプローブにもハイブ
リダイズする同族の遺伝子と区別できる充分に強いシグ
ナルを与える充分なＧＨＲＨ−Ｒ遺伝子を含むＣＤＮＡ
ライブラリーを見つける必要がある。最後に、現在の技
術はＧＨＲＨ−Ｒの最初のスクリーニングに使用される
ほど感度が高くないため（これはリセプターの非特異的
結合と微量のためである）、リセプターの発現のための
形質転換細胞のスクリーニングの繰り返しが必要な発現
クローニングは、ＧＨＲＨ−Ｒのクローニングには非現
実的である。従ってＧＨＲＨ−Ｒと生物活性のあるその
断片をコードする遺伝子のクローニングと発現方法に対
するニーズ、およびＧＨＲＨ−Ｒまたは生物活性のある
その断片の組換えＤＮＡを有する生きている細胞株に対
するニーズがある。またＧＨＲＨ−Ｒまたはその断片と
相互作用する化合物を試験するためのＧＨＲＨ−Ｒまた
は生物活性のあるその断片を利用するスクリーニング法
に対するニーズがある。ＧＲＦは注射により投与される
必要があるため、そのような測定法は経口投与が可能で
ＧＨＲＨ−Ｒまたはその断片と相互作用する化合物を探
索することが極めて重要である。そのような測定法は、
またアゴニストとしてまたはＧＨＲＨ−Ｒまたはその断
片のアンタゴニストとして相互作用する他の化合物を見
つけるためにも極めて重要である。従って本発明の主目
的は、リセプターに結合するＧＨＲＨの感度のよい再現
性のある測定法を開発することである。
【００１９】本発明のさらなる目的は、ＧＨＲＨ−リセ
プターを特異的かつ正確に標識する試薬を開発すること
である。
【００２０】本発明のさらに別の目的は、ＧＨＲＨ−リ
セプターの精製方法を開発することと、ＧＨＲＨ−Ｒの
少なくとも部分的配列決定を可能にする充分な純度を有
するかまたはその純度に容易に精製されることができる
ＧＨＲＨ−Ｒ単離物を得ることである。
【００２１】本発明のさらに別の目的は、精製されたＧ
ＨＲＨ−Ｒを産生することである。
【００２２】本発明のさらに別の目的は、ＧＨＲＨ−Ｒ
または生物活性のあるその断片をコードする遺伝子のク
ローニング法を与えることである。
【００２３】本発明のさらに別の目的は、成長ホルモン
放出ホルモンリセプターまたは生物活性のあるその断片
をコードする、単離され精製された核酸配列を与えるこ
とである。
【００２４】本発明のさらに別の目的は、成長ホルモン
放出ホルモンリセプターまたは生物活性のあるその断片
をコードする核酸配列よりなるベクターを与えることで
ある。
【００２５】本発明のさらに別の目的は、成長ホルモン
放出ホルモンリセプターまたは生物活性のあるその断片
をコードする核酸配列よりなる宿主細胞または生きてい
る細胞株を与えることである。
【００２６】本発明のさらに別の目的は、ＧＨＲＨ−Ｒ
または生物活性のあるその断片よりなる薬剤組成物、お
よび内因性ＧＨＲＨに結合するようにまたはリセプター
に結合して活性を誘導またはブロックする抗体を産生す
るように、該薬剤組成物の有功量を投与する方法を与え
ることである。
【００２７】さらに別の本発明の目的は、ＧＨＲＨ−Ｒ
リセプター結合活性のためのペプチドと生体異物の大規
模のスクリーニングを可能にするのに充分な組換えＧＨ
ＲＨ−Ｒを与えることである。
【００２８】
【発明の要約】本発明のこれらおよび他の目的は、粗Ｇ
ＨＲＨ−Ｒ抽出物（単離物）の性状解析と単離を可能に
する、改良されたＧＨＲＨ結合測定法により達成され
る。本発明はＧＨＲＨ−Ｒまたは生物活性のあるその断
片をコードする遺伝子のクローニングを与え、ＧＨＲＨ
−Ｒまたは生物活性のあるその断片のアミノ酸配列、お
よびＧＨＲＨ−Ｒまたはその断片をコードする遺伝子に
ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプ
ローブまたはプライマーを与える。本発明はまた、ＧＨ
ＲＨ−Ｒおよび生物活性のあるその断片をコードする遺
伝子よりなる組換え生物およびその子孫を与え、該組換
え（「形質転換」）生物は形質転換前は、バックグラン
ドレベル以上にＧＨＲＨ−Ｒを発現せず、ＧＨＲＨ−Ｒ
をコードする遺伝子を含まない。下垂体膜または形質転
換またはトランスフェクションした生物中のＧＨＲＨ−
Ｒは、ＧＨＲＨ類似体から形成される放射能標識プロー
ブを用いて性状解析される。ＧＨＲＨ類似体（ＧＲＦ
ａ、ＧＨＲＨａ、またはＧＨＲＨｂ）および他の類似体
は、固相ヨードビーズを用いる好適な実施態様によりヨ
ード化され、モノヨード化物質は逆相高速液体クロマト
グラフィーで精製されて基本的に担体フリー（担体を含
まない）になる。分注や希釈中のＧＨＲＨ類似体のガラ
スやプラスチックへの非特異的結合は、有機溶媒を用い
ることにより実質的に排除されている。好適な実施態様
においては、ＧＨＲＨ類似体の希釈と分注のために５０
％アセトニトリルが使用される。粗下垂体前葉膜ペレッ
トへのＧＨＲＨ−ＧＨＲＨ．の特異的結合は、細孔形成
性抗生物質を添加することにより増加している。好適な
実施態様においては、ＧＨＲＨ特異的結合を増加させる
ために抗生物質アラメチシン（ａｌａｍｅｔｈｉｃｉ
ｎ）（約０．０５ｍｇ／ｍｌ）はホモゲネートした下垂
体前葉膜ペレットと組合される。
【００２９】ＧＨＲＨ−リセプターに対して特異的高親
和性、ＧＴＰ感受け、架橋性を示す紫外線感受性架橋基
（光プローブまたは光親和性プローブ）が調製されてい
る。プローブは光感受性基の位置とスペーサーアームの
長さの両方により異なる。好適な光プローブは、ＧＨＲ
Ｈ類似体である［Ｈｉｓ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲＨ−
（１−３２）−ＮＨ２を、Ｎ−５−アジド−２−ニトロ
ベンゾイルオキシサクシニミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）また
はスルホサクシニミジル−６−（４’−アジド−２’−
ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−ＳＡ
ＮＰＡＨまたはＳＡＮＰＡＨ）と結合させ、ヨード化と
精製をすることにより形成される。好ましくはＡＮＢ−
ＮＯＳへの結合は、１２または２１位のリジンを標的と
する。この化合物は次に１０位のチロシンでヨード化さ
れ、生成物は逆相高速液体クロマトグラフィーにより精
製されて、１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳと呼
ぶ光プロープが形成される。別の実施態様においては、
ＧＨＲＨａのＮ−末端ヒスチジンを標的にしてＳＡＮＰ
ＡＨを結合させ、逆相高速液体クロマトグラフィーで精
製し、ＧＨＲＨａの１０位のチロシンをヨード化し、高
速液体クロマトグラフィーで再精製することにより、光
プローブ１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＳＡＮＰＡＨが形成さ
れる。
【００３０】前述の光親和性プローブを用いて、ＧＨＲ
Ｈ−Ｒに結合したＧＨＲＨａの可溶性複合体を産生する
ことが可能であることが、驚くべきことに発見された；
共有結合的に加養した複合体は、強くない界面活性剤溶
液（好ましくは蛋白を可溶化できる両性イオン性界面活
性剤を含み、このような界面活性剤として、例えば３−
［（３−コラミドプロピル）−ジメチル−アモニオ］−
１−プロパンスルホネートがあり、これはＣＨＡＰＳと
呼ばれ、カリホルニア州アービン（Ｉｒｖｉｎｅ）のピ
アス（Ｐｉｅｒｃｅ）社またはＩＣＮバイオメディカル
ズ社から入手できる）中で容易に可溶化され、非特異的
に架橋した汚染物質はこの強くない界面活性剤溶液中に
溶解されない。次に非架橋複合体はまたこれらの条件下
で可溶化されることが発見された。光架橋は可溶化の後
に行われ、リセプター（ＧＨＲＨ−Ｒ）とリガンド（Ｇ
ＨＲＨ−プローブ）は安定な可溶性複合体を形成してい
ることがわかった。好適な実施態様において、これはＣ
ＨＡＰＳ含有溶液による抽出で非特異的結合したＧＨＲ
Ｈの約９０％の排除と、活性炭／デキストランにより遊
離のペプチドの除去を可能にする。これによりＧＨＲＨ
結合測定法は大いに改善される。
【００３１】別の実施態様においてＧＨＲＨまたはＧＨ
ＲＨ類似体への官能基の結合による親和性クロマトグラ
フィーにより部分的に精製されたＧＨＲＨ単離物が得ら
れ、これは支持体上に固定化された化合物に対して親和
性がある。好適な実施態様においては、ＧＨＲＨａのビ
オチン化誘導体はＧＨＲＨ−Ｒに結合され、可溶化さ
れ、次にストレプトアビジンカラムに固定化される。結
合したＧＨＲＨ／ＧＨＲＨ−Ｒ複合体は緩衝液中でｐＨ
５．０で解離し、こうしてＧＨＲＨ−Ｒのアミノ酸配列
を決定するのに使用することができる部分的に精製され
たＧＨＲＨ−Ｒ単離物を生成することが発見されてい
る。ＧＨＲＨ−Ｒは好適な実施態様においてはＳＤＳ−
ＰＡＧＥを用いてＧＨＲＨ−Ｒ単離物をさらに精製し
て、配列決定を妨害するような化合物（例えばＧ−蛋
白）を除去して、精製ＧＨＲＨ−Ｒを生成することによ
り得られる。
【００３２】さらに別の実施態様において本発明は、Ｇ
ＨＲＨ−Ｒまたは生物活姓のあるその断片をコードする
遺伝子のクローニングを与える。
【００３３】好ましくはＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白
またはペプチドをコードする遺伝子を単離し、ベクター
ＤＮＡと結合させて組換えＤＮＡを作成する。該遺伝子
を含有するベクターＤＮＡは、原核性または真核性細胞
中で複製することができる。ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する
蛋白またはポリペプチドをコードする遺伝子はベクター
中でプロモーターの顆粒に存在し、ベクターの一部とし
て複製される。次に組換えＤＮＡは、あらかじめ該遺伝
子を有してはいない宿主細胞中に挿入され、ＧＨＲＨ−
Ｒまたは生物活性のあるその断片を発現することができ
る形質転換またはトランスフェクションされた細胞株を
生成する。
【００３４】好適な実施態様において、ベクターλｇｔ
１０中に挿入されたヒト末端巨大症からの成長ホルモン
分泌性下垂体腫瘍から調整されたＣＤＮＡライブラリー
は、ラットセクレチンリセプター（ＲＳ−Ｒ）ｃＤＮＡ
に基づくプローブで低緊縮性でスクリーニングされる。
驚くべきことに、ラットのセクレチンリセプターのｃＤ
ＮＡに基づくプローブは、ＧＨＲＨ−Ｒリセプターをコ
ードするヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリ
ダイズするが、ヒトセクレチンリセプターのクローンは
ヒトの末端巨大症の下垂体（ＨＡＰ）腫瘍ライブラリー
中には有意な量見いだされないことが発見された。この
驚くべき発見（例えばＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白ま
たはポリペプチドをコードするＤＮＡは正常な下垂体組
織よりも多量に見いだされ、セクレチンまたは他の関連
リセプターからの実質的な競合活性は存在しない）は、
ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白またはポリペプチドをコ
ードする遺伝子のクローニングの成功を可能にした。特
に重要なことは、ラットの小脳中にはセクレチンリセプ
ターは検出されないという報告にもかかわらず、ラット
の小脳はＰＣＲを用いて増幅して本明細書中で使用され
るＲＳ−Ｒプローブを産生するのに充分なセクレチンを
含有していたという驚くべき発見である。イシハラ（Ｉ
ｓｈｉｈａｒａ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：１６３５
−１６４１（１９９１）を参照。
【００３５】好ましくは、ＲＳ−Ｒプローブにハイブリ
ダイズするファージのプラーク精製の後に、λｇｔ１０
からクローン化した遺伝子を切取り、プラスミッドｐＧ
ＥＭ７Ｚｆ（＋）に挿入し、次にこれを用いて大腸菌を
形質転換する。挿入された遺伝子はジデオキシ鎖停止法
により配列決定をした後、大腸菌中でプラスミッドを複
製（増幅）し精製する。次にリセプターｃＤＮＡに似て
いる部分配列から標識したオリゴヌクレオチドプローブ
を調製し、ベクターλＢｌｕｅｍｉｄ中の末端巨大症下
垂体（ＨＡＰ）腫瘍ｃＤＮＡライブラリーの高緊縮性ス
クリーニングに使用される。ベクターλＢｌｕｅｍｉｄ
中では挿入体はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミッド
（これはクローニングの目的のためにＧＨＲＨ−Ｒをコ
ードする全遺伝子の理諭的サイズの大きさの挿入体を運
搬することができる）中に含有される。これにより全Ｇ
ＨＲＨ−Ｒのクローニングと配列決定が可能になった。
好適な実施態様において、ＧＨＲＨ−Ｒをコードする遺
伝子は真核性発現ベクター中に挿入され、ＧＨＲＨ−Ｒ
は哺乳動物細胞株中で発現される。
【００３６】本発明は成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨ
ＲＨ）リセプター活性を有する実質的に純粋な蛋白およ
び生物活性のあるその断片に関する。このリセプターは
膜結合リセプターに対して少なくとも１０，０００倍精
製される。「生物活性のある断片」とは、リセプター特
異的リガンドに結合することができるか、または担体へ
結合した状態または非結合状態でも宿主動物中にＧＨＲ
Ｈ−Ｒ特異的抗血清または第２のメッセンジャー応答を
誘導することができる全長のリセプターの天然または合
成部分を意味する。好適な実施態様において、リセプタ
ーはヒトのソースから得られるが、同族のリセプターは
また脊椎動物（例えばサカナ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウ
シ、ブタ、ネズミ、ウマ、イヌ、およびネコがあるが、
これらに限定されるものではない）からも得られる。
【００３７】本発明はまた、薬剤として許容される担体
とともに有功量の純粋なリセプターまたはその断片、ま
たはＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白およびポリペプチド
よりなる薬剤組成物に関し、そのような薬剤組成物の治
療上の使用法を与える。リセプターとリセプター断片
（ＧＨＲＨ−Ｒリガンド結合活性または免疫学的活性を
有する蛋白やポリペプチド）は、ＧＨＲＨ類似体を同定
するためのスクリーニング法や、リセプター部位でＧＨ
ＲＨアンタゴニストとして作用する化合物を同定するた
めのスクリーニング法として有用である。これらはま
た、ＧＨＲＨ−Ｒ特異的抗体を作るのに有功であり、こ
れらの抗体はリセプター部位をブロッキングすることに
よりＧＨＲＨ結合を有功に防ぎ、これにより増殖を阻止
する。ＧＨＲＨ−リセプターを活性化するのに他の抗体
（例えばバセドウ病を引き起こすような甲状腺刺激抗
体）を使用することもできる。リセプターまたはセグメ
ントの断片を含む薬剤組成物は、過剰の循環ＧＨＲＨに
起因するかまたは関連する疾患の治療に使用することも
できる。そのような組成物は、循環ＧＨＲＨに結合し
て、内因性リセプターに結合するのを防ぐように、イン
ビボ投与して使用される。
【００３８】好適な実施態様において、本発明はＧＨＲ
Ｈリセプターをコードする単離された核酸配列、該配列
を含む組換えベクター、およびＧＨＲＨ−リセプターま
たは生物活性を有するその断片（ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有
する蛋白やポリペプチドを含む）の産生に有用な該配列
を有する宿主細胞を与える。
【００３９】ＧＨＲＨ−リセプターのクローニングの全
体的なアプローチは、（１）ＧＨＲＨ−リセプターの性
状解折、（２）ＧＨＲＨ−リセプターを単離するための
ＧＨＲＨ−リセプターの特徴に関する情報の利用、
（３）ＧＨＲＨ−リセプター（またはＧＨＲＨ−リセプ
ターの一部）のペプチド配列の決定、（４）ｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするための縮重オリゴヌク
レオチド配列（これはＧＨＲＨ−リセプターと同族のリ
セプターに由来するかも知れない）の使用によるＧＨＲ
Ｈ−リセプターの産生に関与するＤＮＡ配列の決定、そ
して（５）ＤＮＡ配列のクローニングよりなる。
【００４０】ＧＨＲＨ−Ｒの性状解析 ＧＨＲＨ結合測定法 １つの面において本発明は、高親和性のＧＨＲＨ特異的
でＧＴＰ依存性結合を示す、ＧＨＲＨ−リセプターに対
するＧＨＲＨ結合の、高感度で再現性のある測定法に関
する。陰性に荷電したＧＨＲＨペプチドの強い非特異的
結合のため、単純な濾過タイプの結合測定法は不可能で
あった。本発明の測定法では特異的結合（１０ｎＭのＧ
ＨＲＨａによるホモゲナイズした膜ペレットから除去さ
れる１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ結合により産生されるガン
マ、γ線のカウントと定義される）は粗膜ペレットに結
合した総カウントの３０から６０％であり、強くない界
面活性剤（例えばＣＨＡＰＳ）や活性炭／デキストラン
処理による抽出の後のカウントの９０％までである。本
発明の結合測定法の好適な実施態様は、穏やかな固相ヨ
ード化法、担体フリーのリガンドの高速液体クロマトグ
ラフィー精製、ＧＨＲＨａの定量的分注のための有機溶
媒系、プローブの生物活性を確認するための平板細胞測
定用および逆溶血プラーク測定法、約０．０５ｍｇ／ｍ
１のアラメチシンの使用、下垂体膜ペレットへの特異的
放射能リガンドの結合を増加させるための細孔形成性抗
生物質などの多くの因子よりなる。アラメチシンは特異
的結合を増加させ、捕捉されるカウントを減少させる。
洗浄により回収されるカウントが減少し、特異的結合の
相対量を増加させる。
【００４１】リセプター結合研究の好適なＧＨＲＨａ類
似体は［Ｈｉｓ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲＨ−（１−３
２）−ＮＨ２（ＧＨＲＨａと呼ぶ）である。ＧＨＲＨ類
似体は良好なＧＨＲＨ−Ｒ結合能を有するペプチドであ
り、長さはヒトの配列とは異なり、２つのアミノ酸を有
し、これらはヨード化の基質としての使用を促進するよ
うに変更されている。ＧＨＲＨａの好適なソースはペニ
ンシュララボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ベルモント、カリホルニア州）
である。
【００４２】最適の比活性と生物活性を有するヨード化
ＧＨＲＨ類似体を調製するには、まず固相ヨードヒーズ
（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手できるようなもの）
を用いてＧＨＲＨ類似体（光プローブを含む）をヨード
化し、次にモノヨード化物を逆相高速液体クロマトグラ
フィー（好ましくはフルオロカーボンを基礎にしたバイ
オシリーズ（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｉｅｓ）ポリＦカラム（マ
クモッド（ＭａｃＭｏｄ）より入手出来る））で基本的
に担体フリーにする。有機溶媒（好ましくは水溶液中の
５０％のアセトニトリル）を担体として用いて、定量的
希釈と分注がなされる。こうして水性ビヒクル（ｖｅｈ
ｉｃｌｅｓ）を用いることによる不正確で再現性の悪い
希釈は避けられる。
【００４３】細孔形成性抗生物質を粗下垂体前葉膜ペレ
ットと組合せると、驚くべきことに特異的結合が約３倍
上昇するということが発見された（例えばストルザース
（Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ、１２４：２４（１９８９）を参照）。好適な実施態
様においては、最適の比活性を得るために５０μｇ／ｍ
ｌの抗生物質アラメチシンが使用される。
【００４４】図１に関して、異なる条件下で処理されて
きた粗膜ペレットに対する１２５Ｉ−ＧＨＲＨａプロー
ブの結合が提供される。４組の３つの棒がある。１つの
組の各棒は、ヨード化プローブとインキュベートした後
に結合した総カウントの割合を示す。３つの各組につい
て、左の棒は、冷ＧＨＲＨまたはＧＨＲＨａと競合する
かまたはＧＨＲＨａ結合を妨害することが既知の別の化
合物に対してあらかじめ膜を接触させることなく、ヨー
ド化プローブとのみインキュベートした後に結合した総
カウントを示す。中央の棒は１０ｎＭの非標識ＧＨＲＨ
ａ（これは特異的結合物質に競合する）とともにインキ
ュベートに加えたヨード化プローブとのインキュベート
後に結合した総カウントの割合を示す。各組の棒の最も
左の棒と中央の棒の差は、ＧＨＲＨの特異的結合（これ
は存在するＧＨＲＨ−Ｒの量を示す）を示す。右側の棒
は５０μＭのＧＴＰγＳの存在下で１２５Ｉ−プローブ
とインキュベートした後に結合した総カウントの割合を
示す。ＧＴＰγＳはあるリセプター複合体からＧ−蛋白
の解離を起こすことが知られているため、ＧＴＰ７Ｓを
使用している時の特異的結合の減少はＧＨＲＨ−Ｒ−Ｇ
−蛋白複合体の存在に一致している。
【００４５】特異的結合は２０ｐＭのヨード化類似体の
みで見られる結合と、１０ｎＭの非ヨード化ＧＨＲＨａ
の存在下での類似体の結合との差であると定義される。
飽和結合、スキャッチャード解析；競合研究およびここ
で検討した他のデータは、これらの高親和性部位は特異
的結合部位であることを示している。
【００４６】図２に関して、飽和結合研究はＫｄが約１
６０ｐＭの、単一高親和性部位へのＧＨＲＨ類似体［Ｈ
ｉｓ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ
２（ＧＨＲＨａ）の結合を示す。いくつかの誤差棒は小
さ過ぎ示すことができない（各点につき繰り返し数はＮ
＝６である）。このデータはコンピュータープログラム
リガンドで解折され、これは非変換座標軸系でリガンド
結合式に対して統計的重みづけ最小自乗適合をもとにし
て結合定数を求める。このプログラムは、Ｋｄ＝１５０
±１０ｐＭおよびＲ＝１．５±０．０９ピコモル／ｇｍ
組織（最も適合する値＝適合のおよそのＳＥＭである）
の単一結合部位を報告する。統計的検定はこの単一結合
部位モデルを支持している。点線は結合式中のこれらの
定数を用いて得られた理論曲線を示す。放射能標識した
ＧＨＲＨａの特異的結合は、５０μＭのＧＴＰγＳによ
り６５％まで減少される。関連するペプチドのＶＩＰと
ＰＡＣＡＰは、１００ナノモル濃度でこの結合部位と競
合しなかった。この結合は高親和性Ｇ−蛋白結合ＧＨＲ
Ｈ−Ｒを示す。ＶＩＰリセプターのＶＩＰ結合はスルフ
ヒドリル還元剤に感受性があることは公知である。１ｍ
Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ、関連リセプターへの
高親和性結合を防ぐことが知られている）とプレインキ
ュベートすることによりＧＨＲＨ測定法の中でそのよう
な特異的結合は完全に排除され、これはＧＨＲＨ−Ｒリ
セプターが結合部位であることをさらに支持する結論で
ある。
【００４７】光親和性プローブ 光親和性プローブは光反応性架橋剤を用いて調製され
た。これらのプローブは光感受性基の位置とスペーサー
アームの長さの両方が異なる。プローブは紫外線照射な
しでＧＨＲＨ−Ｒに結合することができ、紫外線照射の
影響でＧＨＲＨ−Ｒに架橋することもできる。光親和性
プローブの好適な非限定例およびその製造方法は以下の
通りである：
【００４８】１）１２５Ｉ−ＧＨＲＨ−Ｒ−ＡＮＢ−Ｎ
ＯＳ ３２個のアミノ酸の［Ｈｉｓ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲ
Ｈ−（１−３２）−ＮＨ２（ＧＨＲＨａ）を、リジン１
２または２１を標的にして試薬Ｎ−５−アジド−２−ニ
トロベンゾイルオキシサクシニミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）
に結合させて、ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳを作成し
た。ヨードビーズを用いてＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳ
をヨード化して放射能リガンド（「光プローブ」１２５
Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳ、「ホットＧＨＲＨａ
−ＡＮＢ−ＮＯＳ」または「ホット光プローブ」（好適
なヨードビーズはピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォ
ード、オリノイ州から入手出来る）を作成した。
【００４９】２）Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＳＡＮＰＡＨ ジメチルホルムアミド溶媒系で、ＧＨＲＨ類似体［Ｈｉ
ｓ１、Ｎｌｅ２７］−ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ２
からＮ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシサク
シニミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）を、ＧＨＲＨａのＮ−末端
ヒスチジンを標的にして、スルホサクシニミジル−６−
（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサ
ノエート（スルホ−ＳＡＮＰＡＨまたはＳＡＮＰＡＨ）
に結合させた。放射能標識した物質を次に、アセトニト
リルの浅い勾配を用いて、フルオロカーボンを基礎にし
たバイオシリーズ（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｉｅｓ）ポリＦカラ
ム上の逆相高速液体クロマトグラフィー（マックモッド
・アナリティカル（Ｍａｃ−Ｍｏｄ Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ）、チャッズフォード（Ｃｈａｄｄｓ Ｆｏｒ
ｄ）、ペンシルベニア州）より入手出来る）により、出
発物質を基本的にフリーになるように精製した。
【００５０】γ線計測によりヒツジの下垂体膜ペレット
中の光プローブ結合を測定し、ドデシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ゲルのオートラジオグラフィーにより紫外線誘導架橋を
測定した。１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ−ＡＮＢ−ＮＯＳプロ
ーブは、親和性約１ナノモルで結合した（ＧＨＲＨａの
約１６０ピコモルに比較して）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはヒ
ツジの下垂体について約５５ｋＤａでバンドを示し（ウ
シの下垂体では５７ｋＤａ）、これは１０ｎＭのＧＨＲ
Ｈａの存在下で完全に排除された；このバンドは５０μ
ＭのＧＴＰγＳにより５０％以上減少し、１００ｎＭの
ＶＩＰにより影響を受けなかった。すなわち５５ｋＤａ
バンドはＧＨＲＨａの光架橋によるものである。図３
は、この特異的５５ｋＤａバンドが、ＣＨＡＰＳ抽出に
より分離されることを示している。図４は、１０ｎＭの
ＧＨＲＨａによる競合を証明している。図５は架橋に対
するＧＴＰγＳの影響を示す。
【００５１】架橋したＧＨＲＨ−リセプターをノイラミ
ニダーゼで処理すると５５ｋＤａバンドが５０ｋＤａに
移動し、これは荷電した末端のシアール酸が除去されて
ゲル上の移動度が低下したことに起因する（図５）。架
橋したＧＨＲＨ−リセプターを精製した、エンドグリコ
シダーゼＦとＮ−グリコシダーゼ（インディアナ州、イ
ンディアナポリスのベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）より入手出来る）の
プロテアーゼを含まない混合物で処理すると、ゲルの移
動度が移動して４５ｋＤａでバンドを形成した（図３と
図４に示されている）。これはＧＨＲＨ−リセプターが
Ｎ−結合糖蛋白（Ｇ−蛋白結合リセプターでは一般的で
ある）であることを示し、脱グリコシル化蛋白鎖のサイ
ズを示唆している。このサイズはＶＩＰとセクレチンリ
セプターの構造に一致する。
【００５２】固定化レクチンによる試験は、架橋したＧ
ＨＲＨ−リセプターはコムギ胚芽凝集素、リシン、リム
ルス凝集素、またはコンカナバリンＡに結合しないこと
を示していた。これはこのリセプターの特異性を示して
おり、これらのレクチンに結合する他のリセプターから
このリセプターの精製と単離へのアプローチを提供す
る。ノイラミニダーゼとベータガラクトシダーゼの処理
の後、このリセプターはピーナッツの凝集素に結合し、
ＧＨＲＨ−リセプターの分離と精製に対する別のアプロ
ーチを提供している。
【００５３】可溶性ｇｒｈ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体および
改良された結合測定法 光親和性架橋は、共有結合したリセプター−リガンド複
合体は、強くない界面活性剤（好ましくはＣＨＡＰＳを
含む溶液）中で可溶性であることを証明した。前述の膜
結合測定法の条件を用いてＧＨＲＨをリセプターととも
にプレインキュベートすると、インタクトのリセプター
−リガンド複合体が架橋していない時でも抽出された。
この複合体は、架橋のない１２５Ｉ−ＧＨＲＨａ（「ホ
ット」ＧＨＲＨａ）でインキュベートした膜の界面活性
剤による抽出の後、γ線計測により検出された。図６
は、粗膜中で見られる特異的カウントの大部分は、リセ
プターに関連した特異的複合体としてのＣＨＡＰＳで抽
出されたものであった。図６のデータは以下のようにし
て得られた。放射能標識したＧＨＲＨａを、１０ｎＭの
非標識ＧＨＲＨａの存在下または非存在下でヒツジの粗
下垂体膜に結合させた。次に界面活性剤で抽出し遠心分
離した；次に上澄液を活性炭／デキストランで処理し
て、遊離のＧＨＲＨａから蛋白を分離し各画分の放射性
ヨードを計測した。
【００５４】粗膜中の結合した標識されたＧＨＲＨａは
界面活性剤処理により（１）不溶性、（２）可溶性およ
び非特異的に結合、（３）特異的に結合するがしかし界
面活性剤で解離される、または（４）可溶性および特異
的に結合と性状解折された。光結合からわかるように、
非特異的結合カウントの大部分はＣＨＡＰＳ可溶性では
なかった。デオキシコレート界面活性剤混合物による抽
出は、わずかに多くの総カウントを可溶化したが、この
ほとんどは不安定であり解離され、非特異的結合カウン
トがほとんどであった。図７はこの複合体がリセプター
を含んでいることを確認するためのこの光架橋の結果を
示す。膜は暗所で光プローブ（１２５Ｉ−ＡＮＢ−ＮＯ
Ｓ−ＧＨＲＨａ）にあらかじめ結合され、ＣＨＡＰＳで
抽出され、次に紫外線で架橋された。これはＧＨＲＨが
可溶化されたリセプターにまだ結合していたことを示し
ている。ＣＨＡＰＳ抽出物では結合の多くは５５ｋＤリ
セプターバンドにあるが、デオキシコレートの場合はバ
ンドの多くは非特異的であった。これは（光プローブは
非特異的結合が強いが）図６に示す結合研究と一致し、
可溶性複合体中のＧＨＲＨ類似体の特異的結合は５５ｋ
Ｄａリセプターに対することを証明している。図６に一
致して、この複合体はデオキシコレートよりもＣＨＡＰ
Ｓ中ではるかに安定であった。またＣＨＡＰＳ抽出物を
光架橋すると非特異的結合バンドはほとんどなかった
（５５ｋＤａリセプターバンドのすぐ下に１つあっ
た）。
【００５５】図８は、ＣＨＡＰＳ抽出により結合測定法
が改良され、非特異的カウントが大幅に減少し感度が上
昇することを示す（図１と比較）。この図はまた、この
複合体は５０μＭのＧＴＰγＳにより部分的に解離され
ることを示しており、Ｇ−蛋白はＣＨＡＰＳを含有する
界面活性剤溶液中で可溶化された複合体にまだ会合して
いることを示唆している。図１はＧＨＲＨの前に添加さ
れる時１ｍＭのＤＴＴは特異的結合を妨害したことを示
す。図８は、プレ結合の後に２０ｍＭのＤＴＴから部分
的な影響が起きたことを示す。この複合体はまた、４℃
で一晩１ＭのＮａＣｌまで安定であったが、１％のトリ
トンＸ−１００（界面活性剤）により完全に解離され
た。結合測定法のためのＣＨＡＰＳ可溶性の活性炭デキ
ストラン処理した試料を用いて得られた低いバックグラ
ンドに注意すべきである。
【００５６】可溶性リセプター−リガンド複合体のｐＨ
安定性を図９に示す。複合体はｐＨで顕著な変化があ
り、複合体はｐＨ５．５およびそれ以下で不安定であ
り、ｐＨ５．５と６の間で安定であり、結合ＧＨＲＨと
遊離ＧＨＲＨの間で交換可能であり、ｐＨ７では極めて
安定で交換不可能である。この複合体の安定性は、改良
されたＧＨＲＨａ結合測定法を与え、新規のリセプター
精製法の基礎を与える。
【００５７】ＧＨＲＨａの単離と精製 固定化ストレプトアヒジン上で保持されるリセプター−
リガンド複合体としてＧＨＲＨ−リセプターを精製する
ことを目的として、ビオチン化ＧＨＲＨ類似体を開発し
た。試験した最初の類似体は、Ｎ−ヒドロキシサクシニ
ミド試薬ＮＨＳ−ＬＳ−ビオチン（ピアス（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）から入手出来る）を用いて１２および／または２１
位のリジンでビオチン化した［Ｈｉｓ１、Ｎｌｅ２７］
−ＧＨＲＨ−（１−３２）−ＮＨ２（ＧＨＲＨａ）であ
る。この類似体は１０位のチロシンでヨード化し、高速
液体クロマトグラフィーでモノビオチン化およびジヒオ
チン化型として分別した。これらの生成物の９０％以上
は３０分以内に固定化ストレプトアビジンに結合した。
モノビオチン化ＧＨＲＨａはＧＨＲＨａに比較して２倍
低いリセプター結合親和性を有し、一方ジビオチン化物
の活性はほとんどゼロであった。ストレプトアビジンへ
の結合がリセプターへの結合をブロックしたため、ビオ
チン基はリセプターの結合ポケットにあるようである。
次に試験した類似体は［Ｈｉｓ１、Ｎｌｅ２７、Ｃｙｓ
３３］−ＧＨＲＨ−（１−３３）−ＮＨ２である。これ
は２量体化する傾向が強く、競合結合測定法でＧＨＲＨ
ａを排除することもできるどの分子種もビオチン化され
なかった。
【００５８】驚くべきことに［Ｈｉｓ１、Ｎ１ｅ２７、
ビオチン−Ｌｙｓ４１］−ＧＨＲＨ−（１−４１）−Ｎ
Ｈ２（ここではＧＨＲＨｂと呼ぶ）は、ＧＨＲＨａに匹
敵する親和性でリセプターに結合することが発見された
（ＧＨＲＨｂを調製するための好適なソースはカリホル
ニア州サンホセのニューロスコーポレーション（Ｎｕｒ
ｏｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である）。この類似体
がリセプター精製に使用できることを証明するために、
ヨード化し、光感受性架橋基（ＡＮＢ−ＮＯＳ）を取り
込み、化合物を高速液体クロマトグラフィーで精製し
た。このヨード−ビオチニル−光活性化可能なＧＨＲＨ
（１２５Ｉ−ＧＨＲＨｂ−ＡＮＢ−ＮＯＳ）をウシ粗下
垂体膜中でリセプターに結合させた。このリセプター−
リガンド複合体をＣＨＡＰＳで可溶化し、活性炭デキス
トランで遊離のＧＨＲＨを除去し、固定化ストレプトア
ビジンに結合させた。
【００５９】ストレプトアビジンが複合体からリセプタ
ーを排除したか否かを試験するために、ストレプトアビ
ジン結合の前と後に試料を紫外線で架橋し、オートラジ
オグラフィーで分析した。この結果、結合に利用できる
リセプターのかなりの部分（３０％）がストレプトアビ
ジンビーズ上に保持された。可溶性リセプター−リガン
ド複合体複合体安定性の研究（図９を参照）は、ストレ
プトアビジンビーズを高塩濃度（０．５ＭのＮａＣｌ）
で洗浄し、低ｐＨで溶出（ｐＨ５）（好ましくはリン酸
塩、酢酸塩、クエン酸塩または他の適切な緩衝液溶液）
すると、リセプターがかなり精製されＧＨＲＨ−Ｒ単離
物が産生されることを示している。この得られたＧＨＲ
Ｈ−Ｒ単離物はＧＨＲＨ−Ｒの配列決定をするのに充分
な純度がある。好適な実施態様において、Ｇ−蛋白およ
び他の妨害する汚染物質は、少なくとも配列決定をする
のに充分な純度のＧＨＲＨ−Ｒを得るために、ゲル電気
泳動などの方法（しかしこれに限定されるものではな
い）で除去される。
【００６０】図１０は、ストレプトアビジンアガロース
カラム上のビオチン化リセプター複合体（ＧＨＲＨｂ−
ＧＨＲＨ−Ｒ）の親和性精製の結果を示す。非特異的結
合を最小にするために、結合複合体を有するアガロース
ビーズを０．５ｍのＮａＣｌ中で洗浄し、次にｐＨ５．
０でリセプターをビオチン化リガンドから解離させ、カ
ラムから溶出した。この溶出液を超遠心分離で濃縮し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。平行して対照カラムを流
し、可溶性リセプター複合体を非ビオチン化類似体ＧＨ
ＲＨａであらかじめ結合させた以外は同様に処理した。
この銀染色ゲル上のＧＨＲＨｂレーンは、ＧＨＲＨａレ
ーンで見られない５２ｋＤａと４５ｋＤａのバンドを示
している。架橋研究で見られる５５ｋＤａバンドは共有
結合した３．６ｋＤａＧＨＲＨａペプチドを含有するた
め、この５２ｋＤａのバンドは前駆体で予想されるサイ
ズに対応する。４５ｋＤａバンドは刺激物質Ｇ一蛋白で
あるＧｓ（これはＧＨＲＨ−リセプター複合体のサブユ
ニットであると考えられている）について報告されてい
るサイズである。これらの２つのバンドの共溶出とこれ
らか対照カラム中に存在しないことは、高度に精製され
たＧＨＲＨ−Ｒが調製されたことを確認している。
【００６１】約５２ｋＤａの分子量を有するＳＤＳゲル
上で得られたバンドに対応する精製された蛋白をヨード
化し、この蛋白をエンドグリコシダーゼＦで脱グリコシ
ル化（これはバンドを約４２ｋＤａの分子量を有する蛋
白に対応するように移動させる）することによっても、
ＧＨＲＨ−Ｒは確認される。この移動は光親和性標識リ
セプターの分子量の同様の減少を反映する。
【００６２】図１１に関して、ＳＤＳゲル電気泳動は、
精製されたＧＨＲＨリセプターの脱グリコシル化挙動を
例示している。最も左のレーンでは分子量約５２ｋＤａ
のヨード化された精製されたリセプターが見られる（図
１１の凡例の読み方を助けるために、プラス（＋）記号
は左に示した化合物が存在することを示し、マイナス
（−）記号は左の化合物が存在しないことを示す）。２
番目のレーンでは、約４２ｋＤａの分子量の蛋白を反映
する単一のバンドが示されている。このバンドはヨード
化された精製されたリセプターをＮ−グリコシダーゼで
処理することにより得られた。３番目のレーンは、１０
ｎＭのＧＨＲＨａ（「ＧＲＦａ］）と光架橋基を有する
ヨード化されたＧＨＲＨａ（これはリセプターに光架橋
することができる）との競合を例示する。バンドは全く
見られないため、ＧＨＲＨａが１２５Ｉ−ＧＨＲＨを排
除していることは明らかである。４番目のレーンはヨー
ド化されたＧＲＦに光架橋したリセプターに対するＮ−
グリコシダーゼの影響を示す。
【００６３】５番目のレーンの試料は２番目のレーンの
試料と同じであり、４番目のレーンはリセプターＧＨＲ
Ｈａ複合体中の光架橋基による分子量の増加の反映し
て、５番目のレーンの蛋白より４番目のレーンの蛋白は
分子量の少し大きいバンドを有すことに注目すべきであ
る。６番目のレーンはヨード化されたＧＨＲＨａに光架
橋されたリセプターの最も大きい分子量を示している。
７番目のレーンの試料は１番目のレーンの試料と同じで
ある。すなわち図１１はＧＨＲＨａが精製され単離され
たことを結諭的に示している。
【００６４】本発明は、合成法であれ組換え法であれ任
意の方法で産生された、ＧＨＲＨ−Ｒまたはその断片
（これは脊椎動物ＧＨＲＨ−Ｒおよび生物活性を有する
その断片を含む）の活性を有する蛋白およびポリペプチ
ドを包含する。精製されたＧＨＲＨ−Ｒから得られた蛋
白配列は、ＧＨＲＨ−Ｒを発現する細胞からのｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングするのに使用されるオリ
ゴヌクレオチドプローブを設計するのに使用することが
できる。プローブはまた、ＧＨＲＨ−Ｒに相同性がある
リセプターに基づくこともできる。特許請求の範囲の前
のリストに示された配列中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３、およ
びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、非限定的な例として、ポ
リメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）方法によりプローブ
を作成するのに有用なプライマーのオリゴヌクレオチド
配列を示す。これらのプローブは発表されているラット
のセクレチンリセプター（ＲＳ−Ｒ）に基づいており、
同族の蛋白をコードする遺伝子を含有するｃＤＮＡライ
ブラリーをプローブ試験するのに有用である。プローブ
のライブラリーとのハイブリダイゼーションは、同族の
遺伝子またはその一部を含有するクローンを同定するこ
とができる。この遺伝子または遺伝子断片はクローンか
ら単離され、全遺伝子が再構成され、次に適当なベクタ
ーに結合される。
【００６５】ある実施態様において、ラットのセクレチ
ンリセプターのｃＤＮＡに基づくＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４までのプライマーから作
成される上記のプローブは、ベクターλｇｔ１０（例え
ばカリホルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）の
クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得られるような
もの、＃１０９７ａ、オリゴ（ｄｔ）およびランダムに
プライミングされたもの）中のヒトの末端巨大症からの
成長ホルモン分泌性下垂体腫瘍から調製されたｃＤＮＡ
ライブラリーを、低緊縮性でスクリーニングするのに使
用される（低緊縮性条件の非限定例は、３０ｍＭのＮａ
Ｃｌおよび０．５％のＳＤＳを含有する緩衝液中で４２
℃で最後の洗浄を含む）。この腫瘍型は下垂体のソマト
トローフからモノクローナル的に得られるものであると
考えられており、普通ＧＨＲＨに応答し、機能性ＧＨＲ
Ｈリセプターの存在を示しており、これはＧＨＲＨ−リ
セプターｍＲＮＡの濃縮ソースであることを示唆してい
る。イクヤマ（Ｉｋｕｙａｍａ）ら、「成長ホルモン放
出ホルモンリセプターの性状解析および末端巨大症患者
の下垂体腺腫」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ．Ｍｅｔａｂ．、６６：１２６５−１２７１（１９８
８）を参照。具体的な分子クローニング法と実験室法に
ついては、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（マニ
アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、「モレキュラークロー
ニング：実験室マニュアル第２版」、コールドスプリン
グハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリ
ングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）、ニューヨーク（１９８９）。ペプチドホルモン、
蛋白精製および遺伝子クローニングに関する情報を与え
る他の論文は、ロゼリン（Ｒｏｓｓｅｌｉｎ）、「ＶＩ
Ｐファミリーペプチド（ＶＩＰ、セクレチン、ＧＲＦ、
ＰＨＩ、ＰＨＭ、ＧＩＰ、グルカゴンおよびオキシント
モジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ））のリセプ
ター。特異性と同定」、ペプチド、７：Ｓｕｐｐ１．
１、８９−１００（１９８６）；マス（Ｍａｓｕ）ら、
「メタボトロピックグルタメートリセプターの発現の順
序（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ａ Ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ Ｇｌｕｔａｍａ
ｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：
７６０−７６５（１９９１）；ホウアマッド（Ｈｏｕａ
ｍａｄ）ら、「ラットの脳からのＧ−蛋白結合グルタメ
ートリセプターのクローニング、発現および遺伝子構
造」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１３１８−１３２０
（１９９１）；タナベ（Ｔａｎａｂｅ）ら、「メタボト
ロピックグルタメートリセプターのファミリー」、Ｎｅ
ｕｒｏｎ、８：１６９−１７９；アボウ−サムラ（Ａｂ
ｏｕ−Ｓａｍｒａ）ら、「ラットの骨芽細胞様細胞化ら
の副甲状腺ホルモン関連ペプチドのリセプターの発現ク
ローニング：単一のリセプターはＣＡＭＰとイノシトー
ル３リン酸を刺激し細胞内遊離カルシウムを増加させ
る」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ・ＵＳ
Ａ、８９：２７３２−２７３６（１９９２）；リベルト
（Ｌｉｂｅｒｔ）ら、「Ｇ蛋白結合リセプターファミリ
ーの４つのメンバーの選択的増幅とクローニング」、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２４４：５６９−５７２（１９８９）；
マクファーランド（ＭａｃＦａｒｌａｎｄ）ら、「黄体
形成ホルモン放出ホルモン−絨毛性ゴナドトロピンリセ
プター：Ｇ蛋白結合リセプターファミリー」、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２４５：４９４−４９９（１９８９）；バッテ
イ（Ｂａｔｔｅｙ）ら、「ボンベシン（Ｂｏｍｂｅｓｉ
ｎ）の分子クローニング／スイス３Ｔ３細胞からのガス
トリン放出ペプチドリセプター」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：３９５−３９９
（１９９１）；フルメス（Ｈｕｌｍｅｓ）ら、「ＧＨ４
Ｃ１下垂体細胞から単離されたソマトスタチンリセプタ
ーの部分的アミノ酸配列」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１８４：１３１−１３６
（１９９２）；マス（Ｍａｓｕ）ら、「卵母細胞発現系
によるウシサブスタンス−ＸリセプターのｃＤＮＡクロ
ーニング」、Ｎａｔｕｒｅ、ロンドン、３２９：８３６
−８３８（１９８７）；スピンデル（Ｓｐｉｎｄｅｌ）
ら、「ネズミの繊維芽細胞ボンベシン／ガストリン放出
ペプチドリセプターをコードする相補的ＤＮＡのクロー
ニングと機能的性状解析」、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｃｒｉｎｏ
ｌ．、４：１９５６−１９６３（１９９０）；ストラウ
ブ（Ｓｔｒａｕｂ）ら、「マウスの下垂体甲状腺刺激ホ
ルモン放出ホルモンリセプターをコードするｃＤＮＡの
発現クローニング」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：９５１４−９５１８（１９９
０）；ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら、「ウシの副腎アンギ
オテンシンＩＩタイプ１リセプターをコードする相補的
ＤＮＡの発現とクローニング」、Ｎａｔｕｒｅ、３５
１：２３０−２３３（１９９１）；ホワイト（Ｗｈｉｔ
ｅ）ら、「アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵
母細胞中の機能性下垂体ソマトスタチンリセプターの発
現」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８７：１３３−１３６（１９９０）；アボウ−サム
ラ（Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ）ら、「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ
リセプターは２つの異なる分子ドメインを介してアデニ
レートサイクラーゼとホスホリパーゼＣを活性化す
る」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ７４ｔｈ
Ｍｅｅｔｉｎｇ、抄録８３６。
【００６６】低緊縮性ライブラリースクリーニングから
得られたクローンをジデオキシ鎖停止法により配列決定
し、リセプターｃＤＮＡに類似の部分配列を含有するク
ローンを用いて、ヒト末端巨大症下垂体（ＨＡＰ）オリ
ゴヌクレオチドプローブ（「ＨＡＰプローブ」）を産生
した。非限定例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳ
ＥＱ ｌＤ ＮＯ：６のオリゴヌクレオチド配列を互い
にハイブリダイズし（１０塩基対の重複がある）、ＤＮ
Ａポリメラーゼのクレノウ断片を放射能標識ヌクレオチ
ドを、対になっていない部分をうめるのに用いた。次に
これらのＨＡＰプロープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を、ｃＤＮＡの５’延長（クロ
ンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より入手出来る、５’ス
トレッチ（Ｓｔｒｅｔｃｈ）ＨＬ１０９７ｖ）を最適化
するために水酸化メチル水銀で完全に変性させておいた
末端巨大症下垂体腫瘍ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡラ
イブラリーの高緊縮性スクリーニングに使用した（高緊
縮条件の非限定例は、３０ｍＭのＮａＣｌと０．５％Ｓ
ＤＳを含む緩衝液中で６５℃で最後の洗浄を含む）。Ｃ
ＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）でプライミングされ、サイズは
選択され（＞５００塩基対）、ベクターλＢｌｕｅｍｉ
ｄ中に方向を決めてクローン化された。挿入体はｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミッド中に含有されサブクロー
ニングされないため、このベクターは配列決定を促進す
る。このライブラリーをＨＡＰプローブでスクリーニン
グすると、ＧＨＲＨ−リセプター遺伝子またはその一部
を含有するクローンが同定される（ここで、本発明の測
定法で決定される高親和性特異的ＧＨＲＨ結合活性を有
する蛋白またはポリペプチドをコードする遺伝子は、Ｇ
ＨＲＨ−Ｒ遺伝子またはその一部であると考えられ
る）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、ＧＨＲＨ−Ｒ活性を
有する蛋白をコードするｃＤＮＡの１２５７塩基対のヌ
クレオチド配列のコード鎖を与え、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：９は、ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白をコードする
ｃＤＮＡの１２７２塩基対のヌクレオチド配列のコード
鎖を与える。この配列は停止コドン、ＴＧＡを含む（Ａ
はデオキシアデニル酸、Ｇはデオキシグアニル酸、Ｃは
デオキシシチジル酸、そしてＴはデオキシチミジル酸を
意味する）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７のヌクレオチド配列に対応して、ＧＨＲＨ−
Ｒ活性を有する蛋白の４１８アミノ酸残基配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
のヌクレオチド配列に対応して、ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有
する蛋白の４２３アミノ酸残基配列を示す。ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に含まれる遺伝
子、またはその断片はクローンから単離され、全遺伝子
を再構成し、次に発現ベクターに結合させた。不幸にも
大腸菌は、宿主細胞としてグリコシル化蛋白の産生にル
ーチンにまたは容易に使用することはできなかった。従
ってＧＨＲＨ遺伝子を挿入して哺乳動物細胞中で発現を
可能にする適当な発現ベクターを見つける必要があっ
た。好適なＧ−蛋白においては、発現ベクターＣＤＭ８
（カリホルニア州サンジエゴのインビトロゲン（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）より入手出来る）が使用され、遺伝子
はＣＯＳ細胞中で発現された（ウイルス複製の欠陥のあ
る開始点を含むＳＶ４０ウイルスゲノムで形質転換した
サルの細胞株。ＣＯＳ細胞中に導入された時、ｐＣＤＭ
８中に挿入されたｃＤＮＡはｍＲＮＡの産生を指令し、
これが翻訳されて蛋白になる）。
【００６７】本発明は、ＧＨＲＨ−Ｒまたはその部分を
コードする遺伝子により形質転換またはトランスフェク
ションされた任意およびすべての宿主細胞、そしてこの
形質転換をさせるのに使用される発現ベクターを含む。
インビボでのリセプター機能を変更するために突然変異
したリセプター、センス、またはアンチセンスｍＲＮＡ
よりなるトランスジェニック動物を作成することもでき
ることは考えられている。
【００６８】非ヒトの同族のリセプターサブタイプの単
離 他の組織型または他の種から、同族のリセプターが以下
のようにして調製できる。目的の特定の組織型または種
からのｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーを放
射能標識したＨＡＰｃＤＮＡとプローブ結合させ、中程
度の緊縮性下で洗浄する（例えば１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ、５５℃）。陽性のプラークを再スクリーニング
して正しいか否かを確認する。次に当該分野で公知の方
法に従いプラスミッドレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）で陽
性のプラークを用いる。レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）し
たプラスミッドを精製し適当な制限酵素で切断し、臭化
エチジウムで染色したアガロースゲルで分析する。第２
のゲルをニトロセルロースフィルターに移し、標識ＨＡ
Ｐとプローブ結合させ、中程度次に高緊縮性（０．１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で順に洗浄しＸ線フ
ィルムに露光する。高緊縮条件下でＨＡＰに強くハイブ
リダイズする挿入体は、リセプターｃＤＮＡ候補である
可能性がある。以下の例に記載する方法に従いまたは当
該分野の公知の技術に従い、これらのリセプターと推定
されるものの本体をさらに確認する。すなわち本発明は
配列リスト中に記載したヌクレオチドやアミノ酸配列の
みでなく、中程度または高緊縮条件下で、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列、およびこれらにコードされ
る生物活性のある蛋白またはその断片とハイブリダイズ
するヌクレオチド配列を包含する。
【００６９】スクリーニングの設計と利用法 スクリーニングは固相または液相または宿主細胞中で、
精製されたまたは組換えリセプターを用いる。スクリー
ニングの中の発現はリガンド結合、第２のメッセンジャ
ー機能、生成物分泌または他の方法により測定する。固
相測定法は、形質導入ありまたはなしで化学的にまたは
免疫学的に固相支持体に結合したリセプターを用いる。
これらの測定法は、放射能、化学的、カロリメトリー的
または発光シグナルを表す抗体、生物学的薬品（例えば
ビオチン）、または結合蛋白または酵素などのレポータ
ーに結合することもできる。宿主細胞を用いるスクリー
ニングは細菌細胞または高等細胞（例えば酵母、昆虫、
哺乳動物）を用いることもできる。理想的な哺乳動物宿
主細胞は、ＧＨＲＨを分泌する腫瘍細胞株、およびトラ
ンスフェクションしたＧＨＲＨ−Ｒの刺激に応答して他
の生成物を分泌する細胞株である。
【００７０】ＧＨＲＨ−Ｒの治療上の有功性 ＧＨＲＨ−Ｒは小児や成人の臨床的発育不全の治療に適
用することができ、正常な体の強度や組成（筋肉対脂
肪）を回復することができ、体の構成や筋肉の強さに関
連する体の老齢化のある面を遅延させたり逆転させたり
することができ、睡眠調節を改善することができ、家畜
の成長を増加させるのに使用することもでき、乳産生動
物の乳汁分泌を増加させたり、免疫機能を改善したり、
食欲をコントロールしたり、有効な食餌や栄養を与えた
りすることができる。
【００７１】ＧＨＲＨリセプターによる抗体の産生 一次配列情報の親水性解析の方法は、疎水性のおそらく
膜を通過している（ｍｅｍｂｒａｎ−ｓｐａｎｎｉｎ
ｇ）ドメインと親水性の抗原性部位の両方を同定するの
に一般的に使用されてきている。ホップとウッズ法（図
１８と図１９を参照、Ｈｏｐｐ， Ｔ．Ｐ．， ａｎｄ
Ｗｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ。、７８：３８２４（１９８１））によるクローン化
したＧＨＲＨリセプターの解析は、７つのドメインが疎
水性残基に富んでいることを示す。これはＧ−蛋白結合
リセプターファミリーでは一般的である、ワング、リプ
フェルト、マルボンおよびバホウス（Ｗａｎｇ，Ｈ．，
ＬｉＰｆｅｒｔ，Ｌ．，Ｍａｌｂｏｎ，Ｃ．，ａｎｄ
Ｂａｈｏｕｔｈ，Ｂ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．２６４：１４４２４（１９８９）。このモデルは、
抗リセプター抗体の結合の標的の可能性のある４つの細
胞外領域、３つの細胞外ループ（ＥＣ−１、ＥＣ−２、
ＥＣ−３）、特にアスパラギン結合グリコシル化の部位
を含むＮ−末端を記載する。
【００７２】リセプターをブロックまたは活性化する抗
体を産生する目的には、細胞外ループ断片特にＮ−グリ
コシル化部位を含まないもの（炭水化物は立体的に抗体
結合を妨害する可能性がある）が好ましい。しかし細胞
内ループ（ＩＣ）は、スクリーニングや他の測定法のリ
セプター蛋白の固相結合に使用される抗体の産生にも有
用である。甲状腺刺激ホルモンリセプターの３つのＥＣ
ループに対する抗体の最近の研究は、抗原としてＥＣ−
３ループを使用するブロッキング抗体の誘導を含むそれ
らの生物活性の不均一性を示している。オーモリ（Ｏｈ
ｍｏｒｉ，Ｍ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，
Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍ．、１７４：３９９（９１９１）を参
照。従ってブロッキング抗体または活性化抗体の誘導に
必要なエピトープを決めるために、広いパネルの抗ペプ
チド抗体および抗リセプター抗体が調製され、注意深く
評価される。
【００７３】ペプチドは通常の固相重合法で産生され、
ＨＦで切断され、高速液体クロマトグラフィーで精製さ
れる（バン・レーゲンモルタール（ｖａｎ Ｒｅｇｅｎ
ｍｏｒｔａｌ，Ｍ．Ｈ．）、「抗原としての合成ペプチ
ド」中、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨー
ク、４１−９３頁（１９８８））。ペプチドは従来法に
よりグルタールアルデヒドを介してキーホールリンペッ
トヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオバルミン（ｏｖａｌ
ｍｉｎ）のような担体免疫原に結合され、これらの結合
体はマウスやウサギを免疫するのに使用される。コリガ
ン（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｊｌ）ら、「免疫学の現代の方
法」中、第１巻、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉ
ｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク
（１９９１）を参照。動物にフロイントの完全アジュバ
ントを用いて結合体ペプチドの第１回目の免疫を行い、
３週間後にフロイントの不完全アジュバントを用いて結
合体ペプチドで毎週追加免疫を行う。特異的抗ペプチド
抗体はＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ測定法でペプチドに対す
るそれらの結合により検出される。ペプチドがプラスチ
ックに付着しない場合、従って直接法が不可能な場合、
プレートに付着する無関係の担体蛋白にペプチドを結合
させる。
【００７４】抗体の特異性はまたウェスタンブロッティ
ング法によっても評価される。トウビン（Ｔｏｗｂｉ
ｎ、ｌｔ．）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、７６：４３５０
（１９７９）を参照。特異抗体は、粗膜調製物、ＷＧＡ
溶出糖蛋白、またはストレプトアビジン溶出液中の５５
ｋＤａの蛋白を認識する。リセプターのない細胞株から
の膜は陰性対照として役に立つ。この方法はまた他の細
胞株や組織（脳、下垂体）からのリセプターサブタイプ
との抗体の交差反応性の程度について情報を与え、各ソ
ースからのリセプター精製の必要性をなくする。生理学
的研究のための組織特異抗体を得ることや、免疫親和性
を用いて種々の組織からのリセプターを精製するための
交差反応性抗体を得ることも有用である。
【００７５】ＧＨＲＨリセプターに対するモノクローナ
ル抗体は、従来法を用いて調製される。ハーローとレー
ン（Ｈａｒｌｏｗ，Ｈ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．）、
「抗体：実験室マニュアル」中、コールドスプリングハ
ーバーラボ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂ）、ニューヨーク、１３９−２４０頁（１９８
８）。免疫に使用される抗原には、（１）前述したよう
に細胞外領域に対応するＫＬＨ−ペプチド結合体、
（２）ヒツジまたはウシの下垂体前葉膜からの精製され
たリセプター、（３）ノイラミニダーゼまたはＮ−グリ
コシダーゼで脱グリコシル化されＳＤＳ−ＰＡＧＥや電
子溶出により精製されたリセプター、（４）トランスフ
ェクションされたＣＨＯ細胞、またはＥＬＩＳＡでペプ
チド免疫原に対する反応性をまたはウェスタンブロッテ
ィング法で蛋白免疫原に対する反応性を試験されたバキ
ュロウイルスなどの組換えソースから精製されたリセプ
ターなどがある。リセプターまたはそのペプチドに対し
て循環抗体を示すものは、ハイブリドーマの調製に使用
される。簡単には脾臓細胞を取り、ポリエチレングリコ
ールの存在下で酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリ
ルアミノプテリン−チミジンの欠損しているＳＰ２／Ｄ
ミエローマ細胞と融合される。脾臓細胞は培養で増殖し
ないため、これで両細胞型の真のハイブリッドが選択さ
れる。ハイブリドーマ上澄液は、（１）精製されたリセ
プターまたはＷＧＡ溶出された糖蛋白のウェスタンブロ
ット、（２）膜に対する放射能標識リガンド結合の阻害
を用いるＥＬＩＳＡにより、リセプターに対する抗体を
スクリーニングする。陽性のハイブリドーマは増殖さ
せ、限界希釈法または軟寒天中の増殖により再クローニ
ングされる；これでモノクローナル性が確保される。陽
性のクローンを用いてマウスに腫瘍を誘導し、腹水中に
抗体を蓄積させる。
【００７６】ポリクローナルＩｇＧ抗体およびモノクロ
ーナルＩｇＧ抗体とも通常の硫酸アンモニウム沈澱法と
プロテインＡクロマトグラフィーにより精製される。ハ
ーロ−（Ｈａｒｌｏｗ）（前述）参照。前述の標準的結
合測定法により膜に対する放射能リガンドの結合をブロ
ックまたは活性化する能力について抗体を解析する。
【００７７】リガンドブロッキングまたは活性化で見込
みのある抗体は、例えばラットを用いるインビボで試験
される。例えば抗ＧＨＲＨリセプター抗体の投与後のＧ
Ｈレベルを追跡するために、ラットに対し静脈内挿入カ
テーテルを用いる。ミエル（Ｍｉｅｌｌ、Ｊ．）ら、
Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３１：７５（１９
９１）。ここで最も高いインビボ活性を示す抗体を試験
して、リセプター上のそれらのエピトープ（まだ決定さ
れていない場合は）を規定する。これらのエピトープは
リセプターの抗原断片であり、免疫原として使用された
場合、成長ホルモン産生レベルを変化させる所期の生理
学的効果を有する抗体を誘導する。
【００７８】
【実験法と例】以下の非限定例により本発明の改良され
たＧＨＲＨ結合測定法、およびインタクトのＧＨＲＨ／
ＧＨＲＨ−Ｒリセプター複合体の可溶化に基づくＧＨＲ
Ｈリセプターを精製する方法をさらに説明する。以下の
非限定遺伝子クローニングおよひ蛋白発現例は、例とし
てのヌクレオチドアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０までについて記載す
る。しかし本発明はこれらの配列にのみ限定されるので
はなく、生物学的に同等の配列を包含することは理解す
べきである。配列に対する変更、例えば得られる蛋白分
子またはその一部に変化を与える配列の欠失、挿入、ま
たは置換は包含される。例えば遺伝子コードの縮重を反
映する遺伝子配列中の変更、または蛋白中の特定の位置
の化学的に同等のアミノ酸残基が産生されるような変更
は包含される。特に本発明は、標準的な中緊縮性から高
緊縮性サザンハイブリダイゼーション条件下でハイブリ
ダイゼーションが起きるように、特異的に開示された配
列の充分に複製可能なＤＮＡ配列、及びそこで産生され
た生物活性のある蛋白を包含する。ここに開示された核
酸配列またはその一部は、種々の種および組織型からの
細胞中のＧＨＲＨ−Ｒを同定し単離するためのサザンハ
イブリダイゼーション法で容易に使用される。そのよう
な宿主細胞およびそれらの誘導はＧＨＲＨ−Ｒのすべて
または一部の組換え産生に使用することができる。
【００７９】不要な実験をすることなく本発明を実施す
るのに、ここに具体的に記載したものとは異なる広範囲
の他の物質が使用可能であることは理解すべきである。
【００８０】
【粗膜ペレット中の結合測定法】
【００８１】組織調製 すべて工程は４℃で行った。凍結したヒツジまたはウシ
の下垂体前葉（ヒツジ：カルシウム１グラム／下垂体
は、イアン・クラーク博士（Ｄｒ．Ｉａｎ Ｃｌａｒｋ
ｅ）、メルボルン、オースオラリアから得られた；ウ
シ：約２．５グラム／下垂体はペエルフリーズ（Ｐｅｌ
−Ｆｒｅｅｚ）（ロジャース、アーカンサス）からの特
別の手配である）を、血液を洗浄し、結合組織を除き、
５０ＭｍのＨＥＰＥＳ緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、
１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１μＭのＥＧＴＡ、ＰＨ７．
４で０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニル
フルオリド）、１０μｇ／ｍｌのリューペプチン（ｌｅ
ｕｐｅｐｔｉｎ）、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンａ、
そして２００Ｕ／ＭＬ（単位／ＭＬ）のアプロチニン中
でホモゲナイズした。この緩衝液は、Ｇ蛋白に結合して
いるかも知れない内因性ＧＴＰを除去するため、および
高親和性結合を回復するために使用した。ホモゲネート
はマイクロフージ中で最高の速度で遠心分離し、上澄液
を捨てた。次にペレットの上（膜）層を、５０ｍＭのト
リス緩衝液、５ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭの塩化マグネシ
ウム、５０μｇ／ｍｌのアラメチシン、３０μｇ／ｍｌ
のバシトラシンおよび前述の他のプロテアーゼインヒビ
ターを含む結合緩衝液中に、静かに再懸濁した。
【００８２】結合条件と解析 試験管当り１／５０の下垂体当量を、結合緩衝液中で、
５００μｌの容量中の約１００，０００カウントのヨー
ド化プローブとともに室温で１時間インキュベートし
た。分注した総カウントと各試験管に結合したカウント
の割合を、実験条件当り３から６重の測定で求めた。飽
和結合プロフィールは、コンピュータープログラムのリ
ガンド（Ｌｉｇａｎｄ）で解析した。これは非変換座標
軸中で正確なリガンド結合式への統計的重みづけ最小自
乗適合を行う。統計的方法（Ｆ検定およびランズ（ｒｕ
ｎｓ）検定）は、単一結合部位モデルに対して充分に良
好な適合を示した。代表的飽和結合測定法を図２に示
す。
【００８３】結果 内因性ＧＴＰを除去し、高親和性ＧＴＰ依存性部位を明
らかにするために、組織を１０ｍＭのＥＤＴＡで処理す
ることは必須であった。最初は非特異的結合が大きすぎ
て、種々のブロッキング剤でも改良は見られなかった。
ショ糖密度遠心分離により精製した膜画分中に、わずか
に良好な結合シグナルが見られた。一貫性のある結果を
得るために、凍結下垂体から大きいバッチの粗膜を調製
し、この膜の分画を後の測定のために凍結した。図１に
関して、ホモゲナイズ後膜を直接試験すると、特異的結
合の大幅な増加が観察された。この凍結融解効果の１つ
の可能性のある機構は、測定法を妨害するベシクル（Ｖ
ｅｓｉｃｌｅｓ）の形成である。この可能性を試験する
と、細孔形成性抗生物質のアラメチシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）は特異的結合／総結合の比を３倍増加させた（図１
にグラフで示してある）。この増加のほとんどは非特異
的結合の減少に起因し、おそらくベシクル中に捕捉され
たプローブの放出によるのであろう。回収される総カウ
ントは減少するが、非特異的結合に対する特異的結合の
増加を最大にするために、膜ペレットを遠心分離により
さらに１回洗浄した。
【００８４】プログラムリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）によ
る飽和結合試験のコンピューター解析は、Ｋｄ＝１５８
±１３ＰＭの単一結合部位を示し、特異的結合部位（Ｒ
Ｔ）の総数は１．５±０．０９ピコモル／グラム組織
（最適値±平均の近似標準誤差（ＳＥＭ））であること
を示している。ＧＨＲＨａの親和性はＧＨＲＨａの生物
学的力価に釣りあっているため、そして関連ペプチドよ
りも優れたＧＨＲＨの特異性（１００ｎＭのＶＩＰまた
はＰＡＣＡＰにより競合はない）と５０μＭのＧＴＰγ
Ｓと１．０ｍＭのＤＴＴに対する感度のため、この結合
はＧＨＲＨ−Ｒ存在を示す。
【００８５】１２５Ｉ−ＧＨＲＨａを市販のヨード化ヒ
トＧＨＲＨ（アマシャム（Ａｍｅｒｉｓｈａ）、アーリ
ントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔ
ｓ）、イリノイ州））と比較すると同様のことが証明さ
れた；１２５Ｉ−ＧＨＲＨａはわずかに優れた特異性を
示し、わずかに強いＧＴＰ効果を示した。
【００８６】光親和性プローブ結合の評価 前述したようにピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォー
ド、イリノイ州）から入手したヘテロ機能性光親和性架
橋剤を用いて、２つの異なる光親和性プローブを調製し
た。ＤＭＦ溶媒系を用いてＳＡＮＰＡＨをＮ−末端ヒス
チジンの位置でＧＨＲＨａに結合した。リジン１２また
は２１でＡＮＢ−ＮＯＳをＧＨＲＨａに結合した。各結
合基−ＧＨＲＨａ生成物を高速液体クロマトグラフィー
で精製しヨード化し再精製した。
【００８７】膜に対する光プローブ結合を粗膜結合測定
法で評価し、次にさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解
析して結合部位を同定した。光プローブを暗所でインキ
ュベートし、長波長（３６６ｎｍ）紫外線ランプで光分
解し、次に試料をペレットにした。このペレットを計測
し、次にＳＤＳ試料緩衝液中で直接沸騰させて抽出した
（総ＳＤＳ抽出物）。あるいは標識したペレットを強く
ない界面活性剤溶液（５ｍＭのＣＨＡＰＳ）中で抽出
し、遠心分離し、クロロホルム／メタノールで濃縮した
上澄液をＳＤＳ緩衝液で変性させた（ＣＨＡＰＳ抽出
物）。これらの試料を次にＳＤＳゲル中で電気泳動し、
オートラジオグラフィーを行った。
【００８８】結果 結合測定法により、両光プローブとも膜ペレットに結合
し、１０ｎＭのＧＨＲＨａで完全に置換され、５０μＭ
のＧＴＰγＳで部分的に置換されることが証明された。
いずれもＩ−ＧＨＲＨａよりは非特異的結合が大きかっ
た。親和性架橋ペレットの総ＳＤＳ抽出物のゲルは、こ
のバンドとしての非特異的結合はＧＨＲＨａまたはＧＴ
ＰγＳに影響されないことを示していた。これらの非特
異的結合バンドは実験毎にやや異なり、２つのプローブ
の間でも異なっていた（図３）。非イオン性界面活性剤
であるＣＨＡＰＳは蛋白の弱い可溶化剤である；リセプ
ター精製は、ＣＨＡＰＳを含む溶液がＧＨＲＨ結合活性
を可溶化できることを示していた。５ｍＭのＣＨＡＰＳ
を含む溶液を用いて得られた架橋ペレットの抽出物をＳ
ＤＳゲル上で観察した時、非特異的に標識された蛋白は
可溶化されないためリセプター架橋の視認性ははるかに
改良されていた。図３と４に関しては、その標識がＧＨ
ＲＨａまたはＧＴＰγＳに大きく影響される５５ｋＤの
バンドは、両プローブで明瞭に見ることができ、ＧＨＲ
Ｈ−Ｒを示している。これらの光プローブは、ＧＨＲＨ
リセプターをさらに性状解析、精製およびクローニング
するのに重要である。
【００８９】脱グリコシル化 多くのＧ−蛋白−結合膜リセプターの細胞外部分はアル
ギニン残基に結合した（Ｎ−結合）多くの炭水化物基を
含有することは公知であるので、図３と４の特異的に光
標識されたバンドはＮ−結合糖蛋白であるか否かを確認
するために実験を行った。試料を、精製した、エンドグ
リコシダーゼＦとＮ−グリコシダーゼＦのプロテアーゼ
を含まない混合物で処理した。
【００９０】光標識ペレット（ＳＤＳまたはＣＨＡＰＳ
を用いて抽出した）をＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰し希釈
して、０．５単位のグリコシダーゼ有りまたはなしで、
１．２５％のノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０としても
知られている非イオン界面活性剤）で３７℃で一晩イン
キュベートした。次にこれらの試料をクロロホルム−メ
タノール沈澱方法（ウェッセル（Ｗｅｓｓｅｌ）ら、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８：１４１−１４３
（１９８４）を参照）により濃縮し、ＳＤＳゲル上で電
気泳動した。
【００９１】図３と４に関して、特異的に光標識された
バンドの移動度の約５５ｋＤから約４５ｋＤへの移動
は、グリコシダーゼの存在下でのみ起きることがわか
る。ＳＤＳ抽出された試料中に見られ、ＧＨＲＨａまた
はＧＴＰγＳがないために非特異的に標識されていると
判断される他のバンドは、脱グリコシル化されていな
い。これはＧＨＲＨ−Ｒが糖蛋白であるという最初の証
明であり、この蛋白鎖の真のサイズの最も正しい推定値
を与える。図５に示すように、光標識したリセプターを
ノイラミニダーゼで処理すると、ゲルの移動度が５２ｋ
Ｄに移動する。これはリセプターがそのオリゴサッカラ
イド鎖の上にいくつかの末端シアル酸を有することを示
している。等電点電気泳動ゲル、高速液体クロマトグラ
フィーでの疎水性およびレクチン結合性からわかるよう
に、これらのシアル酸基はリセプターのＰＩに影響を与
える。脱グリコシル化は精製方法および配列決定のため
のリセプターの光分解性切断を促進するのに有用であ
る。
【００９２】リセプター−ＧＨＲＨ複合体の可溶化 活性炭−デキストラン結合測定法で測定されるように
（ポール（Ｐａｕｌ）らによりＶＩＰについて開発され
たものから応用された、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
６２：１５８−１６２（１９８７））、ＣＨＡＰＳを含
有する溶液中で可溶化された下垂体膜調製物は、ＧＴＰ
に非感受性の低い親和性部位（Ｋｄは約５００ｎＭ）を
示したのみである。他の界面活性剤では保持される結合
はさらに少なく、ＧＨＲＨ−Ｒはこれらの処理に安定で
ないことを示している。光親和性架橋の結果は、共有結
合したリセプター−リガンド複合体はＣＨＡＰＳを含有
する溶液中で可溶性であることを示していた。本発明の
膜結合測定法の条件を用いてＧＨＲＨをリセプターとプ
レインキュベートし、次に強くない界面活性剤溶液（好
ましくはＣＨＡＰＳ）で抽出すると、インタクトのリセ
プター−リガンド複合体が可溶化された。１２５Ｉ−Ｇ
ＨＲＨ類似体でインキュベート、または１２５Ｉ−ＧＨ
ＲＨ類似体でインキュベートのあと１０ｎＭの冷ＧＨＲ
Ｈで処理を行うと、膜の界面活け剤抽出によりこの可溶
性複合体が検出された。
【００９３】精製されたＧＨＲＨ−Ｒ 次にビオチン化ＧＨＲＨ類似体を用いて可溶性ＧＨＲＨ
ｂ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体を形成し、この可溶性複合体を
ＣＨＡＰＳを用いて抽出し、活性炭−デキストランで精
製して、ストレプトアビジンカラムに通した。次にスト
レプトアビジンカラムをＮａＣｌ溶液で洗浄し、グリコ
シル化ＧＨＲＨ−Ｒ単離物を生成させるためにｐＨ５．
０の緩衝液をカラムに流した。
【００９４】次にこのＧＨＲＨ−Ｒ単離物をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでさらに精製した。約５２ｋＤに現れるバンド
（純粋なＧＨＲＨ−Ｒに対応する）は標準ＰＶＤＦ膜で
ブロッキングできる。その上に精製されたＧＨＲＨ−Ｒ
を有するこのＰＶＤＦ膜を次に膜上で消化し、通常の配
列決定法によりＧＨＲＨ−Ｒの完全なまたは部分的アミ
ノ酸配列を得るために配列決定をした。
【００９５】次に配列決定工程から得られたアミノ酸配
列を、ＧＨＲＨ−Ｒの産生に関与している遺伝子のクロ
ーニングに使用される縮重プローブを作成するための基
礎に用いた。
【００９６】すなわちヒツジまたはウシの下垂体膜中の
ＧＨＲＨリセプターに対するＧＨＲＨ類似体の結合を測
定するための改良された方法が開示された（ＧＨＲＨ−
Ｒのヨード化、精製および分注、および細孔形成性抗生
物質の使用を含む）。これにより、ＧＨＲＨリセプター
のＧＴＰ感受性のＧＨＲＨ特異的な高親和性光標識法が
開発された。このリセプターのそのような標識は以前は
実現されなかった。これはリセプターのサイズ、グリコ
シル化、可溶性および他の性質の性状解析を可能にし
た。これにより、ＣＨＡＰＳのような化合物を含む、強
くない界面活性剤溶液は、結合したＧＨＲＨ−ＧＨＲＨ
−リセプター複合体を安定で可溶性の型で抽出できるこ
とが発見された。ＣＨＡＰＳ抽出や活性炭／デキストラ
ン処理（遊離のＧＨＲＨを結合するため）は、多くの非
特異的ＧＨＲＨ結合から精製される可溶性リセプター−
リガンド複合体を与え、従ってこれまでよりも良好な感
度の測定法として、またリセプター精製の出発点として
非常に有用である。このリセプター−リガンド複合体は
塩による洗浄、ＧＨＲＨ交換およびＧＴＰまたはＤＴＴ
処理に比較的安定であるが、低ｐＨにはそうではない。
Ｃ−末端でビオチン化されたＧＨＲＨ類似体が発明さ
れ、これは可溶性ＧＨＲＨ−Ｒ複合体中で結合している
時、固定化ストレプトアヒジンのカラムに保持され、塩
で洗浄し、ｐＨ５で溶出して、ＧＨＲＨリセプターを精
製することを可能にする。この精製されたリセプター蛋
白はリセプターペプチドの部分的配列決定に適してお
り、この配列情報はＧＨＲＨリセプターｃＤＮＡのクロ
ーニングに有用である。
【００９７】ベクター 本発明の実施での使用に適したベクターの非限定例は、
図１３および１４に示したベクターを含む。図１３につ
いては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋ｐｈａｇ
ｅｍｉｄが示される。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐ
ｈａｇｅｍｉｄはｐＵＣ１９由来の２９６１塩基対のｐ
ｈａｇｅｍｉｄである。ＫＳはｌａｃＺ転写がＫｐｎＩ
からＳａｃＩの方向に進むようにポリリンカー配向して
いることを示す。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐｈａｇｅ
ｍｉｄはストラタジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリ
ホルニア州ラホイア）から入手出来る。ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔはストラタジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から
得られ、発行されるカタログ中にある（例えばストラタ
ジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１９９１プロダクトカタ
ログ）。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩプラスミッド
は、ＧＨＲＨ−ＲをコードするＨＡＰｃＤＮＡ（ここで
さらに定義される）からの１．６キロ塩基対の挿入体を
含むことが示されている。ＨＡＰの５’末端の前で切断
する制限酵素にはＳａｃＩ、ＢｓｔＸ、ＮｏｔＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩなどがある。Ｈ
ＡＰのｃＤＮＡの３’末端で切断する制限酵素には、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、Ａｐａ
Ｉなどがある。ＨＡＰのｃＤＮＡの内側で切断する酵素
には、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩがある。
【００９８】図１４では、インヴィトロゲン（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）（カリホルニア州サンジエゴ）から入手
出来るベクターＣＤＭ８が再び示されている。ｐＣＤＭ
８はｃＤＮＡクローニングや大腸菌および真核系での解
析用にシード（Ｂ．Ｓｅｅｄ）により開発された、多機
能姓真核性発現ベクターである。Ｎａｔｕｒｅ、３２：
８４０−８４２（１９８７）を参照。このプラスミッド
ＣＤＭ８は、ＨＡＰｃＤＮＡ挿入体を含むことが証明さ
れている。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、およびＸｈｏＩ
制限部位は、挿入体のプラスミッドへの平滑末端結合の
後に再形成されなかった。
【００９９】ＧＨＲＨ−Ｒまたは生物活性を有するその
断片をコードする遺伝子のすべてまたは一部をクローニ
ングするのに、他のベクターを使用することもできるこ
とを理解すべきである（例えば、非限定例としては、ｐ
ＲＪＢ２と命名されたメルク社（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）の専売の発現ベクター）。
【０１００】オリゴヌクレオチドプローブ １つの実施態様において、ラットセクレチンリセプター
のｃＤＮＡに基づく最初のプローブが産生された。ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す
４つのオリゴヌクレオチドを、イシハラ（Ｉｓｈｉｈａ
ｒａ）らが開示したラットセクレチンリセプターの配列
の鎖の配列の部分にマッチするように、作成した（「セ
クレチンリセプターをコードするｃＤＮＡの分子クロー
ニングと発現」、ＥＭＢＯ．Ｊ．、１０：１６３５−１
６４１（１９９１））。次にこれらのヌクレオチドの２
つ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２）を用いて、ラットセクレチンリセプターのｃＤＮＡ
の全コード配列を増幅するためにラットの小脳からのｃ
ＤＮＡを用いてポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を
行った。サーマルサイクラーを用いてＰＣＲは以下のよ
うに行った：サイクル温度は変性、プライマーアニーリ
ング、およびプライマー伸張についてそれぞれ９４°
Ｆ、５５°Ｆ、７２°Ｆであり、サイクル時間は各サイ
クルでこれらの温度につきそれぞれ約１、１．５、およ
び２．５分であった。全部で３０サイクル行った。標準
ＰＣＲ緩衝液中のポリメラーゼを使用した。残念ながら
最初の２つのプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を用いるＰＣＲ反応では充分な
増幅は得られなかった。この問題を克服するために２回
目のＰＣＲ反応は、最初のセットの内部に折り畳まれて
いたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
を用いた。その生成物はセクレチンリセプターの８１２
塩基対の「疎水性核」であり、これは最初の膜透過部分
から７番目の膜透過部分の後まで（ヌクレオチド６３９
−ヌクレオチド１４５０）延びていた（ある種のＧ蛋白
結合リセプター（ＧＣＲｓ）のようにセクレチンリセプ
ターは細胞膜を通過しており、疎水性アミノ酸の核から
構成された複数の膜透過性部分を有し、ロドプシン（Ｒ
ｈｏｄｏｐｓｉｎ）ＧＣＲｓのようにヒドロパシー曲線
を示す）。ＰｓｔＩとＸｂａＩによる制限エンドヌクレ
アーゼマッピングによりこの物質の本体が確認された。
このＰＣＲ生成物を、ジエチルアミノエチル、ＤＥＡ
Ｅ、紙上で電気泳動し、塩溶出とエタノール沈澱によ
り、アガロースゲルからバンドとして精製した。
【０１０１】低緊縮性ライブラリースクリーニング 次に前に産生したセクレチンリセプターのｃＤＮＡ断片
をランダムプライミングにより放射標識し、ヒト末端巨
大症の下垂体からのλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーか
らの平板にまき、ニトロセルロースフィルターに取り上
げた約１．５×１０６クローンをスクリーニングするた
めのプローブとして使用した。好適な実施態様におい
て、プローブの標識はウィスコンシン州マジソンのプロ
メガ（Ｐｒｏｍｅｔａ）から入手出来るプライマジーン
（Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ）キットを用いて行った
（一般的に緊縮性条件は増強したイオン強度および／ま
たは低下させた温度よりなり；高い緊縮条件は低下した
イオン強度および／または上昇した温度よりなる）。フ
ィルターはオートラジオグラフィーの前に０．５％のド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中の３０ｍＭのＮａＣ
ｌを含む緩衝液中で４２℃で洗浄した。プローブにハイ
ブリダイズしたファージをプラーク法で精製し、ＣｓＣ
ｌ法で分染し、λｇｔ１０中の挿入体をＥｃｏＲＩで切
断し、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（ウィスコンシン州マジソ
ンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｔａ）から入手出来る）中に
サブクローニングした。次にｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中の
クローン化挿入体をランガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（「鎖
停止インヒビターによるＤＮＡ配列決定法」、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４
６３−５４６７（１９７７））のジデオキシ鎖停止法に
より配列決定した。いくつかの小さい（＜４００塩基
対）クローンと３つの大きいクローンが見いだされた。
これらの大きいクローンのうちの２つ（１．０と０．１
キロ塩基）はそれぞれリセプターｃＤＮＡに似た部分配
列（ＨＡＰ配列）を含んででおり、ポリＡテイルで終る
非コード３’画分を含んでいた。これらのクローンはそ
こで重複している同じ配列を含有していたが、２００塩
基対により誘導されるコード領域の長さは異なっており
３００塩基対離れた２つの異なるポリアデニル化部位を
示している。驚くべきことに、使用されるラットのセク
レチンプローブに容易に検出されるはずのヒトのセクレ
チンリセプターを代表するどのクローンも末端巨大症腫
瘍（ＨＡＰ）ライブラリー中に見いだされないことが発
見された。（ＧＨＲＨ−Ｒは下垂体ソマトトローフ中に
は極めて低濃度で存在し、ｃＤＮＡライブラリー中のヒ
トのセクレチンリセプターをコードする遺伝子が比較的
少量存在することは、この方法によるＧＨＲＨ−Ｒのク
ローニングを困難にするため、これは特に意義があ
る）。
【０１０２】１０塩基対だけ重複するＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す２つの相補的３
０量体から作成された標識した５０塩基対のＨＡＰオリ
ゴヌクレオチドプローブ；ハイブリダイズした多量体は
クレノウ断片フィルイン反応（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）で標識
した（これらの多量体は低緊縮性ライブラリースクリー
ニングから得られた配列に基づき調製された）。この５
０塩基対ＨＡＰプローブを用いて、前述のクロンテック
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）＃ＨＬヒト末端巨大症ｃＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングに、そしてｃＤＮＡの５’
末端延長部分を最適化するために水酸化メチル水銀で完
全に変性した末端巨大症化下垂体（ＨＡＰ）腫瘍ｍＲＮ
Ａから特別に調製したクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）５’ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）ＨＬ１９５７ｖ
ライブラリーのスクリーニングに使用した。このｃＤＮ
Ａはオリゴ（ｄｔ）−プライミングされ、サイズ選択さ
れ（＞５００塩基対）、そしてベクターλＢｌｕｅｍｉ
ｄ中に方向をそろえてクローン化した。このベクターは
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミッドに挿入体が含有さ
れているため配列決定を促進し、前述のベクターλｇｔ
１０を用いる時のようにサブクローニングする必要がな
い。両方のライブラリーを前述のようにスクリーニング
したが、最もマッチしていると考えられるもの以外を除
くために、ニトロセルロースフィルターリフトの６５℃
での高緊縮性の最後の洗浄を行った。λｇｔ１０ベクタ
ーを用いるライブラリーは、１５２個のシグナルを産生
し、これは二重リフトにより確認した。
【０１０３】二重リフトによる２番目の「５’ストレッ
チ」のスクリーニングにより６４個のマッチするシグナ
ルが現れ、このうち５８個はプラーク法で精製され、こ
のうち７番目のもの（ＨＡＰ７と命名した）は、ＧＨＲ
Ｈａの完全な蛋白コード領域を含有することがＰＣＲに
より示唆された。さらに詳しくはクローニング部位を含
むファージベクターに対するＰＣＲプライマーの使用、
およひＨＡＰ配列に特異的なプライマーの使用により、
ＰＣＲを用いて既知のＨＡＰ配列に対して５’の各挿入
体全体の大きさとその長さを測定することができた。そ
の結果はこれらの両方の腫瘍ライブラリーにＨＡＰｃＤ
ＮＡは豊富に存在し、全長クローンが産生されたことを
示唆している。
【０１０４】ＨＡＰ７ファージを制限エンドヌクレアー
ゼＮｏｔＩで切断して、ｃＤＮＡ挿入体を含むプラスミ
ッドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを取り出した。次にこのプ
ラスミッドを用いて大腸菌を形質転換し、形質転換した
細胞をアンピシリンに対する耐性で選択した；大腸菌Ｈ
ＡＰ７．３と命名したクローンの１つである、ＤＨ５α
を、１９９２年８月２５日にアメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１ パー
クローンドライブ、ロックヒル、メアリーランド州２０
８５２、米国（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉ
ｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託
し、寄託番号ＡＴＣＣ６９０５８を与えられた。
【０１０５】図１２はＣＯＳ細胞のトランスフェクショ
ンに使用するために、ｐＣＤＭ８中にＨＡＰ７．３ＣＤ
ＮＡ配列を挿入する工程を例示する。この図は、開始コ
ドン（ＡＴＧ）を含むＮＣｏＩの制限部位とｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔとｐＣＤＭ８プラスミッドの異なる抗生物
質耐性を利用している。
【０１０６】市販のキット、または自動化ＤＮＡシーケ
ンサーを用いて、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らジデオキ
シ鎖停止法により、ＨＡＰクローンの配列決定を行っ
た。
【０１０７】ＧＨＲＨ−ＲをコードするＨＡＰ７．３の
ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤＮＯ：７とＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：９に示し、その対応するアミノ酸配列はＳＥ
ＱＩＤ ＮＯ：８とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す。
コンピューター検索（ＦＡＳＴＡｓｔ ＧｅｎＢａｎｋ
Ｒｅｌｅａｓｅ ７１）は、セクレチンファミリーの
リセプター以外に、ＧＨＲＨ−Ｒ配列は他の公知の蛋白
に対して有意な類似性を示さないことを示している。
【０１０８】哺乳動物細胞株でのＨＡＰ７．３ｃＤＮＡ
の発現 ＨＡＰ７．３ｃＤＮＡは、コザック（Ｋｏｚａｋ）によ
り提唱された開始コドンコンセンサス配列に一致するメ
チオニン（Ｍｅｔ）コドンで始まる、伸張翻訳オープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。「６９９
メッセンジャーＲＮＡｓからの５’非コード配列の解
析」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：
８１２５−８１４８（１９８８）を参照。ＨＡＰ７．３
ｃＤＮＡはこの推定上の開始コドンの５’に８０塩基対
を含み、ＡＴＧまたはフレームない停止コドンを欠如し
ている。ＯＲＦは１，２６９塩基対伸張しており、４２
３個のアミノ酸の蛋白をコードする（予想される分子量
は約４５ｋＤａ）。ＨＡＰ７．３ｃＤＮＡは、この推定
上の開始コドンを含有するＮｃｏｌ制限エンドヌクレア
ーゼ部位を利用してｐＣＤＭ８発現ベクター中にサブク
ローニングされた。
【０１０９】Ｃｏｓ−１細胞は、ｐＣＤＭ８とＨＡＰ
ｃＤＮＡをスプライスして作成したベクターでトランス
フェクションしＣｏｓ−１細胞膜は７２時間後に調製し
た。Ｃｏｓ−１細胞は、クレン（Ｃｕｌｌｅｎ）の記載
するＤＥＡＥ−デキストラン法を用いて、１００ｍｍの
皿（ｄｉｓｈ）中で６×１０５細胞につき１０μｇのプ
ラスミッドＤＮＡを用いてトランスフェクションした。
「真核発現技術の利用とクローン化遺伝子の機能的解
析」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：６
８４−７０４（１９８７）を参照。Ｃｏｓ細胞培養物
は、ラットのＡＴ１アンギオテンシンＩＩリセプターを
コードするｃＤＮＡを含有するｐＣＤＭ８と平行してト
ランスフェクションされた。ＨＡＰ ｃＤＮＡでトラン
スフェクションしたＣｏｓ細胞膜は、Ｈｉｓ１、１２５
Ｉ−Ｔｙｒ１０、Ｎｌｅ２７ヒトＧＨＲＨ（１−２９）
ＮＨ２の特異的高親和性結合を示したが、アンギオテン
シンリセプターｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣ
ＯＳ細胞はこれを示さなかった。図１５と１６では、Ｈ
ＡＰ７ｃＤＮＡを含有するｐＣＤＭ８でトランスフェク
ションしたＣＯＳ細胞膜へのヨード化ＧＨＲＨの結合、
およびラットのアンギオエンシンＩＩリセプターをコー
ドするｃＤＮＡを含有するｐＣＤＭ８でトランスフェク
ションした膜に対するヨード化ＧＨＲＨの結合が示さ
れ、この結合は種々の濃度の競合ペプチドの存在下での
ＧＨＲＨａ結合に匹敵していた。
【０１１０】図１５は少ない数の試料に基づいており、
ノイズが高いため２ｎＭのＧＲＦは１０ｎＭのＧＲＦよ
り多量の１２５Ｉ−ＧＲＦを排除しているように思われ
る。しかし図１６の各データの点に反映されているより
多くの数の試料は、添加した競合ペプチドの濃度とヨー
ド化ＧＲＦ類似体の総結合カウントの減少の間の正相関
を示している。
【０１１１】図１６は、はるかに高濃度（Ｋｉは約３０
ｎＭ）ではあるが、ＰＡＣＡＰはヨード化ＧＨＲＨ結合
に競合することを示している。ヨード化ＧＨＲＨの結合
は、１００ｎｍの他のペプチド（ＶＩＰ、セクレチン、
グルカゴン、カルシトニン、ガラニン（ｇａｌａｎｉ
ｎ）、副甲状腺ホルモン、胃腸ペプチド、ＰＨＭ、およ
びソマトスタチンなどを含む）、または１μＭの成長ホ
ルモン放出ホルモンに影響されなかった。ＧＨＲＨはア
ンギオテンシンをコードする遺伝子でトランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ対照細胞に結合しなかったため、ＨＡＰ
７ｃＤＮＡを含有するｐＣＤＭ８でトランスフェクショ
ンしたＣＯＳ細胞中のＧＨＲＨ結合は、ＨＡＰ７ｃＤＮ
Ａによる蛋白の発現に起因することは明らかである。さ
らに図１５と１６に示したＧＨＲＨ特異的結合活性は、
ＨＡＰ７遺伝子の発現により産生された蛋白はＧＨＲＨ
−Ｒのすべての結合特性を有していることを示してい
た。
【０１１２】図１７はヒツジの下垂体膜中の同じＧＨＲ
Ｈ類似体の結合と置換を示す。このデータは０．２ｎＭ
の下垂体中でＧＨＲＨ結合のＫＤを与えた。図１６との
比較により、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞には
匹敵する高親和性部位が誘導されるが、これらの部位の
いくつかは低い親和性を有することを示唆している。ト
ランスフェクションされた細胞中の豊富なＧ蛋白はおそ
らく完全なリセプター結合をするには不充分であるため
これは予想されることであるが、これはまた人工的なＣ
ＯＳ細胞発現系中の他の因子に起因するのかも知れな
い。ＰＡＣＡＰは５００ｎＭと１Ｍのヒツジの下垂体中
でＧＨＲＨの有意な置換を起こしたが、ＶＩＰはこれを
起こさなかった。
【０１１３】ＧＨＲＨ−Ｒ遺伝子がクローン化されたこ
とを確認するいくつかの証拠がある：クローン化遺伝子
によりコードされる蛋白の分子量は、ヒツジの下垂体Ｇ
ＨＲＨリセプターの光親和性架橋からの結果（脱グリコ
シル化後約４２ｋＤａのサイズを示す）によく一致す
る。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列は４
２３個のアミノ酸残基を示す。もし最初のアミノ酸残基
が細胞中の処理により除かれるシグナルペプチドなら、
これにより分子量が約４４ｋＤａの４０１個のアミノ酸
の蛋白が残り、これは前述の脱グリコシル化試験での光
親和性架橋で求められたサイズに非常によく一致する。
【０１１４】クローン化遺伝子によりコードされる蛋白
配列は、Ｇ−蛋白結合リセプターのハイドロパシー曲線
を示す膜通過ドメインの可能性のある部分を含む。例え
ば図１８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列
のハイドロパシープロットであり、図１９はＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１０のアミノ酸配列のハイドロパシープロッ
トである。これらのグラフは、９個のアミノ酸配列残基
の極性の移動平均を求めることにより作成した；水平の
線の下の点は蛋白の極性すなわち親水性部分を示し、こ
の線の上の部分は膜透過部分となると考えられる蛋白の
非極性すなわち疎水性部分を示す。
【０１１５】下記の表１は、コンピューターマッチング
アルゴリズム（ＦＡＳＴＡとして知られている）によ
る、ＧＨＲＨ−Ｒに類似と考えられるリセプター配列中
に見いだされるアミノ酸残基の割合を示す。ピアソン
（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ・ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８（１９
８８）。
【表１】
【表２】
【０１１６】表２はＨＡＰからクローン化された遺伝子
はセクレチンリセプターよりもややＶＩＰリセプターに
似ており、ＰＴＨやカルシトニンリセプターには似てい
ないことを示す（例えば他のＧ−蛋白結合リセプターに
有意の相同性を有する）。
【０１１７】以上より、ＧＨＲＨ−Ｒ活性を有する蛋白
をコードする遺伝子はクローン化され発現されたことは
明らかである。
【０１１８】すなわち本発明は、成長ホルモン放出ホル
モンおよび生物活性のあるその断片の可溶化、精製およ
び蛋白の配列決定に関し、また成長ホルモン放出ホルモ
ンリセプターおよび生物活性のあるその断片をコードす
る遺伝子のクローニングに関する。好適な実施態様にお
いて、ヒト末端巨大症下垂体腫瘍ｃＤＮＡラットから得
られたリセプターヌクレオチド配列がｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔプラスミッド（しかしこれに限定されるものでは
ない）のようなベクターに挿入される；このプラスミッ
ドを用いて適当な宿主細胞（例えば生育可能な培養液中
の細菌）を形質転換する；例えばメアリーランド州ロッ
クビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションの寄
託番号ＡＴＣＣ６９０５８として保存されている細
菌）。ＡＴＣＣで保存されているこの細菌は入手可能で
あり、ＧＨＲＨリセプターのヌクレオチド配列は制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて（非限定的な例としてのＸｂ
ａＩとＸｈｏＩを用いて）細菌プラスミッドから切断さ
れ、このヌクレオチド配列を用いて他の生物または細胞
株（例えばＣＯＳ細胞があるが、これに限定されない）
中で蛋白が発現される。すなわちＡＴＣＣで保存されて
いる形質転換された細菌（寄託番号６９０５８）は、Ｇ
ＨＲＨリセプターをコードするヌクレオチド配列のさら
なるクローニングに有用であり、このＧＨＲＨリセプタ
ーをコードするヌクレオチド配列は蛋白を発現するのに
使用され、この蛋白はＧ−蛋白結合リセプター（例えば
ＧＨＲＨ−Ｒ）と相互作用する種々の薬剤のスクリーニ
ングに使用され、前述の治療に使用することもできる。
【０１１９】以上の説明より本発明の多くの変更や変法
が可能であることは明らかである。非限定的な例とし
て、粗下垂体試料中のＧＨＲＨ−Ｒの他の複合体は、精
製されたＧＨＲＨ−Ｒを産生するために親和性カラムに
結合されることができることが考えられる。従って本発
明はここに具体的に記載したもの以外にも実施されるこ
とを理解すべきである。 配列表 （１）一般情報 （１）出願人：ソーナー、ミシェル・オー ゲイリン、ブルース・ディー リンチ、ケビン・アール ハリソン、ジェフリー・ケー （２）発明の名称：成長ホルモン放出ホルモンリセプタ
ーの単離、性状解析、および蛋白配列決定と、成長ホル
モン放出ホルモンリセプターをコードする遺伝子のクロ
ーニング （３）配列の数：１０ （４）連絡住所： （Ａ）受信人：メーソン、フェヌィック・アンド・ロー
レンス （Ｂ）ストリート：１２２５ ストリート、エヌ・ダブ
リュー・、スイート１０００ （Ｃ）市：ワシントン （Ｄ）州：ディー・シー （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：２０００５ （５）コンピューターに読めるフォーム （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．
０、バージョン＃１．２５ （６）現在の申請データ （Ａ）申請番号： （Ｂ）申請日： （Ｃ）分類： （７）先行申請データ （Ａ）申請番号：ＵＳ０７／９０２，８２６ （Ｂ）申請日：１９９２年６月２３日 （８）弁理士／エージェント情報 （Ａ）名前：オー・ショーネッシー、ブライアン・ピー （Ｂ）登録番号：３２，７４７ （Ｃ）参照／処理番号：１０８４／８１−１３６５ （９）通信情報 （Ａ）電話：２０２−２８９−１２００ （Ｂ）ファックス：２０２−２８９−６６７４ （Ｃ）テレックス：２４８５１６
【０１２１】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ＧＣＡＡＣＡＧＴＧＧ ＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧ ＣＴＣ
ＡＧＣ
【０１２２】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＧＧＣＧＣＣＴＴＧＣ ＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡ ＧＡＴ
ＧＡＴ
【０１２３】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＡＡＧＧＴＣＡＴＧＴ ＡＣＡＣＴＧＴＡＧＧ ＣＴＡ
【０１２４】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＡＧＣＧＧＧＡＡＣＴ ＣＴＴＧＡＡＧＧＴＧ ＣＣＡ
【０１２５】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＣＣＡＡＴＡＣＴＧＡ ＧＡＣＴＧＧＧＴＡＴ ＧＧＡ
ＧＧＣＴＧＣＣ
【０１２６】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡ ＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧ ＧＧＣ
ＡＧＣＣＴＣＣ
【０１２７】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：１２５７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
【化１】
【０１２８】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：４１８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）形態：線状 （２）分子の型：蛋白 （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
【化２】
【化３】
【０１２９】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：１２７２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：１本鎖 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：ｃＤＮＡ （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
【化４】
【１３０】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：４２３アミノ酸味 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （２）分子の型：蛋白 （１１）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
【化５】
【化６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒツジ下垂体の粗膜ペレットに対し
て１２５Ｉ−ＧＨＲＨａの結合を示す棒グラフである。
棒は、プローブのみとまたは１０ｎＭのＧＨＲＨａまた
は５０μＭのＧＴＰγＳの存在下でインキュベートした
後のペレットに結合した総カウントの割合を示す。４つ
の異なるケース（棒のセット）が示されている。最初に
ケース（膜）は粗膜ペレットの調製物に対する結合を示
す。第２のセット（凍結）は、凍結融解の後は同じ膜調
製物中に特異的結合がほとんどないことを示す。第３の
セット（ＤＴＴ）は、１ｍＭのＤＴＴの存在下での同じ
調製物（凍結されていない）に対する結合を示す。第４
のセット（ａｌａ洗浄）は、細孔形成抗生物質アラメチ
シン（ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ）と追加の洗浄工程を含
む本発明の改良した試験法を示す。誤差棒は平均値の標
準誤差を示し、各点の繰り返しのＮ＝３または４であ
る。
【図２】 図２は、飽和結合解析に使用されるグラフで
ある。点は、レベルの増加している非標識ＧＨＲＨａの
存在下で実施された結合測定法からのデータである。誤
差棒は平均値の標準誤差である。囲み部分の中は、スキ
ャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）座標軸中の同じデ
ータと曲線である（囲み部分の中では誤差は示してな
い）。
【図３】 図３は、リセプターの光親和性架橋を示すＳ
ＤＳゲルの放射能図である。ヒツジの粗下垂体膜への架
橋は２つの異なる光プローブ（ＳＡＮＰＡＨとＡＮＳ−
ＮＯＳ）で示されており、それぞれ２つの異なる方法で
抽出された（ＳＤＳとＣＨＡＰＳ）。各ケースに脱グリ
コシル化酵素の影響も示してある。ＣＨＡＰＳ抽出物は
非特異的結合が大きく減少していることを示している。
いずれの光プローブも、脱グリコシル化で４５ｋＤａに
移動する５５ｋＤａのバンドを標識している。
【図４】 図４は、１０ｎＭのＧＨＲＨによる競合と脱
グリコシル化を示すＡＮＢ−ＮＯＳ架橋をＣＨＡＰＳが
抽出したことを示す、図３中のようなＳＤＳゲルの放射
能図である。
【図５】 図５は、ＧＴＰγＳの影響とノイラミニダー
ゼによる部分的脱グリコシル化の影響を含む図４のよう
な光親和性架橋のＳＤＳゲルの放射能図である。
【図６】 図６は、１０ｎＭの非標識ＧＨＲＨａの存在
下または非存在下で、ヨード標識ＧＨＲＨａをヒツジの
粗下垂体膜へ結合させて調製したＧＨＲＨａ−ＧＨＲＨ
−Ｒ複合体の溶解度を示す。
【図７】 図７は、ＡＮＢ−ＮＯＳ−ＧＨＲＨａ光プロ
ーブを用いて図６の実験をして産生された可溶性複合体
の光親和性架橋を示し、界面活性剤可溶性画分は抽出の
後紫外線架橋された。最も左の２つのレーンはＣＨＡＰ
Ｓで抽出したものであり、右の２つのレーンはデオキシ
コレートで抽出したものである。
【図８】 図８はＣＨＡＰＳで可溶化し、活性炭デキス
トランで処理したＧＨＲＨａ−ＧＨＲＨ−Ｒ複合体で、
５０μＭＧＴＰγＳ（±５ｍＭのＭｇ＋＋）、１０ｎＭ
のＤＴＴ、または１％のトリトンＸ−１００に３０分間
接触させた後、解離の量を定量するために再び活性炭デ
キストランで処理したものの安定性を示す。
【図９】 図９は、低ｐＨでの可溶性ＧＨＲＨ−ＧＨＲ
Ｈ−Ｒ複合体の解離を示し、異なるｐＨでの可溶性特異
的複合体の安定性は図８のように評価した。別のデータ
はｐＨ５またはそれ以下でほぼ完全な解離が得られるこ
とを示している。
【図１０】 図１０は、ストレプトアビジンカラム上で
のビオチン化リセプター複合体ＧＨＲＨｂ−ＧＨＲＨ−
Ｒの親和性クロマトグラフィーにより得られた、精製さ
れたＧＨＲＨ−Ｒを含有する溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析を示す。
【図１１】 図１１は、ＳＤＳゲル上の移動で見られる
精製されたＧＨＲＨ−リセプターの脱グリコシル化挙動
を示す。ゲル上の７つのレーンに対応して７つの試料を
流した。（プラス（＋）記号は１２５Ｉ−精製リセプタ
ー、光架橋リセプター、Ｎ−グリコシダーゼ、または１
０ｎＭのＧＲＦａの存在を示す）。最も左のレーンはヨ
ード化した精製されたリセプターのバンドを示し、その
隣のレーンはヨード化した精製されたリセプターをＮ−
グリコシダーゼで処理したもののバンドを示し、その分
子量は約４２ｋＤａである。左から３つ目のレーンは、
１０ｎＭのＧＲＦａはリセプターに架橋できるヨード化
したＧＲＦ類似体と競合することを示しており、従って
バンドは全く見られない。４番目と５番目のレーンは、
それぞれヨード化され精製されたリセプターとヨード化
され光架橋されたリセプターに対するＮ−グリコシダー
ゼの影響を示す。レーン６と７はそれぞれ、ＧＨＲＨ−
Ｒに光架橋したヨード化したＧＨＲＨ類似体とヨード化
され精製されたリセプターを流した。光架橋したリセプ
ターは分子量が大きく、Ｎ−グリコシダーゼで処理した
試料は分子量が小さいことに注目すべきである。
【図１２】 図１２は、哺乳動物細胞株での成長ホルモ
ン放出ホルモンリセプターの発現に有用なプラスミッド
を調製するための操作法のフローチャートである。
【図１３】 図１３は、ＨＡＰ挿入体、種々の制限部位
およびプラスミッドの他の特徴を示す、プラスミッドｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔを表している。
【図１４】 図１４は、ＨＡＰ挿入体、種々の制限部位
の相対的位置およびプラスミッドの他の特徴を示す、プ
ラスミッドＣＤＭ８を表している。
【図１５】 図１５は、アンギオテンシンＡＴ１または
ＨＡＰ含有ベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ
細胞への１２５Ｉ−ＧＨＲＨａの結合を示す棒グラフで
ある。棒は、１２５Ｉ−ＧＨＲＨａと、または徐々に増
加する濃度の非ヨード化ＧＲＦの存在下でインキュベー
トした後の細胞に結合した総カウントを示す。１００ｎ
ＭのＶＩＰの存在下での１２５Ｉ−ＧＨＲＨａとＣＯＳ
細胞とのインキュベートは、ＧＨＲＨａの結合カウント
に何の影響もなかった。
【図１６】 図１６は、ＨＡＰ７ｃＤＮＡ、またはラッ
トのアンギオテンシンリセプターをコードする遺伝子を
含有するｐＣＤＭ８でトランスフェクションした細胞膜
に対する、ヨード化ＧＨＲＨａの結合を示す。増加する
濃度の競合ペプチドの存在下での結合が示されている。
黒丸は、ＧＨＲＨ−Ｒをコードする遺伝子（ＨＡＰ７）
でトランスフェクションした細胞から形成した膜に対す
る、非ヨード化ＧＨＲＨの存在下での結合を示す。四角
は、ラットのアンギオテンシンリセプターをコードする
遺伝子でトランスフェクションした細胞から形成した膜
に対する非ヨード化ＧＨＲＨの存在下での結合を示す。
黒三角は、ＧＨＲＨ−Ｒをコードする遺伝子（ＨＡＰ
７）でトランスフェクションした細胞から形成した膜に
対するＰＡＣＡＰの存在下での結合を示し、白三角はＶ
ＩＰ存在下での結合を示し、白丸はセクレチンの存在下
での結合を示す。非特異的結合はＣＯＳ細胞膜中の総カ
ウントの２０−３０％であり、粗下垂体膜では４０−６
０％であった。
【図１７】 図１７は、徐々に増加する濃度の競合ペプ
チドの存在下でのヒツジの下垂体中の１２５Ｉ−ＧＨＲ
Ｈａの結合を示す。黒丸はＧＨＲＨａを示し、黒三角は
ＰＡＣＡＰを示し、そして白三角はＶＩＰを示す。
【図１８】 図１８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す
アミノ酸配列のハイドロパシープロットを示す。Ｓは推
定されるシグナルペプチドを示し、１−７は推定される
トランスメンブランスパニングらせん（ｔｒａｎｓｍｅ
ｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｈｅｌｉｃｓ）を示
す。
【図１９】 図１９は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示
すアミノ酸配列のハイドロパシープロットを示す。Ｓは
推定されるシグナルペプチドを示し、１−７は推定され
るトランスメンブランスパニングらせん（ｔｒａｎｓｍ
ｅｍｂｒａｎｅｓｐａｎｎｉｎｇ ｈｅｌｉｃｓ）を示
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/00 ＺＮＡ 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00 (71)出願人 593194063 ジョン ロナルド ジスク アメリカ合衆国ニュー ジャージー州，フ レンチ タウン，アール． ディ．２，ボ ックス 183 (71)出願人 593194074 ケビン リンチ アメリカ合衆国バージニア州，シャーロッ テスビル，ジルモス リッジ ロード 385 (71)出願人 593194085 ジェフリー ケイス ハリスン アメリカ合衆国バージニア州，ケスウィッ ク，ミルトン ドライブ 1096 (72)発明者 マイクル オリバー ソーナー アメリカ合衆国バージニア州，ノース ガ ーデン，ルート １，ボックス 487 (72)発明者 ブルース デビッド ゲイリン アメリカ合衆国バージニア州，トレビリア ンズ，ルート ３，ボックス 1545 (72)発明者 ジョン ロナルド ジスク アメリカ合衆国ニュー ジャージー州，フ レンチ タウン，アール． ディ．２，ボ ックス 183 (72)発明者 ケビン リンチ アメリカ合衆国バージニア州，シャーロッ テスビル，ジルモス リッジ ロード 385 (72)発明者 ジェフリー ケイス ハリスン アメリカ合衆国バージニア州，ケスウィッ ク，ミルトン ドライブ 1096

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 成長ホルモン放出ホルモンリセプターの
    少なくとも１つの生物学的性質を有するポリペプチドを
    コードする組換えＤＮＡ配列よりなる、単離され精製さ
    れた核酸分子であって、該生物学的性質は、成長ホルモ
    ン放出ホルモンに結合すること、成長ホルモンの放出を
    刺激すること、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウムポ
    リアクリルアミドゲル電気泳動による分子量約５５ｋＤ
    ａを有すること、およびノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａ
    ｍｉｎｉｄａｓｅ）による処理によりシアル酸を切断す
    る脱グリコシル化パターンを示すこと、よりなる群から
    選択される。
  2. 【請求項２】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列
    をコードする、請求項１記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 請求項１記載の配列を有する核酸分子よ
    りなる組換えＤＮＡベクター。
  4. 【請求項４】 請求項１記載の配列を有する組換え核酸
    分子を含有する宿主細胞。
  5. 【請求項５】 請求項３記載の組換えＤＮＡベクターを
    含有する宿主細胞。
  6. 【請求項６】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７よりなる、単離
    され精製された核酸分子。
  7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列
    よりなる単離され精製されたポリペプチド。
  8. 【請求項８】 組換えＤＮＡは、原核または真核細胞中
    で増殖することができるベクター中に存在する、請求項
    １記載の核酸分子。
  9. 【請求項９】 ベクターは大腸菌である、請求項８記載
    の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 ベクターはＳＶ−４０で形質転換され
    たサルの細胞中にある、請求項８記載の核酸分子。
  11. 【請求項１１】 アメリカンタイプカルチャーコレクシ
    ョン（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９０
    ５８を与えられた、トランスフェクションされたＤＨ５
    α細胞。
  12. 【請求項１２】 ｐＣＤＭ８ベクターの制限酵素により
    切断される配列を有する核酸分子。
  13. 【請求項１３】 インビボで宿主中の成長ホルモン放出
    ホルモンリセプターへの成長ホルモン放出ホルモンの結
    合を防ぐ方法であって、循環する成長ホルモン放出ホル
    モンに結合するのに充分な量の成長ホルモン放出ホルモ
    ンリセプターおよびその断片を宿主に投与し、これによ
    り成長ホルモン放出ホルモンの内因性の成長ホルモン放
    出ホルモンリセプターへの結合を防ぐことよりなる上記
    方法。
  14. 【請求項１４】 薬剤として許容される担体とともに、
    有効量の成長ホルモン放出ホルモンリセプターまたは生
    物活性を有するその断片よりなる薬剤組成物。
  15. 【請求項１５】 成長ホルモン放出ホルモンリセプター
    を組換え法で産生する方法であって、成長ホルモン放出
    ホルモンリセプターをコードする配列を有する核酸分子
    で形質転換した宿主細胞を、リセプターの発現を可能に
    する条件下で培養し、該リセプターを単離することより
    なる、上記方法。
  16. 【請求項１６】 寄託番号６９０５８でアメリカンタイ
    プカルチャーコレクションに寄託された形質転換した細
    菌中のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋ベクターの
    制限酵素で切断される配列を有する核酸分子。
  17. 【請求項１７】 請求項１６記載の核酸を蛋白に翻訳す
    ることができる宿主生物または細胞中のベクター中に該
    核酸が挿入される時、該核酸により発現される蛋白。
  18. 【請求項１８】 標準的な中緊縮性から高緊縮性（Ｓｔ
    ｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
    の核酸配列とハイブリダイズすることができる単離され
    精製された核酸プローブ
  19. 【請求項１９】 試験化合物をＧＨＲＨ−Ｒと反応さ
    せ、結合を追跡することよりなる、ＧＨＲＨ−Ｒに結合
    する化合物を同定する方法。
  20. 【請求項２０】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、およびＳＥＱ
    ＩＤ ＮＯ：６よりなる群から選択される成長ホルモン
    放出ホルモンリセプターの成長ホルモン放出ホルモン結
    合活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子をス
    クリーニングするのに使用するための、単離され精製さ
    れたＤＮＡプローブ。
  21. 【請求項２１】 成長ホルモン放出ホルモンまたはその
    断片に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリ
    クローナル抗体。
  22. 【請求項２２】 宿主中で抗体を産生するのに充分な量
    の実質的に純粋な成長ホルモン放出ホルモンリセプター
    またはその断片を宿主に投与することよりなる、インビ
    ボで宿主中で成長ホルモン放出ホルモンリセプターへの
    成長ホルモン放出ホルモンの結合を防ぐ方法であって、
    該抗体は成長ホルモン放出ホルモンリセプターに特異的
    に結合し、これにより成長ホルモン放出ホルモンリセプ
    ターへの成長ホルモン放出ホルモンの結合を防ぐことよ
    りなる上記方法。
  23. 【請求項２３】 宿主中で抗体を産生するのに充分な量
    の実質的に純粋な成長ホルモン放出ホルモンリセプター
    またはその断片を宿主に投与することよりなる、インビ
    ボで生成した抗体で成長ホルモン放出ホルモンリセプタ
    ーを活性化する方法であって、該抗体は成長ホルモン放
    出ホルモンリセプターに特異的に結合し、これにより成
    長ホルモン放出ホルモンリセプターを活性化し成長ホル
    モン産生を増加させることよりなる上記方法。
  24. 【請求項２４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸
    配列または生物活性のあるその断片をコードする配列を
    有する、単離され精製された核酸分子。
  25. 【請求項２５】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の配列を有す
    る単離され精製された核酸分子。
  26. 【請求項２６】 標準的な中緊縮性から高緊縮性（Ｓｔ
    ｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下で、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：９とハイブリダイズすることができる単離され精
    製された核酸プローブ。
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