PT2601970T - A presente invenção está relacionada com composições antigénicas e de vacinas compreendendo antigénios de norovírus e adjuvantes, em particular misturas de vlps monovalentes e misturas de vlps multivalentes, e com um processo para a produção de vlps monovalente e multivalentes, as vlps compreendendo as proteínas da cápside de um ou mais genogrupos de norovírus. - Google Patents
A presente invenção está relacionada com composições antigénicas e de vacinas compreendendo antigénios de norovírus e adjuvantes, em particular misturas de vlps monovalentes e misturas de vlps multivalentes, e com um processo para a produção de vlps monovalente e multivalentes, as vlps compreendendo as proteínas da cápside de um ou mais genogrupos de norovírus. Download PDFInfo
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Description
DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES DE VACINAS DE NOROVÍRUS"
CAMPO DA INVENÇÃO A invenção situa-se no campo das vacinas, particularmente vacinas para norovirus. Ainda, a invenção está relacionada com métodos de preparação de composições de vacinas e métodos de indução de uma resposta imunitária.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os norovirus são calicivirus humanos, não cultiváveis, que têm surgido como a causa mais importante de surtos epidémicos de gastroenterite não bacteriana (Glass et al., 2000; Hardy et al., 1999). A importância clinica dos norovirus foi subestimada antes do desenvolvimento dos ensaios sensíveis de diagnóstico molecular. A clonagem do genoma do vírus de Norwalk (NV) do genogrupo I protótipo e a produção de partículas do tipo vírus ("vírus-like particles", VLPs) a partir de um sistema de expressão de baculovírus recombinante conduziu ao desenvolvimento de ensaios que revelaram a disseminação das infecções por norovirus (Jiang et al. 1990; 1992).
Os norovirus são vírus de RNA de cadeia simples e polaridade positiva com um genoma de RNA não segmentado. 0 genoma virai codifica três grelhas de leitura abertas, das quais as duas últimas especificam a produção da principal proteína da cápside e uma proteína estrutural menos abundante, respectivamente (Glass et al., 2000) . Quando expressa em níveis elevados em sistemas de expressão eucarióticos, a proteína da cápside de NV e de outros norovírus, sofre auto-montagem em VLPs que estruturalmente simulam os viriões de norovírus nativos. Quando observados por microscopia electrónica de transmissão, as VLPs são morfologicamente indistintas dos viriões infecciosos isolados a partir de amostras fecais humanas.
As respostas imunológicas aos norovírus são complexas e os correlativos de protecção só agora estão a ser elucidados. Estudos com voluntários humanos realizados com vírus nativo demonstraram que as respostas imunes de memória derivadas da mucosa proporcionam protecção da infecção a curto prazo e sugeriram que a protecção mediada por vacinas é possível (Lindesmith et al. 2003; Parrino et al. 1997; Wyatt et al., 1974).
Apesar dos norovírus não poderem ser replicados in vitro, devido à disponibilidade de VLPs e à capacidade de serem produzidos em grandes quantidades, foram feitos progressos substanciais na definição da topografia antigénica e estrutural da cápside dos norovírus. As VLPs preservam a conformação autêntica da proteína da cápside virai, ao mesmo tempo que não possuem material genético infeccioso. Consequentemente, as VLPs simulam as interacções funcionais do virus com os receptores celulares, induzindo assim uma resposta imune adequada no hospedeiro, ao mesmo tempo que não possuem capacidade de replicação ou de causar infecção. Conjuntamente com o NIH, o Baylor College of Medicine estudou as respostas imunes humoral, das mucosas e celular a VLPs de NV em voluntários humanos num ensaio clinico de Fase I financiado por investigadores da academia. VLPs administradas oralmente eram seguras e imunogénicas em adultos saudáveis (Bali et al. 1999; Tacket et ai. 2003). Noutros centros académicos, experiências pré-clinicas em modelos animais demonstraram estimulação das respostas imunes a VLPs quando administrados intranasalmente com adjuvantes de exotoxinas bacterianas (Guerrero et al. 2001; Nicollier-Jamot et al. 2004; Periwal et al. 2003) . Colectivamente, estes dados sugerem que uma vacina consistindo em VLPs adequadamente formuladas representa uma estratégia viável para imunizar contra a infecção por norovirus.
Lobue AD et al. (Vaccine, Elsevier LTD, GB, vol. 24, no. 24, 12 June 2006, pages 5220-5234) está relacionado com a indução por vacinas multivalentes de norovirus de fortes anticorpos bloqueadores, das mucosas e sistémicos, contra múltiplas estirpes.
Nicollier-Jamot B. et al. (Vaccine, Elsevier LTD, GB, vol. 22, no. 9-10, 12 March 2004, pages 1079-1086) está relacionado com partículas do tipo virus recombinante de um norovírus (estirpe do genogrupo II) administradas intranasalmente e oralmente com adjuvantes das mucosas LT e LT(R192G) em murganhos BALB/c para indução de respostas imunes especificas humoral e celular do tipo Thl/Th2.
Hansman GS (Journal of General Virology, vol. 87, no. 4, 01 April 2006, pages 909-919) está relacionado com a diversidade genética e antigénica entre norovirus. EP 2 360 175 está relacionada com partículas do tipo vírus (VLPs) de norovírus e sapovírus.
SUMÁRIO A presente invenção é definida, inter alia, pelos seguintes itens: 1. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de duas ou mais partículas do tipo vírus (VLPs) de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus para usar num método de geração de uma resposta imune, de modo que a composição combinada de VLPs é capaz de induzir imunidade contra a infecção por cada genótipo de norovírus representado na formulação, em que a resposta imune contra uma determinada VLP na combinação é pelo menos 50% da resposta imune da mesma VLP quando medida individualmente. 2. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que pelo menos um das referidas estirpes de norovírus é diferente das estirpes das referidas VLPs. 3. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs monovalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que as referidas duas ou mais estirpes de norovírus são de genótipos diferentes. 4. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que pelo menos uma das referidas estirpes de norovírus é diferente dos genótipos das referidas VLPs. 5. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que pelo menos duas ou mais estirpes de norovírus são de genogrupos diferentes. 6. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que pelo menos uma das referidas estirpes de norovírus é diferente dos genogrupos das referidas VLPs. 7. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 5, em que os referidos genogrupos são seleccionados do grupo consistindo em GI, GII, GUI ou GIV. 8. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que as referidas VLPs monovalentes de norovírus derivam de sequências virais do genogrupo I ou do genogrupo II ou de uma sequência virai de consenso derivada de duas ou mais estirpes de norovírus. 9. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 5, em que as referidas VLPs monovalentes de norovírus derivam dos genótipos 1.1 e II.4. 10. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que a formulação antigénica é administrada nas mucosas ou parentericamente. 11. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 10 para usar de acordo com o item 10, em que a administração nas mucosas é conseguida por via intranasal. 12. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 10 para usar de acordo com o item 10, em que a administração parentérica é conseguida por via intramuscular. 13. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que a formulação antigénica inclui um ou mais adjuvantes seleccionados do grupo consistindo em agonistas dos receptores do tipo "toll" e sais de alumínio. 14. de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com o item 1 para usar de acordo com o item 1, em que a formulação antigénica ainda compreende um agente de entrega.
Descrevem-se formulações antigénicas e de vacina compreendendo um antigénio de norovírus. Numa realização, as formulações ainda compreendem pelo menos um adjuvante. 0 antigénio de norovírus pode derivar de sequências virais do genogrupo I ou do genogrupo II ou de uma sequência virai de consenso. As formulações de norovírus compreendem péptidos, proteínas ou partículas do tipo vírus (VLPs) . Numa realização, as VLPs podem ser desnaturadas. Numa outra realização, os péptidos e proteínas antigénicas são seleccionados do grupo consistindo em monómeros da cápside, multímeros da cápside, agregados proteicos e misturas dos mesmos. Numa outra realização, o antigénio de norovírus está presente numa concentração entre cerca de 0,01% e cerca de 80% por peso. A dosagem do antigénio de norovírus está presente numa quantidade entre cerca de 1 yg e cerca de 100 mg por dose.
Numa outra realização, as VLPs de norovírus são VLPs recombinantes produzidas num sistema de expressão usando uma sequência de ácido nucleico de norovírus, a qual codifica pelo menos uma proteína da cápside ou um seu fragmento. A proteína da cápside é seleccionada do grupo consistindo em VPl e VP2 ou uma combinação das mesmas. 0 sistema de expressão pode ser um sistema de expressão celular recombinante como seja um sistema de expressão de leveduras, bactérias, insectos, mamíferos, ou um sistema de expressão de células infectadas por baculovírus.
Ainda numa outra realização, a composição ainda compreende um agente de entrega, o qual funciona para estimular a tomada de antigénio ao proporcionar um efeito de depósito, aumento do tempo de retenção do antigénio no local de entrega ou estimulação da resposta imune através do afrouxamento das junções celulares no local de entrega. 0 agente de entrega pode ser um bioadesivo, de preferência um mucoadesivo seleccionado do grupo consistindo em glicosaminoglicanos (e.g. sulfato de condroitina, sulfato de condroitina dermatano, sulfato de queratano, sulfato de heparano, hialuronano), polímeros de açúcares (e.g., pecti-na, alginato, glicogénio, amilase, amilopectina, celulose, quitina, estaquiose, unulina, dextrina, dextrano), derivados de ácido poli(acrílico)interligado, álcool polivi-nílico, polivinilpirrolidona, polissacáridos (incluindo mucina e outros mucopolissacáridos) derivados de celulose (e.g. hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose), proteínas (e.g. lectinas, proteínas fimbriais), e ácido desoxirribonucleico. De preferência, o mucoadesivo é um polissacárido. Mais de preferência, o mucoadesivo é quitosano, ou uma mistura contendo quitosano, como seja um sal de quitosano ou base de quitosano.
Ainda numa outra realização, é proporcionada adicionalmente uma composição compreendendo um adjuvante. 0 adjuvante pode ser seleccionado do grupo consistindo em agonistas dos receptores do tipo "toll" (TLR), lípido A monofosforilado (MPL®) , lipido A sintético, simulações ou análogos de lipido A, sais de alumínio, citocinas, saponinas, derivados de muramildipéptido (MDP), oligos CpG, lipopolissacáridos (LPS) de bactérias gram-negativas, poli-fosfazenos, emulsões, virossomas, cocleatos, poli(lactida-co-glicolidos) (PLG) micropartícuias, partículas de polo-xâmero, micropartícuias, endotoxinas, por exemplo endo-toxinas bacterianas e lipossomas. De preferência, o adjuvante é um agonista dos receptores do tipo "toll" (TLR). Mais de preferência, o adjuvante é MPL®.
As composições descritas podem ser proporcionadas como uma formulação líquida ou uma formulação de pó seco. As formulações de pó seco da presente invenção podem conter um tamanho médio de partícula entre cerca de 10 e cerca de 500 micrómetros de diâmetro. Numa realização, a composição é uma formulação antigénica. Numa outra realização, a composição é formulada para administração como uma vacina. Vias adequadas de administração incluem as das mucosas, intramuscular, intravenosa, subcutânea, intradérmica, sub-dérmica ou transdérmica. Em particular, a via de administração pode ser intramuscular ou das mucosas, com vias preferidas de administração das mucosas incluindo as vias intranasal, oral ou vaginal. Numa outra realização, a composição é formulada como um spray nasal, gotas nasais ou pó seco, em que a formulação é administrada através da deposição rápida dentro dos seios nasais a partir de um dispositivo contendo a formulação mantendo perto ou inserido nos seios nasais. Numa outra realização, a formulação é administrada numa ou em ambas as narinas. São igualmente descritos métodos para a geração de uma resposta imune a norovírus num indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma formulação antigénica ou de uma vacina compreendendo a composição de norovírus. Numa realização, as formulações antigénicas e vacinas compreendendo a composição de norovírus têm utilidade na geração de anticorpos contra um ou mais antigénios de norovírus. Numa outra realização, as formulações de vacina de norovírus podem ser usadas para tratar infecções por norovírus.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra um ensaio in vitro de proliferação específica de antigénio de células de nódulos linfáticos cervicais murinos após imunização in vivo intranasal com 10 yg de VLP. A Figura 2 ilustra um ensaio in vitro de proliferação específica de antigénio de esplenócitos após imunização in vivo intranasal com 10 yg de VLP. A Figura 3 ilustra um ensaio in vitro de proliferação específica de antigénio de esplenócitos após imunização in vivo intraperitoneal com 25 yg de VLP. A Figura 4 ilustra IgG ou IgA específicas de VLPs de células secretoras de anticorpos (ASCs) medidas pelo ensaio ELISPOT. A Figura 5 ilustra IgG específica de VLPs medida por ELISA. A Figura 6 ilustra o resultado de um ensaio de potência para a resposta de IgG sérica contra VLPs Norwalk. A Figura 7 ilustra o resultado de um ensaio de potência comparando respostas de IgG sérica contra VLPs Norwalk em murganhos imunizados com uma formulação líquida do antigénio ou uma formulação reconstituída a partir do pó seco. 0 gráfico mostra a potência versus concentração de VLPs Norwalk nas diferentes formulações. A Figura 8 mostra a resposta de IgG sérica em coelhos no dia 21 (painel esquerdo) e dia 42 (painel direito) após administração de diferentes formulações da vacina de VLPs de norovírus. A Figura 9 ilustra a resposta de IgG sérica em coelhos imunizados por via intranasal com uma formulação líquida ou uma formulação de pó seco de VLPs Norwalk. A Figura 10 descreve a estabilidade de uma formulação de pó seco medida por análise de SDS-PAGE quantitativa e cromatografia de exclusão do tamanho (SEC). A análise da regressão não indica tendências estatísticas de yg de VLP total ou intacta por 10 mg de pó seco ao longo de 1 ano. O agregado percentual é um cálculo que assume que a proteína de VLPs não detectada por SEC, comparativamente com a proteína total de VLPs por SDS-PAGE, está agregada. A Figura 11 ilustra os resultados de um ensaio de ELISA de resposta de anticorpos anti-norovírus em murganhos imunizados i.p. com múltiplos antigénios de norovírus. As setas finas indicam injecções de reforço com formulações contendo apenas VLPs Norwalk. As setas espessas significam injecções de reforço com formulações contendo VLPs Norwalk e de Houston. A Figura 12 ilustra um ensaio de ELISA de resposta de anticorpos anti-norovírus em murganhos imunizados i.p. com VLPs Norwalk, VLPs de Houston ou uma combinação de VLPs Norwalk e Houston. A Figura 13 mostra a presença de plasmócitos de vida longa específicos de VLPs Norwalk em esplenócitos (A) , nódulos linfáticos cervicais (B) e medula óssea (C) em murganho 114 dias após imunização intranasal de murganho com VLPs Norwalk. A Figura 14 descreve a resposta de células B de memória especificas de Norwalk em esplenócitos de murganho imunizado intranasalmente com VLPs Norwalk. 0 Painel A mostra células secretoras de anticorpos IgA no dia 0 (gráfico à esquerda) e dia 4 em cultura com VLPs Norwalk (gráfico à direita). 0 Painel B mostra células secretoras de anticorpos IgG no dia 0 (painel à esquerda) e dia 4 em cultura com VLPs Norwalk (painel à direita). A diferença no número de células entre o dia 0 e o dia 4 indica o nivel de expansão e diferenciação de células B de memória. A Figura 15 mostra os resultados do ensaio de ELISPOT de células mononucleadas do sangue periférico isoladas de coelhos imunizados intranasalmente com a formulação de vacina de VLPs Norwalk. 0 painel da esquerda mostra o número de células secretoras de antigénio (ASCs) especifico de VLPs Norwalk no dia 0 (dia da colheita de tecido), enquanto o painel da direita ilustra o número de ASCs especificas de VLPs Norwalk após 4 dias em cultura com VLPs Norwalk. A diferença no número de células entre o dia 0 e o dia 4 indica a resposta de células B de memória.
A Figura 16 mostra os resultados do ensaio de ELISPOT de esplenócitos colhidos de coelhos imunizados intranasalmente com uma formulação de vacina de VLP Norwalk. 0 painel da esquerda mostra o número de células secretoras de antigénio (ASCs) especifico de VLPs Norwalk no dia 0 (dia da colheita de tecido), enquanto o painel da direita ilustra o número de ASCs especificas de VLPs Norwalk após 4 dias em cultura com VLPs Norwalk. A diferença no número de células entre o dia 0 e o dia 4 indica a resposta de células B de memória. A Figura 17 mostra os resultados do ensaio de ELISPOT de células da medula óssea colhidas das tíbias de coelhos imunizados intranasalmente com uma formulação de vacina de VLPs Norwalk. 0 painel da esquerda mostra o número de células secretoras de antigénio (ASCs) especifico de VLPs Norwalk no dia 0 (dia da colheita de tecido) , enquanto o painel da direita ilustra o número de ASCs especificas de VLPs Norwalk após 4 dias em cultura com VLPs Norwalk. A presença de ASCs no dia 0 indica a presença de plasmócitos de vida longa. A diferença no número de células entre o dia 0 e o dia 4 indica a resposta de células B de memória. A Figura 18 mostra os resultados do ensaio de ELISPOT de células dos nódulos linfáticos mesentéricos colhidas de coelhos imunizados por via intranasal com uma formulação de vacina de VLPs Norwalk. 0 painel Amostra as células secretoras de anticorpos (ASCs) positivas para IgG especificas para VLPs Norwalk. 0 painel B mostra ASCs positivas para IgA para as VLPs Norwalk. 0 painel da esquerda mostra o número de células secretoras de antigénio (ASCs) especifico de VLPs Norwalk no dia 0 (dia da colheita de tecido), enquanto o painel da direita ilustra o número de ASCs especificas de VLPs Norwalk após 4 dias em cultura com VLPs Norwalk. A presença de ASCs no dia 0 indica a presença de plasmócitos de vida longa. A diferença no número de células entre o dia 0 e o dia 4 indica a resposta de células B de memória.
Figura 19 ilustra o ensaio in vitro de proliferação específica de antigénio de esplenócitos após imunização intranasal de coelhos. 0 painel da esquerda mostra a proliferação de células T quando de nova estimulação com VLPs Norwalk em esplenócitos não fraccionados, enquanto o painel da direita mostra a proliferação de células T CD4+ quando da nova estimulação com VLPs Norwalk.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção está relacionada com composições antigénicas de norovírus.
Antigénios de norovírus
Descreve-se uma composição compreendendo um ou mais antigénios de norovírus. "Norovírus", "Norovírus (NOR)," "norovírus" e seus equivalentes gramaticais significam membros do género Norovírus da família Caliciviridae. Nalgumas realizações, um norovírus pode incluir um grupo de vírus relacionados de RNA de cadeia simples polaridade positiva, sem invólucro, que podem ser infecciosos para a espécie humana ou mamíferos não humanos. Nalgumas realizações, um norovírus pode causar gastroenterite aguda em humanos. Os norovírus podem ser igualmente referidos como pequenos virus estruturados redondos (SRSVs) tendo uma estrutura de superfície definida ou enrugada quando observada por microscopia electrónica. Dentro dos norovírus estão pelo menos quatro genogrupos (Gi-GIV) definidos por sequências de ácido nucleico e aminoácidos, que compreendem 15 agrupamentos genéticos. Os principais genogrupos são GI e GII. GUI e GIV são propostos e aceites de modo geral. A estirpe Jena bovina é um representante de GUI. GIV possui um vírus, Alphatron, nesta altura. Para descrição adicional de norovírus ver Vinje et al. J. Clin. Micro. 41:1423-1433 (2003) . Por "norovírus" também aqui se pretende significar partículas do tipo vírus recombinantes de norovírus (rNOR VLPs). Nalgumas realizações, as VLPs recombinantes de norovírus são produzidas num sistema de expressão usando uma sequência de ácido nucleico de norovírus, a qual codifica pelo menos uma proteína da cápside ou seu fragmento. Noutras realizações, a expressão recombinante de pelo menos a proteína da cápside de norovírus codificada pela ORF2 em células, e.g. a partir de um vector baculovírus em células Sf9, pode resultar em auto-montagem espontânea da proteína da cápside em VLPs. Ainda noutras realizações, a expressão recombinante de pelo menos as proteínas norovírus codificadas pela ORFl e ORF2 em células, e.g. a partir de um vector de baculovírus em células Sf9, pode resultar em auto-montagem espontânea da proteína da cápside em VLPs. A sequência de ácidos nucleicos de norovírus pode também ser uma sequência de consenso compreendendo várias estirpes de norovírus ou uma construção sintética modificada para aumentar os rendimentos ou estabilidade ou melhorar as propriedades antigénicas ou imunogénicas do antigénio codificado. Assim, "norovirus" inclui viriões que podem ser partículas infecciosas ou não infecciosas, as quais incluem partículas defectivas.
Exemplos não limitantes de norovirus incluem vírus de Norwalk (NV, GenBank M87661, NP056821) , vírus
Southampton (SHV, GenBank L07418), vírus Desert Shield (DSV, U04469), vírus Hesse (HSV), vírus Chiba (CHV, GenBank AB042808), vírus Hawaii (HV, GenBank U07611), vírus Snow Mountain (SMV, GenBank U70059), vírus Toronto (TV, Leite et al., Arch. Virol. 141:865-875), vírus Bristol (BV), vírus Jena (JV, AJ01099), vírus Maryland (MV, AY032605), vírus Seto (SV, GenBank AB031013), Camberwell (CV, AF145896), vírus Lordsdale (LV, GenBank X86557), vírus Grimsby (GrV, AJ004864), vírus Mexico (MXV, GenBank U22498), Boxer (AF538679), C59 (AF435807), VAI15 (AY038598), BUDS (AY660568), vírus Houston (HoV), estirpe Minerva (EF126963.1) , estirpe Laurens (EF126966.1), MOH (AF397156), Parris Island (PiV; AY652979), VA387 (AY038600), VA207 (AY038599), e Operation Iraqi Freedom (OIF, AY675554). Nalgumas realizações, pode ser usado um criptograma para identificação e é organizado por: espécie de hospedeiro a partir do qual o vírus foi isolado/abreviatura do géne-ro/abreviatura da espécie/nome da estirpe/ano da ocorrên-cia/país de origem. (Green et al., Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol. 1 841-874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)).
Nalgumas realizações é preferido o uso de uma combinação de genogrupos de norovírus como sejam genogrupo 1.1 (vírus Norwalk) e II.4 (vírus Houston) ou outras estirpes circulantes, ou construções sintéticas representando combinações ou porções das mesmas. As novas estirpes de norovírus são identificadas de rotina (Centers for Disease Control, Morbidity and Mortality Weekly Report, 56(33):842-846 (2007)) e as sequências de consenso de duas ou mais estirpes podem também ser usadas para expressar antigénios de norovírus. O antigénio de norovírus pode ser na forma de péptidos, proteínas ou partículas tipo vírus (VLPs). Numa realização preferida, o antigénio de norovírus compreende VLPs. Como aqui usado, "partículas do tipo vírus ou VLPs" refere-se a partículas do tipo vírus, fragmentos , agregados ou porções das mesmas produzidas a partir da sequência codificadora da proteína da cápside de norovírus e tendo características antigénicas semelhantes às das partículas de norovírus infecciosas. Os antigénios de norovírus podem também estar na forma de monómeros da cápside, multímeros da cápside, proteína ou fragmentos peptídicos de VLPs ou agregados ou misturas dos mesmos. As proteínas ou péptidos antigénicos de norovírus podem estar igualmente na forma desnaturada, produzida usando métodos conhecidos na arte.
Os antigénios de norovírus podem também incluir variantes das referidas proteínas da cápside ou seus fragmentos expressos nas VLPs da invenção. As variantes podem conter alterações nas sequências de aminoácidos das proteínas constituintes. 0 termo "variante" no que respeita a um polipéptido refere-se a uma sequência de aminoácidos que está alterada num ou mais aminoácidos relativamente à sequência de referência. A variante pode ter alterações "conservadas", em que um aminoácido substituído possui propriedades estruturais ou químicas semelhantes, e.g. substituição de leucina com isoleucina. Como alternativa, uma variante pode ter alterações "não conservadas", e.g. substituição de uma glicina com um triptofano. Variações mínimas análogas podem incluir igualmente deleção ou inserção de aminoácidos ou ambas. Orientações na determinação de quais os resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos, inseridos ou eliminados sem eliminar a actividade biológica ou imunológica podem ser encontradas usando programas informáticos bem conhecidos na arte, por exemplo, o programa DNASTAR.
Textos gerais que descrevem técnicas de biologia molecular, as quais são aplicáveis na presente invenção, tais como clonagem, mutagenização e similares, incluem Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel")· Estes textos descrevem mutagénese, o uso de vectores, promotores e muitos outros tópicos relevantes relacionados com, e.g., a clonagem e mutageni-zação das proteínas da cápside de norovírus. Assim, métodos conhecidos de manipulação de proteínas e tecnologia de DNA recombinante para melhorar ou alterar as características das proteínas expressas nas VLPs da invenção são igualmente descritas. Podem ser usados vários tipos de mutagénese para produzir e/ou isolar ácidos nucleicos variantes incluindo sequências de consenso que codificam moléculas de proteína e/ou ainda modificar/mutar as proteínas nas VLPs da invenção. Elas incluem, mas não lhes estão limitadas, mutagénese dirigida, mutagénese pontual aleatória, recombinação homóloga (embaralhamento de DNA, "DNA shuffling"), mutagénese usando matrizes contendo uracilo, mutagénese dirigida com oligonucleótidos, mutagénese de DNA modificado com fosforotioato, mutagénese que usa duplas hélices de DNA com intervalos ou similares. Outros métodos adequados incluem reparação de desemparelhamentos pontuais, mutagénese usando estirpes hospedeiras deficientes na reparação, selecção por restrição e purificação por restrição, mutagénese por deleção, mutagénese através da síntese total do gene, reparação de quebras da cadeia dupla e similares.
As VLPs da presente invenção podem ser formadas a partir da proteína da cápside de norovírus de tamanho completo, como sejam as proteínas VPl e/ou VP2 ou determinados derivados de VPl ou VP2 usando métodos convencionais na arte. Como alternativa, a proteína da cápside usada para formar a VLP é uma proteína da cápside truncada. Nalgumas realizações, por exemplo, pelo menos uma das VLPs compreende uma proteína VPl truncada. Noutras realizações, todas as VLPs compreendem proteínas VPl truncadas. A truncagem pode ser uma truncagem N-terminal ou C-terminal. Proteínas da cápside truncadas são derivados de proteína da cápside adeguadamente funcionais. Os derivados de proteínas da cápside funcionais são capazes de induzir uma resposta imune (se necessário, guando adeguadamente usadas com adjuvante) na mesma forma gue a resposta imune é induzida por uma VLP consistindo na proteína da cápside de tamanho completo.
As VLPs podem conter proteínas VPl abundantes e/ou proteínas VP2 pouco abundantes. De preferência, cada VLP possui proteína VPl e/ou VP2 de apenas um único genogrupo de norovírus dando origem a uma VLP monovalente. Como aqui usado, o termo "monovalente" significa que as proteínas antigénicas derivam de um único genogrupo de norovírus. Por exemplo, as VLPs possuem VPl e/ou VP2 de uma estirpe de vírus (e.g. VPl e VP2 do vírus Norwlak) . De preferência, a VLP é constituída predominantemente por proteínas VPl. Numa realização da invenção, o antigénio é uma mistura de VLPs monovalentes em que a composição inclui VLPs constituídas por VPl e/ou VP2 derivadas de um único genogrupo de norovírus misturadas com VLPs constituídas por VPl e/ou VP2 de um genogrupo de norovírus diferente seleccionado de entre múltiplas estirpes virais (e.g. vírus
Norwalk e virus Houston). Puramente a título de exemplo, a composição pode conter VLPs monovalentes de uma ou mais estirpes de norovirus do genogrupo I juntamente com VLPs monovalentes de uma ou mais estirpes de norovirus do genogrupo II. De preferência, a mistura de VLPs de norovirus é composta por estirpes de norovirus Norwalk e Houston .
No entanto, numa realização alternativa da invenção, as VLPs podem ser VLPs multivalentes que compreendem, por exemplo, proteínas VPl e/ou VP2 de um genogrupo de norovirus misturadas com proteínas VPl e/ou VP2 de um segundo genogrupo de norovirus, em que as diferentes proteínas VPl e VP2 não são proteínas VPl e VP2 quiméricas, mas associam-se na mesma estrutura de cápside para formar VLPs imunogénicas. Como aqui usado, o termo "multivalente" significa que as proteínas antigénicas derivam de dois ou mais genogrupos de norovirus. As VLPs multivalentes podem conter antigénios de VLP retirados de duas ou mais estirpes virais. Apenas a título de exemplo, a composição pode conter VLPs multivalentes constituídas por monómeros ou multímeros da cápside de uma ou mais estirpes de norovirus do genogrupo I juntamente com monómeros ou multímeros da cápside de uma ou mais estirpes de norovirus do genogrupo II. De preferência, as VLPs multivalentes possuem proteínas da cápside das estirpes de norovirus Norwalk e Houston. A combinação de VLPs monovalentes ou multi- valentes dentro da composição, de preferência, não bloqueará a imunogenicidade de cada tipo de VLP. Em particular prefere-se que não haja interferência entre VLPs de norovírus na combinação da invenção, de modo que a composição de VLPs combinadas da invenção seja capaz de induzir imunidade contra a infecção por cada genótipo de norovírus representado na vacina. Adequadamente, a resposta imune contra um determinado tipo de VLP na combinação é pelo menos 50% da resposta imune do mesmo tipo de VLP quando medido individualmente de preferência 100% ou substancialmente 100%. A resposta imune pode adequadamente ser medida, por exemplo, pelas respostas de anticorpos, como aqui ilustrado nos exemplos. VLPs multivalentes podem ser produzidas através da expressão separada das proteínas da cápside individuais seguido da combinação para formar VLPs. Como alternativa, múltiplas proteínas da cápside podem ser expressas na mesma célula, a partir de uma ou mais construções de DNA. Por exemplo, múltiplas construções de DNA podem ser usadas para transformar ou transfectar células hospedeiras, cada um dos vectores codificando uma proteína da cápside diferente. Como alternativa, pode ser usado um vector único tendo múltiplos genes de proteína da cápside, controlados por um promotor partilhado ou por múltiplos promotores individuais. Elementos IRES podem também ser incorporados no vector, sempre que apropriado. Utilizando tais estratégias de expressão, as proteínas da cápside co-expressas podem ser copurifiçadas para subsequente formação de VLPs ou podem espontaneamente formar VLPs multivalentes que podem ser então purificadas.
Um processo preferido para a produção de VLPs multivalentes compreende a preparação de proteínas da cápside de VLPs ou derivados, tais como proteínas VPl e/ou VP2, de diferentes genótipos de norovírus, mistura das proteínas e montagem das proteínas para produzir VLPs multivalentes. As proteínas da cápside podem estar na forma de um extracto bruto, estar parcialmente purificadas ou serem purificada antes da mistura. As VLPs monovalentes montadas de diferentes genogrupos podem ser desmontadas, misturadas umas com as outras e novamente montadas em VLPs multivalentes. De preferência, as proteínas ou VLPs estão pelo menos parcialmente purificadas antes de serem combinadas. Facultativamente, pode ser realizada purificação subsequente das VLPs multivalentes após montagem.
Adequadamente, as VLPs da invenção são preparadas através da desmontagem e nova montagem de VLPs, para proporcionar VLPs homogéneas e puras. Numa realização, VLPs multivalentes podem ser preparadas através da desmontagem de duas ou mais VLPs, seguido da combinação dos componentes das VLPs desmontadas em qualquer ponto adequado antes da nova montagem. Esta abordagem é adequada quando as VLPs se formam espontaneamente a partir da proteína VPl expressa, como ocorr, por exemplo, nalgumas estirpes de levedura. Quando a expressão da proteína VPl não conduz à formação espontânea de VLPs, as preparações de proteínas ou capsómeros de VPl podem ser combinadas antes da montagem em VLPs.
Quando são usadas VLPs multivalentes, de preferência os componentes das VLPs são misturados nas proporções em que se pretendem nas VLPs mistas finais. Por exemplo, uma mistura da mesma quantidade de uma proteína VPl parcialmente purificada dos vírus Norwalk e Houston (ou outras estirpes de norovírus) proporciona uma VLP multivalente com quantidades aproximadamente iguais de cada proteína.
Composições compreendendo VLPs multivalentes podem ser estabilizadas com soluções conhecidas na arte, tais como as de WO 98/44944, W00045841.
As composições da invenção podem compreender outras proteínas ou fragmentos de proteínas para além das proteínas VPl e VP2 ou derivados. Outras proteínas ou péptidos podem ser igualmente co-administrados com a composição da invenção. Facultativamente, a composição pode também ser formulada ou co-administrada com antigénios não norovírus. Adequadamente estes antigénios podem proporcionar protecção contra outras doenças. A proteína VPl ou derivado funcional da proteína é adequadamente capaz de formar uma VLP e a formação de VLPs pode ser através de técnicas convencionais tais como, por exemplo, microscopia electrónica e dispersão de luz laser dinâmica.
Preparação de antigénios
As moléculas antigénicas da presente invenção podem ser preparadas através do isolamento e purificação dos organismos em que ocorrem naturalmente ou podem ser preparados através de técnicas recombinantes. De preferência os antigénios das VLPs de norovírus são preparados a partir de células de insecto, tais como células Sf9 ou H5, ainda que quaisquer células adequadas tais como E. coli ou levedura, por exemplo, sistema de expressão de S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastori ou outras Pichia, a expressão em células de mamífero, tais como sistemas de CHO ou HEK, possam ser igualmente usadas. Quando preparadas por um método recombinante ou através de síntese, podem ser feitas uma ou mais inserções, deleções, inversões ou substituições de aminoácidos constituindo um péptido. Cada um dos antigénios referidos é, de preferência, usado no estado substancialmente puro.
Os procedimentos de produção de VLPs de norovírus em culturas de células de insecto foi anteriormente divulgado na Patente U.S. No. 6,942,865. Resumidamente, um cDNA do extremo 3' do genoma contendo o gene da cápside viral (0RF2) e um gene estrutural menos abundante (0RF3) foram clonados. Os baculovírus recombinantes portadores dos genes da cápside virai foram construídos a partir do cDNAs clonados. As VLPs de norovírus foram produzidas em culturas de células de insecto Sf9 ou H5.
Adj uvantes É ainda descrita uma composição compreendendo adjuvantes para usar com o antigénio de norovirus. A maioria dos adjuvantes contem uma substância destinada a proteger o antigénio do catabolismo rápido, como seja hidróxido de alumínio ou óleo mineral e um estimulador das respostas imunes, tais como proteínas derivadas de Bordatella pertussis ou Mycobacterium tuberculosis. Adjuvantes adequados são comercializados como, por exemplo, Adjuvante Incompleto de Freund e Adjuvante Completo de Freund (Pifco Laboratories, Detroit, Mich.); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); sais de alumínio tais como gel de hidróxido de alumínio (alum) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados; polissacáridos derivatizados com catiões ou aniões; polifosfazenos; microsferas biodegradáveis; e Quil A.
Adjuvantes adequados incluem também, mas não lhes estão limitados, agonistas dos receptores do tipo "toll" (TLR), monofosforil-lípido A (MPL), lípido A sintético, miméticos ou análogos de lípido A, sais de alumínio, citocinas, saponinas, derivados de muramildipéptido (MDP), oligos CpG, lipopolissacáridos (LPS) ou bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões, virossomas, cocleatos, micropartículas de poli(lactida-co-glicolidos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, endotoxinas, por exemplo endotoxinas bacterianas e lipossomas. De preferência, os adjuvantes são exotoxinas não derivadas de bactérias. Os adjuvantes preferidos são os que estimulam uma resposta tipo Thl, como sejam 3DMPL ou QS21.
Monofosforil-lípido A (MPL), um derivado não tóxico de lípido A de Salmonella, é um agonista forte de TLR-4 que foi desenvolvido como um adjuvante de vacina (Evans et al. 2003). Em estudos pré-clínicos com murganhos, demonstrou-se que MPL intranasal aumenta as respostas humorais, tanto secretórias como sistémicas (Baldridge et al. 2000; Yang et al. 2002) . Foi igualmente demonstrado como seguro e eficaz como adjuvante de vacina em estudos clínicos com mais de 120000 doentes (Baldrick et al., 2002; 2004). MPL estimula a indução de imunidade inata através do receptor TLR-4 e é assim capaz de induzir respostas imunes não específicas contra uma larga gama de patogénios infecciosos, incluindo bactérias gram-negativas e bactérias gram-positivas, vírus e parasitas (Baldrick et al. 2004; Persing et al. 2002) . A inclusão de MPL em formulações intranasais deverá proporcionar indução rápida de respostas inatas, induzindo respostas imunes não específicas quando da exposição virai, ao mesmo tempo que estimula respostas específicas geradas pelos componentes antigénicos da vacina.
Assim, numa realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo monofosforil-lípido A (3D-MPL®) como estimulador de imunidade adaptativa e inata.
Quimicamente, 3D-MPL® é uma mistura de monofosforil-lipido A 3 De-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma preferida de monofosforil-lipido A 3 De-O-acilado está divulgada na Patente Europeia 0 689 454 Bl (SmithKline Beecham Biologicals SA) . Noutra realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo lipido A sintético, miméticos ou análogos de lipido A, tais como PET Lipid A da BioMira ou derivados sintéticos destinados a funcionar como os agonistas de TLR-4. 0 termo "quantidade de adjuvante eficaz" ou "quantidade eficaz de adjuvante" será entendido pelos familiarizados com a arte e inclui uma quantidade de um ou mais adjuvantes que seja capaz de estimular a resposta imune a um antigénio administrado, i.e., uma quantidade que aumenta a resposta imune de uma composição de antigénio administrada, conforme medido em termos dos níveis de IgA nas lavagens nasais, níveis de IgG ou IgM sérica, ou proliferação de células B e T. Adequadamente, aumentos eficazes nos níveis de imunoglobulina incluem mais de 5%, de preferência mais de 25% e, em particular, mais de 50%, comparativamente com a mesma composição de antigénio sem qualquer adjuvante.
Agente de entrega É igualmente descrita uma composição compreendendo um agente de entrega que funcione para estimular a tomada de antigénio baseado, mas não lhe estando restringido, no aumento da viscosidade do fluido devido ao efeito isolado ou combinado de desidratação parcial de mucopolissacáridos do hospedeiro, às propriedades fisicas do agente de entrega ou através das interacções iónicas entre o agente de entrega e os tecidos do hospedeiro no local de exposição, o que proporciona um efeito de depósito. Como alternativa, o agente de entrega pode aumentar o tempo de retenção no local de entrega (e.g., retardamento da expulsão do antigénio). Tal agente de entrega pode ser um agente bioadesivo. Em particular, o bioadesivo pode ser um agente mucopolissacárido seleccio-nado do grupo consistindo em glicosaminoglicanos (e.g., sulfato de condroitina, sulfato de condroitina dermatano, sulfato de queratano, heparina, sulfato de heparano, hialuronano), polímeros de açúcares (e.g., pectina, algi-nato, glicogénio, amilase, amilopectina, celulose, quitina, estaquiose, unulina, dextrina, dextrano), derivados de ácido poli(acrílico)interligado, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polissacáridos (incluindo mucina e outros mucopolissacáridos) derivados de celulose (e.g. hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose), proteínas (e.g. lectinas, proteínas fimbriais), e ácido desoxir-ribonucleico. De preferência, o mucoadesivo é um polissa-cárido, como seja quitosano, um sal de quitosano ou base de quitosano (e.g. glutamato de quitosano). 0 quitosano, um polissacárido linear com carga positiva derivado da quitina das carapaças dos crustáceos, é um bioadesivo para as células epiteliais e sua camada de muco subjacente. A formulação de antigénios com quitosano aumenta o seu tempo de contacto com a membrana nasal, aumentando assim a tomada devido a um efeito de depósito (Ilium et al. 2001; 2003; Davis et al. 1999; Bacon et al. 2000; van der Lubben et al. 2001; 2001; Lim et al. 20 01) . O quitosano foi testado como sistema de entrega nasal para várias vacinas, incluindo gripe, tosse convulsa e difteria, tanto em modelos animais como em seres humanos (Ilium et al. 2001; 2003; Bacon et al. 2000; Jabbal-Gill et al. 1998; Mills et al. 2003; McNeela et al. 2004) . Nestes ensaios, demonstrou-se que o quitosano aumenta as respostas imunes sistémicas para níveis equivalentes ao da vacinação parentérica. Ainda, níveis significativos de IgA específica de antigénio foram igualmente medidos nas secreções das mucosas. Assim, o quitosano pode aumentar grandemente a eficácia de uma vacina nasal. Ainda, devido às suas características físicas, o quitosano é particularmente bem adequado para vacinas intranasais formuladas como pós (van der Lubben et al. 2001; Mikszta et al. 2005; Huang et al. 2004) .
Assim, numa realização, a presente invenção proporciona uma composição antigénica ou de vacina adaptada para administração intranasal, em que a composição inclui antigénio e, facultativamente, uma quantidade eficaz de adjuvante. Em realizações preferidas, a invenção proporciona uma composição antigénica ou de vacina compreendendo antigénio de norovírus, como seja VLPs de norovírus, em combinação com pelo menos um agente de entrega, como seja quitosano e pelo menos um adjuvante, como sejam MPL®, CPGs, imiquimod, gardiquimod ou lípido A sintético ou miméticos ou análogos de lípido A. A massa molecular do quitosano pode ser entre 10 kDa e 800 kDa, de preferência entre 100 kDa e 700 kDa e, mais de preferência, entre 200 kDa e 600 kDa. A concentração de quitosano na composição será tipicamente até cerca de 80% (p/p), por exemplo 5%, 10%, 30%, 50%, 70% ou 80%. De preferência, o quitosano é um que seja pelo menos 75% desacetilado, por exemplo 80-90%, mais de preferência 82-88% desacetilado, são exemplos particulares os que possuem 83%, 84%, 85%, 86% e 87% de desacetilação.
Vacinas e formulações antigénicas
As composições da invenção podem ser formuladas para administração como vacinas ou formulações antigénicas. Como aqui usado, o termo "vacina" refere-se a uma formulação que possui VLPs de norovírus ou outros antigénios de norovírus da presente invenção como acima descrito, que está numa forma capaz de ser administrada a um vertebrado e que induz uma resposta imune suficiente para induzir uma imunidade terapêutica para melhorar uma infecção e/ou para reduzir pelo menos um sintoma de uma infecção e/ou para estimular a eficácia de uma outra dose de VLPs ou antigénio. Como aqui usado, o termo "formulação antigénica" ou "composição antigénica" refere-se a uma preparação que, quando administrada a um vertebrado, e.g. um mamífero, induzirá uma resposta imune. Como aqui usado, o termo "resposta imune" refere-se a resposta imune humoral e a resposta imune celular. A resposta imune humoral envolve a estimulação da produção de anticorpos pelos linfócitos B que, por exemplo, neutralizam os agentes infecciosos, bloqueiam a entrada dos agentes infecciosos nas células, bloqueiam a replicação dos referidos agentes infecciosos e/ou protegem as células hospedeiras da infecção e destruição. A resposta imune celular refere-se a uma resposta imune que é mediada por linfócitos T e/ou outras células, tais como macrófagos, contra um agente infeccioso, apresentado por um vertebrado (e.g. um ser humano), que previne ou melhora a infecção ou reduz pelo menos um dos seus sintomas. A preparação de vacinas está, de um modo geral, descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). As composições da presente invenção podem ser formuladas, por exemplo, para entrega numa ou mais mucosas entre oral, gastrointestinal e respiratória (e.g. nasal).
Quando a composição se destina a entrega na mucosa respiratória (e.g. nasal), tipicamente é formulada numa solução aquosa para administração como um aerossol ou gotas nasais, ou, em alternativa, como pó seco, e.g. para deposição rápida dentro da passagem nasal. As composições para administração como gotas nasais podem conter um ou mais excipientes do tipo geralmente incluído em tais composições, por exemplo preservativos, agentes de ajuste da viscosidade, agentes de ajuste da tonicidade, agentes tamponantes e similares. Os agentes de viscosidade podem ser celulose microcristalina, quitosano, amidos, polissa-cáridos e similares. As composições para administração como pó seco podem conter igualmente um ou mais excipientes geralmente incluídos em tais composições, por exemplo, agentes mucoadesivos, agentes de enchimento e agentes para entregar um fluxo de pó e características de tamanho adequadas. Os agentes de enchimento e pó de fluxo e tamanho podem incluir manitol e sacarose. Por exemplo, a vacina de norovírus pode ser formulada como 10 mg de um pó seco contendo um ou mais antigénios de genogrupo de norovírus (e.g. vírus Norwalk, vírus Houston, vírus Snow Mountain), adjuvante MPL®, mucoadesivo quitosano, e manitol e sacarose como agentes de enchimento e para proporcionar caracte-rísticas de fluxo correctas. A formulação pode compreender cerca de 7,0 mg (gama de 25 a 90% p/p) de quitosano, cerca de 1,5 mg de manitol (gama de 0 a 50% p/p), cerca de 1,5 mg de sacarose (gama 0 a 50% p/p), cerca de 25 yg MPL® (0,1 a 5% p/p) e cerca de 100 yg de antigénio de norovírus (gama de 0,05 a 5% p/p). O antigénio de norovírus pode estar presente numa concentração entre cerca de 0,01% (p/p) e cerca de 80% (p/p) . Numa realização, os antigénios de norovírus podem ser formulados em dosagens de cerca de5 yg, cerca de 15 yg, e cerca de 50 yg por 10 mg de formulação de pó seco (0,025, 0,075 e 0,25% p/p) para administração em ambas as narinas ou cerca de 10 yg, cerca de 30 yg, e cerca de 100 yg (0,1, 0,3 e 1,0% p/p) para administração numa narina. A formulação pode ser dada numa ou em ambas as narinas durante cada administração. Pode haver uma administração de reforço 1 a 12 semanas após a primeira administração para melhorar a resposta imune. O teor dos antigénios de norovirus na vacina e formulações antigénicas pode ser na gama de 1 yg to 100 mg, de preferência na gama de 1-500 yg, mais de preferência 5-200 yg, mais tipicamente na gama 10-100 yg. O total de antigénio de norovirus administrado em cada dose será cerca de 10 yg, cerca de 30 yg ou cerca de 100 yg num total de 20 mg de pó seco quando administrado em ambas as narinas e 10 mg de pó seco quando administrado numa só narina. As caracteristicas do pó seco são tais que menos de 10% das partículas são inferiores a 10 ym de diâmetro. O tamanho médio das partículas varia entre 10 e 500 ym de diâmetro.
Numa realização, as composições antigénicas e de vacina podem ser formuladas como um líquido para subsequente administração a um indivíduo. Uma formulação líquida destinada a administração intranasal compreenderá antigénios de genogrupos de norovirus, adjuvante e um agente de entrega, como seja o quitosano. As formulações líquidas para administração intramuscular (i.m.) ou oral compreenderão antigénios dos genogrupos de norovirus, adjuvante e um tampão, sem agente de entrega (e.g. quitosano).
De preferência, as composições antigénicas e de vacina aqui descritas anteriormente são liofilizadas e guardadas na forma anidra até estarem prontas para usar, altura em que são reconstituídas com diluente, se usadas numa formulação liquida. Como alternativa, os diferentes componentes da composição podem ser guardados separadamente num kit ou embalagem (qualquer um dos componentes estando liofilizado). Os componentes podem permanecer na forma liofilizada para formulação seca ou ser reconstituídos para formulações liquidas e são misturados antes de serem usados ou administrados separadamente ao doente. Para a administração de pó seco, a formulação de vacina ou antigénica pode ser colocada num sistema de entrega intranasal ou emplastro de entrega tópica (e.g. dérmica) e guardada até ser usada. De preferência, tal sistema de entrega e embalagem associada protegerá e assegurará a estabilidade do seu conteúdo. A liofilização das formulações antigénicas e vacinas é bem conhecida na arte. Tipicamente o antigénio liquido é liofilizado na presença de agentes para proteger o antigénio durante o processo de liofilização e para originar pós com as caracteristicas desejáveis. Açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou lactose (presente numa concentração inicial de 10-200 mg/ml) são normalmente usados para crioprotecção e lioprotecção dos antigénios proteicos e para originar queijos liofilizados ou pós com as caracteristicas pretendidas. As composições liofilizadas são teoricamente mais estáveis. Outras tecnologias de secagem, tais como secagem por vaporização ou secagem por vaporização com congelação podem ser igualmente usadas. Se bem que o objectivo da maioria dos processos de formulação é minimizar a agregação e degradação de proteínas, os inventores demonstraram que a presença de antigénio agregado estimula a resposta imune contra VLPs de norovirus (ver Exemplos 3 e 4 em modelos animais). Assim, os inventores desenvolveram métodos pelos quais a percentagem de agregação do antigénio pode ser controlada durante o processo de liofilização para produzir uma proporção de antigénio agregado relativamente ao antigénio intacto para induzir uma resposta imune máxima em modelos animais.
Assim, é igualmente descrito um método de obtenção de formulações de antigénio de norovirus compreendendo (a) preparação de uma solução pré-liofilização compreendendo antigénio de norovirus, sacarose e quitosano, em que as proporções de sacarose para quitosano são entre cerca de 0:1 e cerca de 10:1; (b) congelação da solução; e (c) liofilização da solução congelada entre 30-72 horas, em que o produto final liofilizado contem uma percentagem do referido antigénio de norovirus na forma agregada. A liofilização pode ocorrer à temperatura ambiente, temperatura reduzida ou decorrer em ciclos a várias temperaturas. Apenas para fins ilustrativos, a liofilização pode ocorrer ao longo de uma série de passos, por exemplo um ciclo que começa a -69°C, gradualmente ajustando para -24°C durante 3 horas, depois mantendo a esta temperatura durante 18 horas, depois gradualmente ajustando a -16°C durante 1 hora, depois mantendo esta temperatura durante 6 horas, em seguida gradualmente ajustando a +34°C durante 3 horas e finalmente mantendo esta temperatura durante 9 horas. Numa realização, a solução de pré-liofilização ainda compreende um agente de enchimento. Numa outra realização, o referido agente de enchimento é manitol.
Proporções adequadas de sacarose e quitosano para dar as percentagens pretendidas de agregação podem ser determinadas pelas orientações que se seguem. Uma mistura pré-liofilização contendo proporções de massa de sacarose para quitosano numa gama entre cerca de 2:1 e cerca de 10:1 dará uma gama de aproximadamente 50% a 100% de antigénio de norovirus intacto (i.e. 0% a 50% de antigénio agregado) pós-liofilização dependendo das concentrações de solução de pré-liofilização (ver Exemplo 13) . As proporções de massa de 0:1 de sacarose para quitosano produzirão menos de 30% de antigénio de norovirus intacto (i.e. superior a 70% de antigénio agregado). A omissão de sacarose e de quitosano e o uso de apenas agente de enchimento, como seja manitol, produzirá menos de 10% de antigénio intacto (i.e. superior a 90% de antigénio agregado dependendo das concentrações de solução de pré-liofilização). Usando estas orientações, os familiarizados com a arte poderão ajustar as proporções de massa e concentrações de sacarose para quitosano na mistura de pré-liofilização para obter a quantidade pretendida de agregação necessária para produzir uma resposta imune óptima.
Ainda, a inclusão de sacarose, quitosano e manitol na solução de pré-liofilização não tem efeito negativo no antigénio de norovírus intacto ao longo do tempo, i.e. a proporção de antigénio agregado/antigénio intacto na formulação não aumenta quando guardada como um pó seco durante um período de aproximadamente 12 meses ou mais (ver Exemplo 10) . Assim, este procedimento de liofilização assegura formulações estáveis com proporções previstas e controláveis de antigénio de norovírus agregado relativamente a intacto. Métodos de estimulação de uma resposta imune A quantidade de antigénio em cada formulação antigénica ou de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imune robusta sem efeitos secundários adversos significativos. Tal quantidade variará, dependendo de quais os antigénios são empregues, via de administração e adjuvante usado. Em geral, a dose administrada a um doente, no contexto da presente invenção, deverá ser suficiente para efectuar uma resposta terapêutica benéfica no doente ao longo do tempo ou para induzir a produção de anticorpos específicos de antigénio. Assim, a composição é administrada a um doente numa quantidade suficiente para induzir uma resposta imune contra os antigénios específicos e/ou para aliviar, reduzir ou curar sintomas e/ou complicação da doença ou infecção. Uma quantidade adequada para atingir isto é definida como uma "dose eficaz em termos terapêuticos".
Para uma forma substancialmente pura do antigénio de norovírus, espera-se que cada dose compreenda cerca de 1 yg a 10 mg, de preferência cerca de 2-50 yg para cada antigénio de norovírus na formulação. Num regime de imunização típico empregando as preparações antigénicas da presente invenção, as formulações podem ser administradas em várias doses (e.g. 1-4), cada dosagem contendo 1-100 yg de cada antigénio. A dose será determinada pela actividade imunológica da composição produzida e pela condição do doente, assim como pelo peso do corpo ou áreas de superfície do doente a ser tratado. O tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza e grau de quaisquer efeitos adversos que possam acompanhar a administração de uma composição particular num doente particular.
As formulações antigénicas e de vacina da presente invenção podem ser administradas através de uma via não mucosal ou mucosal. Estas administrações podem incluir a administração in vivo via injecção parentérica (e.g. intravenosa, subcutânea e intramuscular) ou outras vias directas tradicionais, tais como as vias bucal/sublingual, rectal, oral, nasal, tópica (como seja transdérmica e oftálmica), vaginal, pulmonar, intraarterial, intraperitoneal, intra-ocular ou intranasal ou directamente num tecido específico. Como alternativa, as vacinas da invenção podem ser administradas através de qualquer uma de uma variedade de vias tais como oral, tópica, subcutânea, das mucosas, intravenosa, intramus- cular, intranasal, sublingual, transcutânea, subdérmica, intradérmica e via supositório. A administração pode ser conseguida simplesmente através de administração directa usando um emplastro, agulha, cateter ou dispositivo relacionado, numa única vez ou em múltiplas vezes.
Numa realização preferida, as formulações antigé-nicas e de vacina da presente invenção são administradas numa superfície de mucosa. A imunização através das superfícies das mucosas oferece numerosas vantagens potenciais relativamente a outras vias de imunização. Os benefícios mais óbvios são 1) a imunização nas mucosas não requer agulhas ou pessoal altamente treinado para administração e 2) as respostas imunes são induzidas nos locais de entrada do agente patogénico, assim como sistemicamente (Isaka et al. 1999; Kozlowski et al. 1997; Mestecky et al. 1997; Wu et al. 1997).
Num outro aspecto, descreve-se um método de indução de uma resposta imune de IgA das mucosas e uma resposta imune sistémica de IgG (de preferência intranasal ou oral) numa superfície das mucosas do doente de uma composição antigénica ou de vacina compreendendo um ou mais antigénios de norovírus, pelo menos um adjuvante eficaz e/ou pelo menos um agente de entrega. É igualmente descrita a disponibilização de meios para dispersão de formulações intranasais de antigénios de norovírus anteriormente aqui definidos e pelo menos um adjuvante ou pelo menos um agente de entrega como aqui anteriormente definido. Um dispositivo distribuidor pode, por exemplo, ter a forma de um sistema de entrega de aerossol e pode ser arranjado para distribuir apenas uma única dose ou uma multiplicidade de doses. Tal dispositivo entregará uma dose medida da vacina ou formulação antigénica na passagem nasal. Outros exemplos de veículos adequados incluem, mas não lhes estão limitados, conta-gotas, zaragatoas, aerossolizadores, insufladores (e.g. Valois Monopowder Nasal Administration Device, Bespak UniDose DP), nebulizadores e inaladores. Os dispositivos podem entregar a formulação antigénica ou de vacina através de meios passivos requerendo que o indivíduo inale a formulação na cavidade nasal. Como alternativa, o dispositivo pode entregar activamente a formulação bombeando ou pulverizando uma dose na cavidade nasal. A formulação antigénica inclui dois dispositivos por indivíduo (um dispositivo por narina). A dose actual do ingrediente activo (antigénio de norovírus) pode ser cerca de 5-1000 yg. Numa realização preferida, a formulação antigénica ou de vacina é administrada na mucosa nasal através da deposição rápida dentro da passagem nasal de um dispositivo contendo a formulação mantido perto ou dentro da passagem nasal. É igualmente descrito um método de gerar anticorpos contra um ou mais antigénios de norovírus, o referido método compreendendo a administração de uma formulação de vacina ou antigénica da invenção como acima descrito a um indivíduo. Estes anticorpos podem ser isolados e purificados através de métodos de rotina conhecidos na arte. Os anticorpos isolados específicos de antigénios de norovírus podem ser usados no desenvolvimento de ensaios imunológicos de diagnóstico. Estes ensaios poderão ser empregues para detectar um norovírus em amostras clínicas e identificar o vírus particular causador da infecção (e.g. Norwalk, Houston, Snow Mountain, etc.). Como alternativa, os anticorpos isolados podem ser administrados a indivíduos susceptíveis à infecção por norovírus para conferir imunidade passiva ou de curto prazo.
Como acima referido, as formulações de vacina da invenção podem ser administradas a um indivíduo para tratar sintomas de uma infecção por norovírus. Os sintomas da infecção por norovírus são bem conhecidos na arte e incluem náusea, vómitos, diarreia e dor de estômago. Ainda, um doente com uma infecção por norovírus pode ter febre baixa, dor de cabeça, arrepios, dores musculares e fadiga. A invenção inclui um método de indução de uma resposta imune num indivíduo com infecção por norovírus através da administração ao indivíduo de uma formulação de vacina da invenção, de modo que pelo menos um dos sintomas associados à infecção por norovírus seja alivado e/ou reduzido. Uma redução num sintoma pode ser determinada subjectivamente ou objectivamente, e.g. auto-avaliação de um indivíduo, avaliação clínica ou fazendo um ensaio ou medição adequado (e.g. temperatura do corpo), incluindo, e.g., uma avaliação da qualidade de vida, uma progressão mais lenta de uma infecção por norovírus ou sintomas adicionais, uma gravidade reduzida de sintomas de norovírus ou ensaios adequados (e.g. título de anticorpos e/ou ensaio de activação das células T). A avaliação objectiva compreende avaliações animais e humanas.
Exemplos A invenção será agora ilustrada com maior detalhe através da referência a realizações específicas descritas nos exemplos que se seguem. Os exemplos destinam-se a serem puramente ilustrativos da invenção e não se destinam, a limitar de forma alguma o seu âmbito.
Exemplo 1. Investigações de respostas imunes contra diferentes formas de antigénio de norovírus
Para investigar a eficácia das formulações de vacina, murganhos foram imunizados intranasalmente (i.n.) com a formulação de suspensão líquida da vacina através de micropipeta. Os murganhos receberam apenas uma única dose de vacina (sensibilização)
Para a experiência, prepararam-se três formulações de vacina. A primeira, referida como 100% de agregado, foi preparada através da liofilização de VLPs em condições que destroem a estrutura nativa da VLP e induzem agregação. A segunda, 100% intacta, foi preparada com placebo liofilizado reidratado, inoculado com 100% de VLPs monodispersas nativas derivadas do stock de VLPs não liofilizadas. A terceira formulação, Mistura 50/50, foi feita misturando as duas formulações anteriores numa proporção de 1:1 ou através da liofilização em condições que são -50% de VLPs intactas e 50% agregadas. O estado estrutural e a concentração das VLPs intactas nativas foram testados através de cromatografia liquida de alta resolução e exclusão por tamanho (SE-HPLC) e absorvância de ultravioleta (UV). A concentração proteica total (que inclui os agregados) das formulações foi determinada através de coloração quantitativa das proteínas resolvidas por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE). A percentagem de agregado/intacto foi calculada como a razão entre VLP nativa intacta e a proteína total.
Tabela 1. As misturas mostradas abaixo foram preparadas para a Experiência 605.125, vacinação de murganhos com líquido i.n.
Tabela 1. Sensibilização para exp 605.125 (murganho i.n.) Os valores indicam a concentração final das formulações.
Dose: 20 pL por murganho, 10 pL por narina.
Grupo 1, 100% Agg: VLPs 100% agregadas reidratadas
Grupo 2, 100% Intacto: placebo liofilizado reidratado, misturado com VLPs 100% intactas do stock de VLP não liofilizadas
Grupo 3, mistura 50/50: mistura 1:1 das soluções dos Grupos 1 e 2.
Grupo 4, Naive: placebo liofilizado reidratado
Esta experiência mede a resposta imune em murganhos a diferentes formulações de VLPs de norovirus. Grupos de murganhos (5 por grupo) foram vacinados intra-nasalmente (i.n.) uma vez com formulações de pó seco reidratado mostrado na Tabela 1. Os animais vacinados com formulações contendo VLPs receberam a mesma quantidade de proteína total. 100% Agg (100% de proteína VLP agregada); 100% Intacto (100% VLPs nativas monodispersas); Mistura 50/50 (mistura 1:1 de VLPs agregadas e monodispersas); Naive (sem proteína de VLPs) . No dia 14 após imunização i.n., os murganhos foram eutanizados, os nódulos linfáticos cervicais e os baços foram colhidos e uma suspensão de células isoladas foi preparada para ensaios in vitro de proliferação celular específica de antigénio. Nestes ensaios, a resposta das células dos nódulos linfáticos cervicais foi avaliada para determinar as respostas imunogénicas contra o antigénio após imunização in vivo. As células dos nódulos linfáticos cervicais ou esplenócitos foram novamente estimuladas com VLPs monodispersas nativas (VLPs nativas, barras pretas) ou proteína de VLPs desnaturada pelo calor (AVLP, barras brancas) e o grau de proliferação celular de cada forma de antigénio (100% Agg, 100% Intacto, Mistura 50/50 ou naive) foi medido através da incorporação de timidina triciada como indicado no eixo das ordenadas (CPM) (Figura 1, células dos nódulos linfáticos cervicais; Figura 2, esplenócitos).
Exemplo 2. Ensaio in vitro de proliferação específica de antigénio
Para investigar mais a potência das formulações de vacina, murganhos foram imunizados intraperitonealmente (i.p.) com a formulação de vacina de suspensão líquida. Os murganhos receberam apenas uma única dose de vacina (sensibilização).
De forma semelhante ao Exemplo 1, grupos de murganhos (5 por grupo) foram vacinados, mas desta vez intraperitonealmente (i.p.) uma vez com formulações de pó seco reidratado mostrado na Tabela 2. Novamente, os animais vacinados com formulações contendo VLPs receberam a mesma quantidade de proteína total, 100% Agg (proteína de VLPs 100% agregadas); 100% Intacta (VLPs intactas 100% nativas); Mistura 50/50 (mistura 1:1 de VLPs intactas e agregadas); Naive (sem proteína de VLPs).
Tabela 2. As misturas mostradas abaixo foram preparadas para a Experiência 605.127, vacinação de murganhos com líquido i.p.
(continuação)
Sensibilização da exp 605.127 (murganho i.p.) Os valores indicam concentrações finais das formulações e são equivalentes a um único sistema de entrega de 10 mg.
Dose: 1 mL por murganho i.p.
Grupo 1, 100% Agg: VLPsl00% agregadas reidratadas
Grupo 2, 100% Intacto: placebo liofilizado reidratado, misturado com 100% VLPs 100% intactas do stock de VLP não liofilizadas
Grupo 3, mistura 50/50: reidratado de 50:50 de VLP intacta/agregada liofilizada.
Grupo 4, Naive: placebo liofilizado reidratado
Neste ensaio, foi medida a resposta de diferentes células murinas a VLPs após imunização in vivo. No dia 14 após imunização, os murganhos foram eutanasiados, os baços foram colhidos e preparada uma suspensão de células isoladas. Os esplenócitos foram novamente estimulados com VLPs nativas intactas (VLP nativa, barras a ponteado) ou proteína VLP desnaturada pelo calor) e o grau de proliferação celular de cada forma de antigénio (100% Agg, 100% Intacto, Mistura 50/50 ou naive) foi medido através da incorporação de timidina triciada como indicado no eixo das ordenadas (CPM) (Figura 3). Estes dados indicam que diferentes formas biofísicas das VLPs preparadas nas formulações de vacina induzem respostas comparáveis de células T.
Exemplo 3. Ensaio ELISPOT específico de VLPs
As respostas de células secretoras de anticorpos (ASC) específicas de VLPs foram medidas em murganhos imunizados intraperitonealmente com diferentes formulações de NV-VLPs descritas no Exemplo 2. Grupos de murganhos (5 por grupo) foram vacinados i.p., uma vez, com as formulações de pó seco reidratado mostradas na Tabela 2 (Exemplo 2). Os animais vacinados com formulações contendo VLP receberam a mesma quantidade de proteína total. 100% Agg (proteína de VLPs 100% agregadas) ; 100% Intacta (VLPs intactas 100% nativas); Mistura 50/50 (mistura 1:1 de VLPs intactas e agregadas); Naive (sem proteína de VLPs). No dia 14, os murganhos foram eutanasiados e colhidos os nódulos linfáticos cervicais. Os nódulos linfáticos cervicais foram cultivados durante a noite em placas de ELISPOT revestidas com VLPs intactas nativas e foram reveladas para ELISPOTs específicas de IgG ou IgA usando os anticorpos secundários conjugados com HRP adequados (Figura 4) . Estes dados mostra, que as três formulações de antigénio de VLPs induziram todas uma resposta de células B específica de antigénio. O grupo imunizado com VLPs 100% Agg apresentou a maior resposta imune.
Exemplo 4. ELISA específica de VLP
Os níveis de IgG sérica foram medidos em murganhos imunizados i.p. com diferentes formulações de NV-VLPs. Grupos de murganhos (5 por grupo) foram vacinados i.p. uma vez com as formulações de pó seco reidratado mostradas na Tabela 2 (Exemplo 2). Os animais vacinados com formulações contendo VLP receberam a mesma quantidade de proteína total. 100% Agg (proteína de VLPs 100% agregadas); 100% Intacta (VLPs intactas 100% nativas); Mistura 50/50 (mistura 1:1 de VLPs intactas e agregadas); Naive (sem proteína de VLPs) . No dia 14, colheu-se e testou-se soro por ELISA para IgG sérica específica anti-VLP (Figura 5) . Estes dados estão de acordo com os resultados mostrados no Exemplo 3, indicando que as três formulações de antigénio VLP induzem todas uma resposta de células B específica de antigénio. Novamente, o grupo imunizado com VLPs 100% Agg mostrou a maior resposta imune.
Exemplo 5. Formulações de vacinas em coelhos
As formulações foram administrada intranasalmente (i.n.) em coelhos usando o dispositivo Valois Monopowder Nasal Administration Device. As formulações de pó seco estão mostradas nas Tabelas 3 e 4.
Tabela 3. As formulações descritas abaixo foram preparadas para 605.129, vacinação de coelho, i.n., pó seco (DP).
Formulações de sensibilização para exp 605.129 (Coelho i.n.) (quantidades finais para vacinas DP).
Os valores indicam concentrações finais das formulações baseadas num único sistema de entrega (10 mg DP) que é 1 da dose total.
Dose: 20 mg DP por animal, 10 mg por narina.
Grupo 1, 100% Agg: VLPsl00% agregadas liofilizadas Grupo 2, 100% Intacto: VLPs 100% intactas liofilizadas
Grupo 3, mistura 50/50: d 50:50 de VLP intacta/agregada liofilizada (não uma mistura de 1 & 2)
Grupo 4, Naive: placebo
Tabela 4. As formulações descritas abaixo foram preparadas para 605.129, vacinação de coelho, i.n., pó seco (DP).
Formulações de reforço para exp 605.129 (Goelbo i.n.) (quantidades finais para vacinas DP).
valores indicam concentrações finais das formulações baseadas num único sistema de entrega (10 mg DP) que é 1 da dose total.
Dose: 20 mg DP por animal, 10 mg por narina.
Grupo 1, 100% Agg: VLPsl00% agregadas liofilizadas Grupo 2, 100% Intacto: VLPs 100% intactas ** VLP*
Grupo 3, mistura 50/50: 50:50 de VLP intacta/agregada liofilizada não uma mistura de 1 & 2) Group 4, Naive: placebo liofilizado *Formulado san manitol para aumentar a quantidade de VLPs intactas pós liofilização **A preparação originou apenas ~80%de VLPs intactas.
Exemplo 6. Ensaio de potência da formulação de vacina para norovírus em murganhos
Murganhos C57B16 fêmeas foram imunizados intraperitonealmente (i.p.) no dia 0 com diferentes diluições de uma vacina de pó seco de VLPs Norwalk reconstituídas (contendo VLPs Norwalk, MPL e quitosano). Cada um dos animais foi injectado com 100 yL das formulações indicadas. O soro foi colhido semanalmente e a
IgG anti-VLP do soro medida por ELISA. Os valores para o soro colhido 3 semanas após imunização estão mostrados na Figura 6.
Está representado o valor para cada murganho individual, com as barras indicando a média do grupo. Os valores de IgG anti-VLP no soro estão de acordo com a dose de vacina indicada. Este desenho experimental foi refinado e desenvolvido como um ensaio de potência necessário para a entrega de vacinas GMP produzidas para ensaios clinicos em seres humanos (Figura 6).
Exemplo 7. Potência de formulações de norovirus liquidas vs reconstituídas em murganhos
Murganhos C57B16 fêmeas foram imunizados i.p. no dia 0 com formulações que continham quitosano, manitol, MPL e várias concentrações de VLPs Norwalk (Tabela 5) num volume de 100 pL. Gerou-se uma curva padrão interna (grupos 1-5) através da solubilização de 10 mg/ml da matriz de pó seco (manitol, MPL e quitosano) em água pura e adicionando as quantidades especificadas de VLPs Norwalk líquidas. Pelo contrário, os lotes de VLPs GMP foram previamente liofilizados e depois solubilizados em 1,0 ml de água pura (grupos 6-8). O soro foi colhido dos murganhos nos dias 14, 21 e 30 e a IgG anti-VLPs Norwalk foi medida por ELISA.
Tabela 5. Formulações de Norwalk líquidas e reconstituídas usadas para imunizar murganhos (i.p.).
A potência relativa para cada formulação foi calculada usando a seguinte fórmula: Inv Log (Média-intercepção em Y/declive). A potência foi representada graficamente em função da concentração de VLPs nas formulações e descrita em relação à curva padrão gerada usando quantidades conhecidas de VLPs adicionadas à matriz de fundo (Figura 7) . Os resultados mostrados são representativos de 3 pontos separados de colheita de soro. Estes dados indicam que a formulação de VLPs Norwalk reconstituída a partir de pó seco possui uma potência global superior à das formulações líquidas.
Exemplo 8. Potência da formulação de pó seco em coelhos
Quarenta e três coelhos fêmeas New Zealand White foram imunizados intranasalmente (i.n.) usando o dispositivo Valois Monopowder Nasal Administration Device com 5 yg (Baixo, Low) ou 25 yg (Elevado, Hi) de VLPs Norwalk ± MPL e ± quitosano formulados em pós secos. Um grupo recebeu a dose Hi de VLPs e MPL formulado como liquido e administrado intramuscularmente (i.m.). Os coelhos foram vacinados nos dias 0 e 21. MPL, quando usado, foi usado na mesma dose das VLPs (i.e., 5 yg de VLPs
Norwalk e 5 yg de MPL) . Quitosano, quando usado, foi 7 mg/dose.
IgG sérica especifica de VLPs Norwalk (como determinado por ELISA) está mostrada na Figura 8. Os valores médios para cada grupo de tratamento estão apresentados para o dia 21 (painel esquerdo, colhido imediatamente antes da administração da imunização de reforço) e dia 42 (painel direito) . Os valores estão descritos em U/ml de IgG especifica de VLP, com 1 U aproximando-se de 1 yg. Os desvios padrão estão indicados por barras. Todos os grupos de tratamento tinham 6 animais, excepto o grupo controlo negativo (3 coelhos) e o grupo imunizado intramuscularmente (4 animais). Estes dados mostram que a dose de VLPs mais elevada resulta em níveis de IgG anti-VLPs mais elevados. 0 quitosano, em particular, estimula as respostas às vacinas intranasais. 0 grupo imunizado i.m. mostrou as maiores respostas. No entanto, os níveis de IgG específica de VLPs nos grupos imunizados intranasalmente foram também muito robustos.
Exemplo 9. Potência de formulações de norovírus líquidas vs secas dadas intranasalmente em coelhos
Coelhos fêmeas New Zealand White foram imunizados intranasalmente (i.n.) usando o dispositivo Valois
Monopowder Nasal Administration Device com 50 yg de VLPs Norwalk + 50 yg de MPL + 14 mgde quitosano formulados num pó seco ou num líquido. O conteúdo da vacina foi idêntico, excepto no que respeita ao estado físico. As imunizações foram nos dias 0 e 21 (semanas 0 e 3) , com soro colhido antes do reforço às 3 semanas e novamente às 6 semanas após a imunização inicial. A igG sérica específica de VLPs Norwalk foi medida por ELISA e os resultados estão mostrados na Figura 9.
As médias dos grupos estão indicadas, com as barras representando desvios padrões. O grupo de imunização com pó seco tinha 6 coelhos e o grupo de imunização com líquido tinha 10 coelhos. Estão representados oito coelhos controlos negativos. Observou-se pouca diferença entre os grupos de imunização com líquido e pó seco às 3 semanas; no entanto, às 6 semanas após a imunização inicial, os coelhos imunizados com a formulação de pó seco tiveram respostas de IgG anti-VLP superiores comparativamente com o grupo de imunização com líquido.
Exemplo 10- Estabilidade das formulações de norovírus como pó seco
Para investigar a estabilidade da formulação de VLPs como pó seco, o produto fármaco bruto foi preparado misturando (por 10 mg de produto fármaco) 25 yg de MPL, 700 yg de quitosano glutamato, 1,475 mg de manitol e 1,475 mg de sacarose. A solução foi liofilizada, misturada com mais 6,3 mg de quitosano glutamato (por 10 mg de produto fármaco), colocada nos dispositivos de unidose Bespak num valor nominal de 10 mg de pó seco e guardado em bolsas de folha seladas com cápsulas de exsicador. O teor total de VLPs foi medido usando SDS-PAGE corado com Imperial e sujeito a densitometria de varrimento, enquanto a cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) foi usada para quantificar o teor de VLPs. Estas medições indicaram que, dentro do erro experimental, não foi detectada alteração nos VLPs totais ou intactos ao longo do período de 12 meses (Figura 0). Assumindo que a recuperação de proteína de VLPs inferior por SEC, quando comparado com os resultados de SDS-PAGE, foi devida a agregação, a % de agregado calculada não aumentou ao longo do tempo mas manteve-se constante ou reduziu-se ao longo dos 12 meses de armazenamento. Um dos problemas mais comuns de estabilidade das proteínas é o aumento da agregação com o armazenamento. Baseado nos resultados na Figura 10, pode-se concluir que a formulação resulta numa percentagem estável de VLPs intactas permitindo que o produto seja produzido e usado ao longo de um período de pelo menos um ano.
Exemplo 11. Múltiplos antigénios de norovírus
Oito murganhos C57B1/6 (fêmeas, 9 semanas de idade) foram imunizados intraperitonealmente (IP) nos dias 0 e 14 com 2,5 yg de VLPs Norwalk formuladas com 0,7 mg de quitosano, 2,5 yg de MPL e 0,3 mg de manitol ajustado a 0,1 mL com água. Dois murganhos controlo foram imunizados com soro fisiológico. Nos dias 28 e 49, foram imunizados novamente IP com 2,5 yg de VLPs Norwalk + 2,5 yg de VLPs Houston formulados com 0,7 mg de quitosano, 2,5 yg MPL e 0,3 mg de manitol ajustado a 0,1 mL com água. Os murganhos controlo receberam novamente soro fisiológico. As amostras de soro foram colhidas semanalmente começando na semana 5 (dia 35) e analisadas por ELISA relativamente à reactividade com VLPs Norwalk ou VLPs Houston. O tempo do reforço das misturas de apenas Norwalk está indicado por setas finas e das misturas de VLPs Norwalk + Houston estão indicadas por setas largas. São mostradas as respostas de IgG séricas individuais especificas das VLPs Norwalk (painel superior) ou VLPs Houston (painel inferior) em U/mL (com 1 U aproximando-se de 1 yg de IgG) . As médias estão indicadas por barras. Note-se que as escalas nos eixos do Y são diferentes, uma vez que as respostas anti-Norwalk foram muito mais robustas devido a duas imunizações anteriores nos dias 0 e 14 (semanas 0 e 2). No entanto, as respostas contra VLPs Houston são muito robustas, com um grande aumento surgindo na segunda semana após o reforço. Estes dados demonstram que respostas imunes especificas podem ser geradas contra diferentes estirpes antigénicas de VLPs de norovirus na mesma mistura de imunização. (Figura 11) .
Exemplo 12. Resposta imune contra diferentes antigénios de norovírus
Murganhos fêmeas C57B16 foram imunizados intraperitonealmente (IP) nos dias 0 e 14 com 25 yg de VLPs Norwalk, 25 yg de VLPs Houston ou uma combinação de 25 yg de cada uma das VLPs Norwalk e Houston. Colheu-se soro semanalmente e a IgG sérica anti-VLP foi medida por ELISA. Os valores para o soro colhido 4 semanas após imunização estão mostrados na Figura 12. 0 teor de VLPs das imunizações está indicado no eixo dos X. Está representado o valor de cada murganho individual, com as barras indicando a média do grupo. Os níveis de anticorpos estão representados em U/ml, com 1 U aproximando-se de 1 yg de IgG) . Os valores no painel esquerdo foram determinados usando VLPs Norwalk como agente de captura, enquanto as VLPs Houston foram usadas para revestir placas de ELISA para medir os valores no painel direito. Estes dados mostram que a imunização com VLPs Norwalk não conduzem a anticorpos séricos que sejam capazes de reconhecer VLPs Houston ou vice versa.
Exemplo 13. Misturas de sacarose e guitosano preservam a estrutura das VLPs de norovírus em formulações de pó seco
As experiências que se seguem examinaram os efeitos de sacarose, quitosano e manitol, sozinhos ou em combinação, em soluções pré-liofilizadas, na estrutura quaternária de VLPs Norwalk nativas durante a liofilização. A Tabela 6 é uma conjunto de várias experiências mostrando as concentrações da solução pré-liofilização dos constituintes de interesse, o volume total da mistura e as correspondentes razões de massa. Todas as soluções foram agitadas manualmente e suavemente sujeitas a vortex até à homogeneidade, depois congeladas em azoto liquido e liofilizadas no exterior da unidade usando vasos em braços laterais durante tempos que variaram entre cerca de 30 e 60 horas.
Tabela 6. Misturas de solução pré-liofilização usadas para testar os efeitos de diferentes concentrações e combinações de sacarose, quitosano glutamato (quitosano) e manitol na estrutura quaternária de VLPs Norwalk.
(continuação)
A Tabela 7 mostra os resultados da análise por cromatografia liquida de alta resolução e exclusão por tamanho (SE-HPLC) das amostras liofilizadas mostradas na Tabela 6. As amostras liofilizadas foram reconstituídas com água e analisadas por SE-HPLC. NV-VLPs não processadas, analisadas em simultâneo, foram usadas como padrão de referência para quantificar o teor em NV-VLP das amostras a testar reconstituídas. Usaram-se os detectores de UV e de fluorescência para a quantificação (os dados mostrados são do detector de fluorescência). A SE-HPLC foi realizada usando uma coluna de Superose™ 6 10-300, com a fase móvel consistindo em fosfato de sódio 10 mM, ácido cítrico 10 mM, pH 5 e NaCl 500 mM, num fluxo de 0,5 ml/min. As concentrações de proteína foram quantificadas usando áreas integradas de picos de eluição. "VLP" é o pico que eluiu a cerca de 15 min da coluna e qualquer patamar precedente e/ou cauda de pico dentro da janela temporal de eluição aproximada do padrão de referência NV-VLP analisado em simultâneo. O fragmento de VLP que eluiu da coluna a aproximadamente 32 min é uma espécie única altamente estável que resulta da destabilização e consequente desmontagem da VLP. Não foram observados fragmentos intermédios e mais pequenos.
Os resultados mostram que combinações de sacarose e quitosano produziram uma larga gama de recuperações de NV-VLPs monodispersas nativas incluindo a mais elevada (aproximadamente 100% de recuperação) pós-liofilização (amostras LG10-LG12). Ainda, as formas do pico de eluição de NV-VLP destas amostras foram idênticas ao padrão de referência de NV-VLPs não processadas indicando elevada preservação da estrutura nativa. Amostras contendo apenas sacarose apresentaram formas de picos semelhantes ao padrão de referência, apesar das recuperações de NV-VLP serem mais baixas (aproximadamente 60% de recuperação (amostra LG13). Amostras que continham apenas manitol resultaram em VLPs quase totalmente agregadas (amostras LE1-LE6 e LlGld-S3). Os efeitos deletérios do manitol na estrutura de NV-VLPs foram contrariados pela presença de quitosano e sacarose (amostras LlGld-S2 e LlGld-SB).
Tabela 7.Identificação de experiência e amostra, e resultados dos testes do efeito da sacarose, quitosano, e manitol ou suas combinações na estabilidade da estrutura de NV-VLP durante a congelação e liofilização.
Exemplo 14. Indução de plasmócitos de vida longa e células B de memória específicos de norovírus em murganhos imunizados intranasalmente A. Plasmócitos de vida longa específicos de VLPs
Norwalk
Murganhos BALB/c foram imunizados intranasalmente com VLPs de norovírus e um adjuvante. Controlos naive receberam apenas adjuvante. Aos 114 dias após imunização, baço, nódulos linfáticos cervicais e medula óssea foram colhidos de ambos os grupos de murganhos. No dia da colheita de tecidos (dia 0), as células foram testadas usando um ensaio ELISPOT relativamente à presença de células secretoras de anticorpos (ASCs) específicas de antigénio. Os resultados estão apresentados na Figura 13A-C para os diferentes tecidos. A detecção de imunoglobulinas (IgG, IgA e IgM) nestes tecidos indica a presença de plasmócitos de vida longa específicos de norovírus. B. Células B de memória específicas de VLPs
Norwalk
Desenvolveu-se um ensaio in vitro para detectar a presença de células B de memória específicas de VLPs
Norwalk em murganhos imunizados intranasalmente com VLPs Norwalk. Vários tecidos linfóides ou sangue total (células mononucleadas de sangue periférico, esplenócitos, células dos nódulos linfáticos, etc.) podem servir como fonte de células que podem ser testadas relativamente à presença de células B de memória usando este ensaio.
Nesta experiência, o baço foi colhido e processado a partir de animais imunizados e naive (controlos) e os esplenócitos foram cultivados durante quatro dias na presença ou ausência (controlos) de VLPs Norwalk (20 yg/ml). Realizou-se um ensaio ELISPOT específico de VLPs no dia da colheita de tecidos (dia 0) para estabelecer os níveis de fundo de ASCs (secção A acima). Após quatro dias em cultura, as células foram colhidas e testadas novamente num ensaio ELSPOT para quantificar o número de ASCs específicas de VLPs. A diferença nos números de ASCs específicas de VLP entre os ensaios do dia 0 e do dia 4 representa a população de células B de memória específica de antigénio. Os resultados desta experiência estão apresentados na Figura 14A e B.
Exemplo 15. Respostas de células B de memória a norovírus em coelhos
Dois coelhos fêmeas New Zealand White foram imunizados intranasalmente com uma formulação de pó seco consistindo em 25 yg Norwalk VLP, 25 yg MPL, 1,5 mg manitol, 1,5 mg sacarose e 7,0 mg quitosano por 10 mg de pó seco carregado em sistemas de entrega intranasal Valois Mark 4. Os dois coelhos receberam um total de três imunizações com intervalos de 14 dias. Para estas experiências, um coelho fêmea não imunizável foi usado como controlo naive. A. Colheita e processamento de tecidos de coelho Células mononucleadas de sangue periférico
(PBMCs) : Sangue total (~50 ml) foi obtido a partir de coelhos em tubos de colheita contendo EDTA para prevenir a coagulação. O sangue total foi diluído a 1:3 com D-PBS estéril e ~35 ml de sangue total diluído foi colocado sobre 15 ml de Meio de Separação Lympholyte num tubo de centrífuga estéril de 50 ml. Os tubos foram centrifugados a 800xg durante 20 minutos, à temperatura ambiente. A camada leucoplaquetária contendo os PBMCs foi cuidadosamente removida usando uma pipeta estéril de 5 ml e as células foram lavadas duas vezes com D-PBS. Se necessário, os eritrócitos contaminantes doiram removidos por lise ACK. As células foram ressuspensas em RPMI-1640-10% FBS (1640-C)e contadas num hemacitómetro usando um método de exclusão de azul Tripano. Células dos nódulos linfáticos mesentéricos: Os nódulos linfáticos foram colhidos assepticamente de cada um dos coelhos separadamente após eutanásia. Os tecidos foram mantidos numa caixa de Petri de plástico estéril contendo ~10 mL de RPMI-1640-sem soro (1640-NS) . Os nódulos linfáticos foram pressionados através de uma gaze estéril usando um pistão estéril para dispersar o tecido e obter uma suspensão de células isoladas das células dos nódulos linfáticos. As células foram colhidas, lavadas duas vezes com 1640-NS e contadas num hemacitómetro usando um método de exclusão de azul Tripano.
Esplenócitos: os baços foram obtidos assepticamente a partir de cada um dos coelhos após eutanásia. Os baços foram colocados em placas de Petri estéreis contendo aproximadamente 10 ml de 1640-NS. Usando uma agulha estéril de 22 gauge e seringa, o meio foi repetidamente injectado no tecido para fazer a disrupção da cápsula do baço e separar as células. Usou-se então pinças estéreis para desfazer os restantes fragmentos de tecido. Os conteúdos das placas de Petri foram transferidos para um tubo de centrífuga estéril e a suspensão celular e o tecido esplénico disperso foram deixados em repouso durante 6-8 minutos para permitir a sedimentação dos fragmentos maiores de tecido. A suspensão de células isoladas foi transferida para um segundo tubo de centrífuga estéril e as células foram lavadas uma vez com 1640-NS. Os eritrócitos na preparação de esplenócitos foram removidos por lise ACK (8 ml de tampão ACK, 8 minutos, temperatura ambiente) e as células foram lavadas mais uma vez com 1640-NS e finalmente filtradas através de um filtro estéril de 70 ym para remover os aglomerados e detritos. O sedimento de células final foi ressuspenso em 1640-Completo e contadas num hemacitómetro usando um método de exclusão com azul Tripano. Células de medula óssea: Os ossos da tíbia nos membros traseiros foram removidos de coelhos individuais após eutanásia. Para remover as células da medula óssea, os extremos dos ossos foram cortados assepticamente usando uma serra de osso e os conteúdos do osso foram pressionados a sair através de injecções repetidas de meio 1640-NS. As células da medula óssea foram pipetadas para cima e para baixo repetidamente para partir e dispersar os aglomerados. As células foram lavadas uma vez com 1640-NS; os eritrócitos foram lisados com ACK e as células foram lavadas mais uma vez com 1640-NS. Finalmente, as células foram filtradas através de um filtro estéril de 70 ym para remover os aglomerados e detritos. O sedimento de células final foi ressuspenso em 1640-Completo e contado num hemacitómetro usando um método de exclusão de azul Tripano.
B. Ensaios ELISPOT
Após pré-molhagem e lavagem, placas de 96 alvéolos com filtros de PVDF Millipore foram revestidos com uma solução estéril de VLPs Norwalk nativas numa concentração de 40 yg/ml num volume final de 50 yl/alvéolo. As placas foram incubadas durante a noite a 4°C, lavadas com D-PBS e bloqueadas com a adição de 1640-C. As células dos nódulos linfáticos mesentéricos, esplenócitos e células da medula óssea dos coelhos imunizados e de coelho controlo naive foram adicionadas aos alvéolos em diferentes concentrações (lxlO6, 5xl05, 2xl05 e lxlO5 células/alvéolo) e as placas foram incubadas durante a noite a 37°C. As placas foram bem lavadas com PBS-Tween e reagentes de anticorpos secundários específicos para IgG e IgA de coelho foram adicionados aos alvéolos e incubados durante mais 2 horas à temperatura ambiente. Após extensa lavagem, as placas foram reveladas com o cromogénio/substrato DAB e lidas num leitor de placas ELISPOT. As manchas que surgiram nos alvéolos de animais naive controlo foram subtraídas dos grupos experimentais. Os dados são expressos como células secretoras de anticorpos (ASCs) específicas de VLPs Norwalk e estão normalizados por lxlO6 células. C. Ensaio das células B de memória especificas de VLPs Norwalk Células linfóides isoladas a partir dos vários tecidos descritos acima foram ressuspensas em meio 1640-C na presença de VLPs Norwalk (10 yg/mL) a uma densidade de 5xl06 células por mL. As células foram incubadas em placas de 24 alvéolos em volumes de 1 ml durante quatro dias a 37°C. Os ensaios ELISPOT específicos de VLPs foram realizados nestas células na altura da cultura. Após quatro dias em cultura, as células foram colhidas, lavadas duas vezes com meio 1640-NS, ressuspensas em 1640-Completo e contadas num hemacitómetro usando um método de exclusão de azul Tripano. As células foram testadas mais uma vez num ensaio ELISPOT especifico de VLPs Norwalk. Os dados obtidos a partir dos ensaios ELISPOT realizados no dia da colheita de tecidos são referidos como a actividade ASC dia 0 (fundo). Quaisquer manchas detectadas no dia 0 são assumidas como sendo plasmócitos a secretarem activamente ou plasmócitos de vida longa (LLPCs). Os dados obtidos a partir do ensaio ELISPOT realizado nas células em cultura no dia 4 são referidos como actividade ASC dia 4 e a actividade de células B de memória é representada pela diferença entre a actividade ASC dia 4 e a actividade ASC dia 0. D. As células B de memória especificas de VLPs Norwalk estão presentes no sangue periférico de coelhos imunizados intranasalmente
Sangue total foi obtido a partir de dois coelhos imunizados (RB735, RB1411) 141 dias após a última de três imunizações intranasais com uma formulação de vacina de pó seco contendo VLPs Norwalk como atrás descrito. 0 sangue foi igualmente obtido a partir de um coelho naive não imunizado. 0 sangue foi processado para se obter células mononucleadas de sangue periférico (PBMCs) e os PBMCs foram colocados num ensaio de células B de memória especifico de VLPs Norwalk (secção C acima) . Os resultados estão mostrados na Figura 15. 0 painel esquerdo mostra os resultados do ensaio ELISPOT inicial na altura da colheita de tecidos (ASCs dia 0). O painel direito mostra os resultados do ensaio ELISPOT após 4 dias em cultura com VLPs Norwalk (ASCs dia 4).
Os resultados de ELISPOT dia 0 (Fig. 15, painel esquerdo) ilustram que não existem plasmócitos específicos de VLPs no sangue periférico aproximadamente 140 dias após o último reforço com vacina de VLPs Norwalk pó seco. O painel da direita da Figura 15 mostra os resultados do ensaio ELISPOT de PBMCs cultivados durante quatro dias in vitro com VLPs Norwalk. Nos dois coelhos imunizados, um número significativo de PBMCs, presumivelmente uma subpopulação de células B de memória, maturou para dar origem a plasmócitos específicos de VLPs Norwalk secretoras de IgG. Apesar dos ensaios para células B de memória secretoras de IgA serem realizados, apenas células B de memória secretoras de IgG foram detectadas na população de PBMCs. Como esperado, o animal naive não mostrou células B de memória específicas de antigénio. Assim, as células B de memória especificas de VLPs foram encontradas na circulação periférica de coelhos 140+ dias após a última das três imunizações intranasais. E. As células B de memória especificas de VLPs Norwalk estão presentes no baço de coelhos imunizados intranasalmente
Obtiveram-se esplenócitos a partir dos baços dos dois coelhos imunizados com vacina e do coelho controlo não imunizado. Realizaram-se os ensaios de células B de memória especificas de VLPs (acima descritos) nestas células e os resultados estão mostrados na Figura 16. Conforme observado para a população de PBMCs, o ensaio ELISPOT dia 0 mostra que não existem plasmócitos específicos de antigénio presentes no baço (Fig. 16, painel esquerdo). No entanto, após quatro dias de incubação in vitro com VLPs Norwalk, as células B de memória secretoras de IgGs específicas de VLPs são aparentes na população de esplenócitos. Assim, o baço representa um local para a migração das células B de memória após imunização intranasal. F. Uma população de plasmócitos de vida longa específicos de VLPs Norwalk é encontrada na medula óssea mas sem estarem presentes células B de memória Células da medula óssea foram obtidas a partir das tíbias dos coelhos experimentais e testadas relativamente à presença de plasmócitos de vida longa e células B de memória. Os resultados estão apresentados na Figura 17. 0 painel esquerdo da Figura 17 mostra que o coelho 1411 ainda tinha uma população significativa de plasmócitos específicos de antigénio na medula óssea. Os plasmócitos que migram para a medula óssea e aí residem durante um período de tempo significativo após a imunização são referidos como plasmócitos de vida longa (LLPCs). 0 coelho 735 não apresentou um elevado número de LLPCs. Não foram encontradas LLPCs na medula óssea do coelho naive. As células da medula óssea foram cultivadas num ensaio de células B de memória e novamente testadas relativamente à presença de células B de memória. 0 painel direito da Figura 17 mostra que essencialmente não existem células B de memória específicas de antigénio na medula óssea. Assim, os plasmócitos de vida longa migram para a medula óssea mas não se encontram aí células B de memória. G. Células B de memória específicas de VLPs Norwalk secretoras de IgG e secretoras de IgA estão presentes nos nódulos linfáticos mesentéricos de coelhos imunizados intranasalmente
Os nódulos linfáticos mesentéricos foram obtidos a partir de todos os coelhos experimentais e as células isoladas foram testadas relativamente a LLPCs e células B de memória. Os resultados deste ensaio estão mostrados na Figura 18AA. Tal como para a maioria do tecido linfóide analisado, exceptuando a medula óssea, não foram encontradas LLPCs (Fig. 18A painéis esquerdos) nos nódulos mesentéricos. Após incubação in vitro com VLPs Norwalk, um número muito elevado de células B de memória especificas de VLPs secretoras de IgG foram evidentes noa população de nódulos linfáticos mesentéricos (Fig. 18A, painel direito). Os números de células B de memória observados nos nódulos mesentéricos foram significativamente superiores aos observados para os outros tecidos linfóides testados.
Numerosos investigadores demonstraram que a imunização num local indutor das mucosas, como sejam as passagens nasais ou o intestino, é capaz de induzir a chamada resposta imune das mucosas. Esta resposta tem sido geralmente caracterizada pela presença de células B IgA+ e plasmócitos secretores de IgA localizados no tecido linfóide das mucosas. Por este motivo as células dos nódulos mesentéricos foram igualmente testadas relativamente à presença de LLPCs secretoras de IgA ou células B de memória. Os resultados destes ensaios estão mostrados na Figura 18B. Novamente, não foram encontradas LLPCs IgA+ na população de nódulos linfáticos mesentéricos (Figura 18B, painel esquerdo). No entanto, foram detectadas células B de memória secretoras de IgA neste tecido (Figura 18B, painel direito). Assim, a imunização intranasal com uma formulação de vacina VLP Norwalk pó seco induziu uma resposta imune das mucosas que resultou na migração de células B de memória especificas de antigénio IgG+ e IgA+ para o tecido linfóide associado ao intestino. A produção de células B de memória especificas de antigénio induzida por imunização com a formulação de vacina Norwalk é um indicador possível da eficácia da vacina. A presença de células B de memória é um marcador de imunidade de longa duração. H. Células T de memória CD4+ específicas de VLPs
Esplenócitos colhidos a partir de coelhos imunizados foram novamente estimulados com VLPs Norwalk intactas e o grau de proliferação celular foi medido através da incorporação de timidina triciada como indicado no eixo das ordenadas (CPM) (Figura 19). 0 painel esquerdo mostra a proliferação celular de uma população não fraccionada de esplenócitos, enquanto o painel direito mostra a proliferação celular de células T CD4+. A presente invenção não está limitada no seu âmbito pelas realizações específicas descritas que se destinam a ser ilustrações simples de aspectos individuais da invenção e métodos e componentes funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito da invenção. De facto, várias modificações da invenção, para além das mostradas e descritas, serão aparentes para os familiarizados com a área a partir da descrição anterior e dos desenhos juntos usando não mais que experimentação de rotina. Tais modificações e equivalentes destinam-se a cair dentro do âmbito das reivindicações apensas. A citação ou discussão de uma referência não deve ser aqui pensada como uma admissão que tal é um antecedente da presente invenção.
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Lisboa, 24 de janeiro de 2017
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES1. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de duas ou mais partículas do tipo vírus (VLPs) de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus para utilização num método de geração de uma resposta imune de modo que a composição de VLPs combinada é capaz de induzir imunidade contra a infecção por cada um dos genótipos de norovírus representados na formulação, em que a resposta imune contra uma determinada VLP na combinação é de pelo menos 50% da resposta imune da mesma VLP quando medida individualmente.
- 2. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes de norovírus ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs multivalentes de norovírus de acordo com a reivindicação 1 para usar de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma das referidas estirpes de norovírus é diferente das estirpes das referidas VLPs.
- 3. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas duas ou mais estirpes de norovírus são de genótipos diferentes.
- 4. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma das referidas estirpes de norovírus é diferente dos genótipos das referidas VLPs.
- 5. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas duas ou mais estirpes de norovírus são de genogrupos diferentes.
- 6. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma das referidas estirpes de norovírus é diferente dos genogrupos das referidas VLPs.
- 7. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 5 para utilização de acordo com a reivindicação 5, em que os referidos genogrupos são seleccionados do grupo consistindo em GI, GII, GUI e GIV.
- 8. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas VLPs de norovirus monovalentes deriva, de sequências virais do genogrupo I ou do genogrupo II ou de uma sequência de consenso virai derivada de duas ou mais estirpes de norovírus.
- 9. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 5 para utilização de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas VLPs de norovírus monovalentes derivam dos genótipos 1.1 e II. 4
- 10. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a formulação antigénica é administrada nas mucosas ou parentericamente.
- 11. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovírus multivalentes de acordo com a reivindicação 10 para utili zação de acordo com a reivindicação 10, em que a administração nas mucosas é conseguida intranasalmente.
- 12. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovirus multivalentes de acordo com a reivindicação 10 para utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a administração parentérica é realizada por via intramuscular.
- 13. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovirus multivalentes de acordo com a reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a formulação antigénica inclui um ou mais adjuvantes seleccionados do grupo consistindo em agonistas de receptores do tipo "toll" e sais de alumínio.
- 14. Uma formulação antigénica compreendendo uma combinação de pelo menos duas VLPs monovalentes ou uma formulação antigénica compreendendo VLPs de norovirus multivalentes de acordo com a reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a formulação antigénica ainda compreende um agente de entrega.
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