PT2384190T - Formulações de células viáveis para distribuição oral - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

FORMULAÇÕES DE CÉLULAS VIÁVEIS PARA DISTRIBUIÇÃO ORAL

Esta invenção relaciona-se com formulações para a distribuição oral de células viáveis de vacina de bactérias. A distribuição oral de bactérias vivas é atualmente utilizada em dois tipos principais de aplicação terapêutica. Em primeiro lugar, as estirpes de bactérias entéricas não modificadas identificadas a partir de isolados de intestino são de interesse terapêutico na nova colonização do intestino após tratamento antibiótico [1], no alívio sintomático para doentes de doença intestinal inflamatória [2], e igualmente nas formas geneticamente manipuladas para distribuição de terapias biológicas (p. ex. IL-10 [3]). Em segundo lugar, as bactérias vivas são vacinas candidatas atrativas. Atualmente, estão em curso diversos ensaios clínicos humanos que testam várias estirpes de bactérias vivas atenuadas para a proteção contra doenças, tais como Cólera, E. coli enterotóxica e Febre tifoide ([4]). As vacinas de bactérias vivas têm a vantagem relativamente às vacinas convencionais de serem administradas oralmente, evitando injeções e agulhas. As vacinas de bactérias vivas geneticamente manipuladas podem igualmente transportar ADN heterólogo ou antigénios de agentes patogénicos ou tumores para estimular ou preparar respostas imunitárias contra células patogénicas ou tumorais.

As bactérias para distribuição viva são geralmente secas por razões de estabilidade. A alternativa à formulação seca para distribuição de bactérias vivas é um formato "húmido", p. ex. um produto alimentar, tal como iogurte. As bactérias vivas têm problemas de estabilidade significativos nas formas liquidas, mesmo se refrigeradas.

Diversos sistemas de microencapsulamento foram propostos para a distribuição oral de bactérias [5], mas todos sofrem da mesma questão de degradação das bactérias durante o armazenamento, e de um requisito para a refrigeração dispendiosa para reduzir a degradação. Várias técnicas para a produção de bactérias secas são conhecidas na técnica. Mais geralmente, é utilizada a secagem por congelamento convencional. Além disso, existiu um foco recente na utilização de dissacáridos, tais como trealose e sacarose, que estabilizam biomoléculas e tornam as bactérias secas mais estáveis à temperatura ambiente [6], [7]. As bactérias secas estabilizadas por dissacáridos, por exemplo, podem ser convenientemente armazenadas à temperatura ambiente.

Atualmente, as bactérias vivas secas são administradas oralmente em dois formatos comuns: cápsulas entéricas de bactérias secas por congelamento e saquetas de bactérias secas por congelamento para serem ressuspensas num tampão de bicarbonato. Muitas vezes, são fornecidas doses muito elevadas de bactérias e são necessárias múltiplas doses para fornecer apenas efeitos modestos. Curiosamente, os dados clínicos indicam que a formulação de cápsulas entéricas é significativamente menos eficaz do que o sistema de tampão de bicarbonato [8][15], embora se conheça pouco sobre o motivo por que as cápsulas entéricas são relativamente ineficazes.

Sabe-se pouco sobre o mecanismo de ação do sistema de tampão de bicarbonato. A quantidade de tampão de bicarbonato ingerida provavelmente não absorve o ácido segregado para dentro do estômago, e por isso parece provável que as bactérias administradas desta forma encontrem alguma acidez. Apesar destas potenciais limitações, a coadministração com tampão de bicarbonato ou tampão neutralizante de ácido semelhante é atualmente o modo padrão de distribuição em ensaios clínicos humanos em curso de estirpes de vacina para doenças, tais como Cólera [9] e E. coli enterotóxica [10]. O estômago tem a capacidade de segregar ácido clorídrico e reduzir os conteúdos abaixo de pH 1. Poucas bactérias podem sobreviver a este pH [11] e as bactérias vivas secas mostraram ser ainda mais sensíveis do que as bactérias de culturas novas [12] . Um revestimento "entérico" pode ser utilizado para evitar a morte das formulações de bactérias vivas no ácido gástrico. Um revestimento entérico é uma camada de polímero que não irá dissolver-se em condições ácidas, mas irá dissolver-se no intestino após o esvaziamento do estômago, libertando as bactérias secas no intestino delgado superior. Conforme notado acima, as cápsulas entéricas existentes de uma vacina de bactérias vivas são relativamente ineficazes, apesar da respetiva capacidade para proteger bactérias contra o ácido do estômago [8]. 0 intestino contém uma mistura complexa de enzimas e outros agentes microbicidas. A bilis é segregada para dentro do duodeno a partir da vesícula biliar. A bílis geralmente compreende pelo menos 50 % de ácidos biliares, gue funcionam como detergentes para dissolver e digerir componentes de alimentos gordurosos. Os ácidos biliares são igualmente potentes na morte de bactérias. As estirpes de bactérias que habitualmente residem em locais intestinais, tal como Salmonella spp, desenvolveram mecanismos de resistência a detergentes, tais como sais biliares, permitindo a sobrevivência e o crescimento das mesmas no intestino.

Geralmente, as bactérias perdem a respetiva resistência aos ácidos biliares após a secagem ou o congelamento. As bactérias secas que são libertadas para dentro do intestino a partir de uma formulação entérica são sensíveis a ácidos biliares e não sobrevivem no ambiente intestinal [12]. A utilização de formulações compreendendo um primeiro imunogénio e um ou mais segundos imunogénios para distribuir o primeiro imunogénio a localizações específicas dentro do trato gastrointestinal foi relatada [18] . A presente invenção relaciona-se com a descoberta de que a incorporação de pequenas quantidades de um agente aglutinante de bílis em formulações de células viáveis secas aumenta significativamente a sobrevivência das células no trato intestinal. De acordo com a invenção, o agente aglutinante de bílis corresponde a colestiramina e as células viáveis secas correspondem a células de vacina de bactérias viáveis secas. Isto aplica-se ao resto da memória descritiva sempre que for feita referência à invenção. Estas formulações podem, por conseguinte, ser úteis para a distribuição oral de células de vacina de bactérias vivas ao intestino. Um primeiro aspeto da invenção fornece uma formulação sólida compreendendo células de vacina de bactérias viáveis secas e um agente aglutinante de bílis que corresponde a colestiramina para a utilização num método de imunoterapia, conforme apresentado na reivindicação 1. Um segundo aspeto da invenção fornece um método de produção da formulação sólida para a utilização de acordo com a reivindicação 1, o referido método compreendendo as etapas de acordo com a reivindicação 12. 0 agente aglutinante de bílis permite que líquidos aquosos penetrem na formulação, mas absorve os ácidos biliares e atrasa a respetiva penetração na formulação. Isto protege as células viáveis secas contra a toxicidade do ácido biliar até as mesmas serem reidratadas pelo líquido aquoso de penetração e recuperarem a respetiva tolerância à bílis. Isto pode, por exemplo, aumentar a eficácia de distribuição das células ao intestino. As células viáveis secas podem ser células microbianas. As bactérias entéricas são bem conhecidas na técnica e incluem espécies patogénicas e não patogénicas, por exemplo, Enterobacteriaceae, tais como Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus spp e igualmente Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Pseudomonas, Ruminococcusr Lactobacillus, Lactococcus, Campylobacter e Streptococcus spp. A distribuição de células de bactérias entéricas ao intestino pode ser útil, por exemplo, na restauração da flora intestinal de um paciente, p. ex. após tratamento antibiótico, e no alivio sintomático de pacientes com doença intestinal inflamatória. As células microbianas viáveis secas podem ser células eucarióticas, por exemplo células de levedura ou fúngicas, tais como Saccharomyces, Aspergillus spp ou Candida spp. A distribuição de células microbianas com propriedades enzimáticas especificas ou outras ao intestino pode ser útil, por exemplo, na decomposição ou no metabolismo de compostos associados à doença ou toxinas, tal como oxalato, o que é um fator de risco para a formação de pedras nos rins, ou na redução dos níveis de colesterol, influenciando a absorção intestinal. As células microbianas podem expressar um fator terapêutico, tal como uma proteína recombinante. Os polipéptidos recombinantes adequados podem ser exógenos relativamente à célula de bactérias (isto é, um polipéptido não naturalmente expressado pela célula de bactérias, tal como um polipéptido humano), e podem ter um efeito terapêutico no paciente. Os polipéptidos recombinantes adequados incluem citocinas, incluindo interleucinas, tal como IL-10; quimiocinas; e anticorpos, fragmentos de anticorpo ou moléculas de união relacionadas que se unem a mediadores da resposta imunitária, tais como citocinas (p. ex. para neutralizar TNF-alfa nas doenças inflamatórias intestinais).

As células microbianas adequadas para a expressão de polipéptidos recombinantes incluem células de espécies de bactérias de ácido lático, p. ex. Lactococci, tal como L. lactis (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics (2005) 60:349), Enterobacteriaceae e outras bactérias entéricas conforme descrito acima, e outras células microbianas, tais como leveduras e fungos, por exemplo Saccharomyces ou Candida spp.

Na invenção, as células viáveis secas são células de uma vacina de bactérias vivas. As vacinas de bactérias vivas são geralmente células de bactérias cuja virulência foi atenuada, por exemplo pela inativação de um ou mais genes de virulência. Muitos exemplos de células de bactérias atenuadas adequadas para a utilização como vacinas são conhecidas na técnica.

Uma vacina de bactérias pode ser uma célula atenuada de um agente patogénico bacteriano. A expressão de antigénios endógenos nativos do agente patogénico pela vacina atenuada pode estimular ou preparar uma resposta imunitária protetora contra estirpes de não vacina virulenta do agente patogénico. As vacinas de bactérias adequadas incluem células atenuadas de células de Vibrio cholerae, estirpes enterotóxicas de E. coli, tais como 0157:H7, 0121 e 0104:H21, espécie Shigella, tal como S. dysenteriae, S. sonnei, S. boydii e S. flexneri, espécie Campylobacter, tal como C. jejuni, e espécie Salmonella, tal como Salmonella enterica (especialmente, serovar Typhi).

As vacinas de bactérias vivas para a utilização no tratamento terapêutico ou profilático da tifoide são bem conhecidas na técnica e incluem estirpes de Salmonella typhi Ty2la (Vivotif ™) , Ty800, CVD908, CVD908-htr, CVD915 e ZH9.

As vacinas de bactérias vivas para a utilização no tratamento terapêutico ou profilático de cólera são igualmente bem conhecidas na técnica e incluem JBK-70, CVD 101, CVD 102, CVD 104, CVD 105,395N1, JJM43, TCP2, CVD 103, CVD 103-RM, CVD 103-HgR (Mutachol®), CVD110,

Bahrain-3, Peru-3, Peru-5 e Peru-15.

As vacinas de bactérias vivas para a utilização no tratamento terapêutico ou profilático de shigelose e disenteria bacteriana são igualmente bem conhecidas na técnica e incluem estirpes de vacina atenuadas de Shigella atenuada, tais como CVD 1204 e WRSS1.

As vacinas de bactérias vivas para a utilização no tratamento terapêutico ou profilático de diarreia são igualmente bem conhecidas na técnica e incluem células de E. coli enterotóxica atenuadas, tais como PTL002 e PTL003.

As vacinas de bactérias vivas para a utilização no tratamento terapêutico ou profilático de listeriose são igualmente bem conhecidas na técnica e incluem estirpes atenuadas de Listeria monocytogenes, tal como Lmdd.

Uma vacina de bactérias pode compreender ácido nucleico heterólogo que codifica um antigénio exógeno, isto é, um antigénio não naturalmente expressado pela célula de vacina (por exemplo, um antigénio humano ou virai ou um antigénio de diferentes espécies de bactérias). A vacina de bactérias pode estimular ou preparar uma resposta imunitária protetora contra o antigénio exógeno, por exemplo quando o antigénio é apresentado na superfície de um agente patogénico ou uma célula doente, tal como célula cancerígena ou uma célula infetada de modo virai. 0 termo "heterólogo" indica gue uma seguência de ácidos nucleicos é uma sequência recombinante que foi introduzida numa construção, num vetor ou numa célula utilizando artificialmente manipulação genética ou meios recombinantes, isto é, mediante intervenção humana. As sequências de nucleótidos que são heterólogas não ocorrem juntas na natureza. As sequências de nucleótidos ou aminoácidos que são heterólogas relativamente a uma célula ocorrem não naturalmente nas células desse tipo, dessa variedade ou espécie (isto é, exógenas ou estranhas). Uma sequência de ácidos nucleicos que é heteróloga relativamente a uma célula pode codificar uma sequência de aminoácidos heteróloga, isto é, uma sequência de aminoácidos que é exógena ou estranha relativamente à célula.

Em algumas formas de realização, o ácido nucleico heterólogo pode ser expressado pela célula microbiana para produzir o antigénio exógeno. 0 antigénio exógeno pode ser segregado a partir da célula microbiana apresentada na superfície da célula microbiana ou permanecer intracelular dentro da célula microbiana.

Noutras formas de realização, o ácido nucleico heterólogo pode não ser expressado pela célula microbiana. Por exemplo, o ácido nucleico heterólogo pode ser transferido para uma célula hospedeira do indivíduo após a distribuição ao intestino e expressado na célula hospedeira. 0 ácido nucleico heterólogo pode ser expressado para produzir o antigénio exógeno, por exemplo num método de vacinação de ADN ou transferência de ADN, ou pode ser expressado para produzir uma molécula de ARN codificante ou não codificante, por exemplo num método de interferência de ARN.

Os antigénios exógenos adequados que podem ser codificados por um ácido nucleico heterólogo incluem antigénios relacionados com a doença, tais como antigénios de tumor e antigénios de agentes patogénicos virais, bacterianos e outros, por exemplo antigénios derivados de Streptococcus mutans, Shigella sonnei, Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, VIH, virus da Influenza, virus da hepatite, virus do papiloma Plasmodium falciparum, Francisella tularensis e Schistosoma mansoni, ou antigénios derivados de tumores, tais como Her2/neu ou antigénio especifico da próstata (PSA) .

Outros antigénios exógenos adequados incluem moléculas do indivíduo, tais como idiotipos de anticorpo, por exemplo para a geração de uma resposta imunitária anti-idiotípica.

Opcionalmente, a vacina de bactérias pode igualmente coexpressar um polipéptido imunomodulador heterólogo recombinante, por exemplo uma citocina, tal como TNF-alfa, GM-CSF, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, IFN-alfa, IFN-gama, uma quimiocina, tal como CCL-25, ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou outro polipéptido de união que inibe citocinas (p. ex. IL-10, TGF-beta) ou outros mediadores de resposta imunitária ou células imunitária (tais como células T reguladoras ou supressoras) . Isto pode ser útil no aumento da resposta imunitária ao antigénio exógeno.

As vacinas de bactérias adequadas para a expressão de antigénios exógenos incluem estirpes de vacina de bactérias vivas, tais como bactérias patogénicas atenuadas, tais como Salmonella enteric, Vibrio cholerae, E. coli enterotóxica, Shigella e Campylobacter jejuni e células de bactérias não patogénicas, incluindo bactérias entéricas, tais como Enterobacteriaceae, e outras bactérias, tais como Bacillus subtlis e espécies de bactérias de ácido lático, p. ex. Lactococci spp, tal como L. lactis (Nature Reviews Microbiology (2008) 6:349).

As células viáveis secas na formulação sólida podem ser uma população homogénea do mesmo tipo de células (por exemplo, células da mesma estirpe de micro-organismo). Em alternativa, as células viáveis secas na formulação sólida podem ser uma população heteróloga que contém uma mistura de tipos diferentes de células. Por exemplo, a formulação pode compreender células de dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais tipos diferentes. Tipos diferentes de células podem incluir células de diferentes estirpes ou espécies de micro-organismo e/ou células com diferentes modificações genéticas.

As formulações aqui descritas podem ser administradas a qualquer indivíduo adequado. Por exemplo, o indivíduo pode ser um ser humano ou um animal não humano, tal como um roedor (p. ex. uma cobaia, um hamster, um rato, um ratinho), um murino (p. ex. um ratinho), um canino (p. ex. um cão), um felino (p. ex. um gato), um equino (p. ex. um cavalo), um porcino (p. ex. um porco), um primata, simiano (p. ex. um macaco ou simio) , um macaco (p. ex. sagui, babuíno), um simio (p. ex. gorila, chimpanzé, orangotango, gibão), uma ave (p. ex. galinha) ou um peixe (p. ex. salmão, truta).

Por exemplo, as formulações conforme aqui descrito compreendendo células de salmonela viáveis secas podem ser úteis como vacinas no tratamento veterinário de animais não humanos, tais como porcos e cavalos.

Os indivíduos adequados podem ser identificados ou selecionados como necessitando de tratamento. A formulação compreende preferencialmente uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz de células viáveis secas.

Os termos "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade profilaticamente eficaz" conforme aqui utilizado referem-se à quantidade de células viáveis secas que seja eficaz para a produção de algum efeito terapêutico ou profilático desejado, respetivamente, proporcional a uma relação benefício/risco razoável.

Uma formulação aqui descrita pode, por exemplo, compreender 103 ou mais, 104 ou mais, 105 ou mais, 106 ou mais, 107 ou mais, 108 ou mais, 109 ou mais ou IO10 ou mais células viáveis secas.

As células viáveis secas nas formulações aqui descritas retêm, pelo menos, 0,1 %, pelo menos 1 %, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 40 % ou pelo menos 60 % de viabilidade após a reidratação. Por conseguinte, um número significativo de células dentro da formulação é capaz de atividade metabólica e divisão celular, após a reidratação. Os métodos de avaliação da viabilidade de células são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios em placas para unidades formadoras de colónias (UFC).

Preferencialmente, as células viáveis secas nas formulações aqui descritas retêm a viabilidade conforme apresentado acima quando a formulação é armazenada à temperatura ambiente durante períodos prolongados (p. ex. 15 2C a 30 SC durante 24 meses ou mais).

As células secas reduziram o teor de humidade em relação às células não secas. Por exemplo, as células secas podem conter 10 % ou menos, 5 % ou menos, 4 % ou menos, 3 % ou menos ou 1 % ou menos de humidade residual, em relação às mesmas células antes da secagem.

As células adequadas para a utilização conforme aqui descrito podem ser secas através de qualquer método conveniente que não afete significativamente a viabilidade celular. Vários métodos adequados são conhecidos na técnica, incluindo secagem por congelamento, secagem à temperatura ambiente, secagem por pulverização, secagem de leito fluidizado, secagem de espuma, secagem direta durante a granulação para preparação de pastilhas e congelamento com crioprotetores (Potts (2004) Micro Rev 58:755 a 805; Crowe et al. (1990) Cryobiol. 27:219 a 231; Lievense et al. (1994) Adv Biochem Eng Biotechnol. 51 45 a 89) . Opcionalmente, a secagem pode ser realizada na presença de um agente estabilizador, por exemplo um dissacárido, e/ou um excipiente farmacêutico, por exemplo, um polímero, tal como hidroxipropilmetilcelulose.

Em algumas formas de realização, as células podem ser liofilizadas ou secas por congelamento. A secagem por congelamento envolve a remoção de água de um material congelado através de sublimação e dessorção em pressão reduzida. As técnicas de secagem por congelamento

adequadas são bem conhecidas na técnica. (F. Franks European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 1997 (45)221 a 229; "Fundamentais of freeze-drying" JD

Mellor Academic Press 1978). Opcionalmente, as células podem ser secas por congelamento na presença de um agente estabilizador, por exemplo um dissacárido, tal como trealose (Israeli et ai. (1993) Cryobiol 30 519 a 523;

Leslie et al. (1995) Appl. Env. Microbiol. 61 3592 a 3597) e/ou um excipiente farmacêutico ou outros componentes da formulação.

Em algumas formas de realização, as células podem ser submetidas a secagem estabilizada por dissacáridos. Isto pode compreender o aumento do nível intracelular de um dissacárido, tal como trealose, nas células e depois a secagem das células na presença de um agente estabilizador de hidratos de carbono, por exemplo, mediante evaporação e em pressão reduzida e temperaturas de não congelamento. Os agentes estabilizadores de hidratos de carbono adequados incluem dissacáridos, tais como trealose, maltitol, lactitol, palatinit, GPS (alfa-D-glucopiranosil-l->6-sorbitol), GPM (alfa-D- glucopiranosil-l->6-manitol), maltooligossacáridos e maltooligossacáridos hidrogenados. Os métodos de secagem estabilizados por dissacáridos adequados são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Crowe JH et al. Annu Rev Physiol 1998; 60:73 a 103. Bullifent HL, et al. Vaccine 8 de dezembro de 2000; 19(9 a 10):1239 a 1245; Garcia De Castro A, et al. Appl Environ Microbiol setembro de 2000; 66(9):4142 a 4144; US6468782 e US6610531.

Os ácidos biliares são ácidos esteroides que são produzidos no fígado pela oxidação de colesterol e segregados para dentro do intestino como componentes da bílis. Os ácidos biliares incluem ácido eólico, ácido desoxicólico e ácido quenodesoxicólico.

Um agente aglutinante de ácido biliar ou agente sequestrante é um composto que une, absorve ou sequestra ácidos biliares. Os agentes aglutinantes de bílis adequados incluem polímeros positivamente carregados que se unem ao grupo principal de ácido carboxílico negativamente carregado de ácidos biliares. Os polímeros positivamente carregados que se unem a ácidos biliares incluem resinas de troca aniónica, tais como colestiramina (p. ex. Questran™ ou Dowex 1X2™), colestilano, colestimida, cloridrato de colextrano, colesevelam HC1, colestipol, DEAE-dextrano, celulose aminada, DEAE-celulose, TEAE-celulose, Q-Sepharose, QAE Sephadex, hidroxietilcelulose etoxilato quaternizado e quitosana aminada.

Os polímeros positivamente carregados adequados são conhecidos na técnica para a utilização como hipocolesterolemiantes e são descritos, por exemplo em US4557 930, US3308020, US3383281, US3499960, US3780171, W02005023305 e GB929.391.

Outros agentes aglutinantes de bílis adequados incluem polímeros hidrófobos que se unem à fila de colesterol hidrófobo de ácidos biliares. Os polímeros hidrófobos adequados incluem polímeros relacionados com poliestireno.

Outros agentes adequados podem igualmente incluir agentes que ocorrem naturalmente, tais como fibra alimentar, carbono ativado e carvão de osso. Na invenção, o agente aglutinante de bílis é colestiramina. O agente aglutinante de bílis pode ter qualquer formato ou forma dentro da formulação, por exemplo grânulos, pós, pérolas, membranas ou monólitos porosos.

Os dados aqui apresentados mostram que uma pequena quantidade de agente aglutinante de bílis é suficiente para proteger células viáveis secas contra a toxicidade de ácido biliar. A quantidade de agente aglutinante de bílis numa formulação aqui descrita será, de um modo geral, significativamente menor do que a quantidade necessária para unir todos os ácidos biliares aos quais a formulação é exposta no intestino de um indivíduo.

Uma formulação sólida pode encontrar-se numa forma de dosagem unitária e pode compreender 5 g ou menos, 2 g ou menos, 1 g ou menos ou 0,5 g ou menos de material sólido.

Uma formulação sólida conforme aqui descrito pode compreender menos de 95 % (em peso) , menos de 90 % (em peso), menos de 80 % (em peso), menos de 70 % (em peso), menos de 60 % (em peso) , menos de 50 % (em peso) , menos de 40 % (em peso), menos de 30 % (em peso), menos de 20 % (em peso), menos de 10 % (em peso), menos de 1 % (em peso) ou menos de 0,1 % (em peso) do referido agente aglutinante de bílis.

Uma formulação sólida conforme aqui descrito pode compreender mais de 5 % (em peso), mais de 10 % (em peso) ou mais de 20 % (em peso) , mais de 30 % (em peso) , mais de 40 % (em peso) , mais de 50 % (em peso) , mais de 60 % (em peso), mais de 70 % (em peso), mais de 80 % (em peso) , mais de 90 % (em peso) ou mais de 95 % (em peso) do referido agente aglutinante de bílis. A relação em peso das células para agente aglutinante de bílis na formulação pode ser de 5 ou menos, 1 ou menos, 0,5 ou menos, 0,1 ou menos, 0,01 ou menos, 0,001 ou menos ou 0,0001 ou menos. A relação em peso do agente aglutinante de bílis para células na formulação pode ser de 0,2 ou mais, 1 ou mais, 10 ou mais, 100 ou mais, 1000 ou mais ou 10 000 ou mais.

Em algumas formas de realização preferidas, as células viáveis secas, o agente aglutinante de bílis e outros componentes da formulação podem ser encapsulados num invólucro polimérico. O invólucro polimérico pode ser útil para aumentar mais a resistência à bílis da formulação.

Preferencialmente, o invólucro polimérico compreende um polímero hidrófobo-hidrófilo amfifílico, tal como hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Os invólucros poliméricos adequados encontram-se comercialmente disponíveis.

Em algumas formas de realização preferidas, uma formulação sólida conforme aqui descrito pode ser coberta por um revestimento entérico.

Um revestimento entérico corresponde à camada exterior impermeável que protege as células viáveis secas contra danos de ácido à medida que a formulação passa pelo estômago, e depois permite a libertação das células quando a formulação chega ao intestino. A utilização de revestimentos entéricos é bem conhecida na técnica.

Os revestimentos entéricos podem ser sensíveis ao pH. Por exemplo, um revestimento entérico pode ser não lábil em condições ácidas dentro do estômago (p. ex. pH 1 a 3), mas pode ser lábil num pH mais elevado dentro do intestino (p. ex. pH acima de 5,5).

Os materiais poliméricos adequados para a utilização em revestimentos entéricos são bem conhecidos na técnica e podem, por exemplo, incluir ácidos gordos, ceras, shellac™ (goma-laca), ftalato de acetato de celulose (CAP), copolímeros de ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico-acrilato de metilo, succinato de acetato de celulose, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, ftalato de acetato de polivinilo (PVAP), trimelitato de acetato de celulose, carboximetiletilcelulose e copolímeros de ácido metilmetacrilatometacrílico.

Uma formulação sólida conforme aqui descrito pode compreender ainda um ou mais componentes adicionais, por exemplo para modificar ou ajustar as propriedades da formulação para aplicações específicas.

Por exemplo, uma formulação pode ainda compreender um agente de libertação atrasada que controla a libertação das células a partir da formulação para dentro do intestino, após a dissolução do revestimento entérico, por exemplo formando uma camada gelatinosa estável que se corrói lentamente até libertar as células.

Os agentes de libertação atrasada adequados incluem hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxietilcelulose, outras celuloses modificadas, gomas naturais, tal como goma de guar, óxido de polietileno, álcool polivinílico e ácido poli (látic-co-glicólico).

As células viáveis secas podem ser sensíveis a toxinas no intestino que não os ácidos biliares, por exemplo lisozima; péptidos antimicrobianos, tais como defensinas; e enzimas digestivas, tais como pepsina, tripsina e lipase. Uma formulação pode ainda compreender agentes para proteger as células contra essas toxinas. Por exemplo, uma formulação pode compreender uma resina de troca catiónica para unir e proteger células viáveis secas contra enzimas positivamente carregadas, tal como lisozima.

As resinas de troca catiónica adequadas incluem resinas de troca iónica, tal como resina Dowex 50wXl, sulfonato de poliestireno de sódio ou polímeros, tal como carboximetilcelulose ou ácido algínico.

Uma formulação pode ainda compreender estabilizadores para manter a viabilidade das células secas. Os exemplos de estabilizadores adequados incluem hidratos de carbono conforme descrito acima.

Uma formulação pode ainda compreender um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis, adjuvantes, excipientes, aglutinantes, desintegrantes, agentes de volume, substâncias deslizantes, diluentes, cargas, tampões, estabilizadores, conservantes, lubrificantes ou outros materiais bem conhecidos dos peritos na técnica e opcionalmente outros agentes terapêuticos ou profiláticos. Em algumas formas de realização, uma formulação pode ainda compreender um ou mais mucoadesivos que mantêm a formulação no intestino durante a libertação das bactérias. Os mucoadesivos adequados incluem polivinilpirrolidona, poliacrilatos, quitosana, metilcelulose, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose e outros derivados de celulose. 0 termo "farmaceuticamente aceitável" conforme aqui utilizado refere-se a compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, no âmbito do julgamento médico de confiança, adequados para a utilização no contacto com os tecidos de um sujeito (p. ex. ser humano) sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação benefício/risco razoável. Cada portador, excipiente, etc. tem igualmente de ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação. Os portadores, excipientes, etc. adequados podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrão, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21a edição, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 2005; e "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 5a edição, 2006, Pharmaceutical Press, Londres. A formulação da invenção é produzida mediante secagem de células de bactérias viáveis e, em seguida, a mistura das células viáveis secas com um agente aglutinante de bílis e opcionalmente um portador farmaceuticamente aceitável para produzir uma formulação sólida. Em alternativa, a formulação pode ser produzida mediante a mistura de células de bactérias viáveis com o agente aglutinante de bílis e opcionalmente um portador farmaceuticamente aceitável para produzir uma mistura, e a mistura pode depois ser seca para produzir uma formulação sólida; em que o agente aglutinante de bílis é colestiramina e as células de bactérias viáveis são células de vacina de bactérias. Os métodos adequados de secagem são descritos em mais detalhe acima.

As células viáveis secas e o agente aglutinante de bílis podem ser misturados com outros portadores farmaceuticamente aceitáveis, adjuvantes, excipientes e/ou outros materiais descritos acima; comprimidos, moldados ou então feitos numa formulação adequada para distribuição oral; e/ou cobertos por um revestimento entérico para produzir a formulação. É possível determinar a resistência das células na formulação para a exposição à bílis. A quantidade de células e/ou agente aglutinante de bílis na formulação pode ser alterada para otimizar a resistência das células à bilis. Por exemplo, se for possível recuperar números reduzidos de células viáveis a partir da formulação após a exposição à bílis, relativamente a controlos, pode ser aumentada a quantidade de agente aglutinante de bílis na formulação.

As formulações sólidas adequadas para administração oral podem consistir numa ou em mais unidades distintas, tais como pastilhas, péletes, comprimidos ou cápsulas. Em algumas formas de realização, uma unidade distinta, tal como um comprimido ou uma cápsula, pode compreender múltiplas subunidades pequenas, tais como grânulos ou pós.

As formulações sólidas para administração oral podem convenientemente ser apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas mediante quaisquer métodos bem conhecidos na técnica. Esses métodos podem incluir a etapa de associação das células viáveis secas e do agente aglutinante de bílis com o portador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas mediante a associação de forma uniforme e íntima da mistura de células viáveis secas e do agente aglutinante de bílis com portadores sólidos minuciosamente divididos e, em seguida, se necessário, a modelação do produto.

As formulações adequadas para administração oral (p. ex. mediante ingestão) podem ser apresentadas como unidades distintas, tais como cápsulas, hóstias ou pastilhas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada das células viáveis secas e do agente aglutinante de bílis; por exemplo como um pó ou grânulos.

Uma pastilha pode ser feita mediante meios convencionais, p. ex. compressão, moldagem, granulação a húmido ou granulação a seco, opcionalmente com um ou mais componentes acessórios, tais como aglutinantes (p. ex. povidona, gelatina, acácia, sorbitol, tragacanto, hidroxipropilmetilcelulose) ; cargas ou diluentes (p. ex. lactose, celulose microcristalina, fosfato de hidrogénio de cálcio); lubrificantes (p. ex. estearato de magnésio, talco, sílica); desintegrantes (p. ex. glicolato de amido de sódio, povidona reticulada, carboximetilcelulose de sódio reticulada); agentes tensioativos ou de dispersão ou de humedecimento (p. ex. laurilsulfato de sódio); e conservantes (p. ex. metil-p-hidroxibenzoato, propilfidroxibenzoato, ácido sórbico). Por exemplo, as pastilhas comprimidas podem ser preparadas mediante compressão numa máquina adequada do composto ativo numa forma que flui livremente, tal como um pó ou qrânulos, opcionalmente misturado com um ou mais componentes acessórios. As pastilhas moldadas podem ser feitas mediante moldagem numa máquina adequada de uma mistura do composto em pó humedecido com um diluente líquido inerte. As pastilhas podem opcionalmente ser revestidas ou riscadas e podem ser formuladas de modo a fornecer uma libertação lenta ou controlada do composto ativo aí utilizando, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose ou outros agentes de libertação atrasada em proporções variadas para fornecer o perfil de libertação desejado. Conforme descrito acima, as pastilhas, os péletes, os comprimidos, as cápsulas e outras formulações sólidas podem opcionalmente incluir um revestimento entérico para fornecer a libertação em partes do intestino que não o estômago .

As cápsulas compreendendo as células secas e o agente aglutinante de bílis numa forma de pó ou grânulo encapsulada por um invólucro polimérico podem ser feitas mediante meios convencionais.

Os componentes podem ser dispostos em várias disposições diferentes dentro das formulações aqui descritas e a disposição precisa dos componentes dependerá das propriedades específicas que são necessárias para uma determinada aplicação. Por exemplo, uma formulação pode ser homogénea, isto é, as células viáveis secas e os agentes aglutinantes de bílis podem ser distribuídos de forma homogénea dentro da formulação, ou pode ser heterogénea, isto é, as células viáveis secas e os agentes aglutinantes de bílis podem ser distribuídos de forma heterogénea dentro da formulação.

Os exemplos de diferentes disposições de componentes nas formulações aqui descritas são mostrados na figura 6.

Em algumas formas de realização, uma formulação pode compreender; um núcleo que compreende as bactérias secas vivas e o agente aglutinante de bílis, e; um revestimento, preferencialmente um revestimento entérico, que circunda o núcleo. Opcionalmente, o revestimento pode ser um invólucro polimérico que encapsula o núcleo.

Em alternativa, uma formulação pode compreender um núcleo de excipiente farmaceuticamente aceitável que compreende grânulos das bactérias viáveis secas e grânulos do agente aglutinante de bílis seco. Opcionalmente, o núcleo pode ainda compreender grânulos de material de libertação atrasada. Opcionalmente, o núcleo pode ser encapsulado num invólucro polimérico. Opcionalmente, a formulação pode ainda compreender um revestimento entérico que circunda o núcleo.

Em alternativa, uma formulação pode compreender um núcleo das bactérias secas viáveis que é circundado por uma camada do agente aglutinante de bílis.

Opcionalmente, a camada de agente aglutinante de bílis pode ainda compreender um material de libertação atrasada. Opcionalmente, o núcleo e a camada de agente aglutinante de bílis podem ser encapsulados num invólucro polimérico. Opcionalmente, a formulação pode ainda compreender um revestimento entérico que circunda a camada de agente aglutinante de bílis.

As formulações conforme aqui descrito são estáveis à temperatura ambiente, isto é, as células permanecem viáveis após armazenamento prolongado à temperatura ambiente (p. ex. 15 2C a 30 2C) .

As combinações do agente aglutinante de bílis e as células viáveis secas, p. ex. numa formulação conforme descrito acima, são úteis na distribuição de células vivas ao intestino de um indivíduo.

As formulações conforme aqui descrito podem ser úteis para aplicações medicinais, terapêuticas ou profiláticas. Por exemplo, uma combinação do agente aglutinante de bílis e as células viáveis secas, p. ex. na formulação conforme descrito acima, podem ser úteis no tratamento terapêutico ou profilático do corpo humano ou animal. 0 termo "tratamento terapêutico" conforme aqui utilizado no contexto de tratamento de um indivíduo para uma condição refere-se geralmente ao tratamento e à terapia, quer de um ser humano quer de um animal não humano (p. ex. em aplicações veterinárias), nos quais é alcançado algum efeito terapêutico desejado, por exemplo, a inibição do progresso da condição, e inclui uma redução na taxa de progresso, uma paragem na taxa de progresso, um melhoramento da condição ou de um ou mais sintomas da mesma e cura da condição. 0 termo "tratamento profilático" conforme aqui utilizado no contexto de um tratamento de um indivíduo relativamente a uma condição refere-se geralmente ao tratamento que previne ou reduz o risco da ocorrência ou recorrência da condição ou de um ou mais sintomas da mesma. 0 tratamento profilático pode, por exemplo, ser realizado num indivíduo (p. ex. um ser humano ou um animal não humano) que não se encontre no momento do tratamento a sofrer da condição ou que não apresente sintomas da condição.

Em particular, uma combinação de um agente aglutinante de bílis e das células viáveis secas pode ser útil no tratamento terapêutico ou profilático de infeção patogénica num indivíduo. Um método de tratamento de uma infeção patogénica num indivíduo pode compreender a administração oral de uma combinação de um agente aglutinante de bílis e de células viáveis secas a um indivíduo que necessite da mesma.

As infeções patogénicas incluem infeções bacterianas, tais como cólera (V. cholerae), tifoide (S. typhi), disenteria (Shigelia spp), antraz (Bacillus anthracis), peste (Yersinia pestis), tuberculose (Mycobacterium tuberculosis), lepra (Mycobacterium leprae), campilobacteriose (Campylobacter spp) e gastroenterite (E. coli enterotóxica e Salmonella spp); infeções virais, tais como Influenza, VIH-SIDA, varíola e SARS, e infeções parasíticas, tais como malária (Plasmodium spp) , esquistosomíase (Schistosoma spp).

Uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas pode igualmente ser útil nos métodos de imunização e/ou imunoterapia, por exemplo estimulando ou preparando uma resposta imunitária a um antigénio relacionado com a doença que é codificado e preferencialmente expressado pelas células. Um método de tratamento de um indivíduo por imunização ou imunoterapia pode compreender a administração oral de uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas a um indivíduo que necessite da mesma.

Conforme descrito acima, o antigénio relacionado com a doença pode ser naturalmente expressado pelas células (p. ex. numa vacina de bactérias atenuadas) ou o antigénio relacionado com a doença pode ser um antigénio exógeno que é expressado na célula a partir do ácido nucleico heterólogo.

As células podem ainda compreender o ácido nucleico heterólogo que codifica um polipéptido imunomodulador, por exemplo uma citocina, tal como TNF-alfa, GM-CSF, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, IFN-alfa ou IFN-gama; uma quimiocina, tal como CCL-25, ou um anticorpo ou outra molécula de união que inibe citocinas (p. ex. IL-10, TGF-beta) ou outros mediadores de resposta imunitária ou células (tais como células T reguladoras ou supressoras), originando melhores respostas imunitárias.

Os antigénios relacionados com a doença incluem antigénios de tumor e antigénios de agentes patogénicos virais, bacterianos e outros conforme descrito acima. Por exemplo, as células podem expressar um antigénio de um agente patogénico, tais como Streptococcus mutans, Shigeila sonnei, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, VIH, vírus da Influenza, vírus da hepatite, Plasmodium falciparum, Francisella tularensis ou Schistosoma mansoni, ou um antigénio de um tumor, tal como Her2/neu ou antigénio específico da próstata (PSA), de modo a desencadear ou preparar uma resposta imunitária ao agente patogénico ou tumor. As formulações conforme aqui descrito podem assim ser úteis no tratamento terapêutico e profilático de infeção patogénica e cancro.

Uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas pode igualmente ser útil na distribuição de células viáveis ao intestino, por exemplo para restaurar a flora microbiana do intestino num indivíduo. Isto pode ser útil, por exemplo, após o tratamento com antibióticos. Um método de restauração da flora microbiana do intestino pode compreender a administração oral de uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas a um indivíduo que necessite da mesma, p. ex. após o tratamento com antibióticos.

Uma combinação de um agente aglutinante de bilis e células viáveis secas pode igualmente ser útil no tratamento terapêutico e profilático da doença intestinal inflamatória ou de um ou mais sintomas da mesma num indivíduo. Um método de tratamento da doença intestinal inflamatória ou de um ou mais sintomas da mesma pode compreender a administração oral de uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas a um indivíduo que necessite da mesma.

Uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas pode igualmente ser útil no tratamento terapêutico e profilático de formação de pedras nos rins num indivíduo. Um método de tratamento de formação de pedras nos rins pode compreender a administração oral de uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas a um indivíduo que necessite da mesma.

Uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas pode igualmente ser útil na redução de níveis de colesterol num indivíduo. Um método de redução dos níveis de colesterol pode compreender a administração oral de uma combinação de um agente aglutinante de bílis e células viáveis secas a um indivíduo que necessite da mesma.

Um agente aglutinante de bílis e células secas viáveis podem ser utilizados no fabrico de um medicamento para a utilização em qualquer uma das aplicações e tratamentos terapêuticos e profiláticos descritos acima.

Formulações adequadas, agentes aglutinantes de bílis e células de bactérias secas viáveis são descritos acima em mais detalhe.

Os métodos aqui descritos podem ser úteis, por exemplo, no melhoramento da eficácia de um agente terapêutico que compreende células viáveis secas, tal como uma vacina de bactérias. Um método de melhoramento da eficácia de um agente assim pode compreender a formulação do agente com um agente aglutinante de bílis conforme aqui descrito.

Os métodos aqui descritos podem igualmente ser úteis, por exemplo, no aumento da sobrevivência de células viáveis secas no intestino de um indivíduo. Um método de aumento da sobrevivência de células de bactérias viáveis secas no intestino pode compreender a formulação das células com um agente aglutinante de bílis conforme aqui descrito. A divulgação fornece igualmente a utilização de um agente aglutinante de bílis conforme aqui descrito num método aqui descrito, por exemplo, um método de produção de uma formulação sólida compreendendo células viáveis secas para administração oral; aumento da sobrevivência de células de bactérias viáveis secas no intestino de um indivíduo ou melhoramento da eficácia de um agente terapêutico que compreende células viáveis secas. "E/ou" quando aqui utilizado deve ser considerado como divulgação específica de cada uma das duas funcionalidades ou componentes especificados um com ou sem o outro. Por exemplo, "A e/ou B" devem ser considerados como divulgação específica de cada um de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, tal como se cada um fosse aqui apresentado individualmente.

Certos aspetos e certas formas de realização da invenção serão agora ilustrados como exemplo e com referência às figuras descritas abaixo. A Figura 1 mostra a rápida recuperação da tolerância à bílis após reidratação. A Figura 2 mostra que a remoção de ácidos biliares das soluções biliares utilizando BAR previne a toxicidade de soluções biliares relativamente a bactérias secas. A Figura 3 mostra que a colestiramina previne a toxicidade biliar. A Figura 4 mostra que a adição de BAR à secagem de excipiente antes da secagem de bactérias fornece uma proteção significativa contra toxicidade quando as células secas são ressuspensas nas soluções biliares. A Figura 5 mostra que a adição de BAR a pastilhas de matriz comprimidas fornece uma proteção significativa contra toxicidade de uma solução biliar de 1 %. A Figura 6 mostra três exemplos de possíveis formulações para formas de dosagem oral. A Figura 7 mostra a validação de formulação otimizada para a proteção de células de uma vacina de bactérias vivas e secas contra a bílis. A Figura 8 mostra a proteção de uma vacina de Salmonela viva seca contra ácido e bílis utilizando uma cápsula revestida entérica e a colestiramina BAR. A Figura 9 mostra a proteção de bactérias secas de ácido lático contra soluções biliares em cápsulas utilizando a colestiramina BAR. Estes resultados não se encontram de acordo com a invenção.

Experiências

Foi utilizada a estirpe de vacina de bactérias vivas SLDAPD pUC18l como um modelo para a distribuição oral de bactérias [13]. As bactérias cresceram durante a noite no meio M9 (com nutrientes e aminoácidos essenciais) mais 250 mM de NaCl, e depois foram secas amostras de 10 microlitros em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) mais 40 % de trealose e 1,5 % de PVP num dessecador, conforme descrito ([14]). As amostras replicadas foram mantidas secas ou reidratadas com 200 microlitros de PBS ou água e deixadas durante 1,5 ou 20 minutos conforme indicado. As amostras secas ou recuperadas ou as células de controlo de culturas de caldo rico foram depois testadas mediante incubação durante 1 h, diluídas extensivamente em ácido ou solução biliar ou tampão de controlo, conforme indicado, seguindo-se a diluição, colocação em placas de ágar e contagem de colónias noturnas. As contagens de bactérias foram corrigidas relativamente à diluição durante a recuperação e os testes, e expressadas como cfu/ml em relação ao volume de amostras de 10 ul original.

As bactérias secas demonstraram recuperar a tolerância à bílis muito rapidamente quando reidratadas em água ou tampão antes da exposição à bílis. Uma preparação seca de bactérias que perderam 50x de viabilidade quando reidratadas na bílis, ganharam uma sobrevivência 5x melhor em 5 minutos de reidrataçao, e uma sobrevivência 20x melhor após 20 minutos (fig. 1).

Foram obtidos resultados semelhantes mediante reidratação no tampão e em água. 1 h após a reidratação, as bactérias comportaram-se de forma indistinguivel em relação às células de controlo das culturas liguidas. A estirpe de vacina de bactérias vivas SLDAPD pUC18l [13] e a estirpe E. coli K12 DH5a (Invitrogen) cresceram durante a noite no meio M9 mais 250 mM de NaCl, e depois foram secas amostras de 10 μΐ em PBS/40 % de trealose/1,5 % de PVP num dessecador, conforme descrito [12]. Uma solução de 5 % em peso por volume de bilis (Sigma, Bilis de boi) em PBS foi misturada com ou sem 10 % em peso por volume de colestiramina (Dowex 1x2, Sigma, Poole, Reino Unido) durante 1 hora à temperatura ambiente. A colestiramina foi removida mediante centrifugação seguindo-se a filtração (0,2 micrones, Millipore). A medição de sais biliares utilizando um ensaio enzimático (Randox Total Bile Acid Assay - Ensaio de Ácido Biliar Total Randox, Randox labs, Co. Antrim) demonstrou que a concentração de sais biliares foi reduzida de 130 mM para 0,8 mM mediante tratamento de colestiramina. As soluções resultantes foram adicionadas às amostras replicadas de bactérias secas e cultivadas durante 1 h, seguindo-se a diluição, a colocação em placas, a contagem de colónias noturnas e o cálculo de cfu/ml relativo. A remoção de ácidos biliares mediante BAR mostrou prevenir eficazmente a toxicidade de soluções biliares relativamente a bactérias secas (fig 2) . A Figura 2 demonstra igualmente uma elevada toxicidade biliar relativamente às amostras secas de uma estirpe diferente de bactérias, E. coli K12, e mostra que o pré-tratamento com colestiramina também protege estas células secas. Amostras secas de 10 μΐ de SLDAPD pUC18I (contendo o gene de resistência à ampicilina) foram secas em tubos de teste de 6 ml. Às amostras replicadas, nada ou 150 mg de colestiramina foram adicionados por cima das células secas. Em seguida, 2 ml de uma solução de 2 % de bílis em PBS ou PBS de controlo foram adicionados à colestiramina, seguindo-se a incubação durante 1 h a 37 graus. Após a incubação, as amostras foram retiradas, diluídas, colocadas em placas, e as colónias noturnas foram contadas em placas de ágar com ou sem ampicilina e o cfu/ml relativo foi calculado. A colestiramina foi esterilizada antes da adição às amostras de bactérias mediante pré-tratamento com 70 % de Etanol e secagem extensa. Além disso, foi encontrado o mesmo número de colónias com ou sem ampicilina, indicando que apenas a estirpe de teste de bactérias se encontrava presente e que não ocorreu nenhuma contaminação.

Constatou-se que a adição de BAR por cima das bactérias secas seguida da adição da solução biliar bloqueia a toxicidade da solução biliar. Isto demonstra que a remoção sequencial da bílis seguida da administração de líquido sem ácido biliar relativamente às bactérias secas não é necessária para proteger as bactérias, e demonstra que os ácidos biliares complexados relativamente a BAR não têm nenhuma toxicidade relativamente às bactérias secas (figura 3) .

As amostras de 10 μΐ replicadas de SLDAPD pUC18l foram suspensas no excipiente de controlo (40 % de trealose, 1,5 % de PVP em PBS) ou excipiente que contém BAR (40 % de trealose, 1,5 % de PVP mais 5 ou 10 % de colestiramina em PBS) e secas em tubos de teste de 6 ml. Às amostras replicadas, foram adicionados 2 ml de soluções biliares de 2 % ou 0,4 % ou tampão de controlo e os tubos foram incubados durante 1 h a 37 graus, seguindo-se a amostragem, a diluição e a colocação em placas de ágar. A inclusão de BAR no excipiente de secagem mostrou fornecer proteção eficaz de bactérias secas contra a bílis, mesmo em quantidades incapazes de unir a quantidade total do ácido biliar presente numa solução de teste (fig. 4).

Crucialmente, a secagem de forma simples das bactérias com pequenas quantidades de colestiramina adicionadas ao excipiente de secagem mostrou fornecer uma proteção significativa em condições onde não seria esperada nenhuma proteção no caso de BAR se encontrar simplesmente a unir e a sequestrar ácidos biliares. Na figura 4, a quantidade de colestiramina presente é bastante menor do que a quantidade total de ácidos biliares presentes no meio de teste. A colestiramina tem uma capacidade de 1,2 mg de sais biliares por 1 mg (valor típico, valor exato depende do ácido biliar ligado [14]). Por conseguinte, na amostra de bactérias secas de 10 μΐ existe 1 mg de colestiramina com uma capacidade para 1,2 mg de ácidos biliares, mas nos 2 ml de 2 % de solução biliar encontra-se presente um total de 20 mg de ácidos biliares (tipicamente a bílis de boi utilizada contém mais de 50 % de ácidos biliares em peso), superior a 15 vezes mais ácidos biliares.

As células SLDAPD pUC18l foram secas no excipiente padrão (40 % de trealose, 1,5 % de PVP em PBS), e depois moídas num almofariz para criar um pó. As bactérias secas em pó foram misturadas em proporções cuidadosamente pesadas conforme apresentado em seguida: pastilhas de controlo - carga de sacarose: 9 % de bactérias secas em pó/91 % de pó de sacarose; pastilhas de controlo - carga MCC: 8 % de bactérias secas em pó/92 % de celulose microcristalina (MCC, Avicel PH101); pastilhas BAR - colestiramina: 8 % de bactérias secas em pó/33 % de colestiramina/58 % de carga MCC; pastilhas BAR - Dowex 1X2: 6 % de bactérias secas em pó/63 % de resina de malha Dowex 1X2 400/32 % de carga MCC.

As amostras de 70 a 90 mg dos pós misturados foram depois prensadas num troquei de 7 mm numa prensa (Port-A-Press de International Crystal Laboratories, fornecido por Crystan Ltd, utilizando um torque de 10 metros newton) para criar pastilhas de matriz comprimidas com aproximadamente 1 mm de espessura. As pastilhas foram depois testadas em condições intestinais simuladas conforme apresentado em seguida: as pastilhas foram pesadas e individualmente adicionadas a porções de 17 ml de fluido intestinal simulado International

Pharmacopoeia, isto é, tampão de fosfato de potássio/sódio pH 7,0 quer sozinho quer mais 1 % de solução de bilis de boi, e incubadas durante 45 minutos a 37 -C. As amostras foram retiradas, diluídas, colocadas

em placas durante a noite e foi contado cfu vivo. A contagem de bactérias recuperada foi expressada em termos do peso de bactérias secas original, isto é, em cfu/mg de bactérias secas, e cada barra representa uma única pastilha, com a barra de erro a representar múltiplas contagens de bactérias para esta pastilha.

As pastilhas humanas de protótipo que contém BAR mais bactérias secas mostraram oferecer uma proteção biliar significativa num modelo de libertação intestinal simulado (figura 5). Foram testadas pastilhas que contêm bactérias secas vivas com ou sem adição da colestiramina BAR, ou a resina de troca iónica equivalente Dowex 1x2, mediante dissolução no tampão vs. soluções biliares. Com pastilhas de controlo contendo bactérias secas diluídas em sacarose como uma carga, foram recuperadas 1228 vezes menos células após a dissolução na solução biliar de 1 % em comparação com a dissolução no tampão sozinho, indicando toxicidade biliar significativa. De forma semelhante, relativamente às pastilhas feitas utilizando MCC como uma carga, foram recuperadas 638 vezes menos células após a dissolução numa solução biliar de 1 % em comparação com o tampão sozinho. Em oposição, com pastilhas contendo colestiramina ou resina Dowex 1X2 além das bactérias secas e da carga MCC, a dissolução na bílis apenas originou uma redução de 2,5 a 3,1 vezes na recuperação de células vivas. Isto representa um melhoramento de 208 a 254 vezes mais células vivas com a pastilha BAR em comparação com pastilhas de controlo. Essencialmente, as pastilhas de colestiramina contêm um máximo de 24 mg de colestiramina tendo a capacidade de unir um máximo de 29 mg de ácidos biliares, mas 17 ml da solução biliar de 1 % contêm aproximadamente 85 mg de ácidos biliares, por conseguinte a colestiramina não se encontra simplesmente a sequestrar os ácidos biliares totais que estão em excesso na solução de teste.

Sem limitação de modo algum a uma teoria, a formulação pode funcionar conforme apresentado em seguida: a colestiramina no excipiente une os ácidos biliares presentes no volume limitado de tampão que é absorvido na amostra seca, e por isso as bactérias secas são reidratadas em água "limpa", permitindo a rápida recuperação, conforme ilustrado na figura 1. Subsequentemente, quando a amostra reidratada se desintegra e dispersa na solução biliar, as bactérias já recuperaram uma resistência à bilis significativa.

Mesmo com a formulação experimental simples que consiste em BAR adicionado ao excipiente de secagem, foram recuperadas 50 vezes mais bactérias vivas com a formulação BAR (10 % de colestiramina) em comparação com a formulação de controlo quando ressuspensa numa solução biliar de 2 %, representando um melhoramento significativo. Isto representa uma redução de 5 vezes na recuperação de células vivas com a formulação quando ressuspensas em 2 % de bilis em comparação com uma redução de 270 vezes na recuperação de células vivas com a formulação de controlo convencional com excipiente de secagem convencional. De forma semelhante, com a formulação de pastilhas de matriz comprimidas consistindo em BAR misturado com bactérias secas antes da compressão de pastilhas, foram recuperadas 208 a 254 vezes mais bactérias vivas com o BAR contendo formulação de pastilhas em comparação com a formulação de controlo quando ressuspensa numa solução biliar de 2 %, representando um melhoramento significativo. Isto representa uma redução de 2,5 a 3,1 vezes na recuperação de células vivas aquando da dissolução em 1 % de bilis em comparação com uma redução de 1228 a 638 vezes na recuperação de células vivas com a formulação de pastilhas de controlo convencional. A capacidade de uma formulação ótima de proteger uma vacina de bactérias vivas secas contra a bilis foi testada.

Nestas experiências, foi utilizada a estirpe de vacina da peste dos ratinhos SL3261/pAHL [17]; foram obtidos resultados semelhantes utilizando a estirpe de manutenção de plasmideo livre de antibióticos SLDAPD/pUCl8I [12, 16, 13]. As bactérias foram contadas utilizando placas de ágar LB contendo ampicilina para SLDAPD/pUC18l ou canamicina para SL3261/pAHL de modo a garantir que apenas são contadas as bactérias da vacina. As bactérias cresceram e foram secas conforme descrito em [12, 16], e depois diversas preparações secas replicadas foram agrupadas e mordas até um pó homogéneo num almofariz e misturadas com MCC seca para criar um pó que flui livremente para a formulação e o enchimento das cápsulas. Este pó habitualmente continha 2 a 5xl06 cfu/mg e foi armazenado num dessecador a vácuo à temperatura ambiente até aos testes; a preparação mostrou menos de 10 % de perda de viabilidade durante um período de 2 meses.

Este pó foi misturado com carga MCC mais BAR em 25 %, e depois pesado diretamente em tubos de teste ou inserido em cápsulas de tamanho 00 do material de invólucro indicado e pesado em tubos de teste. Foram adicionadas bactérias entre 20 e 30 mg por 1 g de pó total para garantir que bactérias secas em pó de 6 a 10 mg fossem incluídas por cápsula. O pó misturado foi manualmente inserido em cápsulas de tamanho 00 do material de invólucro indicado utilizando um Cap-MQuick (Value Healthcare Company, Sheffield, Reino Unido); um rolamento de esferas de aço de 6,4 mm de diâmetro foi adicionado à cápsula para submergir o mesmo durante a dissolução. 25 ml de tampão ou 1 % ou 4 % de bílis de boi foram adicionados e incubados a 37 2C durante 50 minutos, depois os tubos foram misturados cuidadosamente e as amostras foram retiradas, diluídas, colocadas em placas de ágar com canamicina, e incubadas durante a noite. As colónias foram contadas e utilizadas para determinar o número de células vivas, expressadas como CFU por mg do pó de vacina seco inicial. As células estabilizadas secas da estirpe de vacina da peste dos ratinhos SL3261/pAHL foram utilizadas; foi observada uma proteção semelhante em experiências separadas utilizando células secas da estirpe de vacina SLDAPD/pUCl8I. O efeito de diferentes tipos BAR na proteção biliar foi estudado dentro do invólucro de cápsula HPMC de libertação rápida. As cápsulas HPMC de libertação rápida são cápsulas HPMC modificadas concebidas para fornecer uma libertação muito mais rápida em comparação com cápsulas HPMC convencionais. Os estudos de imagem previram que a proteção fornecida por malha Dowex 1x2 400 podia ser significativamente melhorada simplesmente removendo a humidade para gerar um pó não agregado que flui livremente e, na realidade, quando foi adicionada malha Dowex 1x2 400 seca em 25 % à carga seca MCC e LBV, foi observada uma diferença impressionante, com malha

Dowex 1x2 400 seca a fornecer uma proteção de 92 vezes em comparação com pó sem cápsulas. Em oposição, a preparação a húmido de malha Dowex 1x2 400 não forneceu nenhuma proteção significativa (fig. 7a) . Além disso, a colestiramina forneceu uma proteção ainda melhor do que a malha Dowex 1x2 400, com uma proteção de 120 vezes em comparação com pó sem cápsulas, e não mostrando nenhuma perda significativa de bactérias em 1 % de bílis em comparação com o tampão (fig. 7a).

Em seguida, foi criada e testada uma formulação otimizada numa maior concentração de bílis. Esta formulação incorporou as funcionalidades protetoras previstas pelo trabalho teórico e de imagem - 25 % de colestiramina, maiores tamanho de dose e geometria de cápsula - e foi igualmente testada utilizando cápsulas HPMC convencionais. A adição de 25% de colestiramina BAR resultou numa recuperação de 100 % de células viáveis em cápsulas HPMC em condições de 4 % de bílis com nenhuma diferença na recuperação celular entre bílis e tampão (fig. 7b) . Além disso, não foi detetada nenhuma perda significativa de bactérias em 4 % de bílis em comparação com o tampão quando as cápsulas HPMC de libertação rápida foram igualmente cheias com 25 % de colestiramina e LBV seco (fig. 7b) . Por conseguinte, a simples adição de 25 % de colestiramina a preparações de LBV seco pode fornecer uma proteção de 4200 vezes contra 4 % de bílis. A composição da bílis de porco é mais próxima da dos seres humanos [8], e um grau elevado semelhante de proteção contra a bílis de porco em 1 %, 4 % e 8 % foi igualmente observado, confirmando que esta formulação otimizada pode proteger bactérias de vacina secas contra concentrações em excesso de ácidos biliares. A inclusão de BAR em pastilhas fornece proteção contra uma solução de bilis que contém uma quantidade de ácidos biliares que excederam bastante a capacidade máxima de BAR dentro da pastilha [16] . De forma semelhante, nas experiências de cápsula, a quantidade total de colestiramina foi de 75 mg (25 % de 300 mg de pó) , que pode unir um máximo de 218 a 292 pmole de ácidos biliares [4]. Isto foi adicionado a 25 ml de uma solução biliar de 4 % que continha um total de 2500 pmole de ácidos biliares, representando um excesso de 8 a 11 vezes de ácidos biliares relativamente à capacidade BAR, indicando que, tal como com as pastilhas, as cápsulas que contêm BAR fornecem uma proteção temporária enquanto as bactérias secas recuperam a tolerância à bilis, em vez de sequestrarem simplesmente todos os ácidos biliares dentro da amostra de teste. A capacidade de proteção de uma cápsula revestida entérica e da colestiramina BAR relativamente à vacina de Salmonela viva seca contra a bilis foi testada.

As bactérias SL3261/pAHL cresceram e secaram da mesma maneira em comparação com as anteriores experiências. As bactérias secas em pó foram misturadas com celulose microcristalina e colestiramina na relação de 1:75:25 células:MCC:colestiramina. Este pó foi inserido nas cápsulas HPMC padrão de tamanho 00, aproximadamente 300 mg por cápsula, com um rolamento de esferas a submergir durante os testes de dissolução. As cápsulas não eram revestidas ou foram mergulhadas duas vezes de cada lado numa solução de 10 % em peso por volume de copolímero de acrilato de etilo:ácido metacrílico de polímero entérico (Kollicoat MAE 100 P, BASF, Mannheim, Alemanha) dissolvida numa mistura de 3:2 em volume de metanol e diclorometano, e depois seca durante a noite. 5 cápsulas revestidas entéricas foram individualmente imersas durante 40 minutos em 20 ml de 0,1 M de HC1 a 37 2C para simular ácido gástrico no estômago; conforme esperado, o revestimento entérico preveniu a dissolução ou penetração do invólucro da cápsula pelo ácido. Estas 5 cápsulas foram depois transferidas para 2 % de bílis de boi dissolvida no tampão de fosfato pH 7,0. Ao mesmo tempo, 2 cápsulas revestidas e 3 não revestidas foram individualmente adicionadas a 20 ml de tampão de fosfato pH 7,0 (tampão); ao mesmo tempo, 2 cápsulas não revestidas foram adicionadas individualmente a 20 ml de 0,1 M de HC1. Todas as cápsulas foram depois incubadas a 37 2C durante 1 h, e depois misturadas cuidadosamente. As cápsulas não revestidas dissolveram-se completamente no ácido dentro de 1 h. Após mais 1 h (2 h de incubação total), as amostras foram retiradas, diluídas e colocadas em placas ágar contendo canamicina e depois incubadas durante a noite. As colónias foram contadas e a recuperação de células vivas foi calculada e expressada como unidades formadoras de colónias por ml; cada barra representa 1 cápsula e as barras de erro indicam 1 desvio padrão.

Constatou-se que as cápsulas não revestidas libertam números elevados de células viáveis no tampão, mas nenhumas células vivas foram recuperadas no ácido. Em oposição, foram recuperados números semelhantes de células viáveis no tampão e na bílis após a imersão ácida com as cápsulas revestidas entéricas (consulte a Figura 8). Isto demonstra que uma dose sólida revestida entérica contendo a colestiramina BAR protege células de uma vacina de bactérias secas e vivas de antigénios heterólogos contra ácido gástrico seguido da bílis intestinal. A capacidade de cápsulas contendo a colestiramina BAR para proteger bactérias secas de ácido lático contra soluções biliares foi testada. Estes testes não se encontram de acordo com a invenção. As bactérias vivas de ácido lático foram comercialmente fabricadas na forma de pó através de um processo de fermentação e secagem por congelamento. A cultura foi testada relativamente a Salmonella e outros agentes patogénicos pelo fabricante e fornecida como um suplemento alimentar que é adequado para o consumo humano. 0 pó seco de bactérias de ácido lático que contém Lactobacillus caseii foi misturado com carga de celulose microcristalina (MCC) com ou sem 50 % em peso da colestiramina BAR, e depois inserido em cápsulas HPMC que contêm um rolamento de esferas de 1 g para submergir as cápsulas. 13 a 15 % em peso do conteúdo da cápsula correspondiam a bactérias que se correlacionam com 39 a 45 mg de uma cápsula de 300 mg, isto é, que variam entre 9,8χ10Λ9 e 11χ10Λ9 CFU/cápsula. As cápsulas individuais foram adicionadas a tubos de 50 ml que contêm 25 ml de tampão de fosfato de controlo pH 7,0, ou as concentrações indicadas de bilis de boi e bílis porcina no tampão de fosfato durante 1 h a 37 2C. As amostras foram retiradas, diluídas e porções colocadas em placas de cultura de ágar, incubadas durante 72 h a 37 2C e, em seguida, as colónias foram contadas e as unidades formadoras de colónias (CFU) foram calculadas para indicar o número de células vivas em relação ao peso original de pó seco de ácido lático adicionado às cápsulas. Cada barra representa a média de 4 cápsulas individualmente testadas.

Quando dispersadas no tampão de controlo, constatou-se que as cápsulas de controlo que contêm células misturadas com a carga MCC sozinha libertam os números elevados esperados de células L. caseii vivas; em oposição, o aumento de doses de bilis forneceu reduções na recuperação de células vivas, com 4 % de bílis de boi proporcionando uma morte de mais de 30 vezes. Quando a colestiramina foi adicionada à cápsula misturada com as bactérias e os pós de enchimento, foi observada uma perda de menos de 3 vezes com 4 % de bílis de boi, fornecendo uma proteção de mais de 10 vezes contra esta elevada dose de bilis. Foram observados resultados semelhantes com bílis de porco (Figura 9). Isto demonstra que uma preparação de qualidade alimentar comercial e seca por congelamento de bactérias de ácido lático pode ser protegida contra a bílis utilizando a colestiramina BAR.

Os dados experimentais apresentados acima mostram que as bactérias secas sensíveis à bílis recuperam rapidamente a tolerância à bílis, se reidratadas antes da exposição à bílis, e o pré-tratamento de soluções biliares com um agente sequestrante de ácido biliar previne toxicidade biliar relativamente a bactérias secas. Além disso, constata-se que a adição do agente sequestrante de ácido biliar por cima de bactérias secas previne a toxicidade biliar e a adição do agente sequestrante de ácido biliar ao excipiente antes da secagem fornece igualmente uma proteção significativa contra a toxicidade biliar em comparação com bactérias secas no excipiente convencional. As pastilhas de matriz e as cápsulas que contêm o agente sequestrante de ácido biliar mostram igualmente maior libertação de bactérias viáveis quando adicionadas a soluções biliares, em comparação com pastilhas de controlo ou cápsulas sem o agente sequestrante de ácido biliar.

Após a reidratação sem ácidos biliares, as bactérias secas mostraram recuperar a resistência à bilis muito rapidamente. Isto demonstra que as bactérias secas podem recuperar numa forma de distribuição oral no intestino através de reidratação com proteção biliar. BAR é utilizado convencionalmente para sequestrar ácidos biliares e bloquear a reabsorção, mas não se constatou anteriormente que modulasse o efeito de ácidos biliares no intestino.

Os dados apresentados acima mostram igualmente que, se as bactérias secas e os agentes aglutinantes de ácido biliar estiverem presentes em conjunto, a toxicidade dos ácidos biliares é bloqueada, isto é, os ácidos biliares não podem matar as bactérias secas na presença de agentes aglutinantes de ácido biliar. Isto mostra que as bactérias secas podem ser protegidas in vivo contra a toxicidade dos ácidos biliares.

Os dados apresentados acima mostram igualmente que, se as bactérias forem secas na presença de agentes aglutinantes de bílis, é fornecida proteção suficiente contra toxicidade biliar mesmo numa situação em que a quantidade total de ácido biliar no tubo de teste exceda bastante a capacidade total dos agentes aglutinantes de bílis presentes na formulação de bactérias secas.

Por conseguinte, os agentes sequestrantes de ácido biliar podem ser incorporados nas formulações de dose para aumentar a eficácia de distribuição de bactérias vivas ao intestino. Quando libertado no intestino através de um sistema de distribuição entérico convencional, o agente sequestrante de ácido biliar irá proteger as bactérias secas contra ácidos biliares dando tempo às bactérias para reidratarem sem toxicidade de ácido biliar, permitindo assim a recuperação de tolerância à bílis e melhorando a distribuição de bactérias vivas ao intestino. Por exemplo, uma vacina de bactérias (estirpe SL3261/pAHL) que contém um antigénio recombinante (antigénio F1 de peste num plasmídeo) (de acordo com a invenção) e uma preparação seca comercial da bactéria de ácido lático Lactococcus caseii (não de acordo com a invenção) são protegidas contra a bílis pelas formulações aqui descritas. Além disso, a presença de um revestimento entérico bem como de um agente sequestrante de ácido biliar protege formulações de dose contra a exposição sequencial ao ácido seguido por soluções biliares (ingestão simulada).

Referências [1] Bergogne-Berezin E. Int J Antimicrob Agents dezembro de 2000; 16(4):521 a 526.

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[16] A.D. Edwards, N.K. Slater Vaccine 27(29) (2009) 3897 a 3903.

[17] H.L. Bullifent et al. Vaccine 19(9 e 10) (2000) 1239 a 1245.

[18] WO2007/112747 LISBOA, 20 DE SETEMBRO DE 2017

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma formulação sólida compreendendo células de bactérias viáveis secas e um agente aglutinante de bílis para a utilização num método de imunoterapia que compreende administração oral da referida formulação a um indivíduo que necessite da mesma, em que o agente aglutinante de bílis corresponde a colestiramina e as células de bactérias viáveis correspondem a células de vacina de bactérias.
2. 2. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as células viáveis são secas aumentando o nível intracelular de dissacáridos nas células e secando as células na presença de um agente estabilizador de hidratos de carbono.
3. 3. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações compreendendo; (i) um núcleo que compreende grânulos de células de bactérias viáveis secas e grânulos de agente aglutinante de bílis seco; ou (ii) um núcleo que compreende células de bactérias secas viáveis; o referido núcleo se encontrando rodeado por uma camada compreendendo o agente aglutinante de bílis.
4. 4. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações, em que as células viáveis secas são sensíveis a lisozima.
5. 5. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com a reivindicação 4 que compreende ainda uma resina de troca catiónica.
6. 6. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações, em que as células viáveis secas compreendem ácido nucleico heterólogo.
7. 7. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o ácido nucleico heterólogo codifica um antigénio exógeno.
8. 8. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações, em que as células viáveis secas da vacina de bactérias e o agente aglutinante de bílis são encapsulados num invólucro polimérico.
9. 9. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o invólucro polimérico compreende hidroxipropilmetilcelulose.
10. 10. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações, que é coberta por um revestimento entérico.
11. 11. Uma formulação sólida para a utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a formulação compreende; um núcleo que compreende células de bactérias viáveis secas e agente aglutinante de bílis, opcionalmente em que o núcleo é encapsulado num invólucro polimérico, e; um revestimento entérico que circunda o núcleo e o invólucro polimérico opcional.
12. 12. Um método de produção de uma formulação sólida para a utilização de acordo com a reivindicação 1 compreendendo; a secagem de células de bactérias viáveis, e a mistura das células viáveis secas com um agente aglutinante de bílis e opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável para produzir uma formulação sólida; ou a mistura de células de bactérias viáveis com um agente aglutinante de bílis e opcionalmente um portador farmaceuticamente aceitável para produzir uma mistura e secagem da mistura para produzir uma formulação sólida; em que o agente aglutinante de bílis é colestiramina e as células de bactérias viáveis são células de vacina de bactérias. LISBOA, 20 DE SETEMBRO DE 2017