PT2349268E - N,n¿-dióxidos de 3,3¿,4,4¿-tetrahidroxi-2,2¿-bipiridina para o tratamento de carcinoma de células renais - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

N,N'—DIÓXIDOS DE 3,3',4,4'—TETRAHIDROXI—2,2'-BIPIRIDINA PARA O TRATAMENTO DE CARCINOMA DE CÉLULAS RENAIS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se em geral ao tratamento do cancro. Mais especificamente esta invenção refere-se à utilização de N, N'-dióxidos de 3,3', 4,4'-tetrahidroxi-2,2 bipiridina, especialmente Ν,Ν'-dióxido de 3,3', 4,4'-tetrahidroxi-2,2'-bipiridina (orelanina), para o tratamento de cancro renal, particularmente carcinoma de células renais procedente de células tubulares proximais renais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro aparece em mais de 100 diferentes formas que afetam a quase todas as partes do corpo. Durante toda a vida, as células saudáveis no corpo dividem-se, crescem e substituem-se a si mesmas de um modo controlado. O cancro resulta quando os genes que ditam esta divisão celular funcionam de maneira incorreta e as células começam a multiplicar-se e crescer fora de controlo. Uma massa ou grupo destas células anómalas denomina-se tumor. Não todos os tumores são cancerosos. Os tumores benignos, tais como pintas, deixam de crescer e não se propagam a outras partes do corpo. Sem embargo, os tumores cancerosos ou malignos, continuam crescendo e sufocam as células saudáveis, interferem com funções corporais e extraem nutrientes dos tecidos corporais. Os tumores malignos podem propagar-se a outras partes do corpo através de um processo denominado metástase. As células do "tumor mãe" desprendem-se, migram através dos vasos sanguíneos ou linfáticos ou ao 1 interior do peito, abdómen ou pélvis, dependendo do tumor, e formam eventualmente novos tumores em outra parte no corpo. 0 cancro no rim constitui aproximadamente 3% de todos os tumores sólidos. Aproximadamente 85% dos tumores renais classificam-se como carcinoma de células renais (RCC). Aproximadamente 80% dos RCC diagnosticados originam-se a partir das células epiteliais que recobrem as partes proximais dos duetos que formam a urina dos rins, os túbulos. Devido ao seu aspecto no microscópio, conhece-se este tipo de cancro ou como carcinoma de células claras renais (RCCC, 65%) ou carcinoma papilar de células renais (RPCC, 15%). Embora o RCCC e o RPCC constituam 80% dos RCC diagnosticados, são responsáveis de cerca de 100% das mortes por carcinoma de células renais. O fator mais importante na predição do prognóstico é o estádio. O estádio descreve o tamanho do cancro e como de profundamente foi propagado além do rim. O sistema de estadificação do Comité Conjunto Americano sobre o Cancro (AJCC, American Joint Committee on Câncer) conhece-se como sistema TNM. A letra T seguida por um número de desde 1 até 3 descreve o tamanho do tumor e a propagação a tecidos vizinhos. Os números de T mais altos indicam um tumor maior e/ou uma propagação mais extensiva a tecidos cerca do rim. A letra N seguida por um número de desde 0 até 2 indica se o cancro foi propagado aos gânglios linfáticos cerca do rim e, si é assim, quantos estão afetados. A letra M seguida por 0 ou 1 indica se o cancro foi propagado ou não a órgãos distantes.

Estádio I: O tumor é de 7 cm (aproximadamente 2 3/4 polegadas) ou menor, e se limita ao rim. Não há propagação a gânglios linfáticos ou órgãos distantes. 2

Estádio II: 0 tumor é maior de 7,0 cm, mas ainda limita-se ao rim. Não há propagação a gânglios linfáticos ou órgãos distantes .

Estádio III: Inclui tumores de qualquer tamanho, com ou sem propagação ao tecido gordo ao redor do rim, com ou sem propagação às veias de grande calibre que conduzem desde o rim até o coração, com propagação a um gânglio linfático próximo, mas sem propagação a gânglios linfáticos distantes ou outros órgãos. O estádio III também inclui tumores com propagação a tecido gordo ao redor do rim e/ou propagação às veias de grande calibre que conduzem desde o rim até o coração, que não foram propagados a nenhum gânglio linfático ou outros órgãos.

Estádio IV: Este estádio inclui qualquer cancro que foi propagado diretamente através do tecido gordo e o tecido similar ao ligamento da fáscia que rodeia o rim. O estádio IV também inclui qualquer cancro que foi propagado a mais de um gânglio linfático cerca do rim, a qualquer gânglio linfático não cerca do rim ou a qualquer outro órgão tal como os pulmões, osso ou cérebro.

Definições detalhadas de cancro de células renais, categorias T, N, M, e agrupações de estádio:

Tumor primário (T): TX: Não pode avaliar-se o tumor primário TO: Sem evidência de tumor primário Tl: Tumor de 7 cm ou menos, limitado ao rim T2: Tumor superior a 7 cm, limitado ao rim 3 Τ3: Ο tumor estende-se às veias principais/tecido adre-nal/perirrenal; não além da fáscia de Gerota T3a: 0 tumor invade a gordura adrenal/perirrenal T3b: 0 tumor estende-se à(s) veia(s) renal(is) ou à veia cava por debaixo do diafragma T3c: 0 tumor estende-se à veia cava por cima do diafragma T4: 0 tumor invade além da fáscia de Gerota N - Gânglios linfáticos regionais NX: Não podem avaliar-se os gânglios regionais NO: Sem metástase nos gânglios linfáticos regionais NI: Metástase num único gânglio linfático regional N2: Metástase em mais de um gânglio linfático regional M - Metástase distante MX: Não pode avaliar-se a metástase distante MO: Sem metástase distante Ml: Metástase distante

Como regra geral, o cancro em estádio I ou II trata-se mediante extirpação cirúrgica do rim afetado e o prognóstico para a recuperação é bom. Pelo contrário, os cancros renais de estádio III ou IV estão associados com taxas de supervivência muito baixas, e o Instituto Nacional do Cancro declara no seu sitio web que "praticamente nenhum paciente com cancro de células renais em estádio IV pode curar-se." 0 Instituto Nacional do Cancro estima que 49.096 novos casos de cancro renal foram diagnosticados nos E.U.A. em 2009 (16/105 cidadãos) com 11.033 mortes resultantes (3,6/105 cida- 4 dãos). Os números correspondentes para a União Europeia (2006) são 65.051 diagnósticos (7,8/105 cidadãos) e 27.326 mortes (3,3/105 cidadãos) (Observatório Europeu do Cancro: http://eu-cancer.iarc.fr/cancer-19-kidney.html,en). As estimações a nível mundial (2006) são 209.000 casos diagnosticados (3,2/105 cidadãos) e 102.000 mortes (1,6/105 cidadãos) (Gupta et al. Câncer Treat. Rev. 34, 193-205; 2008). A incidência aparentemente maior nos E.U.A. deve-se ao facto de que o NCI notifica conjuntamente o cancro da pélvis renal (que é relativamente fácil de tratar) com os carcinomas de células renais. A incidência global e taxas de mortalidade menores devem-se provavelmente, pelo menos em parte, ao baixo diagnóstico em grandes áreas do Terceiro Mundo. O principal problema com a técnica convencional é que, tal como se mencionou anteriormente, o resultado para qualquer paciente diagnosticado com cancro renal está ditado em grande medida pelo momento do diagnóstico. Se se diagnostica a doença antes que tenha sido propagado o tumor fora do rim a probabilidade de supervivência é boa, do contrário a maioria dos pacientes morre pela doença. O principal motivo para isso é que o carcinoma de células renais não responde a nenhuma terapia convencional com fármacos citostáticos e/ou citotóxi-cos, tais como cisplatina, carboplatina, docetaxel, paclita-xel, fluorouracil, capecitabina, gemcitabina, irinotecán, topotecán, etopósido, mitomicina, gefitinib, vincristina, vinblastina, doxorubicina, ciclofosfamida, celecoxib, rofeco-xib e/ou valdecoxib.

Diversas soluções descrevem-se na técnica anterior. A quimioterapia convencional contra carcinoma de células renais está contraindicada em geral devido à baixa eficácia e efeitos secundários extensivos. Portanto foram buscadas modalidades 5 de tratamento alternativo, e podem dividir-se em diversas categorias: 1) Antiangiogênese. Nesta estratégia privou-se ao tumor de nutrientes e oxigénio através da inibição de formação dos vasos sanguíneos necessários para o fornecimento ao tecido tumoral. Isso pode conseguir-se de diversas maneiras: la) inibição de fatores de crescimento circulantes, tais como VEGF, PDGF e PIGF, mediante tratamento com anticorpos dirigidos contra estes fatores de crescimento; lb) bloqueio de receptores para fatores de crescimento vascular em células-alvo com anticorpos dirigidos contra os receptores; e lc) tratamento com moléculas menores que interferem com a função do recep-tor de tal maneira que a união de um fator de crescimento vascular ao seu receptor não provoca o efeito angiogênico fisiológico. 2) Tratamento imunomodulador. Esta estratégia tenta estimular o sistema imunitário endógeno para reconhecer as células tumorais como estranhas e começar a lutar contra elas. A estimulação imunitária como tratamento contra o cancro renal segue duas rotas principais: 2a) tratamento com interleucina-2 (IL-2); e 2b) terapia com interferão-alfa (IFND).

Todas as estratégias de tratamento alternativo mencionadas anteriormente melhoram significativamente o período de vida de alguns pacientes com cancro renal num estádio avançado. Sem embargo, o efeito é da ordem de só poucos meses, e o tratamento está associado com numerosos efeitos secundários graves. Muito frequentemente o tumor adapta-se ao tratamento que então deve interromper-se. Isto vai seguido por uma taxa acelerada de crescimento tumoral. Estratégias recentes para o 6 tratamento de cancro renal foram revisadas por Garcia et al. ("Recent progress in the management of advanced renal cell carcinoma." CA Câncer. J. Clin. 57(2): 112-25 (2007)) e por Atkins et al. ("Innovations and challenges in renal cell carcinoma: summary statement from the Second Cambridge Confer-ence." Clin. Câncer. Res. 13(2 Pt 2): 667s-670s (2007)).

Uma revisão da bibliografia indica que muitos dos enfoques terapêuticos originam-se da identificação de marcadores de cancro mais ou menos específicos e a utilização destes marcadores para provocar uma resposta imunitária do hóspede dirigida contra o tecido tumoral invasor. Assim, o documento US2006134708 revela vários marcadores moleculares de cancro de rim e urotelial, concretamente IGFBP-3 (proteína 3 de união ao fator de crescimento similar a insulina), ANGPTL4 (proteína 4 similar a angiopoietina) e ceruloplasmina, assim como anticorpos monoclonais dirigidos contra ditos marcadores, com fins de diagnóstico. Descreve-se a utilização em nível de peptídeo e ácido nucleico de compostos antisentido dirigidos contra os marcadores revelados. Além disso, contempla-se a utilização de anticorpos monoclonais contra os marcadores, a conjugar-se os anticorpos com agentes citotóxicos, como forma de realização terapêutica associada com efeitos secundários menos graves dos agentes citotóxicos devido ao direcionamento proporcionado pelo anticorpo (também conhecido como conceito "panaceia"). No documento CN1359941 adota-se uma estratégia similar, baseada em diferentes antígenos associados a tumor. O documento US6403373 revela moléculas de ácido nucléico associadas com cancro de colo, renal e de estômago, cujos produtos peptídicos dão lugar à produção de anticorpo num hóspede. Contempla-se a utilização dos peptídeos num enfoque de vacina. O documento EP0160250 revela anticorpos monoclo- 7 nais para o diagnóstico de carcinoma renal e menciona a possibilidade de conjugar este com diversos agentes citotóxicos. 0 documento W02007059082 revela a aparição do antigeno TIM-1 (célula T, imunoglobulina ou domínio mucina 1), que se associa com a proliferação celular, em cancro de ovários e renal. Ensina-se a utilização de anticorpos produzidos contra TIM-1 para o tratamento de cancro de ovários e renal, assim como a conjugação de agentes terapêuticos (toxinas, radioisótopos ou agentes quimioterápicos) com ditos anticorpos como meio de destruição dirigida de células tumorais. 0 documento US6440663 revela vários genes expressados por células de cancro renal, cujos produtos conduzem à produção de anticorpos no hóspede. Descrevem-se diversos enfoques para provocar ou aumentar uma resposta imunitária no hóspede para o tecido que expressa os genes revelados, a incluir a produção de células T citotóxicas e a transfecção de células hóspede com os genes dados a conhecer ou fragmentos dos mesmos, seguido pela reintrodução de ditas células no hóspede. 0 documento US 2005261178 revela a administração conjunta de um anticorpo monoclonal (G250), dirigido contra um antigeno (anidrase carbónica IX) expressado na maioria dos cancros renais, e as citocinas interleucina-2 ou interferão-D. As citocinas administraram-se em doses inferiores que as utilizadas quando se trata só com citocinas. A estabilização da doença durante 22 semanas ou mais, ou uma “resposta objetiva", conseguiu-se em aproximadamente 30% dos pacientes num grupo que padecia cancro renal avançado.

Outros enfoques baseiam-se na utilização de substâncias terapêuticas conhecidas em regimes de novo tratamento. Por exem- pio, o documento W02007044015 revela a utilização de compostos de dimetanosulfonato conhecidos anteriormente, em particular NSC-281612, de acordo com um novo protocolo de administração com o fim de tratar o cancro renal. Quando se testa em xenoenxertos em ratos nus, a administração de NSC-281612 conduziu, em alguns casos, à erradicação aparentemente completa da massa tumoral. 0 documento JP2001288110 revela a conjugação de interferão-D com polietilenglicol (PEG) numa tentativa de aumentar a semi-vida em circulação e diminuir a dose terapeuticamente eficaz mais baixa. 0 documento RU2188026 revela um regime de poliquimioterapia com vincristina, adriamicina e depo-provera. Isto reivindica-se para aumentar o período livre de recidivas e diminuir a formação de metástase.

Finalmente, em alguns casos, a terapia sugerida baseia-se em novas substâncias originais. Assim, o documento WO2004075887 revela a utilização de 1-(2-cloroetil)-l-nitroso-3-(2-hidroxietil)urea (HECNU) para o tratamento de muitos tipos de cancro, a incluir cancro renal. A característica principal da HECNU é uma solubilidade em água melhorada em comparação com o composto correspondente conhecido anteriormente, bis-(2-cloroetil)-1-nitroso-urea (BCNU). 0 documento EP1712234 revela a utilização de derivados de 4-piridilmetil-ftalazina como inibidores do receptor de VEGF no tratamento de cancro renal, especialmente para a inibição de crescimento metastático. Encontrou-se que a administração conjunta dos derivados de 4-piridilmetil-ftalazina com qualquer uma de uma pluralidade de agentes quimioterápicos con- 9 vencionais tinha um efeito sinérgico, apesar de que as células tumorais não respondem à quimioterapia só. Além disso, associou-se a terapia de combinação com efeitos secundários visivelmente menores.

Suthpin et al. ("Targeting the Loss of the von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Gene in Renal Carcinoma Cells", Câncer. Res. 67(12), 5896-5905 (2007)) estudaram o efeito seletivo de cro-momicina A3 em cancros renais que não expressavam o gene VHL (este gene que suprime tumores está ausente em aproximadamen-te 70% de todos os cancros de células claras renais) . A cro-momicina A3 retardou significativamente o crescimento tumoral em ratos nus submetidos a xenoenxerto sem afetar ao tecido renal normal, que expressa o gene VHL. A invenção no presente documento utiliza orelanina (fórmula I), que é uma toxina renal seletiva que se produz em quantidades relativamente grandes em várias espécies de fungos da família Cortinarius. A intoxicação com orelanina após a confusão de fungos Cortinarius com cogumelos comestíveis produz-se regularmente em toda Europa, Rússia e América do Norte. Após a ingestão de fungos que contêm orelanina, há um período de poucos dias até 3 semanas sem sintomas ou só sintomas leves, similares aos da gripe. A seguinte fase, quando em geral se busca ajuda médica, caracteriza-se por uremia devido à insuficiência renal aguda. Apesar de muitas descrições de envenenamento com orelanina na bibliografia científica, não foram notificados outros efeitos da orelanina aparte da toxicidade renal recém-mencionada (Danei VC, Saviuc PF, Garon D: Main features of Cortinarius spp. poisoning: a literature review. Toxicon 39, 1053-1060 (2001).). O mais provável é que esta seletividade resida no facto de que a orelanina capta-se especif icamente por um tipo de célula, isto é, as células 10 epiteliais tubulares, particularmente as células epiteliais tubulares proximais (Prast H, Pfaller W: Toxic properties of the mushroom Cortinarius orellanus (Fries) II. Impairment of renal function in rats. Arch Toxicol 62, 89-96 (1988).). 0 mecanismo de toxina da orelanina não foi esclarecido, e não há nenhum tratamento disponível exceto diálise de manutenção enquanto se espera para ver se os rins recuperar-se-ão ou não. 0 desenlace final depende de maneira critica da quantidade de toxina inqerida, e, por regra geral, a ingestão de um fungo proporciona problemas temporais, dois fungos conduzem a perda permanente de parte da função renal enquanto que três ou mais fungos dão como resultado a perda total da função renal e necessidade para toda a vida de diálise ou terapia de substituição renal.

Os requerentes publicaram recentemente um primeiro estudo do modo de ação da orelanina em ratazanas saudáveis (Nilsson UA et al. The fungai nephrotoxin orellanine simultaneously in-creases oxidative stress and down-regulates cellular de-fenses. Free Rad. Biol. Med. 44:1562-9 (2008).). Este estudo mostra o stress oxidativo aumentado em tecido renal cortical junto com a expressão drasticamente diminuída de vários genes antioxidantes chave. Durante este trabalho descobriu-se que a especificidade aparentemente absoluta da orelanina para células epiteliais tubulares renais poderia estender-se teoricamente para abarcar estas células também depois da transformação em células cancerosas. Se se demonstra que é verdadeira, uma hipótese desse tipo significaria que a orelanina é uma arma poderosa contra o cancro renal de origem epitelial, com potencial curativo inclusive em estádios avançados e com metástase em outros tecidos. 11

Seguindo esta hipótese, descobriu-se surpreendentemente que de facto a orelanina também se captou em células de cancro renal humano e que as destruiu com grande eficácia tanto se se derivavam de um tumor primário como de tecido tumoral metastático. A morte celular avançou durante muitos dias após a exposição temporal a orelanina, o que indica que a toxina se captou ativamente e se reteve pelas células.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objeto principal da presente invenção é proporcionar um tratamento para o cancro renal originado a partir de células epiteliais, que implique administrar a um mamífero que o necessita pelo menos um composto de acordo com a fórmula I.

Fórmula I

Outros objetos da presente invenção são proporcionar um composto de acordo com a fórmula I para a sua utilização como medicamento e proporcionar um composto de fórmula I para a sua utilização no tratamento de carcinoma de células renais.

Outro objeto da presente invenção é proporcionar uma composição farmacêutica que compreenda pelo menos um composto de acordo com a fórmula I, que compreenda opcionalmente outros agentes com atividade anticancerígena, assim como portadores 12 e qualquer outro excipiente necessário para otimizar a eficácia da composição.

Ainda outro objeto é proporcionar um kit que contenha a composição anterior, em um ou mais compartimentos individuais, junto com diluentes e/ou solventes de acordo com o que seja necessário, de modo que a composição possa preparar-se facilmente para a sua utilização pela enfermeira ou médico de tratamento .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Observação da viabilidade de células de 5 carcinomas de células renais humanos diferentes (tumores primários e metástases) durante 7 dias após 24 h de exposição a orelanina 400 DM (meio de cultura 100 □g/ml). A viabilidade calcula-se dividindo o número de células vivas em amostras tratadas entre o número de células vivas em amostras controlo (n=6). A área cinza no gráfico representa o período de incubação com orelanina (24 h). Os dias seguintes cultivaram-se as células em meio de cultura completo livre de orelanina. Mudou-se o meio em cada medição de viabilidade.

Figura 2: A toxicidade da orelanina para células de carcinoma renal humano (estirpe 786-0) uma semana após a incubação com orelanina de acordo com os mesmos parâmetros que na figura 1. A micrografia da esquerda mostra células que foram expostas a veículo, e a micrografia da direita mostra células expostas a orelanina 400 □M durante 24 h. Tiraram-se ambas as fotografias com o mesmo aumento, e uma semana após a incubação com orelanina /veículo . 13

Figura 3: Efeito dose/resposta de diferentes concentrações de orelanina no meio de cultura de carcinomas de células renais humanos (786-0 e SKRC7). Observa-se uma clara correlação entre a dose de orelanina e a morte celular no intervalo de concentração 5 - 200 Dg/ml. Figura 4: Efeito da administração repetida de uma dose inferior de orelanina. A administração de uma segunda dose na extremidade inferior do intervalo de dose/resposta (20 Dg/ml) 24 h após a primeira dose conduziu a uma forte diminuição no número de células viáveis, enquanto que a administração da segunda dose às 72 h teve um efeito consideravelmente menor, mas ainda significativo. O primeiro caso é equivalente a uma exposição prolongada das células (48 h) , enquanto que no segundo caso foi deixado que as células se recuperassem no meio livre de orelanina durante dos dias entre as doses. A viabilidade mediu-se 96 h após a adição da primeira dose de orelanina.

Figura 5: Efeitos da orelanina sobre o ciclo celular em carcinoma de células renais (786-0 e SKRC-52) (imuno-transferência de tipo Western). Os níveis de proteína do inibidor do ciclo celular p21 regulam-se por incremento gradualmente com um máximo de 6 h de incubação. Após 24 h, a forma fosforilada de estimulação de ciclo celular da proteína do retinoblastoma (Rb) desapareceu (mostram-se dois sítios de fosforilação diferentes). Ambos destes efeitos convergem numa parada do ciclo celular no ponto de comprovação Gl/S. Simultaneamente, a perda do fator estimulante cdc2 detém o ciclo celular no ponto de comprovação G2/M, impedindo o início da divisão celular.

Figura 6: Indução de apoptose mediante orelanina em células de carcinoma renal (786-0): Efeitos da proteí- 14 na. Regulou-se por incremento fortemente a rota p38 apoptótica (f-p38) após exposição a orelanina (OR), e detectou-se apoptose em forma de caspase 3 clivada. A regulação por incremento forte de ERK1/2 após 24 h (f-ERK1/2) interpreta-se como uma tentativa das células por contrarrestar as influências apoptóticas da orelanina. Para ERK 1/2 e p38, devem comparar-se as razões de proteína fosforilada (f) em relação com proteína total. A caspasa 3 clivada deve comparar-se com o controlo de carga, beta-actina.

Figura 7: Indução de apoptose mediante orelanina em células de carcinoma renal (SKRC-52): efeitos de ARNm. A análise de RT-PCR da expressão de ARNm dos mediadores de apoptose PUMA, ligando Fas (FasL) e fator de necrose tumoral alfa (TNF) revelou uma regulação por incremento drástica nos três casos. Só observaram-se pequenas mudanças na expressão de ARNm receptor. Comparam-se as células com as células controlo incubadas sem orelanina .

Figura 8: Apoptose em cancro de células claras humano (SKRC52) durante a incubação com orelanina. Os sinais típicos de apoptose, vacuolização e contração celular são evidentes já após 4 h de incubação, e agravam-se adicionalmente após 24 h.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO E FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS DA MESMA A presente invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem compostos de N-óxido de piridina e Ν,Ν-dióxido de bipiridina para tratar cancro renal administrando as composições farmacêuticas a um paciente que padece ou é susceptível ao cancro renal. A invenção no presente documento também 15 inclui um kit para tratar um paciente que padece ou é suscep-tível ao cancro renal. A presente invenção proporciona o tratamento a um paciente que padece ou é susceptível ao carcinoma de células renais que compreende a etapa de administrar ao paciente um composto de acordo com a fórmula I tal como se definiu anteriormente, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma composição farmacêutica que compreende dito composto.

Os compostos de fórmula I administrados a um paciente incluem os compostos em que Rl, R2, R3 e/ou R4 não interferem substancialmente com a citotoxicidade de orelanina (Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio) . Portanto, Rl, R2, R3 e/ou R4 selecionam-se de hidrogénio, amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, alquilo Ci-Cê, alquenilo Ci-C5, alquinilo Ci-Cõ, alcanol Ci-Ce, alquenol Ci-Ce, alcoxilo Ci-C6, alquenoxilo C1-C6, cada um dos quais pode estar substituído adicionalmente com grupos que incluem, mas não se limitam a amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo. Numa forma de realização preferida da presente invenção, o composto de fórmula I é orelanina, isto é Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio.

Numa forma de realização do tratamento de acordo com a presente invenção de pacientes que padecem ou são susceptíveis ao cancro renal, o composto de fórmula I administrado ao paciente é um solvato, hidrato ou sal farmaceuticamente aceitável. Tal como se utiliza no presente documento, um sal farmaceuticamente aceitável é um sal de ácido ou base que em geral se considera na técnica que é adequado para a sua utilização em contacto com os tecidos de seres humanos ou animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica 16 ou outros problemas ou complicações. Tais sais incluem sais de ácido orgânico e mineral de resíduos básicos, tais como aminas. Sais farmacêuticos específicos incluem, mas não se limitam a, sais de ácidos tais como clorídrico, fosfórico, bromídrico, málico, glicólico, fumárico, sulfúrico, sulfámi-co, sulfanílico, fórmico, toluenosulfônico, metanosulfônico, benzenosulfônico, etanodisulfônico, 2-hidroxietilsulfônico, nítrico, benzóico, 2-acetoxibenzóico, cítrico, tartárico, láctico, esteárico, salicílico, glutâmico, ascórbico, pamoi-co, succínico, fumárico, maleico, propiónico, hidroximaleico, iodídrico, fenilacético, alcanóico tal como acético, HOOC-(CH2)n-C00H em que n é 0-4, e similares.

No tratamento de cancro renal proporcionado no presente documento, o composto de fórmula I pode administrar-se numa dose única, numa série de doses diárias ou num formato de dosagem intermitente (por exemplo, uma pluralidade de doses ou sequências de doses administradas separadas entre 1 e 30 dias, separadas entre 1 e 14 dias ou separadas entre 1 e 7 dias) . Em certo tratamento, o protocolo de administração e o composto de fórmula I selecionam-se para proporcionar pelo menos uma redução de 50% no tamanho do tumor, ou mais preferivelmente pelo menos uma redução de 75%, 90% ou 95% em tamanho do tumor após a finalização do protocolo de administração, enquanto que em certo outro tratamento, a seleção do protocolo de administração e o composto de fórmula I dão como resultado uma redução de 95% no tamanho do tumor, uma redução de 99% no tamanho do tumor ou uma eliminação substancialmente completa do tumor. Naquele tratamento que compreende um protocolo de administração de dose única, administra-se uma dose única de entre 1 mg/kg e 100 mg/kg de um composto de acordo com a fórmula (I) ou uma quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ao paciente, enquan- 17 to que uma dose única preferida compreende entre 2 mg/kg e 25 mg/kg, o mais preferivelmente entre 5 mg/kg e 15 mg/kg de um composto de fórmula I ou uma quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo administra-se ao paciente.

Em certo outro tratamento de cancro renal, um composto de fórmula I, ou um sal f armaceut icamente aceitável do mesmo administra-se ao paciente que padece ou é susceptível ao cancro renal em duas ou mais doses. Normalmente as doses admi-nistram-se diariamente ou de maneira intermitente (por exemplo, com pelo menos um dia de não administração que separa as doses sequenciais). Em certo tratamento em que o composto de fórmula I, ou um sal f armaceut icamente aceitável do mesmo administra-se numa pluralidade de doses, cada dose compreende entre 0,5 mg/kg e 10 mg/kg do composto, ou mais preferivelmente, cada dose compreende entre 1 mg/kg e 5 mg/kg, ou o mais preferivelmente 2 mg/kg do composto ou sal de fórmula I.

Em certo tratamento em que se administram doses sequenciais de maneira intermitente, as doses sequenciais administram-se separadas entre dois e sete dias, em ainda outro tratamento que compreende a administração intermitente do composto ou sal de fórmula I, o composto administra-se ao paciente em três, quatro, cinco ou seis ou mais doses e em que cada dose administra-se separada entre três e cinco dias, em ainda outro tratamento, administram-se ao paciente quatro, cinco ou seis ou mais doses administradas separadas entre três e quatro dias, em que cada dose compreende entre 1 mg/kg e 20 mg/kg de um composto de fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, preferivelmente 2-10 mg/kg e o mais preferivelmente 5 mg/kg. Em certo outro tratamento de cancro renal, administra-se ao paciente uma dose diária de um com- 18 posto de fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, durante pelo menos dois dias. As doses diárias típicas administradas a pacientes são de entre 0,1 e 10 mg/kg, preferivelmente entre 1 e 5 mg/kg, e o mais preferivelmente 2 mg/kg. Os protocolos terapêuticos compreendem normalmente a administração diária do composto de fórmula I, ou um sal far-maceuticamente aceitável do mesmo, entre 5 e 30 dias, ou preferivelmente entre 10 e 20 dias, ou da maneira mais preferível aproximadamente 14 dias.

Em certos casos, pode ser desejável realizar uma pluralidade de protocolos de administração intermitente, protocolos de administração diária ou uma combinação dos mesmos, tal como se descreveu anteriormente, em combinação com os períodos de repouso e/ou recuperação. Assim, em certos casos, pode ser desejável administrar um composto de fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com um método de administração diária ou intermitente proporcionado no presente documento, medir a resposta tumoral em relação com a terapia, e então realizar terapias de administração diária ou intermitente posteriores de acordo com o que seja necessário para eliminar ou reduzir adicionalmente o tamanho dos tumores de cancro renal. Tais estratégias de administração conhecem-se bem pelo especialista no campo de oncologia.

Numa forma de realização particularmente preferida da presente invenção um paciente que padece carcinoma de células renais trata-se com a substância de acordo com a fórmula 1 da presente invenção mediante injeções diárias de 0,5 - 5 mg de orelanina/kg de peso corporal, o mais preferivelmente 2 mg de orelanina/kg de peso corporal, durante 7-21 dias consecutivos, o mais preferivelmente 14 dias consecutivos. De uma a 5 horas após cada injeção diária de um composto de acordo com a 19 fórmula 1, da maneira mais preferível aproximadamente 2 horas após tal injeção, submete-se o paciente a hemodiálise durante 1-5 h, da maneira mais preferível aproximadamente 2 h, com o fim de eliminar qualquer composto de acordo com a fórmula 1 que foi captado no tecido tumoral e minimizar desse modo qualquer efeito secundário indesejado que poderia produzir-se no espaço extracelular.

As doses e os reqimes de doses preferidos descritos anterior-mente baseiam-se num ser humano que pesa 70 kg e que padece carcinoma de células renais com uma carga tumoral de aproximadamente 1 kg. Sem embargo, como se conhece facilmente pelo especialista no campo de medicina do cancro, tais doses preferidas e regimes de doses regem-se em grande medida pelas características do paciente tais como idade, sexo, peso, estado geral e, sobretudo, a carga tumoral do paciente individual e resposta ao tratamento. Como sempre, a última responsabilidade para eleger a dose e estratégia de tratamento apropriadas recai no médico a cargo do paciente. A invenção proporciona o tratamento de pacientes que padecem ou são susceptíveis ao carcinoma de células renais. Em certo tratamento, o tumor que vai ser tratado localiza-se em um ou ambos dos rins do paciente. Em certo outro tratamento, o carcinoma de células renais foi metastatizado, por exemplo, pelo menos um tumor de carcinoma de células renais está presente em pelo menos um tecido não de rim. Normalmente o tratamento proporcionado no presente documento é adequado em pacientes que padecem ou são susceptíveis aos tumores de carcinoma de células renais que estão presentes nos rins, em tecidos não de rim ou numa combinação dos mesmos. Numa forma de realização preferida, os tumores estão presentes em tecidos não de rim ou numa combinação de tecidos de rim e não de rim. O tra- 20 tamento proporcionado pela presente invenção contempla qualquer via de administração que possa proporcionar uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I na proximidade do tumor. Em certo tratamento preferido proporcionado no presente documento, o composto de fórmula I, ou uma composição farmacêutica que compreende o mesmo administra-se por via intravenosa, por via subcutânea ou por via intraperito-neal. Normalmente o composto de fórmula I, ou uma composição farmacêutica que compreende o mesmo administra-se por via intravenosa.

Em outro aspecto, a invenção proporciona compostos de fórmula I, em que Rl, R2, R3 e/ou R4 não interferem substancialmente com a citotoxicidade da orelanina (Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio) , para a sua utilização como medicamento. A invenção também proporciona a utilização de compostos de fórmula I, em que Rl, R2, R3 e/ou R4 não interferem substancialmente com a citotoxicidade da orelanina (Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio), como medicamento. Rl, R2, R3 e/ou R4 selecionam-se de hidrogénio, amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, alquilo Ci-C6, alquenilo C1-C6, alquini-lo Ci-C6, alcanol C1-C6, alquenol Ci-C6, alcoxilo Ci-C6, alque-noxilo C1-C6, cada um dos quais pode estar substituído adicionalmente com grupos selecionados de amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo. Numa forma de realização preferida da presente invenção, o composto de fórmula I é orelanina, isto é Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio. Outras formas de realização preferidas deste aspecto da invenção resultam evidentes a partir da descrição detalhada.

Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona compostos de fórmula I, em que Rl, R2, R3 e/ou R4 não interferem substancialmente com a citotoxicidade da orelanina (Rl = R2 = R3 = 21 R4 = hidrogénio), para a sua utilização no tratamento de carcinoma de células renais. A invenção também proporciona a utilização de compostos de fórmula I, em que Rl, R2, R3 e/ou R4 não interferem substancialmente com a citotoxicidade da orelanina (Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio), para o fabrico de um medicamento para o tratamento de carcinoma de células renais. Rl, R2, R3 e/ou R4 selecionam-se de hidrogénio, ami-no, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, alquilo Ci-Cç, alquenilo C1-C6, alquinilo Ci-Ce, alcanol Ci-C6, alquenol C1-C6, alcoxilo C1-C6, alquenoxilo Ci-Ce, cada um dos quais pode estar substituído adicionalmente com grupos selecionados de amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo. Numa forma de realização preferida da presente invenção, o composto de fórmula I é orelanina, isto é Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio. Outras formas de realização preferidas deste aspecto da invenção resultam evidentes a partir da descrição detalhada.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um portador farmaceutica-mente aceitável e um composto de acordo com a fórmula (I), em que Rl, R2, R3 e/ou R4 não interferem substancialmente com a citotoxicidade da orelanina (Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio). Assim, Rl, R2, R3 e/ou R4 são hidrogénio, amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, alquilo Ci-C6, alquenilo Ci-C6, alquinilo Ci-C6, alcanol Ci-C6, alquenol Ci-C6, alcoxilo Ci-C6, alquenoxilo Ci-C6, cada um dos quais pode estar substituído adicionalmente com grupos selecionados de amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo. Numa forma de realização preferida da presente invenção, o composto de fórmula I é orelanina, isto é Rl = R2 = R3 = R4 = hidrogénio. 22

Em certas outras composições farmacêuticas, o composto de fórmula I incorpora-se na composição como solvato, hidrato ou sal farmaceuticamente aceitável. Tal como se utiliza no presente documento, um sal farmaceuticamente aceitável é um sal de ácido ou base que em geral se considera na técnica que é adequado para a sua utilização em contacto com os tecidos de seres humanos ou animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação. Tais sais incluem sais de ácido orgânico e mineral de resíduos básicos tais como aminas. Os sais farmacêuticos específicos incluem, mas não se limitam a, sais de ácidos tais como clorídrico, fosfórico, bromídrico, málico, glicólico, fumárico, sulfúrico, sulfámico, sulfanílico, fórmico, toluenosulfônico, metanosulfônico, benzenosulfônico, etanodisulfônico, 2-hidroxietilsulfônico, nítrico, benzóico, 2-acetoxibenzóico, cítrico, tartárico, láctico, esteárico, salicílico, glutâmi-co, ascórbico, pamoico, succinico, fumárico, maleico, propió-nico, hidroximaleico, iodídrico, fenilacético, alcanóico tal como acético, HOOC-(CH2)n-COOH em que n é 0-4.

As composições farmacêuticas proporcionadas pela presente invenção são adequadas para a sua utilização em qualquer via de administração contemplada pelo tratamento em que se usarão as composições. Os compostos da invenção de acordo com a fórmula I e as composições farmacêuticas dos mesmos podem admi-nistrar-se a um sujeito por uma variedade de vias a incluir parenteral (a incluir intravenosa, subcutânea, intramuscular e intradérmica), tópica (a incluir bucal, sublingual), oral, nasal. Em certas composições farmacêuticas preferidas proporcionadas no presente documento, a composição farmacêutica formula-se para a administração mediante injeção intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal. Normalmente a composição far- 23 macêutica formula-se para a administração mediante injeção intravenosa.

Em certas vias de administração parenteral, a composição farmacêutica é uma solução salina estéril que compreende entre 0,1 mg/ml e 25 mg/ml do composto de fórmula I ou um sal far-maceuticamente aceitável do mesmo. Certas composições farmacêuticas preferidas para administração parenteral compreendem entre 0,5 mg/ml e 10 mg/ml do composto de fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo numa solução salina que compreende opcionalmente um ou mais aditivos farmaceuticamente aceitáveis.

Em certas composições farmacêuticas preferidas, a composição compreende entre 25 mg e 5000 mg ou entre 5 mg e 250 0 mg do composto de acordo com a fórmula (I) ou uma quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em certas, outras composições farmacêuticas da invenção, a composição compreende entre 1 mg e 1500 mg do composto de acordo com a fórmula (I) ou uma quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Ainda outras composições farmacêuticas formulam-se para compreender 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg ou 100 mg de um composto de fórmula I ou uma quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Em certo tratamento do paciente que padece ou é susceptível ao cancro, a administração do composto de acordo com a fórmula I a um paciente que padece ou é susceptível ao cancro reduz o tamanho do tumor em pelo menos 50% ou mais preferivelmente em pelo menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90% ou aproximadamente 95%. Em certo outro tratamento do paciente que padece cancro, a administração do composto de acordo com a fórmula I a um paciente que padece cancro reduz o tamanho do tumor em pelo menos 99% ou reduz o tamanho do tumor até que não quede tumor detectável.

Certos tratamentos preferidos de pacientes que padecem cancro incluem tratamento ou prevenção de cancro ou outros transtornos tumorais em pacientes mamíferos a incluir gado, animais de companhia (cães, gatos, cavalos e similares), primatas e seres humanos. 0 tratamento da invenção inclui em geral a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos de fórmula I. No presente tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para reduzir o tamanho dos tumores de carcinoma de células renais presentes num paciente ou para eliminar tumores do paciente. Os pacientes adequados incluem os sujeitos que padecem um transtorno ou doença identificado/a no presente documento. Os pacientes típicos para o tratamento de acordo com a invenção incluem mamíferos, particularmente primatas, especialmente seres humanos. Outros sujeitos adequados incluem animais de companhia domesticados tais como um cão, gato, cavalo e similares, ou um animal de gado tal como gado bovino, porco, ovelha . 0 tratamento preferido da invenção inclui identificar e/ou selecionar um sujeito (por exemplo, mamífero, particularmente ser humano) que padece um estado revelado no presente documento, particularmente um sujeito que padece um ou mais cancros. Uma composição farmacêutica da invenção também pode estar embalada junto com instruções (isto é por escrito, tal como uma folha escrita) para o tratamento de um cancro tal 25 como se revela no presente documento, por exemplo, instrução para o tratamento de um sujeito que padece cancro.

Os compostos da invenção administram-se de maneira adequada a um sujeito numa forma solúvel em água, por exemplo, como sal farmaceuticamente aceitável de um ácido orgânico ou inorgânico, por exemplo, cloridrato, sulfato, hemisulfato, fosfato, nitrato, acetato, oxalato, citrato, maleato, mesilato, etc. obtido após a transformação química apropriada. Além disso, quando um grupo ácido está presente no composto, pode empre-gar-se um sal farmaceuticamente aceitável de uma base orgânica ou inorgânica, tal como um sal de amónio, ou sal de uma amina orgânica, ou um sal de um metal alcalino ou metal alcalino terroso tal como um sal de potássio, cálcio ou sódio. Especificamente os sais farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem os formados com um catião não tóxico, preferivelmente um catião de metal alcalino tal como K ou Na, um catião de metal alcalino terroso tal como Mg ou Ca, outro catião de metal não tóxico tal como AI ou Zn ou um catião de metaloide não tóxico tais como NH4 + , piperazinio ou 2-hidroxietilamonio. Certos compostos preferidos adequados para a sua utilização nos métodos da invenção são suficientemente solúveis em água em forma neutra de tal maneira que podem administrar-se sem geração prévia de um sal farmaceuticamente aceitável.

Para os compostos que contêm um ou mais centros estereogêni-cos, por exemplo, compostos quirais, o tratamento da invenção pode levar-se a cabo com um composto enantiomericamente enriquecido, um racemato ou uma mistura de diastereómeros. Os compostos enantiomericamente enriquecidos preferidos têm um excesso enantiomérico de 50% ou mais, mais preferivelmente o composto tem um excesso enantiomérico de 60%, 70%, 80%, 90%, 26 95%, 98% ou 99% ou mais. Os compostos da invenção de acordo com a fórmula I para a sua utilização nos métodos da invenção podem empregar-se, ou sozinhos ou em combinação com um ou mais de outros agentes terapêuticos, como uma composição farmacêutica em mistura com excipientes convencionais, isto é, substâncias portadoras orgânicas ou inorgânicas farmaceutica-mente aceitáveis adequadas para uma via de administração desejada que não reaja de maneira prejudicial com os compostos ativos e não são prejudiciais para o receptor das mesmas. Os portadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não se limitam a água, soluções salinas, álcool, óleos vegetais, polietilenglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silicico, parafina viscosa, óleo de perfume, monoglicerideos e diglicerideos de ácido graxo, ésteres de ácido graxo de petroetral, hidroximetilce-lulose, polivinilpirrolidona. As preparações farmacêuticas podem esterilizar-se e se se deseja misturar-se com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabi-lizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sais para influenciar na pressão osmótica, tampões, colorantes, aroma-tizantes e/ou substâncias aromáticas e similares que não reagem de maneira prejudicial com os compostos ativos.

Para aplicação parenteral, são particularmente adequadas soluções, preferivelmente soluções aquosas ou oleosas assim como suspensões, emulsões ou implantes, a incluir supositórios. Ampolas são dosagens unitárias convenientes.

Para a aplicação enteral, são particularmente adequados comprimidos, comprimidos recobertos de açúcar ou cápsulas que têm talco e/ou aglutinante portador de carboidrato ou similares, sendo o portador preferivelmente lactose e/ou amido de milho e/ou amido de batata. Pode utilizar-se um xarope, eli- 27 xir ou similar em que se emprega um veiculo edulcorado. Podem formular-se composições de libertação sustentada, a incluir aquelas em que o componente ativo se protege com recobrimen-tos degradáveis de maneira diferenciada, por exemplo, mediante microencapsulamento, recobrimentos múltiplos. Comprimidos, cápsulas e xaropes ou outros fluidos preferem-se em geral para a administração oral.

Deve entender-se que além dos componentes mencionados ante-riormente de maneira explicita as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica em relação com o tipo de formulação em questão, por exemplo, os adequados para a administração oral podem incluir agentes aromatizantes.

De acordo com certas formas de realização, um composto de fórmula I pode administrar-se em combinação com outros compostos, a incluir, por exemplo, agentes quimioterápicos, agentes anti-inflamatórios, agentes antipiréticos, agentes radiosensibilizantes, agentes radioprotetores, agentes uroló-gicos, agentes antieméticos e/ou agentes antidiarreicos, por exemplo, cisplatina, carboplatina, docetaxel, paclitaxel, fluorouracil, capecitabina, gemcitabina, irinotecán, topote-cán, etopósido, mitomicina, gefitinib, vincristina, vinblas-tina, doxorubicina, ciclofosfamida, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, ibuprofeno, naproxeno, ketoprofeno, dexametasona, prednisona, prednisolona, hidrocortisona, acetaminofeno, misonidazol, amifostina, tamsulosina, fenazopiridina, ondan-setrón, granisetrón, alosetrón, palonosetrón, prometazina, proclorperazina, trimetobenzamida, aprepitant, difenoxilato com atropina e/ou loperamida. Numa forma de realização preferida o composto de acordo com a fórmula I administra-se em combinação com fármacos antiangiogênicos, a incluir, por 28 exemplo, anticorpos monoclonais dirigidos contra o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento placentário (PIGF); e inibidores dos receptores de VEGF e PIGF, a incluir, por exemplo, bevacizumab, sorafenib, PTK78, SU11248, AG13736, AEE788 e ZD6474. Em outra forma de realização o composto de acordo com a fórmula I administra-se em combinação com fármacos imunomoduladores, a incluir, por exemplo, interleucina-2 (IL-2) e interferão-alfa (IFND). Ainda em outra forma de realização o composto de acordo com a fórmula I administra-se em combinação com fármacos que interferem com a sinalização de crescimento celular, a incluir, por exemplo, inibidores do alvo de mamífero de rapamicina (mTOR).

Ainda em outras formas de realização da presente invenção os compostos de acordo com a fórmula I unem-se quimicamente a moléculas que potenciam a seletividade alvo inclusive direcionando os compostos de fórmula I especificamente a células cancerosas. Os exemplos de tais moléculas incluem (A) anticorpos monoclonais e policlonais dirigidos contra marcadores que se produzem especificamente ou em números maiores nas células-alvo em comparação com o tecido renal normal, e (B) ligandos a receptores que se produzem especificamente ou em números maiores nas células-alvo em comparação com o tecido renal normal. Tais moléculas de orientação, e técnicas para conjugá-las com os compostos de acordo com a fórmula I, conhecem-se na técnica, e as reações de acoplamento podem realizar-se pelo especialista sem experimentação excessiva. 0 kit da invenção no presente documento compreende pelo menos um portador farmaceuticamente aceitável e de 50 a 3.500 mg de um composto de acordo com a fórmula I, ou a quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, 29 tal como se comentou anteriormente. No kit o composto de acordo com a fórmula I ou sal aceitável do mesmo e o portador farmaceuticamente aceitável localizam-se preferivelmente em compartimentos separados. 0 composto de acordo com a fórmula I está presente preferivelmente como sólido. Para a administração, o composto de acordo com a fórmula I ou sal farmaceu-ticamente aceitável do mesmo combina-se preferivelmente com o portador de modo que se dissolva completa ou substancialmente no portador. 0 kit pode compreender entre 100 mg e 1.500 mg, e o mais preferivelmente entre 200 mg e 500 mg, do composto de acordo com a fórmula I ou uma quantidade equivalente do sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

EXEMPLOS

Exemplo 1; Extração e isolamento de orelanina a partir de cogumelos Cortinarius. A. Método polar: Pulverizaram-se 2 g de cogumelo Cortinarius seco e então se extraíram com metanol a 50% durante 24 h a 25°C. Centrifugou-se a mistura e retirou-se o sobrenadante até um volume final de 5 ml. Após a adição repetida de 5 vol de metanol frio, formou-se um precipitado que se descartou até que se formou uma solução transparente. Evaporou-se o solvente, dissolveu-se o resíduo em água e eliminaram-se substâncias apoiares mediante extração com éter de petróleo. Carregou-se a fase polar numa coluna Sephadex e eluiu-se com etanol a 50%. Cromatografiaram-se as frações resultantes em celulose de camada fina, eluindo com butanol:ácido acéti-corágua (3:1:1). Identificou-se a orelanina como uma banda fluorescente a Rf 0,68. 30 B. Método apoiar: Submeteram-se a refluxo 4 g de cogumelo Cortinarius em polvo durante 24 h em dietil éter e descartou-se o solvente. Submeteu-se a refluxo o resíduo em metanol seguido por evaporação de solvente e lavado com 20 ml de água (6 h, 4°C). Dissolveram-se então em etanol aquoso a 50% (pH 7,0). Carregou-se a mistura numa coluna Sephadex e eluiu-se com etanol a 50%. Cromatografiaram-se as frações resultantes em celulose de camada fina, eluindo com butanol:ácido acéti-cotágua (3:1:1). Identificou-se a orelanina como uma banda fluorescente a Rf 0,68.

Exemplo 2: Síntese de orelanina

Sintetizou-se orelanina a partir de 3-hidroxipiridina comercialmente disponível essencialmente tal como se descreve por outros. (Tiecco M, Tingoli M, Testaferri L, Chianelli D e Wenkert E: Total synthesis of orellanine, the lethal toxin of Cortinarius orellanus Fries Mushroom. Tetrahedron 42, 1475- 1485 (1986))

Exemplo 3: A orelanina tem um efeito tóxico específico sobre células de carcinoma de células renais humano in vitro.

Antecedentes e metodologia.

Cultivaram-se células recolhidas de 5 carcinomas de células renais humanos diferentes (SKRC-52, 786-0, SKRC-17, SKRC-7 e SKRC-21), que representam tanto crescimentos de tumores mãe como metastáticos, em condições convencionais. Quando estavam aproximadamente a 70% de confluência e em crescimento rápido, expuseram-se as células a um meio que continha orelanina (400 DM) durante 24 h. Mudou-se então de novo o meio a meio 31 completo regular e observaram-se as células durante outros seis dias.

Resultados e comentários. 0 efeito do tratamento com orelanina descrito das células ilustra-se na figura 1. Resulta evidente a partir da figura que a orelanina era altamente tóxica para todos os tipos celulares testados. Além disso, a toxicidade não se viu afetada pela retirada da orelanina do meio de cultura após a exposição inicial. Isto sugere que a orelanina se acumula nas células e permanece nas mesmas inclusive quando não há orelanina extracelular presente. A figura 2 mostra o aspecto das células antes e uma semana depois de 24 h de exposição a orelanina .

Exemplo 4: Efeito dose-resposta da orelanina

Antecedentes e metodologia

Cultivaram-se células recolhidas de 2 carcinomas de células renais humanos diferentes (SKRC-7, 786-0), que representam tanto tumores mãe como crescimentos metastáticos, em condições convencionais. Quando estavam aproximadamente a 70% de confluência e em crescimento rápido, expuseram-se as células a um meio que continha diferentes concentrações de orelanina (400 DM) durante 24 h. Mudou-se então de novo o meio a meio completo regular e observaram-se as células durante outros seis dias.

Resultados e comentários 32

Tal como se observa na figura 3, há uma correlação clara entre a concentração de exposição e a fração de células que morrem. 0 intervalo de dose-resposta durante uma única exposição de 24 h de orelanina está entre aproximadamente 5 Dg/ml e 200 Dg/Ι.

Exemplo 5: Efeitos da administração repetida de doses menores de orelanina

Antecedentes e metodologia

Cultivaram-se células recolhidas do carcinoma de células renais humano 786-0 em condições convencionais. Quando estavam aproximadamente a 70% de confluência e em crescimento rápido, expuseram-se as células a meio que continha uma concentração baixa de orelanina (20 Dg/ml) durante 24 h. Mudou-se então o meio a meio novo que contém ou 20 Dg/ml de orelanina durante 24 h (barra do meio) ou de novo a meio completo regular durante 48 h, seguido por outras 24 h em presença de 20 Dg/ml de orelanina (barra mais à direita).

Resultados e comentários A exposição repetida a orelanina, inclusive em dose no limite inferior do intervalo de resposta a uma única exposição, produziu efeitos tóxicos notáveis adicionais sobre células de cancro renal.

Exemplo 6: Efeitos da orelanina sobre outros tipos celulares

Antecedentes e metodologia 33

Cultivaram-se linhas celulares e células primárias procedentes de numerosos tecidos humanos (epitélio tubular, podócitos e células mesangiais de tecido renal, fibroblastos, macrófa-gos, endotélio aórtico, endotélio microvascular e endotélio do cordão umbilical, epitélio intestinal (duodenal, jejunal, ileal e colônico) e condrócitos) em condições convencionais. Quando estavam aproximadamente a 70% de confluência e em crescimento estável, expuseram-se as células durante 24 h a meio que continha orelanina em concentrações selecionadas com o fim de conseguir uma resposta à dose. Mudou-se então de novo o meio a meio completo regular e observaram-se as células durante outros seis dias, seguido por determinação da viabilidade. Para compensar qualquer efeito de retardo do crescimento provocado por diluição do meio de cultura pelo grande volume de solução de orelanina adicionado, complementaram-se todas as células com volumes iguais de tampão de orelanina.

Resultados e comentários

Nenhum dos tipos celulares testados apresentou nenhum efeito sobre a viabilidade quando se expuseram a orelanina de acordo com o exemplo 4 em concentrações de até 1.000 Dg/ml que foi a concentração alcançável mais alta.

Exemplo 7: A orelanina induz a detenção do crescimento paran-do o ciclo celular.

Antecedentes e metodologia

Trataram-se células de cancro renal, cultivadas essencialmente tal como se descreve no exemplo 3, com orelanina (meio de cultura 100 Dg/ml) durante 24 h. Durante este período reco- 34 lheram-se as células após 0, 2, 6 e 24 h de exposição. Realizaram-se imunotransferências de tipo Western no material recolhido com anticorpos dirigidos contra A) o inibidor de cinase p21, B) proteína do retinoblastoma fosforilada (um fator estimulante do crescimento), e C) a proteína cdc2 que permite que a célula avance à fase M do ciclo celular quando a célula se divide.

Resultados e comentários

Mostram-se os efeitos da exposição a orelanina sobre a expressão de proteína de p21, a proteína do retinoblastoma e cdc2 na figura 5. Os níveis intracelulares do inibidor do ciclo celular p21 aumentam com um máximo ao redor das 6 h, enquanto que as formas fosforiladas estimulantes do ciclo celular da proteína do retinoblastoma estão completamente ausentes na medição às 24 h. De um modo similar, a proteína cdc2, que permite que a célula entre na fase de divisão celular, está regulada por diminuição drasticamente às 24 h. Isto indica claramente que a orelanina tem um efeito inibidor profundo sobre o ciclo celular, que se exerce em pelo menos dois pontos de comprovação importantes.

Exemplo 8: A orelanina aumenta a atividade de várias rotas que induzem apoptose, provocando morte de células cancerosas.

Antecedentes e metodologia

Cultivaram-se células de cancro renal e expuseram-se a orelanina de acordo com o exemplo 7 e recolheram-se em diversos momentos até 24 h. O sistema p38 MAPK, o sistema p53, ligando Fas, fator de necrose tumoral (TNF) alfa e caspase clivada 3 são fatores clave nas rotas apoptóticas que conduzem à morte 35 celular. Utilizou-se imunotransferência de tipo Western para determinar os niveis intracelulares de A) p38, B) caspase clivada 3, e C) o fator proliferativo fosforilado ERK 1/2. Utilizou-se PCR quantitativa para determinar a expressão de ARNm de D) modulador de apoptose regulado por incremento por p53 (PUMA) que media praticamente em todos os efeitos apoptó-ticos da rota de p53, E) ligando Fas e F) TNF.

Resultados e comentários

Resumem-se os resultados nas figuras 6-8. Produziu-se um aumento constante de p38 (ativada) fosforilada durante todo o período de observação de 24 h, aumentando a intensidade do sinal apoptótico na célula (figura 6). (A regulação por incremento simultânea da ERK 1/2 fosforilada do estimulador do crescimento interpreta-se pelos inventores como um tentativa das células por "superar" a influência apoptótica da orelanina.)

Em nivel de ARNm, a regulação por incremento extrema de PUMA e os ligandos FasL e TNF de receptor de morte constitui um forte estímulo apoptótico (figura 7). Finalmente, a quantidade de caspase clivada 3, um efetor principal da apoptose, aumentou drasticamente 24 h após a exposição a orelanina (figura 6) .

Junto com as imagens de células cada vez mais apoptóticas apresentadas na figura 8, os resultados anteriores indicam claramente que a apoptose é o modo principal de ação de orelanina em células de cancro renal.

Exemplo 9: A orelanina erradica carcinomas de células renais humanos que crescem em ratazanas atímicas. 36

Antecedentes e metodologia

Utilizam-se ratazanas deficientes em células T, atímicas (RNU, Charles River Laboratories, FRG) como sistema para o crescimento in vivo de carcinomas de células renais humanos. A ausência de uma defensa imunitária baseada em células T nestes animais os faz tolerantes a xenoenxertos. Uma semana após a chegada às instalações de animais 10 animais recebem uma dose de irradiação X de 5 Gy com o fim de suprimir também a sua resposta mediada por células B.

Ao dia seguinte, equipam-se todos os animais com um cateter permanente para diálise peritoneal (DP) . O tratamento com DP substituirá a função renal que se perde como efeito secundário após a administração de orelanina.

Um dia depois, inoculam-se 5 animais por via subcutânea na região do ombro com aproximadamente 10 x 106 células de carcinoma renal humano (SKRC-52). Os 5 animais restantes recebem a mesma quantidade de células mediante injeção intravenosa. No grupo subcutâneo podem palpar-se tumores localizados, 1 x 1x2 cm, sob a pele dos animais após 2-4 semanas. Neste ponto se injeta i.p. a 2 animais (controlos) em cada grupo solução salina fisiológica e os 3 animais restantes recebem 10 mg de orelanina/kg de peso corporal i.p.

Resultados e comentários

Duas semanas após a primeira injeção de solução sali-na/orelanina, os tumores dos animais controlo no grupo subcutâneo têm aproximadamente o dobro de tamanho, enquanto que os tumores nos animais aos que se injetou orelanina foram reduzidos até menos de 25% do seu tamanho registado no momento da 37 injeção. Neste ponto injeta-se outra dose de 5 mg de orelani-na/kg de peso corporal no sítio tumoral dos 3 animais no grupo subcutâneo que recebeu previamente orelanina, e os animais controlo recebem 10 mg de orelanina/kg de peso corporal no sítio tumoral. Após outras 2 semanas não havia sinais evidentes dos tumores nos animais aos que se injetaram duas vezes orelanina, e o tamanho do tumor nos animais anteriormente controlo se reduz em mais de 75%.

Uma e duas semanas após a primeira injeção de solução sali-na/orelanina, os 5 animais no grupo intravenoso receberam injeções i.v. de 5 mg/kg de orelanina ou solução salina, res-pectivamente. Outra semana depois, os animais sacrificam-se e examinam-se as suas cavidades abdominais e torácicas para observar o crescimento tumoral. A estimação da massa tumoral mostra que os animais tratados com orelanina têm menos de 10% da carga tumoral dos animais controlo.

Isto demonstra claramente a atividade de destruição tumoral da orelanina num sistema in vivo.

Exemplo 10: Segurança de orelanina i.v. durante um tratamento em longo prazo em porcos e cães.

Preparam-se 5 porcos da raça de miniporcos Gõttingen e 5 cães mestiços (peso corporal 10-15 kg) para hemodiálise utilizando um equipamento desenhado para crianças e lactantes. Os animais recebem doses iniciais de 10 mg de orelanina/kg de peso corporal 24 h depois e os animais submetem-se a uma sessão de diálise de aproximadamente 3 h. Após a diálise, injetam-se aos animais 5 mg de orelanina/kg de peso corporal. O procedimento de diálise/reinjeção repete-se 3 vezes à semana (segunda-feira, quarta-feira, sexta-feira) durante 8 semanas. Uma 38 vez à semana faz-se uma valoração do estado geral dos animais. Ao final da experiência sacrificam-se todos os animais, e tomam-se espécimes para a avaliação histopatológica de coração, pulmão, rim, figado, baço, intestino delgado, intestino grosso, cérebro, músculo e pele. 0 comportamento e estado geral dos animais permanecem normais durante todo o período experimental. 0 exame histopatológico não revela dano ao tecido com a exceção dos rins em que há dano tubular estendido que conduz a insuficiência renal completa .

Os resultados mostram que o tratamento em longo prazo com doses altas de orelanina é seguro desde o ponto de vista do paciente com cancro renal, com efeitos secundários insignificantes em tecido não renal.

Exemplo 11: Tratamento de um paciente humano, que padece carcinoma de células renais avançado, com orelanina A um paciente que necessita tratamento para um carcinoma renal proporcionam-se a ele uma série de 10 injeções intravenosas diárias de orelanina. Determina-se que a carga tumoral inicial do paciente é de aproximadamente 2 kg. Baseando-se neste valor, determina-se que a dose diária apropriada é de 280 mg (4 mg/kg a um peso corporal de 70 kg) . Antes da primeira injeção, prepara-se ao paciente para a hemodiálise ou diálise peritoneal já que o tratamento com orelanina destruirá de maneira inevitável o tecido epitelial renal saudável junto com a destruição das células cancerosas, deixando, portanto o paciente sem função renal. Duas horas após cada injeção, inicia-se a hemodiálise e mantém-se durante 2 horas. Este procedimento, com administração repetida de quantidades 39 menores de orelanina, tem o benefício de realizar uma acumulação gradual de orelanina até níveis letais no tecido tumo-ral, que capta ativamente a substância, enquanto que as concentrações extracelulares da toxina mantêm-se por abaixo dos níveis que poderiam provocar efeitos secundários. Opcionalmente, se a doença é unilateral, o rim não afetado pode extirpar-se cirurgicamente e conservar-se durante o tratamento, e tentar-se o seu reimplante após a conclusão do tratamento. A evolução do paciente monitoriza-se durante um mês, após o qual se proporcionam administrações em série adicionais de orelanina de acordo com o que seja necessário para inibir o crescimento do carcinoma renal. Durante o tratamento, a massa do tecido tumoral no paciente diminui, e à conclusão do tratamento o cancro renal está completamente erradicado, demonstrando a eficácia da orelanina contra o carcinoma de células claras renais. 25-03-2013 40

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto, de acordo com a fórmula (I):

   caracterizado por Ri, R2, R3 e/ou R4 selecionarem-se do grupo que consiste em hidrogénio, amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, alquilo Ci-C6, alquenilo C1-C6, alquinilo Ci-C6, alcanol C1-C6, alquenol C1-C6, alcoxilo Ci-C6, alquenoxilo Ci-C6, cada um dos quais de alquilo Ci-Cô, alquenilo Ci-Cê, alquinilo Ci-Cô, alcanol Ci-C6, alquenol Ci-C6, alcoxilo C1-C6, alquenoxilo Ci-C6 pode estar substituído adicionalmente com restos selecionados do grupo que consiste em amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, ou a quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a sua utilização como medicamento.
2. 2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, para a sua utilização como medicamento, caracterizado por Ri, R2, R3 e R4 serem hidrogénio.
3. 3. Composto, de acordo com a fórmula (I): 1

   caracterizado por Ri, R2, R3 e/ou R4 selecionarem-se do grupo que consiste em hidrogénio, amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, alquilo Ci-C6, alquenilo Ci-C6, alquinilo Ci-C6, alcanol Ci-C6, alquenol Ci-Cê, alcoxilo Ci-C6, alquenoxilo Ci-Cê, cada um dos quais de alquilo Ci-Cê, alquenilo Ci-C6, alquinilo Ci-C6, alcanol Ci-C6, alquenol Ci-C6, alcoxilo Ci-C6, alquenoxilo Ci-C6 pode estar substituído adicionalmente com restos selecionados do grupo que consiste em amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, ou a quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a sua utilização no tratamento de carcinoma de células renais.
4. 4. Composto para a sua utilização, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por Ri, R2, R3 e R4 serem hidrogénio.
5. 5. Composto para a sua utilização, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o tratamento de carcinoma de células renais incluir a administração do composto como uma dose única de 1 mg/kg a 100 mg/kg.
6. 6. Composto para a sua utilização, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o tratamento de carcinoma de células renais incluir a administração do composto em duas ou 2 mais doses, a compreender cada dose entre 1 mg/kg e 20 mg/kg do composto.
7. 7. Composto para a sua utilização, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o tratamento de carcinoma de células renais incluir a administração do composto em doses sequenciais separadas entre dois e sete dias.
8. 8. Composto para a sua utilização, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o tratamento de carcinoma de células renais incluir administração diária do composto.
9. 9. Composição farmacêutica gue compreende pelo menos um portador farmaceuticamente aceitável e de 50 mg a 3.500 mg de um composto, de acordo com a fórmula (I):

   caracterizada por Ri, R2, R3 e/ou R4 selecionarem-se do grupo que consiste em hidrogénio, amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, alquilo Ci-C6, alquenilo Ci-Cê, alquinilo Ci-C6, alcanol Ci-Cê, alquenol Ci-Cê, alcoxilo Ci-Cê, alquenoxilo Ci-Cê, cada um dos quais de alquilo Ci-C6, alquenilo Ci-Cê, alquinilo Ci-Cê, alcanol Ci-Cê, alquenol Ci-C6, alcoxilo Ci-Cê, alquenoxilo Ci-Cê pode estar substituído adicionalmente com restos selecionados do grupo que consiste em amino, mercapto, carbo- 3 xilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, ou a quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
10. 10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por Ri, R2, R3 e R4 serem hidrogénio.
11. 11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada por o composto ser um sal farmaceuti-camente aceitável.
12. 12. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-11, caracterizada por a composição formular-se para a administração intravenosa, subcutânea ou intraperi-toneal a um paciente.
13. 13. Kit para a sua utilização para tratar um paciente que padece ou é susceptivel ao carcinoma de células renais, que compreende pelo menos um portador farmaceuticamente aceitável e de 50 mg a 3.500 mg de um composto, de acordo com a fórmula I:

    caracterizado por Ri, R2, R3 e/ou R4 selecionarem-se do grupo que consiste em hidrogénio, amino, mercapto, carboxilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, alquilo Ci-C6, alquenilo Ci-C6, 4 alquenol Ci-C6, alcoxilo Ci-C6, alquinilo Ci-Cç, alcanol Ci-C6, alquenoxilo Ci-C6, cada um dos quais de alquilo Ci-C6, alquenilo Ci-C6, alquinilo C1-C6, alcanol C1-C6, alquenol C1-C6, alcoxilo C1-C6, alquenoxilo Ci-Cê, pode estar substituído adicionalmente com restos selecionados do grupo que consiste em amino, mercapto, carbo-xilo, fosfato e halo, a incluir flúor, cloro e bromo, ou a quantidade molar equivalente de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
14. 14. Kit para a sua utilização, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o composto de acordo com a fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e o portador farmaceuticamente aceitável combinarem-se, em relação com a administração, de tal maneira que o composto de acordo com a fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, dissolve-se completa ou substancialmente no portador.
15. 15. Kit para a sua utilização, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por o composto formular-se para a administração intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal a um paciente. 25-03-2013 5