TWI504391B - 誘發腫瘤缺氧於癌症治療上之用途 - Google Patents

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Description

誘發腫瘤缺氧於癌症治療上之用途
本發明大抵關於增加低氧活化之生物還原劑殺死固體腫瘤內之腫瘤細胞的能力之組成物和方法。特定言之，本發明提供於腫瘤內或含有腫瘤之區域內創造局部低氧區之方法和組成物，藉以增進於該局部區域內低氧活化之生物還原劑的活化及殺死腫瘤細胞。
腫瘤生長需要發展新血管形成網絡以供應氧和營養素並排除毒性代謝物。腫瘤內之新血管與正常血管系統極為不同(1,2)。腫瘤新血管於結構和功能上係異常、紊亂且不適的，且某些數據建議相對於正常組織中微管蛋白和肌動蛋白皆作為細胞骨架，腫瘤血管可能較依賴微管蛋白作為細胞骨架支撐(3)。標靶腫瘤血管已經發展成供開發新穎癌症治療劑之有用策略方法(4)。現今使用兩種方法以標靶腫瘤血管。一種方法係藉由阻斷多種血管生成因子或彼等之受體以妨礙血管生成過程，藉此防止新血管生成。此類治療劑之代表係癌思停(bevacizumab，即一種拮抗血管內皮細胞生長因子(VEGF)之單株抗體)及蕾莎瓦(sorafenib)或紓癌特(sunitinib)(此兩種藥物係VEGF受體酪胺酸激酶之小分子抑制劑)(4-8)。
標靶腫瘤血管之第二種策略方法係直接殺死腫瘤內現存之內皮細胞。此類化合物被稱為血管破壞劑(VDA)(9,10)。該血管破壞劑之目標係殺死現存腫瘤血管之內皮細胞以阻止腫瘤得到充分之血液供應，進而導致腫瘤局部缺血及最終腫瘤壞死。此類治療劑之代表係數種小分子，其包括康普立停(combretastatin)A4(CA4)、ZD6126、AVE8062、Oxi4503及1,2-二苯乙烯(stilbene)衍生物(9-13)。該等小分子係藉由干擾秋水仙素部位之微管聚合以殺死腫瘤內皮細胞。數種秋水仙素部位之微管抑制劑現今正發展成VDA。
誘發腫瘤低氧及發展補償反應
藉由抗血管生成劑和血管破壞劑，此等腫瘤血管標靶劑之主要目標係剝奪腫瘤細胞得到血管支援，致使腫瘤呈現低氧狀態並隨後壞死。因此，腫瘤發展呈低氧狀態係誘發腫瘤細胞死亡之關鍵要求。然而，腫瘤低氧並不足以誘發細胞死亡，因為低氧狀態下之腫瘤細胞能發展出各種不同之低氧反應，諸如低氧誘發因子1-α(HIF 1-α)之安定化(14,15)，該HIF 1-α能誘導糖酵解之多種酶的產製，該等酶使腫瘤細胞能於低氧之環境下存活，或促進諸如VEGF和其他血管生成因子之生成以誘發新血管生成。氧化氮(NO)係腫瘤細胞於低氧狀態下所產製之另一因子，能引起血管擴張並因此改善腫瘤之血液供應(16,17)。NO與血管生成亦有密切關連性(18,19)。因此，此等補償機轉可導致拮抗抗血管生成劑和血管破壞劑之抗藥性。
增進治療功效之策略
有數種可能之策略可增進標靶腫瘤血管系統之治療功效。一種策略係結合藥劑與慣常之化療，該策略係目前與抗血管生成劑併用之一般策略。癌思停(即一種拮抗血管內皮細胞生長因數之單株抗體)係典型地與化療結合使用以治療結腸直腸癌、非小細胞肺癌及乳癌。多種血管破壞劑現今正對各種不同之固體腫瘤進行第二期試驗，但是迄今未有一種血管破壞劑已獲美國藥物管理局(FDA)許可。一種新穎之策略係結合抗血管生成劑與血管破壞劑。此種結合係基於觀察到血管破壞劑會引起血管內皮細胞生長因子量之升高，該血管內皮細胞生長因子隨後動員骨髓內皮原始細胞進入血液循環並因此負責修復損壞之腫瘤血管(20)。使用血管內皮細胞生長因子之抑制劑可能阻斷該動員並增進治療功效(11,20)，但是此種策略尚未於臨床環境下被證實。
替拉扎明(tirapazamine；SR4233；3-胺基-1,2,4-苯並三嗪-1,4-二-N-氧化物)係一種生物還原劑，其僅能於低氧環境下有效且亦已經測試作為一種抗癌劑(21)。替拉扎明係經由單電子反應被細胞色素P450還原酶活化，因而產生氧化氮自由基。在氧不存在下，氧化氮自由基引起DNA之單股和雙股斷裂，進而致使細胞死亡。因為此一特性，替拉扎明對低氧細胞比對經充分供氧之細胞顯現高15至200倍之毒性。替拉扎明亦已被證明係一種輻射致敏劑且於癌症治療法中與鉑化合物協同作用(22,23)。
替拉扎明之作用機轉
替拉扎明作用之假定機轉係如下圖所示(24-28)。經由酶(其包括細胞色素P-450、NADH-細胞色素P-450還原酶及其他黃素蛋白或金屬蛋白)之還原性活化作用進行替拉扎明之單電子還原反應。該單電子轉移反應之產物係自由基(式I或II)，該自由基可被氧氧化以生成超氧化物和該原藥物替拉扎明。另一種可能是該自由基(式I或II)可透過除去氫反應之中間產物(III)獲得第二個電子以生成安定之單-N-氧化物(SR4317)。此等分歧之結果導致替拉扎明於低氧環境下之選擇性代謝作用。該自大分子獲得第二個電子被提議係對低氧細胞致死傷害之原因。另一個可能之途徑係自中間產物II釋出羥基以直接生成SR4317，該SR4317可進一步於類似之反應中被代謝成為SR4330。
在所有器官中，肝係代謝替拉扎明最為重要之器官。Costa et al.利用經培養之大鼠肝細胞以檢驗替拉扎明之毒性，該大鼠肝細胞被短暫地培育於氧濃度為1%、2%、4%、10%及20%之低氧環境下(29)。當氧濃度降低時，替拉扎明對單層肝細胞之劑量反應曲線顯著地移向左邊，表示更多肝細胞容易死亡(P<0.05)。於4%氧濃度下經2小時致使50%細胞死亡之替拉扎明濃度比於10%或20%氧濃度下所需之替拉扎明濃度低10倍以上。於2%氧濃度下導致50%細胞死亡所需之替拉扎明濃度比於20%氧濃度下致使相同程度之細胞死亡所需之替拉扎明濃度低15倍。當氧濃度進一步降低至1%時，導致50%細胞死亡所需之替拉扎明濃度比於20%氧濃度下所需之替拉扎明濃度低50倍。此等結果顯示與於20%正常氧環境下相比較，替拉扎明於2%和1%氧濃度下之功效分別增強15倍及50倍。
替拉扎明於臨床前和臨床上之發展
替拉扎明於臨床前和臨床上皆已有顯著進展。替拉扎明之動物研究顯示，替拉扎明之可能副作用包括骨髓毒性、嗅覺神經壞死及視網膜退化(21)。藉由每3週靜脈內注射替拉扎明之第I期臨床研究顯示最大耐受劑量(MTD)達390 mg/m2 ，且當劑量超過330 mg/m2 時，劑量限制性毒性包括可逆性耳毒性和暫時性視覺異常(30,31)。其他非特異性毒性包括肌肉痛性痙攣、噁心、嘔吐及腹瀉。於一位接受劑量450 mg/m2 之病患身上觀察到第一級血小板減少症，但未於任何病患身上觀察到白血球減少症(30)。
已對肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、黑色素瘤及頭頸癌進行替拉扎明之第II期研究並獲致良好之結果(32-35)。在第IV階段非小細胞肺癌之第III期隨機研究中，367位病患被隨機地分配接受碳鉑、紫杉醇及替拉扎明(第1週期260 mg/m2 ，且若第1週期可耐受，則於第2至6週期增加至330 mg/m2 )(n=181)或碳鉑、紫杉醇及安慰劑(n=186)。不幸地，結果係令人失望的，因為接受替拉扎明之組並未顯現於反應比率、整體存活率或無進展存活率上之優異性。相反地還觀察到全身性毒性增加(諸如腹部疼痛性痙攣、疲勞、暫時性聽力喪失、發熱伴隨嗜中性白血球減少症、低血壓、肌痛及皮疹)且全身性毒性導致許多病患退出該研究(36)。經期中分析後，該試驗提早被中止，該期中分析顯示出存活率上將不會達到預期37.5%改善之程度。另一大型子宮頸癌的第III期隨機研究正在進行，其中病患接受順鉑和放射線及替拉扎明或順鉑和放射線(即不含替拉扎明)，但目前尚未得到結果。
現今需要改良的癌症治療方法。使用和改進已知道的癌症療法，使他們的效果更好以及減少副作用到最小，將可以造福更多的患者。
 發明簡述
本發明係基於方法和組成物之開發，該方法和組成物能增加低氧活化之生物還原劑(HABA)的抗腫瘤活性並同時減少因全身性投服該藥劑所可能發生之副作用或使其減至最小。於氧之存在下，HABA係不具活性之前藥；HABA僅在低氧條件下被活化。本發明之投藥策略涉及於活化HABA所欲之局部區域內(例如腫瘤內或含有腫瘤之區域內)誘發低氧狀態。當HABA亦存在於該局部低氧區域時，該HABA被活化並顯現殺死該區域內之細胞(例如腫瘤細胞)的功效且未對該生物體顯現有害之全身性作用。
業已發展實施此技術之兩種一般方法。第1種方法係在血管之直接機械性閉合(即栓塞)之前或同時給予該生物還原劑。栓塞可被局限於一個經隔離之標靶區域，致使該經隔離之標靶區域發展成低氧狀態並因而活化HABA。第2種方法係對腫瘤投遞HABA與一或多種低氧誘發劑(諸如血管破壞劑和抗血管生成劑)之組合。相對於利用機械性栓塞以進行血管之直接物理性閉合，因該方法使用血管破壞劑和抗血管生成劑(即化學藥劑)以達成血管閉合之目的，該等低氧誘發劑亦可被視為係“化學栓塞作用”劑。然而，為清楚起見，標準栓塞劑(例如碘化油Lipiodol)將被視為係僅於實施機械性栓塞時所使用之栓塞劑，反之經給藥後但未直接產生機械性栓塞之藥劑，而是經由藥物作用殺死血管內皮細胞，再導致血管阻塞(例如血管破壞劑和抗血管生成劑)可被稱為“低氧誘發劑”。(於某些具體範例中，於機械性栓塞作用期間亦可選擇地給予低氧誘發劑。)如同機械性栓塞般，局部或系統性給予藥劑(諸如血管破壞劑和抗血管生成劑)及HABA係於腫瘤內選擇性地創造一個局部之低氧環境，其中HABA被活化並殺死周遭之腫瘤細胞，但是該HABA將會以非活化之前藥型式全身性地殘留於非低氧區。因此，可避免有害之副作用。於本發明之某些較佳體系中，結合該等方法，例如給予或實施抗血管生成劑及/或血管破壞劑及/或直接機械性栓塞並同時提供HABA，使得藉由此等方法所誘發之選擇性低氧區可導致HABA之活化。此等發明之技術的整體功效係迅速、有效且協同地破壞局部區域內之腫瘤細胞，且無廣泛地全身性有害之副作用。
本發明之目標係使用各種不同之方法以於腫瘤之隔離區域或該腫瘤之周遭區域誘發低氧。該等方法包括個別地使用栓塞、血管破壞劑或抗血管生成劑或彼等之組合。該等方法係與給予HABA結合，該HABA僅限於低氧區被活化以致使腫瘤細胞死亡。全身性毒性作用亦將會最小以得到最大之益處。
因此，本發明提供一種選擇性殺死動物體內之腫瘤細胞之方法。該方法包含下述之步驟：1)對該動物提供低氧活化之生物還原劑HABA，及2)於腫瘤內或於含有一或多種腫瘤之界定區域內局部形成10%氧或低於10%氧之低氧區。該低氧活化之生物還原劑被活化以殺死該低氧區之腫瘤或界定區域內之腫瘤細胞。於一具體範例中，藉由對該動物提供血管破壞劑和抗血管生成劑中之一或多者(即一或多種血管破壞劑或一或多種抗血管生成劑、或一或多種血管破壞劑和一或多種抗血管生成劑之組合)以達成局部形成低氧區之步驟。於某些具體範例中，對該動物提供該血管破壞劑和抗血管生成劑中之一或多者之步驟係經由全身性實施。於其他具體範例中，對該動物提供該血管破壞劑和抗血管生成劑中之一或多者之步驟係於該區域內局部實施。再卞於其他具體範例中，於提供該低氧活化之生物還原劑的步驟之後實施局部形成該低氧區之步驟。或者可於提供該低氧活化之生物還原劑的步驟同時實施局部形成該低氧區之步驟。於本發明之某些具體範例中，該局部形成步驟使用一或多種血管破壞劑，該等血管破壞劑選自康普立停(combretastatin)、康普立停衍生物、(5S)-5-(乙醯胺基)-9,10,11-三甲氧基-6,7-二氫-5H-二苯並[a,c]環庚烯-3-基磷酸二氫酯(ZD6126)、DMXAA(5,6-二甲基呫噸酮-4-乙酸)、(N-[2-[4-羥基苯基]胺基]-3-吡啶基)-4-甲氧基苯磺醯胺(E7010或ABT-751)、1,2-二苯乙烯(stilbene)衍生物(諸如順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)和順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-羥基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯6c)或彼等之衍生物)或1,2-二苯乙烯5c之前藥N-嗎啉基-胺甲酸酯衍生物。於該相同或其他較佳體系中，該局部形成步驟使用一或多種抗血管生成劑，該等抗血管生成劑選自癌思停(bevacizumab)、蕾莎瓦(sorafenib)、紓癌特(sunitinib)、阿柏西普(aflibercept)、IMC-1C11、瓦他拉尼(vatalanib；PTK-87)、N-(2,3-二氫-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)胺基]-3-吡啶羧醯胺(AMG 706)、3-(4-溴-2,6-二氟-苄氧基)-5-[3-(4-吡咯啶-1-基-丁基)-脲基]-異噻唑-4-羧酸醯胺(CP-547,632)、帕唑帕尼(pazopanib；GW-786034)、N-(4-(3-胺基-1H-吲唑-4-基)苯基)-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲(ABT-869)或西地尼布(cediranib；AXD-2171)。於某些較佳體系中，該低氧活化之生物還原劑係替拉扎明，且該局部形成步驟包括使用順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)之步驟。再於其他具體範例中，該局部形成步驟包括使用癌思停。當給予血管破壞劑和抗血管生成劑兩者時，該局部形成步驟可包括先給予一或多種血管破壞劑並隨後再給予一或多種抗血管生成劑之步驟。
於本發明之其他具體範例中，該局部形成低氧區之步驟係藉由栓塞實施。栓塞可包括給予一或多種栓塞劑之步驟。於某些具體範例中，該給予栓塞劑之步驟係於該局部形成步驟之前實施。於其他具體範例中，該給予栓塞劑之步驟係與該局部形成步驟同時實施。於本發明之該具體範例中，該低氧活化之生物還原劑可為替拉扎明、班諾沙酮(banoxantrone；AQ4N)、N-甲基絲裂黴素、阿帕茲喹酮(apaziquone；EO9)、1,2-雙(甲基磺醯基)-1-(2-氯乙基)-2-[[1-(4-硝基苯基)乙氧基]羰基]肼(KS119)、二硝基苯醯胺芥子衍生物(諸如PR104)或4-[3-(2-硝基-1-咪唑基)-丙基胺基]-7-氯喹啉氫氯化物(NLCQ-1,NSC709257)。
於本發明之某些具體範例中，該區域係位於該動物之肝。於本發明之某些具體範例中，該低氧區中之氧量係5%或低於5%。於本發明之某些具體範例中，該提供低氧區之步驟係經局部實施，然而於其他具體範例中，該提供低氧區之步驟係經全身性實施。
本發明亦包含一種供選擇性殺死動物體內的腫瘤細胞之組成物或套組。該組成物或套組包含1)替拉扎明，和2)抗血管生成劑和血管破壞劑中之一或多者。該抗血管生成劑和血管破壞劑中之一或多者係選自癌思停、蕾莎瓦、紓癌特、阿柏西普、IMC-1C11、瓦他拉尼(PTK-87)、N-(2,3-二氫-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)胺基]-3-吡啶羧醯胺(AMG 706)、3-(4-溴-2,6-二氟-苄氧基)-5-[3-(4-吡咯啶-1-基-丁基)-脲基]-異噻唑-4-羧酸醯胺(CP-547,632)、帕唑帕尼(GW-786034)、N-(4-(3-胺基-1H-吲唑-4-基)苯基)-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲(ABT-869)、西地尼布(AXD-2171)、康普立停、康普立停衍生物、(5S)-5-(乙醯胺基)-9,10,11-三甲氧基-6,7-二氫-5H-二苯並[a,c]環庚烯-3-基磷酸二氫酯(ZD6126)、DMXAA(5,6-二甲基呫噸酮-4-乙酸)、(N-[2-[4-羥基苯基]胺基]-3-吡啶基)-4-甲氧基苯磺醯胺(E7010或ABT-751)、1,2-二苯乙烯衍生物(諸如順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)和順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-羥基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯6c)或彼等之衍生物)或1,2-二苯乙烯5c之前藥N-嗎啉基-胺甲酸酯衍生物。於一較佳體系中，該抗血管生成劑和血管破壞劑中之一或多者包括順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)。於另一具體範例中，該抗血管生成劑和血管破壞劑中之一或多者包括癌思停。
發明詳細說明
本發明提供新穎之協同治療組合以殺死固體腫瘤癌細胞及使用該新穎之治療組合以治療惡性或癌性固體腫瘤之方法。該新穎組合能局部增加低氧活化之生物還原劑(HABA；諸如替拉扎明)之抗腫瘤活性並同時減少因全身性給予HABA所造成之副作用或使其達最小。在氧存在下，該生物還原劑係不具有活性之前藥且係於低氧狀態下方被轉化為活性型式。依據本發明，該生物還原劑之活性型式可被有效地被局限於所欲之作用區域，例如於腫瘤內或於包括一或多種腫瘤之界定區域內。本發明業已開發兩種一般方法，該兩種方法皆涉及創造一個局部低氧區，使得該生物還原劑於該局部低氧區內被活化。第一種方法涉及造成供應標靶區域之一或多條血管經由機械性栓塞，而達成該機械性栓塞通常係經放射科醫師於靜脈內置入導管以給予能機械性阻塞血管之栓塞劑。第2種方法係局部或系統性給予一或多種低氧誘發劑(諸如血管破壞劑及/或抗血管生成劑)以創造一個局部低氧區，且在該局部低氧區內活化同時給予之HABA。本發明亦預期有此等方法之各種不同的組合(例如結合栓塞作用與一或多種低氧誘發劑)以達成整體功效、局部提供經活化之生物還原劑及有效殺死標靶部位內之腫瘤細胞且未產生通常因全身性曝露於生物還原劑下所引起之副作用。此種增強效果亦可允許使用較低劑量之生物還原劑，並同時維持殺死腫瘤細胞的效力，而全身性的副作用也將減到最小。
“低氧區(域)”意指區域內之氧濃度係至少低於約10%且較佳地低於約5%。例如，低氧區之氧濃度可為約10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%。通常，氧濃度約10%或低於10%(較佳地約5%或低於5%)可足以活化低氧活化之生物還原劑(諸如替拉扎明)至至少比其前藥型式之活性大10倍以上的程度。熟習此技藝之人士習知如何測量生物系統中之氧濃度且亦知道氧測量可以“毫米汞柱(mmHg)”表示，其中例如10%氧係等於76 mmHg且1%氧係等於7.6 mmHg。
熟習此技藝之人士當能認知數種低氧活化之生物還原劑可用於本發明，該等低氧活化之生物還原劑的實例包括但不限於替拉扎明、班諾沙酮(AQ4N)、N-甲基絲裂黴素、阿帕茲喹酮(EO9)、1,2-雙(甲基磺醯基)-1-(2-氯乙基)-2-[[1-(4-硝基苯基)乙氧基]羰基]肼(KS119)、二硝基苯醯胺芥子衍生物(諸如PR104)及4-[3-(2-硝基-1-咪唑基)-丙基胺基]-7-氯喹啉氫氯化物(NLCQ-1,NSC709257)(37-39)。
“增強”或“增加”低氧活化之生物還原劑的活性意指當給予定量之低氧活化之生物還原劑至固體腫瘤或含有固體腫瘤之區域時，若給藥係依據本發明所描述之方法實施(即藉由本發明所描述之方法於腫瘤內或含有該腫瘤之區域內產生一個低氧區)，則該固體腫瘤內之腫瘤細胞死亡的程度，會大於當相同量之低氧活化之生物還原劑被投遞至固體腫瘤或含有固體腫瘤之區域但未依本發明所描述之方法產生一個低氧區時該固體腫瘤內之腫瘤細胞死亡的程度。通常活性增加至少約10倍或大於10倍，例如約20-200倍、或約50-200倍或100-200倍。
於本發明之一具體範例中，實施本發明係使用典型且臨床上最有進展之生物還原劑替拉扎明或彼之一或多個衍生物。替拉扎明迄今在臨床發展上尚未成功。在第I和II期試驗中，替拉扎明本身之耐受劑量可達390 mg/m2 。詳細檢驗失敗之第III期臨床試驗顯示替拉扎明係與化學治療劑(例如碳鉑和紫杉醇)結合增強化學治療的毒性(36)。過去的假設是欲治療之腫瘤具有灌流良好區和灌流不佳區，而傳統之化療(碳鉑/紫杉醇)係作用於灌流良好區，而替拉扎明對灌流不佳之低氧區顯現細胞毒性作用。然而，鉑化合物與替拉扎明間的協同增強作用在有氧和缺
氧環境裡都有(36)，雖然該作用對低氧細胞較為明顯，但因為完全不知真正投遞至每個病患之低氧腫瘤的藥物量，該試驗使接受治療的病患經由全身性給藥接受非必要之替拉扎明，進而通常導致全身性毒性。該試驗亦採取增加替拉扎明之劑量至接近其最大耐受劑量之量的標準方法，因此造成許多非特異性毒性之問題，諸如嗜中性白血球減少症、低血壓、疲勞、神經病變，聽力喪失等。分佈到全身性的化學治療與替拉扎明之組合解釋了此種組合所增強的全身性副作用。
考慮上述之結果，且基於相較於對充分有氧之細胞，替拉扎明對低氧細胞顯現增高約15至200倍細胞毒性之活性的事實，本發明提供能改善替拉扎明之功效，並同時減小已知的有害副作用的新穎方法。
栓塞
“栓塞”意指一種對經由可確認之動脈分枝供應血流的腫瘤或含有腫瘤之區域(例如經由肝動脈供應血流之肝細胞腫瘤)藉由注射藥物(碘化油Lipiodol、膠泡綿(gelfoam)或血塊等)以引起供應該含有腫瘤之區域血流的動脈分枝閉塞之局部治療，使得該腫瘤細胞不能得到足夠之血流而壞死。該區域和環繞正常器官或組織之血液供應的解剖決定了該部位的器官或組織是否因閉塞後缺乏血液供應而遭受顯著之損傷。例如，正常肝臟係由雙重血管(肝動脈和門靜脈)供應血流，因此閉塞肝動脈或彼之分枝並未對正常肝臟造成顯著之損傷。此栓塞通常係由介入性放射科醫師實施，該放射科醫師自腹股溝之股動脈置入導管並於螢光鏡X射線之導引下將該導管之尖端推進至供應腫瘤血流之肝動脈分枝處。一旦藉由注射顯影劑以確認供應腫瘤血流之動脈分枝後，則藉由注射栓塞劑(諸如碘化油Lipiodol或膠泡綿)以使該分枝閉塞。此方法係治療肝細胞腫瘤之標準局部區域治療法(40-43)。
於本發明之一具體範例中，令低氧活化之生物還原劑(HABA)(諸如替拉扎明)與栓塞結合以治療局部區域內之腫瘤。這種方法的有三個理論依據。首先，栓塞提供低氧的腫瘤環境以增進替拉扎明之功效。其次，栓塞同時投服之替拉扎明可限制替拉扎明分佈於被栓塞血管所供應之區域。第三，因為栓塞所引起之低氧效果僅限於被栓塞之血管所供應的組織，未引起全身性低氧，因此避免了被活化之替拉扎明所造成之全身性毒性。於本發明之此方面的一具體範例中，替拉扎明係混合或溶解於慣用於化學標準栓塞之藥劑(諸如碘化油Lipiodol)中。共同投服此兩種藥劑之結果係替拉扎明與該栓塞劑(諸如碘化油Lipiodol)局限於腫瘤內。而造成被活化之替拉扎明持續釋出至低氧腫瘤內並因而產生細胞毒性的功效。一旦替拉扎明自栓塞區釋出，替拉扎明可於肝臟內被迅速代謝且失去活性。因此，替拉扎明之全身性毒性可減至最小。此種獨特之組合因此充分利用替拉扎明之殺死細胞能力的顯著優勢且完全去除先前之臨床研究所觀察到的全身性毒性之問題(36)，而在先前之臨床研究中替拉扎明係與慣用之化學治療劑經靜脈內注射。
碘化油Lipiodol係最常使用之栓塞劑。其他可用於實施本發明之其他栓塞劑包括，但不限於，膠泡綿、血塊、奈米粒子或可達成血管閉塞目的之任何臨床上經證明的栓塞劑。可以用任何適當之方式來投服栓塞劑和低氧活化之生物還原劑(HABA)。例如，可在投服栓塞劑之前(例如之前約1至120分鐘)投服HABA，且隨後投服栓塞劑係使HABA“局限”於該區域內。另一種可能，該兩種藥劑可一起投服(例如使用包括該兩種藥劑之混合物的製劑)。通常，對藉由此方法進行治療之病患而言，HABA(例如替拉扎明)之投服劑量將介於約1至約200 mg(較理想地約5至約50 mg)之間；並且將被投服之栓塞劑(例如碘化油Lipiodol)的劑量係介於約5至40 ml(較理想地約20至30 ml)之間。投服足量之栓塞劑要能達到於透視X光檢查下所欲之血管分枝的完全閉塞，藉以確保於栓塞區域內創造低氧區或低氧環境。通常藉由動脈內注射以投服栓塞劑。或者，實施栓塞可藉由其他引起閉塞之方法(諸如使用小顆粒)。
可藉由此方法治療之癌症類型包括可於體內許多位置發生且可經由栓塞隔離之任何癌症，例如肝細胞腫瘤、膽管癌及自大腸或其他胃腸器官之轉移癌。此方法可用於可藉由栓塞治療之任何癌症或可用於位於體內可經栓塞但不會過度地傷害病患之區域內的任何腫瘤，諸如肢體肉瘤。特定地，此技術係用於治療肝細胞腫瘤，因為此類癌症通常地係經栓塞治療。亦共同地投服化學治療劑，稱為化學栓塞(chemoembolization)，其中同時投服化學治療劑和栓塞劑以使化學治療劑完全局限在栓塞區域內，藉以使全身性毒性減至最小並增進治療功效。再者，於多數情況下，機械性栓塞並不持久，且藉由適當選擇栓塞劑可控制血管閉塞之時間，進而允許被活化之HABA作用一段時間以實行殺死腫瘤之功效並隨後當該區域之血流恢復時藉由對該區域輸入氧以使HABA失去活性。對殺死腫瘤細胞而言，機械性栓塞與投服HABA之效果具有協同增效作用，因為藉由此種組合治療所造成之殺死腫瘤細胞的數量係大於基於該等個別方法單獨使用時所能預期的總和，即該效果並非僅是加成性。
利用例如替拉扎明和栓塞或化學栓塞以治療肝細胞腫瘤具有數個優點。在所有的惡性腫瘤中，當替拉扎明係經由肝動脈注射投服且併用栓塞時，替拉扎明特別適用於治療肝細胞腫瘤或初期肝癌。原因之一是替拉扎明需要P450以進行活化，而P450於肝臟中含量豐富。其次，替拉扎明係於低氧條件下作用，而該低氧條件係由肝動脈之栓塞所引起。替拉扎明局限於肝臟內並隨後被緩慢釋出至肝細胞腫瘤。多餘的替拉扎明將於肝臟內被迅速代謝，因而避免波及至其他正常器官並使全身性毒性減至最小。此外，若與血管破壞劑(VDA)結合(如下所述)，VDA對腫瘤血管之相對專一性會對栓塞作用之增強效果亦有助於使全身性毒性減至最小。
低氧活化之生物還原劑(HABA)與血管破壞劑(VDA)之組合
於本發明之其他具體範例中，同時使用低氧活化之生物還原劑和能誘發低氧之血管破壞劑。可用於實施本發明之血管破壞劑包括但不限於康普立停衍生物(9)、(5S)-5-(乙醯胺基)-9,10,11-三甲氧基-6,7-二氫-5H-二苯並[a,c]環庚烯-3-基磷酸二氫酯(ZD6126)(44)、DMXAA(5,6-二甲基呫噸酮-4-乙酸)(9)、(N-[2-[4-羥基苯基]胺基]-3-吡啶基)-4-甲氧基苯磺醯胺(E7010或ABT-751)(45)及1,2-二苯乙烯(stilbene)衍生物(諸如順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)和順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-羥基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯6c)或彼等之衍生物和前藥(N-嗎啉基-胺甲酸酯衍生物)，該等係描述於例如Lee,et al.之美國專利申請案號11/738,813中，該文件之全部內容係併入本文作為參考)。該等化合物即使經全身性投服能選擇性地於腫瘤內誘發深度低氧(20)。投服血管破壞劑可被視為一種化學栓塞之類型，且相對於上述之標準栓塞中直接閉塞血管，該化學栓塞係使用化學劑以於含有腫瘤之區域內達到選擇性栓塞之相同目標。考量VDA和低氧活化之生物還原劑個別單獨之活性，VDA和低氧活化之生物還原劑(諸如替拉扎明)之組合於治療固體惡性腫瘤上係令人驚訝地比所預期的更為有效，即彼等之活性具有協同增效(該等藥劑組合之殺死腫瘤的功效係大於個別藥劑單獨之功效的算術總和)。例如，在替拉扎明之後給予VDA會使替拉扎明活化並增加隨後之腫瘤細胞殺死功效比該個別藥劑單獨使用之腫瘤細胞殺死功效高至少10倍或10倍以上。此方法亦可與先前描述之栓塞組合使用，以更有效地誘發腫瘤低氧和替拉扎明活化。
“協同(增效)”交互作用或功效意指一起投服兩種(或多種)藥劑或治療形式之功效係大於個別藥劑單獨使用之功效所能預期的簡單加成功效。換言之，該等藥劑以若干方式進行交互作用，該交互作用增加整體功效至所觀察到者超出所能預期者。例如，對固體腫瘤單獨投服替拉扎明典型上致使約10至20%之腫瘤細胞死亡。對固體腫瘤單獨投服VDA典型上亦致使約10至20%之腫瘤細胞死亡。然而，當該二者一起被投服時，腫瘤細胞殺死量幾乎可達70至80%，此數量係大於替拉扎明單獨和VDA單獨所能達到之兩個腫瘤細胞殺死量的簡單算術總和。若作用係加成性，則所預期之最大功效係約20至40%。因此，該70至80%之腫瘤細胞殺死量係若無協同增效作用下所能預期之最大腫瘤細胞殺死量的至少約2至4倍。依據本發明，當藉由1)栓塞、2)投服抗血管生成劑或3)投服VDA或該前述三者之二或多種的某些組合以創造局部低氧區之同時投服HABA時，觀察到協同增效。協同增效通常比所預期者高至少約2至5倍(例如2、3、4或5倍)且甚至可更高(例如6至10倍或更高倍)。
觀察到之協同增效的代表性實例係示於實例5(圖5)，其中替拉扎明或1,2-二苯乙烯5c(一種VDA)單獨使用可誘發10至20%腫瘤壞死；然而，替拉扎明與1,2-二苯乙烯5c之組合誘發腫瘤壞死增加至70至80%。壞死之分佈主要位於腫瘤之中心，這符合腫瘤壞死係由於抑制腫瘤血流並誘發低氧的觀念，因為邊緣區之腫瘤可自周圍的正常組織經擴散作用得到一些氧供應。
Masunaga等人曾研究替拉扎明與ZD6126之組合(46)。然而，Masunaga等人所描述之投藥順序係與本文所描述者不同。Masunaga等人先對小鼠藉由腹膜內注射給予ZD6126，並之後在1和24小時給予替拉扎明。下述實例所提供之證據證實VDA可造成被給藥之腫瘤血管立即關閉(例如於數分鐘內)。因此，在ZD6126之後給予替拉扎明係一種不正確之投藥順序，因為一旦腫瘤血流被ZD6126所抑制，替拉扎明將不會被投遞至腫瘤處。相反地，替拉扎明應在投服VDA之前被投遞至腫瘤處以使替拉扎明被分佈於腫瘤內。可能的是，因未能投遞替拉扎明至腫瘤處之故，Masunaga等人所描述之相反的投藥順序顯著地減少治療功效。在此相反順序下，當投服ZD6126後腫瘤血流被選擇性抑制時，替拉扎明將主要分佈於非腫瘤之組織，此不僅損害替拉扎明之治療功效且亦潛在地增加全身性毒性。因此，與Masunaga等人所描述之方法相比較，本發明之方法提供如下述實例和圖3所揭示之主要優點，其中在投服VDA後數分鐘內可抑制腫瘤血流並形成缺氧。
於本發明之該具體範例中，將被投服之HABA劑量用替拉扎明經全身性投服時，將介於約100至約300 mg/m2 ，且較佳地是介於約150至約250 mg/m2 ，將被投服之VDA劑量將介於約10至約100 mg/m2 ，且較佳地是介於約50至約100 mg/m2 ，這係取決於臨床試驗中被證實能有效地抑制腫瘤血流之劑量。被投服之VDA量係足以導致該區域內之氧濃度降低至低於約10%或較佳地低於約5%，該氧濃度能增強HABA之活性達至少10倍。
投服VDA之方法包括但不局限於靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、動脈內、直接腫瘤內注射及口服投藥。
低氧活化之生物還原劑(HABA)與抗血管生成劑(AAA)之結合
再於本發明之另一具體範例中，一或多種HABA係與AAA(例如血管內皮細胞生長因子(VEGF)單株抗體(諸如癌思停)或VEGF受體酪胺酸激酶抑制劑(諸如蕾莎瓦或紓癌特))結合。共同投服係藉由延長腫瘤低氧之期間而引起AAA與HABA於功效上之協同增效並進一步提高HABA之治療功效。
可用於實施本發明之AAA包括但不限於癌思停、蕾莎瓦、紓癌特、阿柏西普、IMC-1C11、瓦他拉尼(PTK-87)、N-(2,3-二氫-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)胺基]-3-吡啶羧醯胺(AMG 706)、3-(4-溴-2,6-二氟-苄氧基)-5-[3-(4-吡咯啶-1-基-丁基)-脲基]-異噻唑-4-羧酸醯胺(CP-547,632)、帕唑帕尼(GW-786034)、N-(4-(3-胺基-1H-吲唑-4-基)苯基)-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲(ABT-869)及西地尼布(AXD-2171)(47)。
於本發明之具體範例中，將被投服之HABA劑量用替拉扎明經全身性投服時，將介於約100至約300 mg/m2 ，且較佳地介於約150至約250 mg/m2 ，將被投服之AAA劑量對癌思停而言將介於約5至15 mg/m2 ，對蕾莎瓦而言將為每天口服兩次約200至400 mg。對其他藥物而言，劑量可依據所使用之藥物的功效而加以改變。被投服之AAA量係足以導致該區域內之氧濃度降低至低於約10%或較佳地低於約5%，即創造一個低氧區。
施用誘發腫瘤低氧之AAA且併用HABA有兩個關鍵因素。第一個因素係AAA之半衰期。單株抗體(諸如癌思停)之半衰期達7天且其作用係中和血管生長因子VEGF。除去VEGF最終能防止腫瘤內新血管生成，並因該腫瘤內氧消耗之緣故而造成腫瘤低氧(48-50)。小分子化合物(諸如蕾莎瓦和紓癌特)之半衰期低於24小時且彼等之作用係直接抑制VEGF受體之激酶活性。因此，即使知道藥物之半衰期，仍可能很難控制由AAA所誘發低氧的時間點。此情況與施用VDA恰成對比，於施用VDA後腫瘤血管於數分鐘內立即被關閉且幾乎立即發展成低氧狀態(實例3)。因替拉扎明於人體內之半衰期為約40分鐘，因此相對於投服AAA之時間點，共同投服替拉扎明之時間點是非常具挑戰性的。其次，AAA亦可引起腫瘤血管系統之暫時正常化(51-53)並真正地改善腫瘤血流及腫瘤內氧濃度。此理論亦用於解釋結合AAA與放射治療之原理，其中足量之氧存在對藉由放射線殺死腫瘤係必要的，而低氧會損害放射線功效(51)。AAA所引起之腫瘤血管系統的暫時正常化之功效係與活化替拉扎明或其他HABA所欲之低氧環境上相反。因此，我們預期施用HABA與單獨之AAA係極具挑戰性。據此，本發明提出結合VDA和AAA以作為誘發腫瘤低氧之方法。原理係使用VDA以引起腫瘤血流之立即性抑制以誘發低氧並活化HABA。然而，在誘發腫瘤低氧後，該腫瘤將會發展補償性低氧反應(諸如產製VEGF或其他血管生成因子)以使內皮原始細胞自骨髓移出以修補受損之腫瘤血管系統(20)。VDA與AAA(諸如癌思停)之結合可幫助防止VEGF之補償性功效並抑制腫瘤血管之修理過程，藉以提高VDA使該腫瘤維持在低氧狀態之功效(20)。1,2-二苯乙烯5c等VDA與癌思停之協同增效係示於實例4。
因此，本發明所描述之腫瘤組合治療的成分包括一或多種抗血管生成劑(AAA)、一或多種血管破壞劑(VDA)及一種低氧活化之生物還原劑(HABA)。當一起經投服時，AAA與VDA之組合能對腫瘤細胞延長低氧的狀態，且該等藥劑本身能於殺死腫瘤細胞上顯現某些功效，但是該等藥劑於單獨投服時對治療固體腫瘤相對上無效。然而，當AAA和VDA如本發明所描述般來與作為抗癌劑的HABA組合一起投服時，該AAA和VDA之活性可由協同增效(非加成)之方式顯著地被增強。本發明所描述之方法可被視為藉由共同投服HABA以增強AAA及/或VDA的抗癌活性之方法，或藉由共同投服AAA及/或VDA以增強HABA的抗癌活性之方法。
可藉由熟習此技藝之人士所習知之任何適當的手段，以進行投服本發明所描述之藥劑，要注意的是該低氧誘發劑之活性必須儘可能地局限於需治療之標靶區(即一種腫瘤或多種腫瘤)或於體內含有一或多種腫瘤且可與鄰近區域分隔之區域。VDA能選擇性地抑制腫瘤血流而不顯著地損害正常血液循環(11)，因此可經全身性投藥。在此狀況下，HABA可經局部或全身性投服，因為HABA之活化將會被主要地局限於由VDA之作用所創造的腫瘤內低氧區。然而，於本發明之某些具體範例中，VDA和HABA之投服係被大大地局限於標靶區，即諸如當與栓塞結合時，投藥係局部性的。可藉由局部投服該等藥劑以完成投藥，例如通過介入性放射科醫師所置入之導管藉由動脈內注射至供應腫瘤血流之血管分支內。實施該局部投藥可藉由如本發明所描述之於接近連續之某一時點下投服一種個別之藥劑或可藉由投服含有該等藥劑之混合物的單一製劑。AAA之投服典型上係於栓塞後經由口服或靜脈內注射之全身性投服，因為AAA係用於抑制由VDA所引起之腫瘤低氧的補償效果，該補償效果係引起全身反應。於本發明之其他具體範例中，所有藥劑(其包括低氧誘發劑(例如AAA及/或VDA)和HABA)係經全身性投服，但因為HABA之活化將會因VDA之選擇性的腫瘤血管功效之緣故而僅發生於腫瘤之局部低氧區。全身性投藥之方法包括但不限於口服、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下或動脈內投藥以及吸入等。再於實施栓塞之其他具體範例中，首先必須投服該等藥劑(例如HABA；或VDA和HABA，含或不含AAA)，使得該等藥劑局限於標靶區內。然而，若低氧係由VDA化學性誘發，則只要投藥就能造成隔離該等藥劑於標靶區內，低氧誘發劑可在HABA之後投服或與HABA同時投服。
投藥模式係如下述。因為AAA之目的係阻斷全身性補償機制，所以AAA係經由全身性投服。對肝細胞癌，HABA和VDA之投藥方式有兩種。一種係於栓塞或未栓塞之情況下藉由動脈內給予VDA和HABA並隨後全身性給予AAA。此方法主要係用於治療肝細胞癌且肝細胞癌係現今使用栓塞作為標準治療之唯一癌症。第二種方法係全身性給予所有3種藥劑，因為VDA即使係經由靜脈內注射全身性投藥，仍能選擇性地引起腫瘤血管之抑制。此方法將適用於不能接受栓塞之病患。對非位於肝臟之其他固體腫瘤，栓塞不是用於治療該等腫瘤之標準方法，且典型上所有3種藥劑(HABA、VDA及AAA)係經由口服、靜脈內、腹膜內或皮下途徑全身性投藥，其投藥順序通常係先投服HABA，隨後投服VDA及最後投服AAA。藉此方法，HABA將被分佈至腫瘤並隨後VDA導致腫瘤血流關閉以誘發低氧。然而，亦可考慮局部投服該等藥劑。AAA之作用係更為緩慢且之後，可用投服AAA以抑制低氧所誘發之補償反應。
本發明所描述之該等藥劑的製劑或調製劑通常係適於投服哺乳動物病患並因此係生理上相容的。該等組成物包括實質上經純化之該等藥劑及藥理上或生理上適合(相容)之載體。該等組成物之製備通常係熟習此技藝之人士所習知。典型上，該等組成物係被製成液體溶液或懸浮液；然而，亦可考慮固體型式，諸如藥片、丸、粉末及類似者。亦可製備適合於投藥前溶解或懸浮於液體中之固體型式。該製劑亦可經乳化。該等活性成分亦可與藥學上可接受且能與該等活性成分相容之賦形劑混合。適當之賦形劑係例如水、生理食鹽水、D-葡萄糖、甘油、乙醇及類似者或彼等之組合。此外，該組成物可含有微量之輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑及類似者。若欲投服該組成物之口服劑型，則可加入各種不同之增稠劑、芳香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑及類似者。本發明之組成物可含有任何前揭之額外成分以生成呈適合投藥之型式的組成物，例如該等藥劑可附著於基質上以提供局部投藥。調製劑中每種藥劑之最終劑量可加以改變。然而，通常該劑量將介於約1至99%。如本發明所描述者且取決於治療方案之細節，該等組成物可含有僅一種藥劑或多種藥劑之混合物(即僅HABA或AAA或VDA或化學栓塞劑，或該等藥劑之兩種或多種的任何組合)。此外，藥劑之每種類型中的超過一者可經組成物投服，例如一種HABA可與兩或多種VDA或兩或多種AAA一起投服，或兩或多種HABA可一起投服等。
特定地，本發明提供藥理上可接受之組成物及/或包含該組成物之套組，該組成物包括至少一種低氧活化之生物還原劑及誘發低氧之血管破壞劑和抗血管生成劑中至少一者，以及生理上可接受之載體。於其他具體範例中，亦提供組成物，該組成物包含至少一種低氧活化之生物還原劑及於機械栓塞期間所使用之化學栓塞劑(例如碘化油Lipiodol)以及可選擇地一或多種VDA及/或AAA。
藉由本發明之方法可治療的癌症類型包括但不限於發展成固體腫瘤(固體惡性腫瘤)之癌症，例如肝細胞癌、膽管癌、胰臟癌、結腸直腸癌、肛門癌、肺癌(其包括小細胞或非小細胞肺癌)、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、腎細胞癌、神經內分泌腫瘤、胃癌、食道癌、頭頸癌、皮膚癌(其包括鱗狀細胞癌或黑色素瘤)、軟組織和骨肉瘤、甲狀腺癌、胸腺瘤、膀胱癌、子宮頸癌、子宮體癌、中樞神經腫瘤、霍傑金(Hodgkin)式和非霍傑金式淋巴瘤。藉由本發明所描述之方法可治療原發性和轉移腫瘤。
本發明之方法通常係欲治療哺乳動物(特別是人)但絕非總需如此。亦可考慮獸醫上之應用。此外，熟習此技藝之人士當能瞭解其他治療之用藥方式可與本發明之方法結合，例如外科手術切除腫瘤或部分腫瘤、各種不同之化學治療方案及其他副作用之治療，諸如治療噁心、食慾刺激劑、維生素等。
 材料和方法 細胞株和腫瘤異種移植模式
本研究使用之腫瘤細胞株包括UCI-101卵巢癌細胞和Hep3B肝細胞癌細胞。令細胞於5% CO2 潮濕環境下分別生長於培養基IMEM和DMEM中並對該培養基IMEM和DMEM補充10%胎牛血清、穀胺醯胺及青黴素/鏈黴素。當細胞匯合成長至80%時，利用1%胰蛋白腖收集細胞並令該細胞經磷酸鹽緩衝鹽水沖洗3次，隨後再經皮下注射至裸鼠體內。對小鼠異種移植物研究，將2×106 個腫瘤細胞經皮下注射至背部。裸鼠係購自NCI Development Therapeutic Program。使用彎腳規測出之長軸和短軸(分別為a和b)監測腫瘤大小並利用公式ab2 /2計算腫瘤體積。藉由腹膜內注射進行利用VDA順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)(50 mg/kg)及替拉扎明(60 mg/kg)之治療。AAA癌思停(劑量10 mg/kg)之治療係經由尾靜脈注射。
藉由DCE-MRI測量腫瘤與正常組織之灌流
令帶有腫瘤異種移植物之裸鼠經混合氧氣之1%異氟烷。利用專用於小動物顯影之實驗級磁共振(MR)系統(Bruker,Biospec 2.35T/40 cm)進行DEC-MRI。解剖頸靜脈以置入供急性期研究之對比注射用的IV導管。第一批小鼠係經由頸靜脈導管注射50μl釓(OmniScan)且每秒收集MRI影像以研究注射後立即地MRI訊號增加之起初速率。經建立該起初速率後，隨後之MRI研究係專注於釓訊號之持續增加，該釓訊號之持續增加亦提供組織灌流之定性和定量資訊。對此研究，將20μl釓直接注射至尾靜脈。該注射後1分鐘內將小鼠轉移至MRI機器之隧道內。每分鐘收集MRI影像達30分鐘。
組織切片之免疫組織化學研究
經殺死小鼠後，解剖主要器官和腫瘤並將彼等固定於10%甲醛水溶液(福馬林)中。將組織包埋於石蠟中並令切片經H&E染色且經抗CD34抗體染色以定量微血管密度。基於Weidner等人所描述之方法，利用配備Diagnostic Instruments Spot RT CCD照相機之Nikon ECLIPSE E800M顯微鏡得到放大200倍之圖像，藉由計算該圖像中之CD34陽性訊號，得到微血管密度之計數。
即時測量經VDA治療後腫瘤氧濃度和血流之變化
對裸鼠皮下注射UCI-101卵巢癌細胞以形成腫瘤異種移植物。當腫瘤大小達最大直徑為8至10mm時，對腫瘤異種移植物進行氧濃度和血流之研究。利用25G針針刺腫瘤以生成供置入感應器探針之隧道。將該感應器探針之尖端置於腫瘤之中心處。利用配備裸纖維(bare-fibre)型感應器探針之OxyLite 2000雙頻道監測系統以測量腫瘤氧濃度和血流，該裸纖維型感應器探針係使用雷射都蔔勒(Doppler)技術(Optonix,Oxford,UK)且被設計用於測量組織氧濃度、溫度及血流。以即時方式進行測量(100次測量/秒)並連續記錄氧濃度和腫瘤血流。因為經由針刺和置入感應器探針所引起之創傷可干擾血流和氧濃度，所以在每隻小鼠經腹膜內注射測試之VDA順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)(50 mg/kg)之前，首先對未經治療之每隻小鼠進行記錄達至少20分鐘。經治療後，再記錄腫瘤血流和氧濃度達20分鐘。
實例1. 利用1,2-二苯乙烯5c以抑制腫瘤血管
檢驗1,2-二苯乙烯5c是否能抑制腫瘤血流並最終導致腫瘤低氧。迅速動力學研究顯示經10分鐘迅速增加後，釓訊號達到高原期並持續達至少30分鐘且未減少(11)。吾人選擇經注射後之30分鐘以研究高原期之影像並比較經1,2-二苯乙烯5c治療之前和之後的相同小鼠之相同腫瘤以避免小鼠彼此間所造成之任何差異。在無對比下首先對小鼠顯影以取得基礎影像(圖1，左上角)。所得之切面係位於腫瘤之中心處。相同切面內之腎臟係作為相同小鼠之腫瘤的內部器官對照組。經由尾靜脈注射20μl釓(OmniScan)後，利用迅速序列MRI每分鐘分析小鼠達總計30分鐘。經注射釓後，腫瘤和腎臟皆顯現MRI訊號之增強，該MRI訊號之增強代表腫瘤和腎臟之血管灌流(圖1，右上角)。隨後靜置小鼠達至少24小時以使釓排出。在第二或第三天，藉由腹膜內注射對相同小鼠注射50mg/kg之1,2-二苯乙烯5c。經注射1,2-二苯乙烯5c後4小時，在經相同之治療方式注射釓之前和之後，再次對小鼠顯影並與經1,2-二苯乙烯5c治療前之先前一組影像相比較。釓注射前之基礎影像與未經治療之小鼠的基礎影像相比較，顯示T1加權之影像顯現些微增加之MRI訊號(圖1，左下角)。該增加之訊號可能是因為自前天體內所殘留之小量釓。經注射釓後，腎臟和其他正常器官皆顯示訊號之增強。然而，與經1,2-二苯乙烯5c治療前之訊號相比較，腫瘤區顯現顯著較少之釓增強(圖1，右角)，該結果建議1,2-二苯乙烯5c選擇性地抑制腫瘤灌流且不影響正常器官。對6隻小鼠進行同樣之研究並對每隻小鼠取得T1圖像。自每個影像計算釓濃度且其結果係示於圖1。因腎臟之訊號達到飽和，故該計算方法對腎臟不適用。經1,2-二苯乙烯5c治療後4小時，腫瘤內釓濃度降低至平均62.8%。相對地，肌肉內釓濃度並未隨1,2-二苯乙烯5c治療而改變，該結果表示1,2-二苯乙烯5c選擇性地抑制腫瘤灌流但未損害正常血管灌流。
實例2. 對腫瘤和正常器官之切片利用CD34血管標記進 行免疫組織化學染色
選用先前經DCE-MRI研究之組織以研究腫瘤之血管密度並將其與源自DCE-MRI之血管灌流研究所得之結果相關連。吾人特別檢驗心臟和腦之切片，因為秋水仙素部位抑制劑在這些部位曾被觀察到毒性。藉由免疫組織化學染色，令組織切片經標準H&E和抗CD34(即一種血管內皮標記)抗體染色。經1,2-二苯乙烯5c治療後，該H&E染色於任何主要器官皆未顯現任何顯著之變化(圖2)。亦未顯現腫瘤內組織之差異。隨後使用抗CD34染色以計數腫瘤和各種不同之正常器官內之微血管密度(54,55)。結果係示於每個圖之右下角(腎臟除外，腎臟因毛細管網絡融合而外觀上非呈分離之小點或小管之故而無法計數)。1,2-二苯乙烯5c之治療雖未改變心臟、肝臟、腎臟及腦之微血管密度，但能顯著地降低腫瘤之微血管密度至幾近四分之一(圖2)。此發現係與MRI結果一致：1,2-二苯乙烯5c選擇性地降低腫瘤血管灌流且未損害正常器官灌流。
實例3. 藉由代表性VDA 1,2-二苯乙烯5c誘發腫瘤低氧 以促進替拉扎明之活化
藉此研究，吾人進行VDA 1,2-二苯乙烯5c之概念研究以證實1,2-二苯乙烯5c能誘發腫瘤低氧。先前於實例1中，已使用DCE-MRI研究以證實1,2-二苯乙烯5c能成功地抑制腫瘤血流。然而，DCE-MRI研究之技術並不能作為連續監測工具且不能記錄1,2-二苯乙烯5c能多快地誘發腫瘤血流之抑制及1,2-二苯乙烯5c能多快地誘發腫瘤低氧。為達到即時監測之目的，使用氧濃度及血流感應器以記錄小鼠經1,2-二苯乙烯5c治療後之前20分鐘內的即時變化。
需要考慮數個問題以解釋結果。腫瘤血流和腫瘤氧濃度係取決於探針於腫瘤內所在之位置。探針所在之位置愈接近腫瘤之邊緣，則腫瘤血流和氧濃度將會愈高。中心部分具有較少之血流，因此通常較為低氧。因為個體差異及感應器探針置入腫瘤內以進行研究之腫瘤位置不同，比較不同小鼠係極困難的。解釋該結果之最可靠方式係使用治療前之血流和氧濃度作為其本身之對照組而與治療後之結果相比較，因為該感應器探針係置於相同之位置上以除去空間差異。因此，對所有小鼠皆記錄達至少20分鐘以作為治療前基礎值。於基礎值研究中，觀察到如圖3所示之顯著的時間變化。該基礎氧濃度和腫瘤血流顯示隨時間之同時變化的基礎值。當腫瘤血流增加時，氧濃度相應地增加。在連續監測達至少20分鐘以建立此時間變化後，注射1,2-二苯乙烯5c，隨後再連續監測20至30分鐘以檢驗1,2-二苯乙烯5c於腫瘤氧濃度和血流上之即時功效。如本實例所使用之3隻小鼠所顯示的，不同腫瘤顯現極為不同之腫瘤血流和氧濃度(圖3)。1號小鼠顯示呈循環樣式大波動之基礎值，其中血流介於600至1100之間且氧濃度介於15至40mmHg之間。最初10分鐘之結果並未被考慮，因為係屬探針插入所造成之損傷的調整期。2號小鼠之腫瘤血流介於200至300之間且氧濃度呈現兩個高原期。一個高原係位於50至60mmHg之間並隨後下降至另一個介於20至30mmHg之間的高原。3號小鼠顯現極高之腫瘤血流(介於2000至3000之間)及介於35至55mmHg之間的氧濃度。經腹膜內注射1,2-二苯乙烯5c(50mg/kg)後，全部3隻小鼠在記錄終止前皆顯現腫瘤氧濃度顯著降低至小於10 mmHg。對1和3號小鼠，腫瘤血流降低至低於1,2-二苯乙烯5c治療前之血流的25%。2號小鼠之腫瘤血流變化起初係顯著的，但隨後回復至某種程度(雖然仍然低於血流基礎值)。該等結果建議下述之結論：(a)1,2-二苯乙烯5c治療能有效地誘發腫瘤低氧；(b)起初之腫瘤血流愈低，則1,2-二苯乙烯5c誘發之腫瘤血流的抑制功效愈差；該結果可被解釋：較少之腫瘤血流導致較少之藥物被運送至腫瘤且較不有效地降低腫瘤灌流；(c)在腫瘤血流上存在顯著之時間和空間變化。吾人之研究係局限於腫瘤內之一個單一定點以排除空間上的變異。
實例4. 藉由癌思停增強1,2-二苯乙烯5c之功效
隨後使用卵巢癌UCI-101細胞以研究1,2-二苯乙烯5c之活體內功效。首先每周3次腹膜內注射1,2-二苯乙烯5c(25mg/kg)。藉由測量長軸和短軸以計算腫瘤體積。不幸地，並未測量到對照組小鼠與經1,2-二苯乙烯5c治療組小鼠於腫瘤生長上之任何差異。此結果建議每周3次投服1,2-二苯乙烯5c可能不是正確之投藥方式。該失敗可能係因為間歇性投藥導致腫瘤邊緣存活，該存活係自周圍正常血管系統得到營養和血液供應。當VDA治療停止時，該存活之腫瘤邊緣迅速生長。這乃藉由移動之內皮祖細胞的補充，腫瘤血管系統迅速恢復。基於此原理，結合使用1,2-二苯乙烯5c和癌思停，該癌思停係用於中和UCI-101腫瘤細胞所分泌之VEGF。為達到較佳之治療功效，亦增加1,2-二苯乙烯5c之治療頻率(20mg/kg/day)至連續5天(周一至周五)達2周。每周投服癌思停(10mg/kg)2次(周一和周五)計5劑量。經單獨1,2-二苯乙烯5c治療組顯現腫瘤生長抑制作用達約45%，且經單獨癌思停治療組顯現腫瘤生長抑制作用達約25%。經1,2-二苯乙烯5c與癌思停之組合的治療組可達80%之腫瘤生長抑制作用(圖4)。在第24天解剖腫瘤後對腫瘤稱重且其結果證實測量結果(數據未顯示)。本研究得到2個結論。當給藥較為頻繁時，1,2-二苯乙烯5c較為有效，且當與血管生成抑制劑癌思停結合時，1,2-二苯乙烯5c更較為有效。
實例5. 結合替拉扎明與1,2-二苯乙烯5c
隨後結合替拉扎明與1,2-二苯乙烯5c以進行原理證明研究。首先利用腹脹內注射替拉扎明(60 mg/kg)以治療帶有已建立之UCI-101腫瘤異種移植物(腫瘤大小之長軸約1cm)之裸鼠。經60分鐘後，腹膜內投服1,2-二苯乙烯5c(50mg/kg)，該劑量已被確立能於數分鐘內誘發深度之腫瘤低氧(圖3)。如前所述，先給予替拉扎明以使其分佈於腫瘤內並隨後再給予1,2-二苯乙烯5c來抑制腫瘤灌流之順序係絕對重要。3天後殺死小鼠。收取腫瘤並在腫瘤之中心部分切開來作組織切片和H&E染色對該中心部分進行分析。先前已知單獨給予替拉扎明(70mg/kg)對抑制腫瘤生長沒有作用，因此不預期單獨給予替拉扎明(圖5B)會顯現任何作用。如示於圖5，對照組腫瘤(圖5A)和經1,2-二苯乙烯5c治療之腫瘤(圖5C)有極小之腫瘤壞死區域。對結合治療組(其中替拉扎明係在給予1,2-二苯乙烯5c之前60分鐘被給予，該投藥方式允許替拉扎明首先分佈於腫瘤內，再給1,2-二苯乙烯5c來誘發腫瘤低氧)，觀察到腫瘤壞死區域顯著增加(圖5D)。最重要的是，壞死區域主要係位於腫瘤中心而邊緣部分仍存活，該結果建議壞死係因為低氧之作用，因為腫瘤邊緣部分可自周圍之正常組織藉由擴散作用得到血液和氧供應。此發現支持吾人之理論：先給予替拉扎明隨後再給予1,2-二苯乙烯5c以誘發腫瘤低氧之組合可顯現協同增效之作用並提高各別藥劑之治療功效。
其次，吾人在多次給藥後，測量腫瘤異種移植物之大小。對裸鼠皮下注射UCI-101細胞並於7天後腫瘤變為肉眼可見。對每個組之6隻小鼠，於第8、10及12天經腹膜內注射以進行投藥治療。1,2-二苯乙烯5c之劑量係50mg/kg而替拉扎明之劑量係60mg/kg。然而，於第14天，經替拉扎明治療之小鼠的兩個組出現體重減輕20%之現象，因此殺死所有小鼠以進行比較。腫瘤體積之結果係示於圖6。與對照組之腫瘤大小相比較，經1,2-二苯乙烯5c或替拉扎明治療之組的腫瘤大小係平均減少至50%，而經1,2-二苯乙烯5c和替拉扎明治療之組的腫瘤大小係進一步減少至對照組之27%>此結果建議1,2-二苯乙烯5c和替拉扎明至少具有加成性且甚至可能係具有協同增效作用。
實例6. 替拉扎明與抗血管生成劑癌思停之組合
基於抗血管生成劑可抑制腫瘤血管系統並導致腫瘤低氧之原理，吾人檢驗替拉扎明與抗血管生成劑癌思停之間是否存有任何之協同增效作用。類似於先前利用替拉扎明與1,2-二苯乙烯5c所進行之研究，利用替拉扎明與癌思停以治療帶有相同之UCI-101腫瘤異種移植物之裸鼠。於第8、10及12天利用腹膜內注射替拉扎明以治療已帶有腫瘤之小鼠並於第8和11天經由尾靜脈注射癌思停(10mg/kg)。測量腫瘤異種移植物並對腫瘤大小繪圖(圖7)。當加入癌思停時，觀察到腫瘤大小沒什麼改善，此結果顯著不同於比較單獨給予替拉扎明與給予替拉扎明和1,2-二苯乙烯5c之間所產生的差異(圖6)。替拉扎明組與替拉扎明和癌思停組之間未存有任何統計上顯著之差異。對此現象有數個可能之解釋。一個是抗血管生成劑之活性作用係遠比血管破壞劑1,2-二苯乙烯5c為慢，該1,2-二苯乙烯5c可誘發幾乎立即之血管關閉。相對地，癌思停中和VEGF並可能需要較長之治療期間以導致腫瘤低氧。其次，依據Jain等人之血管正常化理論，抗血管生成劑癌思停首先係誘發腫瘤內之血管正常化(51-53)。因此，因血管正常化之作用，甚至可改善而非抑制腫瘤氧濃度，且不能增強替拉扎明之治療功效。使用抗血管生成劑癌思停與替拉扎明將需要與1,2-二苯乙烯血管破壞劑結合，該1,2-二苯乙烯已被證實能較有效地誘發腫瘤生長之抑制作用。一種使用該3種藥物組合之可能方法，係於起初使用替拉扎明和1,2-二苯乙烯血管破壞劑，隨後再利用癌思停進行維持治療。
雖然本發明業已藉由多個具體範例加以說明，但是熟習此技藝之人士當能理解在所附之申請專利範圍的精神和範圍內所作之修改仍能實施本發明。因此，本發明將不應限於上述之具體範例，而應進一步包括本發明所描述之技術內容的精神和範圍內之所有修改及彼等之等同體。
圖1A和B. 在釓注射後30分鐘，利用釓之累積研究腫瘤灌流。(A)對同一小鼠經1,2-二苯乙烯5c處理之前及之後的T1加權圖像。利用DCE-MRI分析已患有皮下UCI101腫瘤異種移植之裸鼠的腫瘤灌流。在注射釓(OmniScan)至尾靜脈後，收集DCE-MRI圖像達30分鐘。在經1,2-二苯乙烯5c處理之前及之後對同一小鼠進行研究以避免個體所造成之差異。左邊兩圖顯示在釓注射前之T1加權圖像。右邊兩圖顯示在釓注射後30分鐘之圖像。上方兩圖顯示在小鼠經1,2-二苯乙烯5c處理前，腫瘤和腎之釓增加。下方兩圖顯示類似於經1,2-二苯乙烯5c處理前之情況，腎增加仍然相同。然而，與經1,2-二苯乙烯5c處理前之右上圖相比較，1,2-二苯乙烯5c處理顯著地降低腫瘤之釓增加(右下圖)。在每張圖像中，腫瘤係以大箭頭標記，而腎係以小箭頭標記。顯示的是所研究之6隻小鼠中一隻的代表圖像。(B)在經1,2-二苯乙烯5c處理之前及之後腫瘤和肌肉內經計算之釓濃度的平均值。對6隻小鼠進行相同之實驗以利統計分析。為計算代表組織灌流之組織釓濃度，在注射釓之前和之後30分鐘產生T1圖。在經1,2-二苯乙烯5c處理後，腫瘤訊號平均降低至62.8%；然而，在經1,2-二苯乙烯5c處理後，肌肉未顯現顯著之改變。
圖2. 1,2-二苯乙烯5c處理減少腫瘤之微血管密度，但不會減少正常器官之微血管密度。對已患有UCI腫瘤異種移植之裸鼠經腹膜內注射10% DMSO或1,2-二苯乙烯5c(50 mg/kg)。注射後4小時殺死小鼠並收取各個器官和腫瘤以進行固定和標準蘇木素和伊紅(H&E)染色。利用抗CD34抗體對每一部分進行免疫組織化學染色以定量微血管密度。在原始經免疫組織化學染色之部分，褐色表示CD34染色之陽性訊號。(A)顯示放大200倍之黑白圖。每張CD34染色圖中之陽性訊號數目係經計算並顯示於每張圖之右下角。(B)顯示最富含微血管密度之4個不同區域的平均值和標準偏差係以柱狀圖繪製。腎之部分不能被計分，因為圖像顯示腎小管周遭之所有血管係融合成一個大網絡。此結果建議腫瘤血管密度係顯著地減少幾近4倍，而其他器官、心、肝、腦及腎之血管密度未受1,2-二苯乙烯5c處理所影響。
圖3. 腫瘤血流和腫瘤內氧含量。藉由使用OxyFlo和OxyLite系統(Optronix,牛津,英國)監測氧和血流。令小鼠經異氟烷麻醉並將可記錄溫度、氧及血流之三重感應器插入腫瘤中且進行記錄達1小時。所顯示的是患有源自UCI-101卵巢癌細胞之類似大小皮下腫瘤的3隻小鼠之結果。上圖表示氧濃度且下圖表示腫瘤血流。經標記的是1,2-二苯乙烯5c之注射時間。
圖4. 1,2-二苯乙烯5c之活體內功效及由癌思停所增強之功效。對裸鼠皮下注射UCI-101細胞並令小鼠自周一至周五經1,2-二苯乙烯5c(20 mg/kg/天)及合併或不合併每周2次之癌思停(10 mg/kg)處理。使用長短軸計算腫瘤體積。每組含有8隻小鼠且繪出平均腫瘤體積和標準偏差對天數之圖。
圖5A-D. 替拉扎明與1,2-二苯乙烯5c之協同作用。患有UCI-101腫瘤異種移植之裸鼠分別經載體(5A,對照組)、單獨替拉扎明(5B,60 mg/kg)、單獨1,2-二苯乙烯5c(5C,50 mg/kg)或替拉扎明(60 mg/kg)及隨後1,2-二苯乙烯5c(50 mg/kg)(5D)處理以誘發腫瘤低氧。三天後殺死小鼠並摘取腫瘤進行H&E染色。顯示的是腫瘤部分之低倍數影像。染色較深之腫瘤部分係存活的，而較淡色部分係壞死區域。注意該組合處理組之右下圖的腫瘤部分。大部分之腫瘤係呈壞死，而僅有位於腫瘤中心和周邊之小部分仍然存活。該中心存活部分係接近較大血管之分支處。
圖6. 1,2-二苯乙烯5c與替拉扎明之協同功效。患有皮下腫瘤之裸鼠係於第8、10及12天分別經腹膜內注射(1)生理食鹽水對照組、(2)1,2-二苯乙烯5c(50 mg/kg)、(3)替拉扎明(60 mg/kg)、或(4)1,2-二苯乙烯5c與替拉扎明之組合。隨後小鼠於第14天因減重被殺死。測量腫瘤之長短軸以計算腫瘤大小並對天數繪圖。每個處理組含有6隻小鼠。
圖7. 替拉扎明與癌思停之組合。患有皮下腫瘤之裸鼠係分別經(1)生理食鹽水對照組、(2)第8、10及12天之替拉扎明(60 mg/kg)、或(3)第8、10及12天之替拉扎明與第8和11天之癌思停(10 mg/kg)之組合處理。隨後於第14天殺死小鼠。測量腫瘤之長短軸以計算腫瘤大小並對天數繪圖。每個處理組含有6隻小鼠。

Claims (14)

  1. 一種低氧活化之生物還原劑和血管栓塞劑於製造供殺死動物體內之腫瘤細胞的藥物之用途，其中該低氧活化之生物還原劑係替拉扎明(tirapazamine)。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該血管栓塞劑係選自碘化油(lipiodol)、膠泡綿(gelfoam)、血塊或奈米粒子中一或多者。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該血管栓塞劑在該低氧活化之生物還原劑之後或同時被施予。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該替拉扎明之劑量為1至300mg。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中施予該血管栓塞劑於腫瘤內形成10%氧或低於10%氧之低氧區，藉以活化該低氧活化之生物還原劑以殺死該低氧區內之腫瘤細胞。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之用途，其另包含作為血管破壞劑之1,2-二苯乙烯(stilbene)衍生物可在該血管栓塞劑之後或同時被施予，其中該1,2-二苯乙烯衍生物係選自順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)、順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-羥基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯6c)或1,2-二苯乙烯5c之前藥N-嗎啉基-胺甲酸酯衍生物中一或多者。
  7. 如申請專利範圍第6項之用途，其另包含作為抗血管生成劑之癌思停(bevacizumab)可在該血管破壞劑之後 或同時被施予。
  8. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之用途，其中該腫瘤為肝腫瘤。
  9. 一種低氧活化之生物還原劑和血管破壞劑於製造供殺死動物體內之腫瘤細胞的藥物之用途，其中該低氧活化之生物還原劑係替拉扎明(tirapazamine)且該血管破壞劑係1,2-二苯乙烯(stilbene)衍生物，該1,2-二苯乙烯衍生物可選自順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-胺基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯5c)、順式-3,4’,5-三甲氧基-3’-羥基-1,2-二苯乙烯(1,2-二苯乙烯6c)或1,2-二苯乙烯5c之前藥N-嗎啉基-胺甲酸酯衍生物中一或多者。
  10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該血管破壞劑在該低氧活化之生物還原劑之後或同時被施予。
  11. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該替拉扎明之劑量為1至200mg。
  12. 如申請專利範圍第9至11項中任一項之用途，其中施予該血管破壞劑於腫瘤內形成10%氧或低於10%氧之低氧區，藉以活化該低氧活化之生物還原劑以殺死該低氧區內之腫瘤細胞。
  13. 如申請專利範圍第12項之用途，其另包含作為抗血管生成劑之癌思停(bevacizumab)可在該血管破壞劑之後或同時被施予。
  14. 如申請專利範圍第9至11項中任一項之用途，其中該腫瘤為乳房腫瘤、肺腫瘤或大腸腫瘤。
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