PT2260862E

PT2260862E - Composições e métodos para tratar tumores que apresentam antigénios de survivina

Info

Publication number: PT2260862E
Application number: PT10008550T
Authority: PT
Inventors: Stephen D Gillies; Thore A O Hettmann; Pascal Andre Stein; Stephan G Klinz
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2012-08-31
Also published as: RU2411040C2; ZA200803672B; EP2260862B1; EP1931376A2; PL2260862T3; CA2623497A1; WO2007039192A3; AU2006299106A1; CN101267833A; US20070104689A1; EP2260862A1; AU2006299106B2; CN103169959A; JP2009509991A; KR20080054415A; ES2386411T3; BRPI0616362A2; RU2008114624A; WO2007039192A2; DK2260862T3

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR TUMORES QUE APRESENTAM ANTIGÉNIOS DE SURVIVINA"

ÂMBITO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com estratégias de vacinação para tratamento de tumores. Especificamente, esta invenção relaciona-se com composições para vacinas que estimulam num humano uma resposta imune à survivina humana, atacando assim células afetadas por tumores que sobre-expressam survivina. Em particular, a presente invenção relaciona-se com composições para vacinas compreendendo péptidos derivados de survivina de não-mamifero assim como de survivina modificada de mamifero, especialmente humana.

Este pedido é um pedido divisionário da EP 06 805 883.3 arquivado em 27.09.2006.

ANTECEDENTES O sistema imune exerce a sua função de vigilância em parte por monitorização das composições de proteínas das células. Num processo referido como apresentação de antigénios a células T, as proteínas dentro de uma célula são processadas em péptidos. Um subconjunto dos péptidos processados, os antigénios, são exportados para a superfície da célula, numa associação específica com um membro de uma classe de recetores conhecidos como os recetores do complexo maior de histocompatibilidade (MHC). Estes complexos MHC-péptido são amostrados por células imunes especializadas, as células T, por via de uma interação com as proteínas de superfície da célula T conhecidas como recetores das células T (TCRs). Cada célula 2 T determinada possui um TCR único à sua superfície. Após uma interação produtiva dos TCR das células T com o complexo MHC-péptido, uma resposta imune é ativada que conduz à eliminação da célula que apresenta esse complexo MHC-péptido particular. Geralmente, a interação não é produtiva se os antigénios apresentados forem derivados do hospedeiro, chamados antigénios "próprios". Normalmente, as respostas imunes são ativadas pela interação com um antigénio derivado de uma proteína estranha, por exemplo, com um antigénio derivado de uma proteína constituinte de um vírus infetante. 0 objetivo de tratar tumores por imunização ativa é para induzir o sistema imune a reconhecer e a eliminar células tumorais. Tal como em qualquer outra célula, antigénios peptídicos em células tumorais são derivados do repertório de proteínas expressadas. Antigénios enriquecidos por tumores derivados de proteínas expressas diferencialmente em tumores são, em princípio, um alvo da vigilância imune tal como antigénios virais o são em células infetadas. Do mesmo modo, seria útil explorar ramos do sistema imune que evoluíram para contrariar uma infeção intracelular com o propósito de eliminar um tumor.

Uma dessas proteínas enriquecidas por tumor é a survivina. Células tumorais muitas vezes sobre-expressam a proteína survivina, o que se acredita que bloqueia a apoptose e interfere assim com mecanismos que previnem o crescimento anormal de células tumorais. Células normais, por outro lado, expressam muito pouca survivina. (ver, e.g., Ambrosini et al., (1997) Nat. Med. 3:917-921). Consequentemente, a survivina é um antigénio específico de tumor ou enriquecido por tumor ideal. Seria útil aplicar uma forma antigénica da proteína survivina a células apresentadoras de antigénio, de modo a que uma resposta 3 imune à survivina possa ser estimulada. No entanto, ao contrário de células infetadas por virus, a survivina, como muitas outras proteínas diferencialmente expressadas em tumores, são proteínas do hospedeiro e não ativam o sistema imune. Consequentemente, há uma necessidade na técnica para desenvolver composições eficazes e métodos que desencadeiam uma resposta imune eficaz às células tumorais, particularmente as caracterizadas pela sobre-expressão de survivina.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições eficazes e métodos que desencadeiam uma resposta imune eficaz a células tumorais. Especificamente, a presente invenção fornece estratégias de vacinação formas usando formas antigénicas proteínas enriquecidas por tumores como antigénios de célula T. Em particular, a presente invenção fornece uma forma antigénica de uma proteína enriquecida por tumor, a survivina, preferencialmente survivina humana. A presente invenção relaciona-se com uma vacina incluindo um ácido nucleico que codifica um péptido de survivina humana modificada. Alternativamente, a presente invenção relaciona-se com uma vacina incluindo um péptido de survivina humana modificada. 0 péptido de survivina humana modificada é biologicamente inerte mas imunologicamente substancialmente semelhante à survivina de mamífero. Conforme aqui usado, por "biologicamente inerte" entende-se um péptido de survivina que não é capaz de exercer ou afetar substancialmente uma atividade normalmente associada à survivina normal. Por exemplo, um péptido de survivina "biologicamente inerte" não tem uma atividade anti-apoptótica substancial, nem é capaz de interferir substancialmente com a atividade anti-apoptótica 4 normalmente associada à proteína survivina endógena. Uma survivina biologicamente inerte não teria tipicamente um efeito negativo dominante substancial. Conforme aqui usado, por "imunologicamente substancialmente semelhante a survivina humana" entende-se um péptido de survivina modificada capaz de desencadear pelo menos uma resposta imune à mesma sequência alvo como é o péptido de survivina humana correspondente não modificada. Uma resposta imune pode ser medida, por exemplo, pela população de células T CD8+ ou a libertação de IFNy pelas células T CD8+ em resposta a uma sequência alvo.

Numa forma de realização preferida, a vacina da invenção inclui um ácido nucleico que codifica um péptido de survivina humana modificada. 0 ácido nucleico pode incluir um promotor de mamífero. Numa forma de realização, o ácido nucleico é um ADN nu. Noutra forma de realização, o ácido nucleico é formulado com um reagente que melhora a transfeção de células de mamífero. A vacina da presente invenção pode também incluir um adjuvante.

Numa forma de realização, o ácido nucleico que codifica um péptido de survivina humana modificada é parte de uma partícula virai, por exemplo, uma partícula adenoviral. Partículas adenovirais adequadas para a invenção incluem aquelas derivadas de adenovírus capazes de replicação, ou aquelas derivadas de adenovírus de replicação condicional ("CRADs") que se replicam apenas em certas células ou apenas sob determinadas condições, ou aquelas derivadas de adenovírus incapazes de replicação. Outras partículas virais adequadas incluem, mas não estão limitadas a, partículas virais derivadas de lentivírus ou outros vírus de ARN, vírus adeno-associados, rotavírus, ou vírus vaccinia, para mencionar apenas alguns. 5

Numa forma de realização, a vacina inclui uma bactéria contendo o ácido nucleico que codifica um péptido de survivina humana modificada. Preferencialmente, a bactéria é uma bactéria entérica, tal como Salmonella, Escherichia, ou Klebsiella. Outras bactérias, tais como a espécie Listeria, podem também ser usadas para acolher esses ácidos nucleicos. A bactéria pode ser uma bactéria de tipo selvagem ou pode conter mutações que, por exemplo, atenuam a sua patogenicidade. Geralmente é preferível usar uma forma mutante de uma bactéria, tal como um auxotrófico.

Noutra forma de realização preferida, a vacina da invenção inclui um péptido de survivina humana modificada. Preferencialmente, o péptido de survivina humana modificada inclui um domínio BIR modificado. 0 domínio BIR modificado pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido numa posição correspondente a Argl8, Cys57, Cys60, His77 e Cys84 da survivina humana. Alternativamente, ou para além disso o péptido de survivina humana modificada inclui um domínio helicoidal modificado. 0 domínio helicoidal modificado pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido numa posição correspondente a Lysl22, Alal28, e Ilel35 da survivina humana. Por exemplo, o domínio helicoidal modificado pode conter uma Pro numa posição correspondente a Alal28 da survivina humana. 0 domínio helicoidal modificado pode também incluir uma Pro numa posição correspondente a Ile35. 0 péptido de survivina humana modificada contém preferencialmente um ou mais epitopos de célula T do MHC de Classe I. Por exemplo, o péptido de survivina humana modificada pode incluir a sequência de aminoácidos LTLGEFLKL (SEQ ID N0:1) ou LMLGEFLKL (SEQ ID NO:6).

Em algumas formas de realização, o péptido de survivina humana modificada é fundido a uma porção Fc. Uma porção Fc 6 preferida é derivada de uma região Fc de mamífero, mais preferencialmente de uma região Fc humana. A porção Fc pode conter mutações que melhoram a montagem, por exemplo, substituição da cisteína na sequência EPKSCDK (SEQ ID NO:4) da articulação da IgGl por uma serina. Como resultado, a porção Fc pode conter uma sequência EPKSSDK modificada (SEQ ID NO:5). A porção Fc pode também conter mutações que reduzem a imunogenicidade das regiões para as quais uma resposta imune não é desejada, por exemplo, a junção entre as porções de proteína de fusão.

Em certas formas de realização, o péptido de survivina humana modificada funciona em conjunto com uma molécula efetora que contribui para a resposta imune. Por exemplo, essa molécula efetora pode ser uma porção de citoquina incluindo, mas não se limitando a, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23, GM-CSF, ou qualquer outra citoquina, particularmente uma capaz de ativar uma resposta imune de Thl. Essa molécula efetora pode também ser um inibidor de uma citoquina que reprime o sistema imune, por exemplo, um inibidor STAT3 (e.g., uma proteína STAT3 negativa dominante tal como STAT3P). Citoquinas ou outras moléculas efetoras podem também conter mutações. Por exemplo, uma citoquina pode conter uma substituição de Ser numa posição correspondente a Cysl25 da IL-2.

Deste modo, em formas de realização preferidas, a vacina da invenção inclui um ácido nucleico que codifica um péptido de survivina humana modificada e um segundo péptido incluindo uma molécula efetora descrita acima que contribui para a resposta imune. As regiões que codificam o péptido de survivina humana modificada e o péptido da molécula efetora podem estar numa única unidade de transcrição, ou em duas unidades de transcrição separadas. Alternativamente, a vacina da invenção inclui um ácido 7 nucleico que codifica um péptido de survivina humana modificada e um ácido nucleico separado que codifica um segundo péptido incluindo uma molécula efetora descrita acima que contribui para a resposta imune.

Noutras formas de realização, a vacina da invenção inclui um péptido de survivina humana modificada e um segundo péptido incluindo uma molécula efetora descrita acima que contribui para a resposta imune. Numa forma de realização, o péptido de survivina humana é fundido ou conjugado ao péptido que inclui uma molécula efetora. 0 péptido de survivina humana modificada e a proteína de fusão da molécula efetora podem ser adicionalmente fundidos ou conjugados a uma porção Fc como descrito acima.

Noutro aspeto, a presente invenção relaciona-se com um ácido nucleico capaz de desencadear uma resposta imune contra células expressando survivina humana. 0 ácido nucleico codifica um péptido incluindo uma sequência de aminoácidos com mais de 50% de identidade mas menos de 80% de identidade com o domínio BIR da survivina humana e o ácido nucleico contém um promotor capaz de expressar o péptido numa célula de mamífero. A presente invenção também se relaciona com um método de tratamento compreendendo administrar uma vacina ou um ácido nucleico como descrito acima. Em particular, a invenção fornece métodos de tratamento para cancro e outras doenças envolvendo proliferação celular indesejada. Os métodos de tratamento da invenção podem opcionalmente incluir outros passos, por exemplo, um step para testar primeiro o tumor de um doente em relação a expressão de elevados níveis de survivina. Outro passo opcional é o pré-tratamento de um doente com um agente ligeiramente imunossupressor, tal como uma dose baixa de ciclofosfamida, antes de administrar uma vacina ou um ácido nucleico da invenção. Sem pretender estar limitado pela teoria, um efeito desse pré-tratamento é reduzir o número de células T regulatórias. Consequentemente, outros pré-tratamentos que tenham efeitos semelhantes estão englobados na invenção.

Para além da survivina, a presente invenção pode ser aplicada a uma grande variedade de proteínas que podem ser usadas como antigénios, tais como antigénios específicos de tumores, antigénios virais, e outros antigénios. De entre os antigénios específicos de tumores, para além da survivina, a invenção pode ser aplicada a moléculas de adesão de células epiteliais, oncogenes tais como Ras, antigénio carcinoembrionário, e outras proteínas especificas de tumores ou enriquecidas por tumores. De entre os antigénios virais, a invenção pode ser aplicada a p24 de HIV, hemaglutinina de influenza, e outras proteínas virais.

Em resumo, a invenção é relacionada com os seguintes itens:

Embora este pedido de patente seja especificamente focado em survivina de mamífero preferencialmente de humano, a seguir, as Figuras, Descrição Pormenorizada e Exemplos contêm dados e resultados de survivina não-humana para além da survivina humana.

Esta informação adicional é fornecida para fins ilustrativos e comparativos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um alinhamento das sequências de proteína de homólogos da survivina. Os alinhamentos foram realizados pelo método ClustalW (ver Thompson et al. (1994) Nucl. Acid

Res. 22:4673-4680). As sequências foram obtidas a partir da 9 base de dados NCBI, usando os seguintes números de Acesso: survivina humana (Acesso #: NM_001168, SEQ ID NO:8), survivina de cão (NP_001003019, SEQ ID NO:9), survivina de porco (NP 999306, SEQ ID NO:39), survivina de vaca (NP_001001855, SEQ ID NO:40), survivina de gato (NP 001009280, SEQ ID NO:41), survivina de rato (NP_033819, SEQ ID NO:10), survivina de ratazana (AAF82586, SEQ ID NO:42), survivina de orangotango (CAH91231, SEQ ID NO:43), survivina de galinha (NP_001012318, SEQ ID NO:11), Xenopus laevis SIX (AAO20085, SEQ ID NO:13), homólogo da survivina de Xenopus laevis (AAM76714, SEQ ID NO:46), homólogo da survivina de Xenopus laevis 2 (AAH89271, SEQ ID NO:47), homólogo da survivina de peixe-gato (CK419466, SEQ ID NO:52), homólogo da survivina de peixe-zebra (NP_919378, SEQ ID NO:48), homólogo da survivina de peixe-zebra 2 (NP_660196, SEQ ID NO:49), homólogo tipo-survivina de peixe-balão (CAG04432, SEQ ID NO:50), e homólogo tipo-survivina de peixe-balão 2 (CAG07433, SEQ ID NO:51). O dominio BIR está sublinhado; asteriscos indicam residuos de assinatura envolvidos na coordenação de Zn; e tracejado indica lacunas no alinhamento. Nas sequências não humanas, os residuos que são idênticos aos residuos humanos são representados por pontos; outros residuos são representados em código de aminoácidos de uma só letra. A Figura 2 é uma tabela de percentagens de identidades de aminoácidos para comparações dos dominios BIR de vários homólogos da survivina. A sequência 1 é a sequência humana; a sequência 2 é de cão; a sequência 3 é de porco; a sequência 4 é de vaca; a sequência 5 é de gato; a sequência 6 é de rato; a sequência 7 é de ratazana; a sequência 8 é de orangotango; a sequência 9 é de galinha; a sequência 10 é da proteína SIX de sapo Xenopus laevis; a sequência 11 é de homólogo de sapo Xenopus laevis; a sequência 12 é de homólogo 2 de sapo Xenopus laevis; a sequência 13 é de um 10 homólogo de peixe-gato; a sequência 14 é de um homólogo de peixe-zebra; a sequência 15 é de homólogo 2 de peixe-zebra; a sequência 16 é de proteína 1 tipo survivina de peixe-balão; e sequência 17 é de proteína 2 tipo survivina de peixe-balão. A Figura 3 é um alinhamento das sequências do Domínio BIR de invertebrados com survivina humana. A sequência do domínio BIR da survivina humana é mostrada na SEQ ID NO:63. Os alinhamentos foram realizados pelo método ClustalW (ver Thompson et ai. (1994) Nucl. Acid Res. 22:4673-4680). As sequências foram obtidas a partir da base de dados NCBI, usando os seguintes números de acesso: survivina humana (NM_001168, sequência do domínio BIR mostrada na SEQ ID NO:63), D. melanogaster (AAF55399, homólogo do domínio BIR mostrado na SEQ ID NO:53) e C. elegans (NP_505949, homólogo do domínio BIR mostrado na SEQ ID NO: 54) . O domínio BIR está sublinhado; asteriscos indicam resíduos de assinatura envolvidos na coordenação de Zn; e tracejados indicam intervalos no alinhamento. Nas sequências não-humanas, os resíduos que são idênticos aos resíduos humanos são representados por pontos; outros resíduos são representados no código de aminoácidos de uma só letra. A Figura 4 é uma representação esquemática dos modos de vacinação de ADN por plasmídeos portadores de Salmonella que codificam um polipéptido de survivina. Salmonella no lúmen do intestino invade o epitélio do intestino através de células M das placas de Peyer. Uma vez atravessado o epitélio, a Salmonella invade células tais como macrófagos e células dendríticas. A morte bacteriana e a transferência de plasmídeo permitem expressão do plasmídeo pelos macrófagos, conduzindo à apresentação de péptidos do polipéptido de survivina codificado nas moléculas de classe I do MHC. Para além disso, a absorção por células 11 dendríticas de macrófagos apoptóticos expressando o polipéptido de survivina conduz a iniciação cruzada resultante da apresentação dos péptidos em moléculas de classe I do MHC e de classe II do MHC. A Figura 5 é um gráfico de barras representando a libertação de IFNy pelas Células T isoladas de ratos vacinados com survivina após exposição a células de cancro. A libertação de IFNy foi medida num ensaio ELISpot. Ratos C57B1/6 foram vacinados com Salmonella portadora de um plasmideo de expressão de survivina de galinha ou de murino, ou não foram vacinados (eixo do x) , e o número de pontos de IFNy por 5 x 105 de células T em placa foi medido (eixo dos y) após as células T terem sido expostas a linhas de células de cancro B16/KSA (barras com riscas) ou LLG/KSA (barras pretas). A Figura 6 é um gráfico de barras representando a libertação de IFNy pelas células T isoladas de ratos vacinados com survivina após exposição a células de cancro. A libertação de IFNy foi medida num ensaio ELISpot. Ratos Balb/c foram vacinados com Salmonella portadora de plasmideo de expressão de survivina de galinha ou de murino, ou não foram vacinados (eixo dos x) , e o número de pontos de IFNy por 5 x 105 células T em placa foi medido (eixo dos y) após as células T terem sido expostas a linhas de células de cancro 4T1/KSA (barras com riscas) ou A20 (barras pretas). A Figura 7 é um gráfico de sobrevivência de ratos vacinados com survivina de galinha ou survivina de murino de Salmonella SL7207. A percentagem de ratos Balb/c sobreviventes (eixo dos y) é representada em relação ao número de dias após o desafio com CT26/KSA (eixo dos x) 12 para ratos vacinados com Salmonella portadora de um plasmideo de expressão para survivina de murino (triângulos preenchidos) ou uma survivina de galinha (quadrados preenchidos), ou PBS (diamantes preenchidos). A Figura 8 é um gráfico de sobrevivência de ratos vacinados com survivina de galinha ou survivina de murino de Salmonella SL7207. A % de ratos C57B1/6 sobreviventes (eixo dos y) está representada contra o número de dias após o desafio com LLC/KSA (eixo dos x) para ratos vacinados com Salmonella portadora de um plasmideo de expressão para survivina de murino (triângulos preenchidos) ou uma survivina mutante de galinha, SurvivinadeGalinha (N97E, T99M, V100L, Q101G) (quadrados preenchidos), ou PBS (diamantes preenchidos). A Figura 9 é uma representação esquemática de um plano de dosagem para avaliar o efeito do momento da vacinação em relação ao desafio do tumor ao dia 10. "D" é uma abreviatura para "dia." Assim, por exemplo, alguns ratos receberam vacinação oral ao dia 1, um desafio ao tumor ao dia 10, e vacinação oral ao dia 13; outros ratos receberam um desafio ao tumor e vacinação oral ao dia 10, e uma segunda vacinação oral ao dia 18. As cargas de tumores pulmonares foram avaliadas ao dia 29. A Figura 10 é um gráfico que representa os pesos dos pulmões de ratos que receberam vacinação aos dias 1 e 13; 7 e 13; 10 e 18; ou 13 e 21; ou que receberam PBS. Todos os ratos receberam desafios ao tumor com células LLC/KSA por via intravenosa ao dia 10. As classificações das metástases pulmonares para cada um dos ratos são também fornecidas. A Figura 11 é uma representação esquemática de um plano de dosagem, incluindo vacinações mediadas por Salmonella com 13 survivina de galinha aos dias 1 e 15; desafio ao tumor intravenoso com células LLC/KSA ao dia 4; e ciclofosfamida intraperitoneal (CTX) ao dia 11 e tratamento com indometacina aos dias 12-15. Os pulmões foram classificados em relação à carga tumoral ao dia 28. A Figura 12 é um gráfico que representa os pesos dos pulmões para ratos que receberam apenas o desafio ao tumor (veículo); vacinação com survivina de galinha aos dias 1 (primária) e 15 (reforço) e desafio ao tumor ao dia 4 (PCB); CTX e indometacina e desafio ao tumor C(CI); primária, desafio, CTX, indometacina, e reforço (PC(CI)B); primária, desafio, CTX, e indometacina (PC(Cl)), ou desafio, CTX, indometacina e reforço C(CI)B. As classificações das metástases pulmonares para cada um dos ratos são também fornecidas. A Figura 13 fornece representações de dados de citometria de fluxo de células de sangue periférico que demonstram o aparecimento de uma nova população de células CD44bright, CD3low em ratos após vacinação com Salmonella portadora de um plasmídeo que codifica survivina de não-mamífero. 0 eixo dos x representa as células CD3 e o eixo dos y representa as células CD44. A Figura 14 é uma representação esquemática de um plano de dosagem, incluindo desafio ao tumor subcutâneo ao dia 1; vacinações mediadas por Salmonella com survivina de não-mamífero aos dias 4, 11, 18, e 25; e tratamento intravenoso com imunocitoquina aos dias 8, 9 e 10. A Figura 15 é um gráfico que representa os volumes dos tumores ao longo do tempo para ratos tratados com PBS; imunocitoquina; survivina de não-mamífero; ou imunocitoquina e survivina de-não mamífero. 14

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção melhora o tratamento do cancro ou outras doenças fornecendo composições e métodos que desencadeiam eficazmente uma resposta imune contra células doentes. 0 cancro é a doença alvo primária, embora a invenção se aplique a outras doenças e condições tais como proliferação indesejada de células normais, tal com tecido fibróide. A invenção também contempla composições e métodos para o tratamento de infeções virais, tais como infeções por HIV, infeções pelo virus influenza, e outras infeções virais.

Em particular, para o tratamento de cancro ou outros tumores, a presente invenção fornece composições e métodos para a apresentação de um péptido relacionado com uma proteina especifica do tumor ou enriquecida pelo tumor nas células apresentadoras de antigénios para desencadear uma resposta imune adaptativa num mamífero contra cancro ou células tumorais. Um antigénio especifico do tumor ou enriquecido pelo tumor preferido para esta invenção é a survivina.

Visão geral da apresentação de antigénios a Células T A apresentação de antigénios é um processo celular no qual as proteínas nas células são processadas em péptidos e depois traficadas de acordo com a via secretória para a superfície da célula. Os péptidos processados são traficados como um complexo estável com proteínas de membrana especializadas apresentadoras de péptidos, conhecidas como MHCs. Este processo permite que

componentes do sistema imune, e.g., células T helper (células T CD4+) e células T citotóxicas (CTLs ou células T 15 CD8+) , inspecionem as composições das células por amostragem de um complexo MHC-péptido. As células T helper interagem com os complexos MHC II-péptido, ao passo que as células T citotóxicas interagem com os complexos MHC I-péptido. A interação ocorre por via de um recetor de célula T (TCR) expressado à superfície de uma célula T. Cada célula T expressa um único TCR. À semelhança dos anticorpos, a diversidade de TCR é gerada através do rearranjo dos locais TCR cromossomais. Tal como com células produtoras de anticorpos, o encontro com um antigénio próprio (i.e., um péptido antigénio gerado a partir de uma proteína endógena presente na célula) durante a diferenciação das células T conduz à seleção negativa dessa célula T particular. Essas células T que não são eliminadas durante a seleção negativa continuam a desenvolver-se até células T maduras. Eventualmente, a interação com um antigénio estranho complexado com MHCs conduz à ativação de células T, especialmente na presença de uma estimulação secundária.

Survivina A proteína survivina é caracterizada por um domínio conservado de aproximadamente 70 aminoácidos, conhecido como domínio BIR (ou domínio IAP). Na survivina humana, o domínio BIR corresponde à região que vai desde Aspl6 até Leu87. Cancro ou células tumorais muitas vezes sobre-expressam a proteína survivina, o que se acredita que bloqueia a apoptose destas células e interfere assim com os mecanismos que previnem o crescimento anormal de cancro ou células tumorais. Células normais, por outro lado, expressam muito pouca survivina. Consequentemente, a survivina é um antigénio específico de tumor ou enriquecido pelo tumor ideal. É portanto um objeto da presente invenção 16 fornecer uma forma antigénica da proteína survivina às células apresentadoras de antigénio, de modo a que uma resposta imune às células tumorais expressando survivina possa ser estimulada. As proteínas survivina humanas e de mamífero e os genes são descritos em pormenor na Patente U.S. No. 6,245,523 ou WO 2004/067023.

Survivina de não-mamífero

Como mostrado neste pedido de patente, genes de survivina de não-mamífero e/ou proteínas podem ser usados em vacinas para cancro e outras doenças. Por exemplo, a imunização de um rato ou um humano com um ácido nucleico que codifica survivina de galinha pode gerar células T CD8+ que vão atacar células expressando survivina de rato ou humana, respetivamente. Esta descoberta indica que a proteína survivina de galinha é imunologicamente substancialmente semelhante à survivina humana, sugerindo que a survivina de galinha pode ser usada como uma forma antigénica da proteína survivina para desencadear uma resposta imune num mamífero.

As proteínas survivinas de espécies de mamíferos e de não-mamíferos estão alinhadas na Figura 1. As proteínas survivinas incluídas no alinhamento são survivina humana (Número de Acesso no Genbank NM_001168 ou 015392, SEQ ID NO:8), survivina de cão (Número de Acesso no Genbank NP 001003019, SEQ ID NO:9), survivina de porco (Número de Acesso no Genbank NP_999306, SEQ ID NO:39), survivina de vaca (Número de Acesso no Genbank NP_001001855, SEQ ID NO:40), survivina de gato (Número de Acesso no Genbank NP 001009280, SEQ ID NO:41), survivina de rato (Número de Acesso no Genbank NP_033819, SEQ ID NO:10), survivina de ratazana (Número de Acesso no Genbank AAF82586, SEQ ID NO:42), survivina de orangotango (Número de Acesso no 17

Genbank CAH91231, SEQ ID NO:43), survivina de galinha (Número de Acesso no Genbank NP_001012318, SEQ ID NO:11, "de tipo selvagem"), survivina SIX de Xenopus laevis (Número de Acesso no Genbank AA020085, SEQ ID NO: 13), homólogo da survivina de Xenopus laevis (Número de Acesso no Genbank AAM76714, SEQ IDNO:46), homólogo 2 da survivina de Xenopus laevis (Número de Acesso no Genbank AAH89271, SEQ ID NO:47), homólogo da survivina de peixe-gato (Número de Acesso no Genbank CK419466, SEQ ID NO:52), homólogo da survivina de peixe-zebra (Número de Acesso no Genbank NP_919378, SEQ ID NO:48), homólogo 2 da survivina de peixe-zebra (Número de Acesso no Genbank NP_660196, SEQ ID NO:49), homólogo tipo survivina de peixe-balão (Número de Acesso no Genbank CAG04432, SEQ ID NO:50), e homólogo 2 tipo survivina de peixe-balão (Número de Acesso no Genbank CAG07433, SEQ ID N0:51). Todas as sequências aqui divulgadas por Números de acesso no Genbank são incorporadas como referência. As sequências incluídas na Figura 1 são também listadas na listagem de sequências da especificação.

Para além disso, duas variantes de survivina de galinha são também incluídas na listagem de sequências anexa, variante 1 (Número de Acesso no Genbank NM_001012319,SEQ ID NO:44) que difere começando no resíduo de aminoácido 116 da sequência de survivina de galinha de tipo selvagem mostrada na SEQ ID NO: 11 para dar um terminal C diferente, e variante 2 (Número de Acesso no Genbank NP_001012317, SEQ ID NO:45) que difere começando no resíduo de aminoácido 38 da sequência de survivina de galinha de tipo selvagem mostrada na SEQ ID NO: 11.

As seguintes sequências adicionais são incluídas na listagem de sequências: survivina humana (Número de Acesso no Genbank NM 001168.2, SEQ ID NO:64); survivina de Homo 18 sapiens (Número de Acesso no Genbank 015392, SEQ ID NO:65); survivina de Canis familiaris (Número de Acesso no Genbank NM_0 01003019.1, SEQ ID NO:66); survivina de Sus scrofa (Número de Acesso no Genbank NP_999306.1, SEQ ID NO:67); survivina de Bos taurus (Número de Acesso no Genbank NP_001001855.2, SEQ ID NO:68); survivina de Felis catus (Número de Acesso no Genbank NP_001009280.1, SEQ ID NO:69); survivina de Mus musculus (Número de Acesso no Genbank NP 033819.1, SEQ ID NO:70); survivina de Rattus norvegicus (Número de Acesso no Genbank AAF82586.1, SEQ ID NO:71); survivina de Pongo pygmaeus (Número de Acesso no Genbank CAH91231.1, SEQ ID NO:72); survivina de Gallus gallus (Número de Acesso no Genbank NP_001012318.1, SEQ ID NO:73); survivina de SIX de Xenopus laevis (Número de Acesso no Genbank AAO20085.1, SEQ ID NO:74); homólogo de survivina de Xenopus laevis (Número de Acesso no Genbank AAM76714.1, SEQ ID NO:75); homólogo 2 de survivina de Xenopus laevis (Número de Acesso no Genbank AAH89271.1, SEQ ID NO:76); ácido nucleico que codifica survivina de Ictalurus punctatus (Número de Acesso no Genbank CK419466.1, SEQ ID NO:77); homólogo de survivina de Danio rerio (Número de Acesso no Genbank NP_919378.1, SEQ ID NO:78); homólogo 2 de survivina de Danio rerio (Número de Acesso no Genbank NP 660196.1, SEQ ID NO:79); homólogo tipo survivina de Tetraodon nigroviridis (Número de Acesso no Genbank CAG04432.1, SEQ ID NO:80); homólogo 2 tipo survivina de Tetraodon nigroviridis (Número de Acesso no Genbank CAG07433.1, SEQ ID NO:81); survivina de Drosophila melanogaster (Número de Acesso no Genbank AAF55399.1 , SEQ ID NO: 82); e survivina de Caenorhabditis elegans (Número de Acesso no Genbank NP_505949.1, SEQ ID NO:83). A invenção contempla usar não apenas as sequências de survivina que se encontram na natureza, tais como as 19 sequências de survivina divulgadas na FIG. 1, mas também outras sequências de aminoácidos que têm, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com pelo menos uma das sequências divulgadas na FIG. 1.

Conforme ilustrado na Figura 1, ao passo que as proteínas survivinas de mamífero no alinhamento são mais do que 80 % idênticas à survivina humana, os homólogos de não-mamíferos da survivina no alinhamento são menos de 60 % idênticos à survivina humana. No domínio BIR (a região sublinhada no alinhamento da Figura 1) , no entanto, as proteínas survivinas de não-mamífero são mais do que 60 % mas menos do que 80 % idênticas à survivina humana, enquanto que as proteínas survivinas de mamífero são mais do que 90 % idênticas à survivina humana. As percentagens de identidade dos pares de sequências dos domínios BIR dos homólogos da survivina estão resumidas na Figura 2. Por exemplo, a survivina de galinha é aproximadamente 78 % idêntica à survivina humana ao longo do domínio BIR.

De modo importante, como mostrado na Figura 1, há apenas um péptido 9-mero (18-26: STRAATFRN) (SEQ ID NO:7) na survivina de galinha no domínio BIR contendo mais do que 50 % de variação de aminoácidos em relação à sequência humana correspondente (5 dos 9 aminoácidos são diferentes neste péptido 9-mero particular). A maior parte dos péptidos 9-mero no domínio BIR da survivina de galinha contêm duas ou menos alterações da sequência (48 dos 64 péptidos) . Sem querer estar limitado pela teoria, é contemplado que este grau de conservação de sequência efetivamente torna a survivina de galinha imunologicamente substancialmente semelhante à survivina humana. 20

Em geral, a percentagem de identidade entre o domínio BIR de survivina de galinha e os domínios BIR de survivina de mamífero mostrada na Figura 2 varia entre aproximadamente 72 % e aproximadamente 78 %. Para além disso, cerca de 75 % dos péptidos 9-mero derivados de survivina de galinha dos domínios BIR contêm duas ou menos alterações de sequência comparado com os péptidos 9-mero de mamífero correspondentes. Por exemplo, a survivina de galinha é 75 % por cento idêntica à survivina de rato ao longo do domínio BIR, o que é consistente com o resultado de que a survivina de galinha é imunologicamente substancialmente semelhante à survivina de rato, como descrito no Exemplo 6 abaixo. A eficácia de uma composição de survivina de não-mamífero, tal como uma composição de survivina de galinha, para induzir uma resposta imune num rato contra um tumor expressando survivina de rato, como ilustrado nos Exemplos a seguir, realça um princípio da invenção, nomeadamente, que a vacinação de um mamífero com uma molécula de survivina de não-mamífero é útil para induzir resposta imune contra survivina de mamífero ou contra células sobre-expressando survivina de mamífero. Deste modo, a survivina de galinha é também útil para a produção de uma resposta imune eficaz em humanos contra células que sobre-expressam survivina humana, tais como muitas células tumorais, uma vez que a resposta imunológica é suficientemente conservada entre mamíferos.

Pelo contrário, um alinhamento dos domínios BIR de invertebrados com o domínio BIR da survivina humana mostra que os domínios BIR de D. melanogaster (AAF55399, SEQ ID NO:53) e C. elegans (NP_505949, SEQ ID NO:54) são 50 % ou menos idênticos à sequência do domínio BIR da survivina humana (Figura 3), embora resíduos críticos para a quelação de Zn sejam conservados (ver asteriscos no alinhamento na 21

Figura 3). Por exemplo, o domínio BIR da survivina de mosca é cerca de 50 % idêntico ao domínio BIR da survivina humana. De modo importante, o domínio BIR de mosca contém apenas três (3 de 64) péptidos 9-mero que têm duas ou menos substituições de aminoácidos comparado com os péptidos humanos correspondentes.

De acordo com a invenção, o termo "survivina de não-mamífero, " conforme aqui usado, engloba pelo menos qualquer proteína survivina tendo um domínio BIR (ou um domínio IAP) com pelo menos mais do que 50% de identidade de aminoácidos mas menos do que 90% de identidade de aminoácidos com o domínio BIR da survivina humana, por exemplo pelo menos 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% de identidade com o domínio BIR da survivina humana.

Para calcular a percentagem de identidade, os aminoácidos alinhados de cada sequência são comparados sequencialmente. Se os aminoácidos não forem idênticos, a classificação da identidade do par é zero; caso contrário, a classificação da identidade do par é 1,0. A classificação da identidade bruta é a soma de aminoácidos idênticos alinhados. A classificação bruta é depois normalizada dividindo pelo número de aminoácidos no candidato mais pequeno ou das sequências de referência e multiplicando o resultado por 100. A classificação bruta normalizada é a percentagem de identidade. Inserções e deleções são ignoradas para o objetivo de calcular a percentagem de identidade. Do mesmo modo, penalidades para lacunas não são usadas neste cálculo. Métodos para gerar alinhamentos de múltiplas sequências são bem conhecidos pelos praticantes da técnica. Para alinhar sequências de survivina, foi usado o módulo Megalign 6.1 do pacote de software ADNSTAR Lasergene™ 6, aplicando o 22 algoritmo de alinhamento ClustalV, usando configurações padrão (Higgins e Sharp (1989) Comput Appl Biosci. 5:151-3). Para o subalinhamento dos domínios BIR da survivina, o método ClustalW ("lento-preciso") foi aplicado, usando configurações padrão (Thompson et al., (1994) Nucleic Acid Res. 22:4673-80). É contemplado que survivina de não-mamífero pode também conter mais péptidos com o potencial de gerar uma resposta de células T helper mais do que a survivina de mamífero. Sem querer estar limitado pela teoria, é contemplado que um efeito imunizador melhorado pode ser conseguido com o envolvimento de ambas as células T citotóxicas, através de MHC I, e das células T helper, através de MHC II, na resposta imune. Diferenças nas sequências entre a survivina humana endógena e a survivina de não-mamífero é provável que façam com que alguns péptidos sejam apresentados aos quais o sistema imune humano não foi tornado tolerante. A presença de potenciais epitopos MHC II pode ser analisada usando algoritmos preditivos publicamente disponíveis, tais como ProPred Analysis (www.imtech.res.in/raghava/propred; Singh et al., (2001) Bioinformatics 17:1236-1237. Usando esses algoritmos, verificou-se que, em relação às proteínas survivinas de mamífero, tais como survivina humana ou de cão, as proteínas survivinas de não-mamífero, tais como a survivina de galinha ou a survivina SIX de sapo prediz-se que contêm mais péptidos que se ligam e/ou péptidos com maior afinidade de ligação para moléculas de MHC II (ver Tabela 1). 23

Tabela 1. Predição da ligação de péptidos a HLA-DR humana # | Péptido | #ligação | classificação Survivina humana (SEQ IN NO: 8) 10 WQPFLKDHR 2 59, 1 (resíduos 10-18 da SEQ ID NO 8) 13 FLKDHRIST 9 272,5 (resíduos 13-21 da SEQ ID NO 8) 14 LKDHRISTF 3 68,2 (resíduos 14-22 da SEQ ID NO 8) 19 ISTFKNWPF 3 81,6 (resíduos 19-27 da SEQ ID NO 8) 22 FKNWPFLEG 4 95, 9 (resíduos 22-30 da SEQ ID NO 8) 28 LEGCACTPE 1 21,3 (resíduos 28-36 da SEQ ID NO- 8) 43 FIHCPTENE 4 114,6 (resíduos 43-51 da SEQ ID NO 8) 58 FFCFKELEG 3 80,6 (resíduos 58-66 da SEQ ID NO 8) 74 IEEHKKHSS 11 320,3 (resíduos 74-82 da SEQ ID NO 8) 86 FLSVKKQFE 5 142,5 (resíduos 86-94 da SEQ ID NO 8) 87 LSVKKQFEE 3 79, 9 (resíduos 87-95 da SEQ ID NO 8) 96 LTLGEFLKL 5 148,5 resíduos 96-104 da SEQ ID NO 8) 98 LGEFLKLDR 7 171,3 (resíduos 98-106 da SEQ ID NO: 8) 101 FLKLDRERA 5 106,3 (resíduos 101-109 da SEQ ID NO: 8) 102 LKLDRERAK 1 20,0 (resíduos 102-110 da SEQ ID NO: 8) 113 IAKETNNKK 2 48,8 (resíduos 113-121 da SEQ ID NO:8) # | Péptido | #ligação | classificação Survivina de cão (SEQ IN NO: 9) 10 WQPFLKDHR 2 59, 1 (resíduos 10-18 da SEQ ID NO 9) 13 FLKDHRIST 9 272,5 (resíduos 13-21 da SEQ ID NO 9) 14 LKDHRISTF 3 68,2 (resíduos 14-22 da SEQ ID NO 9) 19 ISTFKNWPF 3 81,6 (resíduos 19-27 da SEQ ID NO 9) 22 FKNWPFLEG 4 95, 9 (resíduos 22-30 da SEQ ID NO 9) 43 FIHCPTENE 4 114,6 (resíduos 43-51 da SEQ ID NO- - 9) 58 FFCFKELEG 4 80,6 (resíduos 58-66 da SEQ ID NO 9) Survivina de cão (SEQIN NO:9) 74 IEEHKKHSS 11 320,3 (resíduos 74-82 da SEQ ID NO 9) 86 FLSVKKQFE 5 142,5 (resíduos 86-94 da SEQ ID NO 9) 87 LSVKKQFEE 3 79, 9 (resíduos 87-95 da SEQ ID NO 9) 96 LTLGEFLKL 5 148,5 resíduos 96-104 da SEQ ID NO 9) 98 LGEFLKLDR 7 171,3 (resíduos 98-106 da SEQ ID NO: 9) 101 FLKLDRERA 5 106,3 (resíduos 101-109 da SEQ ID NO: 9) 102 LKLDRERAK 1 20,0 (resíduos 102-110 da SEQ ID NO: 9) 103 IAKETNNKK 2 48,8 (resíduos 113-121 da SEQ ID NO:9) # | Péptido #ligação | classificação Survivina de rato (SEQ IN NO:10) 6 LPQIWQLYL 2 70,7 (resíduos 6-14 da SEQ ID NO: 10) 10 WQPFLKDHR 26 897,3 (resíduos 10-18 da SEQ ID NO 10) 12 LYLKNYRIA 10 278,3 (resíduos 12-20 da SEQ ID NO 10) 13 YLKNYRIAT 8 202,3 (resíduos 13-21 da SEQ ID NO 10) 14 LKNYRIATF 19 627,3 (resíduos 14-22 da SEQ ID NO 10) 17 YRIATFKNW 5 139, 8 (resíduos 17-25 da SEQ ID NO 10) 19 IATFKNWPF 4 111,6 (resíduos 19-27 da SEQ ID NO 10) 22 FKNWPFLED 2 55, 9 (resíduos 22-30 da SEQ ID NO 10) 43 FIHCPTENE 4 114,6 (resíduos 43-51 da SEQ ID NO 10) 58 FFCFKELEG 3 80,6 (resíduos 58-66 da SEQ ID NO 10) 67 WEPDDNPIE 1 26,3 (resíduos 67-75 da SEQ ID NO 10) 86 FLTVKKQME 3 91,7 (resíduos 86-94 da SEQ ID NO 10) 87 LTVKKQMEE 4 135, 9 (resíduos 87-95 da SEQ ID NO 10) 96 LTVSEFLKL 4 146, 9 resíduos 96-104 da SEQ ID NO 10) 101 FLKLDRQRA 13 305, 6 (resíduos 101-109 da SEQ ID NO: 10) 102 LKLDRQRAK 8 223, 6 (resíduos 102-110 da SEQ ID NO: 10) 113 IAKETNNKQ 3 90,8 (resíduos 113-121 da SEQ ID NO:10) # Péptido #ligação | classificação Survivina de galinha (SEQ IN NO:11) 1 MAAYAEMLP 2 42,9 (resíduos 1-9 da SEQ ID NO: 11) 7 MLPKEWLVY 2 51,0 (resíduos 7-15 da SEQ ID NO: 11) 12 WLVYLVSTR 11 315,7 (resíduos 12-20 da SEQ ID NO: 11) 13 LVYLVSTRA 34 1188,0 (resíduos 13-21 da SEQ ID NO: 11) 14 VYLVSTRAA 28 842,9 (resíduos 14-22 da SEQ ID NO: 11) 15 YLVSTRAAT 3 70,8 (resíduos 15-23 da SEQ ID NO: 11) 16 LVSTRAATF 8 234,7 (resíduos 16-24 da SEQ ID NO: 11) 24 FRNWPFTEG 2 46,4 (resíduos 24-32 da SEQ ID NO: 11) 45 FVHCPSENS 23 656,0 (resíduos 45-53 da SEQ ID NO: 11) 56 VVQCFFCLK 2 42,9 (resíduos 56-64 da SEQ ID NO: 11) 57 VQCFFCLKE 14 428,5 (resíduos 57-65 da SEQ ID NO: 11) 60 FFCLKELEG 3 81,0 (resíduos 60-68 da SEQ ID NO: 11) Survivina de galinha (SEQ IN NO:11) 61 FCLKELEGW 2 41,5 (resíduos 61-69 da SEQ ID NO: 11) 76 LEEHKKHSA 7 161,8 (resíduos 76-84 da SEQ ID NO: 11) 91 LQKDPSNLT 8 226, 6 (resíduos 91-99 da SEQ ID NO: 11) 98 LTVQEFLKL 2 48,3 (resíduos 98-106 da SEQ ID NO: 11) 100 VQEFLKLDK 14 377,6 (resíduos 100-108 da SEQ ID NO 11) 103 FLKLDKKRT 9 236,2 (resíduos 103-111 da SEQ ID NO 11) 104 LKLDKKRTK 19 686, 1 (resíduos 104-112 da SEQ ID NO 11) 114 VIKKAISQK 3 90,1 (resíduos 114-122 da SEQ ID NO 11) 115 IKKAISQKE 3 78,6 (resíduos 115-123 da SEQ ID NO 11) 129 VAKGVRHAI 2 46, 9 (resíduos 129-137 da SEQ ID NO 11) # 1 Péptido | #ligação | classificação Survivina de galinha (N97E ,T99M,V100L, Q101G) (SEQ ID NO:12) 1 MAAYAEMLP 2 42,9 (resíduos 1-9 da SEQ ID NO: 12) 7 MLPKEWLVY 2 51,0 (resíduos 7-15 da SEQ ID NO: 12) 12 WLVYLVSTR 11 315,7 (resíduos 12-20 da SEQ ID NO: 12) 13 LVYLVSTRA 34 1188,0 (resíduos 13-21 da SEQ ID NO: 12) 14 VYLVSTRAA 28 842,9 (resíduos 14-22 da SEQ ID NO: 12) 15 YLVSTRAAT 3 70,8 (resíduos 15-23 da SEQ ID NO: 12) 16 LVSTRAATF 8 234,7 (resíduos 16-24 da SEQ ID NO: 12) 24 FRNWPFTEG 2 46,4 (resíduos 24-32 da SEQ ID NO: 12) 45 FVHCPSENS 23 656,0 (resíduos 45-53 da SEQ ID NO: 12) 56 VVQCFFCLK 2 42,9 (resíduos 56-64 da SEQ ID NO: 12) 57 VQCFFCLKE 14 428,5 (resíduos 57-65 da SEQ ID NO: 12) 60 FFCLKELEG 3 81,0 (resíduos 60-68 da SEQ ID NO: 12) 61 FCLKELEGW 2 41,5 (resíduos 61-69 da SEQ ID NO: 12) 76 LEEHKKHSA 7 161,8 (resíduos 76-84 da SEQ ID NO: 12) 91 LQKDPSELM 9 312,0 (resíduos 91-99 da SEQ ID NO: 12) 98 LMLGEFLKL 5 201,1 (resíduos 98-106 da SEQ ID NO: 12) 100 LGEFLKLDK 3 79,5 (resíduos 100-108 da SEQ ID NO 12) 103 FLKLDKKRT 9 236,2 (resíduos 103-101 da SEQ ID NO 12) 104 LKLDKKRTK 19 686, 1 (resíduos 104-112 da SEQ ID NO 12) 114 VIKKAISQK 3 90,1 (resíduos 114-122 da SEQ ID NO 12) 115 IKKAISQKE 3 78,6 (resíduos 115-123 da SEQ ID NO 12) 129 VAKGVRHAI 2 46, 9 (resíduos 129-137 da SEQ ID NO 12) Survivina SIX de sapo (SEQ ID NO:13) 1 MLSISPIVS 35 1104,7 (resíduos 1-9 da SEQ ID NO: 13) 2 LSISPIVSL 3 135, 9 (resíduos 2-10 da SEQ ID NO: 13) 4 ISPIVSLRR 6 143,4 (resíduos 4-12 da SEQ ID NO: 13) 7 IVSLRRCDN 30 926, 8 (resíduos 7-15 da SEQ ID NO: 13) 8 VSLRRCDNE 1 22, 1 (resíduos 8-16 da SEQ ID NO: 13) 10 LRRCDNEPS 27 867,5 (resíduos 10-18 da SEQ ID NO: 13) 23 WRLYNLATR 28 1040,3 (resíduos 23-31 da SEQ ID NO: 13) 25 LYNLATRLR 22 716,5 (resíduos 25-33 da SEQ ID NO: 13) 25

Survivina SIX de 2 6 YNLATRLRT sapo 21 (SEQ ID NO:13) 663,2 (resíduos 26-34 da SEQ ID NO: 13) 28 LATRLRTFS 2 59, 1 (resíduos 28-36 da SEQ ID NO: 13) 32 LRTFSNWPF 20 710,0 (resíduos 32-40 da SEQ ID NO: 13) 56 FVHCPTDNS 21 683, 3 (resíduos 56-64 da SEQ ID NO: 13) 67 WKCFFCLK 2 42,9 (resíduos 67-75 da SEQ ID NO: 13) 68 VKCFFCLKE 12 374,2 (resíduos 68-76 da SEQ ID NO: 13) 71 FFCLKELEG 3 81,0 (resíduos 71-79 da SEQ ID NO: 13) 72 FCLKELEGW 2 41,5 (resíduos 72-80 da SEQ ID NO: 13) 98 LFIALKKKA 30 1015,6 (resíduos 98-106 da SEQ ID NO: 13) 99 FIALKKKAE 9 325, 6 (resíduos 99-107 da SEQ ID NO: 13) 100 IALKKKAEE 13 464,8 (resíduos 100-108 da SEQ ID NO : 13) 109 LTLSEFLKL 4 165, 8 (resíduos 109-117 da SEQ ID NO : 13) 111 LSEFLKLDL 3 81,6 (resíduos 111-119 da SEQ ID NO : 13) 115 LKLDLEHTK 6 164,7 (resíduos 115-123 da SEQ ID NO : 13) 124 IKMQKQMNL 28 729, 2 (resíduos 124-132 da SEQ ID NO : 13) 126 MQKQMNLHI 14 419, 4 (resíduos 126-134 da SEQ ID NO : 13) 130 MNLHIERFQ 12 410,6 (resíduos 130-138 da SEQ ID NO : 13) 134 IERFQAKAN 1 24,4 (resíduos 134-142 da SEQ ID NO : 13) 144 VRGHLEKLD 4 103, 7 (resíduos 144-152 da SEQ ID NO : 13) A Tabela 1 mostra a posição de partida (#) e sequência (Péptido) de cada péptido 9-mero que se liga pelo menos a um alelo HLA-DR. #ligação refere-se ao número de alelos a que os péptidos se ligam (em cada 50), acima de um limite arbitrário de ligação, neste caso 20 %. O limite de 20 % refere-se a 20 % da classificação máxima teórica de ligação, calculada por um algoritmo como implementado em Propred. A classificação refere-se a uma classificação cumulativa ao longo de todos os alelos HLA aos quais esse péptido se liga. Como referência, o péptido VVHFFKNIV (SEQ ID NO: 14) da proteína básica de mielina humana (MBP), derivado de uma porção da proteína conhecida por originar anticorpos anti-MBP em humanos (MBP(85-99)) liga-se a 29 alelos HLA, com uma classificação cumulativa de 1087,6.

Survivina modificada

Noutro aspeto, a invenção fornece formas antigénicas da proteína survivina através da introdução de modificações nas proteínas survivinas de mamífero. Especificamente, a invenção contempla péptidos de survivina de mamífero modificados que são biologicamente inertes mas 26 imunologicamente substancialmente semelhantes à survivina de mamífero. Este aspeto da invenção também aborda dois problemas específicos com uma abordagem ingénua de expressar simplesmente uma proteína survivina no citoplasma de uma célula apresentadora de antigénio. 0 primeiro problema é que a proteína survivina biologicamente ativa pode quebrar a fisiologia da célula apresentadora de antigénios. 0 segundo problema é que quando a survivina ou essencialmente qualquer outra proteína é expressada numa célula, apenas uma pequena fração da proteína é degradada de tal modo que os péptidos antigénicos são apresentados através do MHC de Classe I à superfície da célula.

Deste modo, a invenção contempla proteínas survivinas de mamífero modificadas, incluindo versões mutantes de survivina humana. A invenção contempla também o uso não só das sequências de survivina que se encontram na natureza, tais como as sequências de survivina divulgadas na FIG. 1, mas também outras sequências de aminoácidos que têm, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de aminoácidos com pelo menos uma das sequências divulgadas na FIG. 1. A estrutura da survivina humana foi determinada (Chantalat et ai., (2000) Mol. Cell 6:183-189; Protein Data Bank (PDB) repositório de estruturas de proteína número de Acesso: PDB ID 1E31 ; Verdecia et ai, (2000) Nat. Struct. Bio. 7:602-608; Protein Data Bank (PDB) repositório de estruturas de proteína número de Acesso: PDB ID 1F3H. Com base na estrutura 3-D, a survivina humana contém pelo menos dois domínios: um domínio globular N-terminal que inclui um sítio de ligação a zinco, referido como o domínio BIR ou IAP, e uma hélice-alfa C-terminal estendida, aqui referida como o domínio helicoidal. Numa forma de realização 27 preferida, a invenção fornece formas de survivina com uma mutação no domínio BIR N-terminal e/ou no domínio helicoidal C-terminal. É entendido na invenção que um efeito ótimo pode ser conseguido mutando ambos os domínios. Sem querer estar limitado pela teoria, pensa-se que o domínio BIR N-terminal e o domínio helicoidal C-terminal têm cada um uma atividade biológica. Por exemplo, o domínio BIR tem algum nível de atividade anti-apoptótica, mesmo na ausência do domínio helicoidal. Para além disso, o domínio helicoidal tem uma atividade de ligação ao citoesqueleto, e pode ter uma atividade biológica distinta.

Especificamente, no domínio BIR, por exemplo, mutações preferidas incluem, mas não estão limitadas a, substituições de aminoácidos nas posições correspondentes a Cys57, Cys60, His77, ou Cys84 da survivina humana. Por exemplo, um domínio BIR modificado pode conter pelo menos uma das seguintes substituições: Cys57Ser, Cys60Ser, His77Phe, e Cys84Ser. Substituições de qualquer um destes aminoácidos para alanina ou prolina são também preferidas. Acredita-se que estas mutações interferem com o sítio de ligação a zinco no domínio BIR. Outras mutações que têm o efeito de interferir com o sítio de ligação a zinco podem também ser usadas. Para além disso, mutações na posição correspondente à Argl8 da survivina humana, preferencialmente para ácido aspártico ou ácido glutâmico, podem ser usadas para gerar um domínio BIR inativo. Domínios BIR modificados nos quais os aminoácidos de ligação ao zinco são mutados em duas, três, ou quatro posições são particularmente preferidos. É geralmente útil introduzir resíduos de prolina em qualquer parte do domínio helicoidal de modo a quebrar a sua função. Em particular, substituições de prolina podem ser introduzidas nas posições correspondentes à Alal28 ou 28

Ilel35 da survivina humana. Outras substituições de aminoácidos que podem interferir com o domínio helicoidal são também preferidas.

Uma survivina de mamífero modificada preferida pode conter uma mutação na Argl8, Cys57, Cys60, His77, e/ou Cys84 e uma prolina no domínio helicoidal. Cada um dos aminoácidos acima mencionados nas posições Argl8, Cys57, Cys60, His77, Cys84, Alal28, e Ilel35 são conservados entre a survivina humana e de galinha e, deste modo, mutações idênticas podem ser introduzidas para gerar uma survivina de galinha biologicamente inerte. Mutações semelhantes podem também ser introduzidas nas posições correspondentes em outras proteínas survivinas de não-mamífero.

Qualquer uma das mutações acima pode ser combinada com uma mutação na posição correspondentes à Leu98 da survivina humana, tal como, por exemplo, Leu98Arg, Leu98Lys, e Leu98Ala. Na survivina de galinha, a posição correspondente à Leu98 humana é VallOO.

Outras mutações úteis podem ser identificadas por experiências de rotina, como descrito nos Exemplos. Por exemplo, uma mutação é introduzida numa proteína survivina e testada, por exemplo, em relação à falta de atividade biológica, e/ou melhor degradação, e/ou capacidade de induzir uma resposta imune contra células tumorais. Ensaios exemplificativos para estes testes são descritos nos exemplos abaixo e são conhecidos na técnica.

Geralmente, um péptido de survivina modificado preferido contém três, quatro, cinco ou mais mutações. No entanto, uma utilidade da survivina modificada contemplada pela invenção é apresentar péptidos de epitopo das células T derivados da survivina através de moléculas do MHC de 29

Classe I. Do mesmo modo, é geralmente preferido mutar menos do que cinquenta (ou menos do que trinta ou menos do que vinte) aminoácidos para manter uma semelhança imunologicamente substancial com a survivina de mamífero.

Apresentação de antigénios A invenção fornece diretrizes para introduzir otimamente mutações na survivina ou outras sequências de proteínas de modo a que o processamento de epitopos do MHC de Classe I seja relativamente desimpedido.

É possível que certas mutações da survivina se encontrem num segmento de péptido que é apresentado por uma molécula do MHC de Classe I e reconhecidas por um recetor das células T específico. É também possível que a mutação possa alterar o processamento proteolítico da survivina em epitopos de péptido de modo que um epitopo é clivado, ou um epitopo não é clivado mas um novo epitopo é preferencialmente criado. Para abordar o problema da apresentação de antigénios, é possível usar bases de dados disponíveis publicamente e informação para identificar epitopos do MHC de Classe I candidatos numa proteína survivina, e depois determinar se uma mutação altera um epitopo. Por exemplo, o algoritmo SYFPEITHI pode ser usado (www.uni-tuebingen.de.uni.kxi; ver também, Rammensee et al, (1999) Immunogenetics 50:213-219, cujos ensinamentos são aqui incorporados como referência). Alternativamente, o algoritmo BIMAS pode também ser usado (bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/; ver também, Parker et al, (1994) J. Immunol. 152:163-175, cujos ensinamentos são aqui incorporados como referência) . Uma vez que os genes HLA que codificam as proteínas do MHC de Classe I humana são altamente polimórficos, com diferentes proteínas do MHC 30 de Classe I a ligarem-se a diferentes motivos peptidicos, uma tabela de potenciais epitopos é criada, tendo num dos eixos várias moléculas do MHC de Classe I e no outro eixo uma sequência da survivina. As entradas na tabela identificam as posições de um epitopo para uma dada molécula do MHC de Classe I. O efeito de uma mutação candidata é julgado com base no efeito em vários epitopos. No fim, uma mutação ou mutações são escolhidas com base nas necessidades de uma vacina, tendo em consideração, por exemplo, a frequência alélica dos diferentes alelos HLA, ou a frequência especifica de grupos de alelos HLA. Para abordar este problema de processamento proteolítico, de acordo com a invenção é possivel usar bases de dados publicamente disponíveis e informação para identificar sitios de clivagem proteassómica candidatos, e para depois determinar se uma mutação altera esse sitio de clivagem. Por exemplo, a base de dados disponível publicamente NetChop pode ser usada (www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/). É geralmente preferível evitar alterar sítios de clivagem.

Para fins ilustrativos, o Exemplo 12 fornece análise exemplificativa na determinação de substituições úteis na proteina survivina.

De acordo com a invenção, é também útil considerar o "imunoproteassoma." Nas células apresentadoras de antigénio, o proteassoma tem uma composição algo diferente das proteínas e a sua especificidade proteolítica é dominada por uma enzima que cliva a terminação C em residuos hidrofóbicos. Como resultado, o proteassoma produz péptidos que se podem ligar ao MHC de Classe I com um resíduo âncora hidrofóbico C-terminal. Se for desejável manter a especificidade do padrão de clivagem do imunoproteassoma, é preferível evitar a mutação desses resíduos hidrofóbicos, particularmente leucina, isoleucina, 31 metionina, tirosina, triptofano, e fenilalanina. Do mesmo modo, é também preferível evitar a mutação de outros resíduos para leucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, e fenilalanina. Assim, as mutações em Argl8, Cys57, Cys60, His77, e Cys84 têm a vantagem de destabilizarem a estrutura da survivina e de não eliminarem os sítios de clivagem do imunoproteassoma. Para além disso, é preferível evitar introduzir mutações nos 7 a 9 aminoácidos imediatamente N-terminais à leucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, e fenilalanina na sequência da proteína.

Deste modo, a invenção fornece um método geral para identificar sítios de mutação preferidos numa sequência de proteína para gerar uma proteína com imunogenicidade melhorada. Com base neste método, um sítio de mutação preferido numa sequência de proteína tem as seguintes propriedades. Primeiro, uma ou mais mutações do sítio destabilizam a estrutura da proteína. Segundo, a mutação destabilizadora não introduz uma leucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, ou fenilalanina. Terceiro, o aminoácido normal nessa posição não é leucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, ou fenilalanina. Este método pode ser aplicado a uma grande variedade de proteínas que podem ser usadas como antigénios, tais como, por exemplo, antigénios específicos de tumores, antigénios virais, e outros antigénios. De entre os antigénios específicos de tumores, para além da survivina, o método pode ser aplicado a moléculas de adesão de células epiteliais, oncogenes tais como Ras, antigénio carcinoembrionário, e outros. De entre os antigénios virais, o método pode ser aplicado a p24 de HIV, hemaglutinina de influenza, e outras proteínas virais. 32

Proteínas de fusão compreendendo survivina de não-mamífero e/ou modificada

Com vista a promover a degradação da porção de survivina e o seu processamento em péptidos que podem ser apresentados através de moléculas do MHC de Classe I, é desejável fundir a survivina de não-mamifero ou os péptidos de survivina mutantes descritos acima a uma segunda proteina adequada. Por exemplo, a ubiquitina é um parceiro de fusão particularmente preferido para este fim. A proteina de fusão ubiquitina-survivina pode ser construída numa das seguintes configurações: N terminal-ubiquitina-survivina-C terminal ou N terminal-survivina-ubiquitina-C terminal. N terminal-ubiquitina-survivina-C terminal é a orientação preferida. Para além disso, é desejável a mutação da metionina N-terminal da survivina, preferencialmente para arginina, ácido aspártico, ou ácido glutâmico. É também desejável introduzir uma lisina numa posição correspondente à Ilel9 ou Val21 da survivina humana numa proteina de fusão ubiquitina-survivina. É também desejável fundir a survivina da presente invenção a uma porção Fc. Uma porção Fc preferida contém dominios CH2 e CH3 de anticorpo, e opcionalmente contém uma região de charneira. A porção Fc pode ser fundida ao N-terminal ou ao C-terminal da survivina. A sequência da proteina de Fc-Survivina de Galinha madura humana é mostrada na SEQ ID NO:25. A sequência da proteina para Fc-Survivina de Galinha madura de murino é mostrada na SEQ ID NO:27.

Para além disso, uma proteina de fusão contendo a survivina e as porções Fc pode ainda conter outras porções, tais como citoquinas que estimulam o sistema imune como descrito na Publicação PCT WO 01/07081. Sem querer estar limitado pela teoria, a presença da porção Fc pode melhorar a absorção de 33 proteínas de fusão contendo survivina para as células apresentadoras de antigénios. É geralmente preferível que a porção Fc seja derivada do organismo a ser tratado. Por exemplo, para tratamento de um humano, é preferível usar uma porção Fc humana.

As proteínas de fusão Fc-survivina ou os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão podem preferencialmente conter uma sequência de sinal para secreção. A presença da sequência de sinal facilita a expressão das proteínas de fusão em linhas de células de mamífero, tais como células NS/0, e pode permitir a secreção da proteína de fusão in vivo se um ácido nucleico correspondente for administrado a um doente. As sequências que codificam a proteína de fusão Fc-survivina começam preferencialmente numa direção 5' para 3' com uma "sequência líder" derivada, por exemplo, de uma cadeia leve (L) de anticorpo, fundida na estrutura com pelo menos uma porção de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou forma mutante desta, preferencialmente da região Fcyl do gene γΐ da imunoglobulina humana. A região Fcyl do gene Fcyl da imunoglobulina inclui preferencialmente pelo menos uma porção do domínio de charneira e um domínio CH3, e mais preferencialmente inclui pelo menos um domínio de charneira, um domínio CH2 e um domínio CH3. A porção de ADN que codifica a sequência de sinal codifica preferencialmente um segmento de péptido que controla a secreção da proteína de fusão Fc e depois disso é clivado em relação à restante proteína de fusão Fc. A sequência de sinal da invenção é um polinucleótido que codifica uma sequência de aminoácidos que inicia o transporte de uma proteína através da membrana do retículo endoplasmático. As sequências de sinal que são úteis na invenção incluem sequências de sinal da cadeia leve de anticorpo, e.g., 34 anticorpo 14.18 (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Meth. 125:191), sequências de sinal de cadeia pesada de anticorpo, e.g., sequência de sinal da cadeia pesada M0PC141 de anticorpo (Sakano et al. (1980) Nature, 286:5774), e quaisquer outras sequências de sinal que são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Watson (1984) Nucleic Acids Research. 12:5145).

As sequências de sinal foram bem caracterizadas na técnica e são conhecidas por conterem tipicamente 16 a 30 resíduos de aminoácidos, e podem conter mais ou menos resíduos de aminoácidos. Um péptido de sinal típico consiste em três regiões: uma região N-terminal básica, uma região hidrofóbica central, e uma região C-terminal mais polar. A região hidrofóbica central contém 4 a 12 resíduos hidrofóbicos que ancoram o péptido de sinal ao longo da bicamada lipídica da membrana durante o transporte do polipéptido nascente. A seguir à iniciação, o péptido de sinal é normalmente clivado no lúmen do retículo endoplasmático por enzimas celulares conhecidas como peptidases de sinal. Os sítios de clivagem potenciais do péptido de sinal geralmente seguem a "regra (-3, -1)." Deste modo, um péptido de sinal típico tem pequenos resíduos de aminoácidos neutros nas posições -1 e -3 e falta-lhe os resíduos de prolina nesta região. A peptidase de sinal vai clivar esse péptido de sinal entre os aminoácidos -1 e +1. Assim, a sequência de sinal pode ser clivada da terminação amino da proteína de fusão durante a secreção. Isto resulta na secreção de uma proteína de fusão Fc. As sequências de péptido de sinal úteis na prática da invenção são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, von Heijne (1986) Nucleic Acids Res., 14:4683. 35

Os termos "sequência de sinal," "péptido de sinal," "sequência lider," ou "péptidos lider" são aqui usados intercambiavelmente. A proteina de fusão secretada pode geralmente ter um dominio Fc corretamente dobrado, mas com uma porção de survivina incorretamente dobrada. Sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se que quando a survivina é forçada para a via secretória pela porção Fc de uma proteina de fusão Fc-survivina, a dobragem da survivina é comprometida, particularmente uma vez que a survivina contém várias cisternas que podem participar na ligação dissulfeto. A dobragem correta da porção de survivina não é necessária para a atividade das vacinas da invenção.

Como uma alternativa às proteínas de fusão por técnicas de modificação genética, a conjugação química usando ligantes cruzados químicos convencionais pode ser usada para unir porções de proteína. Ácidos nucleicos A invenção fornece também ácido nucleicos que codificam a survivina de não-mamífero e/ou modificada e proteínas de fusão incluindo a survivina como descrito acima. Por exemplo, a sequência de nucleótidos para a survivina humana é mostrada na SEQ ID NO: 57, a sequência de nucleótidos para a survivina SIX de Xenopus é mostrada na SEQ ID NO:58, a sequência de nucleótidos para o homólogo da survivina de Xenopus é mostrada na SEQ ID NO:59, a sequência de nucleótidos para o homólogo da survivina de peixe-zebra é mostrada na SEQ ID NO:60, e a sequência de nucleótidos para o homólogo da survivina de peixe-gato é mostrada na SEQ ID NO:61. Os ácidos nucleicos são preferencialmente ligados a e interdigitados com elementos que permitem a expressão em 36 células eucarióticas, particularmente, nas células de mamífero, para formar cassetes de expressão. Tipicamente, uma cassete de expressão que codifica survivina inclui pelo menos um dos seguintes elementos regulatórios tais como promotores, melhoradores, intrões, terminadores, sinais de poliadenilação e outros. Preferencialmente, um promotor de mamífero é incluído. Conforme aqui usado, por "promotor de mamífero" significa um gene promotor que é derivado de um promotor encontrado num mamifero ou num virus que normalmente cresce num mamifero. Por exemplo, promotores preferidos incluem aqueles que estão presentes em vírus que crescem em células de mamíferos, tal como em citomegalovírus (CMV), vírus de símio 40 (SV40), vírus Epstein Barr (EBV), vírus do Sarcoma de Rous (RSV), vírus murino de Moloney, vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), vírus de Tumor Mamário de Rato (MMTV), ou aqueles derivados de genes de mamíferos, tais como de actina de mamífero, beta-globina, miosina, ou opcionalmente derivados de genes de mamífero preferencialmente expressados em células apresentadoras de antigénios, tais como Fascina ou outros genes específicos de APC conhecidos na técnica. Um exemplo de um sinal de poliadenilação útil é um sinal derivado de um sinal de poliadenilação de SV40.

Os elementos de expressão podem controlar a expressão das proteínas survivinas em todas as células eucarióticas, ou podem ter melhoradores específicos para o tipo de célula para controlar a expressão, por exemplo, em células apresentadoras de antigénio. As porções codificantes das cassetes de expressão são também preferencialmente concebidas para terem codões que são mais comummente usados em células eucarióticas, especialmente em células de mamífero ou humanas. 37

As cassetes de expressão da invenção podem ser usadas para produzir proteínas da invenção em células cultivadas. Consequentemente, as cassetes de expressão podem ser ligadas a genes de resistência a fármacos adequados, origens de replicação de ADN, e outros elementos para facilitar a seleção e replicação das cassetes de expressão. Numa forma de realização, as sequências de ácidos nucleicos da cassete de expressão são incorporadas num plasmídeo capaz de ser replicado numa bactéria. Plasmideos adequados para a invenção podem ter marcadores para seleção em células bacterianas, tais como genes de resistência a antibióticos. Alternativamente, plasmideos adequados podem não ter marcadores de resistência antibióticos mas podem incluir opcionalmente um gene que codifica uma enzima metabólica, um tARN supressor, ou outro gene desses que seria normalmente encontrado no genoma de uma bactéria sem resistência a fármacos. Deste modo, uma forma de realização exemplificativa da invenção é um plasmídeo contendo um ácido nucleico que codifica um péptido de survivina da invenção operativamente associado com um promotor de mamífero sem um marcador de resistência a antibiótico. Esse plasmídeo pode ser transformado numa bactéria, e a bactéria podem depois ser usada para vacinar um doente sem introduzir um gene de resistência a antibióticos no doente. Alternativamente, esse plasmídeo pode ser introduzido num doente sem um portador vivo. Por exemplo, esse plasmídeo pode ser introduzido como ADN nu ou como ADN encapsulado dentro de esferas ou revestido na superfície das esferas.

As cassetes de expressão da invenção podem ser incorporadas em genomas virais, plasmideos adequados para administração de ADN nu, ou genomas bacterianos. No caso de genomas virais, é desejável usar vírus de ADN de cadeia-dupla tais como adenovírus e vírus adeno-associados, e vírus de ARN tais como retrovírus. As cassetes de expressão são 38 inseridas nos genomas desses virus por técnicas padrão. Portanto, a invenção fornece tanto formas de ADN como de ARN de ácidos nucleicos.

Moléculas efetoras A presente invenção fornece também formas de realização que permitem que o péptido de não-mamifero ou o péptido de survivina de mamífero modificado funcione em combinação como uma molécula efetora que contribui para a resposta imune. Por exemplo, essa molécula efetora pode ser uma porção de citoquina incluindo, mas não se limitando a, IL-2, IL-7, IL- 12, IL-18, IL-21, IL-23, GM-CSF, ou qualquer outra citoquina, particularmente uma capaz de ativar uma resposta imune Thl. Essa molécula efetora pode também ser um inibidor de uma citoquina que reprime o sistema imune, por exemplo, um inibidor STAT3 (e.g., uma proteina ST AT 3 dominante negativa tal como STAT3P). Citoquinas ou outras moléculas efetoras podem também conter mutações. Por exemplo, uma citoquina pode conter uma substituição de Ser numa posição correspondente à Cysl25 da IL-2.

Portanto, em formas de realização preferidas, a vacina da invenção inclui um ácido nucleico que codifica um péptido de survivina de não-mamifero ou modificado de mamífero e um segundo péptido incluindo uma molécula efetora descrita acima que contribui para a resposta imune. As regiões que codificam o péptido de survivina de não-mamífero ou de mamífero modificado e o péptido da molécula efetora podem estar numa única unidade de transcrição, ou em duas unidades de transcrição separadas. Alternativamente, a vacina da invenção inclui um ácido nucleico que codifica um péptido de survivina de não-mamífero ou de mamífero modificado e um ácido nucleico separado que codifica um 39 segundo péptido incluindo uma molécula efetora descrita acima que contribui para a resposta imune.

Em outras formas de realização, a vacina da invenção inclui um péptido de survivina de não-mamifero ou de mamifero modificado e um segundo péptido incluindo uma molécula efetora descrita acima que contribui para a resposta imune. Numa forma de realização, o péptido de survivina de não-mamifero ou de mamifero modificado é fundido ou conjugado ao péptido incluindo uma molécula efetora. A proteina de fusão do péptido de survivina e da molécula efetora pode ainda estar fundida ou conjugada a uma porção Fc como descrito acima.

Administração

As vacinas da invenção são usadas para tratar humanos ou mamíferos que manifestam ou estão em risco de doenças associadas à sobre-expressão de survivina. Essas doenças incluem cancros ou outros tumores caracterizados por células sobre-expressando survivina.

As vacinas produzidas de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um hospedeiro mamifero por qualquer via. A injeção de antigénios de proteina é commumente usada para desencadear respostas imunes em mamíferos. No entanto, as vacinas da invenção podem também ser administradas a APCs por ácido nucleico, e.g., ADN, injeção. Uma técnica comummente usada é injetar vetores de expressão de ADN que codificam uma proteína antigénica no músculo. Acredita-se que APCs especializadas, por exemplo, macrófagos e células dendríticas, migram para o sítio da injeção ou administração, captam e apresentam o antigénio 40 através de um processo conhecido como o processo de apresentação de antigénio.

Assim, conforme apropriado, a administração pode ser oral ou parentérica, incluindo as vias de administração intravenosa e intraperitoneal. Para além disso, a administração pode ser por injeções periódicas de um bolus da vacina ou pode ser feita mais continua por administração intravenosa ou intraperitoneal a partir de um reservatório que é externo (e.g., um saco i.v.)· Em algumas formas de realização, as vacinas da presente invenção podem ser de grau farmacêutico. Ou seja, certas formas de realização obedecem aos padrões de pureza e controlo de qualidade necessários para administração a humanos. Aplicações veterinárias estão também incluidas no significado pretendido conforme aqui usado.

As formulações, para uso médico veterinário e humano, das vacinas de acordo com a presente invenção tipicamente incluem essas vacinas em associação com um adjuvante farmaceuticamente aceitável, um transportador, e opcionalmente outro(s) ingrediente(s) . 0(s) transportador(es) podem ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes das formulações e não serem prejudiciais para quem os vai receber. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis, neste sentido, pretende-se que incluam todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. O uso desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que um meio convencional ou agente é incompatível com o composto ativo ou o seu vetor de administração, o seu uso nas composições é contemplado. Compostos ativos 41 suplementares (identificados de acordo com a invenção e/ou conhecidos na técnica) podem também ser incorporados nas composições. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia/microbiologia. Em geral, algumas formulações são preparadas pondo a vacina em associação com um transportador liquido ou um transportador sólido finamente dividido ou ambos, e depois, se necessário, moldando o produto na formulação desejada.

Uma composição da vacina da invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração oral ou parentérica, e.g., intravenosa, intradérmica, inalação, transdérmica (tópica) intramucosa e retal. Soluções ou suspensões usadas para aplicação parentérica, intradérmica, ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, soro fisiológico, óleos fixados, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bisulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetraacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

Soluções úteis para administração oral ou parentérica podem ser preparadas por qualquer dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica, descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990. Formulações para administração parentérica podem também incluir glicocolato para administração bucal, 42 metoxisalicilato para administração retal, ou ácido citrico para administração vaginal. A preparação parentérica pode ser contida em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou de plástico. Supositórios para administração retal podem também ser preparados misturando o fármaco com um excipiente não-irritante tal como manteiga de cacau, outros glicéridos, ou outras composições que são sólidas à temperatura ambiente e liquidas à temperatura corporal. As formulações podem também incluir, por exemplo, polialquileno glicóis tais como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados, e semelhantes. As formulações para administração direta podem incluir glicerol e outras composições de alta viscosidade. Outros transportadores parentéricos potencialmente úteis para estas vacinas incluem partículas de copolimero de etileno-vinil acetato, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, e lipossomas. As formulações para administração por inalação podem conter como excipientes, por exemplo, lactose, ou podem ser soluções aquosas contendo, por exemplo, 9-lauril éter de polioxietileno, glicocolato e desoxicolato, ou soluções oleosas para administração na forma de gotas nasais, ou como um gel a ser aplicado por via intranasal. Enemas de retenção podem também ser usados para aplicação retal.

Formulações da presente invenção adequadas para administração oral podem ser na forma de unidades discretas tais como cápsulas, cápsulas de gelatina, saquetas, comprimidos, pastilhas, ou losangos, cada contendo uma quantidade pré-determinada do fármaco; na forma de um pó ou grânulos; na forma de uma solução ou uma suspensão num liquido aquoso ou liquido não-aquoso; ou na forma de uma emulsão óleo-em-água ou uma emulsão água-em-óleo. A vacina pode também ser administrada na forma de um bolus, 43 eleituário ou pasta. Um comprimido pode ser feito comprimindo ou moldando o fármaco opcionalmente com um ou mais componentes acessórios. Comprimidos prensados podem ser preparados comprimindo, numa máquina adequada, o fármaco numa forma de fluxo livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados por um ligante, lubrificante, diluente inerte, agente de superfície ativo ou dispersante. Comprimidos moldados podem ser feitos moldando, numa máquina adequada, uma mistura do fármaco em pó e um transportador adequado hidratado com um diluente liquido inerte.

Composições orais geralmente incluem um inerte diluente ou um transportador comestível. Para o fim de administração oral da vacina, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes. As composições orais preparadas usando um transportador fluido para uso como elixir incluem o composto no transportador fluido e são aplicadas oralmente e agitadas e expetoradas ou engolidas. Agentes ligantes farmaceuticamente compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e semelhantes podem conter qualquer dos seguintes componentes, ou compostos de natureza semelhante: um ligante tal como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose; um agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante tal como dióxido de silicone coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante tal como menta, metil salicilato, ou aromatizante de laranja.

Composições de vacina adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúvel em água) ou 44 dispersões e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, transportadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou soro tamponado com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição pode ser estéril e pode ser fluida na medida em que seja fácil o seu uso com seringa. Pode ser estável sob as condições de fabrico e armazenagem e pode ser preservada contra a ação de microrganismos contaminantes tais como fungos. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol liquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de particula necessário no caso da dispersão e pelo uso de tensioativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, e cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade necessária num solvente apropriado com um ou uma combinação de componentes enumerados acima, como necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros componentes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos de preparação incluem secagem a vácuo e 45 liofilização que produz um pó do componente ativo mais qualquer componente adicional desejado de uma sua solução previamente filtrada para esterilização.

Formulações adequadas para administração intra-articular podem ser na forma de uma preparação aquosa estéril da vacina que pode estar na forma microcristalina, por exemplo, na forma de uma suspensão microcristalina aquosa. Formulações lipossomais ou sistemas de polímeros biodegradáveis podem também ser usados para apresentar a vacina para administração tanto intra-articular como oftálmica.

Formulações adequadas para administração tópica incluem preparações liquidas ou semilíquidas tais como linimentos, loções, géis, aplicantes, emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo tais como cremes, pomadas ou pastas; ou soluções ou suspensões tais como gotas. Formulações para administração tópica na superfície da pele podem ser preparadas dispersando a vacina com um transportador dermatologicamente aceitável tal como uma loção, creme, pomada ou sabão. Em algumas formas de realização, são úteis transportadores capazes de formar uma película ou camada sobre a pele para localizar a aplicação e inibir a sua remoção. Quando a adesão à superfície de um tecido é desejada, a composição pode incluir a vacina dispersada numa composição de fibrinogénio-trombina ou outros bioadesivos. A vacina pode depois ser pintada, pulverizada ou de outro modo aplicada à superfície de tecido desejada. Para administração tópica em superfícies de tecidos internos, o agente pode ser dispersado num adesivo de tecido líquido ou outra substância conhecida para melhorar a adsorção a uma superfície de tecido. Por exemplo, hidroxipropilcelulose ou soluções de fibrinogénio/trombina podem ser usadas vantajosamente. Alternativamente, soluções 46 de revestimento de tecidos, tais como formulações contendo pectina podem ser usadas.

Para tratamentos de inalação, a inalação de pó (formulações autopropulsoras ou sprays) dispensadas com uma embalagem de spray, um nebulizador, ou um atomizador podem ser usados. Essas formulações podem ser na forma de um pó finamente triturado para administração pulmonar a partir de um aparelho de inalação de pó ou formulações autopropulsoras dispensadoras de pó. No caso de soluções autopropulsoras e formulações de spray, o efeito pode ser conseguido por escolha de uma válvula com as caracteristicas desejadas de spray (i.e., ser capaz de produzir um spray com o tamanho de partícula desejado) ou incorporando o componente ativo como um pó suspendido com tamanho de partícula controlado. Para administração por inalação, as vacinas podem também ser aplicadas na forma de um spray de aerossol a partir de um recipiente pressurizado ou dispensador que contém um propulsor adequado, e.g., um gás tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador. Gotas nasais também podem ser usadas. A administração sistémica pode também ser por meio transmucosal ou transdérmico. Para administração transmucosal ou transdérmica, penetrantes adequados da barreira a ser permeada são usados na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares, e derivados do ácido filsidico. A administração transmucosal pode ser conseguida através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, as vacinas são tipicamente formuladas em pomadas, unguentos, géis, ou cremes como geralmente conhecido na técnica. 47

Numa forma de realização, as vacinas são preparadas com transportadores que vão proteger contra a eliminação rápida do organismo, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de administração microencapsulados. Polímeros biodegradáveis biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido polilático. Métodos para a preparação dessas formulações vão ser evidentes para os especialistas na técnica. Os materiais podem também ser obtidos comercialmente de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossomais podem também ser usadas como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, como descrito na Pat. U.S. No. 4,522,811. Microssomas e micropartículas podem também ser usados.

Composições orais ou parentéricas podem ser formuladas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como doses unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada de composto ativo calculada para produzir o efeito da vacina desejado em associação com o transportador farmacêutico necessário. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção é ditada por e diretamente dependente das caracteristicas únicas do composto ativo e do efeito particular da vacina a ser atingido, e as limitações inerentes à técnica de compor esse composto ativo para o tratamento de indivíduos.

Geralmente, as vacinas identificadas de acordo com a invenção podem ser formuladas para administração 48 parentérica ou oral a humanos ou outros mamíferos, por exemplo, em quantidades terapeuticamente eficazes, e.g., quantidades que fornecem concentrações apropriadas do fármaco ao tecido alvo por um período suficiente para induzir o efeito desejado. Adicionalmente, as vacinas da presente invenção podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outras moléculas conhecidas por terem um efeito benéfico na doença específica ou indicação de interesse. A título de exemplo apenas, cofatores úteis incluem cofatores aliviadores dos sintomas, incluindo antisséticos, antibióticos, agentes antivirais e antifúngicos e analgésicos e anestésicos. A concentração eficaz das vacinas identificada de acordo com a invenção que é para ser aplicada numa composição da vacina vai variar dependendo de vários fatores, incluindo a dose final desejada de fármaco a ser administrada e a via de administração. A dose preferida a ser administrada é também provavelmente dependente de variáveis tais como o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, o estado geral de saúde do doente específico, a eficácia biológica relativa da vacina administrada, a formulação da vacina, a presença e tipos de excipientes na formulação, e a via de administração. Em algumas formas de realização, as vacinas desta invenção podem ser fornecidas a um indivíduo usando unidades de dosagem típicas deduzidas dos estudos descritos anteriormente de mamíferos usando primatas não-humanos e roedores. Como descrito acima, uma unidade de dosagem refere-se a uma unidade, i.e., uma dose única que é capaz de ser administrada a um doente, e que pode ser facilmente manuseada e embalada, permanecendo como uma dose unitária fisicamente e biologicamente estável compreendendo a vacina como tal ou uma mistura dela com diluentes ou transportadores farmacêuticos sólidos ou líquidos. 49

Configuração da aplicação de um ácido nucleico de survivina com uma esfera

Noutra forma de realização, os ácidos nucleicos da invenção podem ser configurados com um veículo de aplicação tal como uma esfera. Por exemplo, um ácido nucleico da invenção pode ser revestido em esferas de celulose de acordo com o método como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2003-0166594, cujos ensinamentos são aqui incorporados como referência. Um ácido nucleico da invenção pode ser incorporado nas esferas poliméricas de acordo com o método descrito na Patente U.S. No. 5,783,567.

Em certas formas de realização, organismos (e.g., bactérias, células de mamífero, e partículas virais) são modificados para produzir a survivina da invenção. Estes organismos podem libertar a survivina para recolha ou podem ser introduzidos como vacinas diretamente num doente.

Configuração da aplicação de um ácido nucleico de survivina dentro de um vírus

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser configurados com um veículo de aplicação virai. O veículo de aplicação virai pode opcionalmente ter um efeito adjuvante. Por exemplo, vírus adequados incluem, mas não estão limitados a adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, ou vírus vaccinia. É frequentemente preferível usar um mutante ou forma defeituosa de um vírus, tal como um vírus incapaz de replicação. Os ácidos nucleicos da invenção são inseridos nos genomas virais e são adicionalmente incorporados nas partículas virais. Os ácidos nucleicos são embalados usando sistemas de vírus helper que são bem conhecidos na técnica de terapia genética. 50

Configuração de aplicação do ácido nucleico de survivina dentro de uma bactéria

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser configurados para aplicação dentro de um hospedeiro microbiano, como, por exemplo, descrito por Gentschev et al. (2000) J.

Biotechnol., 83:19-26; ou por Stocker BAD (2000) J.

Biotechnol., 83:45-50. Bactérias adequadas para aplicação de ácido nucleico (e.g., ADN) incluem, mas não estão limitadas a, Salmonella, Shigella, Listeria, ou E. coli. É frequentemente preferível usar um mutante, forma atenuada de uma bactéria, tal como um auxotrófico. Por exemplo, estirpes de Salmonella adequadas incluem, mas não se limitam a, Salmonella typhimurium aroA auxotrófico SL7202 (ver, e.g., Darji et al., (1997) Cell, 91:765-775),

Salmonella typhimurium aroA, dam’ auxotrófico RE88 (ver, e.g., Heithoff et al., (1999) Science, 284:967-70), Salmonella typhimurium msb’ purl auxotrófico VNP20009 (ver, e.g., Clairmont et al., (2000) J. Infect. Pis., 181(6): 1996-2002; Low, et al., (2004) Methods Mol. Med., 90:47- 60), ou Salmonella typhimurium prototrófica LT2 (ATCC #700720). Um modo exemplificativo de vacinação com ADN por Salmonella é ilustrado na Figura 4.

Terapia de combinação A vacina da invenção pode ser combinada com outras modalidades de tratamento usadas no tratamento do doente. Numa forma de realização do tratamento, a vacina é usada em combinação com resseção cirúrgica do tumor. Noutro conjunto de formas de realização do tratamento, a vacina é usada em combinação com quimioterapia ou radioterapia o que reduz o tamanho do tumor, potencialmente provoca lesões na vasculatura do tumor, ou torna o tumor suscetível a 51 respostas imunes. Agentes de quimioterapia ou radioterapia particularmente úteis para terapia em combinação com a vacina da invenção incluem, mas não se limitam a, agentes que danificam o ADN tais como ciclof osf amida; antimetabolitos tais como gemcitibina; e agentes que quebram as funções do citosqueleto tais como taxóis. Tais agentes reduzem o crescimento do tumor e podem lesar a vasculatura do tumor, que, sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se tornar o tumor mais suscetível a respostas imunes.

Em terapia de combinação, quimioterapia ou radiação é tipicamente seguida da administração da vacina de tal modo que a formação de uma resposta imune eficaz antitumoral não é comprometida por potenciais efeitos residuais do tratamento anterior.

Numa forma de realização adicional de terapia de combinação, o tratamento com vacina pode ser combinado com tratamentos de imunocitoquinas. Sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se que uma vacina gera uma resposta imune mais eficaz, quando a citoquina que promove a resposta imune está presente no microambiente do tumor. Por exemplo, imunocitoquinas especificas úteis são aquelas que desencadeiam resposta Thl, tal como IL-2 ou IL-12. Durante a terapia de combinação, por exemplo, um doente pode primeiro receber uma vacina da invenção para gerar uma resposta imune contra o tumor, depois uma imunocitoquina que pode ser contra o tumor e ajuda a resposta imune no tumor. Imunocitoquinas preferidas têm tipicamente, por exemplo, uma porção de anticorpo que reconhece um antigénio de superfície caracteristico do tumor, tal como EpCAM, ou que reconhece uma caracteristica do centro necrótico de um tumor, tal como ADN. Imunocitoquinas também têm tipicamente uma porção de citoquina tal como IL-2, IL- 12, ou outras 52 que preferencialmente controlam uma resposta Thl. Imunocitoquinas adequadas para a invenção são descritas na Patente U.S. No. 5,650,150, cujos conteúdos são aqui incorporados como referência.

EXEMPLOS A prática da invenção vai ser melhor entendida a partir dos seguintes exemplos, que são aqui apresentados com fins somente ilustrativos, e que não devem ser interpretados como limitando a invenção de qualquer modo.

Exemplo 1. Clonagem de survivina de galinhar produção de variantes de survivina de galinha, construção de plasmídeos que se replicam em Salmonella e expressam survivina de galinha em células de mamífero. Métodos para isolar as moléculas de ADN desejadas são familiares a pessoas especialistas na técnica. Por exemplo, quando a sequência da molécula de ADN desejada é conhecida, transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) são comummente empregues, ou a molécula de ADN pode ser obtida por síntese química usando um fornecedor comercial tal como Blue Heron Biotechnology Inc. (Bothwell, WA) . Para obter ADN que codifica survivina de galinha de tipo selvagem, RT-PCR foi realizada em mARN polyA+ isolado de fígado de galinha (BD Biosciences cat # 636307), empregando a RT-PCR Superscript One-Step para Kit Long Templates (Invitrogen, Carlsbad, CA) e um conjunto de primers externos numa primeira volta de transcrição reversa e amplificação, e o Kit Supermix High Fidelity (Invitrogen) e um conjunto de primers internos para a segunda volta de amplificação. Os primers externos eram o primer de sentido 5'-GAAAAATGGCGGCCTATGC- 3' (SEQ ID NO:17) e o primer 53 antisentido 5' -CACCGTAGACCCAGAGGAACC- 3' (SEQ ID NO:18), e os primers internos eram o primer de sentido 5 '

CTCTAGAATGGCGGCCTATGCTG- 3' (SEQ ID NO: 19), incorporando um sitio de restrição Xba I (sublinhado) , e o primer antisentido 5' - CCTCGAGACCTAAGGGCCCATGTTCTC- 3' (SEQ ID NO:20), incorporando um sitio de restrição Xho I (sublinhado), respetivamente. 0 produto de PCR amplificado foi separado por eletroforese em gel, isolado, clonado num vetor pCR2.1 (Invitrogen), e a sua sequência verificada. 0 nucleótido e as sequências de aminoácidos da survivina de galinha de tipo selvagem são mostrados na listagem de sequências como SEQ ID N0:21 e SEQ ID NO:11, respetivamente. 0 fragmento de ácido nucleico que codifica a survivina de galinha de tipo selvagem de comprimento total foi transferido para vetores de expressão apropriados para a sua expressão em células de mamifero. Por exemplo, o fragmento Xba I /Xho I digerido da survivina de galinha de tipo selvagem que codifica a sequência foi inserido no plasmideo pdCs igualmente digerido (ver Lo et al., (1998)

Protein Engineering 11:495), colocando o gene da survivina de galinha de tipo selvagem sob controlo de um promotor CMV.

Como outro exemplo, um fragmento que codifica survivina de galinha de tipo selvagem foi inserido no vetor de expressão pdCs-huFc (ver Lo et al., (1998) Protein Engineering 11 :495), colocando um fragmento de survivina de galinha de tipo selvagem de comprimento total sem a metionina inicial a jusante da sequência que codifica Fc humana, gerando um plasmideo que codifica uma proteina de fusão huFc-SurvivinadeGalinha. Em resumo, uma ligação tripla foi realizada com um fragmento PfIMI/Xhol da survivina de galinha de tipo selvagem (o sitio PfIMI está no nucleótido 54 26 da survivina de galinha de tipo selvagem), um fragmento do plasmídeo Smal/Xhol pdCs-huFc (ver Lo et al., (1998)

Protein Engineering 11:495), e uma molécula duplex de oligonucleótido adaptador que restaura a extremidade 5' da sequência de survivina de galinha de tipo selvagem, omitindo o codão ATG inicial. A molécula adaptadora duplex foi formada por hibridização de oligonucleótidos complementares, os oligonucleótidos de sentido 5' -GGGTGCAGCGGCCTATGCTGAAATGCTGCCCAAGGA- 3' (SEQ ID NO:22) e antisentido 5' -TTGGGCAGCATTTCAGCATAGGCCGCTGCACCC- 3' (SEQ ID NO:23). A produção da proteína de fusão corretamente codificada foi verificada por sequenciação. A sequência de nucleótidos da Fcyl-

SurvivinadeGalinha(SurvivinadeGalinha menos Met inicial) madura humana é mostrada na listagem de sequências as SEQ ID NO:24.

Para obter um vetor de expressão que codifica muFc-SurvivinadeGalinha, o fragmento Sma I/Xhol digerido de survivina de galinha de tipo selvagem de pdCs-huFc-SurvivinadeGalinha foi transferido para um vetor de expressão igualmente tratado derivado de pdCs-muFc, resultando numa sequência quimérica entre muFc e survivina de galinha de tipo selvagem, com survivina de galinha colocada na estrutura, diretamente a jusante da sequência que codifica uma porção CH3 de muFc. A porção muFc codificada por este vetor de expressão era do isótopo IgG2a. A sequência de nucleótidos da muFcy2-Survivina de galinha (SurvivinadeGalinha menos Met inicial) madura é mostrada na SEQ ID NO: 26. A sequência de aminoácidos para mu-Fc survivina de galinha madura é mostrada na SEQ ID NO:27. 55 A sequência de survivina de galinha que codifica SurvivinadeGalinha(N97E, T99M, V100L, Q101G) foi gerada por uma abordagem de PCR incorporando primers mutagénicos. Substituições de codões no primer de sentido mutagénico (Mutls) 5' - CCTCTGAACTGATGTTGGGGGAGTTCTTGAAGCTGGAT- 3' (SEQ ID NO:28) e primer antisentido (Mutla) 5' AACTCCCCCAACATCAGTTCAGAGGGATCTTTCTG- 3' (SEQ ID NO:29) são mostradas sublinhadas, e uma substituição A para G que eliminou um sitio EcoRI está indicada a negrito. Dois fragmentos de PCR sobrepostos foram gerados do modelo de ADN da survivina de galinha de tipo selvagem, o fragmento a montante usando o primer Prls flanqueador (5' CCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGGCGGCCTATGCTGAAATG- 3') (SEQ ID NO:30) e Mutla, e o fragmento a jusante usando o primer Prla flanqueador (5' - AGATCTGGATCCCTAAGGGCCCATGTTCTCTATC- 3') (SEQ ID NO:31) e Mutls, respetivamente, para as amplificações. Uma reação de PCR foi realizada nos fragmentos de PCR resultantes, combinados em conjunto com os primers Prls e Prla, gerando o produto de comprimento total, o qual foi clonado num vetor pCR2.1 (Invitrogen), e a sua sequência foi verificada. O fragmento que codifica SurvivinadeGalinha(N97E, T99M, V100L, Q101G) foi excisado com Not I/Bam Hl e ligado a um vetor de expressão pdCs igualmente digerido. A sequência de proteína para SurvivinadeGalinha(N97E, T99M, V100L, Q101G) é mostrada como SEQ ID NO: 12 e a sequência de aminoácidos é mostrada como SEQ ID NO:62.

Exemplo 2. Síntese de genes de survivina a partir de outros não-mamíferos e construção de vetores de expressão de mamíferos.

De acordo com a invenção, os genes de survivina e proteínas de outros não-mamíferos vertebrados são usados em 56 composições de vacinas. Por exemplo, um gene de survivina de um peixe tal como um peixe-balão, tubarão, peixe-gato ou peixe-zebra, ou de um anfibio tal como o sapo Xenopus, ou de um réptil tal como um jacaré, crocodilo, tartaruga, lagarto ou salamandra, ou de outras aves para além da galinha, são obtidos por métodos análogos àqueles descritos no Exemplo 1 ou por outros métodos conhecidos dos especialistas na técnica de biologia molecular. Em alguns casos, tal como os homólogos de survivina de Xenopus, peixe-zebra, peixe-gato e peixe-balão, (as sequências dos quais são fornecidas na listagem de sequências deste pedido de patente) os homólogos da survivina foram descritos e estão disponíveis em bases-de-dados públicas tais como PubMed. Quando a sequência de genes de um homólogo da survivina é conhecida, o ADN correspondente pode ser obtido de uma empresa de síntese de ADN comercial, tal como Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA).

Os homólogos da survivina provenientes de peixes, anfíbios, répteis, e aves são configurados em composições de vacinas por métodos análogos aos dos Exemplos 3, 4 e 5. Por exemplo, genes de survivina de Xenopus, peixe-zebra, peixe-gato e peixe-balão são colocados no plasmídeo pdCs após a adição de um sítio Xba I 5 ' e um sítio Xho I 3 ' nas extremidades da sequência codificante. Isto é feito, por exemplo, usando métodos de PCR análogos aos do Exemplo 1, ou por síntese de genes total da sequência codificante relevante flanqueada por ligantes. 0 plasmídeo pdCs-survivina é depois colocado numa estirpe de Salmonella pelos métodos descritos no Exemplo 3.

Alternativamente, genes de survivina são configurados em plasmídeos expressando proteínas de fusão Fc-survivina como no Exemplo 1, e as proteínas de fusão Fc-survivina são usadas como vacinas. Por exemplo, genes de survivina de 57

Xenopus, peixe-zebra, peixe-gato ou peixe-balão são colocados no plasmideo pdCs após a adição de um sitio Xma I 5' e um sitio Xho I 3' nas extremidades da sequência codificante. Isto é feito, por exemplo, usando métodos de PCR análogos aos do Exemplo 4, ou por sintese de genes total da sequência codificante relevante flanqueada por ligantes. 0 plasmideo Fc-survivina é depois colocado numa linha de células de mamifero adequada para alto nivel de expressão, tal como células NS/0, e a proteina secretada resultante é colhida e purificada como no Exemplo 4 e formulada com um adjuvante e usada para vacinar humanos ou animais como no Exemplo 5.

Exemplo 3. Construção de estirpes de Salmonella contendo plasmideos da invenção.

Estirpes de Salmonella portadoras de plasmideos da invenção para uso em vacinação foram geradas por um protocolo de eletroporação padrão delineado a seguir, familiar aos especialistas na técnica. Por exemplo, o plasmideo pdCs-SurvivinadeGalinha foi transformado numa estirpe de Salmonella sem plasmideo tal como a estirpe de Salmonella typhimurium aroA atenuada SL7207. Outras estirpes de Salmonella atenuadas podem também ser usadas, tais como RE88, com o genótipo aroA, dam-, VNP20009, com o genótipo msb”, purl, ou alternativamente a estirpe prototrófica LT2. Estirpes de Salmonella typhii, preferencialmente atenuadas, podem também ser usadas.

Para preparar bactérias eletrocompetentes, 50 mL de uma cultura de fase log de Salmonella foram recolhidos a uma D0600 de pelo menos 0,5, arrefecidos em gelo, e as células foram sequencialmente lavadas num volume igual e depois em metade do volume de HEPES 1 mM arrefecido com gelo, e repeletizadas. As células foram depois ressuspendidas em 1 58 mL de glicerol 10% frio, HEPES 1 mM, peletizadas e finalmente ressuspendidas em 0,5 mL de glicerol 10% frio, HEPES 1 mM por pipetagem suave. As células foram mantidas em gelo até serem usadas, ou aliquotas foram armazenadas a -8 0 °C.

Para eletroporação, 40 microlitros de bactérias eletrocompetentes foram adicionados a um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL pré-arrefecido, combinado com até 200 ng de plasmideo superenrolado pdCs-SurvivinadeGalinha em até um volume de 2 microlitros, e misturados com toque. A mistura bactéria-ADN foi transferida para uma cuvete de espaços de 0,2 cm pré-arrefecida (Bio-Rad, Hercules, CA) e eletroporada com um pulso elétrico de 2500 V, 25 μΕ, 200 ohms, geralmente resultando num constante de tempo de 4,5 + /-0,2, ao qual 1 mL de meio SOC foi adicionado. Após 1 hora de incubação a 37°C, 0,1 mL das células foram plaqueados em placas de seleção de antibiótico LB (100 micrograma/mL de ampicilina).

Isolados de colónias individuais foram obtidos e cultivados, e o ADN do plasmideo foi isolado para confirmar a sua identidade por análise de restrição. Uma cultura validada recentemente crescida foi suplementada com glicerol 15 %, congelada rapidamente em aliquotas de 500 microlitros e armazenada a -80°C.

Exemplo_4^ Transfeção. expressão, caracterização preliminar, e purificação de proteínas de fusão Fc-survivina A. Transfeção e Expressão de Proteínas de Fusão Fc-survivina. 59

Para análise rápida da expressão da proteína, plasmídeos expressando, por exemplo, muFc-SurvivinadeGalinha ou muFc-muSurvivina são comummente introduzidos numa linha celular tal como de células HEK 2 93 de rim embrionário humano (ATCC# CRL-1573) por transfeção transiente usando lipofectamina (Invitrogen).

Para obter clones estavelmente transfectados que expressam Fc-proteínas survivinas, por exemplo, o ADN do plasmídeo apropriado foi introduzido nas células NS/0 de mieloma de rato por eletroporação. Células NS/0 foram crescidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro de bovino fetal 10% inativado pelo calor, glutamina 2 mM e penicilina/estreptomicina. Cerca de 5xl06 células foram lavadas uma vez com PBS e ressuspendidas em 0,5 mL de PBS. 10 pg de ADN de plasmídeo linearizado foram depois incubados com as células numa Cuvete Gene Pulser (espaço de elétrodo de 0,4 cm, BioRad, Hercules, CA) em gelo durante 10 min. A eletroporação foi realizada usando um Gene Pulser (BioRad) com configurações a 0,25 V e 500 mF. As células foram deixadas recuperar durante 10 min em gelo, após o que elas foram ressuspendidas em meio de crescimento e plaqueadas em placas de 96 poços. Clones estavelmente transfectados foram selecionados pelo seu crescimento na presença de metotrexato (MTX) 100 nM, que foi adicionado ao meio de crescimento dois dias após a transfeção. As células foram alimentadas a cada 3 dias por duas ou três vezes mais, e clones resistentes a MTX apareceram em 2 a 3 semanas. Os sobrenadantes dos clones foram analisados por ELISA anti-Fc para identificar altos produtores. Clones de elevada produção foram isolados e propagados em meio de crescimento contendo MTX lOOnM. Tipicamente, o meio de crescimento H-SFM ou CD (Invitrogen) foi usado. 60

Alternativamente, clones estavelmente expressando proteínas de fusão Fc-survivina são obtidos em células HEK 293 de rim embrionário humano por seleção de metotrexato, por um método semelhante ao descrito acima. Clones HEK 293 são mantidos em DMEM suplementado com FBS 10%. B. Purificação e análise de proteínas de fusão Fc-survivina .

Uma purificação padrão de Fc-contendo proteínas de fusão foi realizada com base na afinidade da porção de proteína Fc para a Proteína A. Resumidamente, as células transfectadas com um plasmídeo que codifica uma proteína de fusão Fc-survivina foram tipicamente crescidas em frascos rolantes em H-SFM suplementado com MTX 0,1 μΜ, e o sobrenadante das células contendo a proteína de fusão foi carregado numa coluna de Sepharose Fast Flow com Proteína A pré-equilibrada (fosfato de sódio 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 80 0,01 % a pH neutro). A coluna foi lavada extensivamente neste tampão, e a proteína ligada foi eluída a pH baixo (pH 2,5) no mesmo tampão como acima e as frações foram levadas a um pH de 6,7 com base Tris 1M, pH 11.

As proteínas de fusão Fc-Survivina purificadas com Sepharose de Proteína A foram analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) analítica, e verificou-se que tipicamente a maior parte do material estava num estado agregado. Este resultado não foi inesperado uma vez que a survivina é normalmente uma proteína citoplasmática. Sem querer estar limitado pela teoria, pensa-se que quando a survivina é forçada pela via secretória pela porção Fc de uma proteína de fusão Fc-survivina, o dobramento da survivina é comprometido, particularmente uma vez que a survivina contém várias cisteínas que podem estar envolvidas na ligação dissulfeto. Enquanto que esta 61 agregação pode interferir com a atividade biológica, a agregação não é indesejada quando a proteína é para ser usada como uma vacina. A integridade e pureza das proteínas de fusão foram verificadas por eletroforese SDS-PAGE redutora. A banda mais forte foi vista a aproximadamente 45 kDa, o tamanho esperado da proteína de fusão. Uma variedade de bandas secundárias estava também presente: evidência adicional de que a proteína de facto se agregou. C. Procedimentos de ELISA. A concentração de produtos de proteína contendo Fc nos sobrenadantes de clones resistentes a MTX e outras amostras de teste foram determinadas por ELISA anti-Fc.

Procedimentos padrão como descrito em pormenor abaixo foram essencialmente seguidos. i. Placas de revestimento.

Placas de ELISA foram revestidas com IgG de cabra anti-murino AffiniPure (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) a 5 yg/mL em PBS, e 100 yL/poço em placas de 96-poços (Nunc-Immuno plate Maxisorp). As placas revestidas foram cobertas e incubadas a 4°C durante a noite. As placas foram depois lavadas 4 vezes com Tween 0,05% (Tween 20) em PBS, e bloqueadas com BSA 1%/soro de cabra 1% em PBS, 200 QL/poço. Após incubação com o tampão bloqueante a 37°C durante 2 horas, as placas foram lavadas 4 vezes com Tween 0,05% em PBS e secas com toques com tolhas de papel. ii. Incubação com amostras de teste e anticorpo secundário 62

Amostras de teste foram diluídas como apropriado em tampão de amostra (BSA 1%/ soro de cabra 1%/Tween 0,05% em PBS) . Uma curva padrão foi preparada usando um anticorpo quimérico (com uma Fc humana) , a concentração da qual era conhecida. Para preparar uma curva padrão, diluições seriadas foram feitas no tampão de amostra para dar uma curva padrão a variar desde 125 nq/mL até 3,9 ng/mL. As amostras diluídas e padrões foram adicionados à placa, 100 pL/poço e a placa incubada a 37°C durante 2 horas. Após incubação, a placa foi lavada 8 vezes com Tween 0,05% em PBS. A cada poço foram depois adicionados 100 pL de anticorpo secundário, a IgG de rábano anti-humana conjugada com peroxidase (Jackson Immuno Research), diluído até aproximadamente 1:120.000 em tampão de amostra. A diluição exata de anticorpo secundário a ser usada varia para cada lote. Após incubação a 37°C durante 2 horas, a placa foi lavada 8 vezes com Tween 0,05% em PBS. iii. Desenvolvimento A solução de substrato foi adicionada à placa a 100 pL/poço. A solução de substrato foi preparada dissolvendo 30 mg de OPD (dihidrocloreto de o-fenilenodiamina (OPD), (1 comprimido) em 15 mL de Ácido cítrico 0,025 M/tampão Na2HP04 0,05 M, pH 5, que contém 0,03% do peróxido de hidrogénio recentemente adicionado. A cor foi deixada desenvolver durante aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. O tempo de desenvolvimento é sujeito a alteração, dependendo da variação entre lotes das placas revestidas, do anticorpo secundário, etc. A reação foi parada adicionando ácido sulfúrico 4N a 100 pL/poço. A placa foi lida num leitor de placas, que foi configurado a 490 e 650 nm e programado para subtrair a DO de fundo a 650 nm da DO a 490 nm. 63

Exemplo 5. Métodos para aplicação da vacina e desafio do tumor.

Ratos C57B1/6 e Balb/c (7-8 semanas de idade) foram comprados na Jackson Laboratories (Bar Harbour, ME) . Os ratos foram mantidos no EMD Lexigen Research Center Corp., Billerica, MA, e todas as experiências animais foram realizadas de acordo com Procedimentos Operacionais em Biotérios aprovados.

Para preparar a amostra de vacina de Salmonella, 5 mL de cultura de LB/AMP foram inoculados com uma colónia bacteriana transformada individual, crescida durante a noite a 37°C, centrifugada a 2000xg durante 10 minutos, lavada uma vez em PBS e depois ressuspendida em 2 mL de PBS. A D0600 de uma diluição 1:10 da cultura em PBS foi medida, e a concentração da cultura foi ajustada a 109 células/mL com PBS, assumindo que 1 unidade de D0600 correspondeu a aproximadamente 109 bactérias/mL (como determinado plaqueando uma diluição seriada da cultura em placas de LB/Ampicilina) . A vacinação por gavagem oral foi realizada com uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de alimentação descartável 20G x 1,5" que foi enroscada ao estômago. Os ratos foram pré-tratados com uma gavagem de 0,1 mL de bicarbonato de sódio 10% para neutralizar os ácidos do estômago, e cinco minutos depois foi administrada aos ratos uma amostra de vacina de 0,1 mL (108 bactérias). O efeito da vacina foi medido em linhas de células tumorais que expressam survivina de mamífero e apresentam antigénios derivados de survivina em MHCs. As linhas de células tumorais usadas nos exemplos abaixo foram a linha de células D121 de carcinoma do pulmão de murino, a linha de células A20 de linfoma de murino, a linha 4T1 de tumor mamário de murino, a linha de células LLC de Carcinoma do 64

Pulmão de Lewis de murino, a linha de células CT26 de cancro do cólon de murino, e a linha de células B16 de melanoma de murino, mas outras linhas celulares expressando survivina de mamifero e apresentando antigénios derivados de survivina podiam ser usadas. Em algumas experiências, foram usadas linhas de células tumorais que foram modificadas para expressar molécula de adesão de células epiteliais humanas (EpCAM), concebidas por "KSA" (por exemplo LLC/KSA). A expressão da survivina é convenientemente avaliada por Western blot, por métodos padrão. 0 anticorpo policlonal de coelho contra survivina humana e de murino (AHP604, Serotec, Raleigh, NC) foi usado numa diluição de 1:500.

As linhas de células tumorais usadas nos Exemplos abaixo foram mantidas nos seguintes meios. D121 foram crescidas em DMEM com 10% de soro bovino fetal (FBS) , suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de Na, e 1 % de aminoácidos não essenciais. A20 e 4T1 foram crescidas em RPMI com 10% de FBS, 1% de P/S, 1% de L-glutamina. LLC foram crescidas em DMEM com 10% de FBS, 1% de P/S, 1% de L-glutamina. CT26 foram crescidas em DMEM com 10% de FBS, 1% de P/S, 1% de L-glutamina , e 1% de meio de vitamina B16. Os meios CT26/KSA incluíam também 1% de piruvato de Na e 1 % de aminoácidos não essenciais. O meio para linhas de células expressando adicionalmente EpCAM continham também 1 pg/mL de G418.

Para avaliar o efeito da vacina na sobrevivência dos ratos ou na carga de tumor pulmonar de ratos tratados, as células tumorais foram administradas por via intravenosa. As linhas de células tumorais foram lavadas com PBS, tripsinizadas durante 3 minutos, e a tripsina foi neutralizada com meio condicionado. As células foram peletizadas e lavadas duas vezes com PBS, ou no caso das células D121, com PBS, 1% de 65 albumina de soro de bovino, 50 μΜ de EDTA. Uma suspensão de células única foi obtida aplicando as células ressuspendidas em múltiplos crivos de malha de nylon descartáveis de 100 μΜ (BD Falcon) . Os ratos foram injetados por via intravenosa na veia da cauda com a suspensão de células num volume de 200 pL por rato usando uma agulha de 27 gauge. Os pulmões foram removidos, pesados e classificados avaliando a percentagem de área de pulmão coberta por tumor para comparar a carga de tumores metastáticos.

Exemplo 6. Imunização com ADN que codifica survivina de galinha gera anticorpos que têm reação cruzada com survivina de mamífero.

Para testar se a vacinação com ácidos nucleicos que codificam survivina de galinha pode gerar anticorpos que têm reação cruzada com survivina de mamífero, foram realizadas as experiências seguintes. Um protocolo de imunização descrito por Davis ((1996) Adv. Drug Delivery Reviews 21:33) foi usado como base para as experiências. Ratos Balb/c fêmeas com 7-8 semanas de idade (n=2 por grupo de tratamento) foram imunizados uma vez (Dia 1) ou três vezes (Dia 1, 21, e 46) com plasmídeos de expressão que codificam survivina de galinha de tipo selvagem (ChSur) ou muFc-SurvivinadeGalinha (FcChSur) ou com um plasmídeo de expressão de controlo que codifica muFc- antigénio carcinoembrionário (CEA) (FcCEA). Os ratos foram injetados no músculo tibial anterior com 100 pL de uma solução 10 μΜ de cardiotoxina, seguido cinco dias mais tarde por injeção com 100 pg de ADN de plasmídeo. Ao dia 62, os ratos foram sangrados e o soro foi analisado em relação a anticorpos contra survivina de murino. Soro com diluições seriadas foi aplicado a uma placa de ELISA revestida com proteína de fusão muFc-muSurvivina, a placa foi lavada, as amostras 66 foram incubadas com um anticorpo IgG2a anti-rato conjugado com peroxidase. 0 ELISA detetou a presença de anticorpos anti-survivina por um ensaio colorimétrico comparado com o controlo negativo de ratos naive. Os resultados mostrados na Tabela 2 indicam que as vacinas de ADN de survivina foram eficazes a desencadear anticorpos reativos à survivina de murino enquanto que a vacina de ADN de controlo não o foi.

Tabela 2: Titulos de anticorpos anti-survivina de murino.

Diluição seriada 1 tratamento (n=2) 3 tratamentos (n=2) ChSur FcChSur FcCEA ChSur FcChSur FcCEA 50 x 0,285 1,089 n. a. 2,176 2,495 0,046 200 x 0,123 0,769 n. a. 1,177 1,276 0,042 800 x 0,124 0,484 n. a. 0,417 0,454 0,044

Os anticorpos anti-survivina de rato são testados adicionalmente em relação a reatividade cruzada contra survivina humana em Western blot ou em ELISA. É esperado que os anticorpos de survivina de rato, obtidos por vacinação dos ratos com uma composição de vacina de survivina de galinha, se liguem também â proteína survivina humana.

Exemplo 7. Vacinação de um mamífero com ADN que codifica survivina desencadeia uma resposta imune de células T contra células cancerígenas.

Para determinar a capacidade de uma vacina de survivina à base de Salmonella de estimular uma resposta de células T contra células cancerígenas, foram realizadas as seguintes experiências. Ratos Balb/c foram vacinados com a estirpe de Salmonella SL7207 portadora de uma mutação AroA (Medina et al., (1999) Infection and Immunity, pp. 1093-1099) e portadora também de um vetor de expressão de mamífero que 67 codifica survivina de murino (n=2) ou survivina de galinha de tipo selvagem (n=2) ao dia 0 e ao dia 14, como descrito no Exemplo 5. Ratos naive não imunizados (n=2) foram usados como controlo negativo nesta experiência.

Um mês após a primeira vacinação, esplenócitos de cada grupo foram extraídos e agrupados. Células T CD8+ foram purificadas e usadas como respondedores num ensaio IFNy ELISpot de murino, essencialmente como descrito abaixo. Neste ensaio, as linhas de células de tumores A20 e 4T1 foram usadas como células efetoras (Figura 6) . As células 4T1 tinham sido modificadas para expressarem molécula de adesão de células epiteliais humanas (EpCAM), mas isto não foi considerado relevante para a experiência. Houve significativamente mais células T responsivas a IFNy de ratos vacinados do que dos animais de controlo. A vacinação com Salmonella contendo um plasmideo de expressão de survivina de galinha ou de murino correlacionou-se com um elevado número de células T precursoras secretando IFNy em resposta às diferentes linhas de células tumorais. 0 mesmo protocolo de vacinação foi também realizado em ratos C57B1/6. Células T CD8+ dos baços desses ratos foram incubadas com células do Carcinoma do Pulmão de Lewis (LLC) ou células de melanoma B16 no ensaio IFNy ELISpot de murino. As células LLC e B16 tinham sido modificadas para expressarem molécula de adesão de células epiteliais humanas (EpCAM) , mas isto não foi considerado relevante para a experiência. Ambas as vacinas resultaram num aumento no número relativo de células T responsivas direcionadas contra péptidos do antigénio alvo expressado no contexto do MHC de classe I quando comparado com animais C57B1/6 naive (Figura 5). Houve significativamente mais células secretoras de IFNy produzidas em ratos vacinados com 68 survivina de galinha SL7207 do que em ratos com survivina de murino SL7207 contra ambas as células tumorais LLC e células B16.

Em conjunto, estes resultados indicam que ambas as abordagens de vacinação desencadeiam um aumento no número de Células T CD8+ precursoras reativas contra células cancerígenas que apresentam péptidos de survivina de mamífero no contexto de epitopos MHC de classe I. Estas observações sugerem também que a imunização com survivina de galinha pode ser mais potente a quebrar a tolerância e a gerar uma resposta imune direcionada contra células alvo expressando survivina de mamífero.

Neste Exemplo e em muitos dos Exemplos seguintes, a estirpe de Salmonella typhimurium SL7207 foi usada, mas outras estirpes de Salmonella podiam ser usadas, tais como Salmonella typhi. Aquando do tratamento de humanos com Salmonella typhi em humanos, é geralmente preferível usar auxotróficos que transportam opcionalmente mutações atenuantes adicionais.

Protocolo do ensaio IFNy ELISpot de murino: 0 ensaio ELISpot foi realizado essencialmente como descrito por Power et ai., (Power et ai., (1999) J. Immunol. Meth. 227:99-107). Células T CD8+ foram isoladas dos esplenócitos usando um kit de isolamento de células T CD8+ Miltenyi (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) e separadas num separador de esferas magnético Automacs seguindo as instruções do fabricante. As células T CD8+ foram mantidas em RPMI suplementado com 0,7 ng/mL de IL-2 (R&D Sistemas) . Em 24 horas, as células viáveis foram purificadas num gradiente Lympholyte® e ressuspendidas até uma concentração final de 69 10° células/mL. As células T CD8+ foram plaqueadas em diluições seriadas começando em 105 células/poço numa placa de IFNy ELISpot de murino (BD Biosciences, San Jose, CA) , pré-revestida com 5 pg/mL de anticorpo IFNy anti-murino. Todas as linhas de células tumorais foram adicionadas a uma concentração de 5 x 104 células/poço. Após 18 - 24 horas, as células foram removidas, as membranas revestidas com anti-IFNy foram lavadas com Tween 0,05% em PBS, incubadas com um anticorpo biotinilado secundário contra IFNy em PBS com 2% de soro de bovino fetal, e o anticorpo secundário ligado foi visualizado por exposição a HRP conjugado com estreptavidina e AEC solução de acetato (3-amino-9-etilcarbazole). Os pontos correspondentes a células T CD8+ secretoras de IFNy foram quantificados usando o sistema Zeiss KS ELISpot (Muenchen-Hallergmoss, Alemanha).

Exemplo 8. Imunização in vitro de células imunes derivadas de humanos com survivina de galinha.

Para confirmar a capacidade de uma sequência de survivina de não mamífero, tal como a sequência de survivina de galinha, para desencadear uma resposta anti-survivina em humanos, um ensaio de imunização in vitro é realizado usando células do sangue periférico do doente (hu PBMCs). Em essência, as células dendríticas (DCs) e as células T são purificadas em relação a hu PBMCs, as DCs são carregadas com um antigénio de escolha e incubadas com células T, e a resposta das células T à exposição a péptidos de survivina, por exemplo na forma de células alvo expressando survivina humana, é analisada, empregando métodos padrão familiares aos especialistas na técnica.

Por exemplo, as DCs (de huPBMCs de doentes HLA-A2+ e derivadas usando IL-4 e GM-CSF) são pulsadas com uma 70 sequência de péptido de survivina controlo conhecida por ser um epitopo para alelos HLA-A2+, tais como LMLGEFLKL (SEQ ID NO:6), ou são pulsadas com péptidos experimentais, tais como (i) um péptido derivado de survivina de galinha 30-mero GCAFAALQKDPSELMLGEFLKLDRERAKNV (SEQ ID NO:32); (ii) um péptido da survivina de galinha de tipo selvagem; ou (iii) um péptido da survivina de galinha mutado tal como SurvivinadeGalinha(N97E,T99M,V100L,Q101G) (SEQ ID NO:12). Alternativamente, elementos de construção de ADN expressando estas sequências são introduzidos nas DCs. Após a incubação com os péptidos ou proteínas, ou expressão do ADN introduzido, as DCs são irradiadas e lavadas para remover o excesso do péptido adicionado exogenamente, e são também misturadas com células T singeneicas na presença de IL-7 e IL-2. As células T são re-estimuladas semanalmente misturando as células T cultivadas com DCs recentemente tratadas e irradiadas.

Num ensaio, a presença de células T reativas a survivina é detetada por um ensaio IFNy ELISpot, essencialmente como descrito no Exemplo 7. Alternativamente, um ensaio de libertação de [51Cr] convencional é usado para avaliar a atividade funcional destas células, no qual as células tumorais alvo, apresentando péptidos de survivina no contexto das moléculas do MHC de classe I, são carregadas com [51Cr] e incubadas com estas células T, e a lise das células tumorais é quantificada pela libertação de [51Cr]. Uma linha de células alvo de controlo que não expressam survivina é usada como controlo negativo. É esperado que as preparações experimentais sejam pelo menos tão eficazes como a preparação de controlo na produção de células T que são responsivas à survivina, indicando que as sequências derivadas de survivina de galinha podem servir como 71 epitopos que dirigem uma resposta imune especifica às células expressando survivina humana.

Exemplo 9. Efeitos da vacinação em cancros do pulmão.

Para determinar se a resposta imune desencadeada pela vacina podia inibir o crescimento de tumores metastáticos quando o segundo tratamento foi retardado até depois do desafio do tumor, foram realizadas as seguintes experiências.

Ao Dia 0, os ratos C57B1/6 (n=5 por condição de tratamento) foram vacinados oralmente com 100 pL de bicarbonato de sódio 10% seguido de 108 de salmonella SL7207 contendo: um plasmideo que codifica uma survivina de galinha mutante (SurvivinadeGalinha((N97E, T99M, V100L, Q101G)); um plasmideo que codifica muFc-SurvivinadeGalinha; ou um plasmideo com duas unidades transcricionais, uma que codifica SurvivinadeGalinha((N97E, T99M, V100L, Q101G) e uma que codifica a proteina de fusão muFc-muIL2 como um adjuvante. Os ratos de controlo foram tratados com PBS.

Os ratos foram pré-doseados oralmente com 100 pL de bicarbonato de sódio 10%, e as Salmonellas SL7207 foram administradas em PBS (preparado como descrito acima). Dez dias depois da vacinação primária, os ratos foram injetados por via intravenosa com uma suspensão de células únicas de lxlO6 células LCC/KSA em 200 pL de PBS, e reforçados com uma segunda vacinação oral, usando a mesma concentração de Salmonella. Os ratos foram sacrificados ao Dia 32.

Resultados típicos são mostrados na Tabela abaixo (Tabela 3) . Os resultados indicam que a vacinação com Salmonella portadora de um vetor de expressão para qualquer elemento 72 de construção da survivina de galinha dá proteção semelhante contra cancro do pulmão metastático.

Tabela 3. Pesos dos pulmões e classificações das metástases de ratos com cancro do pulmão tratados com uma vacina de survivina. Média ± desvio padrão (q) Classificação do tumor* PBS 1,12 ± 0,25 3,3,3,3,3 SurvivinadeGalinha (N97E, T99M, V100L, Q101G) 0,23 ± 0,05 1,1,1,1,1 SurvivinadeGalinha (N97E, T99M, V100L, Q101G) + muFc-muIL2 0,21 + 0,13 1, 1,2,1,1 muFc- SurvivinadeGalinha 0,24 + 0,03 1,1,1,1,1

Na Tabela 3, (*) a Carga Tumoral foi avaliada numa escala de 0-3 (0= ausência de tumor nos pulmões, 1= <5% de carga tumoral, 2= 5-50% de carga tumoral, 3= >50 % dos pulmões cobertos por tumor.) Classificações de tumores em itálico e negrito indicam ratos em que se encontrou um tumor extrapulmonar na base da cauda.

Exemplo 10. Vacinação com survivina de galinha ou survivina de murino de SL7207 retarda significativamente a mortalidade

Para determinar se a vacinação com Salmonella SL7207 portadora de plasmideos de expressão de survivina poderia reduzir a carga tumoral e aumentar a sobrevivência, ratos Balb/c (n=5 por condição de tratamento) foram doseados duas vezes por gavagem oral como descrito anteriormente, com duas semanas de diferença, com PBS, Salmonella SL7207 com um plasmideo de expressão de survivina de murino, ou Salmonella SL7207 com um plasmideo de expressão de survivina de galinha de tipo selvagem. Duas semanas depois 73 da segunda vacinação os ratos foram injetados por via intravenosa com 200 yL de uma suspensão PBS de 5xl05 células/mL células singeneicas CT26/KSA (que expressaram também a proteina humana EpCAM, o que não foi considerado relevante para a experiência). Os ratos foram monitorizados em relação à sobrevivência. Como ilustrado na Figura 7, houve um perfil de sobrevivência mais longo nos ratos tratados com survivina de galinha de SL7207 comparado com o tratamento com PBS ou survivina de murino de SL7207.

Exemplo 11. Sobrevivência prolongada de mamíferos com metástases de cancro como resultado da vacinação com Salmonella portadora de vetores de expressão de survivina.

Para avaliar se mamíferos com cancro pré-existente poderiam ser vacinados com Salmonella portadora de plasmídeos de expressão de survivina, foi realizada a seguinte experiência. Nesta experiência, ratos C57B1/6 foram pré-tratados com 0,1 mL de bicarbonato de sódio 10 % e depois vacinados oralmente com cerca de 100 milhões de salmonellas SL7207 contendo um vetor para survivina de murino (n=5) ou SurvivinadeGalinha(N97E, T99M, V100L, Q101G) (n=5) em PBS (preparado como descrito acima) ao dia 0. Os ratos de controlo foram gavajados com bicarbonato de sódio e PBS (n=5) . Dez dias depois da vacinação primária, os ratos foram injetados por via intravenosa com 200 yL de uma suspensão PBS de lxlO6 células LLC/KSA (que expressaram também a proteina humana EpCAM, o que não foi considerado relevante para a experiência). Todos os ratos foram reforçados com uma segunda vacinação oral administrada 4 horas após a injeção do tumor usando a mesma concentração de Salmonella administrada para preparar a resposta imune. A sobrevivência foi seguida ao longo de um período de 12 semanas após desafio do tumor. Todos os ratos de controlo 74 faleceram dentro de 35 dias da administração do tumor. De modo importante, todos os ratos vacinados com um dos elementos de construção da survivina ainda estavam vivos ao dia 35. Todos os ratos no grupo de tratamento de SL7207 SurvivinadeGalinha (N97E, T99M, V100L, Q101G) faleceram dentro de 10 semanas da injeção de LLC/KSA. Houve um animal que sobreviveu no grupo tratado com survivina de murino de SL7027 após 3 meses. Não houve diferenças significativas na sobrevivência entre os dois grupos de tratamento (p= 0,243).

Na Figura 8, são mostradas as curvas de sobrevivência para a vacinação contra um desafio de tumor com células LLC/KSA.

Exemplo 12. Uso de algoritmos preditivos para avaliar substituições nas sequências de survivina.

Algoritmos preditivos podem ser usados para avaliar se variantes de survivina da invenção comprometem potenciais epitopos antigénicos, ou inversamente, se epitopos antigénicos subdominantes podem ser potencialmente melhorados. Por exemplo, a variante de huSurvivina huSur(R18E, H77A, C84A, A128P) (SEQ ID NO:84) é analisada usando uma base de dados disponivel publicamente para predição do sitio de clivagem proteassomal, por exemplo NetChop (www.cbs.dtu.dk/NetChop), assim como uma para predição do epitopo para os principais supertipos de MHC I HLA, por exemplo SYFPEITHI (www.syfpheithi.de). Usando NetChop, verificou-se que o padrão de clivagem não é drasticamente alterado pela introdução das substituições R18E, H77A, C84A, A128P na survivina humana ("S" indica sitios de clivagem potenciais acima de um limiar de 0,8), como mostrado: 75 Ε cftgaptlppawqpflkdhrístfknwpflegcâctpennaeagfíhcptenepdl S.,..3...5.. SSSS.. S. , SS...... 5--------,,3.,..,.......... $ Variante de S-----S. .. .S.SSSS. .S, .SS. .... .S, ......S............ . ,S tiposefvagem

S........S.SS... SS.... Variante de S, . .S. . . ,S.SS. . .SS____ tipo selvagem ...ss.ss.s...ss.ss.s

P àknkiaketimkkkefeetakkvrraieglaamd (SEQ ID NO:8) · · · S.......SS.,.. . S. SS,.. . .. S,. S. Variante de . ., .$.......SS.S. . ,. .SS.S. . . ,S. .S. tipo selvagem

Um epitopo antigénico identificado anteriormente que se liga ao subtipo HLA-A0201 é mostrado a negrito e sublinhado, e o NetChop prediz um sitio de clivagem C-terminal para este epitopo.

Usando SYFPEITHI, a sequência huSur(R18E, H77A, C84A, A128P) (SEQ ID NO:84) é analisada em relação a epitopos que se ligam a supertipos HLA A2, A3, e B7, que em conjunto cobrem pelo menos 85 % da população humana (ver Sette et al., (1999) Immunogen. 50:201-212). Quando comparado com huSurvivina de tipo selvagem, os epitopos no topo do ranking são idênticos para HLA-A 0201 e para HLA-A 03, mas para HLA-B 0702, a sequência de survivina variante produz um epitopo do topo do ranking, devido a um residuo de ancoragem C-terminal mais favorável pela substituição H77A. Assim, o péptido EPDDDPIEEA (SEQ ID NO: 33) pode ser um melhor péptido antigénico do que o péptido EPDDDPIEEH (SEQ ID NO:34).

Substituições adicionais, como sugerido pela análise NetChop, tal como P47L e Q56L, podem ser introduzidas em huSur(R18E, H77A, C84A, A128P), e a sequência pode ser 76 reanalisada por SYFPEITHI como acima. A sequência para SurvivinaHumana(R18E, H77A, C84A, A128P) é mostrada na SEQ ID NO:84. A sequência para SurvivinaHumana(R18E, P47L, Q56L, H77A, C84A, A128P, I135P) é mostrada na SEQ ID NO:56. Especificamente, a mutação P47L fortalece a posição de âncora 2 no péptido CPTENEPDL (SEQ ID N0:2), que é alterada para CLTENEPDL (SEQ ID NO:35).

Do mesmo modo, a substituição Q56L cria o péptido ALCFFCFKEL (SEQ ID NO:36) com um residuo de âncora preferido na posição comparado com AQCFFCFKEL (SEQ ID NO:37), o que é previsto ser um ligante bastante fraco para HLA-A 0201. Quando comparado com huSurvivina de tipo selvagem, a sequência de survivina variante Q56L produz um péptido que é previsto ser um antigénio tão forte como o péptido antigénico huSurvivina validado ELTLGEFLKL (SEQ ID NO:38) (Andersen et al., (2001) Câncer Res. 61:869-872).

De acordo com a invenção, essa análise pode produzir sequências de survivina contendo péptidos altamente antigénicos aos quais CTLs são menos prováveis de serem tornados tolerantes, por exemplo, promovendo respostas a epitopos subdominantes.

Exemplo 13. Tratamento de um doente de cancro humano com uma vacina contendo um vetor para expressar survivina de não-mamífero.

De acordo com a invenção, um ser humano com cancro é tratado com uma vacina da invenção como se segue. Primeiro, os candidatos ao tratamento são opcionalmente categorizados com um agente de diagnóstico que testa se as células do seu cancro sobre-expressam survivina. Por exemplo, uma amostra do tumor pode ser analisada por imunofluorescência com 77 anticorpos anti-survivina. Alternativamente, uma amostra de tumor de um doente candidato pode ser analisada por hibridização com um chip de genes que deteta niveis de mARN de survivina, por PCR de transcriptase reversa, ou por qualquer outro método que deteta niveis da proteina ou de mARN de survivina. Os doentes podem também ser categorizados em relação à probabilidade de responder com base em outros testes diagnósticos, tais como testes para niveis de expressão de MHC, niveis das moléculas de transdução de sinal conhecidas por estarem envolvidas na morte mediada por células T, ou com base nos niveis das moléculas cuja função não é entendida mas que são empiricamente conhecidas por se correlacionarem com responsividade à imunoterapia. É particularmente útil escolher doentes humanos que foram sujeitos a resseção cirúrgica da maior parte do tumor. Isto permite a análise de diagnóstico do tumor como descrito acima. Para além disso, sem querer estar limitado pela teoria, é vantajoso tratar após resseção cirúrgica porque um tumor grande e volumoso pode simplesmente titular o sistema imune. Para além disso, os tumores secretam fatores imunossupressores difusiveis que conseguem maiores concentrações em grandes massas do que em pequenas metástases.

Os doentes que são escolhidos para tratamento têm melanoma, carcinoma do cólon, cancro da mama, cancro da próstata, cancro do pulmão, cancro do rim, glioblastoma, cancro da cabeça e pescoço, e outros cancros.

Após diagnóstico apropriado e seleção dos doentes, um doente é tratado com uma estirpe de Salmonella carregando um vetor de expressão de survivina de não-mamifero (um vetor para expressar survivina de não-mamifero numa célula 78 de mamífero). Por exemplo, um doente pode receber cerca de 109 até 1013 Salmonellas LT2 vivas portadoras de um plasmídeo com expressão da survivina de galinha conduzida por um promotor de mamífero. Preferencialmente, cerca de 1010-1012 bactérias são usadas, e mais preferencialmente cerca de 2xlOn Salmonellas são administradas. A estirpe de Salmonella é preferencialmente auxotrófica, e qualquer das estirpes mencionadas nos Exemplos pode ser usada.

Dois métodos alternativos são usados para abordar o problema da sobrevivência das bactérias de Salmonella no ambiente ácido do estômago. Pelo primeiro método, um doente ingere primeiro uma quantidade segura e eficaz de bicarbonato de sódio para neutralizar o ácido do estômago. Pelo segundo método, as bactérias de Salmonella são formuladas como um comprimido com um revestimento entérico que permite a passagem através do estômago e dissolução no intestino delgado.

Efeitos secundários podem incluir diarreia ligeira quando estirpes bacterianas de Salmonella typhimurium são usadas; Salmonella typhimurium é naturalmente um agente patogénico do rato e não é normalmente patogénica em humanos. É preferível tratar essas diarreias ligeiras sintomaticamente, com não tratar com antibióticos, uma vez que esse tratamento pode destruir o efeito da vacina.

Exemplo 14. Momento da vacinação em relação ao desafio do tumor.

Uma experiência foi realizada para testar a importância do momento da vacinação com survivina de galinha em relação à altura do desafio do tumor. Os ratos foram doseados com Salmonella contendo um plasmídeo que codifica SurvivinadeGalinha(N97E, T99M, V100L, Q101G) por gavagem 79 oral. 0 planeamento das doses é mostrado na Figura 9. Como mostrado, a gavagem oral foi realizada nos dias 1 e 13; dias 7 e 13; dias 10 e 18; ou dias 13 e 21, em relação ao desafio intravenoso com células LLC/KSA ao dia 10 e uma avaliação da carga tumoral no pulmão ao dia 29. Como mostrado na Figura 10, a gavagem oral com salmonella contendo um plasmídeo que codifica SurvivinadeGalinha (N97E, T99M, V100L, Q101G) foi eficaz para reduzir a carga tumoral no pulmão independentemente do plano de dosagem usado. 0 efeito da vacina foi mais pronunciado quando a dose de vacina primária foi administrada mais do que três dias antes do desafio do tumor.

Os efeitos dos diferentes planos de dosagem em metástases do pulmão foram também avaliados. Metástases pulmonares foram classificadas como se segue: a um rato com mais do que 50% de cobertura da sua superfície pulmonar com tumor foi dada uma classificação de 3; a um rato com 5-50% da superfície do seu pulmão coberta por tumor foi dada uma classificação de 2; a um rato com menos do que 5% da superfície pulmonar coberta pelo tumor foi dada uma classificação de 1; e a um rato sem colónias de tumor no pulmão visiveis foi dada uma classificação de zero. Como mostrado na Figura 10, os planos de dosagem que incluiam uma primeira dose antes do desafio do tumor tenderam a reduzir a classificação das metástases pulmonares comparado com planos de dosagem mais tardios ou com ratos que não foram imunizados oralmente com SurvivinadeGalinha(N97E, T99M, V100L, Q101G).

Exemplo 15. Terapia de combinação com vacina de survivina e quimioterapia.

Os efeitos de combinar vacinação contra survivina e quimioterapia foram também avaliados. O protocolo de 80 testagem é mostrado na Figura 11. Como mostrado na figura, os ratos que receberam o tratamento completo foram preparados com Salmonella portadora de um plasmídeo que codifica survivina de galinha de tipo selvagem ao dia 1. Células LLC/KSA foram introduzidas por via intravenosa (desafio) ao dia 4. Ciclofosfamida (CTX) foi administrada por via intraperitoneal ao dia 11 e indometacina foi administrada aos dias 12-15. Ao dia 15, foi dada aos ratos uma segunda gavagem oral (reforço) com Salmonella portadora de plasmideo de survivina de galinha do tipo selvagem e a carga de tumor no pulmão foi avaliada ao dia 28.

Outros ratos receberam apenas porções do tratamento, recebendo por exemplo: apenas a primária, o desafio, e o reforço (PCB); o desafio, a CTX e a indometacina, mas não a primária ou o reforço (C(CI)); a primária, o desafio, a CTX, e a indometacina, mas não o reforço (PC (Cl)); ou o desafio, a CTX, a indometacina, e o reforço, mas não a primária (C(CI)B).

Como mostrado na Figura 12, os ratos que receberam apenas a primária, o desafio e o reforço mostraram uma carga tumoral reduzida e classificação de metástases pulmonares reduzidas comparado com o controlo negativo. CTX e indometacina tiveram efeitos semelhantes na classificação das metástases pulmonares e uma maior redução geral da carga tumoral. As cargas tumorais mais baixas e a classificação mais baixa de metástases pulmonares foram observadas em ratos que receberam pelo menos a primária e CTX e indometacina, demonstrando que o tratamento de vacinação e a quimioterapia podem cooperar para reduzir cargas tumorais e metástases pulmonares.

Exemplo 16. Vacinação à base de Salmonella com ADN que codifica survivina de não-mamífero correlaciona-se o 81 aparecimento de células T com um fenótipo de memória ativado.

Linfócitos do sangue periférico foram isolados de ratos sujeitos a PCB, Cl, PC(Cl), C(CI)B, ou a tratamentos completos (PC(CI)B) descritos no exemplo anterior. As células foram analisadas por citometria de fluxo para determinar se os tratamentos conduziram ao aparecimento de células T de memória ativadas. A presença ou ausência de células T de memória foi determinada monitorizando células com alta expressão de CD44 e baixa expressão de CD3 (CD44bright CD3low) - Como mostrado na Figura 13, os ratos tratados com o protocolo primária-desafio-reforço (PCB) demonstraram células T com um perfil de expressão de CD44bright indicativo do aparecimento de células T de memória ativadas. Perfis semelhantes foram observados em cada um dos protocolos que incluia imunização com Salmonella portadora de um plasmideo que codifica survivina de galinha, mas não nos ratos tratados apenas com quimioterapia (e não nos controlos negativos).

Exemplo 17. Terapia de combinação com uma imunocitoquina e a vacinação com ADN que codifica survivina de não mamífero.

Para determinar se a vacinação usando uma survivina de não-mamífero pode melhorar a eficácia dum um tratamento tumoral à base de imunocitoquinas, os ratos foram desafiados ao dia 1 com células LLC/KSA por via subcutânea e tratados de acordo com o plano mostrado na Figura 14. Os ratos que receberam gavagem oral com salmonella abrigando um plasmideo que codifica SurvivinadeGalinha(N97E, T99M,

V100L, Q101G) foram doseados aos dias 4, 11, 18, e 25. A imunocitoquina selecionada para uso nesta experiência foi uma fusão de IL-2 com um anticorpo anti-EpCAM desimunizado, 82 como descrito na publicação do pedido de patente US 2003-0157054. Os ratos que receberam a imunocitoquina receberam 20 yg da imunocitoquina por via intravenosa aos dias 8, 9 e 10.

Os volumes tumorais resultantes ao longo do tempo são mostrados na Figura 15. Quer a vacinação quer os tratamentos com imunocitoquina foram suficientes para abrandar o crescimento tumoral ao longo do tempo. Os ratos que receberam ambas a vacina e a imunocitoquina foram ainda melhores, demonstrando ainda mais reduções nas taxas de crescimento tumoral comparado com só vacinação ou só tratamento com imunocitoquina.

Exemplo 18: Avaliação da atividade biológica dos elementos de construção da survivina da invenção

Algumas das variantes de survivina da invenção são concebidas para serem biologicamente inertes. Deste modo, as próprias proteinas não exibem atividade anti-apoptótica quando expressadas em células sob condições que normalmente induziriam apoptose evitável por uma proteína survivina de tipo selvagem. Do mesmo modo, as proteínas não interferem com a atividade da survivina endógena de tipo selvagem para proteger células do efeito dos agentes indutores de apoptose. A inércia biológica de uma proteína survivina pode ser testada usando células precursoras de linfócitos BaF3. As células BaF3 são dependentes de IL-3 para crescerem e sofrem apoptose após retirada do fator de crescimento, o que pode ser combatido pela atividade da survivina (ver, por exemplo, Ambrosini et al., (1997) Nat. Med. 3:917-921). As células BaF3 são transfectadas com plasmídeos que codificam um elemento de construção da survivina da 83 invenção, uma proteína survivina de tipo selvagem ou uma inserção vazia, e adicionalmente uma proteína marcadora tal como GFP, de modo a que células expressando o ADN introduzido exogenamente possam ser monitorizadas. Após recuperação da transfeção, IL-3 é retirada do meio e as células BaF3 são monitorizadas em relação a apoptose, por exemplo, avaliando a % de viabilidade aos dias 1, 2, 3, e 4, ou por um ensaio indicativo de apoptose familiar aos especialistas na técnica, tal como por morfologia nuclear (condensação e fragmentação de ADN) . Verificou-se que ao passo que as células BaF3 transfectadas com a survivina de tipo selvagem permaneceram largamente viáveis ao longo do período de 4 dias, as células BaF3 transfectadas com um plasmídeo vazio ou uma variante de survivina da invenção não permaneceram viáveis e apresentaram largamente uma morfologia nuclear indicativa de apoptose. A inércia biológica do elemento de construção da survivina da invenção pode também ser testada usando células HeLa. Células HeLa expressam survivina endógena a níveis significativos, e é sabido que mutações específicas, tais como huSurvivina(C84A), atuam como formas de survivina dominantes negativas (Survivina DN) e induzem apoptose nestas células (ver por exemplo Li et al., (1999) Nat. Cell Biology 1:461-466). Células HeLa são transfectadas com plasmídeos que codificam uma Survivina DN ou um elemento de construção de survivina da invenção, para além de uma proteína marcadora tal como GFP, de modo a que as células expressando o ADN introduzido exogenamente possam ser monitorizadas. Após recuperação da transfeção, as células HeLa são crescidas durante 48 horas, fixadas, os núcleos são corados com DAPI, e a morfologia nuclear das células é analisada por microscopia de imunofluorescência. Verifica-se que ao passo que as células HeLa transfectadas com Survivina DN tipicamente têm características de sofrerem 84 apoptose, tal como núcleos condensados e fragmentados, as células HeLa transfectadas com elementos de construção de survivina da invenção crescem normalmente.

Exemplo 19: Avaliação da estabilidade dos elementos de construção da survivina da invenção.

Para avaliar a estabilidade de um elemento de construção da survivina, ele pode ser expressado a partir de um vetor que expressa adicionalmente uma proteina marcadora tal como GFP de modo que a quantidade da proteina survivina expressada pode ser medida em relação a um padrão. Células de cultura de tecidos, tais como células BHK, são transitoriamente transfectadas e o nivel de expressão do elemento de construção da survivina é analisado por Western blot, normalizado para expressão do marcador. Se anticorpos anti-survivina disponíveis não reconhecerem a proteina, versões marcadas C-terminalmente destas variantes podem ser usadas. Verificou-se que comparado com a survivina de tipo selvagem, alguns elementos de construção da survivina preferidos modificados da invenção, tais como aqueles com múltiplas mutações destabilizantes, são detetados a niveis muito mais reduzidos.

Para além de analisar niveis de estado estável, a taxa de degradação pode ser avaliada numa experiência ao longo do tempo. Cicloheximida inibidora da tradução é adicionada às células ao tempo 0 e as células são incubadas durante 4 horas. Aos 0, 2, 5, 10, 20, 60 e 240 minutos, as amostras são removidas para análise de Western blot. Para comparar taxas entre elementos de construção da survivina modificados e de survivina de tipo selvagem, as quantidades são normalizadas ao ponto de tempo 0. Verificou-se que certos elementos de construção da survivina preferidos 85 modificados da invenção são degradados mais rapidamente do que a survivina de tipo selvagem.

Para avaliar se a degradação ocorre pela via mediada por proteassoma, as células são opcionalmente incubadas na presença ou ausência de um inibidor de proteassoma tal como lactacistina (2 horas, 100 μΜ), e mais uma vez os niveis de survivina são analisados por Western blot. Na presença de lactacistina, verifica-se que variantes da survivina da invenção e huSurvivina de tipo selvagem são detetadas em niveis semelhantes.

Lisboa, 27 de Agosto de 2012 1

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Vacina que desencadeia uma resposta imune à survivina humana compreendendo um péptido derivado de uma survivina humana modificada ou de um ácido nucleico que codifica o referido péptido, em que a referida survivina humana modificada compreende uma mutação no domínio BIR que anula substancialmente a atividade biológica atribuída ao domínio BIR, caracterizado pelo referido péptido compreender um domínio helicoidal modificado e conter as seguintes mutações sobreviventes de humano: R18E, P47L, Q56L, H77A, C84A, A128P e I135P, formando assim a sequência de aminoácidos como especificado na SEQ ID NO 56.

2. Vacina da reivindicação 1, em que o péptido é fundido a uma porção Fc.

3. Vacina da reivindicação 1 ou 2, em que a vacina codifica adicionalmente ou inclui um péptido derivado de uma molécula efetora.

4. Vacina da reivindicação 3, em que a molécula efetora é uma citoquina selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2 IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23 e GM-CSF.

5. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o ácido nucleico que codifica o péptido compreende um promotor de mamífero.

6. Vacina da reivindicação 5, em que o ácido nucleico é um ADN nu. 2

7. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que o ácido nucleico é formulado com um reagente que melhora a trasfeção de células de mamífero.

8. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1 - 7, em que o ácido nucleico é parte de uma partícula virai.

9. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1 - 8, em que a vacina compreende uma bactéria compreendendo o ácido nucleico.

10. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1-9, compreendendo adicionalmente um adjuvante.

11. Composição farmacêutica compreendendo uma vacina como especificado em qualquer uma das reivindicações 1 - 10, opcionalmente em conjunto com um transportador aceitável, diluente ou excipiente.

12. Vacina ou composição farmacêutica como especificado em qualquer uma das reivindicações 1-11 para o uso de imunizar um doente contra células tumorais que sobre-expressam survivina humana. Lisboa, 27 de Agosto de 2012