PT2205245E - Utilização terapêutica de diaminofenotiazinas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO UTILIZAÇÃO TERAPÊUTICA DE DIAMINOFENOTIAZINAS Campo da Técnica A presente invenção refere-se geralmente a métodos e materiais para utilização no tratamento ou profilaxia de doenças, por exemplo distúrbios cognitivos, utilizando diaminofenotiazinas. Em particular refere-se a tratamentos tendo propriedades farmacocinéticas otimizadas.

Antecedentes da técnica

Foi mostrado anteriormente que os compostos de 3,7-diaminofenotiazina inibem a agregação de proteína tau e perturbam a estrutura de PHFs, e revertem a estabilidade proteolítica do núcleo de PHFs (veja-se o documento WO96/30766, F Hoffman-La Roche). Tais compostos foram divulgados para utilização no tratamento e profilaxia de várias doenças, incluindo AD e Doença de Corpos de Lewy, e incluíram cloreto de metiltionínio ("MTC"). 0 documento WO96/30766 descreve, no caso de administração por via oral, uma dosagem diária de cerca de 50 mg a cerca de 700 mg, preferentemente cerca de 150 mg até cerca de 300 mg, dividida em preferentemente 1-3 doses unitárias.

Outras divulgações de fenotiazinas na área dos distúrbios neurodegenerativos incluem os documentos WO 02/075318, WO 2005/030676.

Foi sabido na técnica que os compostos de DAPTZ podem ocorrer numa forma com carga (oxidada) e forma sem carga (reduzida ou "leuco"). Foi também sabido que a absorção celular destes diferiu. Adicionalmente, foi sabido que tais compostos podiam em princípio ter efeitos hematológicos adversos e outros efeitos secundários em determinadas doses. O documento WO 02/055720 (The University Court of the

University of Aberdeen) discute a utilização de formas reduzidas de diaminofenotiazinas especificamente para o tratamento de uma variedade de doenças de agregação proteica, embora a divulgação se refira primariamente a taupatias. 0 documento WO 02/055720 discute um modelo farmacocinético preliminar baseado em estudos de conjuntos de dados de excreção urinária em seres humanos, cães e ratos por DiSanto e Wagner, J Pharm Sei 1972, 61:1086-1090 e 1972, 61:1090-1094 e Moody et al., Biol Psych 1989, 26: 847-858. Nota adicionalmente que a única forma de azul-de-metileno que atravessa a barreira hematoencefálica após administração por via i.v. é a forma reduzida. Com base na atividade in vitro das formas reduzidas de diaminofenotiazinas na mesma, uma dosagem diária sugerida foi de 3,2-3,5 mg/kg, e foram também descritas dosagens de 20 mg tds, 50 mg tds ou 100 mg tds, combinadas com 2x mg relação de ácido ascórbico de maneira a alcançar mais de 90% de redução anteriormente à ingestão.

No entanto o documento WO 02/055720 não proporcionou um modelo que integrasse dados de níveis sanguíneos tais como os descritos por Peter et al. (2000) Eur J Clin Pharmacol 56: 247-250 ou proporcionaram um modelo validado através de dados de ensaio químico. Com efeito, conforme descrito abaixo, os dados de Peter et al. contradisseram os dados anteriores de DiSanto e Wagner no que diz respeito à semivida de eliminação terminal.

May et al. (Am J Physiol Cell Physiol, 2004, Vol. 286, pp. C1390-C1398) mostraram que os eritrócitos humanos reduzem sequencialmente e absorvem MTC, isto é, que o próprio MTC não é absorvido por parte das células mas em vez disso é a forma reduzida de MTC que atravessa a membrana celular. Também mostraram que a taxa de absorção é dependente de enzimas, e que tanto MTC como MTC reduzido são concentrados em células (o MTC reduzido reequilibra-se uma vez dentro da célula para formar MTC). Não obstante, a otimização de uma dose terapêutica adequada de compostos de DAPTZ tais como MTC, e a sua formulação, particularmente para otimizar a atividade desejada ou minimizar os efeitos secundários adversos são problemas complexos. Uma barreira principal a isto é a falta de um modelo farmacocinético adequado. Asim pode ser visto que a provisão de um tal modelo, e como tal o ensinamento sobre como a abordagem de um ou mais destes problemas, proporcionaria uma contribuição à técnica. 0 pedido PCT/GB2007/001103 anteriormente depositado, não publicado, divulga compostos incluindo:

Estes compostos podem ser considerados como uma forma reduzida estabilizada em comparação com, por exemplo, MTC. O documento PCT/GB2007/001103 descreve unidades de dosagem compreendendo 20 a 300 mg dos compostos de DAPTZ descritos no mesmo, por exemplo, 30 a 200 mg, por exemplo 30 mg, 60 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg. É sugerida uma dose adequada do composto de DAPTZ no intervalo de cerca de 100 ng até cerca de 25 mg (mais tipicamente cerca de 1 yg até cerca de 10 mg) por quilograma de peso corporal do sujeito, por dia, por exemplo 100 mg, 3 vezes ao dia, 150 mg, 2 vezes ao dia, 200 mg, 2 vezes ao dia.

Divulgação da invenção O cloreto de metiltioninio ("MTC") é o ingrediente ativo de uma preparação terapêutica com direitos de propriedade (designada "rember™") sendo desenvolvida para o tratamento de AD e demências relacionadas. Foi levado a cabo um ensaio clinico no qual foi demonstrada eficácia terapêutica ao longo de 50 semanas de tratamento em AD leve e moderada.

Utilizando os resultados deste ensaio, os presentes inventores desenvolveram um modelo farmacocinético integrado completamente inovador aplicável à dosagem oral humana de compostos de DAPTZ incluindo, mas não limitado a, MTC. 0 modelo tem importantes implicações para definir os parâmetros que determinam a dosagem oral ótima em termos de segurança e eficácia, e implica modalidades de tratamento inovadoras para o tratamento de distúrbios cognitivos. É mostrado que o novo modelo é preciso na previsão da excreção urinária, e prevê corretamente as cinéticas do compartimento de tecido cerebral verificado através do estudo de porcos.

Brevemente, o ensaio clinico mostrou que o MTC tem duas ações farmacológicas sistémicas: efeitos cognitivos e efeitos hematológicos, mas que inesperadamente estas ações são separáveis. Especificamente os efeitos cognitivos não mostram uma relação de resposta à dose monotónica, enquanto os efeitos hematológicos sim. Os inventores propõem que duas espécies diferentes são responsáveis pelos dois tipos de atividade farmacológica: o MTC absorvido como a forma

Leuco-MT sem carga sendo responsável pela atividade cognitiva benéfica, e o MTC absorvido como espécie dimérica oxidada sendo responsável pela oxidação da hemoglobina. Já que estes efeitos são mecanisticamente diferentes, podem ser manipulados separadamente de forma a maximizar a biodisponibilidade da espécie terapeuticamente ativa (cognitivamente eficaz).

Como tal estas constatações têm implicações profundas na dosagem de ambos compostos de DAPTZ oxidado e leuco, em cada caso de forma a maximizar a atividade terapêutica e como tal reduzir os efeitos secundários através da otimização do regime e formulação de dosagem relevante para o agente em questão.

Compostos de DAPTZ oxidados - formas de dissolução rápida (não parte da invenção)

Como pode ser observado a partir da Figura 31A, há uma perda acentuada de eficácia prevista à medida que a dissolução de cápsula observada aos 30 minutos cai por debaixo de 20%. Isto confirma que a dissolução rápida é critica para a atividade terapêutica e pode ser explicada através do papel critico do estômago na absorção da fração de metiltioninio (MT) na sua forma terapeuticamente ativa.

Especificamente, de acordo com a hipótese de dissolução retardada, uma forma bastante diferente de MT é responsável pelos efeitos secundários hematológicos. Esta foi postulada como sendo um dimero, a formação do qual é favorecida nas condições alcalinas do intestino delgado e intestino grosso. Portanto, os efeitos secundários hematológicos observados no ensaio clinico foram uma consequência especifica da formulação de cápsula de gelatina utilizada no estudo (e particularmente a sua taxa de dissolução - veja-se a Figura 7) em vez de uma caracteristica inerente da própria fração de MT, se absorvida no estômago.

Como tal, no desenho de uma formulação melhorada de MTC ou outros compostos de DAPTZ, a obtenção de eficácia prevista é criticamente determinada pelo requisito de que a dissolução do produto medicinal investigado (isto é, comprimido ou cápsula) seja superior a 50% em 30 minutos em condições padrão.

Como tal num aspeto é divulgado um método de tratamento de um distúrbio cognitivo ou do SNC num paciente, em que o dito distúrbio é um que é suscetível a tratamento através de um composto de DAPTZ, cujo método compreende administrar por via oral ao dito paciente uma unidade de dosagem contendo o dito composto de DAPTZ em forma oxidada como ingrediente ativo, em que a dita dosagem liberta pelo menos 50% do dito ingrediente ativo no prazo de 30 minutos sob condições padrão . 0 tratamento do distúrbio cognitivo ou do SNC será de forma a maximizar o beneficio cognitivo ou do SNC relativo frente aos efeitos hematológicos do composto de DAPTZ (veja-se por exemplo a Figura 7). A dissolução de cápsula é determinada através da quantidade de DAPTZ libertada na fase aquosa de fluido gástrico simulado (SGF) sob condições de dissolução padrão da US/EU Pharmacopoeia. Isto é descrito no Exemplo 11.

Unidades de dosagem desta forma maximizarão como tal a absorção no estômago, e mais criticamente minimizarão a formação de dimeros que é favorecida nas condições alcalinas do intestino delgado e intestino grosso.

Preferentemente mais de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60% ou 50% será absorvido no estômago em menos de 30 minutos. São discutidas formulações e veículos de administração adequados para esta dissolução rápida mais detalhadamente abaixo. A quantidade de DAPTZ oxidada na forma farmacêutica será uma quantidade terapeuticamente eficaz. No entanto com base na divulgação no presente documento pode ser observado que doses muito elevadas (em que a dissolução é retardada) levará somente a absorção limitada da dose nominal no estômago através do mecanismo de redutase levando a absorção retardada indesejável a partir do intestino delgado a pH mais elevado através da formação de dimeros.

Assim preferentemente a unidade de dosagem compreende menos de 120 mg, menos de 100, menos de 70, mais preferentemente desde 40-70 mg (por exemplo 40, 45, 50, 55, 60, 65, ou 70) e é administrada 3/dia ou 4/dia (vejam-se por exemplo as Figuras 29 e 30 e 32 e 36).

Compostos de DAPTZ oxidados - formas de retenção gástrica (não parte da invenção)

Como tal num aspeto é divulgado um método de tratamento de um distúrbio cognitivo ou do SNC num paciente, em que o dito distúrbio é um que é suscetível a tratamento através de um composto de DAPTZ, cujo método compreende administrar por via oral ao dito paciente uma unidade de dosagem contendo o dito composto de DAPTZ em forma oxidada como ingrediente ativo, em que a dita unidade de dosagem é retida gastricamente. 0 tratamento do distúrbio cognitivo ou do SNC será de forma a maximizar o benefício cognitivo ou do SNC relativo frente aos efeitos hematológicos do composto de DAPTZ (veja-se por exemplo a Figura 7).

Uma forma retida gastricamente será preferentemente mantida no estômago durante pelo menos 30 minutos, mais preferentemente pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 horas ou mais . São discutidas formulações e veículos de administração adequados para a retenção gástrica mais detalhadamente abaixo. A quantidade de DAPTZ oxidada na forma retida gastricamente será uma quantidade terapeuticamente eficaz. Ao minimizar o trânsito ao intestino delgado (e como tal a formação de dímeros terapeuticamente inativos) são factíveis cargas mais elevadas de DAPTZ oxidada. Assim preferentemente a unidade de dosagem compreende pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg, ou mais, por exemplo, 200, 300, 400, 500 mg.

Compostos reduzidos de DAPTZ

As relações descritas no presente documento têm implicações no que diz respeito à abordagem convencional para alcançar a utilização de um regime de dosagem mais conveniente, isto é, 2/dia ou 1/dia. Estes regimes de dosagem são em princípio mais desejáveis em pacientes com demência, que têm esquecimento e como tal necessitam incitamento para tomar a medicação. A abordagem convencional para alcançar um regime de dosagem mais conveniente é a criação de uma formulação de libertação lenta. Contudo, a presente análise indica que, pelo contrário, uma formulação de libertação lenta padrão de uma forma oxidada de DAPTZ de um produto terapêutico eliminaria essencialmente a eficácia, conforme ilustrado convenientemente através das propriedades da cápsula de 100 mg em TRx-014-001 nos Exemplos adiante.

Como tal, devido às razões discutidas acima, não seria factível gerar uma formulação de libertação retardada de um produto medicinal à base de DAPTZ oxidada. Contudo, este não seria o caso de produtos farmacêuticos em que o composto de DAPTZ está em forma reduzida. Isto deve-se a que as formas leuco de tais compostos não podem formar dímeros, uma vez que não são moléculas "planas" não têm a carga que permite a estabilização da forma dimérica através de neutralização da carga.

Como tal num aspeto adicional é divulgado um método de tratamento de um distúrbio cognitivo ou do SNC num paciente, sofrendo de um distúrbio hematológico em que o dito distúrbio é um que é suscetível a tratamento através de um composto de DAPTZ, cujo método compreende administrar por via oral ao dito paciente uma unidade de dosagem contendo o dito composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável como ingrediente ativo.

Conforme descrito abaixo o composto é de forma a tratar o distúrbio cognitivo ou do SNC e a maximizar os benefícios cognitivos ou do SNC relativos frente aos efeitos hematológicos do composto de DAPTZ.

Particularmente, com base no ensinamento no presente documento, a perda devido à não absorção inicial por parte do estômago seria grandemente reduzida já que as formas cristalinas reduzidas estáveis têm maior solubilidade que os equivalentes oxidados e não requiririam a atividade da tiazina redutase corante (May et al., 2004) que se presume existir no estômago e presume-se ser necessária para a absorção (veja-se absorção prevista na Figura 33). É como tal inferido que podem ser alcançados uma eficácia mais elevada e um regime de dosagem superior utilizando a forma L-MTx da fração de metiltioninio. A quantidade de DAPTZ reduzida na forma farmacêutica será uma quantidade terapeuticamente eficaz.

Em particular uma formulação de libertação retardada (por exemplo 1/dia) do composto de DAPTZ reduzido a entre 100-1000 mg não levaria em principio às consequências adversas da absorção retardada (veja-se Figura 38) . Como tal à luz da divulgação no presente documento podem ser consideradas dosagens de até 1000 mg ou mais (por exemplo 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg) administradas 1/dia ou mais.

Preferentemente esta é uma formulação de libertação lenta ou retardada, isto é, libertação de menos de <50% em 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas.

Como pode ser observado a partir das Figuras 34 e 35, é previsto que poderia ser alcançado um nível de eficácia de -8,1 unidades de ADAS-cog num regime de dosagem de 100 mg da DAPTZ reduzida (descrita como "forma L-MTx") administrada duas vezes diariamente. Isto pode ser também alcançado através da administração de dose com 60 mg 3 vezes por dia. Seriam esperados níveis de eficácia ainda maiores utilizando 100 mg ou mais, administrados 3 vezes por dia.

Os compostos de DAPTZ reduzidos da presente invenção podem ser convenientemente descritos como estando numa "forma reduzida cristalina estabilizada" e são descritos no pedido anteriormente depositado, não publicado, PCT/GB2007/001103. Será apreciado, no entanto, que inclusive estes compostos podem auto-oxidar-se em certa medida para dar as formas oxidadas correspondentes. Assim, é provável, se não inevitável, que composições compreendendo os compostos de DAPTZ de forma reduzida cristalina estabilizada da presente invenção conterão, como uma impureza, pelo menos alguns do composto oxidado correspondente.

Em aspetos da presente invenção pertencendo a estes compostos de DAPTZ de forma reduzida cristalina estabilizada, estes compostos de DAPTZ oxidados podem representar não mais de 50% em peso, por exemplo, não mais do que 40% em peso, por exemplo, não mais do que 30% em peso, preferentemente por exemplo, não mais do que 20% em peso, por exemplo, não mais do que 10% em peso, por exemplo, não mais do que 5% em peso, por exemplo, não mais do que 3% em peso, por exemplo, não mais do que 2% em peso, por exemplo, não mais do que 1% em peso do teor total de DAPTZ da forma farmacêutica.

Tratamento O termo "tratamento", conforme utilizado no presente documento no contexto do tratamento de uma condição, pertence geralmente ao tratamento e terapêutica de um ser humano, no qual algum efeito terapêutico desejado é alcançado, por exemplo, a inibição do progresso da condição, e inclui a redução na taxa de progresso, uma paragem na taxa de progresso, regressão da condição, melhoria da condição e cura da condição. A presente invenção inclui adicionalmente medidas profiláticas (isto é, profilaxia, prevenção). O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" conforme utilizado no presente documento, refere-se àquela quantidade de um composto ativo, ou um material, composição ou forma farmacêutica compreendendo um composto, que é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado, comensurável com uma razão de risco/beneficio razoável, quando administrada de acordo com um regime de tratamento desejado.

De forma semelhante, 0 termo "quantidade profilaticamente eficaz" conforme utilizado no presente documento, refere-se àquela quantidade de um composto ativo, ou um material, composição ou forma farmacêutica compreendendo um composto, que é eficaz para produzir algum efeito profilático desejado, comensurável com uma razão de risco/benefício razoável, quando administrada de acordo com um regime de tratamento desejado. 0 termo "tratamento" inclui tratamentos e terapêuticas de combinação, nos quais dois ou mais tratamentos ou terapêuticas são combinadas, por exemplo, sequencialmente ou simultaneamente. Tratamentos de combinação são discutidos em maior detalhe adiante.

Distúrbios cognitivos ou do SNC

Distúrbios cognitivos ou do SNC preferidos são descritos abaixo. Distúrbios neurodegenerativos adicionais são descritos nos Exemplos adiante. 0 distúrbio cognitivo pode ser uma condição de taupatia num paciente (veja-se por exemplo o documento WO96/30766). Bem como doença de Alzheimer (AD), a patogénese de distúrbios neurodegenerativos tais como a doença de Pick e a Paralisia Supranuclear Progressiva (PSP) parece estar correlacionada com uma acumulação de agregados patológicos de tau truncada no giro dentado e nas células piramidais estreladas do neocórtex, respetivamente. Outras demências incluem demência fronto-temporal (FTD); parkinsonismo ligado ao cromossoma 17 (FTDP-17); complexo de desinibição-demência-parkinsonismo-amiotrofia (DDPAC); degeneração pallido-ponto-nigral (PPND); sindrome de Guam-ALS; degeneração pallido-nigro-lousiana (PNLD); degeneração cortico-basal (CBD) e outras (veja-se Wischik et ai. 2000, loc. cit, para discussão detalhada - especialmente o Quadro 5.1) . Todas estas doenças, que são caracterizadas primariamente ou parcialmente por agregação anormal de tau, são referidas no presente documento como "taupatias".

Neste e em todos os restantes aspetos da invenção com respeito a taupatias, preferentemente a taupatia é selecionada a partir do grupo consistindo nas indicações acima, isto é, AD, doença de Pick, PSP, FTD, FTDP-17, DDPAC, PPND, síndrome de Guam-ALS, PNLD, e CBD.

Numa forma de realização preferida a taupatia é a doença de Alzheimer (AD).

Onde a doença é qualquer taupatia, o método de tratamento da taupatia pode ser tal que o composto de DAPTZ causa inibição da agregação da proteína tau associada com o dito estado da doença e também dissolução de agregados de tau no cérebro do paciente ou sujeito. Conforme descrito nos Exemplos abaixo, os presentes inventores mostraram que a dissolução de tais agregados é um efeito fundamental na abertura de uma via de eliminação (veja-se por exemplo Figuras 6A e 6B).

Numa forma de realização o distúrbio cognitivo pode ser deficiência cognitiva leve (MCI) por exemplo MCI amnéstica. 0 pedido provisional US 60/945,006 anteriormente depositado descreve a utilização de compostos de DAPTZ para MCI. Embora ainda haja discussão na literatura sobre a natureza do conceito de MCI (veja-se Gauthier et al., Lancet, 2006; 367: 1262-1270; Petersen RC et al.

Neuropathological features of amnestic mild cognitive impairment. Arch Neurol 2006; 63: 665-672) a MCI é reconhecida como um alvo de doença válido por parte da FDA. É definida como tendo um grau menor de deficiência cognitiva não cumprindo ainda os critérios clínicos para um diagnóstico de demência.

Numa forma de realização o distúrbio do SNC pode ser uma sinucleinopatia tal como a Doença de Parkinson (PD). O pedido PCT/GB2007/001105 anteriormente depositado descreve a utilização de compostos de DAPTZ para o tratamento de PD e outras sinucleinopatias.

As sinucleinopatias consistem atualmente nos seguintes distúrbios: PD, demência com corpos de Lewy (DLB), atrofia de múltiplos sistemas (MSA), parkinsonismo induzido por fármacos (por exemplo produzido por 1-metil-4-fenil- I, 2,3,6-tetrahidropiridina [MPTP] ou pesticidas tais como rotenona), e falência autonômica pura (PAF).

Grupos de pacientes

Sujeitos adequados para o método podem ser selecionados com base em fatores convencionais.

Assim, por exemplo, para AD a seleção inicial de um paciente pode envolver qualquer um ou mais de: avaliação rigorosa por parte de um clinico experiente; exclusão de diagnóstico não de AD na medida do possível através de investigações laboratoriais suplementares ou outras; avaliação objetiva do nível de função cognitiva utilizando uma bateria neuropatologicamente validada.

Para a MCI, os critérios representativos para a MCI sindrómica incluem as características: A. 0 paciente não é normal nem demente; B. Existe evidência de deterioração cognitiva mostrada através tanto de declínio medido objetivamente ao longo do tempo e/ou relato subjetivo de declínio pelo próprio ou um informante em conjunto com testes cognitivos objetivos (por exemplo testes secundários de memória); C. As atividades da vida diária são conservadas e funções instrumentais complexas permanecem ou intatas ou minimamente afetadas (veja-se também Winblad, B. et al. (2004) Mild cognitive impairment - beyond controversies, towards a concensus: report of the

International Working Group on Mild Cognitive Impairment. J. Intern. Med. 256: 240-246) . O paciente será geralmente diagnosticado com MCI, mas não será diagnosticado com AD (isto é, não mostrará demência) . O paciente pode, por exemplo, ter idade superior a 45, 50, 55 anos. O paciente pode cumprir um ou todos dos seguintes critérios com respeito a: (i) Estádio de Braak de 3 ou menos, 2 ou menos,

1 ou menos, (ii) pontuação de MMSE menor ou igual a MMSE 24,25,26,27,28 ou 29, mais preferentemente menor ou igual a MMSE 24,25,26, mais preferentemente menor ou igual a MMSE 2 4 ou 2 5 . 0 diagnóstico de PD é bem conhecido por parte dos peritos na especialidade.

Conforme notado acima, os métodos da presente invenção são pretendidos para tratar o distúrbio cognitivo ou do SNC num paciente de forma a maximizar o beneficio cognitivo ou do SNC relativos frente aos efeitos hematológicos do composto de DAPTZ.

Assim o paciente pode ser um paciente que se sabe sofrer de uma hemoglobinopatia tal como anemia falciforme, talassemia, meta-hemoglobinemia; uma anemia (por exemplo uma anemia hemolitica); uma malignidade hematológica (por exemplo um linfoma), mieloma, plasmacitoma ou leucemia); uma coagulopatia tal como hemofilia; e assim por diante. 0 risco acima da média de tais doenças pode ser avaliado utilizando critérios convencionais, por exemplo sintomáticos, genéticos, idade, estilo de vida, etnia (por exemplo a anemia falciforme ocorre de forma mais comum em pessoas - ou os seus descendentes - de partes do mundo tal como a África Subsariana). Um tipo particular de pacientes em risco de um distúrbio hematológico seriam aqueles com mais de 70 anos de idade, que podem estar sujeitos a condições de anemia relacionada com a idade (por exemplo displasia mieloide).

Dosagem, formulações e veículos de administração

Dentro da divulgação no presente documento, o nível de dosagem selecionado irá depender de uma variedade de fatores incluindo, mas não limitado a, a atividade do composto de DAPTZ particular, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos químicos, e/ou materiais utilizados em combinação, da gravidade da condição, e da espécie, sexo, idade, peso, condição, saúde geral, e do histórico médico anterior do paciente.

Podem ser proporcionadas unidades de fármaco ou de dosagem (por exemplo, um comprimido ou cápsula farmacêuticos) com as propriedades de carga, dissolução, ou retenção gástrica adequadas descritas acima por parte dos peritos na especialidade com base na divulgação no presente documento utilizando tecnologias convencionais, e as tecnologias convencionais não formam parte per se da presente invenção.

Por exemplo podem ser proporcionadas unidades de fármaco de dissolução rápida de (para compostos de DAPTZ oxidados ou reduzidos) ou unidades de dissolução lenta ou retardada (para compostos de DAPTZ reduzidos) e testadas para aquisição a partir de fontes comerciais (por exemplo Encap Drug Delivery (Unidades 4, 5 e 6, Oakbank Park Way, Livingston, West Lothian, EH53 OTH, Escócia, Reino Unido); Eurand (Via Martin Luther King, 13 20060, Pessano con Bornago, Milão) e assim por diante.

As unidades de fármaco retidas gastricamente são também amplamente conhecidas na literatura de patente (por exemplo documentos US6207197, US5972389) e literatura geral, e têm-no sido durante vários anos - veja-se por exemplo Davis, et al., "Transit of pharmaceutical dosage forms through the small intestine", Gut, 27 (8) :886-892 (1986); Fara, "Physiological limitations: gastric emptying and transit of dosage forms" em: Rate Control in Drug Therapy, L.F. Prescott, et al., Eds., Churchill Livingstone, Nova Iorque (1985); Davis, S.S. (2005) Formulation strategies for absorption windows Drug Discovery Today 10:249-257. Este último nota que o processo de trânsito gastrintestinal em seres humanos e as suas implicações para a administração de fármacos são agora bem entendidas. As formas farmacêuticas administradas a um estômago alimentado terão esvaziamento retardado. Um sistema multiparticulado, tal como um contendo microsferas ou sedimentos, pode ser misturado com a comida e, como uma consequência, será esvaziado com a comida ao longo de um período de tempo prolongado. Se as partículas administradas são de grande tamanho, não serão capazes de passar através do piloro constrito com a comida digerida, e terão de esperar até o estômago estar vazio e em estado de jejum. Em geral, pode ser esperado que partículas de até 10 mm de tamanho sejam esvaziadas a partir do estômago alimentado. O momento exato do esvaziamento das partículas irá depender também do seu número e das suas posições relativas no interior do estômago. Por isso, é esperado que uma forma farmacêutica maior do que 15-20 mm e administrada com comida alcance retenção gástrica. Uma tal forma farmacêutica terá então uma oportunidade de esvaziar após a comida ter deixado o estômago quando ocorra o estado de jejum.

Um sistema de unidade única (ou multiparticulado) pode esvaziar rapidamente a partir do estômago em jejum. O momento exato do esvaziamento irá depender também do tempo das ondas de limpeza do estômago em relação à dosagem. O piloro aberto tem um diâmetro de 15 mm em seres humanos. Um objeto de tamanho superior a este terá dificuldade em passar para o intestino delgado no estado de jejum (ou alimentado). Com base neste conhecimento, foram elaboradas várias abordagens para a retenção gástrica. Estes caem em duas classes principais: (i) partículas pequenas que têm propriedades bioadesivas (e também propensão a flutuar no conteúdo no estômago); e (ii) objetos grandes incháveis que serão retidos no estômago devido ao seu tamanho. Estes sistemas incháveis podem também ter características de flutuação, normalmente proporcionadas pela geração de dióxido de carbono. A companhia de administração de fármacos Depomed descreveu comprimidos com retenção gástrica "que se incham no estômago que trata o comprimido como comida não digerida, e não permite a sua passagem para o intestino delgado. 0 comprimido é retido no estômago durante várias horas, onde pode administrar a sua carga útil de fármaco tão rápida ou lentamente como desejado", (http ://www.depomedinc.com/products_pipeline.htm)

Estes sistemas são baseados no óxido de polietileno (PEO) em combinação com hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) para produzir um comprimido de matriz de libertação sustentada que se pode inchar. De acordo com a companhia, as moléculas candidatas incluem metformina, gabapentina ciprofloxacina e furosemida. Comunicados de imprensa recentes afirmam que Depomed completou ensaios clínicos de Fase III com metformina uma vez por dia para o tratamento da diabetes de Tipo II e com ciprofloxacina uma vez por dia para o tratamento de infeções do trato urinário, e que foram depositadas novas aplicações de fármacos para ambos produtos com a FDA. A companhia está também a levar a cabo um ensaio de Fase II com a furosemida diurética.

Um resume recente descreveu um estudo de cintilografia duplamente marcada de libertação controlada de comprimidos com retenção gástrica de furosemida de libertação controlada em voluntários saudáveis. 0 procedimento de mareagem dupla permitiu a caracterização por separado da erosão e do inchamento. Os comprimidos (e um controlo de libertação imediata) foram administrados após um pequeno-almoço rico com elevado teor de gordura. A permanência gástrica dos comprimidos incháveis foi suficientemente longa para administrar o fármaco ao trato gastrointestinal superior. Consequentemente, a concentração em plasma do fármaco foi prolongada e, além disso, ao contrário de formulações de libertação lenta anteriores relatadas na literatura, não houve redução da biodisponibilidade. Desde um ponto de vista de adesão do paciente, o comprimido com retenção gástrica proporcionou diurese e natriurese gradual, em vez da diurese breve e intensa do tempo de latência curta experimentado por parte de pacientes tomando comprimidos de furosemida de libertação imediata convencionais.

Assim formas farmacêuticas conhecidas podem ser aplicadas à presente invenção, e em particular para a utilização com formas de DAPTZ oxidadas.

Enquanto é possível para o composto de diaminofenotiazínio ser utilizado (por exemplo, administrado) por si só, é frequentemente preferível apresentá-lo com uma composição ou formulação.

Preferentemente o fármaco ou unidade de dosagem é proporcionado como uma composição farmacêutica (por exemplo, formulação, preparação, medicamento) compreendendo o composto de DAPTZ, conforme descrito no presente documento, e um portador, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto de diaminofenotiazínio, conforme descrito no presente documento, em conjunto com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos para os peritos na especialidade, incluindo, mas não limitado a, portadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes, excipientes, adjuvantes cargas, tampões, conservantes, antioxidantes, lubrificantes, estabilizantes, solubilizantes, tensioativos (por exemplo, agentes humectantes), agentes de mascaramento, agentes de coloração, agentes aromatizantes, e agentes edulcorantes.

Numa forma de realização, a composição compreende adicionalmente outros agentes ativos, por exemplo, outros agentes terapêuticos ou profiláticos.

Portadores, diluentes, excipientes, etc. adequados podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrão. Veja-se, por exemplo, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a Edição (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nova Iorque, EUA), Remington's

Pharmaceutical Sciences, 20a Edição, pub. Lippincott, Williams e Wilkins, 2000; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edição, 1994. O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme utilizado no presente documento, refere-se a compostos, ingredientes, materiais, composições, formas farmacêuticas, etc., que são, dentro do âmbito do bom julgamento médico, adequadas para a utilização em contacto com os tecidos do indivíduo em questão (por exemplo, ser humano) sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma razão de risco/benefício razoável. Cada portador, diluente, excipiente, etc. deve também ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação.

As formulações podem ser preparadas através de quaisquer métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Tais métodos incluem a etapa de colocar em associação o composto ativo com um transportador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas associando uniformemente e intimamente o composto ativo com portadores (por exemplo, portadores líquidos, veículos sólidos finamente divididos, etc.), e posteriormente dar forma ao produto, se necessário.

Conforme notado acima, a formulação pode ser preparada para proporcionar uma libertação rápida ou lenta; imediata, retardada, programada, ou sustentada; ou uma combinação das mesmas.

Terapêuticas de Combinação

Tratamentos e terapêuticas de combinação, nos quais dois ou mais tratamentos ou terapêuticas são combinados, por exemplo, sequencialmente ou simultaneamente, são discutidos em maior detalhe doravante. Assim será entendido que qualquer das utilizações médicas ou métodos descritos no presente documento podem ser utilizados numa terapêutica de combinação, por exemplo outro tratamento para AD, MCI, ou PD, respetivamente. Por exemplo um tratamento para AD empregando um composto da invenção pode ser em combinação com um inibidor da colinesterase tal como Donepezil (Aricept™), Rivastigmine (Exelon™) ou Galantamine (Reminyl™).

Um tratamento empregando um composto da invenção pode ser em combinação com um antagonista de recetor de NMDA tal como Memantine (Ebixa™, Namenda™).

Um tratamento empregando um composto da invenção pode ser em combinação com um antagonista de recetor muscarinico.

Um tratamento empregando um composto da invenção pode ser em combinação com um inibidor de proteína precursora amilóide para beta-amilóide (por exemplo, um inibidor do processamento de proteína precursora amilóide que leva à geração potenciada de beta-amilóide).

Exemplos de compostos de DAPTZ A relação entre compostos de DAPTZ oxidados e reduzidos por ser convenientemente ilustrada utilizando MTC, um sal de fenotiazin-5-io. Esta pode convenientemente ser considerada como uma "forma oxidada" quando considerada com respeito ao composto de 10H-fenotiazina correspondente, Ν,Ν,Ν', Ν'—tetrametil-10H-fenotiazina-3,7-diamina, que pode convenientemente ser considerada uma "forma reduzida".

Este aspeto da invenção refere-se a determinados compostos de diaminofenotiazina e análogos dos mesmos, tendo uma das seguintes fórmulas, e sais, hidratos, e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos (referidos coletivamente no presente documento como "diaminofenotiazinas" ou "compostos de diaminofenotiazina").

A Fórmula (1) ilustra compostos numa forma reduzida, enquanto cada uma das Fórmulas (2), (3), e (4) ilustram compostos numa forma oxidada.

Numa forma de realização, os compostos são selecionados a partir de compostos de fórmula (1), e sais, hidratos, e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Cada uma das estruturas acima é somente uma de muitas estruturas de ressonância equivalentes, e cada uma das quais pretendem ser abrangidas por essa estrutura representativa. Por exemplo, a estrutura (4) é somente uma de muitas estruturas de ressonância equivalentes, algumas das quais são mostradas abaixo, e das quais todas pretendem ser abrangidas pela estrutura (4).

Substituintes de Átomos de Anéis de Carbono

Em cada uma das fórmulas acima, cada R1, R2, R4, R6, R8, e R9 são independentemente selecionados a partir de: -H; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -OR; -SH; -SR; -no2; -C(=0)R; -C(=0)OH; -C(=0)OR; -C (=0) NH2; -C (=0) NHR; -C(=0)NR2; -C (=0) NRn1Rn2; -NH2; -NHR; -NR2; -NRn1Rn2; -NHC(=0)H; -NRC(=0)H; -NHC(=0)R; -NRC(=0)R; -R; em que cada R é independentemente selecionado a partir de: alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquilo Ci-6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído, cicloalquilo C3-6 substituído; carboarilo Οε-ιο não substituído; carboarilo Οε-ιο substituído; heteroarilo C5-i0 não substituído; heteroarilo C5-i0 substituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 não substituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 substituído; em que, em cada grupo -NRn1R,n2, independentemente, RN1 e RN2 tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Exemplos de grupos -NRn1Rn2, em que RN1 e RN2 tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel, incluem: pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino, pirrolilo, e formas substituídas, tais como formas N-substituidas, tais como N-metilpiperazino.

Numa forma de realização, cada R1, R2, R4, R6, R8, e R9 são independentemente selecionados a partir de: -H; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -OR; -C (=0)OH; -C(=0)OR; -R.

Numa forma de realização, cada R1, R2, R4, R6, R8, e R9 são independentemente selecionados a partir de: -H; -R.

Numa forma de realização, cada R é independentemente selecionado a partir de: alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquilo Ci-6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído, cicloalquilo C3-6 substituído .

Numa forma de realização, cada R é independentemente selecionado a partir de: alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquilo Ci-6 alifático substituído.

Numa forma de realização, cada R é independentemente selecionado a partir de: -Me, -Et, -nPr, e -iPr. Numa forma de realização, cada R é independentemente selecionado a partir de: -Me e -Et.

Numa forma de realização, o grupo alquilo Ci-6 é um grupo alquilo C1-4.

Numa forma de realização, o grupo alquenilo C2-6 é um grupo alquenilo C2-4.

Numa forma de realização, o grupo cicloalquilo C3-6 é um grupo cicloalquilo C3-4.

Exemplos de grupos alquilo Ci_6 alifático não substituído incluem: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, terc-pentilo, neopentilo, hexilo, isoexilo, etc.

Exemplos de grupos alquenilo C2-6 alifático não substituído incluem: propen-l-ilo, propen-2-ilo, buten-1- ilo, buten-2-ilo, buten-3-ilo, etc.

Exemplos de grupos cicloalquilo C3-6 não substituído incluem: ciclopropilo, ciclopropilmetilo; ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc.

Numa forma de realização, o grupo carboarilo C6-io é um grupo carboarilo C6.

Numa forma de realização, o grupo heteroarilo C5-10 é um grupo heteroarilo C5-6.

Numa forma de realização, o grupo carboarilo C6-io_alquilo C1-4 é um grupo carboarilo C6-alquilo C2-2.

Exemplos de grupos carboarilo C6-io não substituídos incluem: fenilo, naftilo.

Exemplos de grupos heteroarilo C5-i0 não substituídos incluem: pirrolilo, tienilo, furilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, pirazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo.

Exemplos de grupos carboarilo C6-io_alquilo C1-4 não substituídos incluem: benzilo, feniletilo.

Numa forma de realização, substituintes opcionais (por exemplo, em alquilo C1-6 alifático, alquenilo C1-6 alifático, cicloalquilo C3-6, carboarilo Ce-10, heteroarilo C5-10, carboarilo C6-io_alquilo C1-4) são independentemente selecionados a partir de: -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -OR'; -SH; -SR'; -no2; -C(=0)R'; -C (=0) OH; -C(=0)0R'; -C (=0) NH2; -C(=0)NHR'; -C(=0)NR'2; -C (=0) NR' N1R' N2; -NH2; -NHR'; -NR'2; -NR'n1R'n2; -NHC (=0) H; -N'RC(=0)H; -NHC(=0)'R; -N'RC(=0)'R; -Rf; em que cada R' é independentemente selecionado a partir de: alquilo C2-6 alifático não substituído; alquilo C2-6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído, cicloalquilo C3-6 substituído; carboarilo Οε-ιο não substituído; carboarilo C6-10 substituído; heteroarilo C5-i0 não substituído; heteroarilo C5-losubst ituído; carboarilo C6-io-alquilo C1-4 não substituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 substituído; em que, em cada grupo -NR' N1R'N2, independentemente, R,N1 e R,n2 tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Numa forma de realização, substituintes opcionais (por exemplo, em alquilo Ci-6 alifático, alquenilo Ci-6 alifático, C3-6cicloalquilo, carboarilo C6-io/· heteroarilo C5-i0, carboarilo C6-io_alquilo C1-4) são independentemente selecionados a partir de: -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -OR; -C (=0)OH; -C(=0)OR'; -R' .

Numa forma de realização, substituintes opcionais (por exemplo, em alquilo C1-6 alifático, alquenilo C1-6 alifático, C3-6CÍcloalquilo, carboarilo Οε-ιο, heteroarilo C5-10, carboarilo C6-io_alquilo C1-4) são conforme definidos acima, exceto que cada R' é independentemente selecionado a partir de: alquilo C1-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído; carboarilo C5-i0 não substituído; heteroarilo C5-10 não substituído; carboarilo Cs-io-alquilo C1-4 não substituído.

Numa forma de realização, substituintes opcionais (por exemplo, em alquilo Ci-6 alifático, alquenilo Ci-6 alifático, C3-6cicloalquilo, carboarilo C6-io, heteroarilo C5-i0-carboarilo C6-io_alquilo C1-4) são conforme definidos acima, exceto que cada R' é independentemente selecionado a partir de: alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído.

Numa forma de realização, substituintes opcionais (por exemplo, em alquilo Ci-6 alifático, alquenilo Ci-6 alifático, C3-6cicloalquilo, carboarilo C6-io/· heteroarilo C5-i0, carboarilo C6-io_alquilo C1-4) são conforme definidos acima, exceto que cada R' é independentemente selecionado a partir de: alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquilo Ci-6 alifático substituído.

Numa forma de realização, substituintes opcionais (por exemplo, em alquilo C1-6 alifático, alquenilo C1-6 alifático, C3-6CÍcloalquilo, carboarilo C6-10, heteroarilo C5-10, carboarilo C6-io-alquilo C1-4) são conforme definidos acima, exceto que cada R' é independentemente selecionado a partir de: -Me, -Et, -nPr, e -iPr.

Numa forma de realização, substituintes opcionais (por exemplo, em alquilo C1-6 alifático, alquenilo C1-6 alifático, C3-6CÍcloalquilo, carboarilo C6-10, heteroarilo C5-10, carboarilo C6-io_alquilo Ci_4) são conforme definidos acima, exceto que cada R' é independentemente selecionado a partir de: -Me e -Et.

Numa forma de realização, cada R1, R2, R4, R6, R8, e R9 são independentemente selecionados a partir de: -H -Me, -

Et, -nPr, e -iPr.

Numa forma de realização, cada R1, R2, R4, R6, R8, e R9 são independentemente selecionados a partir de: -H -Me, e -Et.

Numa forma de realização, cada R1, R2, R4, R6, R8, e R9 são independentemente selecionados a partir de: -He -Me.

Numa forma de realização, todos exceto quatro de R1, R2, R4, R6, R8, e R9 são -H.

Numa forma de realização, todos exceto dois de R1, R2, R4, R6, R8, e R9 são -H,

Numa forma de realização, todos exceto um de R1, R2, R4, R6, R8 e R9 é -H.

Numa forma de realização, cada R1, R2, R4, R6, R8, e R9 é -H. Grupos Amino

Em cada uma das fórmulas acima, em cada grupo NR3naR3nb, se presente, cada r3na e R3NB é independentemente -H ou conforme definido acima para R; ou R3NA e R3NBtomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Por exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada r3na e R3NB é independentemente conforme definido acima para R; ou r3na e R3NBtomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Por exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada r3na e R3NB é independentemente selecionado a partir de: -H; alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquilo Ci-6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído; cicloalquilo C3-6 substituído; carboarilo Οε-ιο não substituído; carboarilo Οε-ιο substituído; heteroarilo C5-i0 não substituído; heteroarilo C5-i0 substituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 não substituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 substituído; ou R3na e R3NBtomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Por exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada R3NA e R3NB é independentemente selecionado a partir de: alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquilo Ci-6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído, cicloalquilo C3-6 substituído; carboarilo Οε-ιο não substituído; carboarilo Οε-ιο substituído; heteroarilo C5-i0 não substituído; heteroarilo C5_ losubst ituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 não substituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 substituído; ou R3na e R3NBtomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada R3NA e r3nb é independentemente selecionado a partir de: -H; alquilo Ci_6 alifático não substituído; alquilo Ci_6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído, cicloalquilo C3-6 substituído; ou R3na e R3NBtomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada R3NA e r3nb é independentemente selecionado a partir de: alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquilo Ci-6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído, cicloalquilo C3-6 substituído; ou R3na e R3NBtomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada R3NA e r3nb é independentemente selecionado a partir de: -H; alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído; ou R3na e R3NBtomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada R3NA e r3nb é independentemente selecionado a partir de: alquilo C1-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído; ou R3na e R3NBtomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada R3NA e r3nb é independentemente selecionado a partir de: -H -Me, -Et, - nPr, e -iPr.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada R3NA e r3nb é independentemente selecionado a partir de: -H -Me, e -Et (por exemplo, -NR3naR3na é -NH2, -NHMe, -NMe2, -NHEt, -NEt2, ou -NMeEt) .

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR3naR3nb, se presente, cada R3NA e R3NB é independentemente selecionado a partir de: -He -Me (por exemplo, -NR3NAR3NA é -NH2, -NHMe, ou -NMe2) .

Em analogia precisa, em cada uma das fórmulas acima, em cada grupo -NR7naR7nb, se presente, cada R7NA e R7NB é independentemente -H ou conforme definido acima para R; ou R7na e R7nb tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Por exemplo, numa forma de realização, em cada grupo -NR7naR7nb, se presente, cada r7na e R7NB é independentemente conforme definido acima para R; ou R7NA e R7NB tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão unidos para formar um anel tendo desde 3 até 7 átomos de anel.

Numa forma de realização, -NR3NAR3NB e -NR7naR7nb, se ambos presentes, são iguais.

Numa forma de realização, -NR3NAR3NB e -NR7naR7nb, se ambos presentes, são diferentes.

Em cada uma das fórmulas acima, em cada grupo =NR3nc, se presente, R3NC é independentemente -H ou conforme definido para R.

Por exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc, se presente, R3NC é independentemente conforme definido para R.

Por exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc, se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: -H; alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquilo Ci-6 alifático substituído; alquenilo C2-e alifático não substituído; alquenilo C2-e alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído, cicloalquilo C3-6 substituído; carboarilo Cõ-io não substituído; carboarilo Cõ-io substituído; heteroarilo C5-i0 não substituído; heteroarilo C5-i0 substituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 não substituído; carboarilo C6-io-alquilo C1-4 substituído.

Por exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc, se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: alquilo C1-6 alifático não substituído; alquilo C1-6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-e alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído, cicloalquilo C3-6 substituído; carboarilo C6-io não substituído; carboarilo C6-io substituído; heteroarilo C5-i0 não substituído; heteroarilo C5_ losubst ituído; carboarilo C6-io-alquilo C1-4 não substituído; carboarilo C6-io_alquilo C1-4 substituído.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc, se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: -H; alquilo C1-6 alifático não substituído; alquilo C1-6 alifático substituído; alquenilo C2-5 alifático não substituído; alquenilo C2-5 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído; cicloalquilo C3-6 substituído.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc, se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: alquilo C1-6 alifático não substituído; alquilo C1-6 alifático substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído; cicloalquilo C3-6 substituído.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc, se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: -H; alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc, se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: alquilo Ci-6 alifático não substituído; alquenilo C2-6 alifático não substituído; cicloalquilo C3-6 não substituído.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc , se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: -H -Me, -Et, -nPr, e -iPr.

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc , se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: -H -Me, e -Et (por exemplo, =NR3nc é =NH, =NMe, OU =NEt) .

Noutro exemplo, numa forma de realização, em cada grupo =NR3nc , se presente, R3NC é selecionado independentemente a partir de: -He -Me (por exemplo, =NR3nc é =NH ou =NMe).

Em analogia precisa, em cada uma das fórmulas acima, em cada grupo =NR™C, se presente, R™c é independentemente conforme definido acima para R3NC.

Substituintes de Átomos de Anéis de Azoto

Também, em analogia precisa, em cada uma das fórmulas acima, RN1°, se presente, é independentemente conforme definido acima para R3NC (ou R™c) .

Por exemplo, numa forma de realização, RN1°, se presente, é independentemente selecionado a partir de: -He alquilo alifático Ci-6 não substituído.

Por exemplo, numa forma de realização, RN1°, se presente, é independentemente selecionado a partir de: -H -Me, e -Et.

Por exemplo, numa forma de realização, RN1°, se presente, é independentemente selecionado a partir de: -He -Me.

Por exemplo, numa forma de realização, RN1°. se presente, é independentemente -H.

Contra-Ião X~, se presente, é um ou mais contra-iões aniónicos para alcançar neutralidade elétrica.

Exemplos de contra-iões aniónicos adequados são discutidos abaixo sob o cabeçalho "Sais".

Numa forma de realização, X~ é independentemente um anião halogénio (isto é, um haleto).

Numa forma de realização, X~ é independentemente Cl”, Br~, ou I-.

Numa forma de realização, X~ é independentemente Cl-.

Numa forma de realização, X- é independentemente NO3-. Isómeros

Determinados compostos podem existir numa ou mais formas geométricas, óticas, enantioméricas, diastereoméricas, epiméricas, atrópicas, estereoisoméricas, tautoméricas, conformacionais, ou anoméricas particulares, incluindo, mas não limitadas a, formas cis e trans, formas E e Z; formas c, t, e r; formas endo e exo; formas R, S, e meso; formas D e L; formas del; formas ( + ) e (-) ; formas ceto, enol, e enolato; formas sin e anti; formas sinclinal e anticlinal; formas (alfa) e (beta); formas axiais e equatoriais; formas de barco, cadeira, torcida, de envelope, e de meia cadeira; e combinações das mesmas, doravante coletivamente referidas como "isómeros" (ou "formas isoméricas") .

Note-se que, exceto conforme discutido abaixo para formas tautoméricas, especificamente excluídas do termo "isómeros" conforme utilizado no presente documento, são isómeros estruturais (ou constitucionais) (isto é, isómeros que diferem nas uniões entre átomos em vez de meramente pela posição dos átomos no espaço) . Por exemplo, uma referência a um grupo metoxi, -OCH3, não deve ser entendida como uma referência ao seu isómero estrutural, um grupo hidroximetilo, -CH2OH. De forma semelhante, uma referência a orto-clorof enilo não deve ser entendida como uma referência ao seu isómero estrutural, meta-clorofenilo. Contudo, uma referência a uma classe de estruturas pode também incluir formas estruturalmente isoméricas que se incluem dentro dessa classe (por exemplo, alquilo Cl-7 inclui n-propilo e isopropilo; butilo inclui n-, iso-, sec-, e terc-butilo; metoxipentilo inclui orto-, meta-, e parametoxifenilo). A exclusão anterior não se refere a formas tautoméricas, por exemplo, formas ceto, enol, e enolato, como, por exemplo, nos seguintes pares tautoméricos: ceto/enol (ilustrado abaixo), imina/enamina, álcool amida/imino, amidina/amidina, nitroso/oxima, tiocetona/enetiol, N-nitroso/hidroxiazo, e nitro/aci-nitro.

Note-se que especificamente incluídos no termo "isómero" estão compostos com uma ou mais substituições isotópicas. Por exemplo, H pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 2H, 2H (D) , e 3H (T) ; C pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 21C, 12C, 13C, e 14C; 0 pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 160 e 180; e semelhantes. A menos que especificado de outra forma, uma referência a um composto particular inclui todas as tais formas isoméricas, incluindo (total ou parcialmente) racémicas e outras misturas das mesmas. Métodos para a preparação (por exemplo, síntese assimétrica) e separação (por exemplo, meios de cristalização fracionária e cromatográficos) de tais formas isoméricas são conhecidos na técnica ou são prontamente obtidos através da adaptação dos métodos ensinados no presente documento, ou métodos conhecidos, de uma forma conhecida.

Sais

Poderá ser conveniente ou desejável preparar, purificar, e/ou manipular um sal correspondente do composto, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são discutidos em Berge et al. , 1977, "Pharmaceutically

Acceptable Salts," J. Pharm. Sci. Vol. 66, pp. 1-19.

Por exemplo, se o composto for aniónico, ou tiver urn grupo funcional que pode ser aniónico (por exemplo, -COOH pode ser -COO-) , então um sal pode ser formado com um catião adequado. Exemplos de catiões inorgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, iões de metais alcalinos tais como Na+ e K+, catiões alcalino-terrosos tais como Ca2+ e Mg2+, e outros catiões tais como Al3+. Exemplos de catiões orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, ião amónio (isto é, NH4+) e iões amónio substituídos (por exemplo, NH3R+, NH2R2 + , NHR3+, NR4+) . Exemplos de alguns iões amónio substituídos adequados são aqueles derivados a partir de: etilamina, dietilamina; diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina, e trometamina, bem como aminoácidos, tais como lisina e arginina. Um exemplo de um ião amónio quaternário comum é N(CH3) 4+.

Se o composto é catiónico, ou tem um grupo funcional que pode ser catiónico (por exemplo, -NH2 pode ser -NH3+) , então um sal pode ser formado com um anião adequado. Exemplos de aniões inorgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, aqueles derivados a partir dos seguintes ácidos inorgânicos: clorídrico, bromídrico, iodídrico, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosfórico, e fosforoso.

Exemplos de aniões orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, aqueles derivados a partir dos seguintes ácidos orgânicos: 2-acetioxibenzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzóico, canforossulfónico, cinâmico, cítrico, edético, etanodissulfónico, etanossulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutâmico, glicólico, hidroximaleico, hidroxinaftaleno carboxílico, isetiónico, lático, lactobiónico, láurico, maleico, málico, metanossulfónico, múcico, oleico, oxálico, palmitico, pamoico, pantotenico, fenilacético, fenilssulfónico, propiónico, pirúvico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, tartárico, toluenossulfónico, e valérico. Exemplos de aniões orgânicos poliméricos adequados incluem, mas não estão limitados a, aqueles derivados a partir dos seguintes ácidos poliméricos: ácido tânico, carboximetilcelulose. 0 composto pode também ser proporcionado na forma de um sal misto (isto é, o composto em combinação com um sal, ou outro sal) . Por exemplo, o sal misto de cloreto de metiltionínio cloreto de zinco (MTZ) é um sal misto de cloreto de met ilt ionínio (MTC) , um sal de cloreto, e outro sal, cloreto de zinco. Tais sais mistos pretendem ser abrangidos pelo termo "e sais farmaceuticamente aceitáveis do(s) mesmo (s)". A menos que especificado de outra forma, uma referência a um composto particular também inclui formas de sal do mesmo.

Hidratos e Solvatos

Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar, e/ou manipular um solvato correspondente do composto ativo. 0 termo "solvato" é utilizado no presente documento no sentido convencional para se referir a um complexo de soluto (por exemplo, composto, sal do composto) e solvente. Se o solvente é água, o solvato pode ser convenientemente referido como um hidrato, por exemplo, um monoidrato, um diidrato, um triidrato, etc. A menos que especificado de outra forma, uma referência a um composto particular também inclui formas de solvato do mesmo.

Compostos de DAPTZ reduzidos cristalinos estáveis

Estes compostos são descritos no pedido anteriormente depositado, não publicado, PCT/GB2007/001103, e são compostos de 3,7-diamino-lOH-fenotiazina da seguinte fórmula:

em que: cada R1 e R9 é independentemente selecionado a partir de: -H alquilo C1-4, alquenilo C2-4, e alquilo C1-4 halogenado; cada R3na e R3NB é independentemente selecionado a partir de: -H alquilo C1-4, alquenilo C2-4, e alquilo C1-4 halogenado; cada R7na e R7NB é independentemente selecionado a partir de: -H alquilo C1-4, alquenilo C2-4, e alquilo C1-4 halogenado; cada HX1 e HX2 é independentemente um ácido prótico; e sais, solvatos, e hidratos farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

Sem pretender vincular-se a qualquer teoria particular, os inventores acreditam que é possível, se não provável, que os compostos existam na seguinte forma:

Embora os compostos de DAPTZ sejam eles mesmos sais, podem também ser proporcionados na forma de um sal misto (isto é, a DAPTZ em combinação com outro sal) . Tais sais mistos pretendem ser abrangidos pelo termo "e sais farmaceuticamente aceitáveis do(s) mesmo(s)". A menos que seja especificado de outro modo, uma referência a um composto particular também inclui sais do mesmo.

Os compostos de DAPTZ podem também ser proporcionados na forma de um solvato ou hidrato. 0 termo "solvato" é utilizado no presente documento no sentido convencional para se referir a um complexo de soluto (por exemplo, composto, sal do composto) e solvente. Se o solvente é água, o solvato pode ser convenientemente referido como um hidrato, por exemplo, um monohidrato, um diidrato, um triidrato, etc. A menos que especificado de outra forma, uma referência a um composto particular também inclui formas de solvato do mesmo.

Numa forma de realização, os grupos alquilo C1-4 são selecionados a partir de: grupos alquilo C1-4 lineares, tais como -Me, -Et, -nPr, -iPr, e -nBu; grupos alquilo C3-4 ramificados, tais como -iPr, -iBu, -sBu, e -tBu; e grupos alquilo C3-4 cíclicos, tais como -cPr e -cBu.

Numa forma de realização, os grupos alquenilo C2-4 são selecionados a partir de grupos alquenilo C1-4 lineares, tais como -CH=CH2 (vinilo) e -CH2-CH=CH2 (alilo) .

Numa forma de realização, os grupos alquilo C1-4 halogenado são selecionados a partir de: -CF3, -CH2CF3, e - cf2cf3.

Os Grupos R1 e R9

Numa forma de realização, cada R1 e R9 é independentemente -H, -Me, -Et, ou -CF3.

Numa forma de realização, cada R1 e R9 é independentemente -H, -Me, ou -Et.

Numa forma de realização, R1 e R9 são iguais.

Numa forma de realização, R1 and R9 são diferentes.

Numa forma de realização, cada R1 e R9 é independentemente -H.

Numa forma de realização, cada R1 e R9 é independentemente -Me.

Numa forma de realização, cada R1 e R9 é independentemente -Et.

Os Grupos R3na e R3NB

Cada R3na e R3NB é independentemente selecionado a partir de: -H alquilo C3-4, alquenilo C2_4, e alquilo Ci_4 halogenado.

Numa forma de realização, cada R3NA e r3nb é independentemente selecionado a partir de: alquilo Ci-4, alquenilo C2-4, e alquilo C4-4 halogenado.

Numa forma de realização, cada R3NA and r3nb é independentemente -Me, -Et, -nPr, -nBu, -CH2-CH=CH2, ou - CF3.

Numa forma de realização, cada R3NA and r3nb é independentemente -Me, -nPr, -nBu, -CH2-CH=CH2, ou -CF3.

Numa forma de realização, cada R3NA e r3nb é independentemente -Me ou -Et.

Numa forma de realização, R3NA e R3NB são iguais. Numa forma de realização, r3na e R3NB são diferentes.

Numa forma de realização, cada R3NA e R3NB é independentemente -Me. Numa forma de realização, cada r3na e R3nb é independentemente -Et.

Os Grupos R7na e R7NB

Cada R7na e R7NB é independendemente selecionado a partir de: -H, alquilo C1-4, alquenilo C2-4, e alquilo C1-4 halogenado.

Numa forma de realização, cada R™A e r™b é independentemente selecionado a partir de: alquilo C1-4, alquenilo C2-4, e alquilo C1-4 halogenado.

Numa forma de realização, cada R7NA e R7NB é independentemente -Me, -Et, -nPr, -nBu, -CH2-CH=CH2, ou -CF3.

Numa forma de realização, cada R7NA e R7NB é independentemente -Me, -nPr, -nBu, -CH2-CH=CH2, ou -CF3.

Numa forma de realização, cada R7NA e r7nb é independentemente -Me ou -Et.

Numa forma de realização, R7NA e R7NB são iguais. Numa forma de realização, r7na e R7NB são diferentes.

Numa forma de realização, cada R7NA e r7nb é independentemente -Me. Numa forma de realização, cada r7na e R7nb é independentemente -Et.

Numa forma de realização, R3NA e R3NB e r7na e R7NB são iguais.

Numa forma de realização, R3NA e R3NB e R7NA e R7NB são conforme definido no presente documento, com a condição de que pelo menos um de r3na e R3NBe r7na e R7NB é outro que não seja -Et.

Condições Opcionais

Numa forma de realização, o composto é como definido no presente documento, mas com a condição de que: r3na e R3NB e R7na e R7nb não são cada um -Et.

Numa forma de realização, o composto é como definido no presente documento, mas com a condição de que: se: cada R1 e R9 é -H; então: r3na e R3NB e r7na e R7NB não são cada um -Et.

Os Grupos -N(R3na) (R3nb) e -N(R7na) (R7nb)

Numa forma de realização, cada R3na and R3NB é independentemente alquilo C1-4, alquenilo C2-4, ou alquilo C1-4 halogenado; cada R7na e R7NB é independentemente alquilo C1-4, alquenilo C2-4, ou alquilo C1-4 halogenado; opcionalmente com a condição de que pelo menos um de r3na e R3NBe R7na e R7NB é outro que não seja -Et.

Numa forma de realização, cada R3na and R3NB é independentemente -Me, -Et, -nPr, nBu, -CH2-CH=CH2, ou -CF3; cada R7na e R7NB é independentemente -Me, -Et, -nPr, -nBu, -CH2-CH=CH2, ou -CF3; opcionalmente com a condição de que pelo menos um de r3na e R3NBe R7na e R7NB é outro que não seja -Et.

Numa forma de realização, cada R3na e R3NB é independentemente -Me ou -Et; cada R7na e R7NB é independentemente -Me ou -Et; opcionalmente com a condição de que pelo menos um de r3na e R3NBe R7na e R7NB é outro que não seja -Et.

Numa forma de realização, os grupos -N (R3NA) (R3NB) e - N (R7na) (R7nb) são iguais.

Numa forma de realização, os grupos -N (R3NA) (R3NB) e - N (R7na) (R7nb) são diferentes.

Numa forma de realização, cada um dos grupos N (r3na) (r3nb) e -N (r7na) (r7nb) é independentemente selecionado a partir de: -NMe2, -NEt2, -N (nPr) 2, -N(Bu)2, -NMeEt, -NMe (nPr) , e - N (CH2CH=CH2) 2.

Numa forma de realização, os grupos -N (R3NA) (R3NB) e - N (R7na) (R7nb) são iguais, e são independentemente selecionados a partir de: -NMe2, -NEt2, -N(nPr)2, -N(Bu)2, -NMeEt, -NMe(nPr), e -N (CH2CH=CH2) 2.

Numa forma de realização, os grupos -N (R3NA) (R3NB) e - N (r7na) (r7nb) são iguais, e são independentemente selecionados a partir de: -NMe2 e -NEt2.

Numa forma de realização, cada um dos grupos N(R3na) (R3nb) e -N(R7na) (R7nb) é: -NMe2+.

Numa forma de realização, pelo menos um dos grupos -N(R3na) (R3nb) e -N(R7na) (R7nb) é outro que não seja -NEt2.

Numa forma de realização, cada um dos grupos N(R3na) (R3nb) e -N(R7na) (R7nb) é outro que não seja -NEt2.

Por exemplo, numa forma de realização, os grupos -N (R3na) (R3nb) e -N (R7na) (R7nb) são iguais, e são selecionados a partir de: -NMe2, -N(nPr)2, -N(Bu)2, -NMeEt, -NMe (nPr) , e -N(CH2CH=CH2)2.

Os Grupos HX1 e HX2

Cada HX1 e HX2 é independentemente um ácido prótico.

Exemplos de ácidos próticos incluem, por exemplo, ácidos inorgânicos, tais como sais de hidrohaletos (por exemplo, HC1, HBr, Hl), ácido nítrico (HN03) , ácido sulfúrico (H2S04) , e ácidos orgânicos, tais como ácido carbónico (H2C03) e ácido acético (CH3COOH) .

Numa forma de realização, cada HX1 e HX2 é independentemente um ácido monoprótico.

Numa forma de realização, cada HX1 e HX2 é independentemente um ácido de hidrohaleto (isto é, um ácido hidrohálico).

Numa forma de realização, cada HX1 e HX2 é independentemente selecionado a partir de HC1, HBr, e Hl.

Numa forma de realização, HX1 e HX2 são iguais.

Numa forma de realização, HX1 e HX2 são diferentes.

Numa forma de realização, HX1 e HX2 são iguais, e são independentemente selecionados a partir de HC1, HBr, e Hl. Neste caso, o composto (um composto de diaminofenotiazina) pode convenientemente ser referido como um " sal de diaminofenotiazina bis (haleto de hidrogénio)".

Numa forma de realização, HX1 e HX2 são cada um HC1. Neste caso, o composto pode ser convenientemente referido como um "sal de diaminofenotiazina bis(cloreto de hidrogénio)".

Numa forma de realização, HX1 e HX2 são cada um HBr. Neste caso, o composto pode ser convenientemente referido como um "sal de diaminofenotiazina bis(brometo de hidrogénio)".

Numa forma de realização, HX1 e HX2 são cada um Hl. Neste caso, o composto pode ser convenientemente referido como um "sal de diaminofenotiazina bis(iodeto de hidrogénio) " .

Algumas Combinações Preferidas Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H, -Me, ou -Et; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2 ou -NEt2.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H, -Me, ou -Et; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2 ou -NEt2.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H, -Me, ou -Et; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2 ou -NEt2; e cada HX1 e HX2 é independentemente selecionado a partir de HC1, HBr, e Hl.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H, -Me, ou -Et; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2; e cada HX2e HX2 é independentemente selecionado a partir de HC1, HBr, e Hl. Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2 ou -NEt2; e cada HX1 e HX2 é independentemente selecionado a partir de HC1, HBr, e Hl.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2; e cada HX1 e HX2 é independentemente selecionado a partir de HC1, HBr, e Hl.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2; e cada HX1 e HX2 é HC1.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2; e cada HX2e HX2 é HBr.

Numa forma de realização: cada R1 e R9 é independentemente -H; e cada um dos grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7NA) (R7NB) é independentemente -NMe2; e cada HX1e HX2 é Hl.

Variação Isotópica

Numa forma de realização, um ou mais dos átomos de carbono do composto e C, C, ou C. Numa forma de realização, um ou mais dos átomos de carbono do composto é 41C.

Numa forma de realização, um ou mais dos átomos de carbono do composto é 13C.

Numa forma de realização, um ou mais dos átomos de carbono do composto é 14C.

Numa forma de realização, um ou mais dos átomos de azoto do composto é 15N.

Numa forma de realização, um ou mais ou todos os átomos de carbono de um ou mais ou todos dos grupos R3NA, R3NB, r™a, r7nb, r1 , R9, e R10 é 41C. (Ou 13C.) (Ou 14C.)

Numa forma de realização, um ou mais ou todos os átomos de carbono de um ou mais ou todos dos grupos R3NA, FT3™, r™a, e R7nb é 41C. (Ou 13C.) (Ou 14C.)

Numa forma de realização, os grupos -N (R3NA) (R3NB) e -N (R7na) (R7nb) são iguais, e são: -Ν(41ΟΗ3)2. (Ou -N(13CH3)2.) (Ou -N(14CH3)2.)

Numa forma de realização, o composto é selecionado a partir dos seguintes compostos, e sais, solvatos, e hidratos farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

Outros aspetos da invenção

Onde qualquer método de tratamento é divulgado no presente documento, também são divulgados:

Um composto de DAPTZ para utilização num método de tratamento de um distúrbio cognitivo ou do SNC num paciente, sofrendo de um distúrbio hematológico em que o dito distúrbio é um que é suscetível a tratamento através do dito composto de DAPTZ, cujo método compreende administrar por via oral ao dito paciente uma unidade de dosagem contendo o sito composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável como um ingrediente ativo,

Utilização de um composto de DAPTZ na preparação de uma unidade de dosagem de medicamento para utilização num método de tratamento de um distúrbio cognitivo ou do SNC num paciente, sofrendo de um distúrbio hematológico em que o dito distúrbio é um que é suscetível a tratamento através de um composto de DAPTZ, cujo método compreende administrar por via oral ao dito paciente uma unidade de dosagem contendo o dito composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável como ingrediente ativo,

Num aspeto a invenção proporciona uma unidade de fármaco para o tratamento de um distúrbio cognitivo ou do SNC num paciente, sofrendo de um distúrbio hematológico em que o dito distúrbio é um que é suscetível a tratamento através de um composto de DAPTZ, cuja unidade de dosagem contém o dito composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável como ingrediente ativo, numa dosagem descrita acima (por exemplo, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 mg), e tendo uma taxa de dissolução descrita acima (por exemplo <50% em 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, ou 5 horas) .

Ligandos É adicionalmente contemplada a utilização como um indicador de diagnóstico ou prognóstico por exemplo como um ligando para marcar agregados de proteínas no cérebro. As constatações no presente documento nas quais o efeito cognitivo (dependente da concentração no cérebro) frente ao efeito hematológico negativo (deduzido como sendo a partir da formação de dimeros) têm implicações também na utilização como um ligando.

Tais compostos de DAPTZ (ligandos) podem incorporar, ser conjugados a, ser quelados com, ou de outra forma ser associados a, outros grupos químicos, tais como isótopos detetáveis estáveis e instáveis, radioisótopos, átomos de emissão de positrões, marcadores de ressonância magnética, corantes, marcadores fluorescentes, grupos antigénicos, frações terapêuticas, ou qualquer outra fração que possa auxiliar num prognóstico, diagnóstico, ou aplicação terapêutica.

Por exemplo, numa forma de realização, o composto de DAPTZ é conforme definido no presente documento, mas com a limitação adicional de que o composto incorpora, é conjugado com, é quelado com, ou é de outra forma associado com, um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, etc.) marcadores detetáveis, por exemplo, isótopos, radioisótopos, átomos de emissão de positrões, marcadores de ressonância magnética, corantes, marcadores fluorescentes, grupos antigénicos, ou frações terapêuticas.

Numa forma de realização, o composto de DAPTZ é um ligando bem como um marcador, por exemplo, um marcador para proteínas tau (ou proteínas tau agregadas), e incorpora, é conjugado com, é quelado com, ou é de outra forma associado com, um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, etc.) marcadores detetáveis. Por exemplo, numa forma de realização, o composto de DAPTZ é conforme definido acima, mas com a limitação adicional de que o composto incorpora, é conjugado com, é quelado com, ou é de outra forma associado com, um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, etc.) marcadores detetáveis.

Compostos de DAPTZ marcados (por exemplo, quando ligados a proteína tau ou proteína tau agregada) podem ser visualizados ou detetados através de qualquer meio adequado, e o perito na especialidade apreciará que qualquer meio de deteção adequada conforme é conhecido na técnica pode ser utilizado.

Por exemplo, o composto de DAPTZ (ligando-marcador) pode ser adequadamente detetado incorporando um átomo de emissão de positrões (por exemplo, Τ10) (por exemplo, como um átomo de carbono de um ou mais substituintes de grupo alquilo, por exemplo, substituintes de grupo metilo) e detetando o composto utilizando tomografia de emissão de positrões (PET) conforme é conhecida na técnica.

Tais compostos de DAPTZ marcados com Τ10 podem ser preparados adaptando os métodos descritos no presente documento em formas conhecidas, por exemplo, em analogia aos métodos descritos no documento WO 02/075318 (veja-se Figuras 11a, 11b, 12) e o documento WO 2005/030676. É divulgado um método de mareagem de uma proteína de doença agregada associada com um distúrbio neurodegenerativo no cérebro de um paciente sofrendo de um distúrbio hematológico em que a dita proteína de doença agregada é uma que é suscetível a mareagem com um composto de DAPTZ, cujo método compreende administrar por via oral ao dito paciente uma unidade de dosagem contendo o dito composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável como um ingrediente ativo.

Proteínas de doença agregadas, compostos de DAPTZ, e doenças neurodegenerativas preferidos são discutidos noutro ponto do presente documento.

Os métodos podem compreender adicionalmente a etapa de determinar a presença e/ou quantidade do dito composto ligado à dita proteína agregada e de correlacionar o resultado da determinação com o estado da doença do sujeito.

Onde qualquer método de mareagem, diagnóstico ou prognóstico é divulgado no presente documento, também são divulgados:

Um composto de DAPTZ para utilização nesse método e utilização do composto de DAPTZ na preparação de um indicador de diagnóstico ou prognóstico para o dito método. Formas de realização, preferências, e individualizações correspondentes, descritas no presente documento aplicam-se mutatis mutandis a estes aspetos.

Ao longo desta memória descritiva, incluindo as reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro indicado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

Deve ser notado que, conforme utilizado na memória descritiva e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "uma/um" e "o/a" incluem os respetivos plurais a não ser que o contexto claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, referência a "um portador farmacêutico" inclui misturas de dois ou mais tais portadores, e semelhantes.

Os intervalos são normalmente expressos no presente documento como desde "cerca" de um valor particular, e/ou até "cerca" de outro valor particular. Quando um tal intervalo é expresso, outra forma de realização inclui a partir do valor particular e/ou até ao outro valor particular. De forma semelhante, quando os valores são expressos como aproximações, através da utilização do antecedente "cerca", será compreendido que o valor particular forma outra forma de realização.

Todas as combinações compatíveis das formas de realização descritas acima são explicitamente divulqadas no presente documento como se cada combinação fosse especificamente e individualmente recitada.

Quaisquer subtítulos no presente documento são incluídos somente por conveniência, e não devem ser entendidos como limitando a divulgação de qualquer forma. A invenção será agora adicionalmente descrita com referência às seguintes Figuras e Exemplos não limitantes. Outras formas de realização da invenção ocorrerão para aqueles peritos na especialidade na luz destas.

Figuras

Figura 1. Desenho dos estudos de ensaio clínico TRx-014-001 e 009 Os números correspondem aos pacientes em cada estádio do estudo. 323 pacientes entraram no estudo base, um sujeito foi randomizado mas não recebeu medicação. Os sujeitos foram tratados com MTC conforme indicado ou placebo. Após 24 semanas e 50 semanas, os sujeitos continuaram em 2 extensões (El e E2) do ensaio e posteriormente continuaram no ensaio TRx-014-009. Por motivos éticos, os pacientes recebendo placebo durante as primeiras 24 semanas receberam 100 mg bd em El. "tid" significa dosagem numa frequência de três vezes por dia, e "bd" significa dosagem numa frequência de duas vezes por dia.

Figura 2. Resposta ao tratamento em indivíduos com CDR moderado às 24 semanas. Para este diagrama, as convenções de etiquetagem de "plac" refere-se a placebo, "low" refere-se a dosagem baixa (100 mg) (veja-se nota de rodapé 1, Quadro 1) "30 mg" refere-se a dose de 30 mg tid e "60 mg" refere-se a dose de 60 mg tid.

Figura 3. Comparação dos efeitos de tratamento de rember™ conforme observado através de produção de imagens cerebrais funcionais utilizando SPECT. É observado fluxo sanguíneo cerebral regional diminuído (rCBF) como áreas em branco ao longo do cérebro. (1) A análise SPM mostra regiões onde a visita 4 teve rCBF significativamente menor que a visita 1 em pacientes tratados com placebo. Limiar de diferença p<0,005, p<0,05 corrigido para comparações múltiplas, significação tanto de voxel como de cluster. R= direita, L= esquerda, A= anterior, P= posterior. O par superior em cada painel representa as vistas anterior (esquerda) e posterior (direita) respetivamente. (2) A análise SPM não mostra regiões onde a visita 4 teve rCBF significativamente menor que a visita 1 em pacientes tratados com rember™ a 30 mg ou 60 mg tid. Limiar de diferença p<0,005, p<0,05 corrigido para comparações múltiplas, significação tanto de voxel como de cluster. (3) Localizações de diferença dependente de tratamento no declínio entre um ponto de referência e a visita 4 em sujeitos com CDR leve tratados com placebo frente àqueles com rember™ a 30/60 mg tid. Limiar de diferença p<0,005, p<0,05 corrigido para comparações múltiplas, significação tanto de voxel como de cluster.

Figura 4. Alteração de ITT/OC ADAS-cog desde um ponto de referência e curvas ajustadas. Para este diagrama, as convenções de etiquetagem de "placow" refere-se a sujeitos que foram originalmente randomizados a placebo e foram posteriormente mudados à dose de 100 mg bd após 24 semanas, "low" refere-se a dosagem baixa (100 mg) tid, "30 mg" refere-se a dose de 30 mg tid e "60 mg" refere-se a dose de 60 mg tid.

Figura 5. Dissolução de cápsulas em fluido intestinal simulado por dosagem: cápsulas de (A) 30 mg e (B) dissolvidas inicialmente e após 24 meses de armazenamento. A dissolução da cápsula de 100 mg foi mais lenta que a da cápsula de 30 mg e esta diferença aumentou com o tempo desde o fabrico.

Figura 6A. rember™ inibe o evento de nucleação e a agregação autocatalitica de tau.

Figura 6B. rember™ abre uma nova via de eliminação para agregados de tau.

Figura 7. Relação entre tempo de dissolução e efeitos cognitivos e hematológicos relativos. % Dissolução é α ajustada com base nos cálculos abaixo:

Um índice de atividade cognitiva (Cl) foi primeiramente determinado como o tamanho do efeito ADAS-cog normalizado às 50 semanas a cada dose nominal relativamente ao tamanho do efeito máximo observado às 50 semanas, utilizando as estimações de mínimos quadrados lineares de tamanho de efeito. Foi expresso um índice de atividade hematológica (Hl) correspondente como a alteração normalizada da contagem de glóbulos

vermelhos às 24 semanas a cada dose nominal relativamente ao tamanho do efeito máximo de glóbulos vermelhos observado. Os pontos temporais de 50 semanas para efeitos cognitivos e 24 semanas para efeitos hematológicos foram eleitos porque os efeitos correspondentes foram máximos nestes pontos. A atividade cognitiva relativa foi expressa na forma Cl/(CI+HI) e a atividade hematológica relativa foi expressa na forma Hl/(CI+HI), e ambas atividades relativas foram normalizadas aos seus máximos correspondentes através das doses. Foi utilizado um cálculo semelhante para expressar a percentagem relativa de MTC disponível em solução antes ou após 30 minutos relativamente ao total, com base nos dados de dissolução de cápsulas com 24 meses, quando as diferenças de dissolução entre potências de cápsulas foram máximas. As relações explicitamente calculadas podem ser expressas conforme segue:

onde α é um parâmetro de escala para relacionar unidades Cl com unidades Hl (constatado como sendo 0,645 através de estimativa de mínimos quadrados), D30 é a percentagem de MTC total disponível a partir de cápsulas com 24 meses aos 30 minutos, e Dtotai é a dose nominal total que é eventualmente dissolvida.

Figura 8. Relação dose-resposta implicada às 50 semanas. Tamanhos dos efeitos calculados utilizando estimações de mínimos quadrados lineares às 50 semanas. A dose terapêutica eficaz disponível a partir da cápsula de 100 mg foi equivalente a uma dose de aproximadamente 25 mg, indicando que as cápsulas não permitiram administração e absorção adequadas da dose nominal numa forma terapêuticamente ativa.

Figura 9. Diferença em parâmetros fundamentais de glóbulos vermelhos em ratinhos entre entre MTC e L_MTx administrados por via oral durante 14 dias nas doses diárias indicadas. As diferenças são os termos de alteração mostrados observados com L-MTx com respeito a MTC. Por exemplo, numa dose de L_MTx a 150 mg/kg, a contagem de glóbulos vermelhos é aumentada por >1 x 106/μ1 e a concentração média celular de hemoglobina é aumentada por 3 pg/dl. A análise estatística dos dados é mostrada no Quadro 4. Abreviaturas e unidades: RBC: contagem de glóbulos vermelhos, 106/pL; HB: hemoglobina, g/dl; MCV: volume celular médio, fl; MCHC: concentração de hemoglobina celular média, g/dl; RETI: contagem de reticulócitos, % de glóbulos vermelhos.

Figura 10. Taxas de excreção urinária média para MTC oxidado (Οχ-MT) a partir de 7 sujeitos humanos adultos após 10 mg de dose oral (média, SE) . (De DiSanto e Wagner, 1972b).

Figura 11. Taxas de excreção urinária média para leuco-MT (L-MT) a partir de 7 sujeitos humanos adultos após 10 mg de dose oral (média, SE). (De DiSanto e Wagner, 1972b). Figura 12. Taxa de excreção urinária para Ox-MTC após uma dose oral de 10 mg.

Figura 13. Taxa de excreção urinária para L-MT após uma dose oral de 10 mg.

Figura 14. Concentração de Οχ-MT em sangue inteiro após administração intravenosa de 100 mg de MTC (de Peter et al., 2000) .

Figura 15. Concentração de Οχ-MT em sangue inteiro após administração oral de 100 mg de MTC com (círculos abertos) ou sem (círculos preenchidos) 800 mg de Mesna (média, SE) (de Peter et al., 2000) .

Figura 16. Estimativa de biodisponibilidade aparente com base na excreção de MT total (isto é, Ox-MT + L-MT) a T-infinito após dosagem oral, onde a curva foi ajustada através da equação empírica:

Recuperação urinária = 86s9 - (86,9 x Dose) / (69, 7 + Dose;

Note-se o valor menor que o esperado (marcado "P") para o resultado de dose de 100 mg relatado por Peter et al. (corrigido para a excreção esperada às 48 horas).

Figura 17. Taxa de excreção urinária de MTC total (pmol/h) durante os intervalos de tempo indicados após administração i.v. (barras pretas) e oral (barras cinzentas) de MTC. Média, SE, n = 7 (de Peter et al., 2000) .

Figura 18. Primeiro estádio do modelo: ajuste dos dados de concentração após dose intravenosa de 100 mg de MTC e dados de excreção urinária escalonados após dose oral única de 10 mg de MTC.

Figura 19. Ajuste entre dados de concentração sanguínea observados após dosagem intravenosa de Peter et al. (Quadro 7) e previsão do modelo ilustrado na Figura 18. Figura 20. Ajuste entre excreção urinária de Ox-MT observada escalonada após uma dose oral única de 10 mg de MTC de DiSanto e Wagner (Quadro 5) e previsão do modelo (mostrado na Figura 18) após dose intravenosa única de MTC (100 mg).

Figura 21. Ajuste entre excreção urinária de L-MT observada escalonada após dose oral única de 10 mg de MTC de DiSanto e Wagner (Quadro 5) e previsão do modelo (mostrado na Figura 18) após dose intravenosa única de MTC (100 mg).

Figura 22. Segundo estádio do modelo: ajuste dos dados de concentração após dose oral de 100 mg de MTC e dados de excreção urinária escalonados após dose oral única de 10 mg de MTC.

Figura 23. Ajuste entre dados de concentração sanguínea observados após dosagem oral de Peter et al. (Quadro 7) e previsão do modelo ilustrado na Figura 22.

Figura 24. Ajuste entre excreção urinária de Ox-MT observada escalonada após dose oral única de 10 mg de MTC de DiSanto e Wagner (Quadro 5) e previsão do modelo (mostrado na Figura 22) após dose oral única de MTC (100 mg) .

Figura 25. Ajuste entre excreção urinária de L-MT observada escalonada após dose oral única de 10 mg de MTC de DiSanto e Wagner (Quadro 5) e previsão do modelo (mostrado na Figura 22) após dose oral única de MTC (100 mg) .

Figura 26. Comparação das taxas de excreção urinária média de MT total conforme relatado por Peter et al. e aquelas previstas através do modelo oral mostrado na Figura 22 para os mesmos intervalos. É mostrada a comparação da excreção total ao longo de 24h.

Figura 27. Reproduz a Figura 16, mas inclui a previsão do modelo ("M") para a excreção de MTC. 0 valor do modelo aproxima-se mais àquele previsto a partir de outros estudos que o estimado relatado por Peter et ai. ("P"). Figura 28. Os resultados do modelo oral para C2 (sangue), C4 e C3 são mostrados reescalados para os seus máximos correspondentes. Estes são comparados com um modelo triexponencial aplicado ao nível medido de MT em cérebro de porco após uma dose oral única.

Figura 29. Relação entre a eficácia clínica observada de rember™ e nível de estado constante médio previsto de MT em C3 para o regime de dosagem de 3/dia. São também mostrados os níveis de estado constante previstos de MT em C3 para os regimes de dosagem de 2/dia e 1/dia.

Figura 30. Relação entre a eficácia clinica observada de rember™ e nível de estado constante médio previsto de MT em C2 para o regime de dosagem de 3/dia. São também mostrados os níveis de estado constante previstos de MT em C2 para os regimes de dosagem de 2/dia e 1/dia.

Figura 31A. Diferença entre o tamanho do efeito observado e o tamanho do efeito previsto como uma função de percentagem de dissolução de cápsula aos 30 minutos. A dissolução de cápsula é determinada através da quantidade de MTC libertada na fase aquosa em condições de dissolução da US/EU Pharmacopoeia.

Figura 31B. Relação entre o nível de estado constante de MT no compartimento central (C2, isto é, sangue) e a perda observada de glóbulos vermelhos a 24 expressa (expressa como uma alteração fracionai em relação ao intervalo normal).

Figura 32. Relação entre dose real ("dose") e dose eficaz ("eff dose") com base nos dados de excreção urinária. Figura 33. Comparação da fração prevista absorvida para MTC e L-MTx assumindo que a administração da forma L-MTx elimina a não absorção desde o estômago (isto é, Cl na Figura 22).

Figura 34. Relação entre a eficácia clinica esperada de uma forma à base de L-MTx da fração de metiltioninio e o nível de estado constante médio previsto de MT em C3 para uma gama de regimes de dosagem desde 1/dia até 3/dia. Figura 35. Relação entre a eficácia clínica esperada de uma forma à base de L-MTx da fração de metiltioninio e o nível de estado constante médio previsto de MT em C2 (sangue) para uma gama de regimes de dosagem desde 1/dia até 3/dia.

Figura 36. Resposta à dose observada para o efeito de MTC na formulação da cápsula utilizada no ensaio TRx-014-001 na perda de glóbulos vermelhos e para a relação de resposta à dose e esperada de MTC para uma forma à base de L-MTX de um produto medicinal de metiltioninio administrado nas doses indicadas com uma frequência de 3/dia.

Figura 37. Vários modelos quantitativos para a progressão e tratamento da Doença de Alzheimer conforme descrito no Exemplo 12.

Figura 38. Relação entre a eficácia clínica esperada e uma preparação à base de L-MTx para uma formulação de libertação lenta de 1/dia.

Figura 39. 0 efeito diferencial de inibidores de diferentes sítios da via de agregação de tau. 0 esquema da esquerda mostra o sitio de inibição da entrada de tau na via de agregação de tau (entrada) e o sítio de eliminação potenciada dos agregados de tau a partir dessa via. 0 efeito das alterações em ambos estes sítios nos níveis de PHF nos neurónios é mostrado no painel da direita. A inibição da entrada diminui o nível de PHFs inicialmente, antes que a taxa de formação continue ao mesmo nível que anteriormente. A eliminação potenciada de tau, no entanto, resulta numa diminuição constante do nível de tau agregada.

Figura 40. Aglomeração de tau e a sua eliminação na doença de Alzheimer. Os oligómeros de tau podem ou reunir-se em PHFs filamentosos e/ou entrar na via de eliminação endossómica-lisossómica.

Exemplos

Exemplo 1 - Ensaio Clínico TRx-014-001 de Fase 2 Sumário

Foi levado a cabo um estudo de constatação de intervalo de dose exploratório de Fase 2 de 50 semanas para o ratamento de demência leve e moderada de tipo Alzheimer utilizando um produto medicinal de investigação (IMP) do qual MTC foi o ingrediente farmacêutico atico (API). O estudo foi um estudo randomizado, duplo cego, controlado por placebo cujo objetivo primário foi investigar os efeitos de MTC em três doses (30, 60 e lOOmg, cada uma três vezes por dia) em comparação com placebo na atividade cognitiva (conforme medido através da escala ADAS-cog: Escala de Avaliação da Doença de Alzheimer - subescala cognitiva). Houve 322 sujeitos randomizados, dos quais 245 (74%) completaram as primeiras 24 semanas de tratamento. Destes, 227 (93%) optaram por continuar o tratamento durante 6 meses adicionais, dos quais 177 (78%) completaram 50 semanas de tratamento no dia 2 de julho de 2007. As análises finais compreendem análises da população ITT/OC (intenção de tratamento/caso observado - Intention to Treat/Observed Case) de 245 sujeitos que completaram 24 semanas de tratamento, e 177 sujeitos que completaram 50 semanas de tratamento no dia 2 de julho de 2007. O desenho do estudo é resumido na Figura 1. Por motivos de questões éticas, os sujeitos que foram originalmente randomizados a placebo durante a fase dos primeiros 6 meses foram mudados à dose de 100 mg durante a segunda fase de extensão de 6 meses do estudo ("Ei").

Análises de 24 Semanas O resultado pré-especifiçado primário foi uma análise ITT/OC de alteração de ADAS-cog desde um ponto de referência às 24 semanas utilizando uma análise de abordagem de covariância que incluiu uma avaliação da interação entre o efeito no tratamento com rember™ e a gravidade desde um ponto de referência conforme definido através de CDR (escala de classificação de demência clínica - Clinical Dementia Rating Scale). Esta análise demonstrou um efeito positivo em rember™ a 60 mg tid que alcançou significação estatística em ambas as populações ITT/OC e ITT/LOFC (intenção de tratar/última observação levada a cabo - Intention to Treat/Last Observation Carried Forward) . A gravidade de CDR num ponto de referência foi constatada como sendo um cofator altamente significativo, e quando incluída no modelo mostrou que o efeito de rember™ foi significativo às 24 semanas somente em sujeitos com CDR moderada num ponto de referência. A falta de declínio em sujeitos com CDR moderada em placebo preveniu a análise de eficácia neste grupo durante as primeiras 24 semanas. No entanto a eficácia de rember™ foi confirmada neste grupo através de análise por exame cerebral funcional às 24 semanas, e através de ADAS-cog às 50 semanas.

Quadro 1. Tamanho do efeito de ADAS-cog às 24 weeks em sujeitos com CDR moderada (em unidades ADAS-cog)

Na análise do subgrupo da população ITT/OC com CDR moderada num ponto de referência (Figura 2), o tamanho do efeito de rember™ na dose de 60 mg tid foi de -5,4 unidades ADAS-cog e 3,4 unidades MMSE (Mini-Avaliação do Estado Mental) (dados de MMSE não mostrados). Enquanto os sujeitos tratados com placebo pioraram em 5,1 unidades ADAS-cog, não houve evidência de declínio em sujeitos tratados com rember™ a 30 mg ou 60 mg tid ao longo de 24 semanas. As variáveis de resultados não cognitivos (medição da perturbação psiquiátrica e das atividades de habilidades da vida diária) também confirmaram as propriedades de estabilização de doença e o tamanho de eficácia de rember™ no grupo moderado. Os sujeitos recebendo rember™ na dose de 60 mg tid, mostraram um tamanho do efeito de 1,4-1,9 unidades na escala CGIC (Impressão de Alteração Global Clínica) às 24 semanas com respeito ao placebo, registado por assessores clínicos sem conhecimento dos restantes resultados das medidas. A relação de probabilidade de não declínio de CGIC para sujeitos tomando rember™ na dose de 60 mg foi 9 vezes melhor que a do placebo. O parâmetro CDR-sum-of-boxes, outra medida clínica global, mostrou benefício de -1,7 unidades. Finalmente, rember ™ na dose de 60 mg mostrou benefício significativo na medida de ADFACS (Escala de Avaliação Funcional da Doença de Alzheimer) de atividades da vida diária, com um tamanho do efeito de 3,1 a 6,1 unidades ao longo de 24 semanas. Em todas as análises psicométricas às 24 semanas, a cápsula de 100 mg mostrou eficácia mínima, consistente com um defeito de formulação das cápsulas a esta concentração de dosagem discutidas mais abaixo). A dose de 100 mg é referida como a "dose baixa (100 mg)" para indicar que na sua presente formulação, a eficácia terapêutica da cápsula de 100 mg não correspondeu à dose nominal. Isto é discutido em mais detalhe nos Exemplos abaixo.

Análise por Exame Cerebral Funcional A prevenção do declínio ao longo de 14 semanas foi independentemente confirmada através de análise de alterações em exame cerebral funcional em 135 sujeitos que foram submetidos a dois exames SPECT com um intervalo médio de 6 meses (Figura 3). Enquanto sujeitos recebendo placebo mostraram o padrão esperado de deterioração nas regiões frontal e temporo-parietal do cérebro, sujeitos recebendo rember™ a 30 mg ou 60 mg não mostraram qualquer evidência de deterioração em qualquer região cerebral. Quando o subgrupo com CDR leve num ponto de referência foi examinado por separado, houve também evidência de declínio proeminente al longo de 6 meses em sujeitos recebendo placebo, ascendendo a perda de 8% do volume neuronal funcional. O efeito do tratamento observado na população total foi também observado no subgrupo com CDR leve, demonstrando a eficácia de rember™ em AD com CDR leve. O fato de haver evidência objetiva de deterioração funcional progressiva no subgrupo leve sem evidência correspondente de declínio em qualquer das escalas psicométricas ao longo de 6 meses confirma a forte influência de confundimento da reserva cognitiva na AD leve. Em geral, apesar deste efeito, os défices funcionais de referência mostrados através de exame SPECT foram altamente correlacionados com a pontuação ADAS-cog de referência, e o benefício do tratamento com rember™ mostrado na escala ADAS-cog foi de forma semelhante correlacionado com o beneficio cerebral demonstrado através de exame SPECT. A ação de rember™ observada através de exame cerebral funcional sugere vivamente que a capacidade de rember™ de reverter a patologia de agregação de tau, que se sabe que ocorre nas mesmas região cerebrais que aquelas mostrando defeitos em exames cerebrais funcionais, é responsável pela sua capacidade de prevenir o declínio da função cerebral cortical nas mesas regiões. Dada a maior sensibilidade de SPECT na deteção tanto do declínio como dos efeitos do tratamento, e a sua capacidade de prever a resposta ao tratamento (veja-se análise de 50 semana abaixo), é concluído que SPECT poderia ser utilizado como substituto ou marcador alternativo para futuros ensaios clínicos visando demonstrar modificação na doença.

Análises de 50 Semanas O estudo de 50 semanas prolongou e confirmou as constatações do estudo de 24 semanas, e demonstrou benefícios significativos em sujeitos com CDR tanto leve como moderada nas populações ITT/OC e ITT/LOFC globais (Figura 4; Quadros 2 e 3) . Sujeitos originalmente randomizados a placebo foram mudados à dose baixa (100 mg) bd após 24 semanas. Isto é referido como o "ramo de tratamento placebo-low". Devido à eficácia mínima da dose low (100 mg) em qualquer das escalas psicométricas ao longo das primeiras 24 semanas de tratamento, o ramo de tratamento placebo-low serviu convenientemente como o ramo de comparação de Dose Mínima Exposta para o estudo de 50 semanas. O declínio médio observado ao longo do estudo de 50 semanas em sujeitos tratados com placebo foi de 7,8 unidades ADAS-cog (Figura 4) . Para sujeitos tratados com rember™ a uma dose de 60 mg tid, o declínio observado ao longo de 50 semanas não foi significativamente diferente de zero nem na escala ADAS-cog nem na escala MMSE para os sujeitos. Na escala ADAS-cog, cerca de 60% dos sujeitos melhoraram ou permaneceram iguais às 50 semanas. Na escala MMSE, 62% melhoraram ou permaneceram iguais às 50 semanas. A probabilidade de que um paciente não piore em nenhuma escala foi de cerca de 3,4 vezes melhor na dose de 60 mg que em placebo-low. Os tamanhos dos efeitos correspondentes foram de -6,8 unidades ADAS-cog e 3,2 unidades MMSE durante o ensaio de 50 semanas. Adicionalmente ao efeito na progressão da doença, houve uma melhoria sintomática inical às 15 semanas de 1,6 unidades de ADAS-cog e 0,8 unidades MMSE na dose de 60 mg, comparável com aquela observada com inibidores de AchE.

Quadro 2. Tamanhos dos efeitos inferidos a partir de análises de efeitos mistos às 50 semanas (em unidades ADAS-cog]_

Dose Estimativa IC 95% Valor-p(1) low(lOOmg)__-4, 04__-7,21, -0, 87 0,0124 _3 0mg__-3, 87__-6, 90, -0, 84 0,0126 _6 0mg__-6,78_ -9,74, -3, 82 <0, 0001 1. O valor-p é desde um teste de se o valor é significativamente diferente do placebo.

Quadro 3. Tamanhos dos efeitos inferidos a partir de análises de mínimos quadrados às 50 semanas (em unidades ADAS-cog)

Dose Estimativa Cl a 95%, Valor-p(1) low (10 Omg)__-3,59__-5, 81, -1,37 0,0015 _3 Omg__-4,37__-6, 83, -1, 92 0,0005 _6 Omg__-6,50_ -8,89, -4,14 <0, 0001 1. O valor-p é desde um teste de se o valor é significativamente diferente do placebo. Não houve deterioração nas escalas não cognitivas em sujeitos com CDR leve no ramo de placebo-low durante 50 semanas. Os resultados não cognitivos às 50 semanas em sujeitos com CDR moderada confirmaram as constatações das análises de 24 semanas. O NPI (Inventário Neuropsiquátrico) demonstrou benefícios para tratamento com rember™ durante 50 semanas. Enquanto sujeitos no ramo de placebo-low pioraram por 9, 6 unidades na escala de perturbação de pacientes e 4,9 unidads na escala de desgaste de cuidadores, não foi observado tal declínio em sujeitos tratados continuamente com rember™ durante 50 semanas, com melhores tamanhos dos efeitos correspondentes de -9,2 unidades e -4,6 unidades. O ramo placebo-Iow em comparação com o ramo low (100 mg) proporcionou uma aproximação estreita a um desenho de início retardado para confirmar que rember™ é modificador de doença num sentido regulador formal. Sujeitos que iniciaram posteriormente uma dose de eficácia terapêutica aparente mínima conforme considerado através de ADAS-cog durante as 24 semanas iniciais permaneceram significativamente diferentes às 50 semanas em relação a sujeitos que tinham recebido a dose low (100 mg) continuamente. Adicionalmente sujeitos tratados cont inuamente com a dose low (100 mg) mostraram atraso na taxa de progressão da doença. Embora houvesse diferença no regime de dosagem da cápsula entre os dois ramos (tid frente a bd) , os efeitos secundários hematológicos, que mostraram um claro perfil de resposta à dose, não foram distinguíveis com respeito aos dois regimes de dose, sustentando a equivalência aproximada de exposição biológica, e como tal sustentando a inferência de que rember™ é modificador de doença. Isto é também confirmado pela capacidade de rember™ de deter a progressão da doença durante 50 semanas na dose de 60 mg, e de reduzir a taxa de progressão da doença nas doses de 30 mg e low (100 mg) às 50 semanas.

Resumo da Segurança Clínica de rember™ O perfil de efeito adverso global foi substancialmente melhor no ensaio com rember™ que para inibidores de AChE (Acetilcolina Esterase) em dose de tratamento ótima relatada em Cochrane Review (Birks, 2006). Não houve diferenças significativas nas probabilidades de que sujeitos tomando rember™ a 30 mg ou 60 mg desistissem, experimentassem efeitos adversos ou desistissem devido a um efeito adverso, em comparação com os inibidores de AChE. A diarreia foi o evento adverso mais frequente relatado por parte de sujeitos tratados com rember™, particularmente a dose low (100 mg), mais provavelmente devido ao trânsito de rember™ não absorvido para o intestino distai, causando repopulação da flora intestinal devido a uma atividade antibiótica leve de MTC que foi bem documentada na literatura (Kristiansen e Amaral, 1997; Gunics et al., 2000) . Embora os sujeitos recebendo rember™ tenham maiores probabilidades de desenvolver diarreia que o relatado para os inibidores de AChE, os sujeitos tomando rember™ relataram significativamente menos náuseas, vómitos, anorexia e dor abdominal, dor de cabeça, fadiga e agitação. A experiência por parte de alguns dos centros de tratamento indicou que a diarreia pode ser gerida com preparações probióticas adequadas (por exemplo preparações de Lactobacillus seco). Não foram observadas alterações de significação clinica em nenhum dos parâmetros químicos clínicos de rotina. Foram observadas pequenas reduções nas contagens de glóbulos vermelhos, hemoglobina, meta-hemoglobina e contagens de glóbulos brancos em sujeitos tratados com rember™, e estas alterações foram relacionadas com a dose. As alterações foram negligenciáveis para a dose de 30 mg tid, mas tornaram-se estatisticamente significativas para as doses de 60 mg e low (100 mg) tid. No caso de parâmetros de glóbulos vermelhos, apareceram às 24 semanas, mas foram resolvidos às 50 semanas, exceto a evidência de que a dose de 60 mg tid aumentou os níveis de meta-hemoglobina às 24 semanas e estabilizou posteriormente. A esta dose, o nível médio de meta-hemoglobina aumentou desde o valor médio normal de 0,4% a 0,8% de hemoglobina, mas ainda assim por debaixo do limite superior da normalidade (1%). No caso dos glóbulos brancos, uma vez mais as alterações foram negligenciáveis para a dose de 30 mg tid, mas para a dose de 60 mg os valores diminuíram e estabilizaram posteriormente a níveis não significativamente diferentes dos da dose de 30 mg durante 50 semanas. É concluído que a oxidação da hemoglobina por parte de uma forma oxidada da fração de metiltionínio é o mecanismo mais provável responsável pelas alterações nos parâmetros de glóbulos vermelhos.

Dentro do período do estudo, nenhuma destas alterações foi clinicamente significativa, e todas permaneceram dentro do intervalo normal. Portanto, é concluído que as alterações não causam preocupação suficiente em termos de relação risco/benefício para impactar o desenvolvimento clínico adicional das concentrações de dosagem de 30 mg e 60 mg. A presente formulação da dose low (100 mg) não é adequada para desenvolvimento clínico adicional devido a um perfil de eficácia/efeitos secundários mais pobre discutido abaixo.

Exemplo 2 - Formulação e concentração do Produto Medicinal de Investigação (IMP) A formulação de renter™ utilizada em TRx-014-001 consistiu em cápsulas de gelatina azul/azul de Tamanho 1 contendo um preenchimento semi-sólido composto por MTC, Gelucire 44/14 e Aerosil 200. Foram fabricadas três concentrações de cápsula, diferindo somente na massa do preenchimento, com concentrações alvo de 30, 60 e 100 mg de MTC, respetivamente. Foi proporcionado um placebo correspondente contendo somente Gelucire 44/14. As cápsulas de gelatina duras e a gelatina utilizada para a união das cápsulas cumpriu com as orientações atuais com respeito a Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis. A uniformidade das cápsulas foi testada através de Ensaio de Uniformidade de Massa de Preenchimento e Aparência (modificado a partir de USP 27), Pureza cromatográfica (TLC conforme especificado por USP 27) e Dissolução utilizando o método de pás rotativas de European

Pharmacopoeia e US Pharmacopoeia. Foram produzidos seis lotes de fabrico de cápsulas, e foram testados para uniformidade e estabilidade.

Através destes estudos de dissolução, foi constatado que a dissolução da cápsula de 100 mg em todas as condições in vitro foi mais lenta que a da cápsula de 30 mg e que esta diferença aumentou ao longo do tempo desde o fabrico (Figura 5). A cápsula de 60 mg teve um perfil de dissolução intermédio em relação aos dados de 30 mg e 100 mg mostrados na Figura 5. Estudos adicionais mostraram que a reticulação acelerada das cápsulas de gelatina em presença de MTC a massas de preenchimento elevadas (isto é, particularmente cápsulas de 100 mg) diminuiu a probabilidade de rutura inicial da cápsula, embora a dissolução subsequente da cápsula rota foi rápida. O MTC libertado a partir da cápsula foi constatado como retendo o nível esperado de bioatividade no ensaio de agregação de tau in vitro (WO96/030766). É provável que este atraso na dissolução da cápsula de 100 mg tenha desviado o sítio primário de absorção desde o estômago até ao intestino delgado, levando tanto a absorção reduzida (levando a diarreia) como a absorção da maioria da dose biodisponível como uma espécie dimérica terapeuticamente inativa. A relação de resposta à dose implicada discutida mais abaixo indica que na presente formulação, a dose cognitivamente ativa equivalente disponível a partir da cápsula de 100 mg foi de ~25 mg, quando comparada com as atividades cognitivas das doses de 30 mg e 60 mg. A presente formulação limita o grau ao qual podem ser clinicamente exploradas doses mais elevadas de rember™ em futuros estudos clínicos. Conforme discutido mais abaixo, não existe base teórica para um patamar de eficácia na dose de 60 mg. É concluído que o patamar aparente a 60 mg tid reflete um conjunto de limitações na solubilidade, dissolução e absorção de rember™ a doses mais elevadas. Exemplo 3 - Modelo matemático de eficácia

Um modelo matemático cinético foi desenvolvido para tentar obter uma melhor compreensão do processo de agregação de tau e da sua relação quantitativa com a deterioração cognitiva. A estrutura do modelo é ilustrada abaixo na Figura 6, mostrando as constantes de velocidade relevantes.

Uma ampla gama de entradas de dados experimentais foram utilizadas para derivar estimações das constantes de velocidade fundamentais no modelo acima. Estas incluem inter alia: estudos quantitativos clínico-patológicos ligando a agregação de tau e a pontuação MMSE no ser humano, estimativa da taxa de progressão de estádios de Braak ao longo do tempo (Braak and Braak, 1991), relação de resposta à dose em modelos celulares e no ensaio de ligação de tau in vitro, relação de resposta à dose na redução da patologia de tau em animais transgénicos, e um modelo farmacocinético ligando a dose aos níveis cerebrais disponíveis estimados de rember™ em animais e no ser humanos discutidos mais abaixo.

Os dados de ensaio clínico foram utilizados para validar este modelo de eficácia que pode por sua vez explicar as relações entre agregação de tau, demência clínica e o perfil de eficácia clínica de rember™. Especificamente, não são formalmente requeridas assunções adicionais implicando a acumulação de proteína β-amilóide ou outros fatores de neurotransmissor desconhecidos. É surpreendente, dada a complexidade da patofisiologia de AD geralmente assumida no campo, que um conjunto de assunções e constantes de velocidade extremamente parcimonioso possa proporcionar a base completa para um conjunto de relações definíveis formalmente ligando a taxa de progressão da demência clínica, as dinâmicas da cascata de agregação de tau ilustradas acima e a eficácia da intervenção terapêutica de inibidores da agregação de tau.

Existem inferência importantes a ser tiradas do modelo para explicar o mecanismo de ação de rember ™. Enquanto parece a priori, e é geralmente assumido no campo, que a inibição da taxa de agregação de tau através da redução da taxa de k3 (isto é, inibição no lado de entrada) , seria importante para explicar a eficácia, isto não é corroborado por parte do modelo matemático. 0 modelo pode ser utilizado para mostrar que o impacto de um fármaco teórico que atua somente no lado de influxo da cascata de agregação (por exemplo estratégias para reduzir a alimentação a montante de produtos no estádio de tau agregada) produziria somente uma redução transiente por etapas da agregação de tau que seria compensada ao longo do tempo através de agregação continuada. Em outras palavras, o impacto teórico de um tal fármaco seria somente sintomático e não alteraria a taxa de progressão da doença, apesar de o mecanismo aparentar ser potencialmente modificador de doença devido a visar patologias primárias. 0 modelo mostra que ainda haveria acumulação progressiva de agregados de tau ao longo do tempo, e à mesma taxa que sem o fármaco. Isto deve-se primariamente a que a via de eliminação para os agregados de tau permanece ineficaz num sujeito com AD e deteriora-se ao longo do tempo a uma taxa que pode ser medida através da taxa de progressão do estádio de Braak ao longo do tempo. No caso de estratégias anti-tau potenciais, isto aplica-se particularmente a abordagens que podem ter base na inibição da fosforilação de tau, ainda que a fosforilação de tau fosse assumida como sendo critica de velocidade para a agregação de tau, que foi contestado por parte dos inventores (por exemplo Wischik et ai., 1997) . Isto aplica-se adicionalmente a argumentos baseados na taxa à qual a proteína β-amilóide pode, de algum modo ainda desconhecido, disparar a agregação de tau, conforme afirmado por versões atuais recentes da teoria Αβ da patogénese de AD (por exemplo Selkoe, 2004) . A ação terapêutica mais importante de rember™ reside na sua capacidade de potenciar a eliminação de agregados de tau através da dissolução dos agregados e da libertação de tau previamente agregada na forma de um monómero que pode ser processado através de uma via de eliminação muito mais eficaz, isto é, a via protossómica. Em termos do modelo, a ação fundamental de rember™ é a potenciação ou abertura da constante de velocidade k4b na Figura 6B. De facto, isto abre uma nova via de eliminação, previamente indisponível para os agregados de tau. Esta nova via de eliminação, a via de eliminação protossómica, é ilustrada através da constante de velocidade k4b na Figura 6B. O poderoso efeito da eliminação potenciada no modelo cinético é devido ao efeito autocatalítico dos agregados, em que a taxa de agregação é diretamente proporcional à concentração de agregado. Este é o mecanismo primário responsável pela alteração a longo prazo prevista na taxa de progressão da doença, que foi corroborada no ensaio clinico TRx-014-001. O modelo abre a possibilidade de que rember™, se administrado muito antes na progressão da doença (isto é, em ou inclusive antes de MCI clínico), poderia também modificar a deterioração estrutural da via de eliminação neuronal e proporcionar uma razão adicional para rember™ como uma terapêutica preventiva primária.

Uma característica adicional do modelo cinético é que preveria um efeito sintomático precoce devido à dissolução inicial da carga de agregado de tau existente. Este disparo inicial de eliminação de agregados existentes é previsto por parte do modelo como contribuindo a uma melhora sintomática precoce. Isto foi também corroborado no ensaio clínico de Fase 2 de rember™. A posterior ação de modificação da doença de rember™ depende do grau ao qual a taxa contínua de produção de oligómeros de tau, e a degradação contínua das vias de eliminação ELM/proteossómicas ao longo do tempo (que é o determinante último da taxa inerente de progressão através dos estádios de Braak ao longo do tempo), podem ser neutralizadas através de eliminação potenciada devido à solvatação/solubilização dos oligómeros de tau. Já que estes fatores são diretamente proporcionais à concentração de agregado, pequenas alterações do perfil farmacocinético do fármaco podem ter um grande impacto na taxa de progressão da doença. Estas características do modelo foram novamente corroboradas pelo ensaio clínico de Fase 2, e enfatizam a necessidade de maximizar a biodisponibilidade da espécie terapeuticamente ativa que é absorvida. Em particular, não existe mecanismo inerente dentro do modelo na sua presente forma que previsse um patamar de resposta à dose.

Exemplo 4 - Relação entre Atividade Cognitiva e Hematológica

Houve defeitos na formulação da cápsula de 100 mg, resumidos acima levando ao aumento do atraso da dissolução ao longo do tempo desde o fabrico. Estudos adicionais in vitro mostraram que isto é mais provavelmente devido à reticulação acelerada das cápsulas de gelatina em presença de MTC a elevadas massas de preenchimento (isto é, cápsulas de 100 mg).

Estudos in vitro publicados sugeriram que a absorção de MTC é um processo complexo que depende em parte da atividade de uma tiazina redutase corante de superfície celular intrínseca (Merker et ai., 1998; Merker et ai., 2002; May et ai., 2004). Foi desenvolvido um modelo f armacocinét ico "PK" (discutido mais abaixo) com base em estudos em seres humanos publicados (DiSanto e Wagner, 1972a,b,c; Peter et ai., 2000) que sugere que a semivida de desaparição de MTC do compartimento primário de absorção é de 30 minutos, consistente com o estômago sendo o sítio primário de absorção para MTC ingerido por via oral. MTC encontra-se altamente ionizado quando está na forma oxidada a pH 7 num ambiente não redutor. Como tal, tem pobre solubilidade em lípidos. Contudo, a redução à forma reduzida ("L-MT") através da adição de dois eletrões leva a uma espécie sem carga que é prontamente absorvida. Estudos in vitro sugerem que esta etapa de redução só pode ocorrer fisiologicamente a pH baixo. Esta propriedade explicaria o motivo de o estômago ser o sítio primário de absorção mais provável. Estudos de PK em roedores, porcos e primatas, indicam que a forma predominante da fração de metiltionínio encontrada em tecidos é a forma L-MT incolora, e que após administração oral, somente uma pequena proporção contribui à forma oxidada que pode ser prontamente medida em sangue. É como tal provável que somente a forma L-MT possa atravessar a barreira hematoencefálica, onde um novo estado constante é estabelecido entre as fornas oxidada e reduzida dentro dos neurónios. Após administração intravenosa, podem ser detetados níveis substancialmente mais elevados da forma oxidada em sangue que após administração oral da mesma dose (Peter et al., 2000) . Estudos de PK adicionais em porcos mostraram que isto é devido a uma diferença no nível da forma L-MT circulante após administração oral, e não, conforme sugerido por Peter et al., devido à pobre biodisponibilidade através da via oral. Isto sugere que MTC é submetido a redução durante a absorção oral e subsequente distribuição tecidual.

Em circunstâncias onde a dissolução foi retardada, tal como para a cápsula de 100 mg utilizada no ensaio de rember™, é provável que somente tenha ocorrido absorção limitada da dose nominal através do mecanismo de redutase que foi descrito. Isto levaria a absorção retardada a partir do intestino delgado a pH mais elevado. Na base dos estudos in vitro é deduzido que estas circunstâncias favoreceriam a formação de um dímero de monómeros de MTC oxidado que é bem descrito na literatura (Rabinowitch and Epstein, 1941; Lewis et al., 1943; Spencer e Sutter, 1979). Devido a empilhamento antiparalelo, o dimero não tem carga liquida. Portanto, seria esperado que a dissolução retardada levasse a absorção retardada de MTC em estado oxidado ao pH mais elevado do intestino delgado. A partir de estudos in vitro, não se esperaria que o dimero tivesse atividade terapêutica, mas teria efeitos hematológicos devido à sua capacidade de oxidar a hemoglobina.

Esta hipótese de dissolução retardada é consistente com os dados derivados do ensaio de rember™. Essencialmente, o ensaio clinico mostrou que o MTC tem duas ações farmacológicas sistémicas: efeitos cognitivos e efeitos hematológicos. Os efeitos cognitivos não mostram uma relação de resposta à dose monotónica, enquanto os efeitos hematológicos sim (Figura 8). Isto sugere qye duas espécies diferentes são responsáveis pelos dois tipo de atividade farmacológica: o MTC absorvido como a forma L-MT sem carga sendo responsável pela atividade cognitiva benéfica, e o MTC absorvido como espécie dimérica oxidada sendo responsável pela oxidação da hemoglobina. Se assim fosse, seria esperado que pudesse ser derivada uma relação ligando o tempo de dissolução com as duas atividades farmacológicas a diferentes potências de cápsula. Este foi de facto constatado como sendo o caso, conforme mostrado na Figura 8.

Foi encontrada uma correlação muito elevada (R=0,996) entre a dissolução normalizada expressa como pecentagem dissolvida anteriormene a ou após 30 minutos, e os índices de atividade cognitiva ou hematológica relativa normalizados. Para discussão relativa, foi calculada a percentagem da dissolução total que ocorreu in vitro anteriormente a ou após 30 minutos. A partição correspondente de atividade farmacológica total foi derivada conforme mostrado na Figura 7.

Deve ser tido em mente que a atividade cognitiva relativa a cada dose nominal é expressa como a proporção de atividade farmacológica total (isto é, cognitiva e hematológica) a cada dose nominal. Portanto, embora a dose de 30 mg tenha um efeito cognitivo absoluto menor que a dose de 60 mg, tem um índice de atividade cognitiva superior relativamente à atividade farmacológica total, devido a ter menos atividade hematológica que a dose de 60 mg.

De modo inverso, a falta de relação dose-resposta monotónica observada nas análises de eficácia de ADAS-cog às 50 semanas implica que a dose terapêutica eficaz disponível a partir da cápsula de 100 mg foi conforme indicado na Figura 8, isto é, aproximadamente 25 mg, ou um quarto da dose nominal, semelhante à dose de 30 mg em atividade às 50 semanas. És por este motivo que nas análises apresentadas acima, a dose de 100 mg foi indicada como "low" (100 mg) para significar que a formulação destas cápsulas não permitiu administração e absorção proporcionadas da dose nominal esperada na sua forma terapeuticamente ativa. Pareceria que um determinante principal da atividade terapêutica no cérebro é dependente da absorção na forma L-MT, que pode ser mediada através da capacidade desta forma de atravessar a barreira hematoencefálica.

Estas análises sugerem vivamente que é possível dissociar os efeitos cognitivos benéficos da fração de metiltioninio de MTC dos seus efeitos hematológicos indesejáveis através da otimização da formulação. Conforme discutido num pedido de patente previamente depositado e não publicado (PCT/GB2007/001103, o conteúdo do qual se encontra incorporado no presente documento especificamente para referência), uma forma inovadora de sal reduzido estabilizado (designada "L-MTx") teria o benefício de evitar a atividade redutase que é necessária para a absorção da fração de metiltionínio de MTC. L-MTx estável foi constatado como tendo maior solubilidade que MTC, e após dissolução permanece substancialmente no estado reduzido incoloro durante mais de 1 hora, permitindo a absorção direta como a espécie reduzida de metiltionínio. Um benefício adicional de L-MTx pode ser que pode ser obtida eficácia ainda mais elevada devido a que poderiam ser absorvidas doses mais elevadas da forma terapeuticamente ativa sem limitação por parte da capacidade da tiazina redutase corante por um lado, e dos efeitos secundários hematológicos e diarreia por outro lado. Estes são discutidos mais abaixo.

Conforme previsto a partir da presente análise, a forma de sal de L-MT foi constatada como tendo significativamente menor toxicidade hematológica que MTC. A Figura 9 mostra as diferenças entre MTC e L-MTx ao longo de um intervalo de doses orais em termos de parâmetros de glóbulos vermelhos fundamentais em ratos recebendo doses diárias durante 14 dias. Como pode ser observado, animais recebendo doses de L-MTx tiveram contagens mais elevadas de glóbulos vermelhos ("RBC"), níveis mais elevados de hemoglobina ("HB") e concentração de hemoglobina em glóbulos vermelhos mais elevada ("MCHC"). 0 volume de glóbulos vermelhos médio foi menos ("MCV"), indicando que foram libertados mais glóbulos vermelhos maduros a partir da medula óssea, e a reticulose induzida por parte dos efeitos hemolíticos de MTC foi reduzida ("RETI").

Quadro 4. Análise estatística de diferenças em parâmetros de glóbulos vermelhos fundamentais entre doses de MTC e L-_MTx._

Exemplo 5 - Estudos disponíveis

Como pode ser observado a partir da anterior discussão, a otimização de uma dose terapêutica adequada de MTC e a sua formulação são complexas. Uma barreira principal a isto é a falta de um modelo farmacocinético adequado. Embora tenham havido tentativas de gerar um modelo PK, estas são contraditórias e não têm em conta todos os dados disponíveis. Portanto, foi requerida uma abordagem totalmente inovadora para o desenvolvimento de um modelo PK. Antes da apresentação do mesmo, são resumidos os dados e modelos disponíveis.

Existe 3 estudos publicados de MTC em seres humanos. Estes são primeiramente resumidos, e posteriormente discutidos em conjunto. Existe um estudo adicional publicado em seres humanos (Rengelshausen et ai., (2004) Pharmacokokinetic interaction of chloroquin and methylene blue combination against malaria. Eur. J. Clin. Pharmacol. 60: 709-715) que não é adicionalmente utilizado no presente documento, já que a sua metodologia e constatações são semelhantes às de Peter et al. (2000) discutido abaixo. 1) Estudos de técnicas anteriores 1

Os primeiros estudos de referência sistemáticos foram levados a cabo por DiSanto e Wagner (1972) e relataram uma série de três documentos, dois dos quais são resumidos abaixo. la) DiSanto AR e Wagner JG (1972a) Pharmacokinetics of highly ionized drugs I: whole blood, urine and tissue assays. J Pharmaceut Sc 61: 598-601 O documento relata um método de análise de MTC em sangue inteiro, urina e tecidos. Essencialmente, o método consiste em preparar a matriz aquosa com uma elevada concentração de sal (> 2M), extrair MTC em dicloroetano, e medir a absorvância do extrato de dicloroetano total a 660 nm. Foi encontrada uma leuco-forma estabilizada de MTC ("leuco-MTC") em urina, mas não identificada quimicamente. Isto poderia ser analisado transformando-o primeiro em "MTC livre" adicionando HC1 a 5N e aquecendo em banho de água em ebulição durante 2 minutos anteriormente à extração em dicloroetano. A diferença entre MTC recuperado a partir de urina após tratamento ácido e MTC recuperado sem tratamento ácido ("MTC livre") foi relatada como "leuco-MTC". 1 b) DiSanto AR e Wagner JG (1972b) Pharmacokinectis of highly ionized drugs II: absorbtion, metabolism and excrection in man and dog after oral administration. J Pharmaceut Sc 61: 1086-1090.

Neste estudo, 7 voluntários adultos do sexo masculino com idades entre 21 e 40 anos e pesando entre 54,5 e 95,3 kg ingeriram 10 mg de MTC USP. Foi colhida urina nos intervalos tabulados abaixo. As taxas de excreção urinária médias para MT oxidado ("Οχ-MT", também referido como "MB livre") e leuco-MT ("L-MT") con erros padrão correspondentes são mostradas no Quadro 5, e nas Figuras 10 e 11.

Quadro 5. Taxas de excreção e erro padrão ("ep") para MTC oxidado ("Ox-MTC") e MTC reduzido ("L-MT") de DiSanto e Wagner (1972) .

Quadro 6. Dados de excreção urinária para Οχ-MT e L-MT

A partir dos dados de excreção urinária, Οχ-MT and L-MT diferem com respeito à fase de distribuição e biodisponibilidade aparente. Contudo, a semivida de eliminação terminal (-16 h) e o volume central aparente corrigido (4 1) são comparáveis (Quadro 6) . A recuperação urinária total é de 6,465 mg (isto é, 65% da dose), da qual 23% é excretado como Οχ-MT e 77% é excretado como L-MT. 2) Estudos de técnicas anteriores 2

Isto é descrito em Peter C, Hongwan D, Kupfer A, Lauterberg BH (2000) Pharmacokinetics and organ distribution of intravenous and oral methylene blue. Eur J Clin Pharmacol 56: 247-250.

Neste estudo 7 voluntários humanos (4 membros do sexo masculino, 3 membros do sexo feminino) de idades entre 19 e 53 anos receberam MTC 100 mg (313 μΜ) em 3 ocasiões com um intervalo de pelo menos 1 semana como ou uma única injeção por via i.v. (20 mg/ml em NaCl a 0,9% durante 30 segundos) ou duas cápsulas de 50 mg em gelatina, ou duas cápsulas de 50 mg em conjunto com 800 mg de Mesna (mercaptoetanosulfonato de sódio). O efeito farmacocinético da co-administração de Mesna foi incluído devido à utilização clínica de MTC em regimes de quimioterapêutica de cancro com base em ifosfamida para o qual é co-administrado Mesna para prevenir urotoxicidade. A metodologia analítica para o sangue diferiu da utilizada por DiSanto e Wagner nos seguintes contextos: • Inclusão de um padrão interno • Utilização de hexanossulfonato de sódio como um par iónico para potenciar a extração en dicloroetano • Separação cromatográfica utilizando uma coluna

Nucleosil 100-5 CN com uma fase móvel isocrática, com efluxo monitorizado a 660 nm.

Peter et al. mediram também a excreção urinária de Οχ-MT e L-MTC a 24 hr, mas relataram somente médias de excreção total a intervalos terminando a 2, 4, 6, 10, 14, 24 h pós-dose. O método analítico na urina foi dito ser essencialmente idêntico ao de DiSanto e Wagner.

Os resultados não estão tabulados pelos autores, mas são mostrados graficamente conforme reproduzido nas Figuras 14 e 15.

Os dados foram lidos a partir destes gráficos e estão tabulados abaixo.

Quadro 7. Concentração de Οχ-MT em sangue inteiro após administração i.v. de 100 mg de MTC.

Quadro 8. Concentração de Οχ-MT em sangue inteiro após administração intravenosa de 100 mg de MTC (média de com e sem Mesna).

Peter et al relatam os seguintes parâmetros farmacocinéticos (Quadro 9).

Quadro 9. Parâmetros farmacocinéticos relatados por Peter et al. (2000) para MTC administrado por vias intravenosa e oral.

Peter et al. notam adicionalmente que a fração de MT total excretada na urina na forma L-MB foi aproximadamente 1/3 do total, e isto não diferiu entre as dosagens oral e i . v. 3) Estudos de técnicas anteriores 3

Isto é descrito em Moody JP, Allan SM, Smith AHW, Naylor GJ (1989) Methylene blue excretion in depression. Biol Psychiat 26: 847-858.

Este é um estúdio limitado de excreção urinária de 24 h durante um período de ensaio de 3 semanas em sujeitos com depressão tornado 15 mg/dia (5 mg t.i.d.) ou 300 mg/dia (100 mg t.i.d.). Foram obtidas colheitas de urina de vinte e quatro horas em 7 sujeitos após 7, 14 ou 21 days de tratamento. 0 método analítico foi dito ser o de DiSanto e Wagner. Os resultados são resumidos no Quadro 10.

Quadro 10. Resumo dos dados de excreção urinária de MTC e seres humanos a partir do estudo por Moody et al. (1989) .

Os dados de dose única deste estudo foram combinados com os dos estudos de DiSanto e Wagner e Peter et al. para proporcionar uma estimativa da biodisponibilidade oral aparente com base na excreção urinária às 48 h de MT total. Discussão dos resultados fundamentais

Existem vários contextos nos quais os modelos desenvolvidos com base nos dados tabulados acima são inconsistentes. 0 mais importante é que a semivida de eliminação terminal deduzida por Peter et al. (5,5-6,3h) a partir dos dados da análise da concentração em sangue é inconsistente com a semivida de eliminação terminal deduzida por DiSanto e Wagner (15 -16,5h) a partir dos dados de excreção urinária. É também inconsistente com a longa descoloração da urina observada após administração intra-operat iva por via i.v. de MTC para localizar as glândulas paratiróides para cirurgia (Kuriloff e Sanborn, 2004). O problema surge porque Peter et al. (2000) basearam as suas estimações em dados de sangue obtidos a partir de 4h, ou 12h no caso de Rengelshausen et al. (2004) que seguiram a mesma abordagem farmacocinética. Estas análises não têm em conta a fase de eliminação terminal, devido a dificuldades técnicas encontradas ao estimar os níveis de Οχ-MT em sangue, inclusive utilizando LC-ME (Cromatografia Líquida-Espetroscopia de Massa) após os níveis em sangue se encontrarem por debaixo dos limites de deteção. A fase de eliminação terminal pode ser mais bem analisada utilizando dados de excreção urinária. Embora seja bem sabdo que a taxa de excreção urinária pode proporcionar uma forma válida de estimar a constante da taxa de eliminação em sistemas simples (por exemplo Gibaldi and Perrier (1982) Pharmacokinetics) , o problema com os dados de MTC disponíveis é que é complexo, e não existe uma forma óbvia de unir os dados de sangue e os dados de excreção urinária num modelo integrado coerente simples capaz de ter em conta ambos para os casos de dosagem i.v. e oral. Proporcionar uma solução a este problema é crucial para o desenvolvimento de um modelo previsivo adequado que pode ser utilizado para otimizar a dosagem de MTC u outras formas de MT para o tratamento de AD e noutros contextos terapêuticos. A solução a este problema é discutida abaixo. Exemplo 6 - Desenvolvimento de Modelo Farmacocinético Integrado i) Biodisponihilidade oral

Os dados de Peter et al. proporcionam uma indicação útil dos níveis em sangue após administração oral frente a i.v. A comparação dos valores de AUC durante o período de tempo de 4h indic que os níveis em sangue após administração oral são 8,2% dos observados após administração i.v. Contudo, esta estimativa não pode ser utilizada para determinar a biodisponibilidade oral. É inconsistente com os dados de recuperação de urina de Peter et al. às 24 horas, onde a recuperação urinária após dosagem oral foi constatada como sendo 65% da obtida após dosagem i.v. (veja-se o Quadro 5). Este número é comparável com os dados de excreção urinária obtidos a partir dos estudos de DiSanto e Wagner e de Moody et al.

Os dados a partir destes estudos são combinados na Figura 16 para proporcionar uma estimativa global da biodisponibilidade oral. Sugere um número entre 40% - 80% dependendo da dose sobre o intervalo de 10 - 100 mg. É também aparente a partir da Figura 16 que existe uma redução dependente de dose da biodisponibilidade conforme determinado através de recuperação urinária após dosagem oral.

Existe portanto uma discrepância entre a estimativa da biodisponibilidade oral determinada a partir de medição direta em sangue e a determinada a partir de excreção urinária. Isto implica que os níveis sanguíneos baixos observados em sangue após dosagem oral não podem ser explicados simplesmente através de uma limitação da absorção como sugerido por Peter et al. (2000) . Os níveis sanguíneos baixos observados após administração oral têm mais probabilidade de refletir uma diferença no volume aparente de distribuição para MTC administrado por via oral e através da via i.v. Foi confirmada absorção tecidual precoce rápida por DiSanto e Wagner que relataram que 29,8% da dose intravenosa de MTC poderia ser recuperada no coração, pulmão, fígado e rim 2 minutos após administração em ratos. Esta imagem de uma fase de distribuição precoce rápida seguida após 10 horas por uma fase de eliminação lenta é também consistente com os dados de excreção urinária mostrados nas Figuras 12 e 13. Portanto, os dados de sangue coletados durante um período de 24 horas conforme proporcionados por Peter et al. não são suficientes para derivar uma estimativa válida de redistribuição de MT entre absorção, compartimentos central e periférico. 11) Modelo construído combinando dados de Peter et al. (Quadros 7 e 8) e dados de excreção urinária de DiSanto e Wagner (Quadro 5)

Uma abordagem à derivação de um modelo farmacocinético a partir dos estudos disponíveis é a utilização de equações diferenciais lineares para determinar diretamente um sistema de compartimentos que podem ser ajustados aos conjuntos de dados disponíveis. Os dados utilizados são os dados de excreção urinária de DiSanto e Wagner estabelecidos para 7 sujeitos listados no Quadro 5, tendo em conta a excreção diferencial de Οχ-MT e L-MT. Isto é combinado com os dados de níveis sanguíneos de Peter et al. listados nos Quadros 7 e 8, também baseados em 7 sujeitos. É assumido que os dados de DiSanto e Wagner podem ser unidos tanto a conjuntos de dados de concentração sanguínea oral como i.v. após escalonamento adequado com base em que os perfis de excreção urinária conforme determinados por Peter et al. foram semelhantes para as 2 vias de administração (Figura 17).

Contudo, o conjunto de dados de excreção de DiSanto e Wagner é utilizado para ajustar de preferência aos dados de Peter et al. devido a que os últimos não têm explicitamente em conta a excreção diferencial de Οχ-MT e L-MT, e devido a que os intervalos de amostragem são genéricos relativamente aos disponíveis a partir do conjunto de dados de DiSanto e Wagner. A modelagem foi feita em duas etapas:

Na primeira etapa os dados de concentração sanguínea de Peter et al. a 4h após uma dose única por via i.v. de 100 mg de MTC foram combinados com os dados de excreção urinária de DiSanto e Wagner estabelecidos a 120 horas para dose oral única de MTC de 10 mg. A segunda etapa foi verificar se o mesmo sistema de compartimento ou semelhante pode ser utilizado para ser ajustado aos dados de concentração sanguínea de Peter et al. após uma dose oral única de 100 mg de MTC, em combinação com os dados de excreção urinária de DiSanto e Wagner estabelecidos a 120 horas para dose oral única de MTC de 10 mg. Em ambos casos, foram estimados parâmetros de escalonamento para permitir a diferença de 10 vezes a dose através dos modelos correspondentes. A Figura 18 mostra a melhor distribuição dos compartimentos e as correspondentes constantes de velocidade que poderiam ser ajustadas aos três conjuntos de dados (dados de concentração sanguínea de dosagem i.v. de Peter et al. [Quadro 7], dados de Οχ-MT [Quadro 5] e dados de L-MT [Quadro 5] urinário de DiSanto e Wagner). O compartimento central é C2. Os parâmetros de escalonamento para permitir o fato de haver uma diferença de 10 vezes as doses utilizadas nos conjuntos de dados de urina e sangue foram explicitamente estimados através do modelo para Ox-MT urinário (S-Οχ) e L-MT urinário (S-L) e são mostrados no Quadro 11. A solução ao modelo requer dois compartimentos periféricos, mostrados como C3 e C4 na Figura 18, e um compartimento adicional de excreção (C5). Existem duas saídas a partir de C5, uma das quais representa a excreção urinária observada escalonada de L-MT (designada K50 no Quadro 11), e uma segunda saída que representa uma perda não medida (designada K500 no Quadro 11), que se presume representar o metabolismo hepático secundário de MT que é excretado através da bílis como um metabolito não medido. A saída a partir de C3 (designada K30 no Quadro 11) representa a quantidade medida como MT-Οχ urinário. As percentagens mostradas representam partições de excreção total prevista às 120h, estimadas a partir dos valores correspondentes de AUC.

Os parâmetros estimados através do modelo são listados abaixo no Quadro 11.

Quadro 11. Parâmetros de modelo estimados para uma dose única intravenosa de 100 mg de MTC. As constantes de velocidade são conforme indicado na Figura 18. K50 é a constante de velocidade de excreção urinária a partir de C5, e K500 é a constante de velocidade de excreção hepática presumida a partir de C5. V2 é o volume aparente de distribuição de MT em C2 calculado através do modelo. SOx e S-L são os parâmetros de escalonamento calculados através do modelo para ter em conta o fato de que os dados urinários provieram de uma experiência na qual MTC foi administrado como uma dose oral de 10 mg, e os dados sanguíneos provieram de uma experiência na qual MTC foi administrado como uma dose única i.v. de 100 mg.

Na segunda etapa, o mesmo modelo básico foi ajustado aos dados de concentração sanguínea de Peter et al. após uma dose oral única de 100 mg de MTC (Quadro 8), e aos dados de excreção urinária escalonados de DiSanto e Wagner (Quadro 5) após uma dose oral única de 10 mg de MTC. A Figura 22 mostra a melhor distribuição dos compartimentos e as correspondentes constantes de taxa que poderiam ser ajustadas aos três conjuntos de dados (dados de concentração sanguínea de dosagem oral de Peter et al. [Quadro 7], dados de Οχ-MT [Quadro 5] e dados de L-MT [Quadro 5] urinário de DiSanto e Wagner). O modelo oral assume dois compartimentos adicionais anteriormente ao compartimento central (C2). Estes são Cl (o compartimento primário de absorção, assumido como correspondendo ao estômago), e um segundo compartimento pré-central (C6, presumido como representando um compartimento hepático de metabolismo de primeira passagem). Ocorre uma perda desde Cl (designada K100 no Quadro 12) que se presume representar MTC não absorvido, e perda adicional desde C6 (designada K600 no Quadro 12) que se presume representar perda devido ao metabolismo de primeira passagem. Os parâmetros de escalonamento para permitir o fato de haver uma diferença de 10 vezes as doses utilizadas nos conjuntos de dados de urina e sangue foram explicitamente estimados através do modelo para Οχ-MT urinário (S-Οχ) e L-MT urinário (S-L) e são mostrados no Quadro 12. Relativamente ao modelo i.v., a solução ao modelo requer dois compartimentos periféricos, mostrados como C3 e C4 na Figura 22, e um compartimento adicional de excreção (C5) . Existem duas saídas desde C5, uma das quais representa a excreção urinária observada escalonada de L-MT (designada K50 no Quadro 12), e uma segunda saída que representa uma perda não medida (designada K500 no Quadro 12), que se assume representar o metabolismo hepático secundário de MT que é excretado através da bílis como um metabolito não medido. A saída a partir de C3 (designada K30 no Quadro 12) representa a quantidade medida como MT-Οχ urinário. As percentagens mostradas representam partições de saída total prevista a partir da excreção do sistema às 120h, estimadas a partir dos valores correspondentes de AUC.

Os parâmetros estimados através do modelo são listados abaixo no Quadro 12.

Quadro 12. Parâmetros de modelo estimados para dose única oral de 100 mg de MTC.

Os fatores de escalonamento para Οχ-MT e L-MT urinário de DiSanto e Wagner (dose de 10 mg, oral) para ser ajustados com os dados de Peter et al. (dose de 100 mg, oral) são estimados explicitamente para a versão oral do modelo como S-Οχ e S-L respetivamente. Uma modificação adicional requerida para alcançar um ajuste para os dados orais foi a introdução de um atraso temporal para os dados de excreção urinária de DiSanto e Wagner. Este atraso foi estimado como uma função não linear variando desde 0,2 até lh para tempos de excreção anteriores a lh, e um atraso temporal constante depois disso.

Como pode ser observado nos Quadros 11 e 12, houve correlações muito elevadas (todas superiores a 0,96) entre os conjuntos de dados de saída e de entrada do modelo, conforme pode ser prontamente observado a partir das Figuras 19-21 e 23-25. Como tal o modelo proporciona um ajuste estrito aos dados experimentais. iii) Comparações de dados de modelos com outras fontes de dados

Como uma verificação do modelo oral, as suas saídas foram comparadas com outros conjuntos de dados disponíveis.

As saídas do modelo oral (Figura 22) foram primeiramente comparadas com as taxas de excreção urinária relatadas por Peter et al. (2000) e mostradas acima na Figura 18. Esta comparação é mostrada abaixo na Figura 26. Houve boa concordância geral, aparte do intervalo de coleção de 2-4h, quando o nível relatado por Peter et al. foi metade do previsto por parte do modelo. Excluindo este valor, a correlação entre ambos foi de 0,86. A excreção total de 24h prevista através do modelo e a relatada por Peter et al. é também comparada na Figura 26. O modelo prevê que a excreção urinária total foi 23% da dose, enquanto a estimativa de Peter et al. foi de 18,6%.

Como uma verificação adicional do modelo, a excreção total de 24h prevista através do modelo foi comparada com os dados mostrados acima na Figura 16, que compila os dados de excreção urinária de DiSanto e Wagner e Moody et al. Isto é novamente mostrado abaixo na Figura 27, com a saída do modelo indicada por "M", e os dados de Peter et al. indicados por "P".

Finalmente, foi efetuada uma comparação entre as previsões dos compartimentos e os resultados de um estudo oral no qual foi administrada a porcos uma dose única de 20 mg/kg, e foram determinados os níveis cerebrais de MT. Os porcos receberam uma administração oral única de MTC numa dose alvo de 20 mg/kg de peso corporal. Sangue (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 e 48 h) e urina (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, e 24h) foram coletados em pontos temporais regulares até 48 horas. Dois animais foram sacrificados a cada 1, 8, 24 e 48h após a dose e foram retidas amostras cerebrais. Foi realizada uma avaliação farmacocinética da base livre de MTC em amostras de sangue inteiro e tecido cerebral. Foram extraídos dois lotes de tecido cerebral para cada animal e analisados essencialmente conforme descrito por Peter et al. (2000). O tecido cerebral (500 mg) foi submetido a vórtex e posteriormente extraído com dicloroetano (5 ml) e a fase orgânica foi levada à secura sob azoto. O extrato foi captado com metanol e separado através de HPLC de fase reversa com deteção ultravioleta. O método foi validado, utilizando padrões internos, sobre o intervalo de 10 a 2000 ng de MTC por grama de tecido. A precisão inter-ocasião média para MTC foi de 107%, 95% e 105% a 20, 100 e 1600 ng/g, respetivamente e o coeficiente de variação a cada nível, não foi superior a 20%. A semivida de eliminação terminal em porcos foi constatada como sendo de 23,5 horas tanto em sangue como no cérebro, consistente com as constatações de excreção urinária de DiSanto e Wagner indicando que a fase de eliminação terminal é muito mais longa que o estimado tanto por Peter et al. (2000) como por Rengelshausen et al. (2004) .

De forma a utilizar os dados de porcos para determinar que compartimento do modelo humano prevê os níveis cerebrais, a base temporal para porcos foi reescalonada para corresponder à semivida humana (15,7h).

Os resultados são mostrados na Figura 28. Todos os compartimentos foram reescalonados aos seus máximos respetivos. Pode ser observado a partir da Figura 28 que o compartimento central (C2, sangue) e C4 se seguem mutuamente muito estritamente, indicando que MT é livremente permutável entre C2 e C4.

Por outro lado, pode ser observado que a eliminação de MT a partir do cérebro de porco é paralela à eliminação prevista a partir de C3, e não de C4. Portanto, dos dois compartimentos internos do modelo (C4 e C3) , pode ser observado que C3 proporciona uma previsão de níveis cerebrais esperados.

iii) Interpretação do modelo farmacocinético integrado para MTC

As principais características farmacocinéticas dos modelos oral e i.v. são agora comparadas. a) Modelo humano i.v.

As características cinéticas fundamentais do modelo intravenoso humano são resumidas no Quadro 13. Os dados foram normalizados para o caso de uma dose única de 100 mg (313 pm).

Quadro 13. Resumo das caracteristicas cinéticas fundamentais do modelo PK intravenoso humano.

Compartimentos Centrais. Como pode ser observado a partir do Quadro 13, e também a partir da Figura 28, as propriedades cinéticas de MT nos compartimentos C2 e C4 são essencialmente idênticas, sustentando o conceito de que a forma de MT em C4 está em equilíbrio de permuta pronto entre a forma medida como o nível sanguíneo de Οχ-MT no sangue em C2. Já que o compartimento C4 é o principal determinante da excreção urinária da forma L-MT medida em urina, é concluído que a forma C4 de MT representa o lado L-MT do equilíbrio L-M - Οχ-MT que existe no corpo. Após administração i.v., a quantidade de MT em C4 alcança o ser nível máximo no prazo de 30 minutos, e é posteriormente eliminada à taxa de eliminação terminal comum.

Compartimento Profundo Em contraste, pode ser observado que C3 no caso de i.v. tem propriedades dinâmicas diferentes. Demora 4 h após a administração para ser alcançado o nível máximo de C3, e o tempo médio de residência em C3 é substancialmente mais longo que tanto em C2 como em C4. Á luz dos dados de cérebro de porco, é inferido que o compartimento C3 representa o agrupamento de MT que é cineticamente capturado no interior das células conforme descrito por May et al. (2004) .

De acordo com May et al. (2004), MT necessita estar na forma L-MT de forma a atravessar a membrana celular. No interior da célula, existe um novo equilíbrio L-MT - Ox-MT que é determinado através de uma combinação do ambiente redutor predominante no meio celular, e o pH prevalecente no interior da célula (~pH 7) . Experiências in vitro (não mostradas) indicaram que é muito difícil manter MT no estado reduzido a pH 7 utilizando agentes redutores fisiologicamente aceitáveis a concentrações fisiologicamente aceitáveis. Isto é, a pH 7, MT tenderia a existir predominantemente no estado Ox-MT se não fossem as condições redutoras predominantes que são mantidas no interior da célula. Contudo, na forma Ox-MT, MT não pode ser difundido fora da célula. Isto cria condições para um novo equilíbrio pelo qual MT é capturado no interior das células, levando a acumulação de MT intracelular frente a um gradiente de concentração, que pode ser demonstrado em cultura tecidual (não mostrado). Isto explica a observação farmacocinética de outra forma paradoxal de que MT é tanto rapidamente distribuído aos tecidos após administração i.v. (conforme relatado por DiSanto e Wagner) , mas não obstante eliminado muito mais lentamente. Como tal DiSanto e Wagner constataram que 2 minutos após uma dose administrada por via i.v. em ratos, aproximadamente 25% poderia ser recuperado a partir dos órgãos principais.

De acordo com o modelo i.v. humano, o nível de MT que é medido em urina como a forma Οχ-MT está estritamente relacionado cineticamente com a espécie que é capturada num ambiente intracelular, incluindo o cérebro, conforme indicado por parte dos dados de cérebro de porco. b) Modelo humano oral

As características cinéticas fundamentais do modelo oral humano são resumidas no Quadro 14. Os dados foram normalizados para o caso de uma dose única de 100 mg (313 pm) .

Quadro 14. Resumo das características cinéticas fundamentais do modelo PK oral humano (para detalhes veja-_se notas de rodapé do Quadro 13) ._

Compartimento primário de absorção No modelo oral, existem dois compartimentos de entrada (Cl e C6) anteriormente à aparição de MT nos compartimentos centrais (C2 e C4), Conforme discutido acima na seção Relação entre Atividade Cognitiva e Hematológica, as propriedades de Cl são cruciais na determinação da biodisponibilidade e da forma na qual MT é absorvido. Conforme mostrado no Quadro 14, o tempo médio de residência em Cl é de 30 minutos. Pode ser calculado que 50% de MT foi absorvido aos 30 minutos, e que 90% de MT foi absorvido a partir de Cl em lh. Isto indica que Cl é o estômago, onde o pH baixo (pH ~ 2) favorece a conversão mediada por enzimas de MT na forma L-MT que é prontamente absorvida (May et al., 2004) . É importante notar que 23% de MTC administrado escapa à absorção, e é posteriormente perdido (mostrado como K100 no Quadro 14) . Portanto, a absorção a partir de Cl é também crítica na determinação de quanto MTC passa através do trato gastrointestinal ao intestino distai onde a atividade antibiótica leve de MTC causa diarreia devido a repopulação da flora gástrica distai. As propriedades de Cl são como tal cruciais para otimizar a absorção e eficácia de MTC, e minimizar os efeitos secundários, tanto de MTC não absorvido (diarreia) como de MTC absorvido tardiamente conforme mostrado no ensaio clínico (efeitos secundários hematológicos).

Compartimentos Centrais Relativamente ao modelo i.v., as propriedades cinéticas dos compartimentos C2 e C4 são essencialmente idênticas no modelo oral. A diferença significativa entre os casos i.v. e oral é que a constante de velocidade K24 (3, 94) é 4 vezes mais elevada no caso de

i.v. que no caso oral (K24: 0, 67) . Isto indica que após administração i.v., há um grande fluxo de Ox-MT administrado à forma L-MT. Em contraste, no caso oral, a maior parte de MT já foi reduzido à forma L-MT anteriormente à entrada nos compartimentos centrais.

Uma diferença significativa adicional que pode ser observada entre o modelo i.v. e o modelo oral é que o volume aparente estimado de distribuição de MT é muito maior no caso oral (320 1, Quadro 12) que no caso i.v. (66 1, Quadro 11). Esta diferença de quase 4 vezes é a principal explicação para a baixa concentração de Ox-MT observada em sangue após administração oral que após administração i.v. Isto foi explicado erroneamente por Peter et ai. (2000) como uma baixa biodisponibilidade. Embora seja verdade que aproximadamente metade da dose administrada por via oral é perdida por uma combinação de não absorção (a perda C100 no Quadro 14 e Figura 22), e metabolismo de primeira passagem (a perda C600 no Quadro 14 e Figura 22) , a AUC de C2 no caso oral é 64% da AUC de C2 no caso i.v. Como tal a biodisponibilidade aparente conforme determinado através de relações de AUC em sangue é muito próxima à biodisponibilidade aparente calculada a partir dos dados de excreção de DiSanto e Wagner, que indicaram que 65% da dose administrada poderia ser recuperada em urina para o caso da dose de 10 mg.

Compartimento Profundo O nível máximo de MT é visto nos compartimentos centrais 2h após administração. Em contraste, o nível de pico é alcançado no compartimento profundo (C3) somente às 5h após administração. Uma vez mais o tempo médio de residência de MT em C3 e muito mais longo que nos compartimentos centrais (25h frente a 16h) . Portanto, as caracteristicas de C3 são essencialmente idênticas nos modelos de dosagem i.v. oral. É importante comparar a biodisponibilidade aparente de MT em C3, que é representativa dos níveis cerebrais, entre as vias de dosagem oral e i.v. A AUC de C3 oral é 50% da AUC de C3 i.v. Como tal essencialmente metade da dose oral está disponível no interior das células em comparação com o caso i.v.

Exemplo 7 - Implicações da dosagem do modelo farmacocinético integrado

Um modelo farmacocinético integrado é uma ferramenta crítica requerida para: • otimização do regime de dosagem • otimização da formulação • estabelecimento de uma relação entre o nível sanguíneo e a eficácia O parâmetro de planeamento fundamental que pode ser derivado a partir o modelo farmacocinético é a previsão de níveis de estado constante alcançados com dosagem repetida. Será evidente que um modelo que assume uma semivida de eliminação terminal de 5-6h (Peter et al, 2000; Rengelshausen et al., 2004) produzirá estimativas bastante diferentes do regime de dosagem ótima de um em que a semivida de eliminação é de 16h. Pode ser estimado a partir do modelo integrado que foi desenvolvido que um regime de dosagem de 3/dia terá implicações bastante diferentes no que respeita aos níveis de estado constante previstos assumindo uma semivida de eliminação de 6h frente a 16h. Assim, se a estimativa de Peter et al. fosse correta, então o fator de acumulação (R, isto é, a relação entre nível de estado constante e nível de dose única) que seria observado para dosagem cada 8 horas seria de 1,4. Em contraste, Se a estimativa de 16h é correta, estão o valor correspondente de R é de 4,8 para dosagem cada horas. Isto implica que existiria uma diferença de 3,4 vezes no nível de estado constante esperado de MT (em sangue e no cérebro) de acordo com os dois modelos. É como tal difícil determinar uma relação precisa entre dose e eficácia ou efeitos secundários sem um modelo farmacocinético válido. A variável interveniente fundamental relacionando dose e eficácia é uma estimativa dos níveis de estado constante de MT em compartimentos críticos em frequências de dose regular variáveis. 0 modelo permite que estes sejam determinados como os níveis de estado constante médios previstos em C2 e C3, conforme mostrado no Quadro 15.

Quadro 15. Níveis de estado constante médios previstos em C2 e C3 como uma função de frequência de dose (valores em pmol). C2 C3 3/dia 4,8 295,5 2/dia 3,2 197,0 1/dia 1,6 98,5

Correlação entre eficácia clinica observada e prevista com base no modelo farmacocinético humano oral integrado É examinada primeiro a relação entre a eficácia clínica observada (tamanho do efeito em unidades ADAS-cog às 50 semanas) e o nível de estado constante previsto de MT no compartimento profundo (C3) que está, conforme discutido acima, correlacionado com os níveis medidos em porcos. Isto é, a quantidade de MT em C3 e a concentração de MT no cérebro estão relacionadas através de uma constante que depende da fração de MT que alcança o cérebro, e da precisão da deteção de MT total no cérebro. Já que este fator de escalonamento é atualmente desconhecido no caso humano, para a finalidade de discussão adicional a quantidade de MT em C3 é tomada como um suposto para o nível cerebral esperado. A relação é mostrada na Figura 29. Como pode ser observado na Figura 29, existe uma relação muito estrita entre o nível de estado constante médio previsto de MT no cérebro e o tamanho do efeito clínico de rember™ em TRx-014-001 para as doses de 30 mg 3/dia e 60 mg 3/dia. A relação não se mantém para a cápsula de 100 mg devido aos motivos discutidos acima na seção Relação entre Atividade Cognitiva e Hematológica. Essencialmente, o atraso na dissolução da formulação da cápsula de 100 m utilizada em TRx-014-001 não permitiu absorção proporcionada de MTC na sua forma terapeuticamente ativa.

Pode ser definida uma relação idêntica entre o nível sanguíneo de estado constante de MT (isto é, determinado através de C2) e o tamanho do efeito, conforme mostrado na Figura 30.

Dosagem e implicações na formulação da correlação entre eficácia clinica observada e prevista com base no modelo farmacocinético humano oral integrado A partir da análise anterior, existe a expetativa de uma relação dose-resposta monotónica entre os níveis de MT em sangue que possam ser medidos clinicamente e o tamanho do efeito. A partir disto, podem ser calculados monogramas adequados que têm em conta a metodologia da medição. Isto é, a eficácia poderia estar relacionada com os níveis sanguíneos, e poderiam ser especificados níveis sanguíneos terapêuticos utilizando metodologia analítica.

Uma implicação da relação mostrada na Figura 30 é o cálculo da relação entre a dissolução da cápsula observada e o défice de eficácia, isto é, a diferença do tamanho do efeito entre o tamanho do efeito observado e o tamanho do efeito previsto. Isto é mostrado na Figura 31. Como pode ser observado a partir da Figura 31, há uma perda acentuada de eficácia prevista à medida que a percentagem de dissolução da cápsula observada aos 30 minutos cai por debaixo de 20%. Isto confirma as conclusões alcançadas acima na seção Relação entre Atividade Cognitiva e

Hematológica, e confirma que a dissolução rápida é critica para a atividade terapêutica. Conforme discutido adicionalmente na seção Interpretação do modelo farmacocinético integrado para MIC, isto pode ser explicado através do papel critico do estômago na absorção da fração de MT na sua forma terapeuticamente ativa.

Como tal, no desenho de uma formulação melhorada de MTC, a obtenção da eficácia prevista é criticamente determinada através do requerimento de que a dissolução do produto medicinal de investigação (isto é, comprimido ou cápsula) seja superior a 50% em 30 minutos em condições padrão.

As relações descritas no presente documento têm implicações no que diz respeito à abordagem convencional para alcançar um regime de dose mais conveniente, isto e, 2/dia or 1/dia. Estes regimes de dose seriam muito mais desejáveis em pacientes com demência, que têm esquecimento e como tal necessitam incitamento para tomar a medicação. A abordagem convencional para alcançar um regime de dose mais conveniente é a criação e uma formulação de libertação lenta. Contudo, a presente análise indica que, pelo contrário, uma formulação de libertação lenta de uma forma à base de MTC de um produto terapêutico com carga alta eliminaria essencialmente a eficácia, conforme ilustrado convenientemente através das propriedades da cápsula de 100 mg em TRx-014-001.

Uma inferência adicional que pode ser tirada a partir das Figuras 29 e 30 é que a dose de uma forma à base de MTC de um produto necessitaria ser administrada numa dosagem unitária de 120 mg ou superior para alcançar um nível de eficácia comparável com o visto no ensaio clinico TRx-014-001 com a dosagem unitária de 60 mg administrada 3 vezes por dia.

Uma inferência adicional que pode ser tirada a partir das Figuras 29 e 30 é que uma dosagem unitária de 100 mg ou mais administrada 3 vezes por dia seria requerida para alcançar um nivel de eficácia superior ao visto no ensaio clinico TRx-014-001. Contudo, conforme discutido na seção Resumo do Ensaio Clínico TRx-014-001 de Fase 2 existe uma limitação da quantidade de MTC que pode ser administrada na presente formulação devido ao aumento dos efeitos hematológicos adversos e diarreia em doses de ou por cima de 100 mg 3/dia.

Implicações para formulações e regimes de dosagem melhorados

Como pode ser observado a partir da Figura 31A, há uma perda acentuada de eficácia prevista à medida que a dissolução de cápsula observada aos 20 minutos cai por debaixo de 20%.

Como tal, no desenho de uma formulação melhorada de MTC, a obtenção da eficácia prevista é criticamente determinada através do requerimento de que a dissolução do produto medicinal de investigação (isto é, comprimido ou cápsula) seja superior a 50% em 30 minutos em condições padrão.

As relações descritas no presente documento têm implicações no que diz respeito à abordagem convencional para alcançar um regime de dose mais conveniente, isto é, 2/dia ou 1/dia. Estes regimes de dose seriam muito mais desejáveis em pacientes com demência, que têm esquecimento e como tal necessitam incitamento para tomar a medicação. A abordagem convencional para alcançar um regime de dose mais conveniente é a criação e uma formulação de libertação lenta. Contudo, a presente análise indica que, pelo contrário, uma formulação de libertação lenta de uma forma à base de MTC de um produto terapêutico com carga alta eliminaria essencialmente a eficácia, conforme ilustrado convenientemente através das propriedades da cápsula de 100 mg em TRx-014-001.

Uma inferência adicional que pode ser tirada a partir das Figuras 29 e 30 é que a dose de uma forma à base de MTC de um produto necessitaria ser administrada numa dosagem unitária de 120 mg ou superior para alcançar um nível de eficácia comparável com o visto no ensaio clínico TRx-014-001 com a dosagem unitária de 60 mg administrada 3 vezes por dia.

Uma inferência adicional que pode ser tirada a partir das Figuras 29 e 30 é que uma dosagem unitária de 100 mg ou mais administrada 3 vezes por dia seria requerida para alcançar um nível de eficácia superior ao visto no ensaio clínico TRx-014-001. Contudo, conforme discutido na seção Resumo do Ensaio Clínico TRx-014-001 de Fase 2 existe uma limitação da quantidade de MTC que pode ser administrada na presente formulação devido ao aumento dos efeitos hematológicos adversos e diarreia em doses de ou por cima de 100 mg 3/dia.

Correlação entre efeitos secundários hematológicos observados e previstos com base no modelo farmacocinético humano oral integrado É agora considerada a relação entre o nível de estado constante de MT em C2 (sangue) e os efeitos secundários hematológicos observados no estudo TRx-014-001. A perda de glóbulos vermelhos às 24 semanas é tomada como a variável indicativa mais informativa. A relação é mostrada abaixo na Figura 31B.

Como pode ser observado na Figura 31B, o nível de perda de glóbulos vermelhos é muito mais elevado que o nível de estado constante previsto de MT no sangue. Isto confirma vivamente a hipótese de dissolução retardada delineada na seção Relação entre Atividade Cognitiva e Hematológica. Especificamente, de acordo com a hipótese de dissolução retardada, uma forma bastante diferente de MT é responsável pelos efeitos secundários hematológicos. Esta foi postulada como sendo um dímero, a formação do qual é favorecida nas condições alcalinas do intestino delgado e intestino grosso. Portanto, os efeitos secundários hematológicos observados em TRx-014-001 foram uma consequência especifica da formulação de cápsulas de gelatina utilizada no estudo, e é pouco provável que sejam uma caracteristica inerente da própria fração de MT, se absorvida através do estômago conforme descrito.

Exemplo 8 - Implicações para composições e regimes de dosagem melhorados Absorção e eficácia

Como pode ser observado a partir da anterior análise, os fatores limitantes a nível de eficácia terapêutica que poderiam ser obtidos utilizando um produto medicinal à base de MTC são uma combinação de limitações da absorção e limitações de efeitos adversos. A presente seção discute como estas limitações poderiam ser superadas á luz da análise feita possível através do desenvolvimento do modelo farmacocinético integrado. É primeiro comparada a dose atual com a dose eficaz na Figura 32, calculada utilizando a mesma relação discutida na Figura 16.

Como pode ser observado, o fator limitante da eficácia é uma combinação de limitação da absorção e metabolismo de primeira passagem discutido acima. Estes combinam-se para limitar gravemente o benefício que poderia teoricamente ser alcançado através do aumento da dose. Com efeito o patamar de eficácia aparente sugerido acima na Figura 7 é determinado quase totalmente através da limitação da dose eficaz que pode ser administrada utilizando um produto medicinal com base na forma presente de MTC. 0 pedido anteriormente depositado não publicado PCT/GB2007/001103 descreve determinadas formas de sal reduzidas estabilizadas da fração de metiltionínio (referia no seguinte como "L-MTx"). É aqui utilizado o modelo farmacocinético integrado, e a relação definida pelo menos com a eficácia terapêutica observada em TRx-014-001 para determinar como esta composição inovadora de matéria poderia ser utilizada para otimizar o tratamento de AD com base na fração de metiltioninio.

Foi primeiramente considerada a fração prevista de L-MTx administrado por via oral que seria esperado ser absorvido. Isto é calculado com base em que a perda devido ao metabolismo de primeira passagem (isto é, a perda a partir de C6 designada C600 no Quadro 14 e mostrada na Figura 22) não fosse eliminada através de dosagem com a forma L-MTx. Contudo, É esperado que a perda devido à não absorção inicial a partir de Cl (isto é, a perda a partir de Cl designada C100 no Quadro 14 e mostrada na Figura 22) fosse eliminada através de dosagem com a forma L-MTx. Isto é devido a que a forma L-MTx (particularmente o sal de diidrobrometo, PCT/GB2007/001103) tem mais do dobro da solubilidade de MTC, e seria esperado que evitasse a tiazina redutase corante (May et ai., 2004) que é assumida como existindo no estômago e é assumida como sendo necessária para a absorção. Com base nestas assunções, a fração prevista de dose absorvida, calculada a partir dos dados proporcionados por parte do modelo é mostrada na Figura 33. Especificamente, as perdas dos compartimentos pré-centrais totais equivalem a 4% da dose administrada para o caso de 100 mg. Desta perda total, 43% é devida à não absorção por parte de Cl. Isto é aplicado através de doses para estimar a biodisponibilidade esperada de L-MTx administrado permitindo perda devido ao metabolismo de primeira passagem subsequente.

Após ter ocorrido a absorção para o compartimento central, a eficácia prevista pode ser determinada a partir das relações descritas acima ligando o nível de estado constante em C3 ou C2 com o tamanho do efeito observado. Estes são mostrados para C3 na Figura 34.

As relações correspondentes entre a eficácia clínica esperada de uma forma à base de L-MTx da fração de metiltionínio e o nível de estado constante médio previsto de MT em C2 (sangue) para uma gama de regimes de dosagem desde 1/dia até 3/dia são mostradas na Figura 35.

Como pode ser observado a partir das Figuras 34 e 35, é previsto que poderia ser alcançado um nível de eficácia de -8,1 unidades de ADAS-cog num regime de dose de 100 mg da forma L-MTx administrada duas vezes diariamente que pode ser também alcançado através de dose com 60 mg 3 vezes por dia. Seriam esperados níveis de eficácia ainda maiores utilizando 100 mg ou mais administrados 3 vezes por dia. É como tal inferido que podem ser alcançados uma eficácia mais elevada e um regime de dose superior utilizando a forma L-MTx da fração de metiltionínio. Segurança e tolerabilidade da forma L-MTx da fração de metiltionínio

Conforme discutido acima na seção Relação entre Atividade Cognitiva e Hematológica, uma limitação significativa do grau ao qual podem ser administradas doses mais elevadas de MTC para alcançar melhor eficácia é devida às consequências combinadas do aumento dos efeitos secundários hematológicos e da pobre tolerabilidade devido a diarreia. Embora seja provável que a forma L-MTx reduzisse substancialmente a diarreia, não está claro quais seriam os efeitos hematológicos esperados.

Conforme mostrado na Figura 9 e Quadro 4 na seção Relação entre Atividade Cognitiva e Hematológica, é esperado que a forma L-MTx tenha menores efeitos secundários hematológicos com base nos estudos de ratos discutidos acima. Além disso, conforme discutido acima na seção Correlação entre efeitos secundários hematológicos observados e previstos com base no modelo farmacocinético humano oral integrado, é pouco provável que os efeitos hematológicos sejam inerentes à própria fração MT, no intervalo de dosagem requerido para a atividade anti-demência. A doses orais mais elevadas, mostradas por exemplo no estudo de ratos acima, é claro que seriam observados efeitos hematológicos adversos, mas é pouco provável que estas doses fossem alcançadas na utilização clínica de formas à base de MTC de um produto medicinal.

Dada a relação dose-resposta observada no estudo de ratos discutido acima na seção Relação entre Atividade Cognitiva e Hematológica, o efeito esperado na contagem de glóbulos vermelhos totais pode ser calculado, conforme mostrado na Figura 36. Como pode ser observado, é esperado que os efeitos secundários hematológicos conforme indexado através do declínio da contagem de glóbulos vermelhos sejam negligenciáveis.

Factibilidade da formulação de libertação retardada da forma L-MTx da fração de metiltionínio

Enquanto, devido às razões discutidas acima, não seria fatível gerar uma formulação de libertação retardada de um produto medicinal à base de MTC, este não seria o caso para uma forme à base de L-MTx da fração de metiltionínio. Isto deve-se a que a forma leuco do metiltionínio não pode formar dimeros. Isto é devido a não ser uma molécula "plana" (ao contrário de Ox-MT) , e não tem carga o que permite a estabilização da forma dimérica através de neutralização da carga.

Como tal, é provável que uma formulação de libertação retardada da forma à base de L-MTx da fração de metiltionínio fosse fatível sem encontrar as consequências adversas da absorção retardada. Isto poderia ser criado numa forma de dosagem de toma única diária.

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Exemplo 9 - Síntese química de compostos de DAPTZ de forma reduzida cristalina estável A seguinte divulgação corresponde geralmente à do pedido anteriormente depositado, não publicado, PCT/GB2007/001103 (incorporado especificamente para referência) mas é incluída no presente documento unicamente para completude.

Por exemplo, uma fenotiazina adequada pode ser transformada na correspondente 3,7-dinitrofenotiazina, por exemplo, utilizando nitrito de sódio com ácido acético e clorofórmio. O grupo amino do anel pode então ser protegido, por exemplo, como o acetato, por exemplo, utilizando anidrido acético e piridina. Os grupos nitro podem então ser reduzidos a grupos amino, por exemplo, utilizando cloreto de estanho (II) com etanol. Os grupos amino podem então ser substituídos, por exemplo, dissubstituídos, por exemplo, dissubstituídos com metilo, por exemplo, utilizando iodeto de metilo, hidróxido de sódio, DMSO, e brometo de tetra-n-butilamónio. O grupo amino pode então ser desprotegido, por exemplo, o grupo N-acetilo pode ser removido, por exemplo, utilizando ácido clorídrico aquoso. É então preparado o sal correspondente, por exemplo, utilizando ácido hidroclórico aquoso, por exemplo, ao mesmo tempo que a desproteção. Um exemplo de um tal método é ilustrado no seguinte esquema.

Assim, outro aspeto da invenção refere-se a um método de preparar um composto de 3,7-diamino-10H-fenotiazina da seguinte fórmula, para utilização nos métodos de tratamento descritos acima:

em que R1, R9, R3NA, R3NB, R7NA , R7NB, HX1 e HX2 são conforme definidos no presente documento (por exemplo, onde HX1 e HX2 são cada um HC1), compreendendo a etapa de: (vi) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de: (v) desproteção de grupos amino do anel (DP); e (vi) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de: (iv) substituição de aminas (AS), (v) desproteção de grupos amino do anel (DP) opcional, e (vi) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de (iii) redução de grupos nitro (NR), (iv) substituição de aminas (AS), (v) desproteção de grupos amino do anel (DP), e (vi) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de (ii) proteção de grupos amino do anel (AP) opcional, (iii) redução de grupos nitro (NR) , (iv) substituição de aminas (AS), (v) desproteção de grupos amino do anel (DP), e (vi) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de (i) nitração (NO), (ii) proteção de grupos amino do anel (AP), (iii) redução de grupos nitro (NR), (iv) substituição de aminas (AS), (v) desproteção de grupos amino do anel (DP), e (vi) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, as etapas são realizadas na ordem listada (isto é, qualquer etapa na lista é realizada ao mesmo tempo que, ou subsequentemente à etapa precedente na lista).

Numa forma de realização, a etapa de (v) desproteção de grupos amino do anel (DP) e a etapa de (vi) formação de sais (SF) são realizadas simultaneamente (isto é, como uma etapa).

Numa forma de realização, a etapa de nitração (NO) é: (i) nitração (NO), em que uma 10H-fenotiazina é transformada numa 3,7-dinitro-10H-fenotiazina, por exemplo:

Numa forma de realização, a nitração é levada a cabo utilizando um nitrito, por exemplo, nitrito de sódio, por exemplo, nitrito de sódio com ácido acético e clorofórmio. Numa forma de realização, R10 é -H.

Numa forma de realização, a etapa de proteção de grupos amino do anel (AP) é: (ii) proteção de grupos amino do anel (AP) , em que o grupo amino (-NH-) do anel de uma 3,7-dinitro-l0H-fenotiazina é transformado num grupo amino do anel protegido (-NRprot) , por exemplo:

Numa forma de realização, a proteção do grupo amino do anel é alcançada como um acetato, por exemplo, utilizando anidrido acético, por exemplo, utilizando anidrido acético e piridina.

Numa forma de realização, a etapa de redução de grupos nitro (NR) é: (iii) redução de grupos nitro (NR) , em que cada um dos grupos nitro (-NO2) de uma 3,7-dinitro-10H-fenotiazina protegida é transformado num grupo amino (-NH2) , por exemplo:

Numa forma de realização, a redução de grupos nitro pode ser levada a cabo utilizando, por exemplo, cloreto de estanho (II), por exemplo, cloreto de estanho (II) com etanol.

Numa forma de realização, a etapa de substituição de aminas (AS) é: (iv) substituição de aminas (AS) , em que cada um dos grupos amino (-NH2) de uma 3,7-diamino-10H-fenotiazina protegida é transformado num grupo amino dissubstituído, por exemplo:

Numa forma de realização, a substituição de aminas é levada a cabo utilizando um haleto de alquilo, por exemplo, um iodeto de alquilo, por exemplo, iodeto de metilo, por exemplo, iodeto de metilo com hidróxido de sódio, DMSO, e brometo de tetra-n-butilamónio.

Numa forma de realização, a etapa de desproteção de grupos amino do anel (DP) é: (v) desproteção de grupos amino do anel (DP) , em que o grupo protetor, RProt, é removido, por exemplo:

Numa forma de realização, a desproteção de grupos amino pode ser levada a cabo utilizando ácido, por exemplo, ácido clorídrico, por exemplo, ácido hidroclórico aquoso concentrado.

Numa forma de realização, a etapa é: (vi) formação de sais (SF), em que o sal correspondente é formado, por exemplo:

Numa forma de realização, a formação de sais pode ser levada a cabo utilizando ácido, por exemplo, ácido clorídrico, por exemplo, ácido clorídrico aquoso concentrado.

Numa forma de realização, as etapas de desproteção de grupos amino do anel e de formação de sais são levadas a cabo simultaneamente (isto é, como uma etapa), por exemplo, o composto (1) é formado a partir do composto (1) numa etapa.

Noutra abordagem, um cloreto de tionínio adequado (por exemplo, cloreto de metiltionínio, MTC) é transformado no haleto correspondente, por exemplo, através de reação com iodeto de potássio, por exemplo, iodeto de potássio aquoso. 0 iodeto de tionínio resultante é então reduzido, por exemplo, com iodeto de etilo e etanol, e o correspondente sal é formado. Um método semelhante é descrito em Drew, H.D.K, e Head, F.S.H., "Derivatives of Methylene-blue," Journal of the Chemical Society, 1933, pp. 248-253. Um exemplo de um tal método é ilustrado no seguinte esquema.

Como tal, outro aspeto da invenção refere-se a um método de preparar um composto de DAPTZ da seguinte fórmula, para utilização nos métodos de tratamento descritos acima:

em que R1 R9, R3NA, R3NB, R7NA, R7NB, HX1 e HX2 são conforme definidos no presente documento (por exemplo, onde HX1 e HX2 são cada um Hl), compreendendo a etapa de: (ii) redução e formação de sais de iodeto (RISF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de: (i) permuta de iodeto (IE); e (ii) redução e formação de sais de iodeto (RISF).

Numa forma de realização, as etapas são realizadas na ordem listada (isto é, qualquer etapa na lista é realizada ao mesmo tempo que, ou subsequentemente à etapa precedente na lista).

Numa forma de realização, a etapa de permuta de iodeto (IE) é: (i) permuta de iodeto (IE), em que um sal de 3,7-di(amino dissubstituído)-tionínio é transformado no iodeto de 3,7-di(amino dissubstituído)-tionínio correspondente, por exemplo (onde Y é um contra-ião aniónico, por exemplo, haleto, por exemplo, cloreto ou brometo):

Numa forma de realização, a permuta de iodeto (IE) é alcançada através de reação com iodeto de potássio, por exemplo, iodeto de potássio aquoso.

Numa forma de realização, a etapa de redução e formação de sais de iodeto (RISF). é: (ii) redução e formação de sais de iodeto (RISF) , em que um iodeto de 3,7-di(amino dissubstituído)-tionínio é reduzido e transformado no composto de iodeto de 3,7-diamino-10H-fenotiazina correspondente, por exemplo:

Numa forma de realização, a redução e formação de sais de iodeto (RISF) é alcançada através de reação com iodeto de etilo, por exemplo, iodeto de etilo e etanol.

Numa forma de realização, um sal de tionínio adequado, por exemplo, cloreto de semi zinco de tionínio de etilo, é simultaneamente reduzido e o grupo amino do anel é protegido, por exemplo, através de reação com fenilidrazina, etanol, anidrido acético, e piridina. Pode então ser preparado o sal correspondente, por exemplo, utilizando ácido hidroclórico aquoso, por exemplo, ao mesmo tempo que a desproteção. Um exemplo de um tal método é ilustrado no seguinte esquema.

Assim, outro aspeto da invenção refere-se a um método de preparar um composto de 3,7-diamino-10H-fenotiazina (DAPTZ) da seguinte fórmula:

em que R1, R9, R3NA, R3NB, R7NA, R7NB, HX1 e HX2 são conforme definidos no presente documento (por exemplo, onde HX1 e HX2 são cada um Hl), compreendendo a etapa de: compreendendo a etapa de: (iv) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de (iii) desproteção de grupos amino do anel (DP), e (iv) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de (ii) proteção de grupos amino do anel (AP), (iii) desproteção de grupos amino do anel (DP), e (iv) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, o método compreende as etapas de (i) redução (RED) (ii) proteção de grupos amino do anel (AP), (iii) desproteção de grupos amino do anel (DP), e (iv) formação de sais (SF).

Numa forma de realização, as etapas são realizadas na ordem listada (isto é, qualquer etapa na lista é realizada ao mesmo tempo que, ou subsequentemente à etapa precedente na lista).

Numa forma de realização, a etapa de (i) redução (RED) e a etapa de (ii) proteção de grupos amino do anel (AP) são levadas a cabo simultaneamente (isto é, como uma etapa).

Por exemplo, numa forma de realização, a etapa combinada de redução (RED) e de proteção de grupos amino do anel (AP) é: (i) redução (RED) e roteção de grupos amino do anel (AP), em que um sal de 3,7-di(amino dissubstituído)-tionínio é reduzido para dar a 3,7-di(amino dissubstituído)-10H-fenotiazina correspondente, e o grupo amino (-NH-) do anel da 3,7-di(amino dissubstituído)-1OH-fenotiazina é transformado num grupo amino do anel protegido (-Rprot) para dar a 3,7-di(amino dissubstituído)-10H-fenotiazina protegida correspondente, por exemplo:

Numa forma de realização, Y representa Cl-.

Numa forma de realização, a etapa combinada de redução (RED) e de proteção de grupos amino do anel (AP) é alcançada utilizando fenilidrazina e ácido acético, por exemplo, fenilidrazina, etanol, anidrido acético, e piridina.

Numa forma de realização, a etapa de (iii) desproteção de grupos amino do anel (DP) e a etapa de (iv) formação de sais (SF) são realizadas simultaneamente (isto é, como uma etapa).

Por exemplo, numa forma de realização, a etapa combinada de desproteção de grupos amino do anel (DP) e formação de sais (SF) é: (ii) desproteção de grupos amino do anel (DP) e formação de sais (SF), em que o grupo protetor de uma 3,7-di(amino dissubstituído)-10H-fenotiazina protegida é removido para dar uma 3,7-di(amino dissubstituído)-10H-fenotiazina, e o sal correspondente é formado, por exemplo:

Numa forma de realização, a etapa combinada de desproteção de grupos amino do anel (DP) e formação de sais (SF) pode ser levada a cabo utilizando ácido, por exemplo, ácido clorídrico, por exemplo, ácido clorídrico aquoso concentrado.

Numa abordagem semelhante, um cloreto de tionínio adequado (por exemplo, cloreto de metiltionínio, cloreto de etiltionínio) é primeiro reduzido e acetilado para dar a 1-(3,7-bis-dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona, por exemplo, através de reação com hidrazina (NH2NH2) , metilidrazina (MeNHNH2) , ou boroidreto de sódio (NaBH4) ; e anidrido acético ( (H3CCO)20) ; por exemplo, na presença de uma base adequada, por exemplo, piridina (C5H5N) ou base de Hunig (diisopropiletilamina, C8Hi9N), por exemplo, num solvente adequado, por exemplo, etanol ou acetonitrilo. 0 composto reduzido e acetilado é então desprotegido (através da remoção do grupo acetilo), por exemplo, através de reação com um ácido hálico, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido bromídrico, num solvente adequado, por exemplo, etanol, e opcionalmente com a adição de um éter adequado, por exemplo, éter dietílico.

Exemplos específicos são conforme segue: Síntese Química Síntese 1 3-Nitro-10H-fenotiazina

Nitrito de sódio (20,00g, 210 mmol) foi adicionado a uma mistura de 10H-fenotiazina (20,00 g, 50 mmol), clorofórmio (100 cm3), e ácido acético (20 cm3), E a mistura foi agitada durante 1 hora a temperatura ambiente. Foi então adicionado ácido acético (20 cm3) e a mistura foi agitada durante 18 horas adicionais. A suspensão foi filtrada e lavada com ácido acético, etanol, água, e finalmente etanol para dar um sólido roxo/castanho. o resíduo foi dissolvido em DMF quente e foi permitido que arrefecesse antes de filtrar o composto di-nitro como um sólido roxo. A concentração da solução de DMF e a lavagem do precipitado com água e metanol deram o composto mono-nitro do título (15 g, rendimento de 50%) como um sólido castanho; vmax (KBr) /cm-1: 3328 (NH) , 3278 (NH) , 3229 (NH) , 3119 (CH) , 3049 (CH) , 1557 (NOz) , 1531 (NCZ) : õH (250 MHz; DMSO) : 6,64 (5H, m, ArH) , 7,68 (1H, d, J 2,5, ArH) , 7,79- 7,84 (1H, dd, J 2,75, 6,5, Ar H) ; 5C (62,9 MHz; DMSO): 113,3 (ArC) , 115,3 (ArC) , 116,9 (ArC) , 121,8 (ArC) , 123,6 (ArC) , 123,7 (ArC), 124,6 (ArC), 126,4 (ArC), 128,1 (ArC), 138,8 (ArC), 141,0 (ArC), 147,8 (ArC). Síntese 2 3,ll-Dinitro-10H-fenotiazina

O procedimento para a síntese de 3-nitro-10H- fenotiazina foi seguido utilizando 3-nitro-10H-fenotiazina (10,00g 41 mmol), clorofórmio (40 cm3), ácido acético (2 x 10 cm3), e nitrito de sódio (11,86 g, 173 mmol). O resíduo obtido foi recristalizado a partir de DMF para proporcionar o composto di-nitro do título (6,60 g 56%) como agulhas roxas; vmax (KBr)/cm-1: 3331 (NH) , 3294 (NH) , 3229 (NH) , 3101 (CH) , 3067 (CH) , 1602 (NOz) , 1558 (NOz) ; δΗ (250 MHz; DMSO): 6,73-6,76 (2H, d, J 9, Ar H) , 7,78 (2H, s, Ar H) , 7, 89-7,85 (2H, d, J 9, ArH) . Síntese 3 1- (3,7-Dinitro-fenotiazin-10-il)-etanona

Uma solução de 3,ll-dinitro-10H-fenotiazina (3,00 g 10,37 mmol), anidrido acético (15,88 g, 155,50 mmol), e piridina (30 cm3) foi agitada a refluxo durante 18 horas. A solução quente foi então cuidadosamente depositada sobre água gelada. Foi formado um precipitado e foi filtrado, dissolvido em diclorometano, seco sobre sulfato de magnésio, filtrado, e concentrado para dar um sólido castanho/laranja, que foi purificado através de cromatografia de coluna (Si02. acetato de etilo : éter de petróleo, 2:3, carregado como uma solução de diclorometano) para dar o composto do título (2,46g, 71%) como um sólido amarelo claro que pode ser recristalizado a partir de acetona para dar agulhas amarelas claras; vmax(KBr) /cm-1: 3091 (CH) , 3063 (CH) , 1680 (C=0), 1575 (N02) , 1510 (NOz) ; õH (250 MHz; CDC13) : 2,28 (3H, s, CH3) , 7, 65-7, 69 (2H, d, J 9,

ArH) , 8,22-8,26 (2H, dd, J 2,75, 8,75, Arfí) , 8,33-8,32 (2H, d, J 2,5, ArH) ; õc (62,9 MHz; CDC13) : 168,2 (C=0), 146,3 (ArC), 143,3 (ArC), 133,6 (ArC), 127,8 (ArC), 123,4 (ArC), 122,9 (ArC), 23,1 (CH3) ; m/z (ES) 331,0 (80%, [M]+). Síntese 4 1- (3,7-Dinitro-fenotiazin-10-il)-etanona

Uma mistura de 1-(3,7-dinitro-fenotiazin-10-il)- etanona (2g, 6,04 mmol), diidrato de cloreto de estanho (II) (14,17g, 62,8 mmol), e etanol (50 cm3) foi aquecida a refluxo e agitada a esta temperatura durante 5 horas. A mistura foi então arrefecida até à temperatura ambiente e depositada sobre água gelada. O pH foi ajustado a 7 com hidrogenocarbonato de sódio a 5% anteriormente à extração do produto com acetato de etilo (3 x 50 cm3). Os extratos foram lavados com salmoura e secos sobre sulfato de magnésio, filtrados, e concentrados para dar o composto do título (1,64 g, 100%) como um sólido azul arroxeado; vmax (KBr) /cm-1: 3445 (NH) , 3424 (NH) , 3368 (NH) , 3322 (NH) . 3203 (NH) , 3054 (CH) , 2995 (CH) , 1706 (C=0) , 1650 (N02) , 1590 (N02) ; õH (250 MHz; CDC13) : 2,01 (3H, s, CH3) , 5,09- 5,43 (4H, s 1, H; 6,47-6,51 (2H, dd, J 1,5, 8,25, ArH) , 6,61 (2H, s, ArH) , 7,11-7,15 (2H, d. J 8, ArH) ; õc (62,9 MHz; CDC13) : 169,1 (C=0) , 147,2 (ArC) , 128,1 (ArC) , 127,6 (ArC) , 127,3 (ArC), 112,3 (ArC), 111,5 (ArC), 22,6 (CH3) ; m/z (ES) 293, 9 (95%, [M + H, Na]+), 272, 0 (20%, [M + H]+), 227, 9 (100%, [M + H, - Ac]+) . Síntese 5 3,7-Diaminofenotiazina bis (cloreto de hidrogénio) (B4)

Uma mistura de 1-(3,7-dinitro-fenotiazin-10-il)-etanona (0,25 g, 0,921 mmol) foi dissolvida em ácido clorídrico aquoso (5 N, 10 cm3) e a reação foi aquecida a refluxo e agitada durante 30 minutos. A concentração da mistura de reação deu o composto do título como um sólido azul claro. õH (250 MHz; D20) : 6, 60 (2H, d 1, ArH), 7,07 (4H, s 1, ArH) . Síntese 6 1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona (0,25 g 0,92 mmol) foi dissolvida em DMSO (3 cm3) . Foram adicionados tolueno (10 cm3), iodometano (l,96g, 13,8 mmol), brometo de tetrabutilamónio (50 mg), e finalmente solução de hidróxido de sódio aquoso (50%, 1,25 cm3) A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. Foram então adicionados hidróxido de sódio aquoso (50%, 1,25 cm3) e iodometano (1,96 g, 13,8 mmol) adicionais. A mistura foi deixada a agitar durante 3 horas adicionais à temperatura ambiente anteriormente a ser adicionadas uma terceira aliquota de hidróxido de sódio aquoso (50%, 1.25 cm3) e iodometano (1,96 g, 13,8 mmol) e a mistura ser agitada durante 18 horas adicionais. A suspensão espessa foi lavada com água (3 x 75 cm3) e o extrato de tolueno foi colhido. A água foi extraída com diclorometano (3 x 50 cm3) e os extratos foram combinados com o tolueno, e secos sobre sulfato de magnésio, filtrados, e concentrados para dar um sólido roxo escuro. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna (SÍO2, acetato de etilo : éter de petróleo, 2:3, carregado como uma solução de diclorometano) para dar o composto do título (0,12 g, 40%) como um sólido roxo claro; vmax (KBr) /cm-1: 2910 (CH) , 2876 (CH) , 2856 (CH) , 2799 (CH) , 1659 (C=0), 1596 (N02) , 1502 (N02) } õH (250 MHz; CDCI3) : 2,16 (3H, s, CH3) , 2,93 (12H, s, NCH3) , 6,59-6,62 (2H, d, J 8,5, ArH) , 6,69-6,71 (2H, d, J 2,75, ArH) , 7,08- 7,47 (2H, s 1, ArH) ; õc (62,9MHz; CDC13) : 170,3 (C=0), 148,9 (ArC) . 127,2 (ArC) , 127,1 (ArC) . 127,0 (ArC) , 110,9 (ArC) , 110,7 (ArC), 40,7 (NCH3) , 22,9 (CH3). Síntese 7 Ν,Ν,Ν' , Ν'-Tetrametil-10H-fenotiazina-3,7-diamina bis (cloreto de hidrogénio) (B3)

1-(3,7-Bis-dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona (0,5 g, 1,84 mmol) foi dissolvida em ácido clorídrico aquoso (5 Ν, 15 cm3) e a solução foi aquecida a temperatura de refluxo e agitada durante 30 minutos. A concentração da mistura de reação deu o composto do título como um sólido azul/verde; õH (250MHz; D20) : 3,18 (12H, s, NCi73) , 6,67 (2H, d, J 8,5, Arfí) , 7,16 (4H, s 1, ArH) ; õc (62,9 MHz; D20) : 144,3 (ArC) , 138,9 (ArC) , 122,4 (ArC) , 120,8 (ArC) , 120,7 (ArC) , 117,6 (ArC), 48,9 (NCH3) . Síntese 8

Iodeto de metiltionínio

A um balão de fundo redondo foi adicionado cloreto de metiltionínio (MTC, Azul de Metileno) (2 g, 6,25 mmol) e água (50 cm3) e a mistura foi agitada durante 10 minutos ou até o sólido ser dissolvido. Foi então adicionado iodeto de potássio (1,56 g, 9,4 mmol) à mistura e foi formada uma suspensão de cor negra verdosa. A reação foi aquecida até à ebulição e foi deixada arrefecer naturalmente dando o composto do título (2,03 g, 79%) como agulhas de cor verde viva. Anál. Calcda para Ci6Hi8N3SI: C, 46,72; H, 4,41; N, 10,22; S, 7,80; I, 30,85. Encontrado: C, 46,30; H, 4,21; N, 10,14; S, 7,86; I, 29,34. Síntese 9 Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetrametil-10H-fenotiazina-3,7-diamina bis(iodeto de hidrogénio) (B6)

A um balão de fundo redondo foi adicionado iodeto de metiltioninio (2g, 4,86 mmol), etanol (100 cm3) e iodeto de etilo (75,8 g, 486 mmol) e a mistura foi aquecida a refluxo durante 18 horas onde a cor mudou de verde/azul a castanho com um precipitado amarelo. Depois de arrefecida até à temperatura ambiente, a mistura foi filtrada e lavada com éter dietilico (20 cm3) para dar o composto do titulo (l,99g, 76%) como um sólido verde-claro. δΗ (250 MHz; D20) : 3,20 (12H, s, NCH3) , 6,76 (2H, d, J 8,5, ArH) , 7,22 (2H, s 1, ArH) } õc (62,9 MHz; D20) : 145, 0 (ArC) , 139,3 (ArC) , 122,6 (ArC) . 121,1 (ArC), 120,9 (ArC). 117,9 (ArC), 48,9 (NCH3) . Síntese 10 1- (3,7-Bis dietilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

A um balão de fundo redondo de 25cm3 seco foi adicionado foi adicionado cloreto de zinco de etiltioninio (0,5 g, 1,13 mmol) e etanol (10 cm3) . Foi então adicionada fenilidrazina (0,134 g, 1,24 mmol) gota a gota sob uma atmosfera de azoto. A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 1 hora e foi concentrada sob alto vácuo. Foram adicionados piridina (50 cm3) e ácido acético e a mistura foi agitada durante 18 horas a 60 °C. A solução foi aberta a gelo/água (250 cm3) e os orgânicos foram extraídos em acetato de etilo (3 x 50 cm3) . Os extratos foram lavados com solução de sulfato de cobre saturada e secos sobre sulfato de magnésio, filtrados, e concentrados para dar o produto bruto como um óleo castanho, que foi purificado utilizando cromatografia de coluna flash com um eluente de acetato de etilo a 40%: essência de petróleo a 60% 40-60 °C e sílica a 40-63 μ 60 Á para dar o composto do título (0,18g, 41%) como um sólido vítreo verde. δΗ (250 MHz; CDC13) : 7,0-7,5 (2H, s 1, ArH) , 6,64 (2H, s, ArH) , 6,52 (2H, d, ArH), 3,35 (8H, q, 7, NCH2) , 2,18 (3H, s, CH3) , 1,16 (12H, t, 7, CH3) ; óc (62,9 MHz; CDC13) : 12,5 (CH3) , 22,9 (CH3) , 44,6 (NCH2) , 110,1 (ArC) , 127,4 (ArC) , 146,5 (ArC), 170,2 (C=0). Síntese 11 N,N,Ν',Ν'-Tetraetil-10H-fenotiazina-3,7-diamina bis(cloreto de hidrogénio)

A um balão de fundo redondo de 25 cm3 foi adicionada 3,7-dietilamino-10-acetil-fenotiazina (0,125 g, 0,33 mmol) e ácido clorídrico aquoso (5 M, 5 cm3) . A mistura foi aquecida a 100 °C durante 2 horas anteriormente ao arrefecimento à temperatura ambiente e foi concentrada para dar o composto do título (0,llg, 81%) como um sólido vítreo verde amarelado. õH (250 MHz; CD3OD) 7,07 (4H, d 1, ArH), 6,65 (2H, d 1, ArH), 3,35 (8H, d 1, NCH2) , 0,97 (12H, d 1, CH3) ; õc (62,9 MHz; CD3OD) : 10,8 (CH3) , 55,1 (NCH2) , 116,6 (ArC), 120,4 (ArC), 121,5 (ArC), 123,6 (ArC), 132,6 (ArC), 144,5 (ArC). Síntese 12 1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

Síntese utilizando metilidrazina/piridina em dois potes. A um balão de fundo redondo de 250 cm3 colocado sob uma atmosfera de árgon foi adicionado triidrato de cloreto de metiltionínio (26,74 mmol, 10 g), etanol (100 cm3) e metilidrazina (58,83 mmol, 2,71 g) . A mistura foi aquecida até 40 °C e agitada durante 2 horas. A suspensão amarela/verde foi arrefecida até 5 °C e filtrada sob árgon, lavada com etanol (20 cm3) e seca para dar leuco-azul de metileno como um sólido verde-claro. Ao produto leuco foi adicionado anidrido acético (40 cm3) e piridina (10 cm3) e a solução foi aquecida a 100 °C durante 18 horas. A mistura arrefecida foi então depositada cuidadosamente sobre água gelada enquanto agitando para dar um precipitado, que foi filtrado, lavado com água, e seco a 60 °C durante 2 horas para proporcionar o composto do título (5,82g, 66%) como um sólido castanho claro. Pf 137°C; vmax (KBr) /citT1 2910 (CH) , 2876 (CH) , 2856 (CH) f 2799 (CH) f 1659 (C=0), 1596 (NOz) , 1502 (NOz); δΗ (250MHz; CDC13) 2,16 (3H, s, CH3) , 2,93 (12H, s, NCH3) , 6,59-6, 62 (2H, d, J 8,5, Arfí) , 6,69-6,71 (2H, d, J 2,75, ArH) , 7, 08-7,47 (2H, s 1, Arfí) ; õc (62,9MHz; CDC13) 170,3 (C=0), 148,9 (ArC) , 127,2 (ArC) , 127,1 (ArC) , 127,0 (ArC) . 110,9 (ArC). 110,7 (ArC), 40,7 (NCH3) , 22,9 (CH3); m/z (ES) 284,2 (100%, [M - OAc]+), 328,1 (15%, [M + H]+), 350,1 (41%, [M + Na] +) , Síntese 13 1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

Síntese utilizando metilidrazina/base de Hunig num pote. A uma câmara de reação de 5000 cm3 sob uma atmosfera de azoto foi adicionado triidrato de cloreto de metiltionínio (0,54 mol, 200 g) e acetonitrilo (1000 cm3) . Foi adicionada metilidrazina (1,07 mol, 49,36 g) gota a gota a 1,5 ml por minuto. A temperatura da mistura aumentou até 32 °C e foi agitada durante 20 minutos. À suspensão amarela/verde foi adicionado anidrido acético (5,35 mol, 541 g) e posteriormente base de Hunig (diisopropiletilamina) (1,55 mol, 200 g) . A mistura foi aquecida a 90 °C durante 2 horas. A mistura arrefecida foi então depositada cuidadosamente em água gelada (2000 cm3 em dez porções de 200 cm3 enquanto agitando para dar um precipitado. O precipitado foi agitado durante 45 minutos antes de ser filtrado, lavado com água (3 x 250 cm3) . e seco ao ar durante 30 minutos. O material bruto foi cristalizado a partir de etanol quente (2750 cm3) para proporcionar o composto do titulo (112,1 g, 64%) como um sólido cinzento claro. Pf 137 °C; vmax(KBr) /cm-1 2910 (CA), 2876 (CH) , 2856

(CH) , 2799 (CH) , 1659 (C=0) . 1596 (NOz) , 1502 (NOz) ; õH (2 5 0MHz; CDC13) 2,16 (3H, s, CH3) , 2,93 (12H, s, NC A3) , 6,59-6, 62 (2H, d, J 8,5, ArH) , 6,69-6,71 (2H, d, J 2,75,

ArA), 7, 08-7,47 (2H, s 1, ArA) ; õc (62,9MHz; CDC13) 170,3 (C=0) , 148,9 (ArC) , 127,2 (ArC) , 127,1 (ArC) . 127,0 (ArC) , 110,9 (ArC). 110,7 (ArC), 40,7 (NCH3) , 22,9 (CH3), m/z (ES) 284,2 (100%, [M - OAc ]+ ) , 328,1 (15%, [M + H]+), 350,1 (41%, [M + Na]+) . Síntese 14 1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

Síntese utilizando metilidrazina/piridina num pote. A um balão de fundo redondo de 250 cm3 sob uma atmosfera de azoto foi adicionado triidrato de cloreto de metiltionínio (26,74 mmol, 10 g) e acetonitrilo (50 cm3) . Foi adicionada metilidrazina (53,5 mol, 2,46 g) em quatro porções iguais sobre um período de tempo de 30 minutos. A temperatura da mistura foi mantida a 35 °C com um banho de água fria e foi agitada durante 30 minutos. À suspensão amarela/verde foi adicionado anidrido acético (267 mmol, 27,3 g) e piridina (80,2 mmol, 6,35 g). A mistura foi aquecida a 90 °C durante 2 horas. A mistura arrefecida foi então depositada cuidadosamente em água gelada (200 cm3 em dez porções iguais enquanto agitando para dar um precipitado. O precipitado foi agitado durante 30 minutos antes de ser filtrado, lavado com água (3 x 50 cm3) .e seco ao ar durante 30 minutos. O material bruto foi cristalizado a partir de etanol quente (120 cm3) para proporcionar o composto do título (5,97 g, 68%) como um sólido cinzento claro. Pf 137 °C; vmax (KBr) / citT1 2910 (CH) , 2876 (CH) , 2856 (CH) , 2799 (CH) , 1659 (C=0) , 1596 (N02) , 1502 (N02) ; õH (250MHz; CDC13) 2,16 (3H, s, CH3) , 2,93 (12H, s, NCH3) , 6,59-6, 62 (2H, d, J 8,5, ArH) , 6,69-6,71 (2H, d, J 2,75, ArH) , 7, 08-7,47 (2H, s 1, ArA) ; õc (62,9MHz; CDC13) 170,3 (C=0), 148,9 (ArC) , 127,2 (ArC). 127,1 (ArC). 127,0 (ArC). 110,9 (ArC), 110,7 (ArC), 40,7 (NCH3), 22,9 (CH3); m/z (ES) 284,2 (100%, [M -OAc ]+ ) , 328,1 (15%, [M + H]+), 350,1 (41%, [M + Na]+). Síntese 15 1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

Síntese utilizando boroidreto de sódio/piridina num pote. A um balão de fundo redondo de 500 cm3 sob uma atmosfera de azoto foi adicionado triidrato de cloreto de metiltionínio (0,134 mol, 50 g) e acetonitrilo (250 cm3) . Foi adicionado boroidreto de sódio (0,174 mol, 6,6 g) em quatro porções iguais sobre um período de tempo de 30 minutos. A temperatura da mistura foi mantida a 35 °C com um banho de água fria e foi agitada durante 30 minutos. À suspensão amarela/verde foi adicionado anidrido acético (0,535 mol, 55 g) e piridina (0,174 mol, 13,76 g) . A mistura foi aquecida a 90 °C durante 2 horas. A mistura arrefecida foi então depositada cuidadosamente em água gelada (250 cm3 em dez porções iguais enquanto agitando para dar um precipitado. O precipitado foi agitado durante 30 minutos antes de ser filtrado, lavado com água (3 x 50 cm3), e seco ao ar durante 30 minutos. O material bruto foi cristalizado a partir de etanol quente (500 cm3) para proporcionar o composto do título (26,7 g, 61%) como um sólido cinzento claro. Pf 137 °C; vmax(KBr) /cm-1 2910 (CA), 2876 (CA) , 2856 (CH) , 2799 (CH) , 1659 (C=0), 1596 (NOz) , 1502 (NOz); δΗ (250MHz; CDC13) 2,16 (3H, s, CA3) , 2,93 (12H, s, NCA3) , 6,59-6, 62 (2H, d, J 8,5, ArA). 6,69-6,71 (2H, d, J 2,75, ArA) , 7, 08-7,47 (2H, s 1, ArA) ; õc (62,9MHz; CDC13) 170.3 (C=0), 148,9 (ArC) , 127,2 (ArC) , 127,1 (ArC) , 127,0 (ArC) , 110,9 (ArC), 110,7 (ArC). 40,7 (NCH3) , 22,9 (CH3); m/z (ES) 284,2 (100%, [M - OAc]+), 328,1 (15%, [M + H]+), 350,1 (41%, [M + Na]+) . Síntese 16 1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

Síntese utilizando boroidreto de sódio/base de Hunig num pote. A um balão de fundo redondo de 500 cm3 sob uma atmosfera de azoto foi adicionado triidrato de cloreto de metiltionínio (80,2 mmol, 30 g) e acetonitrilo (150 cm3). Foi adicionado boroidreto de sódio (104 mmol, 3,94 g) em quatro porções iguais sobre um período de tempo de 30 minutos. A temperatura da mistura foi mantida a 35 °C com um banho de água fria e foi agitada durante 30 minutos. À suspensão amarela/verde foi adicionado anidrido acético (321 mmol, 32,75 g) e base de Hunig (diisopropiletilamina) (120 mmol, 15,55 g). A mistura foi aquecida a 90 °C durante 2 horas. A mistura arrefecida foi então depositada cuidadosamente em água gelada (200 cm3 em dez porções iguais enquanto agitando para dar um precipitado. O precipitado foi agitado durante 30 minutos antes de ser filtrado, lavado com água (3 x 50 cm3) , e seco ao ar durante 30 minutos. O material bruto foi cristalizado a partir de etanol quente (300 cm3) para proporcionar o composto do titulo (13,55g, 52%) como um sólido cinzento claro. Pf 137°C; vmax (KBr) /cm-1 2910 (CH) . 2876 (CH) , 2856

(CH) , 2799 (CH) , 1659 (C=0), 1596 (NOz) , 1502 (NOz) ; õH (2 5 0MHz; CDC13) 2,16 (3H, s, C H3) , 2,93 (12H, s, NC H3) , 6,59-6, 62 (2H, d, J 8,5, ArH) , 6,69-6,71 (2H, d, J 2,75,

ArH) . 7, 08-7,47 (2H, s 1, ArH) ; 5C (62,9MHz; CDC13) 170,3 (C=0) , 148,9 (ArC) , 127,2 (ArC) , 127,1 (ArC) , 127,0 (ArC) , 110,9 (ArC), 110,7 (ArC), 40,7 (NCH3) , 22,9 (CH3) ; m/z (ES) 284,2 (100%, [M - OAc ]+ ) , 328,1 (15%, [M + H]+), 350,1 (41%, [M + Na]+) . Síntese 17 1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

Síntese utilizando monoidrato de hidrazina/piridina num pote. A um balão de fundo redondo de 250 cm3 sob uma atmosfera de azoto foi adicionado triidrato de cloreto de metiltionínio (26,74 mmol, 10 g) e acetonitrilo (50 cm3) . Foi adicionado monoidrato de hidrazina (58,8 mol, 2,95 g) e a mistura foi aquecida a refluxo e agitada durante 10 minutos anteriormente ao arrefecimento até 25 °C. À suspensão amarela/verde foi adicionado anidrido acético (424 mmol, 43,3 g) e piridina (124 mmol, 9,78 g). A mistura foi aquecida a 90 °C durante 2 horas. A mistura arrefecida foi então depositada cuidadosamente em água gelada (100 cm3 em dez porções iguais enquanto agitando para dar um precipitado. O precipitado foi agitado durante 30 minutos antes de ser filtrado, lavado com água (3 x 50 cm3) , e seco ao ar durante 30 minutos. O material bruto foi cristalizado a partir de etanol quente (100 cm3) para proporcionar o composto do título (4,87 g, 56%) como um sólido cinzento claro. Pf 137°C; vmax (KBr) /cm-1 2910 (CH) , 2876 (CH) , 2856 (CH) , 2799 (CH) , 1659 (C=0), 1596 (N02) , 1502 (N02) ; δΗ (2 5 0MHz; CDC13) 2,16 (3H, s, CH3) , 2,93 (12H, s, N CH3) , 6,59-6, 62 (2H, d, J 8,5, ArH) , 6,69-6,71 (2H, d, J 2,75,

ArH) , 7, 08-7,47 (2H, s 1, ArH) ; 5C (62,9MHz; CDC13) 170,3 (C=0) , 148,9 (ArC) , 127,2 (ArC) , 127,1 (ArC) , 127,0 (ArC) , 110,9 (ArC), 110,7 (ArC), 40,7 (NCH3) , 22,9 (CH3); m/z (ES) 284,2 (100%, [M - OAc ]+ ) , 328,1 (15%, [M + H]+), 350,1 (41%, [M + Na]+) . Síntese 18 1- (3,7-Bis dimetilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

Síntese utilizando monoidrato de hidrazina/base de Hunig num pote. A um balão de fundo redondo de 250 cm3 sob uma atmosfera de azoto foi adicionado triidrato de cloreto de metiltionínio (80,2 mmol, 30 g) e acetonitrilo (150 cm3) . Foi adicionado monoidrato de hidrazina (176,5 mmol, 8,84 g) e a mistura foi aquecida a refluxo e agitada durante 10 minutos anteriormente ao arrefecimento até 25 °C. À suspensão amarela/verde foi adicionado anidrido acético (794 mmol, 81,2 g) e base de Hunig (diisopropiletilamina) (232 mmol, 29, 97 g) . A mistura foi aquecida a 90 °C durante 2 horas. A mistura arrefecida foi então depositada cuidadosamente em água gelada (400 cm3 em dez porções iguais enquanto agitando para dar um precipitado. O precipitado foi agitado durante 30 minutos antes de ser filtrado, lavado com água (3 x 100 cm3) , e seco ao ar durante 30 minutos. O material bruto foi cristalizado a partir de etanol quente (400 cm3) para proporcionar o composto do título (17,15g, 65%) como um sólido cinzento claro. Pf 137 °C; vmax (KBr) /cm1 2910 (CH) , 2876 (CH) , 2856 (CH) f 2799 (CH) f 1659 (C=0), 1596 (N02) , 1502 (N02) ; õH (2 5 0MHz; CDC13) 2,16 (3H, s, CH3) , 2,93 (12H, s, NCH3) , 6,59-6, 62 (2H, d, J 8,5, ArH) , 6,69-6,71 (2H, d, J 2,75, ArH) , 7, 08-7,47 (2H, s 1, ArA) ; õc (62,9MHz; CDC13) 170,3 (C=0), 148,9 (ArC) , 127,2 (ArC) . 127,1 (ArC) , 127,0 (ArC) , 110,9 (ArC), 110,7 (ArC), 40,7 (NCH3) , 22,9 (CH3); m/z (ES) 284,2 (100%, [M - OAc]+), 328,1 (15%, [M + H]+), 350,1 (41%, [M + Na]+) . Síntese 19 3,ll-Dinitro-10H-fenotiazina

A lOH-fenotiazina (20,00 g, 100 mmol), diclorometano (100 cm3) e ácido acético (40 cm3) foi adicionado nitrito de sódio (20,07 g, 300 mmol) e a mistura foi agitada durante 10 minutos à temperatura ambiente. Foram posteriormente adicionados ácido acético (40 cm3) , diclorometano (100 cm3) e nitrito de sódio (20,07 g, 300 mmol) adicionais. Foram adicionados 120 cm3 de ácido acético adicional para tentar separar a mistura espessa da reação. A mistura foi agitada durante 3 horas. A suspensão foi filtrada e lavada com 100 cm3 cada de etanol, água, e finalmente etanol para dar um sólido roxo/castanho. O resíduo foi dissolvido em DMF quente e foi deixado arrefecer antes de filtrar o produto di-nitro, que foi lavado com etanol (150 cm3) e seco para dar o composto do título (24,88 g, 86%) como um sólido castanho; vmax (KBr) / cm“ 1 3331 (NH) , 3294 (NH) , 3229 (NH) , 3101 (CH) , 3067 (CH) , 1602 (N02) , 1558 (N02) ; õH (250MHz; DMSO) 6,73-6,76 (2H, d, J 9, ArH) , 7,78 (2H, s, ArH) , 7, 89-7,85 (2H, d, J 9, ArH) . Síntese 20 1- (3,7-Bis dietilamino-fenotiazin-10-il)-etanona

A um balão de fundo redondo de 250 cm3 sob uma atmosfera de azoto foi adicionado monohidrato de nitrato de etiltionínio (7,13 mmol, 3 g) e acetonitrilo (20 cm3) . Foi adicionado monoidrato de hidrazina (16,4 mmol, 0,82 g) e a mistura foi aquecida a refluxo e agitada durante 10 minutos anteriormente ao arrefecimento até 25 °C. À solução

castanha foi adicionado anidrido acético (114 mmol, 11,65 g) e base de Hunig (diisopropiletilamina) (21,4 mmol, 2,77 g). A mistura foi aquecida a 90 °C durante 2 horas. A mistura arrefecida foi então depositada cuidadosamente em água gelada (40 cm3 em dez porções iguais enquanto agitando para dar um precipitado. 0 precipitado foi agitado durante 30 minutos antes de ser filtrado, lavado com água (3 x 25 cm3) .e seco ao ar durante 30 minutos. O material bruto foi cristalizado a partir de etanol quente (50 cm3) para proporcionar o composto do titulo (1,73 g, 63%) como um sólido cinzento claro. õH (250 MHz; CDC13) 7,0-7,5 (2H, ls, ArH), 6,64 (2H, s, ArH), 6,52 (2H, d, ArH), 3,35 (8H, q, 7, NCH2) , 2,18 (3H, s, CH3) , 1,16 (12H, t, 7, CH3) ; õc (62,9 MHz; CDC13) 12,5 (CH3) , 22,9 (CH3) , 44,6 (NCH2) , 110,1 (ArC), 127,4 (ArC), 146,5 (ArC), 170,2 (C=0). Síntese 21 N,N,Ν',Ν'-Tetraetil-10H-fenotiazina-3,7-diamina bis(cloreto de hidrogénio)

A um balão de fundo redondo foi adicionada l-(3,7-bis-dietilamino-fenotiazin-10-il) etanona (0,5 g, 1,30 mmol), etanol (5 cm3), e ácido clorídrico (37%, 1,3 cm3) e a reação foi aquecida até 80 °C durante 1 hora. Depois de arrefecida até à temperatura ambiente, a mistura foi concentrada dando o composto do título (0,54 g, 100%) como um vidro verde-claro. δΗ (250 MHz; CD3OD) 7,07 (4H, 1,

ArH), 6,65 (2H, 1, ArH), 3,35 (8H, 1, NCH2) , 0,97 (12H, 1, CH3) ; õc (62,9 MHz; CD3OD) 10,8 (CH3) , 55,1 (NCH2) , 116,6 (ArC), 120,4 (ArC), 121,5 (ArC), 123,6 (ArC), 132,6 (ArC), 144,5 (ArC). Síntese 22 Ν,Ν,Ν' , Ν'-Tetraetil-10H-fenotiazina-3,7-diamina bis(brometo de hidrogénio)

A um balão de fundo redondo foi adicionada l-(3,7-bis-dietilamino-fenotiazin-10-il) etanona (0,5 g, 1,30 mmol), etanol (5 cm3), e ácido bromidrico (48%, 0,75 cm3) e a reação foi aquecida até 80 °C durante 1 hora. Depois de arrefecida até à temperatura ambiente, a mistura foi concentrada dando o composto do titulo (0,65g, 100%) como um vidro amarelo claro. õH (250 MHz; D20) 7,05 (4H, 1,

ArH) , 6,79 (2H, 1 d, ArH) , 3,43 (8H, 1, NCH2) , 1,05 (12H, 1 t, CH3) ; 5C (62,9 MHz; D20) 12,3 (CH3) , 56,2 (NCH2) , 117,9 (ArC), 121,4 (ArC), 122,4 (ArC), 124,5 (ArC), 133,5 (ArC), 145,1 (ArC). Síntese 23 Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetrametil-10H-fenotiazina-3,7-diamina bis (cloreto de hidrogénio)

A um balão de fundo redondo foi adicionada l-(3,7-bis-dimetilamino-fenotiazin-10-il) etanona (1 g, 3,05 mmol), etanol (10 cm3), e ácido clorídrico (37%, 3 cm3) e a reação foi aquecida até 80 °C durante 1 hora. Depois de arrefecida até à temperatura ambiente, foi adicionado éter dietílico enquanto agitando até ser obtida uma solução turva constante. Após algum tempo, foi formado um precipitado, que foi filtrado e lavado com éter dietílico (10 cm3) dando o composto do título (0,98 g, 90%) como um sólido verde-claro. Pf (dec) 230 °C; vmax (KBr)/citT1 3500-3229 (NH) , 3061 (CH) , 3021 (CH) , 2948 (CH) , 2879 (CH) , 2679 (CH), 2601 (CH) , 1604 (CH) , 1483 (CH) , 1318 (CH) } δΗ (250MHz; D20) 3,18 (12H, s, NCH3) , 6,67 (2H, d, J 8,5, ArH) , 7,16 (4H, s 1, ArH); 5C (62,9MHz; D20) 144,3 (ArC) , 138,9 (ArC) , 122,4 (ArC) , 120,8 (ArC). 120,7 (ArC), 117,6 (ArC), 48,9 (NCH3) ; m/z (ES) 286, 1 (100%, [M - H, 2C1]+), 285, 1 (40%), 284,1 (41%) , [M - 3H, 2C1 ] +) . Síntese 24 N,N,Ν' , Ν'-Tetrametil-10H-fenotiazina-3,7-diamina bis (brometo de hidrocrénio)

A um balão de fundo redondo foi adicionada l-(3,7-bis-dimetilamino-fenotiazin-10-il) etanona (1 g, 3,05 mmol), etanol (10 cm3), e ácido bromidrico (48%, 4 cm3) e a reação foi aquecida até 80 °C durante 1 hora. Depois de arrefecida até à temperatura ambiente, foi formado um precipitado, que foi filtrado e lavado com éter dietilico (10 cm3) dando o produto (1,22 g, 89%) como um sólido de cor mostarda claro. Pf (dec) 230 °C; vmax (KBr) /citT1 3500-3229 (NH) , 3061 (CH), 3021 (CH), 2948 (CH) , 2879 (CH) , 2679 (CH) , 2601 (CH) , 1604 (CH), 1483 (CH), 1318 (CH) ; δΗ (250MHz; D20) 3,18 (12H, s, NCH3) , 6,66 (2H, d, J 8,75, ArH) , 7,15 (4H, s, Ar Η) ; δ0 (62, 9MHz; D20) 144,3 (ArC), 138,9 (ArC), 122,4 (ArC), 120,8 (ArC), 120,7 (ArC), 117,6 (ArC). 48,9 (NCH3) . Síntese 25 N,N,Ν',Ν'-Tetraetil-10H-fenotiazina-3,7-diamina bis(brometo de hidrogénio)

A um balão de fundo redondo foi adicionada l-(3,7-bis- dietilamino-fenotiazin-10-il) etanona (1,0 g, 2,60 mmol), metanol (10 cm3), e ácido bromidrico (48%, 2,94 cm3) e a reação foi aquecida até 80 °C durante 1 hora. Após arrefecimento até 5 °C, foi adicionado à mistura éter dietilico, dando uma solução turva. A solução foi agitada durante 30 minutos e deu o composto do titulo (0,83 g, 63%) como um sólido amarelo claro. õH (250 MHz; D20) 7,05 (4H, 1, ArH) , 6,79 (2H, 1 d, ArH) , 3,43 (8H, 1, NCH2) , 1,05 (12H, 1 t, CH3) ; óc (62,9 MHz; D20) 12,3 (CH3) , 56,2 (NCH2) , 117,9 (ArC), 121,4 (ArC), 122,4 (ArC), 124,5 (ArC), 133,5 (ArC) , 145, 1 (ArC) .

Exemplo 10 - Outros distúrbios cognitivos ou do SNC

Os métodos de tratamento, profilaxia, diagnóstico ou prognóstico da presente invenção, utilizando compostos de DAPTZ na forma oxidada ou reduzida, podem em qualquer aspeto ser aplicados a qualquer uma ou mais das seguintes doenças.

Referências para o Exemplo 10

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Exemplo 11 - Teste de dissolução padrão

Titulo: Dissolução com Fluido Intestinal Simulado para cápsulas contendo DAPTZ

Realizado por: Encap Drug Delivery, Unidades 4, 5 e 6, Oakbank Park Way, Livingston, West Lothian, EH53 OTH, Escócia, Reino Unido. 1. Finalidade

Este método é adeguado para utilização como um Método de Teste de Dissolução para a finalidade de proporcionar dados para a determinação da % de dissolução ai longo do tempo de DAPTZ contendo unidades de dosagem em Fluido Intestinal Simulado (SIF), conforme descrito na USP (http://www.usp.org) como medio de dissolução. 0 método é exemplificado com cápsulas de MTC de 30 mg, 60 mg e 100 mg formuladas em Gelucire 44/14 e emprega o Aparelho de Dissolução 2 da USP <711> padrão (pá e peso de imersão). Onde relevante abaixo, o MTC pode ser substituído por um composto de DAPTZ alternativo na carga apropriada.

2. CONDIÇÕES DO MÉTODO 2.1. Reagentes Água - grau laboratorial ou eguivalente Dihidrogenortofosfato de Potássio - grau laboratorial ou equivalente

Hidróxido de Sódio - grau laboratorial ou equivalente Pancreatina - grau USP Ácido Clorídrico - grau laboratorial ou equivalente 2.2. Segurança

Os reagentes são possivelmente irritantes e possivelmente nocivos. 2.3. Condições de Dissolução

Aparelho de Dissolução

Aparelho de Dissolução 2 da USP <711> (pá e peso de imersão)

Amostra - 1 cápsula colocada num peso de imersão Velocidade de rotação - 75 rpm Temperatura - 37 °C +/- 0,5 °C

Meio de Dissolução - 1000 ml de Fluido Intestinal Simulado Tempos de Amostragem - 15, 30, 45, 60 minutos

Duração do teste - 60 minutos

Tamanho da amostra - 5 ml (não substituídos) (Não filtrar)

Condições do Espetrofotómetro UV

Comprimento de onda de determinação - 665 nm

Referência - Diluir SIF

Comprimento do Trajeto - 10 mm

Largura de Banda - 2,0 nm 2.4. Preparação de Fluido Intestinal Simulado (SIF)

Por cada litro requerido, dissolver 6,8 g de diidrogenoortofosfato de potássio em 250 ml de água, misturar e adicionar 77 ml de hidróxido de sódio a 0,2 N e 500 ml de água. Adicionar 10,Og de mistura de pancreatina, USP, e ajustar a solução resultante com ou hidróxido de sódio a 0,2 N ou ácido clorídrico a 0,2 N até um pH de 6,8 +/- 0,1. Diluir com água até 1000 ml. Esta solução deve ser preparada fresca cada dia. 2.5. Soluções Padrão (preparar por duplicado)

Pesar com precisão aproximadamente 100 mg de MTC num balão volumétrico de 1000 ml. Dissolver em 80 ml de etanol e água a 50/50 com sonicação de 15 minutos e posteriormente completar o volume com etanol/água a 50/50 e misturar bem (1000 pg/ml) . Transferir 5,0 ml desta solução a um balão volumétrico de 100 ml e completar o volume deste balão com SIF e misturar bem (50 pg/ml). Transferir 4,0ml desta solução a um balão volumétrico de 100 ml e completar o volume deste balão com água e misturar bem (2,0 pg/ml). Esta é a solução padrão. 2.6. Procedimento de Dissolução

Adicionar 1000 ml de Fluido Intestinal Simulado a cada uma de seis câmaras de dissolução. Inserir as pás à velocidade de rotação correta e deixar equilibrar até 37 °C +/- 0,5 °C. Colocar seis cápsulas individuais em pesos de imersão de aço inoxidável e adicionar um a cada câmara anotando o tempo. A cada um dos tempos especificados extrair uma amostra de 5 ml. 2.7 Preparação de Referência de Fundo

Transferir 2,0 ml de SIF a um balão volumétrico de 100 ml e completar o volume com água e misturar bem. Esta solução está destinada a ser utilizada como a referência de fundo no espetrofotómetro UV. 2.8 Preparação de Amostras

Para as cápsulas de 30 mg transferir 3, 0 ml desta solução a um balão volumétrico de 50 ml e completar o volume com água e misturar bem (1,8 yg/ml).

Para as cápsulas de 60mg transferir 3,0 ml desta solução a um balão volumétrico de 100 ml e completar o volume com água e misturar bem (1,8 pg/ml).

Para as cápsulas de lOOmg transferir 1 ml desta solução a um balão volumétrico de 50 ml e completar o volume com água e misturar bem (2,0 pg/ml) . Estas são as soluções de amostra. 2.9. Procedimento

Determinar as soluções padrão e de amostra num espetrofotómetro UV que foi ligado e deixado aquecer até à temperatura de operação. 2.10 Verificação Padrão

Verificar os fatores de resposta médios de duas soluções padrão. O Padrão 2 deve ser verificado como 98 -102% do Padrão 1. 2.11 Cálculos

Realizar todos os cálculos com duas casas decimais Determinar a % de libertação de MTC de cada amostra relativamente ao padrão de referência utilizando a equação adequada: % libertação para a cápsula de 100 mg = Asam/Astd x Wstd/(100 mg) x P x 100 % libertação para a cápsula de 30 mg = Asam/Astd x Ws!d/{60 mg} x 2/3 x P x 100 % libertação para a cápsula de 60 mg = Asam/Astd x Wâíd/{3Q mg) x 1/3 x P x 100

Asam é a absorvância de MTC para a amostra individual a 665 nm

Astd é a absorvância média de MTC dois padrões a 665 nm Wstd é a massa média dos dois padrões utilizados (mg) P é a pureza do padrão de referência utilizado, como um decimal (por exemplo 0,999)

Onde o material de entrada é utilizado como um padrão é aplicado um fator de correção de 1 para P)

Representar a % de libertação de MTC frente ao tempo de dissolução num gráfico onde as câmaras individuais são representadas por separado.

Representar a % média de libertação de MTC, ao longo das seis câmaras, frente ao tempo de dissolução num gráfico.

Assim geralmente pode ser utilizada a seguinte equação. % libertação para a cápsula de x mg - Asam/Astd x Wstd/(x) x d x P x 100

Será apreciado por parte dos peritos na especialidade que "d" é a correção, se requerida, para a diluição na preparação da amostra como na etapa 2.8 acima. 2.12 Teste padrão para o Fluido Gástrico Simulado (SGF)

Este teste padrão é realizado conforme descrito acima mas utilizando SGF em vez de SIF. SGF é preparado de acordo com a USP29 conforme segue:

Dissolver em Fluido Gástrico, Simulado, TS 2,0 g de cloreto de sódio e 3,2 g de pepsina purificada, que é derivada a partir de mucosa estomacal suína, com uma atividade de 80 a 2500 unidades por miligrama de proteína, em 7,0 ml de ácido clorídrico e água suficiente para completar 1000 ml. [A atividade da pepsina é descrita nas especificações do Código dos Produtos Químicos Alimentícios sob Testes Gerais e Ensaios]. Esta solução de teste tem pH de cerca de 1,2.

Exemplo 12 - Modelos quantitativos para a progressão e tratamento da Doença de Alzheimer O processo químico subjacente à Doença de Alzheimer é a agregação e truncagem de proteínas tau. Neste Exemplo, são utilizados modelos cinéticos da via de reação de tau de forma a descrever a progressão da doença e o efeito do tratamento, e para comparar a eficácia de tratamentos que visam diferentes partes da via. I. Formular um modelo de equilíbrio A Figura 37A mostra a ligação de uma proteína tau a um agregado de proteínas tau truncadas, seguida da truncagem da proteína tau para formar um agregado maior. Dentro da célula esta reação está incorporada numa via mais longa, com vias para a criação de novas proteínas tau e para a eliminação de agregados. A Figura 37B mostra um modelo natural. Aqui, S denota a quantidade de proteína tau solúvel, e a quantidade de tau truncada agregada. De forma a produzir um modelo cinético, é necessário especificar taxas. É sabido que a taxa de agregação de tau aumenta tanto com a disponibilidade de S e a disponibilidade de A [Wischik, CM., Edwards, P.C., Lai, R.Y.K., Roth, M. e Harrington, C.R. (1996) Selective inhibition of Alzheimer disease-like tau aggregation by phenothi-azines. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 93, 11213-11218]. É natural assumir que existe um mecanismo de retorno envolvido na criação de S, e como tal que a taxa de produção de S depende da quantidade de S [Lai, R.Y.K., Gertz, H.-J., Wischik, D.J., Xuereb, J. H., Mukaetova-Ladinska, E.B., Harrington, C.R., Edwards, P.C., Mena, R., Paykel, E.S., Brayne, C, Huppert, F.A., Roth, M. e Wischik, CM. (1995) Examination of phosphorylated tau protein as a PHF-precursor at early stage Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging 16, 433- 445.]. Para as outras vias mostradas, será feita a assunção cinética padrão de que a taxa de uma reação é proporcional à quantidade de reagente.

Isto proporciona o modelo cinético mostrado na Figura 37C. Através desta figura pretende-se dizer, por exemplo, que se S(t) é a quantidade de proteína tau solúvel no tempo t então

Escalas temporais de progressão da doença e da cinética

Um aspeto crucial deste modelo é a escala temporal sobre a qual progride a Doença de Alzheimer, e a sua relação com a escala temporal sobre a qual operam equações como a equação 1 . É defendido que a dinâmica das equações cinéticas ocorre ao longo de horas ou dias, e que a progressão da doença é devida à alteração lenta de parâmetros como kA0 sobre a escala temporal de anos. Foi adotada uma posição contrária em Wischik et al. (1995), nomeadamente que a escala temporal da cinética é medida em anos, e que a progressão da doença reflete o aumento gradual de A(t) conforme modelado por parte da cinética.

Existem dois elementos de evidência para a separação das escalas temporais. Em primeiro lugar, experiências in vitro [documento WO96/30766], nas quais é incubada tau solúvel com tau truncada em fase sólida, mostram que a maior parte de tau solúvel ligou em questão de horas. 0 segundo elemento provém de experiências in vivo em ratinhos transgénicos que expressam proteína tau truncada humana [documento WO 02/059150]. Estes ratinhos desenvolvem lentamente patologia de tau de doença de Alzheimer sobre períodos de meses, conforme medido tanto através de testes cognitivos como através de examinação neuropatológica [Zabke, C., Dietze, S., Stamer, K., Rickard, J.E.,

Harrington, C.R., Theuring, F., Seng, K.M. e Wischik, C.W. (2008) Early and advanced stages of tau aggregation In transgenic mouse models. International Conference on

Alzheimer's Disease, Chicago, 26-31 de julho de 2008, Pl-054] . Quando tratada com doses orais diárias de MTC sobre um período de 17 dias, a patologia de doença de Alzheimer foi reduzida [Harrington, C., Rickard, J.E., Horsley, D., Harrington, K.A., Hindley, K.P., Riedel, G., Theuring, F.,

Seng, K.M. e Wischik, C.M. (2008) Methylthioninium chloride (MTC) acts as a tau aggregation inhibitor (TAI) in a cellular model and reverses tau pathology in transgenic mice models of Alzheimer's disease. International Conference on Alzheimer's Disease, Chicago, 26 a 31 de julho de 2008, 06-01-04] . Como tal a escala temporal da cinética é na ordem de dias, enquanto a escala temporal da progressão da doença e muito mais longa, medida em meses para estes ratinhos. A técnica matemática deve como tal ser a seguinte: é suposto que qualquer paciente tem constantes de velocidade que dependem de há quanto tempo o paciente padece da doença, ou seja kA0(a) etc. em que a é o número de anos desde o início; e é suposto que os níveis resultantes de S e A são os valores de equilíbrio do sistema dinâmico. Concretamente, é necessário resolver equações como esta forma modificada da equação 1:

Foi omitido t, já que não são de interesse as dinâmicas do sistema mas somente o comportamento do equilíbrio. Será algumas vezes escrito S(a) etc. para enfatizar a dependência dos valores das constantes de velocidade.

Representação da criação de novos agregados A reação de agregação (Figura 37A) tem início com uma molécula de agregado e termina com uma molécula de agregado, de forma a descrever o crescimento dos agregados existentes e não a criação de novos agregados. Igualmente no sistema cinético (Figura 37C) , se não é modelada a criação de agregados então o agrupamento de A diminuirá de forma constante, significando que a solução de equilíbrio é Ã=0 . A forma mais simples de representar a criação de novos agregados é alterando a estequiometria da reação de agregação. Especificamente, será assumido o esquema mostrado na Figura 37D (embora os valores reais de rj e n2 sejam desconhecidos).

Por exemplo, se rq=2,3 e n2=l,87 então a partir de 230 moléculas de tau e 100 moléculas de agregado são produzidas 87 novas moléculas de agregado.

Resumo do modelo

Foi proposto o sistema dinâmico mostrado na Figura 37E.

As equações para o estado de equilíbrio deste sistema são:

No resto deste Exemplo serão descritas várias experiências que permitem quantificar as constantes de velocidade e de tal forma permitir o efeito do tratamento. 2. Quantificação da progressão da doença

Lai et al. (1995) estudaram uma série de pacientes de

Alzheimer post-mortem e encontraram uma relação entre A e S:

em que a=2450 and β=0,3459.

Mukaetova-Ladinska et al. (Mukaetova-Ladinska, E.B., Garcia-Siera, F., Hurt, J., Gertz, H.J., Xuereb, J.H., Hills, R., Brayne, C., Huppert, F.A., Paykel, E.S., McGee, M., Jakes, R., Honer, W.G., Harrington, C.R. e Wischik, C.M. (2000) Staging of cytoskeletal and β-amyloid changes in human isocortex reveals biphasic synaptic protein response during progression of Alzheimer's disease. American Journal of Pathology 157, 623-636) estudaram uma série de pacientes de Alzheimer pre- e post-mortem, e encontraram uma relação entre os níveis de PHF e o estádio de Braak do paciente B:

onde γ=4,8383 e 5=9,8156. É razoável assumir que os níveis de PHF são proporcionais aos níveis de agregados de tau:

embora ε seja desconhecido.

Ohm et al. [Ohm, T.G., Muller, H., Braak, H. e Bohl, J. (1995) Close-meshed prevalence rates of different stages as a tool to uncover the rate of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neuroscience 64, 209-217] estudaram a distribuição dos estádios de Braak numa população, e no apêndice é descrito como a partir destes dados pode ser obtida uma relação entre o estádio de Braak médio Be o tempo a desde o início da demência, em anos:

Utilizando estas três relações, podem ser reescritas as reações de equilíbrio 3-4 para obter:

3. Quantificação do efeito de um fármaco O documento WO 02/055720 descreve um modelo celular para a doença de Alzheimer, e medidas demonstrando o efeito de MTC nos níveis de A. As células foram geneticamente modificadas para produzir tau solúvel S a uma taxa constante. Por si só, não forma agregados espontaneamente, e como tal as células foram adicionalmente modificadas para produzir tau truncada T a uma taxa constante. É assumido que as células têm um mecanismo normal para a destruição de Γ, e que o efeito do fármaco é a abertura de uma via através da qual A é dissolvido e se transforma em Γ. Para simplicidade, é assumido que aqui S é utilizado somente na via de Alzheimer. Como tal é mostrado o modelo cinético na

Figura 37F.

Foi escrita kAT(d) para enfatizar que esta constante de velocidade depende do nível da dose d, e será assumido que kAT(0)=0. Deve ser escrito estritamente kA0 (aCéiuia) , em que âcéiuia é o tempo em anos desde o início da doença para estas células, embora seja omitido nas equações.

As equações de equilíbrio para este sistema são:

Utilizando as equações 11 e 12, podem ser eliminados S e T da equação 12 para obter:

Escrevendo A(0) para o nível de referência de tau agregada, na ausência de qualquer fármaco, então:

Estas duas equações são convenientemente simplificadas, e indicam que:

(Foi escrito aqui A(d) para enfatizar que o nível de agregados A observado é uma função da dose d). 0 documento WO 02/055720 relata que:

onde ζ=-1,0665, η=51,735 e 9=1,3328. 4. Quantificação do efeito combinado

Pode agora ser perguntado: como seria esperado que o fármaco altere a progressão da doença? O modelo cinético é agora o mostrado na Figura 37G, com as equações de equilíbrio:

É desejado resolver estas equações para A=A{a,d). Para tal, é mais conveniente utilizar a equação 16 para expressar T em termos de A:

e para então substituir em 17 para encontrar uma expressão para S=S (a, d)

e para finalmente utilizar as equações 15 e 9 para transformá-la numa expressão para A(a,d)

A expressão para S(a,d) pode de forma mais útil ser escrita como uma relação envolvendo S(a0,0) em que a0 é o tempo desde o início da doença ao qual o tratamento foi iniciado. Deve também ser substituído nas expressões obtidas parakA0{a) e kAT{d) , para dar:

A fórmula para g(d) é dada acima na equação 14, a fórmula para f é dada na equação 8, e a fórmula para kA0(a) é dada na equação 9.

Interpretação do resultado.

Se se permite que d=0, a

equação 19 dá: À medida que a aumenta, a via através da qual os agregados são eliminados degenera-se, e kA0(a) diminui em direção a 0; como tal S(a, 0) diminui em direção a 0 e, de acordo com a equação 18, A aumenta até ao infinito. Ao tratar com o fármaco a alguma dose fixa, é prevenido que S diminua por debaixo de um determinado limiar:

o que significa que é prevenido que A aumente por cima de um determinado limiar ^1(Siimiar) . Em palavras, este tratamento não atrasa meramente a progressão da doença, interrompe-a. 5. Um modelo de tratamento alternativo

Foi sugerido que a doença de Alzheimer pode ser tratada inter alia através da inibição da reação de ligação tau-tau (Wischik, C.M., Edwards, P.C., Lai, R.Y.K., Roth, M. e Harrington, C.R. (1996) Selective inhibition of Alzheimer diseaselike tau aggregation by phenothiazines. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 93, 11213-11218) . Que efeito teria isto na progressão da doença? Considere-se o modelo cinético mostrado na Figura 37H em que k (d) é o valor da constante de velocidade, após ter sido inibida a reação através deste suposto fármaco à dose d. As equações de equilíbrio são:

Resolvendo estas equações, e substituindo na equação 8, é obtido: S(a,d)/S(a0.0) = [kM(a)lkAO{a0)] / [/c(d)//c<0>] A(a,d) = f '\S{a,d)) I [k{d)lk(0)\

Pode ser observado que o nível de S(a,d) diminui até 0 à medida que o tempo aumenta, para qualquer dose fixa d. Como tal o nível de A aumenta até ao infinito. Em palavras, um tratamento com base puramente na inibição da reação de ligação tau-tau atrasaria a progressão da doença, mas não a deteria. 6. Resultados numéricos A Figura 371 ilustra estes resultados numericamente. 0 gráfico da esquerda mostra o efeito de um fármaco que cria uma nova via A^T, conforme descrito na seção 3; o gráfico da esquerda mostra o efeito de um fármaco que inibe a via S+A->A, conforme descrito na seção Erro! Fonte de referência não encontrada. Em vez de representar o nível de agregados de tau Λ, foi represntado MMSE, utilizando a relação entre MMSE e o estádio de Braak B derivado a partir dos dados em Ohm et al. (1995). MMSE = σ(τ-Β)/(ρ-β) em que ct=56,2204, t=6,5969 e p=ll,599, em conjunto com as relações nas equações 6 e 7, e definindo s = l. Isto foi representado como uma função do número de anos desde o inicio do tratamento, para um paciente que iniciou o tratamento a MMSE=15. A linha tracejada mostra a deterioração de MMSE sem qualquer tratamento; as restantes linhas mostram o efeito do tratamento a vários níveis de dose. Os níveis de dose ilustrados aqui são (para o gráfico da esquerda) d= 25, 50 e 90; e (para o gráfico da direita) k(d)/k(0)=45%, 20%, 7%. 7. Implicações para a eliminação de agregados de tau na progressão da doença

Estes valores (Figura 371) ilustram o que já foi explicado de forma algebraica, nomeadamente que a inibição da ligação tau-tau somente pode atrasar a progressão da doença, enquanto pode ser interrompida através da abertura de uma nova via para a dissolução de agregados. Isto pode ser ilustrado esquematicamente na Figura 39. A agregação de tau pode ser prevenida afetando dois sítios: primeiramente inibindo a entrada de tau no ciclo de agregação e em segundo lugar potenciando a eliminação de agregados a partir do ciclo de agregação (Figura 39) . O nível de tau agregada ou filamentos helicoidais emparelhados progressa de forma constante com o avanço da idade. Se a entrada de tau é prevenida, então o nível de PHFs diminuirá até um determinado nível, previsto através do estádio de Braak, após o qual a taxa de progressão continuará como anteriormente. Somente quando é potenciada a eliminação de tau agregada começarão os níveis de tau a diminuir ao longo do tempo (Figura 39) . Em tais circunstâncias, pode ser afirmado que um fármaco tendo um tal efeito é modificador da doença. Foi discutido por Wischik et al. (Wischik, CM., Lai, R.Y.K. e Harrington, C.R. (1997) Modelling prion-like processing of tau protein in Alzheimer's disease for pharmaceutical development. Em Microtubule-Associated Proteins: Modifications in Disease. (Eds. J. Avila, R. Brandt, e K. S. Kosik) Harwood Academic Publishers, Amesterdão, 185-241) que a agregação de tau pode ser fomentada por proteínas surgindo a partir do volume mitocondrial relacionado com a idade (por exemplo proteínas nucleares 2 do complexo III, porinas e subunidades 9 da ATP sintetase). Estes agregados de tau podem ou reunir-se em PHFs e/ou entrar na via de eliminação endossómica-lisossómica, contribuindo para a congestão desta via com o avanço da idade (Figura 40) . Eliminação potenciada de agregados de tau a partir desta via que diminuirá a carga metabólica no neurónio. Este Exemplo demonstra como isto poderia deter a progressão da doença, em vez de simplesmente atrasar a sua progressão.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9630766 A [0002] [0003] [0051] [0500] • WO 02075318 A [0004] [0241] • WO 2005030676 A [0004] [0241] • WO 02055720 A [0006] [0007] [0514] [0521] • GB 2007001103 W [0010] [0012] [0043] [0166] [0286] [0362] [0363] [0374] • US 60945006 B [0055] • GB 2007001105 W [0057] • US 6207197 B [0068] • US 5972389 A [0068] • WO 96030766 A [0267] • WO 02059150 A [0500]

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Lisboa, 7 de Setembro de 2015

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de 3,7-diaminofenotiazina (DAPTZ) numa forma reduzida cristalina estável para utilização num método de tratamento ou profilaxia de um distúrbio cognitivo ou do SNC num paciente, em que o dito distúrbio é um que é suscetível a tratamento através do dito composto de DAPTZ, cujo método compreende administrar por via oral ao dito paciente uma unidade de dosagem contendo o dito composto de DAPTZ como ingrediente ativo, em que o paciente é um que foi avaliado como sofrendo de um distúrbio hematológico, os efeitos de cujo distúrbio hematológico podem de outra forma ser exacerbados por parte do composto de DAPTZ.
2. 2. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado na reivindicação 1 em que a unidade de dosagem é uma formulação de libertação retardada do composto de DAPTZ reduzido a entre 100-1000 mg.
3. 3. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado na reivindicação 2 em que a formulação de libertação retardada liberta menos de <50% em 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, ou 8 horas.
4. 4. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 3 em que a formulação de libertação retardada compreende não mais de 5% em peso de composto de DAPTZ oxidado.
5. 5. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 4 em que o distúrbio cognitivo ou do SNC é uma taupatia.
6. 6. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado em qualquer das reivindicações anteriores em que o distúrbio cognitivo ou do SNC é selecionado a partir de: (i) doença de Alzheimer, doença de Pick, Paralisia Supranuclear Progressiva (PSP), demência fronto-temporal, demência fronto-temporal com parkinsonismo ligado ao cromossoma 17, complexo de desinibição-demência-parkinsonismo-amiotrofia, degeneração pallido-ponto-nigral, síndrome de Guam-ALS; degeneração pallido-nigro-louisiana, degeneração cortico-basal, ou (ii) é deficiência cognitiva leve, ou (iii) é uma sinucleinopatia, que é opcionalmente Doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, parkinsonismo induzido por fármacos, ou falência autonômica pura (PAF).
7. 7. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 6 em que o paciente é um que se sabe sofrer de uma hemoglobinopatia que é opcionalmente anemia falciforme, talassemia, meta-hemoglobinemia; uma anemia que é opcionalmente uma anemia hemolítica; uma malignidade hematológica que é opcionalmente linfoma, mieloma, plasmacitoma ou leucemia, uma coagulopatia que é opcionalmente hemofilia.
8. 8. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado na reivindicação 7 em que o paciente tem mais de 70 anos de idade e está submetido a uma condição anémica relacionada com a idade que é opcionalmente displasia mieloide.
9. 9. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 8 em que o dito composto de DAPTZ é selecionado a partir de compostos da seguinte fórmula e sais, solvatos, e hidratos farmaceuticamente aceitáveis da mesma:

   em que: cada de R1 e R9 é independentemente selecionado a partir de: -H, alquilo Ci_4, alquenilo C2-4, e alquilo Ci_4 halogenado; cada de R3NA e r3nb é independentemente selecionado a partir de: -H, alquilo C4-4, alquenilo C2-4, e alquilo C4-4 halogenado; cada de R7NA e r7nb é independentemente selecionado a partir de: -H, alquilo Ci_4, alquenilo C2-4, e alquilo Ci_4 halogenado; cada de HX1 e HX2 é independentemente um ácido prótico.
10. 10. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado na reivindicação 9, em que cada R1 e R9 é independentemente -H.
11. 11. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado na reivindicação 9 ou reivindicação 10, em que cada R3NA e R3NB e R7na e R7nb é independentemente -Me, -Et, -nPr, -nBu, -CH2- CH=CH2, ou -cf3.
12. 12. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 9 a 11, em que cada um dos grupos -N(R3na) (R3nb) e -N(R7na) (R7nb) é: -NMe2.
13. 13. Utilização de um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 12 na preparação de uma unidade de dosagem de medicamento para utilização no método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
14. 14. Um composto de 3,7-diaminofenotiazina (DAPTZ) numa forma reduzida cristalina estável para utilização num método de mareagem de uma proteína de doença agregada associada com um distúrbio neurodegenerativo no cérebro de um paciente de forma a prognosticar ou diagnosticar o dito distúrbio, em que a dita proteína de doença agregada é uma que é suscetível a mareagem através do dito composto de DAPTZ, cujo método compreende administrar por via oral ao dito paciente uma unidade de dosagem contendo o dito composto de DAPTZ como ingrediente ativo marcado em que o paciente é um que foi avaliado como sofrendo de um distúrbio hematológico, os efeitos de cujo distúrbio hematológico podem de outra forma ser exacerbados pelo composto de DAPTZ.
15. 15. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado na reivindicação 14 em que o composto de DAPTZ é conforme definido numa reivindicação de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12.
16. 16. Um composto de DAPTZ em forma reduzida cristalina estável para utilização conforme reivindicado na reivindicação 14 ou reivindicação 15 em que o composto de DAPTZ incorpora, é conjugado com, é quelado com, ou está de outra forma associado com, um ou mais marcadores detetáveis opcionalmente selecionados a partir de: isótopos, radioisótopos, átomos de emissão de positrões, marcadores de ressonância magnética, corantes, marcadores fluorescentes, grupos antigénicos ou frações terapêuticas. Lisboa, 7 de Setembro de 2015