PT2193789E - Aplicação de 3,5-dihidroxitolueno ou seus derivados na preparação de medicamentos e alimentos funcionais para o tratamento ou prevenção da depressão - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO «APLICAÇÃO DE 3,5-DIHIDROXITOLUENO OU SEUS DERIVADOS NA PREPARAÇÃO DE MEDICAMENTOS E ALIMENTOS FUNCIONAIS PARA O TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DA DEPRESSÃO»

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a 5-metil-l,3-benzenodiol ou derivados específicos deste, ou a medicamentos de composições farmacêuticas ou alimentos funcionais que as contenham, para uso no tratamento e prevenção da depressão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A depressão é um distúrbio mental comum que afecta até 20% da população total. Os seguintes sintomas de depressão são comuns: humor deprimido persistente ou recorrente, ansiedade, agitação, perturbações do sono, resposta anormal ao stress e redução de capacidades cognitivas.

[0003] Ao longo das últimas décadas, têm sido desenvolvidos muitos modelos animais aceites para avaliar a actividade dos antidepressivos sob o impulso da neurofarmacologia. Os modelos mais amplamente usados são o teste de natação forçada e o teste de suspensão pela cauda em roedores. Em anos recentes, muitos estudos revelaram que a escuridão constante, a privação de sono e o stress ligeiro imprevisível crónico são modelos etiológicos para a 1 ocorrência de depressão. Estes modelos serviram de base ao estudo dos antidepressivos. Embora a patogénese da depressão ainda não seja inteiramente clara, as alterações na plasticidade sináptica no hipocampo (por exemplo, a potenciação a longo prazo) e o seu papel na função cognitiva pode ser um dos mecanismos chave subjacentes à depressão.

[0004] 0 5-Metil-1,3-benzenodiol (habitualmente conhecido como orcinol) é habitualmente usado como inibidor de polimerização térmica no processamento de intermédios da pirólise para síntese orgânica. Também é um reagente para a determinação específica do RNA. 0 5-Metil-1,3-benzenodiol e seus derivados têm frequentemente sido usados como antioxidantes e possuem um certo grau de actividade antibacteriana. Até à data, não existem dados sobre a sua utilização na redução da depressão, ansiedade, agitação, perturbações do sono, resposta anormal ao stress e redução de capacidades cognitivas. 0 documento CN 1171264 divulga uma mistura de plantas que inclui rhizoma curculinginis para o tratamento da depressão.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0005] A presente invenção refere-se a 5-metil-l,3-benzenodiol ou derivados específicos deste ou medicamentos de composições farmacêuticas ou alimentos funcionais que as contenham, para uso no tratamento e prevenção da depressão. Os referidos derivados específicos são representados pela Fórmula I: 2

Me

ι onde R1 e/ou R2 são hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6)-β-D-glucopiranosilo, manosilo, 2, 3, 4, 6-tetra^-acetil^-D-glucopiranosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo,propionilo, benzoilo, cinamoilo,succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo.

[0006] Mais preferencialmente, os compostos da presente invenção são o 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula II:

Me M-or1

HO

II onde R1 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6)-β-D-glucopiranosilo, manosilo, 2, 3, 4, 6-tetra^-acetil^-D-glucopiranosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo,propionilo, benzoilo, cinamoilo,succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo; 3 [0007] Mais preferencialmente, em que R1 é hidrogénio; β-D- glucopiranosil; β-D-glucopiranosil-(1-6)-β-D- glucopiranosilo, que está listado como orcinol ou orcinol-Ι-Ο-β-D-glucopiranósido ou orcinol-1-0-[β-D-glucopiranosil-(1—6) ] -β-D-glucopiranósido.

[0008] Mais preferencialmente, os compostos da presente invenção são os derivados de 5-metil-l,3-benzenodiol representados pela Fórmula III:

Me OGIc r2o

III onde R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (1-6)-β-D-glucopiranosilo, 2, 3, 4, 6-tetra-O-acet ϋ-β-D- glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoilo, cinamoilo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo.

[0009] Especialmente, R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D- glucopiranosil- (1—6) -β-D-glucopiranosilo ou ramnopiranosilo.

[0010] Mais preferencialmente, os compostos da presente invenção são os derivados de 5-metil-l,3-benzenodiol representados pela Fórmula IV: 4

onde R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6)-β-D-glucopiranosilo, 2, 3, 4, 6-tetra-0-acet ϋ-β-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoilo, cinamoilo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo.

[0011] De preferência, R2 é 2, 3, 4, 6-tetra-0-acetϋ-β-D-glucopiranosilo ou acetilo.

[0012] A depressão, tal como descrita no Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, quarta edição (DSM-IV), publicado pela Associação Psiquiátrica Americana, e na Classificação Internacional de Doenças, décima edição (CID-10), inclui diferentes subtipos de doenças e perturbações mentais com: (1) depressão e perturbações do humor, tais como depressão, mania, mania mista e hipomania; (2) perturbações depressivas, tais como perturbação depressiva e humor negativo; (3) outros distúrbios afectivos, por exemplo, causados por falta de saúde, que incluem diferentes doenças mentais ou subtipos de perturbações com caracteristicas de perturbações depressivas e transtornos afectivos causados por substâncias (por exemplo, drogas) ou tratamentos (como cirurgia, radioterapia ou quimioterapia); (4) perturbação bipolar ou perturbação afectiva bipolar, 5 com dois ou mais episódios de depressão e hipomania, e episódios alternados de mania e depressão.

[0013] Para além dos sintomas de depressão descritos no DSM-IV e na CID-10, a presente invenção também envolve o tratamento e prevenção de distúrbios do ritmo circadiano, perturbações do sono, stress crónico, ansiedade, incapacidade induzida por stress agudo ou redução ou perturbação das capacidades cognitivas, como sintomas adicionais de depressão.

[0014] Perturbações do sono e distúrbios do ritmo circadiano: perturbação do sono, uma doença muito comum nos doentes com depressão, é um dos conteúdos das escalas que avaliam a extensão da depressão. Os distúrbios do ritmo circadiano referem-se à função fisiológica mais essencial. 0 ritmo circadiano normal é produzido pela alternância entre a escuridão e a luz. As diferenças horárias, estação, hábitos de vida ou hereditariedade podem ocasionar distúrbios do ritmo circadiano, que podem resultar em défices das funções cerebrais superiores, tais como depressão e redução de capacidades cognitivas. De acordo com o DSM-IV ou a CID-10, as perturbações do sono dividem-se em três categorias principais: (1) dissónias, como a insónia, hipersónia, narcolepsia, perturbação do sono relacionada com a respiração, e perturbações do ritmo circadiano do sono; (2) parassónias, como pesadelos, perturbação de terrores nocturnos e sonambulismo; (3) perturbações do sono relacionadas com problemas de saúde e perturbações do sono induzidas por substâncias (por exemplo, drogas) ou tratamentos (como cirurgia, radioterapia ou quimioterapia). 6 [0015] A ansiedade é um sintoma muito comum em doentes com depressão. É uma das linhas de orientação para avaliar a gravidade da depressão. As perturbações de ansiedade incluem duas categorias principais: (1) perturbações de pânico, por exemplo, agorafobia, perturbações de pânico especificas (tais como fobias de animais específicos, ambientes ou transfusão sanguínea, fobia social ou perturbação obsessiva-compulsiva), perturbação de stress pós-traumático, perturbação aguda de stress e perturbação da ansiedade generalizada; e (2) perturbações de ansiedade relacionadas com a saúde e perturbações induzidas por substâncias (por exemplo, drogas) ou tratamentos (como cirurgia, radioterapia ou quimioterapia). 0 teste do labirinto elevado e o comportamento de imobilidade são modelos amplamente usados com roedores para avaliar a actividade ansiolítica dos fármacos.

[0016] 0 stress é definido em sistemas biológicos como qualquer condição que perturbe gravemente a homeostase fisiológica ou psicológica de um organismo. 0 stress é considerado como um dos factores principais que exacerbam ou conduzem a muitas doenças, como a doença mental e perturbações das capacidades cognitivas. Os eventos geradores de stress podem incluir vários acontecimentos de vida e variam de pessoa para pessoa. O consumo de determinadas substâncias, por exemplo substâncias viciantes, ou a sujeição a tratamentos como a cirurgia, habitualmente conduzem a respostas anormais ao stress. Os indicadores biológicos habitualmente usados para avaliar o stress incluem os níveis de corticosteróides (como a corticosterona em roedores e o cortisol nos humanos), que podem levar a incapacidade induzida por stress agudo 7 relevante, como, por exemplo, a danos na plasticidade sináptica no hipocampo, assim como na aprendizagem e na memória. Em experiências com animais, os métodos de stress habitualmente usados incluem choques nos pés e a plataforma elevada.

[0017] A cognição é uma das funções cerebrais superiores mais importantes. Inclui aprendizagem, memória, linguagem, pensamento e humor. A depressão é considerada um tipo de distúrbio cognitivo e os doentes que sofrem dela têm pensamentos negativos e humor deprimido automaticamente. Em 1949, Hebb propôs a ideia de que a modificação sináptica é a base da aprendizagem e da memória. Em 1973, esta hipótese foi validada em experiências por Bliss et al. que descobriram a potenciação a longo prazo do hipocampo (LTP). Contudo, até ao momento, nenhum fármaco que regule a LTP foi usado directamente na prática clínica para tratar a depressão. É possível obter efeitos curativos melhores e mais rápidos no tratamento da depressão, seus sintomas associados e suas causas, através do desenvolvimento de fármacos que modificam a plasticidade sináptica.

[0018] 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados podem ser usados directamente na forma livre ou em composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas descritas contêm 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados numa razão de peso de 0,1-99% em excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0019] Tal como aqui empregue, o termo " veículos e/ou excipientes farmacêuticos" refere-se a um ou mais sólidos, semi-sólidos ou diluentes líquidos, aditivos de enchimento ou formulação auxiliar de qualquer tipo. As composições 8 farmacêuticas de 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados são preparadas para serem vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou suplementos dietéticos aceitáveis, através de técnicas bem conhecidas no campo dos produtos farmacêuticos e alimentares. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou suplementos dietéticos aceitáveis incluem sprays, aerossóis, líquidos como injecções, suspensões, emulsões e xaropes e sólidos, como comprimidos, cápsulas e grânulos, ou pó dissolvido ou suspenso em líquido.

[0020] Na presente invenção, os métodos de administração incluem injecção ou infusão (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea) e administração oral, sublingual e pela mucosa.

[0021] A dosagem eficaz dos componentes activos (5-metil-1,3-benzenodiol ou derivados) para tratar ou prevenir as doenças acima referidas, suas causas e sintomas, situa-se entre 0,1 mg/adulto/dia e 12 g/adulto/dia e a dosagem óptima é de 50-200 mg/adulto/dia.

[0022] A presente invenção revela que o 5-metil-l,3-benzenodiol ou derivados específicos deste, as composições farmacêuticas, os medicamentos e alimentos funcionais que os contêm, fornecem uma nova opção para o tratamento e prevenção da depressão, de sintomas sugestivos de depressão como a ansiedade, stress e redução das capacidades cognitivas e das causas etiológicas da depressão. 9

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0023] Os exemplos que se seguem descrevem os detalhes dos compostos e métodos para a compreensão e suplementos da invenção.

[0024] Orcinol (OR), orcinol-l-O^-D-glucopiranósido (ORG) e orcinol-1-0- [ β-D-glucopiranosil- (l->6) ] -β-D-glucopiranósido (ORGG) podem ser extraídos de Curculigo orchioides Garr. Outros derivados de orcinol podem ser preparados através de técnicas bem conhecidas. O processo específico é o seguinte: [0025] 1. 0 orcinol pode ser posto em reacção com o produto acetilado correspondente de açúcares em que R1 e/ou R2 são β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6)-β-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo ou arabinosilo, e os compostos correspondentes podem ser obtidos através da reacção do orcinol com o produto acetilado indicado de açúcares em metanol com protecção contra a luz e pela adição de ácido hidrobrómico e ácido acético e agitação durante 1-5 h à temperatura ambiente. São obtidos os glicosídeos acetilados de orcinol. Os glicosídeos acetilados de orcinol correspondentes são tratados com metóxido de sódio em metanol durante 1-5 h à temperatura ambiente para produzir os glicosídeos de orcinol correspondentes.

[0026] 2. Quando R1 e R2 são acilo, orcinol ou glicosídeos de orcinol são dissolvidos em piridina pela adição dos anidridos de ácidos ou cloretos de acilo correspondentes e 4-dimetilaminopiridina a 10-20% e agitação durante 3-5 h a 10 60-120°C. A mistura é vertida em água e então extraida com clorofórmio para produzir um produto bruto que é ainda purificado para produzir produtos acilados.

[0027] 3. Quando R1 e R2 são alquilo, orcinol ou glicosideos de orcinol são dissolvidos em tetrahidrofurano ou dimetilsulfóxido pela adição de hidreto de sódio e agitação durante 30-60 min. Após a adição do alquilogénio correspondente, a mistura de reacção é ainda agitada durante 3-5 h, e então vertida em água e extraídas com clorofórmio para produzir um produto em bruto que é ainda purificado para produzir produtos alquilados. EXEMPLO 1

Extracçao e isolamento de orcinol-l-O-p-D-glucopiranósido, orcinol e orcinol-l-O-[β-D-glucopiranosil-(1^6)]-β-D-glucopiranósido [0028] Curculigo orchioides Garr. foi colhido, seco à sombra ou ao sol e feito em pó.

[0029] 0 material em pó (20 kg) foi extraído 3 vezes com etanol a 90% (200 kg) sob refluxo durante 2 h de cada vez. Os extractos foram combinados e concentrados para cerca de 30 kg e filtrados após 12 h de deposição. Os extractos em bruto foram então cromatografados numa coluna de resina macroporosa D-101 (o peso da resina foi de 20 kg) e eluídos sucessivamente com 100 kg de água destilada, 60 kg de etanol a 70% e 60 kg de etanol a 90%. 0 eluente etanol a 70% e eluente etanol a 90% foram colhidos separadamente e 11 evaporados à secura para obter eluente etanol a 70% (340 g) e eluente etanol a 90% (60 g).

[0030] O eluente etanol a 70% obtido (340 g) foi dissolvido em metanol e absorvido em 400 g de sílica-gel. Depois de seco à temperatura ambiente, o sólido foi pulverizado, peneirado e sujeito a cromatografia em coluna de sílica-gel (2,1 kg, 200-300 mesh) e eluído com clorofórmio-metano1- água (90:10:1 a 70:30: 3, v/v/v) para obter 26 fracções. Cada fracção foi de 1500 ml. As fracções 2-3 foram combinadas, concentradas e cristalizadas a partir de etanol para produzir orcinol (5 g). As fracções 9-15 foram combinadas, concentradas e cristalizadas a partir de etanol para produzir orcinol-l-O-p-D-glucopiranósido (50 g) . As fracções 22-26 foram combinadas, concentradas e cristalizadas a partir de etanol para produzir orcinol-l-O-[ β-D-glucopiranosil- (l->6) ]-β-D-glucopiranósido (10 g) .

[0031] Determinação da estrutura: A rotação óptica foi medida com um polarímetro SEPA-300; foram obtidos espectros UV-VIS com um espectrómetro UV-210A; os dados IV foram colhidos num espectrómetro Bio-Rad FTS-135 com grânulos KBr; foram realizados espectros de ressonância magnética nuclear (RMN e RMN 13C) num espectrómetro DRX500 de Bruker em CDCI3 com TMS como padrão interno. Os materiais para cromatografia em coluna e a sílica-gel para cromatografia em camada fina foram da Makall Group Co. Ltd. (Qingdao, China). 12

Nome: 0rcinol-l-0-|3-D-glicopiranósido [0032] 7 Me

Fórmula molecular: Ci3Hi807;

Peso molecular: 286;

Propriedades: Pó amarelo claro; [oí]d -63, 03° (c 5,95, metanol); UV (metanol): Xmax (logs) 279 (3, 19), 273 (3,21), 219 (3, 99), 203 (4,58); IV (KBr) : vmax 3495, 3385, 1620, 1596, 1175, 1076, 1032 cm- i. r FAB-MS (-) : m/z 285 [(M-l)“, 100], 123 [ (M-l-glcT, 87]; RMN 3Η (CD3OD, 400 MHz) õH: 6,41 (1H, s, H-2), 6,36 (1H, s, H-6), 6,29 (1H, s, H-4), 4,84 (1H, d, J = 7,3 Hz, H-l ' ) , 2,22 (3H, s, H-7); 13C-RMN (CD3OD,100 MHz) õc: 160,1 (s, C-l), 111,4 (d, C-2), 159,2 (s, C-3), 102,4 (s, C-4), 141,3 (s, C-5), 110,0 (d, C-6), 21,6 (q, C-l)r 102,5 (d, C-l'), 75,0 (d, C-2'), 78,1 (d, C-3'), 71,6 (d, C-4'), 78,2 (d, C-5'), 62,7 (t, C-6').

Nome: Orcinol 13 [0033]

Fórmula molecular: C7H8O2;

Peso molecular: 124;

Propriedades: Pó amarelo claro-branco; UV (metanol): Xmax (logs) 281 (3,20), 275 (3,22), (4,59), 203 (4,58); IV (KBr) : vmax 3313, 1629, 1601, 1512, 1477, 1332, 1148, 1032, 973 cm-1; EI-MS (70 ev): mlz 125 [(M+l)+, 8], 124 [M+, 100], 123 1)\ 55], 107 [ (M+l-18) +, 7] , 95 (12), 77 (8); RMN 3Η (CD3OD, 400 MHz) δΗ: 6,14 (2H, brs, (1H, brs, H-4) , 2,16 (3H, s, H-7) ; 13C-RMN (CD3OD,100 MHz ) õc: 159,2 (sx2, C-l, 3), 108,7 C-2, 6), 108,7 (s, C-4), 141,2 (s, C-5), 21,5 (q, C-7)

Nome: Orcinol-l-O-[β-D-glucopiranosil-(1^6)] glucopiranósido [0034] 204 1208, [ (M-6, 10 (dx2, — β—D—

Fórmula molecular: C19H28O12;

Peso molecular: 448; Propriedades: Pó branco amorfo; 14 P . F • 117- 119 ° C ; FAB- MS (-) (m/z) : 447 [M-l] “, 123 [M- l-2glc] r RMN XH (40 0MHz, CD30D) δΗ: 6,43 (1H, brs, H-2) r 6,40 (1H brs, H -4) , 6, 28 (1H, brs, H -6) , 4 , 82 (1H, d, r J= 7 , 30 H Iz , H 1'), 4 ,40 (1H, d , J= 7 , 73 H z, H -1 ") , 2,21 (3H, ε u H-7) , 13cnmr (125 MHz, CD3OD) õc: 160, 0 (s, C-l) , 102, 0 (d, C -2) 159, 2 (s, C-3) , 111, 2 (d, C-4) r 141, r 3 (s, C-5) r 109, 8 (d C-6) t 21,7 (s, C -7) , 1 .02, 1 (d, c- -í') , 74,8 (d, c -2') , 77, (d, c- 3') , 71,3 (s, C- -4'), 77, 5 (d, C-5) , 69, 6 (t, c 6') 104, 6 (d, C-l"), 75, 2 (d, C-2 " ), 77, , 8 (d, C-3" ), - 71, 5 (d C-4" ) , 77, 9 (d, C-5") ' , 62, 6 (t, c -6") e EXEMPLO 2

Preparação de 1,3-O-diacetilorcinol [0035] Um frasco de 100 ml de fundo redondo foi carregado com piridina (40 ml) e orcinol (1,24 g, 0,01 mol) . A mistura de reacção foi agitada à temperatura ambiente e foi adicionado anidrido acético (3 ml) gota a gota. Depois de ser agitada durante 24 h à temperatura ambiente, a mistura de reacção foi vertida em 200 ml de água gelada. A mistura foi extraída com acetato de etilo (3x50 ml) . As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas 3 vezes com ácido clorídrico a 5%, 3 vezes com NaHC03 aq. saturado, e 3 vezes com cloreto de sódio saturado, secas sobre Na2S04, filtradas e evaporadas até à secura sob vácuo. 0 produto em bruto foi sujeito a cromatografia em coluna de sílica-gel e eluído com éter de petróleo-acetona (90:10, v/v) para produzir 1,3-O-diacetilorcinol (1,87 g, rendimento 90%).

Nome: 1,3-O-diacetilorcinol 15 [0036] 7 Me

AcO

OAc Fórmula molecular: CnH 12O4;

Peso molecular: 208;

Propriedades: Óleo incolor

Dados estruturais de 1,3-0-diacetilorcinol ESI-MS (+) m/z: 231 [M+Na]+; IV (KBr) vmax: 1769, 1602, 1592, 1466, 1434, 1369, 1292, 1198, 1124, 1036 cm-1; RMN ΧΗ (CDCI3) ÕH : 6,78 (2H, s, J = 1,9 Hz, H-4, 6) , , 6,71 (1H , d, , J = 1, 9 H z, H-2) , 2, 30 (3H r s, H- -7), 2,19 (s, 6H) ; 13c RMN (CDCI3) õc : 169,0 (s, CH3CO) r 169, 0 (s, CH3CO), 150, 9 (S, c- 1), 150,9 (s, C-3 ), 1 40,3 ( s, C-5 ), 119,7 (d, C-4) , 119 ,7 (d, C-6), 112,5 (d, C-2) , 21 -, 2 (q, C-7) , 20, 9 (q, CH3CO) , 20,9 (q, CH3CO) . EXEMPLO 3

Preparação de 3-O-acetil-orcinol-l-O-(2,3,4, 6- tetraacetil)-β-D-glucopiranósido [0037] Orcinol (286 mg) foi dissolvido em piridina (20 ml). A mistura de reacção foi agitada à temperatura ambiente e foi adicionado anidrido acético (2,5 g, 25 mmol) gota a gota. Depois de ser agitada durante 24 h à temperatura ambiente, a mistura de reacção foi vertida em 50 ml de água gelada. A mistura foi extraída com acetato de 16 etilo (3x20 ml) . As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas 3 vezes com ácido clorídrico a 5%, 3 vezes com NaHC03 aq. saturado e 3 vezes com cloreto de sódio saturado, secas sobre Na2SC>4, filtradas e evaporadas até à secura sob vácuo. O produto em bruto foi sujeito a cromatografia em coluna de sílica-gel para produzir 3-0-acetil-orcinol-1-0-(2, 3, 4, 6-tetraacetil)-β-D- glucopiranósido (421 mg, rendimento 85%) .

Nome: 3-O-acetil-orcinol-l-O-(2,3,4,6-tetraacetil)-β-D-glucopiranósido [0038] 7

Fórmula molecular: C23H28O12,'

Peso molecular: 496;

Propriedades: Pó branco amorfo; ESI-MS (+) m/z: 519 [M+Na]+;

IV (KBr) vmax: 1759, 1625, 1590, 1373, 1241, 1211 cm-1; RMN τΗ (CDCls) õH: 6,68 (1H, s, J = 1,9 Hz), 6,63 (1H, s, J = 1,9 Hz), 6,54 (1H, s, J = 1,9 Hz), 5, 30-5,22 (m, 2H) , 5,14 (t, 1H, J = 9,7 Hz), 5,06 (1H, d, J = 7,5 Hz), 4,28-4,14 (m, 2H) , 3, 89-3, 85 (m, 1H) , 2,31 (s, 3H) , 2,27 (s, 3H) ,

2,08 (s, 3H) , 2,05 (s, 3H) , 2,04 (s, 3H) , 2,03 (s, 3H) ; 13C RMN (CDCI3) õc: 170,6 (s, CH3CO) , 170,2 (s, CH3C0) , 169,4 (s, CH3ÇO), 169,3 (s, CH3ÇO), 169,3 (s, CH3ÇO) , 157,2 (s, C-3), 151,1 (s, C-l), 140,6 (s, C-5), 117,2 (d, C-6), 115,1 17 (d, C-4), 107,6 (d, C-2), 98,8 (s, C-l' ) , 72,6 (d, C-3' ) , 72,0 (d, C-5'), 71,0 (d, C-2'), 68,2 (d, C-4'), 62,0 (t, C-6'), 21,5 (q, C-l), 21,1 (q, ÇH3CO), 20,6 (q, CH3COx4). EXEMPLO 4

Preparação de orcinol-l-tetra-O-acetil-ramnopiranose [0039] Tetra-O-acetil-ramnopiranose (36 g) foi dissolvida numa mistura (100 ml) de ácido hidrobrómico e ácido acético. A mistura de reacção foi agitada durante 5 h com protecção contra a luz. A mistura de reacção foi vertida em 500 ml de água gelada e extraída com acetato de etilo (3x500 ml).

As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas 3 vezes com água, 3 vezes com NaHC03 aq. a 5%, e 3 vezes com cloreto de sódio saturado, secas sobre Na2S04, filtradas e evaporadas até à secura sob vácuo para produzir brometo de tetra-O-acetil-ramnopiranosilo.

[0040] Orcinol (12,4 g) foi dissolvido em clorofórmio (20 ml) . A mistura de reacção foi agitada e foi adicionada solução de hidróxido de sódio a 5% (20 ml) . Quando a temperatura foi elevada para 50°C, a solução do brometo de tetra-O-acetil-ramnopiranosilo (0,12 mol) dissolvida em clorofórmio foi adicionada gota a gota. A mistura de reacção foi agitada a 50°C até a reacção estar concluída, e depois vertida em 150 ml de água gelada. O pH foi ajustado para 7 com ácido clorídrico a 5%. A mistura foi extraída com acetato de etilo. As camadas foram combinadas, lavadas com cloreto de sódio saturado, secas sobre Na2S04, filtradas e evaporadas até à secura sob vácuo. O produto em bruto foi sujeito a cromatografia em coluna de sílica-gel e 18 eluído com acetato de etilo-éter de petróleo (5:1, v/v) para produzir orcinol-l-tetra-O-acetil-ramnopiranose (l,87g, rendimento 90%). EXEMPLO 5

Preparação de orcinol-l-ramnopiranose [0041] Foi adicionado metóxido de sódio (0,18 g) a uma solução de orcinol-l-tetra-O-acetil-ramnopiranose (4,14 g) em metanol (20 ml) . Depois de ser agitada durante 2 h à temperatura ambiente, a mistura de reacção foi neutralizada com ácido clorídrico a 5%. O metanol foi removido sob vácuo após adição de água destilada (50 ml). A mistura foi extraída com n-butanol (3x50 ml) . As camadas foram combinadas, lavadas com cloreto de sódio saturado, secas sobre Na2SC>4, filtradas e evaporadas até à secura sob vácuo. O produto em bruto foi cristalizado a partir de etanol para produzir orcinol-l-ramnopiranose. EXEMPLO 6 [0042] Orcinol-l-O^-D-glicopiranósido preparado de acordo com o EXEMPLO 1 foi dissolvido em água para injecção. Após a filtração bacteriana (filtração de 0,2-0,45 pm) , a solução foi acondicionada em frascos, selada e esterilizada para produzir a injecção de orcinol-1-Ο-β-ϋ-glicopiranósido. 19 EXEMPLO 7 [0043] Orcinol-l-O-p-D-glicopiranósido preparado de acordo com o EXEMPLO 1 foi dissolvido em água para injecção isenta de bactérias. A solução foi sujeita por filtração a vácuo usando um funil de Buchner, filtrada com um filtro de precisão (filtração 0,2-0,45 pm) em condições livres de bactérias, acondicionada em ampolas e selada após liofilização para fornecer pó liofilizado para injecção de orcinol-l-O-p-D-glicopiranósido. EXEMPLO 8 [0044] Orcinol-l-O-p-D-glicopiranósido preparado de acordo com o EXEMPLO 1 foi misturado com excipientes para fornecer a injecção em pó de orcinol-l-O-p-D-glicopiranósido. A razão do peso do primeiro para o último foi de 9:1. EXEMPLO 9 [0045] Orcinol-l-O-p-D-glicopiranósido foi preparado de acordo com o EXEMPLO 1. Comprimidos, cápsulas e grânulos foram preparados misturando orcinol-l-O-p-D-glicopiranósido com excipientes em razões do peso do composto e excipientes entre 1:5 e 1:10. EXEMPLO 10 [0046] Orcinol-l-O-p-D-glicopiranósido foi preparado de acordo com o EXEMPLO 1. Foi preparado um liquido oral de 20 com métodos orcinol-l-O^-D-glicopiranósido de acordo convencionais. EXEMPLO 11 [0047] Orcinol-l-O-p-D-glicopiranósido foi preparado de acordo com o EXEMPLO 1. Cápsulas e grânulos foram preparados misturando orcinol-l-O^-D-glicopiranósido com excipientes numa razão do peso de 5:1. EXEMPLO 12 [0048] Orc ΙηοΙ-Ι-Ο-β-D-glicopiranósido (12,4 g) preparado de acordo com o EXEMPLO 1, amido (600 g), lactose (200 g), mentol (5 g) e carboximetilamido sódico (183 g) foram misturados e preparados para serem reduzidos a trociscos como alimentos funcionais.

[0049] Para uma melhor compreensão da essência da invenção, foram estudados os efeitos farmacológicos das composições farmacêuticas contendo orcinol ou seus derivados e veículos ou excipientes farmacêuticos.

Experiência 1

Estudo farmacológico de ORG e OR 1 Efeitos antidepressivos de ORG e OR com relação dose-efeito no teste de suspensão pela cauda (TST) e teste de natação forçada (FST) em ratazanas e ratos 21 1.1 Métodos experimentais [0050] Foram usados ratos kunming e ratazanas Sprague-Dawley (número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. Os ratos tinham 3-4 semanas de idade no início das experiências e pesavam 25-30 g. As ratazanas pesavam 250-300g. Os números de animais em cada grupo estão apresentados nas Tabelas 1-5. Orcinol (OR), orcinol-1-Ο-β-D-glucopiranósido (ORG), orcinol-l-O-[β-D-glucopiranosil-(l->6) ]-β-D-glucopiranósido (ORGG) , 1,3-0-diacetilorcinol (0R-2Ac), e 3-O-acetil-orcinol-l-O-(2, 3, 4, 6-tetraacetil)-β-D-glucopiranósido (ORG-5Ac) foram preparados de acordo com os Exemplos 1, 2 e 3. Os animais foram divididos num grupo experimental com doses diferentes, um grupo de veiculo e dois grupos de controlo positivo contendo um grupo imipramina (Sigma, N.° de lote 106kl588) e um grupo venlafaxina (Wuhan Yuancheng Co., Ltd., N.° de lote 200701001) .

[0051] Substâncias: ORG foi dissolvido em solução salina normal. Em controlos positivos, imipramina ou venlafaxina foram suspensas em solução salina normal contendo CMC-sódio a 0,5 % por sonicação. A dose de imipramina ou venlafaxina foi 15 mg/kg. 0 volume de injecção i.g. ou i.p. foi 0,1 ml/10 g em ratos e 1 ml/100 g ou 0,1 ml/100 g em ratazanas.

[0052] FST em ratos: 0 aparelho consistiu num cilindro (24 cm altura *15 cm diâmetro) enchido com água até 17 cm de profundidade, a uma temperatura de 24±2°C. Todas as substâncias e veículos foram administrados 24 h e 5 h antes de iniciar o FST. 0 tempo de imobilidade dos ratos durante 22 os últimos 4 minutos do período total de 6 minutos foi registado manualmente.

[0053] FST em ratazanas: Houve duas sessões natatórias em cada experiência. Primeiro, foi realizada uma sessão natatória pré-teste durante 15 minutos e foi registado manualmente o tempo de imobilidade durante os primeiros períodos de 5 minutos. Se o tempo de imobilidade fosse demasiadamente longo ou demasiadamente curto, a ratazana era rejeitada. Todas as substâncias e veículos foram administrados duas vezes às 0 e às 19 h após a sessão natatória pré-teste. Vinte e quatro horas após a sessão natatória pré-teste, foi registado manualmente o tempo de imobilidade durante a sessão de teste de 5 minutos.

[0054] TST em ratos: Todas as substâncias e todos os veículos foram administrados 24 h e 5 h antes de iniciar o TST. Os ratos foram suspensos com fita adesiva de forma a prender as caudas a 2 cm da ponta da cauda numa barra horizontal que foi colocada 50 cm acima do nível do chão da câmara de teste. 0 tempo de imobilidade durante 6 minutos foi registado manualmente.

[0055] Análise dos dados: Os resultados são expressos como média ± EPM e foram analisados usando o software SPSS 11. As comparações entre grupos foram realizadas usando a análise de variância unidireccional (ANOVA) seguida do teste de diferença mínima significativa (DMS). 0 nível de significância foi definido como P <0,05. Os valores ED50 foram calculados usando o software GraphPad Prism. 23 1.2 Resultados 1.2.1 Efeito antidepressivo do ORG (i.g.) no FST em ratazanas [0056]

Tabela 1. Relação dose-tempo de imobilidade de ORG (i.g.) em FST em ratazanas

Grupo Dose (mg/kg) jNúmero de | animais \ Tempo (s) de I imobilidade (média ± |EPM) Valor P NS 1 ml/lOOg 30 1179, 50 ± 5,32 ORG 0,0625 | io 1187,2 0 ± 11,97 0, 60 0, 125 20 1181,5 0 ± 8,19 0, 86 0,1875 20 1138, 90 ± 13,31* 0, 006 0,25 20 1121,0 5 ± 9,44* <0,001 0,5 ! 2 0 1113,7 0 ± 6,74* <0,001 1 20 196, 87 ± 7,40* <0,001 2 20 191,60 ± 7,06* <0,001 4 20 184,40 ± 9,20* <0,001 8 20 | 94,30 + 9,86* <0,001 16 20 191,40 ± 11,36* <0,001 32 19 1107,2 6 ± 10,74* <0,001 64 20 1105, 90 ± 19,77* <0,001 128 20 1103, 00 ± 17,42* <0,001 Venlafaxina 15 10 1100, 80 ± 9,84* <0,001 Imipramina 15 29 I 92,72 ± 7,09* <0,001 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS). 24 [0057] Foi avaliada a relação dose-efeito do ORG administrado oralmente a ratazanas. O ORG reduziu o tempo de imobilidade e o efeito foi significativamente dependente da dose (Tabela 1). A dose com melhor eficácia foi 4 mg/kg, e o ED50 foi de cerca de 0,22 mg/kg. 1.2.2 Efeito antidepressivo do ORG (i.g.) no FST em ratos [0058] No presente estudo, ORG foi administrado i.g. às 24 h e às 5 h antes de iniciar o FST. O tempo de imobilidade diminuiu e o efeito foi significativamente dependente da dose (Tabela 2) . A dose com melhor eficácia foi 3 mg/kg, e o ED50 foi de cerca de 0,22 mg/kg.

Tabela 2. Relação dose-tempo de imobilidade de ORG (i.g.) no FST em ratos íDose (Número , 1 Tempo des. . _ (s) sValor Grupo \ . ,Λ . irmobilrdade (medra + s \(mg/kg) s animais ΪΕΡΜ) | P NS |0,lml/lOgΪ108 117 8,50 + 3, 04 j 0,0 93 14 0 1169, 35 + 4,32 lo,26 |θ, 186 i 30 1155,30 + 9, 19* lo, 01 |0, 3725 130 1137,57 + 6, 41* | <0,ooi 0, 75 160 ! 139,45 + 7,04* |<o,ooi ]l,5 j 60 1127,23 + 6,63* ! <0,0 01 ORG ! 3 178 1114,41 + 6,23* |<0,001 ! 6 170 112 9,7 6 + 5, 99* ]<0,001 112 j 7 0 j122,71 + 5,56* j<0,001 124 170 1121,57 + 6, 13* |<o,ooi 148 69 1135,3 6 + 4,60* |<o,ooi 1 96 50 j145,34 + 5, 39* |<o,ooi Venlafaxina |15 178 1134,28 + 3,76* |<o,ooi Imipramina 115 17 9 1131,20 + 3, 91* |<o,ooi *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS). 25 1.2.3 Efeito antidepressivo do ORG (i.g.) em TST em ratos [0059] ORG foi administrado i.g. às 24 h e 5 h antes de iniciar o TST. 0 tempo de imobilidade diminuiu e o efeito foi significativamente dependente da dose (Tabela 3) . A dose com melhor eficácia foi 12 mg/kg, e o ED50 foi de cerca de 0,73 mg/kg.

Tabela 3. Relação dose-tempo de imobilidade de ORG (i.g.) no TST em ratazanas

Grupo NS jDose | (mg/kg |) |0,lml/ 110 g nT, , i Tempo s) ;Numero de; . , . Ί . , , , , , . : . . ;imobilidade (media lanimais ; iEPM) i38 1161,18 ± 5,47 dehi 1 iValor + s \P 10,1875 40 161,70 ± 6,89 (O, 95 10,375 | 4 0 1155,68 ± 6,77 |θ, 52 |θ, 5 130 1125,30 ± 6,93* ] <0,001 10,75 j 30 117,33 ± 6,56* i<0,001 |l,5 130 109,27 ± 6,81* ko, ooi ORG |3 j 30 98, 07 ± 5,95* {<0,001 I6 j 30 89, 73 ± 5,02* (<0,001 j 12 j 30 77, 67 ± 5,33* (<0,001 j 2 4 j 30 (91,03 ± 7,44* 1 <0,001 148 (20 1100,20 ± 10,46* ko, ooi | 96 i 19 h 07,68 ± 8,85* (<0,001 Venlafaxina l15 ! 2 0 h 02,85 ± 9,34* |<0,001 Imipramina 115 140 1105,65 ± 5,71* (<0,001 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS). 1.2.4 Efeito antidepressivo do OR (i.p.) no FST em ratos 26 [0060] No presente estudo, OR foi administrado i.p. às 24 h e às 5 h antes de iniciar o FST. O tempo de imobilidade diminuiu (Tabela 4).

Tabela 4. Efeito do OR (i.p.) sobre o tempo de imobilidade no FST em ratos

Grupo Dose (mg/kg) Número de animais Tempo (s) imobilidade (média EPM) dejT7 1 jValo _ j r p NS 0,1 ml/10 g 9 156, 56 ± 19,78 \ OR 10 10 82,40 ± 10,64* 0, 00 I5 Imipramina 15 13 96,38 ± 12,04 LO i—1 O *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS). 1.2.5 Efeito antidepressivo dos derivados de OR (i.p.) no FST em ratos [0061] Neste estudo, os derivados de ORG (ORGG, 0R-2Ac e ORG-5Ac) foram administrados por injecção intraperitoneal (i.p.) às 24 h e 5 h antes de iniciar o FST. Todos os derivados de ORG reduziram o tempo de imobilidade em ratos no modelo FST (Tabela 5).

Tabela 5. Efeito dos derivados de ORG (i.p.) no tempo de imobilidade em FST em ratos

Dose (mg/kg)

Grupo Número jTempo (s) dej de ^imobilidade (média ±jValor p

animais |EPM) I NS 0,1 ml/lOg jlO ! 213,60 + 3,77 ORGG 10 110 1184,20 + 11,29* 0R-2AC 10 110 1170,10 + 6,37* ORG-5AC 10 110 I178,90 + 9, 61* 0,012 <0,001 0,003 27 Número de de

Tempo (s) de | imobilidade (média ±jValor p

Imipramina Í15 |10 jl46,00 ± 6,46* <0,001 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS)

1.3 índice terapêutico (IT) da actividade antidepressiva do ORG

[0062] No teste de toxicidade aguda, quando foi administrado ORG numa dose de 1750 mg/kg a ratos Kunming, a concentração saturada, a investigação etológica e histológica não revelaram nada de anormal. Então, a dose tóxica média (TDso) de ORG foi superior a 1750 mg/kg.

[0063] 0 índice terapêutico (IT) do ORG em ratos no FST = TD50 t ED50 => 1750 mg/kg = 0,22 mg/kg =>7955.

[0064] 0 índice terapêutico (IT) do ORG em ratos no TST = ED50 t ED50 => 1750 mg/kg = 0,73 mg/kg =>2397.

Experiência 2

Efeito antidepressivo do ORG dependente do tempo no teste de natação forçada (FST) em ratos 2.1 Métodos experimentais [0065] Foram usados ratos Kunming (número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. Eles tinham 3-4 28 semanas de idade no início das experiências e pesavam 25-30 g. Os números de animais em cada grupo estão apresentados nas Tabelas 6-8. 0 ORG foi preparado como descrito no

Exemplo 1. Os animais foram divididos em grupos experimentais com diferentes doses e grupos de veículo de controlo. 2.1.1 Administração e Design Experimental: [0066] ORG foi dissolvido em solução salina normal (NS) em concentrações diferentes. Todas as substâncias e seus veículos foram administrados oralmente num volume de 0,1 ml/10 g. 2.1.2 Frequência de administração: [0067] Os animais foram tratados com ORG (3 mg/kg) ou NS 1 a 5 vezes oralmente no período de 24 h. 0 tempo de imobilidade foi registado 5 h após o último tratamento com ORG. 2.1.3 Comparação de diferente doses e frequências de administração: [0068] Os ratos foram tratados uma vez com 6 mg/kg de ORG ou duas vezes com 3 mg/kg de ORG no período de 24 h. 0 tempo de imobilidade foi registado 5 h após o último tratamento com ORG. 2.1.4 Efeito do ORG na actividade antidepressiva (inicio de acção e tempo de manutenção): [0069] Os ratos foram tratados com ORG (3 mg/kg). Dezanove horas após a administração, foi administrada outra dose de ORG (3 mg/kg). 29 [0070] O tempo de imobilidade foi registado a 2,5 h, 5 h, 24 h, 72 h e 2 semanas após a segunda administração. 2.1.5 Análise dos dados: [0071] Os resultados são expressos como média ± EPM (%).

Os tempos de imobilidade dos grupos NS foram definidos como 100% e o efeito antidepressivo de cada grupo foi calculado com base no grupo NS. Um melhor efeito antidepressivo é representado como um valor de percentagem inferior. Este método de normalização permitiu comparações entre grupos experimentais. A análise estatística foi ANOVA unidireccional seguida do teste de DMS.

Um valor de P <0,05 foi considerado significativo. 2.2. Resultados 2.2.1 Efeito antidepressivo do ORG para diferentes frequências de administração no período de 24 h no FST em ratos.

[0072] ORG (3 mg/kg) foi administrado 1-5 vezes no período de 24 h. 0 tempo de imobilidade diminuiu significativamente nos grupos tratados 2 ou 3 vezes com ORG (Tabela 6) . Os resultados mostram que o melhor efeito farmacológico foi obtido após 2 ou 3 administrações no período de 24 h a intervalos de 10-19 h. 30

Tabela 6. Frequência de administração e efeito antidepressivo do ORG no FST em ratos

Grupo Dose (mg/kg) ^Frequência de ^administração !em 24 h |Número jde lanimais Imobilidade (%NS) (média ± EPM) | Valor |p NS í 110 100 3 I1 10 83,57 ± 6,66 0, 098 I2 | io 64, 98 ± 5,96* |o,001 ORG I3 | io 65, 65 ± 9,67* |o,ooi 3 14 j 10 89,81 ± 6,50 jo,302 3 Í5 110 91,26 ± 5,93 IO,375 2.2.2 Comparação do efeito antidepressivo entre diferentes frequências de administração com a mesma dose final no periodo de 24 h [0073] Quando os ratos foram tratados uma vez com 6 mg/kg de ORG ou duas vezes com 3 mg/kg de ORG em 24 h, os tempos de imobilidade diminuíram em todos os grupos (Tabela 7).

Mas foi apresentado um melhor efeito em ratos tratados duas vezes com 3 mg/kg ORG em 24 h.

Tabela 7. A mesma dose administrada duas vezes teve um melhor efeito antidepressivo do que quando administrada uma vez no periodo de 24 h 31 IDose

Grupo j j(mg/kg) j jFreguência de INúmero jImobilidade administração Ide j(%NS) (média ± jem 24 h lanimais |EPM)

Valor P

NS ORG 12 ! 31 1100 ]9 164, 03 ± 7,20* ORG ! 6 |1 130 180,70 ± 4, 64* *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS). <0,001 =0,002

2.2.3 Efeito antidepressivo do ORG com início de acção rápido e manutenção de longa duração no FST

[0074] Os ratos foram tratados com ORG oralmente (3 mg/kg). Dezanove horas mais tarde, foi administrada outra dose de ORG (3 mg/kg). O tempo de imobilidade foi registado às 2,5 h, 5 h, 24 h, 72 h e 2 semanas após a segunda administração. O efeito antidepressivo do ORG ocorreu rapidamente 2,5 h após a segunda administração. O melhor efeito ocorreu às 24 h após a segunda administração e o efeito foi mantido durante pelo menos 72 h (Tabela 8) . Os resultados mostram gue ORG apresenta um efeito antidepressivo de início rápido gue dura pelo menos 72 h.

Tabela 8. Relação tempo-resposta para ORG no FST em ratos

Grupo ÍDose j(mg/kg) | Tempo após a júltima | administração 1 (h) iNúmero ide lanimais | Imobilidade I(%NS) (média !± EPM) Valor P NS ii 150 ! 100 | 6 [2,5 20 73,63 ± 14,21* <0,001 UKCj I6 i5 20 ! 71, 92 ± i 6,05* 0, 001 32

Grupo

Dose (mg/kg) 6 6

Tempo após a última administração (h) 24 72 6 2 (semanas) iNúmero Imobilidade Valor ide (%NS) (média ianimais ± EPM) P 20 62,83 ± 6, 59* <0,001 ! 2 0 77,33 ± 6, 07* 0, 002 20 99, 54 ± 5,54 0, 954 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS).

Experiência 3

Efeito antidepressivo do ORG no modelo de stress ligeiro imprevisível crónico em ratos [0075] 0 stress ligeiro imprevisível crónico (CMS) é considerado um modelo de depressão que tem a mesma etiologia do stress crónico que exacerba ou causa a depressão em humanos. Uma variedade de stresses ligeiros imprevisíveis, tais como a restrição alimentar ou de bebida, a imobilização e terem de nadar, pode levar os animais a uma falta de resposta à recompensa (e.g. preferência de bebida açucarada). 0 tempo de imobilidade aumenta significativamente no FST e TST após exposição a CMS, indicando uma depressão mais acentuada. Assim, o CMS é amplamente usado para avaliar os efeitos de antidepressivos na depressão causada por stress. 3.1. Métodos experimentais [0076] Foram usados ratos Kunming (número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. Os ratos tinham 3-4 semanas de idade no início das experiências e pesavam 33 25-30 g. Os números de animais em cada grupo estão apresentados nas Tabelas 9 e 10. O ORG foi preparado tal como descrito no Exemplo 1. Os animais foram divididos em grupos experimentais com diferentes doses, um grupo de controlo de veiculo e um grupo imipramina (Sigma, Lote N.° 106kl588) como controlo positivo.

[0077] Modelo CMS: Os stresses ligeiros crónicos a que os ratos Kunming foram sujeitos foram: inversão do ritmo circadiano, luz continua, frio, cama húmida, gaiola inclinada, restrição alimentar e de água e imobilidade forçada. Apenas um destes stresses foi imposto a cada rato aleatoriamente no periodo de 24 h e o mesmo stress não surgiu duas vezes consecutivamente. O período de stress durou 8 semanas. Na última semana, o ORG foi administrado oralmente uma vez por dia durante 7 dias consecutivos. O teste comportamental foi realizado 30 minutos após a última administração. 0 parâmetro testado foi 0 tempo de imobilidade no FST e TST nos ratos do modelo de CMS . Os métodos de FST e TST e a análise dos dados foram como descrito acima. 3.2. Resultados

3.2.1 Efeito antidepressivo do ORG no FST em ratos no modelo de CMS

[0078] ORG reduziu significativamente o tempo de imobilidade no FST e os efeitos foram significativamente dependentes da dose (Tabela 9). A melhor dose para o efeito antidepressivo foi 20 mg/kg e o ED50 foi de cerca de 0,81 mg/kg. 34

Tabela 9. Relação dose-tempo de imobilidade do ORG no FST em ratos no modelo de CMS

Grupo Dose (mg/kg) jNúmero | animais de $ 1 ^imobilidade (media |epm) ± jvalor p NS 0,1 ml/10 g 28 (208, 00 + 5,57 \ 1,25 10 1190, 90 + 12, 94 jO,255 2,5 11 1177, 00 + 11,78* 10,033 ORG 5 10 1177, 50 ± 12,39* 10,043 10 19 117 0, 84 + 10,48* j 0,002 20 2 0 1164, 95 + 11,36* |<o,ooi Imipramina 15 | io \ 16 6, 00 + 13,84* 10,005 rP <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS).

3.2.2 Efeito antidepressivo do ORG no TST em ratos no modelo de CMS

[0079] ORG reduziu significativamente o tempo de imobilidade no TST e os efeitos foram significativamente dependentes da dose (Tabela 10) . A melhor dose para o efeito antidepressivo foi 20 mg/kg e o ED50 foi de cerca de 4,22 mg/kg.

Tabela 10. Relação dose-tempo de imobilidade do ORG no TST em ratos no modelo de CMS

Grupo Dose (mg/kg) jNúmero de | animais íTempo (s) í imobilidade j(média ± EPM) de I jvalor p NS 0,1 ml/lOg 116 1185,25 ± 6,66 1,25 | ío ΐ171,20 ± 13,02 0,3 92 ORG 5 10 {14 6,30 ± 11,66* 10,018 10 16 1145,31 ± 12,41* 0,006 20 ! 6 1140,69 ± 14,14* 0,0 02 35

Grupo Dose (mg/kg) jNúmero |animais de Tempo (s) imobilidade (média ± EPM) de | jValor p Imipramina 15 j 9 131,22 ± 10,61* ] 0,0 02 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS) . — 3.3 IT do ORG no TST e no FST em ratos no modelo de CMS [0080] No teste de toxicidade aguda, quando os ratos receberam ORG numa dose de 1750 mg/kg , a concentração saturada, a investigação etológica e histológica não revelaram nada de anormal. Então, a dose tóxica média (TD50) do ORG foi superior a 1750 mg/kg. O índice terapêutico (IT) do ORG em ratos CMS no FST => 1750 mg/kg 1 0,81 mg/kg => 2160. O índice terapêutico (IT) do ORG em ratos CMS no TST = TD50 1 ED50 => 1750 mg/kg 1 4,22 mg/kg => 415.

Experiência 4

Efeito antidepressivo do ORG no modelo de escuridão permanente (DD) em ratos [0081] O modelo DD é um modelo etiológico apresentado recentemente, que é usado para estudar a depressão associada à perturbação do ritmo circadiano. Neste modelo, o ritmo circadiano do animal é alterado numa condição de criação contínua no escuro que induz ou exacerba a depressão. Assim, neste estudo, o modelo DD foi usado para causar ou exacerbar a depressão e o efeito antidepressivo do ORG foi então testado no FST e no TST. 36 4.1 Métodos experimentais [0082] Foram usados ratos Kunming (número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Provincia de Sichuan. Os ratos tinham 3-4 semanas de idade no inicio das experiências e pesavam 25-30 g. Os números de animais em cada grupo estão apresentados nas Tabelas 11 e 12. O ORG foi preparado tal como descrito no Exemplo 1. Os animais foram divididos em grupos experimentais com diferentes doses, grupos de controlo de veiculo e um grupo imipramina (Sigma, Lote N.° 106kl588) como controlo positivo.

[0083] Modelo DD em ratos: Os ratos foram mantidos continuamente no escuro. A substituição da cama, a adição de água e alimentos e outras operações foram realizadas com a condição de que a intensidade de luz vermelha fosse inferior a 1,0 lux. Esta situação prolongou-se por 28 dias. Na última semana, foi administrado oralmente ORG uma vez por dia durante 1 semana. 0 FST e o TST foram realizados 30 minutos após a última administração. Os métodos e análise de dados foram como acima descrito. 4.2 Resultados

4.2.1 Efeito antidepressivo do ORG no FST em ratos no modelo DD

[0084] ORG reduziu significativamente o tempo de imobilidade no FST e os efeitos foram significativamente dependentes da dose (Tabela 11). A dose com melhor eficácia foi 10 mg/kg, e o ED50 foi de cerca de 1,48 mg/kg. 37

Tabela 11. Relação dose-tempo de imobilidade de ORG no FST em ratos no modelo DD

Grupo jDose I (mg/kg) Tempo (s) Numero de· . . . Ί . . , , , ,. : imobilidade (media animais jEpM) de | ±|valor p NS jo,l ml/10 !g 32 193,13 ± 5, 57 \ 1,25 11 ! 180,27 ± 10,36 jO,306 12, 5 11 174,27 ± 11,89 10,134 ORG |5 10 161,70 ± 14,89* 10,016 l10 21 1151,86 ± 8,89* j <0,001 140 10 1156,60 ± 13,86* |o,005 Imipramina !15 11 1161,22 ± 13,08* 10,019 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS) .

4.2.2 Efeito antidepressivo do ORG no TST em ratos no modelo DD

[0085] ORG reduziu significativamente o tempo de imobilidade no TST e os efeitos foram significativamente dependentes da dose (Tabela 12). A dose com melhor eficácia foi 20 mg/kg, e o ED50 foi de cerca de 1,75 mg/kg.

Tabela 12. Relação dose-tempo de imobilidade de ORG em TST em ratos no modelo DD

Grupo

Dose (mg/kg) jNúmero |de janimais N,S, jO, 1 ml/10 ]l, 2515 ORG I |1012 0

Imipramina |15 g |16 ] 0 1 0 116 116 9 I Tempo (s) dej limobilidade (médiajValor p i± EPM) j i 185, 25 ± 6,66 | j171,20 ± 13,02 0,392 1146, 30 ± 11,66* 0,018 j145,31 ± 12,41* 0,006 ! 140, 69 ± 14,138* 0,0 02 j131,22 ± 10,61* 0,002 38

Grupo

Dose (mg/kg) Número de animais

Tempo (s) dej imobilidade (médiajValor p ± EPM) | *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS),

Experiência 5

Efeito antidepressivo do ORG no modelo de privação do sono (SD) em ratos [0086] A perturbação do sono é um dos sintomas da depressão. Pode ser um dos factores patológicos que desencadeiam ou exacerbam a depressão. 0 comportamento de tipo depressivo como a imobilidade é reforçado pela privação do sono. Assim, o modelo SD foi usado para causar ou exacerbar a depressão e o efeito antidepressivo do ORG foi então testado em FST e TST em ratos no modelo SD. 5.1 Método experimental [0087] Foram usados ratos Kunming (número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. Os ratos tinham 3-4 semanas de idade no início das experiências e pesavam 25-30 g. Os números de animais em cada grupo estão apresentados na Tabela 13. 0 ORG foi preparado tal como descrito no Exemplo 1. Os animais foram divididos em grupos experimentais com diferentes doses, um grupo de controlo de veículo e um grupo imipramina (Sigma, Lote N.° 106kl588) como controlo positivo.

[0088] Modelo SD: Foi usado um método modificado com múltiplas plataformas num ambiente aquoso para estabelecer o modelo SD em ratos. Os ratos nas plataformas podiam comer 39 e beber à vontade. Contudo, se adormecessem, caíam na água devido à perda de tónus muscular. Os animais que caíam subiam novamente para a plataforma através de um poste inclinado que apoiava as plataformas. Após 72 h de privação do sono, ORG foi administrado oralmente 24 h e 5 h antes de iniciar o FST. Foi registado o tempo de imobilidade dos animais. Os métodos e análise de dados foram como acima descritos. 5.2. Resultados

5.2.1 Efeito antidepressivo do ORG no FST em ratos no modelo SD

[0089] No terceiro dos três dias de privaçao do sono, o ORG foi administrado duas vezes 24 h e 5 h antes de iniciar o FST. ORG reduziu significativamente o tempo de imobilidade no FST e os efeitos foram significativamente dependentes da dose (Tabela 13) . A dose com melhor eficácia foi 10 mg/kg, e o ED50 foi de cerca de 3,79 mg/kg.

Tabela 13. Relação dose-tempo de imobilidade do ORG e TST em ratos no modelo SD :! ii iTempo (s) de j

Grupo Dose (mg/kg) Número animais de imobilidade (média EPM) 1Valor ± i | p NS 0,1 ml/10 g 26 189,27 ± 9, 67 l ORG 1,25 10 198,00 ± 11,43 ] 0,57 0 ORG 2,5 12 177,67 ± 15, 95 ] 0,421 40

Tempo (s) de i

Grupo Dose (mg/kg) Número de animais imobilidade (média EPM) |Valor + | ! P ORG 5 10 160, 80 ± 11, 64 j 0,0 64 ORG 7,5 10 153, 00 ± 11,83* 10,019 ORG 10 22 148, 23 ± 7,80* lo,001 ORG 20 21 162, 67 + 9, 27* 10,029 Imipram 7,5 11 150, 27 ± 13,17* 0, 009 ma Φ <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS),

5.3. índice terapêutico do ORG em ratos no modelo DD e no modelo SD

[0090] A dose tóxica média (TD50) do ORG foi superior a 1750 mg/kg (ver acima) . 0 índice terapêutico do ORG em ratos DD no FST = TD50 t ED50 => 1750 mg/kg 1 1,48 mg/kg =>1182. O índice terapêutico do ORG em ratos DD no TST = TD50 -t ED50 => 1750 mg/kg 1 1,75 mg/kg => 1000 . O índice terapêutico do ORG em ratos SD no FST = TD50 1 ED50 => 1750 mg/kg -f 3,79 mg/kg =>462.

Experiência 6

Estudo farmacológico do efeito ansiolitico do ORG

[0091] 0 comportamento de imobilidade completa induzido por choques nos pés e o stress por medo condicionado em roedores são amplamente aceites como modelos para avaliar o nível de ansiedade. Os roedores exibem um comportamento de 41 imobilidade total quando é aplicado um estímulo negativo. A imobilidade total, que é uma resposta normal dos animais a estímulos de medo inevitáveis, é definida como a ausência total de movimento corporal ou a manutenção de uma postura de agachamento. Os ansiolíticos reduzem o comportamento de imobilidade total nos animais. Adicionalmente, o teste do labirinto elevado é um modelo amplamente aceite para a avaliação da ansiedade em roedores. A avaliação da ansiedade é baseada no conflito entre a tendência para exploração da novidade e o medo das alturas, de modo que o roedor gasta espontaneamente mais tempo no braço fechado do labirinto elevado se estiver com medo. Assim, o comportamento de exploração de novidade é reforçado por ansiolíticos e é inibido por ansiogénicos. 6.1 Métodos experimentais [0092] Foram usados ratos Kunming (número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. Os ratos tinham 3-4 semanas de idade no início da experiência e pesavam 25-30 g. Os números de animais em cada grupo estão apresentados na Tabela 13. O ORG foi preparado tal como descrito no Exemplo 1. Os animais foram divididos em grupos experimentais com diferentes doses, um grupo de controlo de veículo e um grupo diazepam (Jinyao Ltd. Co., Lote N.° 106kl588) como controlo positivo.

[0093] Comportamento de imobilidade total induzido por choques nos pés: Os animais receberam uma injecção i.p. de ORG ou veículo 24 h e 5 h antes de serem colocados numa câmara de condicionamento Standard (Med Associates, USA) durante uma sessão de treino de 10 minutos. Dois, 4, 6, 8 e 42 10 minutos após o início da sessão, foi administrado um choque nos pés (0,8 mA, 2 s) através do chão de rede metálica da câmara. Foi registado o tempo de imobilidade total durante os últimos 5 minutos. As ratazanas foram colocadas novamente na câmara sem choques nos pés 24 h após o primeiro treino e foi registado o tempo de imobilidade total.

[0094] Teste do labirinto elevado (EPM): 0 EPM tinha dois braços abertos e dois braços fechados de tamanho igual (30 cm de comprimento χ 5 cm largura). Os dois braços fechados estavam ligados por uma área central de 5 cm χ 5 cm. Todo o labirinto foi elevado para uma altura de 35 cm. ORG foi administrado i.p. 24 h e 5 h antes do teste começar. Os ratos foram colocados individualmente no centro do labirinto voltados para um braço fechado. Cada animal foi testado durante 5 minutos numa única sessão. O número de entradas nos braços abertos, o número de entradas nos braços fechado, o tempo total gasto nos braços abertos, e o tempo total gasto nos braços fechado foram registados; o critério de entrada foi definido como a passagem de todos os membros pelo braço. O número de entradas nos braços abertos e o tempo gasto nos braços abertos foram os indícios principais para avaliar o nível de ansiedade dos animais, já que quanto mais entradas ou tempo, menor o nível de ansiedade.

[0095] Análise dos dados: Os resultados do teste são expressos como média ± EPM. Foi usada a ANOVA unidireccional seguida de teste DMS com o software SPSS 11. 0 nível de significância foi definido como P <0,05. 43 6.2 Resultados 6.2.1 O efeito ansiolitico do ORG no teste de comportamento de imobilidade total induzido por choque nos pés em ratazanas [0096] 0 tempo de imobilidade total foi reduzido significativamente em ratazanas quando ORG foi administrado intraperitonealmente 24 h e 5 h antes do teste começar (Tabela 14) .

Tabela 14. Relação dose-resposta do ORG no teste de comportamento de imobilidade total induzido por choque nos pés em ratazanas (Dose (Número de (Duração de imobilidade! Grupo : j (Valor p : (mg/kg) ij ratazanas (total (s) (média ± EP) j Io, 1 NS j 110 \22Ί, 90 ± 20,70 ( ij ml /10 0 g I5 I io (203, 90 ± 34,09 0,523 ORG i..................... $ | i 2 C | io (100,70 ± 21,78* 0,002 rP <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS), 6.2.2 Efeito ansiolitico do ORG no teste de comportamento de imobilidade total induzido por stress por medo condicionado em ratazanas [0097] As ratazanas receberam ORG i.p. duas vezes às 24 h e 5 h antes de receberem os choques nos pés e reexposição ao mesmo ambiente sem choque nos pés 24 h mais tarde. A evocação da memória do medo induzida por estímulos ambientais conduz ao comportamento de imobilidade total 44 induzido por stress devido a medo condicionado em ratazanas. ORG reduziu significativamente o comportamento de imobilidade total (Tabela 15).

Tabela 15. Relação dose-resposta do ORG no teste do comportamento de imobilidade total induzido por stress por medo condicionado em ratazanas

Grupo Dose (mg/kg) Número ratazanas de jDuração da imobilidade jtotal (s) (média ± EPM) Valor P 0,1 NS ml/100 10 ]285,4 0 ± 47,91 g | 5 10 !310,30 ± 66,19 0,776 ORG 20 10 | 95, 0 0 ± 17,73* 0,004 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS). 6.2.3 Efeito ansiolitico do ORG no teste do labirinto elevado em ratos [0098] ORG administrado duas vezes às 24 h e 5 h antes do teste de labirinto elevado aumentou significativamente o número de entradas em braços abertos e o tempo total gasto nos braços abertos (Tabelas 16 e 17). Este resultado indicou um efeito ansiolitico significativo do ORG. 45

Tabela 16. ORG (i.p.) aumentou o tempo total gasto nos braços abertos em ratos

Grupo Dose (mg/kg) jNúmero ide ratos jTempo total gasto jbraços abertos 1 (média ± EPM) nos | (s) jValor p NS 0,1 ml/10 g 110 132,50 ± 8,93 \ 5 |1 o j50,00 ± 8,99 10,151 ORG 20 110 j16,50 ± 3,60 10,18 8 100 I10 170, 60 ± 11,56* 0,003 Diazepam 2 jio 146, 90 ± 7,19 0,236 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS).

Tabela 17. ORG (i.p.) aumentou as entradas nos braços abertos em ratos Número de entradas nos Dose Número de Valor Grupo (mg/kg) ratos braços abertos (média ± EPM) P NS 0,1 10 3,50 + 0,87 ml/10 g 5 10 4,50 ± 0,58 ! 0,27 9 20 10 1, 80 ± 0,79 10,0 69 100 10 5,90 ± 0,57* 10,012 Diazepam 2 10 4,80 ± 0,77 ] 0,161 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS).

Experiência 7

Estudo farmacológico do efeito anti-stress do ORG

[0099] 0 stress é definido em sistemas biológicos como qualquer condição que perturbe gravemente a homeostase fisiológica ou psicológica de um organismo. Considera-se que o stress é um dos factores principais que exacerba ou gera muitas doenças. 0 hipocampo é uma formação cerebral 46 importante na aprendizagem e memória, assim como na regulação das respostas ao stress. 0 stress pode conduzir a redução da plasticidade sináptica do hipocampo, a dificuldades de aprendizagem e memória. A concentração de corticosterona sérica é uma das indicações mais comuns para avaliar os niveis de stress. 7.1 Métodos experimentais [0100] Foram usadas ratazanas com peso de 250-300 g, do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. 0 ORG foi preparado como descrito no Exemplo 1. A fluoxetina foi adquirida à Wuhan Yuancheng Technology Co. (Wuhan, China; Lote N.° 1004-0801002).

[0101] Determinação da corticosterona sérica: Foi usado o radioimunoensaio (RIA; DSL 80100; Texas) para determinar o efeito do ORG na concentração de corticosterona sérica. No grupo não sujeito a stress, o sangue foi colhido por punção cardíaca sob anestesia com éter 1 h após a injecção com ORG. No grupo sujeito a stress, 1 h após a injecção com ORG, as ratazanas foram sujeitas a stress por plataforma elevada durante 30 minutos e depois as amostras foram colhidas do mesmo modo. As amostras de sangue foram mantidas à temperatura ambiente durante 4 h e depois centrifugadas durante 15 minutos (3000 rpm). O sobrenadante (sérico) foi colhido e guardado a -20°C.

[0102] Método de registo da potenciação a longo prazo (LTP) no hipocampo: Os potenciais excitatórios pós-sinápticos (EPSPs) no hipocampo foram registados para determinar o efeito anti-stress do ORG. O stress compromete a LTP na área CAI do hipocampo e isso pode ser resolvido por 47 fármacos anti-stress. Ratazanas foram sujeitas a stress por choque nos pés do modo que se segue: 1 mA, 2s, 5 vezes, a intervalos de 2 minutos. Foram preparadas fatias do hipocampo, que foram depois incubadas durante lha 34-36°C e posteriormente mantidas à temperatura ambiente. Foi aplicado ORG na solução de banho. Os EPSPs mediados pelos receptores NMDA e AMPA na região CAI foram registados até os valores iniciais estarem estáveis durante 20 minutos. Então, foi usada uma frequência de estimulação elevada (HFS, 100 Hz, 100 impulsos, intervalo de 20 s) para induzir a LTP. Os EPSPs foram registados durante 1 h após a HFS.

[0103] Análise dos dados: Os dados são expressos como média ± EPM e a LTP é expressa como a percentagem da amplitude média dos últimos 10 minutos relativamente ao início do estudo. Foi usada ANOVA unidireccional seguida de teste DMS com o software SPSS 11. O nível de signif icância foi definido como P <0,05. 7.2 Resultados 7.2.1 Efeito anti-stress do ORG (i.p.) na elevação induzida por stress agudo do nivel de corticosterona sérica.

[0104] O sangue foi colhido por punção cardíaca 1 h após a injecção i.p. do ORG em controlos ou após a experiência de stress de 30 minutos. O ORG reduziu significativamente o nível de corticosterona sérica de um modo dependente da dose (Tabela 18). 48

Tabela 18. Relação dose-nivel de corticosterona de ORG (i.p.) IDose ! Número IConcentraçao de iVa1or Grupos ide jcorticosterona sérica ^ mg/ Kg) janimais |(ng/ml) (média ± EPM) \P Sem stress + ^0,1 t......................... NS (ml/lOOg ! 16 1116, 06 ± 27,84 (O,875 |8 12 0 9, 02 ± 52,77 jO,197 Sem stress + |3,5 I8 1166, 06 ± 41,90 Í0, 649 ORG |l4 16 j70, 04 ± 14,75 (O,084 (28 I8 1 63,13 ± 22,21 (0,122 Sem stress +! 15 16 116 7,20 ± 31,35 (O,559 Fluoxetina 130 |8 117 8,14 ± 38,77 (O,490 Í3,l Stress + NS jml/100 I16 13 2 4,30 ± 48,81 jg I | 0,875 I8 13 4 9, 85 ± 61,75 (0,706 j3, 5 18 12 6 3, 63 ± 49, 14 lO,372 Stress + ORG ----- --------------------- ----—------ ] 14 |16 12 3 7, 63 ± 32,45 10,120 j 2 8 |8 113 7,41 ± 26,84* lO,007 Stress + l15 ! 16 (331,35 ± 46, 43 jO, 899 Fluoxetina j 30 i8 (324,58 ± 58,63 (0,997 rP <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS), 7.2.2 Efeito de recuperação do ORG na LTP no hipocampo comprometido pelo stress [0105] Foram preparadas fatias do hipocampo de ratazanas após exposição a stress por choque nos pés, que é um protocolo bem aceite para debilitar a LTP no hipocampo. Em fatias incubadas com ORG durante 1 h, foram registados os EPSPs iniciais durante 20 minutos. ORG restaurou a LTP comprometida pelo stress e até a aumentou significativamente na dose de 5 μΜ/L, revelando um efeito dependente da dose (Tabela 19). 49 [0106] Os resultados acima mostram que o ORG tem um efeito anti-stress significativo e um valor clinico importante no tratamento da depressão com etiologia associada ao stress.

Tabela 19. Relação dose-efeito nas fatias do hipocampo incubadas com ORG na recuperação da LTP comprometida pelo stress

Grupos pose Número de fatias Média dos últimos 10 min, (média ± EPM) Valor P Controlo \ 9 134,52 ± 10,71 Controlo + i uM ORG \ K 11 122,93 ± 3,75 0,453 FS + NS |0'. 11 113,22 + 6,77 0,234 sml/10 g FS + ORG 150 nM 9 128,99 ± 7,30 0,732 FS + ORG |5 μΜ 8 189, 56 ± 23, 6* 0,002 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS).

Experiência 8

Estudo farmacológico de ORG e reforço da aprendizagem e memória [0107] 0 labirinto de água de Morris (MWM) é amplamente usado em estudos de aprendizagem e memória dependentes do hipocampo e respectivos mecanismos celulares e moleculares. É habitualmente aceite que o MWM é um método eficaz de avaliação farmacológica da aprendizagem e memória. A latência, estratégia e trajectória de fuga dos animais são automaticamente detectadas e analisadas para investigar a respectiva aprendizagem e memória espacial. Depois de os animais aprenderem a escapar, a plataforma oculta é removida para testar a retenção no quadrante alvo. 50

Um período mais longo gasto no quadrante direito indica uma memória melhor. 8.1 Métodos experimentais [0108] Foram usados ratos Kunming (número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. Os ratos tinham 3-4 semanas de idade no início da experiência e pesavam 25-30 g. Os números de animais em cada grupo estão apresentados nas Tabelas 20 e 21. O ORG foi preparado tal como descrito no Exemplo 1. Os animais foram divididos em grupos de administração de fluoxetina ou doses diferentes de ORG e um grupo de controlo de veículo. Os grupos de administração de substância receberam 1,75 mg/kg ou 3,5 mg/kg de ORG ou 15 mg/kg de fluoxetina. Os animais receberam uma única injecção i.p. de substância ou veículo 30 minutos após o treino diário ou 30 minutos antes do teste de retenção no dia 8.

[0109] Labirinto de água de Morris: O MWM foi realizado numa piscina circular (100 cm de diâmetro e 36 cm de profundidade) com uma plataforma oculta (10 cm x 10 cm) que estava aproximadamente 1 cm abaixo da superfície da água. A piscina estava circundada por cortinas amarelas com marcadores de formas diferentes suspensos em cada quadrante. O tempo dispendido até encontrar a plataforma oculta e a trajectória do rato foram registados por computador. Dos dias 1 ao 7, os ratos foram colocados na piscina para procurar a plataforma oculta fixa. No dia 8, a plataforma foi removida e o tempo que o rato despendeu no quadrante alvo foi contado em 1 minuto de natação livre. 51 [0110] Análise dos dados: Os resultados do teste são expressos como média ± EPM. Foi usada ANOVA unidireccional seguida de teste DMS com o software SPSS 11. 0 nivel de significância foi definido como P <0,05. 8.2. Resultados

8.2.1 Efeito de ORG (i.p.) imediatamente após o treino no teste MWM

[0111] Quando ORG foi administrado após treino diário, a evocação da memória espacial (o tempo que os animais despenderam no quadrante alvo) foi reforçada significativamente ao influenciar a memória de consolidação (Tabela 20).

Tabela 20. A memória espacial foi reforçada nos ratos com a administração diária de ORG após o treino

Grupo ;ÍDose | (mg/kg) Número de ratos Tempo gasto quadrante direito (média ± EPM) no (s) Valor P NS |o,i (ml/10 g 10 27,10 ± 2,79 ORG ] 1,7 5 10 28,18 ± 1,70 0,74 ORG j 3,5 10 34,24 ± 2,01* 0,03 Fluoxetina 115 9 32,61 ± 2,20 0,11 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS).

8.2.2 Efeito de ORG (i.p.) antes da evocação no teste MWM 52 [0112] O treino terminou após 7 dias. O teste de evocação foi realizado no dia 8. Quando o ORG foi administrado 30 minutos antes da evocação, a memória de evocação espacial foi significativamente reforçada (Tabela 21).

Tabela 21. A memória espacial foi reforçada em ratos aos quais foi administrado ORG 30 minutos antes da evocação depempo gasto no quadrante Valo ^direito (s) (média ± EPM) r p §27, 95 ± 2,19 2:9, 38 ± 2,16 0, 65 135,52 ± 2,43* 0, 02 129, 4 4 ± 2,14 0, 65

Grupo pose ΐ(mg/kg) Número ratos NS |o,i jml/10 g 10 ORG ! 1,7 5 10 ORG 13,5 10 Fluoxet ina !15 9 *P <0,05 (ANOVA unidireccional seguida de DMS).

Experiência 9

Teste de toxicidade de ORG 9.1 Teste de toxicidade aguda do ORG em ratos 9.1.1 Métodos experimentais [0113] Foram usados ratos Kunming (número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. Os ratos tinham 3-4 semanas de idade no início da experiência e pesavam 25- 53 30 g. O ORG foi preparado tal como descrito no Exemplo 1. ORG (1750 mg) foi dissolvido em 10 ml NS para produzir uma concentração de 175 mg/ml. Os ratos foram divididos em dois grupos, o grupo ORG para avaliação recebeu ORG e um grupo foi tratado com NS para controlo de veiculo. Foram administrados oralmente ORG e NS a cada grupo num volume de 0,1 ml/10 g. 9.1.2. Resultados [0114] Quando o ORG foi administrado a ratos a 1750 mg/kg num teste de toxicidade aguda, a aparência, comportamento, estado mental, apetite, cabelo, cor e respiração dos animais foram observados durante 14 dias e não foi detectado nada de anormal. Todos os ratos sobreviveram à experiência e o ganho de peso foi normal. Não se verificou uma diferença significativa entre os dois grupos. Todos os ratos foram sacrificados no dia 14, e o coração, fígado, baço, pulmões, rins, pâncreas, ovários, testículos, intestino delgado e outros órgãos viscerais foram investigados por secção patológica e também não revelaram anomalias evidentes. 9.2 Teste de toxicidade subaguda do ORG em ratazanas 9.2.1 Métodos experimentais [0115] Foram usadas ratazanas (Número de certificado: A4CXK(Chuan)2003-16) do Instituto de Animais Experimentais, Hospital Popular da Província de Sichuan. 0 respectivo peso era de 250-300 g. O ORG foi preparado tal como descrito no Exemplo 1. 54 9.2.2 Resultados [0116] ORG (1750 mg/kg) , que é 7955 vezes o ED50 no FST a ratos e 2397 vezes o ED50 no TST a ratos, foi administrado oralmente uma vez ao dia durante 14 dias consecutivos. A aparência, comportamento, estado mental, apetite, cabelo, cor e respiração dos animais foram observados durante 14 dias e não foi detectado nada de anormal. Todas as ratazanas sobreviveram à experiência e o ganho de peso foi normal. Não se verificou uma diferença significativa entre os dois grupos. Todas as ratazanas foram sacrificadas no dia 14, e o coração, fígado, baço, pulmões, rins, pâncreas, ovários, testículos, intestino delgado e outros órgãos viscerais foram investigados por secção patológica e imagens das secções tecidulares não revelaram anomalias evidentes.

Resumo farmacológico de 5-metil-l,3-benzenodiol e seus derivados [0117] A relação dose-efeito e tempo-resposta dos efeitos antidepressivos do ORG e seus derivados foram estudados usando os modelos FST, TST, DD, SD e CMS. Os resultados indicam que o OR, ORG e seus derivados exibem actividades úteis para tratar e prevenir a depressão e os sintomas sugestivos de depressão: perturbações do ritmo circadiano, perturbações do sono e stress crónico. Estudos do mecanismo ant idepressivo revelaram que o OR, ORG e seus derivados reparam a redução da LTP no hipocampo, reforçam a aprendizagem e memória dependentes do hipocampo, e tratam e previnem os factores relacionados com a depressão, como ansiedade e stress agudo. O mecanismo da LTP no hipocampo 55 relaciona-se sobretudo com receptores NMDA e AMPA e suas vias moleculares e celulares. Em conclusão, o OR, ORG e seus derivados podem ajustar estes alvos como reguladores e produzir os efeitos de tratamento e prevenção da depressão através da recuperação da LTP no hipocampo.

[0118] Uma vez que os neurónios comunicam principalmente via sinapses químicas, e se considera que as memórias são armazenadas dentro dessas sinapses, a LTP é considerada um dos mecanismos celulares principais subjacentes à aprendizagem e à memória. Assim, o OR, ORG e seus derivados podem também ser aplicados para tratar e prevenir outras perturbações como a doença de Alzheimer, PHDA infantil, autismo e esquizofrenia. Já que mais do que 90% de todas as doenças podem ser induzidas ou exacerbadas por stress e as funções do hipocampo de regulação do stress envolvem plasticidade sináptica, o OR, ORG e seus derivados podem ser benéficos no tratamento, prevenção e reabilitação de muitas doenças na prática clínica, por exemplo, no caso de toxicodependentes que sofrem de stress extremo no decurso do período de desintoxicação e doentes com cancro ou doença cardiovascular sujeitos a stress excessivo ou ansiedade.

[0119] Em combinação com os resultados das experiências preliminares de toxicidade, o OR, ORG e seus derivados têm novas aplicações no tratamento e prevenção da depressão e causas etiológicas da mesma com características de eficiência elevada e toxicidade reduzida. Outros usos do OR, ORG e seus derivados são aplicações no tratamento e prevenção de sintomas sugestivos de depressão, tais como stress agudo e ansiedade. Os mecanismos envolvidos no efeito antidepressivo do OR, ORG e seus derivados são a regulação de corticosteróides séricos, a plasticidade 56 sináptica no hipocampo, incluindo os receptores NMDA e AMPA e respectivas vias de sinalização intracelular, e a aprendizagem e memória.

[0120] Assim, as utilizações terapêuticas e os efeitos benéficos da presente invenção do OR, ORG e seus derivados são os seguintes: (1) efeito terapêutico sobre a depressão; (2) efeitos terapêuticos sobre as causas da depressão; (3) efeitos terapêuticos sobre os sintomas da depressão. Os compostos revelados podem também ser úteis para outras doenças gue envolvam stress, ansiedade e redução de capacidades cognitivas.

Lisboa, 57

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uso de 5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula I ou preparações farmacêuticas contendo 5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula I para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção da depressão

   em que: R1 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (1—*-6) -β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-O-acetil^-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo,propionilo, benzoilo, cinamoilo,succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo; R2 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6) -β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-O-acetίΙ-β-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo,propionilo, benzoilo, cinamoilo,succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo. 1 seus derivados
2. 2. Uso de 5-metil-l,3-benzenodiol ou representados pela Fórmula II ou preparações farmacêuticas contendo 5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula II para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção da depressão Me HO

   II em que: r1 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D glucopiranosil-(1—6)-β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6 tetra-O-acetil^-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoilo, cinamoilo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo.
3. 3. Uso de 5-Metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula II de acordo com a Reivindicação 2, em que R1 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D- glucopiranosil-(1-6)-β-D-glucopiranosilo, 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil^-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosil ou arabinosil.
4. 4. Uso de 5-metil-l,3-benzenodiol ou respectivos derivados representados pela Fórmula II de acordo com a Reivindicação 3, em que R1 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil-(1-6)-β-D-glucopiranosil. 2
5. 5. Uso de derivados de 5-metil-l,3-benzenodiol representados pela Fórmula III ou preparações farmacêuticas que os contêm para o fabrico de um medicamento para tratamento ou prevenção da depressão Me °Gic RO III em que: R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6)-β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-0-acetil^-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoilo, cinamoilo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo.
6. 6. Uso de 5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula III de acordo com a Reivindicação 2, em que R2 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6) -β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-0-acetϋ-β-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosil ou arabinosil.
7. 7. Uso de acordo com a Reivindicação 6, em que o R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6) -β-D-glucopiranosilo ou ramnopiranosilo. 3
8. 8. Uso de derivados de 5-metil-l,3-benzenodiol representados pela Fórmula IV ou preparações farmacêuticas que as contêm para o fabrico de um medicamento para tratamento ou prevenção da depressão

   R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6)-β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-0-acetil^-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoilo, cinamoilo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo.
9. 9. Uso de acordo com a Reivindicação 8, onde R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6) -β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-0-acetϋ-β-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoilo, cinamoilo ou succinilo.
10. 10. Uso de acordo com a Reivindicação 8, em que R2 é 2,3,4, 6-tetra-0-acetil^-D-glucopiranosilo ou acetilo: 1,3-O-diacetilorcinol ou 3-0-acetil-orcinol-l-0-(2,3,4,6-tetraacetil)-β-D-glucopiranósido.
11. 11. Uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 10, de 5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados representados pelas Fórmulas I, II, III ou IV ou 4 preparações farmacêuticas contendo 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula I, II, III ou IV em excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou suplementos dietéticos aceitáveis para tratamento ou prevenção da depressão, para regular directamente a LTP no hipocampo e regular os corticosteróides séricos.
12. 12. Uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 10, em que o termo "depressão" inclui os seguintes subtipos: (1) depressão e perturbações do humor, tais como depressão, psicose maníaco-depressiva, depressão mista e distúrbio maníaco ou hipomania; ou (2) perturbações depressivas, tais como perturbação depressiva e distimia; ou (3) outros distúrbios afectivos, causados por diferentes doenças mentais ou subtipos de perturbações com características de perturbações depressivas e distúrbios afectivos causados por substâncias (por exemplo, drogas) ou tratamentos (como cirurgia, radioterapia ou quimioterapia) ; (4) perturbação bipolar ou perturbação afectiva bipolar, com dois ou mais episódios de depressão e hipomania, e episódios alternados de mania e depressão.
13. 13. Uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 10, em que os sintomas de depressão ou sintomas sugestivos de depressão se referem a perturbações do ritmo circadiano, perturbações do sono e stress crónico, ansiedade, incapacidade induzida por stress agudo ou redução ou distúrbio das capacidades cognitivas. 5
14. 14. Uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 10, em que os alimentos funcionais incluem alimentos ou bebidas comuns aos quais são aplicados 5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados ou preparações farmacêuticas contendo 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados são aplicados para tratar e prevenir os supramencionados sintomas de depressão ou sugestivos de depressão.
15. 15. Um medicamento compreendendo 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula I ou composições farmacêuticas contendo os componentes activos (5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados I) em veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis: Me

    em que: R1 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D- glucopiranosil-(1-6)-β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6- tetra-O-acetil^-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoílo, cinamoílo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo; R2 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D- glucopiranosil-(1-6)-β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6- tetra-O-acetil^-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoílo, cinamoílo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo para uso no tratamento ou prevenção da depressão. 6
16. 16. Um medicamento compreendendo 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula II ou composições farmacêuticas contendo componentes activos (5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados II) em veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis:

    II em que: R1 é hidrogénio, β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (1-,6) -β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-O-acetil^-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoílo, cinamoílo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo para uso no tratamento ou prevenção da depressão.
17. 17. Um medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 16, onde R1 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (1-,6) -β-D-glucopiranosilo, 2,3,4, 6-tetra-0-acetil^-D- glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, ou arabinosilo.
18. 18. Um medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 17, em que o R1 é β-D-glucopiranosilo ou β-D-glucopiranosil-(1-6)-β-D-glucopiranosilo.
19. 19. Um medicamento compreendendo 5-metil-l,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula III ou 7 composições farmacêuticas contendo componentes activos (5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados III) em veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis: Me

    em que: R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (l->6)-β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-0-acetϋ-β-D- glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoílo, cinamoílo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo para uso no tratamento ou prevenção da depressão.
20. 20. Um medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 19, em que R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (1—»6)-β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-0-acetil-p-D- glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo ou arabinosilo.
21. 21. Um medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 20, em que R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil-(l->6)-β-D-glucopiranosilo ou ramnopiranosilo.
22. 22. Um medicamento compreendendo 5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados representados pela Fórmula IV ou composições farmacêuticas contendo componentes activos (5-metil-1,3-benzenodiol ou seus derivados IV) em veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis: 8 Μι/\ OAc r2o IV em que: R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil-(1^6)-β-D-glucopiranosilo, 2,3,4,6-tetra-0-acetϋ-β-D-glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoílo, cinamoílo, succinilo, metilo, etilo, propilo, butilo ou benzilo para uso no tratamento ou prevenção da depressão.
23. 23. Um medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 22, em que R2 é β-D-glucopiranosilo, β-D-glucopiranosil- (1-,6) -β-D-glucopiranosilo, 2,3,4, 6-tetra-0-acetil^-D- glucopiranosilo, manosilo, alosilo, galactosilo, ramnopiranosilo, fucosilo, xilosilo, arabinosilo, acetilo, propionilo, benzoilo, cinamoílo ou succinilo.
24. 24. Um medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 23, em que R2 é 2,3,4,6-tetra-0-acetίΙ-β-D-glucopiranosilo ou acetilo: 1,3-0-diacetilorcinol ou 3-0-acetil-orcinol-1-0-(2,3,4,6-tetraacetil)-β-D-glucopiranósido.
25. 25. Um medicamento para uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 15 a 24, uma dosagem eficaz dos componentes activos (5-metil-l,3-benzenodiol ou derivados representados pelas Fórmulas I, II, III ou IV) para tratar ou prevenir a 9 depressão situa-se entre 0,1 mg/adulto/dia e 12 g/adulto/dia e a dosagem óptima é de 50-200 mg/adulto/dia.
26. 26. Um medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 25, uma dosagem eficaz dos componentes activos (5-metil-1,3-benzenodiol ou derivados representados pelas Fórmulas I, II, III ou IV) para tratar ou prevenir a depressão situa-se entre 50-200 mg/adulto/dia. Lisboa, 10