PT1981851E - Inibidores de cinase e processos para a sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

INIBIDORES DE CINASE E PROCESSOS PARA A SUA

UTILIZAÇÃO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto inibidores de cinase, composições farmacêuticas que contêm os inibidores e processos para a preparação destes inibidores. Os inibidores de cinase da presente invenção são úteis para o tratamento de inflamação, osteoartrite, artrite reumatóide, cancro, doenças autoimunes e outras doenças mediadas por citocinas. 2. Descrição do estado da técnica

Um certo número de estados clínicos inflamatórios crónicos e agudas têm sido associados ao excesso de produção de citocinas pró-inflamatórias. Essas citocinas incluem, mas não se limitam a factor de necrose tumoral alfa (FNT-oí) , interleucina 1 beta (IL-Ιβ), interleucina 8 (IL-8) e interleucina 6 (IL-6). A artrite reumatóide (AR) é uma doença crónica em que estão implicados FNT-oí e IL-Ιβ, no início e na progressão da doença dos ossos e na destruição das articulações verificada em conjunto com este estado clínico debilitante. Tratamentos terapêuticos recentemente aprovados para a AR têm incluído o receptor solúvel de FNT-oí (Enbrel™) e o antagonista do receptor de IL-1 (ANAKINRA™). Estes tratamentos funcionam por meio do bloqueio e da capacidade das suas respectivas citocinas para se ligarem aos seus receptores naturais. Métodos l alternativos para o tratamento de doenças mediadas por citocinas estão actualmente sob investigação. Um desses processos envolve a inibição da via de sinalização que regula a sintese e a produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como p38. A P38 (também conhecida como CSBP ou RK) é uma proteína cinase activada por um agente mitogénico (PCAM) de serina/treonina que tem demonstrado regular as citocinas pró-inflamatórias. A PCAM P38 foi identificada pela primeira vez como uma cinase que se torna numa tirosina fosforilada em monócitos de rato após o tratamento com lipopolissacáridos (LPS). Uma ligação entre a PCAM p38 e a resposta das células às citocinas foi estabelecida, pela primeira vez, por Saklatvala et al., (Cell, 1994, 78: 1039-1049), que mostrou que a IL-1 activa uma cascata de proteína cinase que resulta na fosforilação de proteínas pequenas de choque térmico, Hsp27, provavelmente por meio de uma proteína cinase 2 activada por uma proteína activada por um agente mitogénico (MAPKAP cinase-2). A análise de sequências peptídicas derivadas da cinase purificada indicou que estava relacionada com a PCAM p38 activada por LPS em monócitos de rato (Han, J., et al., Science, 1994, 265: 808-811) . Ao mesmo tempo, foi demonstrado que a PCAM p38 foi ela própria activada por uma cinase a montante, em resposta a uma variedade de tensões celulares, incluindo a exposição à radiação UV e ao choque osmótico e a identidade da cinase que fosforila directamente Hsp27 foi confirmada como MAPKAP cinase- 2 (Rouse, J., et al., Cell, 1994, 78: 1027-1037). Subsequentemente foi demonstrado que a PCAM p38 era o alvo molecular de uma série de compostos de piridinilimidazol que inibiram a produção de FNT a partir de monócitos humanos estimulados por LPS (Lee, J., et al., Nature, 372: 739-746). Esta foi uma descoberta chave e 2 levou ao desenvolvimento de uma série de inibidores selectivos da PCAM p38 e a elucidação do seu papel na sinalização de citocina. É agora sabido que as múltiplas formas da PCAM p38 (cx, β, γ, õ) , cada uma codificada por um gene separado, fazem parte de uma cascata de cinases envolvida na resposta das células a uma variedade de estímulos, incluindo o stress osmótico, a luz UV e os eventos mediados por citocinas. Pensa-se que estas quatro isoformas de p38 regulam diferentes aspectos da sinalização intracelular. A activação de p38 faz parte de uma cascata de eventos de sinalização que levam à síntese e à produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como FNT-α. P38 funciona por fosforilação dos substratos a jusante, que incluem outras cinases e factores de transcrição. Os agentes que inibem a PCAM p38 MAPK têm demonstrado que bloqueiam a produção de citocinas, incluindo, mas não se limitando a FNT-α, IL-6, IL-8 e IL-Ιβ em modelos in vitro e in vivo (Adams, J. L., et al., Progress in Medicinal Chemistry, 2001, 38: 1-60). A Abl (também conhecida como Ableson) é uma tirosina-cinase que é expressa em células hematopoiéticas e está implicada na progressão de vários tumores líquidos, incluindo leucemia mielóide crónica (LMC) e leucemia linfoblástica aquda (LLA). A transformação é um resultado de uma translocação cromossómica, conhecida como o cromossoma de Filadélfia. Isto origina a uma quimera activada constitutivamente entre Ableson e a região dos aglomerados do ponto de interrupção (RAI), a proteína AB1-RAI. O GLEEVEC®, também conhecido como Imatinib (Novartis) é um potente inibidor da Abl e é actualmente utilizado para tratar doentes com LMC (N. Engl. J. Med., 2001, 344: 1031-1037) . Este fármaco tornou-se o padrão de tratamento para 3 esta doença mortal e também está a ser analisado numa variedade de outras configurações de cancro, incluindo tumores do estroma gastrointestinal (TEGI). Há evidências de que os fibroblastos reagem à proteina do factor de crescimento FCT-β pela estimulação da via de ABI e levam a alterações morfológicas indicativos de fibrose; por conseguinte, ABI poderia desempenhar um papel na patogénese de doenças fibróticas como fibrose pulmonar idiopática. Leof et al. (J. Clin. Invest., 2004, 114 (9) 1308-1316) demonstraram a eficácia pré-clinica de Gleevec® num modelo de fibrose do pulmão mediada por bleomicina, em ratos. GLEEVEC® está a ser avaliado em doentes com fibrose pulmonar. TEK (também conhecido como Tie-2) é um outro receptor de tirosina-cinase expresso apenas nas células endoteliais que têm demonstrado desempenhar um papel na angiogénese. A ligação do factor angiopoietina-1 resulta numa auto-fosforilação do dominio da cinase de TEK e resulta num processo de transdução de sinal que parece mediar a interacção das células endoteliais com células de suporte peri-endotelial, facilitando assim a maturação dos vasos sanguíneos recém-formados. O factor angiopoietina-2, por outro lado, parece antagonizar a acção da angiopoietina-1 em TEK e interrompe a angiogénese (Maisonpierre et al., Science, 1997, 277: 55-60). Tie2 é regulada crescentemente nos vasos angiogénicos de tumores (Trogan, E. Br. J. Câncer, 1998, 77: 51-56) e há evidências de que pode desempenhar um papel de apoio em cancros hematopoiéticos (L. Naldini et al., Câncer Cell, 2005, 8: 211-226; Suda, T. et al., Cell, 2004, 118: 149-161). Para além do seu possivel papel no cancro, a angiogénese também pode ter implicações em doenças como a artrite reumatóide (AR) , 4 psoríase e progressão de patologias originadas por inflamação. A formação de pano, a legião destrutiva responsável pela progressão da artrite é, em parte, impulsionada pela formação de novos vasos sanguíneos e, num artigo recente de Lin, C. et al. (Arthritis and Rheumatism, 2005, 52 (5): 1585-1594) demonstra-se o papel patológico de Tie2 em modelos de AR de uma artrite induzida por colagénio num rato. Portanto, a inibição de Tie2 poderia proporcionar um efeito benéfico contra doenças proliferativas e inflamatórias. Várias outras cinases têm sido implicadas na progressão de doenças proliferativas tais como o cancro. Entre estas, numerosas proteínas, elementos da família das Src, têm demonstrado que desempenham um papel semelhante às Src e podem fornecer vias de sinalização paralelas durante a proliferação celular descontrolada. Exemplos primários incluem as tirosina-cinases Lin, Fin, Lck e Hck. Lin e Hck têm sido implicadas na progressão de leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL), um cancro hematopoiético de células B (Li, S. et al. Nat Genet., 2004 36 (5): 453-461). A família do Hpe (Eph em inglês) (sequência amplificada de hepatoma que produz eritropoietina) dos receptores de tirosina-cinase liga-se a efrinas o que leva a inúmeros processos celulares. Os Hpe parecem desempenhar um papel de modulação da adesão e motilidade e capacidade de invasão das células tumorais e algumas evidências demonstram um papel activo dos Hpe e das efrinas na neo-vascularização durante processos patológicos. Os receptores A dos Hpe são expressos em excesso na vasculatura tumoral do pulmão, rim e zona gástrica e as proteínas A2 ou A3 de Hpe solúvel, de dominante negativo, têm demonstrado que 5 regulam a angiogénese e a progresssão in vivo do tumor (Lackmann M. et al., IUBMB Life, 2005, 57 (6): 421-31).

Os factores de crescimento endotelial vascular e os seus receptores cognatos, por exemplo KDR (R2 FCEV) e FLT1 (RI FCEV) são reguladores chave da angiogénese. O fármaco da proteína terapêutica AVASTIN® tem-se mostrado promissor no cancro do cólon e funciona através da via do RFCEV. O SUTENT/SU 1248 (malato de sunitinib) (Pfizer) é um inibidor potente de KDR e tem mostrado resultados promissores contra TEGI e carcinomas das células renais.

Os monócitos do sangue periférico (CMSP) têm demonstrado que expressam e segregam citocinas pró-inflamatórias quando estimulados, in vitro, com lipo-polissacáridos (LPS). Os inibidores de p38 bloqueiam eficientemente este efeito quando as CMSP são pré-tratadas com esses compostos antes da estimulação com LPS (Lee, J.C., et al., Int. J. Immunopharmacol., 1988, 10: 835-843). A eficácia dos inibidores de p38 em modelos animais de doença inflamatória levou a uma investigação dos mecanismos subjacentes que poderiam explicar o efeito destes inibidores. O papel da p38 na resposta das células a IL-1 e FNT tem sido investigado num certo número de sistemas de células relevantes para a resposta inflamatória usando um inibidor de piridinil-imidazol: células endoteliais e IL-8 (Hashimoto, S., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001, 293: 370-375), fibroblastos e IL-6/GM-CSF/PGE2 (Beyaert, R., et al., EMBO J., 1996, 15: 1914-1923), neutrófilos e IL-8 (Albanyan, E. A., et al., Infect. Immun., 2000, 68: 2053-2060) macrófagos e IL-1 (Caivano, M. e Cohen, P., J. Immunol., 2000, 164: 3018-3025) e células do músculo liso e RANTES (Maruoka, S., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1999, 161: 659-668). Os efeitos destrutivos de muitos 6 estados de doença são causados pela produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias. A capacidade dos inibidores de p38 para regular esta produção excessiva torna-os excelentes candidatos a agentes modificadores da doença.

Os inibidores conhecidos de PCAM p38 são activos numa variedade de modelos de doenças amplamente reconhecidos. Os inibidores da PCAM p38 mostram efeitos positivos num certo número de modelos animais de padrão de inflamação, incluindo artrite induzida pelo colagénio em ratos (Jackson, J.R., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998, 284: 687-692); artrite induzida por adjuvantes em ratos (Badger, A. M., et al., Arthritis Rheum., 2000, 43: 175-183; Badger, A. M., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., (1996) 279: 1453-1461); e edema da pata em murganhos, induzido por carragenina (Nishikori, T., et al., Eur. J. Pharm., 2002, 451: 327-333). As moléculas que bloqueiam a função de p38 têm demonstrado serem eficazes na inibição da reabsorção óssea, inflamação e outras patologias do sistema imunológico e com base inflamatória nestes modelos animais.

Assim, um inibidor de cinase seguro e eficaz providenciará um meio para tratar doenças debilitantes que podem ser reguladas por regulação de uma ou mais cinases. A publicação do pedido de patente internacional com o número WO 2004/078116 descreve alguns compostos como inibidores de cinase. Entre estes compostos estão alguns derivados do indazol substituídos em NI tendo um substituinte na posição 5 que contém um grupo pirazol-5-ilureia. Exemplos desses compostos incluem os compostos dos exemplos 94 e 138 em que o substituinte NI é, respectivamente, um grupo metilo e um grupo 2-hidroxi-2-metilpropilo. 7

Verificou-se agora que os compostos com propriedades particularmente desejáveis se podem obter por selecção do grupo álcool primário, -CH2CH2OH, como o substituinte NI e um substituinte particular na posição 5, contendo um grupo 3- terc-butil-l-p-tolil-lff-pirazol-5-ilo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto compostos que inibem uma ou mais cinases e eventos mediados por cinases, tais como a inibição da produção de citocinas, angiogénese ou proliferação celular. Tais compostos têm utilidade como agentes terapêuticos para doenças que podem ser tratadas pela inibição das vias de sinalização da cinase.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Num aspecto, a presente invenção proporciona um composto de fórmula I:

OH I ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 0 composto pode também ser descrito pelo nome quimico 1- (3-terc-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il) -3- (5-fluoro-2-(1- (2-hidroxietil) -lií-indazol-5-iloxi) benzil) ureia.

Verificou-se que o composto de fórmula I tem uma potência acrescida relativamente a certas cinases. Além disso, observou-se que a solubilidade do composto correspondente, em que o substituinte NI está substituído com um qrupo éster de fosfato de fórmula -CH2CH2OPO3H, é várias ordens de qrandeza maior do que a do composto de fórmula I. Assim, o composto de fórmula I possui uma posição única para a criação de pró-fármacos solúveis. Mais particularmente, como demonstrado com os dados dos ensaios dados a seguir, verificou-se que o composto de fórmula I era um inibidor significativamente mais potente do que Abl e Tie2 do que os compostos dos exemplos 94 e 138 de WO 2004/078116. Além disso, os compostos dos exemplos 94 e 138 da WO 2004/078116 não possuem um grupo álcool primário que pode ser derivado para se obter um pró-fármaco.

Além do composto de fórmula I, a presente invenção também inclui os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico do composto e os solvatos do composto e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. A frase "aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" indica que a substância ou a composição é quimicamente e/ou toxicologicamente compatível com os outros ingredientes que compreendem uma formulação e/ou com o mamífero a ser tratado com a mesma.

Um "solvato" refere-se a uma associação ou a um complexo de um ou mais moléculas de dissolvente e um composto da presente invenção. Exemplos de dissolventes que 9 formam solvatos incluem, mas não se limitam a água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético e etanolamina. 0 termo "hidratado" refere-se ao complexo em que a molécula de dissolvente é água.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de um composto de fórmula I no fabrico de um medicamento para o tratamento de um estado clinico mediado por cinase, num mamifero. 0 presente documento descreve um processo de tratamento ou de prevenção de um estado clinico mediado por cinase, compreendendo a administração de um composto de fórmula I numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir o referido estado clinico mediado por cinase.

Também têm por objecto os pró-fármacos do composto de fórmula I.

Um "pró-f ármaco" é um composto que pode ser convertido, em condições fisiológicas ou por solvólise, no composto especificado ou num sal desse composto. 0 grupo hidroxilo livre do composto da presente invenção pode derivar, como um pró-fármaco, por conversão do grupo hidroxi, num grupo tal como mas não se limitando a um éster de fosfato, hemissuccinato, dimetilaminoacetato ou grupo fosforiloximetiloxicarbonilo, tal como sublinhado em Advanced Drug Delivery Reviews, 1996, 19, 115. Os pró-fármacos de carbamato de grupos hidroxi estão também incluidos, assim como pró-fármacos de carbonato, ésteres de sulfonato e ésteres de sulfato de grupos hidroxi. A derivação dos grupos hidroxilo como éteres de (aciloxi)-metilo e de (aciloxi) etilo, em que o grupo acilo pode ser 10 um éster de alquilo opcionalmente substituído com grupos, incluindo, mas não se limitado a funcionalidades de éter, amina e de ácido carboxílico ou em que o grupo acilo é um éster de aminoácido, tal como descrito antes, também estão abrangidos. Pró-fármacos deste tipo estão descritos em J. Med. Chem., 1996, 39, 10. Exemplos mais específicos incluem a substituição do átomo de hidrogénio do grupo álcool com um grupo tal como (alcanoiloxi Οχ-Οβ) metilo, 1-(alcanoiloxi Ci-C6)etilo, 1-metil-l-(alcanoiloxi Ci-C6)etilo, (alcoxi Cq-C6) carboniloximetilo, N-(alcoxi Οχ-Οδ) carbonilaminometilo, succinoílo, alcanoílo Cx-C6, α-amino-alcanoí lo Cx-C4, arilacilo e α-aminoacilo ou α-aminoacil-a-aminoacilo em que cada grupo α-aminoacilo se selecciona, independentemente, entre L-aminoácidos de ocorrência natural, P(O) (OH)2, P(O)(O(alquilo Cx-C6)2 ou glicosilo (o radical resultante da remoção de um grupo hidroxilo da forma de hemiacetal de um hidrato de carbono).

Portanto, de acordo com um outro aspecto, a presente invenção tem por objecto a utilização de um pró-fármaco de um composto de fórmula I no fabrico de um medicamento para 0 tratamento com um composto de acordo com a reivindicação 1 de um estado clínico mediado por uma cinase num mamífero, em que o pró-fármaco é di-hidrogenofosfato de 2- (5- (2-((3-(3-tert-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)ureido)-metil)-4-fluoro-fenoxi)-lH-indazol-l-il)etilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo para o tratamento ou a prevenção de um estado clínico, num mamífero, mediado por uma cinase, com um composto de fórmula I, compreendendo a administração, a um mamífero, de um pró-fármaco de um composto de fórmula I, numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir o referido 11 estado clinico mediado por uma cinase, em que o pró-fármaco é di-hidrogenofosfato de 2-(5-(2-((3-(3-terc-butil-l-p-tolil-lií-pirazol-5-il) ureido) -metil) - 4-f luoro-fenoxi) -lií-indazol-l-il) etilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Sem pretender estar ligado a uma teoria, acredita-se que o composto de éster de fosfato funciona como um pró-fármaco para o álcool primário correspondente.

Tal como aqui descrito, tem-se verificado que o éster fosfato do composto de fórmula I possui uma solubilidade particularmente boa.

Um "sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico", salvo indicação em contrário, inclui sais que retêm a eficácia biológica do ácido livre correspondente ou de uma base do composto especificado e não são biologicamente ou de outra forma indesejáveis. Um composto da presente invenção pode possuir um grupo suficientemente ácido, um grupo suficientemente básico ou ambos os grupos funcionais e, consequentemente, pode reagir com qualquer uma das bases ou ácidos inorgânicos ou orgânicos para formar um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Exemplos de sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem os sais preparados por reacção dos compostos da presente invenção com um ácido inorgânico ou orgânico ou uma base inorgânica. Tais sais incluem, mas não se limitam a sulfatos, pirossulfatos bisulfatos, sulfitos, bissulfitos, fosfatos, mono-hidrogenfosfatos, di-hidrogenfosfatos, metafosfatos, pirofosfatos, cloretos, brometos, iodetos, acetatos, propionatos, decanoatos, caprilatos, acrilatos, formiatos, isobutiratos, caproatos, heptanoatos, propiolatos, oxalatos, malonatos, succinatos, suberatos, 12 sebacatos, fumaratos, maleatos, butin-1,4-dioatos, hexino-1,6-dioatos, benzoatos, clorobenzoatos, metilbenzoatos, di-nitrobenzoatos, hidroxibenzoatos, metoxibenzoatos, ftalatos, sulfonatos, xilenossulfonatos, fenilacetatos, fenilpropionatos, fenilbutiratos, citratos, lactatos, γ-hidroxibutiratos, glicolatos, tartratos, metanossulfonatos, propanossulfonatos, naftaleno-l-sulfonatos, naftaleno-2-sulfonatos e mandelatos. Uma vez que um único composto da presente invenção pode incluir mais do que uma porção ácida ou básica, os compostos da presente invenção podem incluir mono, di ou tri-sais num único composto.

Se o composto da presente invenção é uma base, o sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico desejado, pode ser preparado por qualquer processo adequado disponível na técnica, por exemplo, por tratamento da base livre com um composto ácido, por exemplo um ácido inorgânico tal como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares ou com um ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, um ácido de piranosidilo tal como o ácido glucurónico ou ácido galacturónico, ácido alfa-hidroxi tal como ácido cítrico ou ácido tartárico, um aminoácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico, um ácido aromático tal como ácido benzóico ou ácido cinâmico, um ácido sulfónico tal como ácido p-toluenossulfónico ou ácido etanossulfónico ou similar.

Se o composto da invenção for um ácido, o sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico desejado, pode ser preparado por qualquer processo adequado, por exemplo, por tratamento do ácido livre com uma base inorgânica ou 13 orgânica. Exemplos de sais inorgânicos adequados incluem os formados com metais alcalinos e alcalino-terrosos tais como litio, sódio, potássio, bário e cálcio. Exemplos de sais adequados, de base orgânica, incluem, por exemplo, sais de amónio, dibenzilamónio, benzilamónio, 2-hidroxietilamónio, bis(2-hidroxietil)amónio, feniletilbenzilamina, dibenzil-etilenodiamina e sais semelhantes. Outros sais de partes ácidas podem incluir, por exemplo, os sais formados com procaina, quinina e N-metilglicosamina, mais os sais formados com aminoácidos básicos tais como glicina, ornitina, histidina, fenilglicina, lisina e arginina. A presente invenção também engloba compostos da presente invenção marcados com isótopos, que são idênticos aos citados aqui, excepto no facto de um ou mais átomos estarem substituídos por um átomo com uma massa atómica ou um número átomico diferente da massa atómica ou do número átomico normalmente encontrado na natureza. Os compostos da presente invenção marcados isotopicamente podem geralmente ser preparados por procedimentos análogos aos divulgados nos esquemas e/ou nos exemplos que se seguem, substituindo um reagente marcado isotopicamente por um reagente não marcado isotopicamente.

SÍNTESE DOS COMPOSTOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Os compostos da presente invenção podem ser preparados por vias sintéticas que incluem processos análogos aos bem conhecidos nas técnicas químicas ou como descritos no pedido de patente internacional, com o número de publicação WO 2004/078116, particularmente à luz da descrição aí contida. Os materiais iniciais estão geralmente disponíveis em fontes comerciais tais como a Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) ou são facilmente preparados utilizando 14 processos bem conhecidos pelos especialistas na matéria (por exemplo, preparados pelos processos geralmente descritos em Louis F. Fieser e Mary-Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, N.Y. (1967-1999 ed.) ou Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlim, incluindo os suplementos (também disponível através da base de dados em linha Beilstein).

De acordo com outro aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo para a preparação de um composto de fórmula I ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, que compreende:

(a) o acoplamento de um composto de fórmula II

NH- de um

hidrogénio ou um grupo protector de hidroxilo, com composto de fórmula III 15

em que Z representa um grupo eliminável ou o isocianato correspondente; ou

(b) a redução de um composto de fórmula IV

Re

IV em que Re representa um átomo de hidrogénio ou um resíduo de um álcool; 16 seguido da eliminação de qualquer grupo de protecção e, se desejado, formando um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Exemplos de grupos protectores de hidroxilo convenientes, representados por P1, incluem hemicetais ciclicos, tais como tetra-hidro-2H-piran-2-ilo. 0 grupo eliminável representado por Z pode ser, por exemplo, um grupo hidrocarbiloxilo insubstituido ou substituído, por exemplo, um grupo halogeno-alcoxi Ci-6, tal como 2,2,2-tricloroetoxi, um grupo alceniloxi, tal como CH2=C(CH3)0- ou um grupo ariloxi eventualmente substituído, por exemplo, com um ou mais grupos seleccionados entre F, Cl, Br e NCq. Os valores particulares para um grupo ariloxi eventualmente substituído incluem fenoxi, 4-clorofenoxi, 4-bromofenoxi, 4-fluorofenoxi, 4-nitrofenoxi e 2-nitrofenoxi. Numa modalidade particular, Z representa fenoxi.

Verificou-se que o composto IV pode ser isolado, vantajosamente, com um bom rendimento e elevada pureza, sem uma etapa de cromatografia quando Z, do composto III, é um grupo ariloxi eventualmente substituído, tal como um grupo fenoxi. 0 acoplamento de um composto de fórmula (II) com um composto de fórmula (III), quando Z é um grupo fenoxi eventualmente substituído, pode ser convenientemente realizado a uma temperatura entre 0 e 100 °C e, mais particularmente, à temperatura ambiente. Dissolventes convenientes incluem dissolventes apróticos tais como éteres (por exemplo tetra-hidrofurano ou p-dioxano), DMF, DMSO ou acteonitrilo. A reacção de acoplamento é 17 convenientemente realizada na presença de uma base tal como uma amina terciária (por exemplo, trietilamina ou DMA).

Os valores particulares de Re, quando representados por um residuo de um álcool incluem grupos alcoxi Ci_6, tal como etoxi.

Acredita-se que os compostos de fórmulas (II) e (IV) são novos e são providenciados como aspectos adicionais da presente invenção.

Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo para a preparação de um pró-fármaco de fosfato do composto de fórmula I, isto é, di-hidrogenofosfato de 2-(5-(2 - ( (3- (3- terc-butil-l-p-tolil-lií-pirazol-5-il) ureido) -metil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-l-il)etilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, que compreende a fosforilação de 1- (3-terc-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il) -3- (5-fluoro-2- (1- (2-hidroxietil) -lfí-indazol-5-iloxi) -benzil)ureia ou um seu sal. A fosforilação, de acordo com isto, é convenientemente realizada por reacção do álcool com uma dialquilfosfinamidite de dialquilo ou diarilo, tal como di-isopropilfosfinamidite de di-terc-butilo ou di-isopropil-fosfinamidite de di-fenilo, seguido da remoção dos grupos alquilo ou arilo no produto de fosfato por hidrólise ou hidrogenação catalitica.

Para fins ilustrativos, os esquemas 1 e 2 e os exemplos ilustram processos para a preparação dos compostos da presente invenção, bem como produtos-chave intermédios. Os especialistas na matéria entenderão que outras vias sintéticas podem ser utilizadas para sintetizar os 18 compostos da presente invenção. Embora os materiais iniciais e os reagentes específicos estejam descritos nos esquemas e discutidos a seguir, outros materiais iniciais e reagentes podem ser facilmente substituídos para proporcionar uma variedade de derivados e/ou condições de reacção. Além disso, muitos dos compostos preparados pelos processos descritos a seguir podem ser ainda modificados à luz da presente descrição utilizando a química convencional bem conhecida dos peritos na matéria.

Esquema 1 19

Cfi HjN 63 76 OH EMSO Wew»

o·5^ 76

CM

I.MCi X NaOH

CM OMe

CCjCCt, OMF 66

HCMíeOH 101ÍPWC

►O NH 6» O^OJW 80*C, W h

MeSM* "«•SET

ESQUEMA2 A redução do nitrilo do composto 77, tal como se mostra em 2, requer concentrações elevadas de ácido (por exemplo, HC1 ou ácido acético) para minimizar a formação de dímeros. No entanto, concentrações mais elevadas de ácido podem também causar a hidrólise de uma parte do éster do composto 78 para o ácido correspondente. 0 esquema 3 ilustra um processo melhorado para a preparação do composto de fórmula I, que reduz a formação de dimeros e as impurezas de ácido. 20

Esquema 3 0 esquema 3 ilustra um processo para reduzir o grupo éster do composto 77 para o álcool correspondente antes da redução do grupo nitrilo para se obter o composto 79A isento de impurezas ácidas e com a formação minima de impurezas de dimeros.

Mais especificamente, o composto 77 pode ser reduzido por etapas, em que o grupo éster é reduzido com boro-hidreto de sódio num dissolvente adequado para fornecer o composto de álcool correspondente 78A. 0 grupo nitrilo do composto 78A é então reduzido em condições padrão de hidrogenação catalítica ou utilizando boreto de níquel, num dissolvente orgânico adequado para dar origem ao correspondente composto metílico de amina 79A. A via mostrada no esquema 3 oferece várias vantagens sobre as vias mostradas no esquema 2 para a formação do 21 composto de Fórmula I. Usando as vias mostradas no esquema 3, a redução do grupo nitrilo pode ser realizada com concentrações mais elevadas de HC1 que, vantajosamente, reduzem a quantidade de impurezas de dímeros que se formam. Além disso, a via mostrada no esquema 3 evita a utilização de boro-hidreto de sódio na etapa final, evitando assim as etapas adicionais de purificação para remover as impurezas residuais de boro na etapa final. Por conseguinte, através da inclusão da etapa de redução de boro-hidreto de sódio numa fase inicial da sequência da reacção, o boro residual pode ser facilmente removido durante as etapas intermédias da sequência. Além disso, o acoplamento do composto de amino-álcool 79 A com o composto 69A pode ser realizado a temperaturas mais baixas, melhorando assim a pureza do produto 72. Por conseguinte, a via apresentada no esquema 3 permite melhorar o rendimento da síntese do composto de fórmula I e, consequentemente, proporciona uma via sintética eficiente para a produção do composto de Fórmula I que é mais apropriada ou adequada para o fabrico em larga escala.

De acordo com isto, a presente invenção também tem por objecto um processo para a preparação de um composto de fórmula(II), compreendendo: (i) a redução de um composto de fórmula (V)

22 na qual P2 representa hidrogénio ou um grupo protector de hidroxilo, em condições de hidrogenação catalítica ou na presença de boreto de níquel.

No que se refere à etapa (i) , os catalisadores de hidrogenação incluem qualquer catalisador de paládio adequado, tal como Pd(OH)2 ou paládio suportado em carvão. A hidrogenação ocorre em condições ácidas (por exemplo, pela adição de um ácido, por exemplo, ácido acético ou HCl) ou com a adição de amónia. A hidrogenação catalítica pode ser realizada em qualquer sistema dissolvente adequado tal como um álcool (por exemplo, metanol, etanol, isopropanol), éster (por exemplo, acetato de etilo) ou éter (por exemplo, THF) . Misturas de dissolventes, por exemplo álcool e THF, são também adequadas para a etapa de hidrogenação. A pressão de hidrogénio pode estar no intervalo entre 25 e 100 psi, por exemplo 4 0 psi. A redução é normalmente realizada a uma temperatura entre 20 - 100 °C.

No que se refere à etapa (i) , o boreto de níquel pode ser preparado in situ a partir de um sal de metal de transição, de preferência um sal de Ni (II) e boro-hidreto de sódio. Numa modalidade preferida, o boreto de níquel é preparado a partir de cloreto de níquel (II) e boro-hidreto de sódio. A reacção ocorre, convenientemente, num dissolvente adequado tal como um álcool (por exemplo, metanol, etanol, isopropanol) . A redução é normalmente realizada à temperatura ambiente.

Um composto de fórmula (V) pode ser preparado por meio da redução de um composto de fórmula (VI). 23

F

Ο

(vi) em que P3 é definido tal como P2, usando quaisquer condições convenientes para a redução do éster (por exemplo, boro-hidreto de sódio), num dissolvente adequado tal como um álcool (por exemplo, metanol, etanol, isopropanol).

Na preparação dos compostos da presente invenção, pode ser necessária a protecção de funcionalidades remotas (por exemplo, aminas primárias ou secundárias, álcoois, etc.) de produtos intermédios. A necessidade de tal protecção variará consoante a natureza da funcionalidade remota e as condições dos processos de preparação. Por exemplo, os grupos protectores de amino adequados (NH-Gp) incluem acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC), benzil-oxicarbonilo (CBz) e 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Grupos protectores convenientes para o hidroxilo incluem tetra-hidro-2H-piran-2-ilo, benzilo, trialquilsililo e acetal. A necessidade de tal protecção é prontamente determinada por um especialista na matéria. Para uma descrição geral de grupos protectores e a sua utilização, ver T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1991. 24

PROCESSOS DE TRATAMENTO

Os compostos da presente invenção podem ser utilizados para tratar doenças mediadas por meio da modulação ou da regulação das proteinas-cinases. De acordo com isto, os processos de tratamento ou de prevenção de doenças ou de estados clinicos aqui descritos compreendem a administração, a um mamífero, tal como a um ser humano, de uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um composto da presente invenção ou de um seu sal, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, numa quantidade eficaz para tratar ou para prevenir o referido distúrbio. Numa modalidade, o processo compreende a administração, a um mamífero, de um composto da presente invenção numa quantidade eficaz para inibir uma ou mais cinases.

Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de composto que, quando administrada a um mamífero com necessidade desse tratamento, é suficiente para efectuar o tratamento de uma doença mediada pela actividade de uma ou mais proteínas cinases, tais como a PCAM p38 e os eventos associados, mediados por cinase, tal como a produção de citocina. Assim, por exemplo, uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de um composto da presente invenção ou de um seu sal ou um seu metabolito activo, é uma quantidade suficiente para modular, regular ou inibir a actividade de uma ou mais proteínas cinases, tal que o estado de doença que é mediado por essa actividade seja reduzido ou aliviado.

Por "tratamento" entende-se pelo menos a atenuação de um estado de doença num mamífero, tal como um ser humano, que é afectado, pelo menos em parte, pela actividade de uma 25 ou mais proteínas cinases. Os termos "tratar" e "tratamento" referem-se tanto ao tratamento terapêutico como a medidas profilácticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma mudança fisiológica ou um distúrbio indesejados. Para os fins da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a alívio dos sintomas, diminuição do prolongamento da doença, estabilização (isto é, não agravamento) do estado da doença, atraso ou diminuição da progressão da doença ou paliação ou melhoria do estado de doença e remissão (quer parcial ou total), quer detectável ou indetectável. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se não se receber tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem os que já estão no estado clínico ou têm o distúrbio bem como os que são propensos a ter a doença ou distúrbio ou aqueles em que a doença ou distúrbio devem ser prevenidos. A quantidade de um composto da presente invenção administrada a um mamífero pode variar, dependendo de factores tais como o composto particular, o estado da doença e a sua gravidade, a identidade (por exemplo, o peso) do mamífero com necessidade de tratamento, mas pode, no entanto, ser determinada, por rotina, por um especialista na matéria.

Tal como aqui utilizado, o termo "mamífero" refere-se a um animal de sangue quente que tem ou está em risco de desenvolver uma doença tal como aqui descrita e inclui, mas não se limita a cobaias, cães, gatos, ratos, murganhos, hamsters e primatas, incluindo seres humanos. 26

Num aspecto da presente invenção, os compostos da presente invenção ou os seus sais farmacêuticos podem ser formulados em composições farmacêuticas para administração a animais ou a seres humanos, para tratar ou prevenir um estado clinico mediado por cinase. A expressão "estado clinico mediado por cinase", tal como aqui utilizada, significa qualquer doença ou outro estado clinico nocivo em que se sabe que p38 desempenha um papel e inclui os estados clínicos que são conhecidas por causarem pela produção excessiva de IL-1, FNT, IL-6 ou IL-8. Tais estados clínicos incluem, mas não se limitam a, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, distúrbios destrutivos dos ossos, distúrbios proliferativas, doenças infecciosas, doenças virais, doença fibrótica e doenças neurodegenerativas.

As doenças inflamatórias que podem ser tratadas ou prevenidas incluem, mas não se limitam a pancreatite aguda, pancreatite crónica, asma, alergias e síndrome de insuficiência respiratória do adulto.

As doenças autoimunes que podem ser tratadas ou prevenidas incluem, mas não se limitam a glomerulonefrite, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, esclerodermia, tiroidite crónica, doença de Graves, gastrite autoimune, diabetes mellitus dependente de insulina (tipo I), anemia hemolítica autoimune, neutropénia autoimune, trombocitopénia, dermatite atópica, hepatite crónica activa, miastenia grave, esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino, colite ulcerosa, doença de Crohn, psoríase ou doença do hospedeiro versus o enxerto.

Os distúrbios destrutivos dos ossos que podem ser tratados ou prevenidos incluem, mas não se limitam a 27 osteoporose, osteoartrite e distúrbios ósseos relacionados com mieloma múltiplo.

As doenças fibróticas que podem ser tratadas ou prevenidas incluem, mas não se limitam a fibrose pulmonar idiopática, fibrose do rim e hepática.

As doenças proliferativas que podem ser tratadas ou prevenidas incluem, mas não se limitam a leucemia mielóide aquda, leucemia mielóide crónica, melanoma metastático, sarcoma de Kaposi, sindrome mielodisplásica, mieloma múltiplo, astrocitoma, cancro dos ossos, cancro do cérebro, cancro de mama, cancro colorrectal, cancro qástrico, glioma, glioblastoma, cancro multiforme, cancro da cabeça e do pescoço, cancro hematológico, distúrbios da hemato-poiese, doenças pulmonares intersticiais, sarcoma de Kaposi, leucemia linfocitica, melanoma, leucemia mielóide, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro de ovário, cancro de próstata, sarcoma, cancro da pele, cancro do pulmão de células pequenas e cancro do estômago. Outros doentes que podem ser tratados incluem os que foram submetidos a transplante da medula óssea.

As doenças infecciosas que podem ser tratadas ou prevenidas incluem, mas não se limitam a septicémia, choque séptico e shigelose.

As doenças virais que podem ser tratadas ou prevenidas incluem, mas não se limitam a infecção de hepatite aguda (incluindo a hepatite A, a hepatite B e a hepatite C) , infecção por VIH e retinite de CMV.

Os estados clinicos ou doenças degenerativos que podem ser tratados ou prevenidos pelos compostos da presente 28 invenção incluem, mas não se limitam a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, isquémia cerebral e outras doenças neurodegenerativas. A expressão "estados clinicos mediados por cinase" também inclui a isquémia/reperfusão em acidente vascular cerebral, ataques cardíacos, isquémia miocárdica, hipóxia de um órgão, hiperplasia vascular, hipertrofia cardíaca e agregação plaquetária induzida por trombina.

Além disso, os inibidores de cinase da presente invenção são também úteis para a inibição da expressão de proteínas pró-inflamatórias indutíveis, tais como prostaglandina endoperóxido sintase-2 (PGHS-2), também referida como ciclo-oxigenase-2 (COX-2). Por conseguinte, outros "estados clínicos mediados por cinase" incluem, mas não se limitam a edema, analgesia, febre e dor, tal como dor neuromuscular, dor de cabeça, dor do cancro, dor de dentes e dor da artrite.

Os estados clínicos e doenças que podem ser tratados ou prevenidos pelos inibidores de cinase da presente invenção podem também ser convenientemente agrupados pela citocina (por exemplo, IL-1, FNT, IL-6, IL-8) que se crê ser responsável pela doença.

Assim, uma doença ou estado clínico mediado por IL-1 inclui artrite reumatóide, osteoartrite, acidente vascular cerebral, endotoxémia e/ou síndrome de choque tóxico, reacção inflamatória induzida por endotoxina, doença inflamatória do intestino, tuberculose, aterosclerose, degeneração muscular, caquexia, artrite psoriática, síndroma de Reiter, gota, artrite traumática, artrite da 29 rubéola, sinovite aguda, diabetes, doença das células β do pâncreas e doença de Alzheimer.

As doenças ou estados clínicos mediados por FNT incluem, mas não se limitam a artrite reumatóide, espondilite reumatóide, osteoartrite, artrite gotosa e outros estados clínicos artríticos, septicémia, choque séptico, choque endotóxico, septicémia gram negativa, síndrome do choque tóxico, síndrome da insuficiência respiratória do adulto, malária cerebral, doença pulmonar inflamatória crónica, silicose, sarcoidose pulmonar, doenças de reabsorção óssea, danos de reperfusão, reacção do hospedeiro versus enxerto, rejeição de aloenxerto, febre e mialgias devidas a infecção, caquexia secundária a infecção, SIDA, CRS (complexo relacionado com a SIDA) ou malignidade, formação de quelóides, formação de tecido cicatricial, doença de Crohn, colite ulcerosa ou estado febril. As doenças mediadas por FNT também incluem infecções virais, tais como as infecções por VIH, CMV, vírus da gripe e herpes; e infecções virais veterinárias, tais como infecções por lentivírus, incluindo, mas não se limitando a vírus da anemia infecciosa equina, vírus da artrite caprina, vírus visna ou vírus visna-maedi; ou infecções retrovirais, incluindo as do vírus da imunodeficiência felina, vírus da imunodeficiência bovina ou vírus da imunodeficiência canina.

As doenças ou estados clínicos mediados por IL-8 incluem, mas não se limitam a doenças caracterizadas por infiltração maciça de neutrófilos, tais como, psoríase, doença inflamatória do intestino, asma, lesão de reperfusão cardíaca e renal, síndrome da insuficiência respiratória do adulto, trombose e glomerulonefrite. 30

Além disso, os compostos da presente invenção podem ser usado topicamente para tratar ou prevenir estados clínicos causadas ou exacerbadas por IL-1 ou FNT. Tais estados clínicos incluem, mas não se limitam a articulações inflamadas, eczema, psoríase, estados clínicos inflamatórios da pele tais como queimaduras solares, estados clínicos oculares inflamatórios, tais como conjuntivite, estados febris; dor e outros estados clínicos associadas com a inflamação.

Embora os compostos da presente invenção tenham valor principalmente como agentes terapêuticos para utilização em animais de sangue quente (incluindo seres humanos) , também são úteis sempre que é necessário inibir os efeitos das citocinas. Assim, são úteis como padrões farmacológicos para utilização no desenvolvimento de novos ensaios biológicos e na pesquisa de novos agentes farmacológicos. 0 tamanho da dose para fins terapêuticos ou profilácticos de um composto da presente invenção irá, naturalmente, variar de acordo com a natureza e a gravidade dos estados clínicos, a idade e o género do animal ou do doente e a via de administração, de acordo com princípios bem conhecidos da medicina.

Outro aspecto da presente invenção proporciona um composto da presente invenção para uso como um medicamento no tratamento das doenças ou dos estados clínicos aqui descritos, num mamífero, por exemplo, num ser humano, sofrendo dessa doença ou desse estado clínico. Também providencia a utilização de um composto da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças e estados clínicos aqui descritos, num animal de 31 sangue quente, tal como um mamífero, por exemplo um ser humano, que sofra desse distúrbio.

TERAPIA DE COMBINAÇÃO

Os compostos da presente invenção podem ser utilizados em combinação com outros fármacos e terapias utilizados no tratamento de estados de doença que beneficiariam com a inibição das cinases e das citocinas associadas, tais como IL-1, FNT, IL-6 ou IL-8. A dose do segundo fármaco pode ser adequadamente seleccionada com base numa dose clinicamente utilizada. A proporção do composto da presente invenção e a do segundo fármaco pode ser apropriadamente determinada de acordo com o indivíduo a quem se administra, a via de administração, a doença-alvo, o estado clínico, a combinação e outros factores. Nos casos em que o indivíduo a quem se administra é um ser humano, por exemplo, o segundo fármaco pode ser utilizado numa quantidade de 0,01 a 100 partes em peso por parte em peso do composto da presente invenção. O segundo fármaco da formulação da combinação farmacêutica ou do regime de dosagem tem, por exemplo, actividades complementares em relação ao composto da presente invenção, de tal modo que não se afectam negativamente um ao outro. Tais fármacos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida. De acordo com isto, um outro aspecto da presente invenção proporciona uma composição compreendendo um composto da presente invenção em combinação com um segundo fármaco, tal como aqui descrito. 32 0 composto da presente invenção e os fármacos adicionais, farmaceuticamente activos, podem ser administrados em conjunto, numa composição farmacêutica unitária ou separadamente e, quando administrados separadamente, isto pode ocorrer simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Tal administração sequencial pode ser próxima no tempo ou remota no tempo. As quantidades do composto da presente invenção e do segundo fármaco e os tempos relativos de administração serão seleccionados de modo a atingir o efeito terapêutico combinado desejado. A terapia de combinação pode proporcionar "sinergia" e provar ser "sinérgica", isto é, o efeito alcançado quando os ingredientes activos são utilizados em conjunto é maior do que a soma dos efeitos que resultam da utilização dos compostos separadamente. Um efeito sinérgico pode ser alcançado quando um composto da presente invenção e o segundo fármaco são: (1) co-formulados e administrados ou libertados simultaneamente numa formulação combinada de dosagem unitária; (2) libertados alternadamente ou em paralelo, como formulações separadas; ou (3) por qualquer outro regime. Quando libertado na terapia de alternância, pode-se atingir um efeito sinérgico quando um composto da presente invenção e o segundo fármaco são administrados ou libertados sequencialmente, por exemplo, por meio de injecções diferentes em seringas separadas. Por exemplo, durante a terapia de alternância, uma dosagem eficaz de cada ingrediente activo pode ser administrado sequencialmente, isto é, em série, ao passo que em terapia de combinação, as dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes activos são administradas em conjunto. 33

Por exemplo, em virtude da sua capacidade para inibir citocinas, os compostos da presente invenção são de valor no tratamento de certas doenças inflamatórias e não inflamatórias que são actualmente tratadas com um fármaco anti-inflamatório não esteróide (FAINE) inibidor de ciclo-oxigenase, tal como a indometacina cetorolac, ácido acetilsalicilico, ibuprofeno, sulindac, tolmetina e piroxicam. A co-administração de um composto da presente invenção com um FAINE pode resultar numa redução da quantidade do último agente necessário para produzir um efeito terapêutico e assim, a probabilidade de efeitos colaterais adversos do FAINE, tal como efeitos gastrointestinais, é reduzida. Assim, de acordo com uma outra caracteristica da presente invenção, proporciona-se uma composição farmacêutica que compreende um composto da presente invenção ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em conjunto ou misturado com um agente anti-inflamatório não esteróide, inibidor de ciclo-oxigenase e um diluente ou veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Os compostos da presente invenção podem também ser usados no tratamento de estados clínicos tais como artrite reumatóide, em combinação com agentes anti-artríticos tais como ouro, metotrexato, esteróides e penicilinamina e em estados clínicos tais como osteoartrite, em combinação com esteróides.

Os compostos da presente invenção podem também ser usados no tratamento de doenças degenerativas, por exemplo osteoartrite, em combinação com agentes condroprotectores, anti-degradativos e/ou reparadores tais como diacereína, formulações de ácido hialurónico, tais como Hyalan, Rumalon, Arteparon e sais de glicosamina tais como Antril. 34

Os compostos da presente invenção podem também ser usados no tratamento de asma, em combinação com agentes antiasmáticos tais como broncodilatadores e antagonistas de leucotrieno.

ADMINISTRAÇÃO DOS COMPOSTOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Os compostos da presente invenção podem ser administrados por qualquer via adequada ao estado clinico a ser tratado. As vias adequadas incluem a administração oral, parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intradérmica, intratecal e epidural), transdérmica, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal, intraperitoneal, intra-pulmonar e intranasal. Deve entender-se que a via utilizada pode variar, por exemplo, com o estado clinico do destinatário. Quando o composto é administrado por via oral, pode ser formulado como uma pilula, cápsula, comprimido, etc., com um veiculo ou excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Quando o composto é administrado por via parentérica, pode ser formulado com um veiculo parentérico aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e uma unidade de dosagem numa forma injectável, como se detalha a seguir.

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS A fim de utilizar um composto da presente invenção para o tratamento terapêutico (incluindo o tratamento profiláctico) de mamiferos, incluindo seres humanos, normalmente formula-se o composto como uma composição farmacêutica, de acordo com a prática farmacêutica padrão. De acordo com este aspecto da presente invenção providencia-se uma composição farmacêutica compreendendo um 35 composto da presente invenção em associação com um diluente ou veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

As composições farmacêuticas da presente invenção são formuladas, doseadas e administradas de uma forma, isto é, nas quantidades, concentrações, programas, percurso, veículos e via de administração, consistentes com a boa prática médica. Os factores a considerar neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamifero particular a ser tratado, o estado clínico do doente individual, a causa do distúrbio, o local de administração do agente, o processo de administração, o programa de administração e outros factores conhecidos pelos médicos. A quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, do composto a ser administrado, será orientada por essas considerações e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar o distúrbio. 0 composto da presente invenção é normalmente formulado em formas de dosagem farmacêuticas para providenciar uma dosagem facilmente controlável do fármaco e para permitir a tolerância do doente em relação ao regime prescrito. A composição para utilização na presente invenção é de preferência estéril. Em particular, as formulações para serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Essa esterilização consegue-se facilmente, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração esterilizadas. 0 composto normalmente pode ser armazenado como uma composição sólida, uma formulação liofilizada ou como uma solução aquosa.

As formulações farmacêuticas dos compostos da presente invenção podem ser preparadas por várias vias e tipos de administração. Por exemplo, um composto da presente 36 invenção possuindo o grau desejado de pureza pode opcionalmente ser misturado com diluentes, veiculos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16a edição, Osol, A. Ed.), sob a forma de uma formulação liofilizada, um pó moido ou uma solução aquosa. A formulação pode ser produzida por mistura, à temperatura ambiente, ao pH apropriado e no grau de pureza desejado, com veiculos aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico, isto é, veiculos que não são tóxicos para os receptores, nas dosagens e concentrações utilizadas. O pH da formulação depende principalmente do uso particular e da concentração do composto, mas pode variar, por exemplo, entre cerca de 3 e cerca de 8. A formulação, num tampão de acetato, a pH 5, é uma forma de realização adequada. As formulações podem ser preparadas usando processos convencionais de dissolução e de mistura. Por exemplo, dissolve-se a substância do fármaco a granel (isto é, o composto da presente invenção ou a forma estabilizada do composto, por exemplo, um complexo com um agente derivado de ciclodextrina ou outro agente de complexação conhecido) num dissolvente adequado, na presença de um ou mais excipientes. O veiculo, diluente ou excipiente particular utilizado dependerá do meio e da finalidade para a qual o composto da presente invenção vai ser aplicado. Os dissolventes são geralmente seleccionados com base em dissolventes reconhecidos por especialistas na matéria como sendo seguros (GRAS) para serem administrados a um mamífero. Em geral, os dissolventes seguros são dissolventes aquosos não tóxicos tais como água e outros dissolventes não tóxicos que são solúveis ou miscíveis em água. Os dissolventes aquosos adequados incluem água, etanol, propileno-glicol, polietileno-glicóis (por exemplo, PEG 400, PEG 300), etc. e 37 as suas misturas. Os diluentes, veículos ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilo e amónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool de butilo ou benzílico; alquil-parabenos tais como metil- ou propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); poli-péptidos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como poli-vinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou agentes tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno-glicol (PEG). As formulações podem também incluir um ou mais agentes estabilizadores, tensioactivos, agentes de molhagem, agentes lubrificantes, emulsionantes, agentes de suspensão, conservantes, antioxidantes, agentes opacificantes, deslizantes, auxiliares de processamento, corantes, edulcorantes, agentes perfumantes, agentes aromatizantes e outros aditivos conhecidos para proporcionar uma apresentação elegante do fármaco (isto é, um composto da presente invenção ou uma sua composição farmacêutica) ou ajuda no fabrico do produto farmacêutico (isto é, o medicamento). Os ingredientes farmacêuticos activos podem também ser fechados em microcápsulas preparadas, por 38 exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetil-celulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, em sistemas de libertação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980). Um "lipossoma" é uma vesicula peguena composta de vários tipos de lipidos, fosfolipidos e/ou tensioactivos, que é útil para a administração de um fármaco a um mamifero. Os componentes do lipossoma estão dispostos normalmente numa formação em camada dupla, similar ao arranjo lipidico das membranas biológicas.

Podem preparar-se preparações de libertação sustentada dos compostos da presente invenção. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo um composto da presente invenção, matrizes que estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) ou poli(álcool vinilico)), polilactidos (patente norte-americana U.S. No. 3.773.919), copolimeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato, copolimeros não degradáveis de etileno-acetato de vinilo, copolimeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico, tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico. 39

As composições farmacêuticas da presente invenção podem estar sob a forma de uma preparação injectável esterilizada, tal como, sob a forma de uma suspensão aquosa ou oleosa injectável esterilizada. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando agentes dispersantes ou de molhagem adequados e os agentes de suspensão mencionados antes. A preparação esterilizada injectável também pode ser uma solução ou uma suspensão esterilizada injectável num diluente ou dissolvente não tóxico, aceitável sob o ponto de vista parentérico, tal como uma solução em 1,3-butanodiol ou preparada como um pó liofilizado. Entre os veiculos e dissolventes aceitáveis que podem ser utilizados estão água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Além disso, utilizam-se convencionalmente, como dissolventes ou meio de suspensão, óleos não voláteis esterilizados. Para este efeito, pode-se utilizar qualquer óleo não volátil insipido incluindo mono- ou diglicéridos sintéticos. Além disso, os ácidos gordos, tal como o ácido oleico, podem também ser utilizados na preparação de injectáveis.

As composições farmacêuticas da presente invenção, adequadas para administração parentérica, incluem soluções aquosas e não aquosas esterilizadas para injecção que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do destinatário pretendido; e suspensões aquosas e não aquosas esterilizadas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes.

As composições da presente invenção podem também ser formuladas sob uma forma adequada para utilização oral (por exemplo, sob a forma de comprimidos, pastilhas, cápsulas duras ou moles, suspensões aquosas ou oleosas, emulsões, 40 pós dispersíveis ou grânulos, xaropes ou elixires), para utilização tópica (por exemplo como cremes, pomadas, géis ou soluções ou suspensões aquosas ou oleosas), para administração por inalação (por exemplo como um pó finamente dividido ou um aerossol liquido), para administração por insuflação (por exemplo, como um pó finamente dividido)

Os excipientes adequados, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, para uma formulação de comprimido incluem, por exemplo, diluentes inertes tais como lactose, carbonato de sódio, fosfato de cálcio ou carbonato de cálcio, agentes de granulação e de desintegração tais como amido de milho ou ácido algínico; agentes de ligação tais como amido; agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco; agentes conservantes tais como p-hidroxibenzoato de etilo ou de propilo e anti-oxidantes, tais como ácido ascórbico. As formulações em comprimidos podem ser ou não revestidas quer para modificar a sua desintegração e a absorção posterior do ingrediente activo dentro do tracto gastrointestinal, quer para melhorar a sua estabilidade e/ou aspecto, em qualquer dos casos, utilizando agentes convencionais de revestimento e procedimentos bem conhecidos na técnica.

As composições para uso oral também podem ser formuladas sob a forma de cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente activo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente activo é misturado com água ou com um óleo, tal como, óleo de amendoim, parafina liquida ou azeite. 41

As suspensões aquosas contêm, geralmente, o ingrediente activo sob a forma de um pó finamente dividido, em conjunto com um ou mais agentes de suspensão, tal como, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropil-metilcelulose, alginato de sódio, polivinil-pirrolidona, goma de tragacanto, e goma de acácia; agentes dispersantes ou de molhagem tal como lecitina ou produtos da condensação de um óxido de alquileno com ácidos gordos, (por exemplo, estearato de polioxietileno) ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetileneoxicetanol ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e um hexitol tal como monooleato de polioxietileno e sorbitol ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo, monooleato de polietileno e sorbitano. As suspensões aquosas podem também conter um ou mais conservantes (tais como p-hidroxibenzoato de etilo ou de propilo, anti-oxidantes (tais como ácido ascórbico), agentes corantes, agentes aromatizantes e/ou agentes edulcorantes (tais como sacarose, sacarina ou aspartame).

As suspensões oleosas podem ser formuladas, suspendendo o ingrediente activo num óleo vegetal, (tal como óleo de arachis, azeite, óleo de gergelim ou óleo de coco) ou num óleo mineral, (tal como parafina liquida) . As suspensões oleosas podem também conter um agente espessante, tal como cera de abelha, parafina sólida ou álcool cetilico. Também se podem adicionar agentes edulcorantes, tal como referido ante e os agentes aromatizantes para se obter uma preparação oral com bom gosto. Estas composições podem ser conservadas pela adição de um antioxidante tal como ácido ascórbico. 42

Os pós dispersáveis e os grânulos adequados para a preparação de uma suspensão aquosa, por adição de água, geralmente contêm o ingrediente activo em conjunto com um agente de dispersão ou de molhagem, um agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou agentes de molhagem adequados e agentes de suspensão são exemplificados pelos já mencionados antes. Excipientes adicionais, tal como agentes adoçantes, aromatizantes e corantes, podem também estar presentes.

As composições farmacêuticas da presente invenção também podem estar sob a forma de emulsões de óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, tal como azeite ou óleo de arachis ou um óleo mineral, tal como, por exemplo, parafina liquida ou as suas misturas. Agentes emulsionantes apropriados podem ser, por exemplo, gomas de ocorrência natural, tal como goma de acácia ou goma de tragacanto, fosfatideos de ocorrência natural, tal como, sementes de soja, lecitina e ésteres ou derivados de ésteres parciais de ácidos gordos e anidridos de hexitol (por exemplo mono-oleato de sorbitano) e produtos de condensação dos referidos ésteres parciais com óxido de etileno, tal como mono-oleato de polioxietileno e sorbitano. As emulsões podem também conter agentes adoçantes, aromatizantes e conservantes.

Podem formular-se xaropes e elixires com agentes edulcorantes tais como glicerol, propileno-glicol, sorbitol, aspartame ou sacarose e podem também conter um demulcente, conservante, aromatizante e/ou agente corante.

As formulações em supositórios podem ser preparadas pela mistura do ingrediente activo com um excipiente não irritante adequado que é sólido a temperaturas normais, mas 43 líquido à temperatura rectal e, portanto, derrete no recto para libertar o fármaco. Os excipientes adequados incluem, por exemplo, manteiga de cacau e polietileno-glicóis. As formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações para pulverização contendo, para além dos ingredientes activos, veículos tais como os que são conhecidos na técnica como sendo apropriados.

As formulações tópicas, tais como cremes, pomadas, géis e soluções ou suspensões aquosas ou oleosas podem geralmente ser obtidas pela formulação de um ingrediente activo com um veículo ou diluente convencional, aceitável sob o ponto de vista tópico, utilizando procedimentos convencionais bem conhecidos na técnica.

As composições para administração transdérmica podem estar sob a forma de adesivos transdérmicos para a pele que são bem conhecidos dos especialistas na matéria.

As composições para administração por insuflação podem estar sob a forma de um pó finamente dividido contendo partículas de diâmetro médio de, por exemplo, 30 ym ou muito menos, compreendendo o próprio pó quer ingrediente activo isolado ou diluído com um ou mais veículos aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico, tal como lactose. 0 pó para insuflação é então convenientemente retido numa cápsula contendo, por exemplo, 1 a 50 mg de ingrediente activo para utilização com um dispositivo turbo-inalador, tal como o que é utilizado para insuflação do agente conhecido de cromoglicato de sódio.

As composições para administração por inalação podem estar sob a forma de um aerossol pressurizado convencional 44 arranjado para libertar o ingrediente activo quer como um aerossol contendo o sólido finamente dividido ou goticulas de liquido. Podem utilizar-se os propelentes convencionais dos aerossóis, tais como hidrocarbonetos fluorados voláteis ou hidrocarbonetos voláteis e o dispositivo do aerossol é arranjado de forma a libertar uma quantidade medida de ingrediente activo. A composição farmacêutica (ou formulação) para aplicação pode ser embalada numa variedade de formas, dependendo do processo utilizado para administrar o fármaco. Por exemplo, um dispositivo para a libertação pode incluir um recipiente que tem nele depositada a formulação farmacêutica numa forma apropriada. Os recipientes adequados são bem conhecidos dos especialistas na técnica e incluem materiais tais como frascos de plástico (plástico e vidro), saquetas, ampolas, sacos de plástico, cilindros de metal e similares. 0 recipiente pode também incluir um conjunto fechado à prova de violação para impedir o acesso indiscreto ao conteúdo da embalagem. Além disso, 0 recipiente tem um rótulo que descreve o conteúdo da embalagem. 0 rótulo também pode incluir advertências adequadas. As formulações podem também ser embaladas em recipientes de dose unitária ou de várias doses, por exemplo, ampolas e frascos selados e podem ser armazenadas em condições de liofilização, requerendo apenas a adição do veiculo liquido esterilizado, por exemplo água, para injecção, imediatamente antes da sua utilização. Soluções e suspensões para injecções extemporâneas são preparadas a partir de pós esterilizados, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito. As formulações de dosagem unitária preferidas são aquelas que contêm uma dose diária ou uma sub-dose unitária diária, tal como aqui citado antes ou uma fracção apropriada do ingrediente activo. 45 A presente invenção proporciona ainda composições veterinárias que compreendem pelo menos um ingrediente activo como definido antes, em conjunto com um veiculo para veterinária. Veiculos veterinários são materiais úteis para administrar a composição e podem ser materiais sólidos, liquidos ou gasosos que são ainda inertes ou aceitáveis na técnica veterinária e que são compatíveis com o ingrediente activo. Estas composições veterinárias podem ser administradas por via parentérica, por via oral ou por qualquer outra via desejada. A quantidade de um composto da presente invenção que se combina com um ou mais excipientes para produzir uma forma de dosagem única variará necessariamente consoante o indivíduo tratado, a gravidade do distúrbio ou do estado clinico, a taxa de administração, a libertação do composto e o critério de prescrição do médico. Numa modalidade, administra-se uma quantidade adequada de um composto da presente invenção a um mamífero que dela necessite. A administração numa modalidade de realização ocorre numa quantidade entre cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal até cerca de 60 mg/kg de peso corporal por dia. Noutra modalidade, a administração ocorre numa quantidade entre cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal até cerca de 40 mg/kg de peso corporal por dia. Nalguns casos, níveis de dosagem abaixo do limite inferior do intervalo referido antes podem ser mais do que adequados, enquanto noutros casos, doses ainda maiores podem ser utilizadas sem causar qualquer efeito secundário prejudicial, desde que essas doses maiores sejam primeiro divididas em várias doses pequenas para administração ao longo do dia. Para mais informações sobre as vias de administração e os regimes de dosagem ver o capítulo 25.3 no volume 5 de Comprehensive Medicinal 46

Chemistry (Corwin Hansch; Presidente do Conselho editorial), Pergamon Press 1990.

EMBALAGENS COM MATERIAIS PARA OS PROCEDIMENTOS A presente invenção também tem por objecto uma embalagem com os materiais para o procedimento ou estojo ou "kit", contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos antes. Numa modalidade de realização, o estojo compreende um recipiente que contém um composto da presente invenção. As embalagens adequadas incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, embalagem em "blister", etc. A embalagem pode ser formada por uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. A embalagem pode conter um composto da presente invenção ou uma sua formulação que é eficaz para tratar o estado clinico e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, a embalagem pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). O estojo pode ainda incluir um rótulo ou uma inserção na embalagem ou associada com o recipiente. A expressão "inserção na embalagem" ou "bula" refere-se às instruções normalmente incluidas nas embalagens comerciais dos produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, o uso, a dosagem, a administração, as contra-indicações e/ou os avisos sobre o uso desses produtos terapêuticos. Numa modalidade de realização, os rótulos ou as bulas indicam que a composição, compreendendo um composto da presente invenção, pode ser usada para tratar uma doença ou um distúrbio mediados por cinase. O rótulo ou a bula podem também indicar que a composição pode ser usada para tratar outros distúrbios. 47

Nalgumas modalidades, os estojos são adequados para a entrega das formas orais sólidas de um composto da presente invenção, tais como comprimidos ou cápsulas. Esses estojos incluem, de preferência, um certo número de dosagens unitárias. Esses estojos podem incluir um cartão com as dosagens orientadas no sentido da utilização pretendida. Um exemplo desses estojos é uma embalagem em "blister". As embalagens em "blister" são bem conhecidas na indústria da embalagem e são amplamente utilizadas para a embalagem de formas unitárias de dosagens farmacêuticas. Se desejado, pode ser fornecido um auxiliar de memória, por exemplo sob a forma de números, letras ou outras marcações ou com a inserção de um calendário, designando os dias no esquema de tratamento em que as doses têm de ser administradas.

De acordo com outra modalidade de realização, um estojo pode compreender (a) um primeiro recipiente com um composto da presente invenção nele contido; e (b) um segundo recipiente com uma segunda formulação farmacêutica nele contida, em que a segunda formulação farmacêutica compreende um composto segundo útil para o tratamento de uma doença ou de um distúrbio mediados por cinase. Alternativamente ou adicionalmente, o estojo pode ainda compreender um terceiro recipiente compreendendo um tampão, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, tal como água bacteriostática para injeção (ABPI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. 0 estojo pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. 0 estojo pode ainda conter instruções para a administração do composto da presente invenção e, se 48 presente, a segunda formulação farmacêutica. Por exemplo, se o estojo compreender uma primeira composição compreendendo um composto da presente invenção e uma segunda formulação farmacêutica, o estojo pode ainda conter instruções para a administração simultânea, sequencial ou separada da primeira e da segunda composições farmacêuticas, a um doente que delas necessite.

Noutras modalidades de realização em que o estojo compreende uma composição da presente invenção e uma segunda formulação farmacêutica, o estojo pode compreender um recipiente para conter as composições separadas tais como um frasco dividido ou um pacote de alumínio dividido, no entanto, as composições separadas podem também estar contidas dentro de um único recipiente não dividido. Nalgumas modalidades, o estojo compreende instruções para a administração dos componentes separados. A forma de estojo é particularmente vantajosa quando os componentes separados são administrados, preferencialmente, em formas de dosagem diferentes (por exemplo, oral e parentérica) , são administrados a intervalos de dosagem diferentes ou quando a titulação dos componentes individuais da combinação é desejada pelo médico prescritor.

ACTIVIDADE BIOLÓGICA

Inibição da PCAM p38 A actividade dos compostos da presente invenção pode ser analisada quanto à inibição da PCAM p38 in vitro, in vivo ou numa linha de células. Os ensaios in vitro incluem ensaios que determinam a inibição quer da actividade da cinase, quer a actividade da ATPase da PCAM p38 activada. Alternativamente, nos ensaios in vitro quantifica-se a 49 capacidade do inibidor para se ligar à PCAM p38 e pode ser medida quer por marcação radioactiva do inibidor antes da ligação, isolando o complexo de inibidor/PCAM p38 e determinando a quantidade de marcador radioactivo ligado ou realizando uma experiência comparativa em que novos inibidores são incubados com a PCAM p38 ligada a radioligandos conhecidos. Estes e outros ensaios de cultura de células úteis, in vitro, são bem conhecidos dos especialistas na matéria.

Os ensaios de culturas de células do efeito inibidor dos compostos da presente invenção podem ser utilizados para determinar as quantidades de FNT-α, IL-1, IL-6 ou IL-8 produzidas no sangue total ou nas respectivas fracções em células tratadas com inibidor, em comparação com as células tratadas com controlos negativos. 0 nivel destas citocinas pode ser determinado através da utilização de ensaios de ELISA comercialmente disponíveis ou como descrito na secção de Exemplos Biológicos a seguir.

EXEMPLOS

Para ilustrar a presente invenção, incluíram-se os seguintes exemplos. No entanto, deve entender-se que estes exemplos não limitam a presente invenção e pretendem apenas sugerir um processo de praticar a presente invenção.

EXEMPLOS BIOLÓGICOS

As actividades biológicas dos compostos da presente invenção foram demonstradas pelos seguintes ensaios in vitro. Nos exemplos C-M utilizaram-se os seguintes compostos: composto 72: 1-(3-tert-butil-l-p-tolil-líí-pirazol-5-il) -3- (5-fluoro-2- (1- (2-hidroxietil) -lfí-indazol- 50 5-iloxi) benzil) ureia (exemplos 1 e 3); e composto 74: di-hidrogenofosfato de 2- (5- (2- ( (3- (3-terc-butil-l-p-tolil-1#-pirazol-5-il)ureido)metil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-1-il)etilo (exemplos 2 e 4).

Exemplo A:

Ensaio bioquímico de p38

Analisou-se a actividade da p38, à temperatura ambiente, em 100 pL de mistura reaccional contendo 5 nM da enzima p38cx activada e AFT-2 (proteína de fusão de activação do factor 2 de transcrição) 1 μΜ, como substrato, em HEPES 25 mM (pH 7,4), vanadato 100 μΜ, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM e [γ-33Ρ]-ATP 10 μΜ (— 0,1 pCi P33/reacção) . A reacção terminou após 30 - 40 minutos pela adição de TCA a 25 %, deixou-se repousar durante 5 minutos e, em seguida, transferiu-se directamente para uma placa de filtro de membrana FV-B. Lavou-se o filtro duas vezes durante 30 segundos com ácido fosfórico a 0,5 % utilizando um dispositivo de recolha automática Tomtec Mach III. Após a lavagem, continuou-se o vácuo durante 30 segundos para secar o filtro. Adicionou-se aproximadamente 30 pL de cintilante, por poço, na placa de filtro e, em seguida, leu-se num contador de cintilação de líquido (TopCount HTS da Packard).

Exemplo B

Ensaio de CMSP 51 A capacidade dos compostos da presente invenção para inibir a produção de FNT-α foi avaliada usando células mononucleares humanas de sangue periférico ("CMSP") que sintetizam e segregam FNT-α quando estimuladas com lipo-polissacáridos.

As soluções de ensaio do composto foram preparadas fazendo 5 diluições em série em DMSO, diluições que foram então diluidas com 5x soluções concentradas, por diluição com MEM, soro bovino fetal inactivado pelo calor ("SBF") a 2 %, HEPES 20 mM, L-glutamina 2 mM e penicilina/ estreptomicina a 1 %.

As CMSP foram isoladas a partir de sangue humano, como se segue. As amostras de sangue completo foram recolhidas de voluntários humanos num Vacutainer™ CPT da Becton Dickinson. Os tubos foram misturadas e centrifugadas, à temperatura ambiente (18 - 25 °C) , num rotor horizonta, durante um minimo de 15 minutos, a 1500-1800 de FCR (força centrífuga relativa). Para cada dador, agruparam-se as camadas de células brancas num único tubo e lavaram-se duas vezes com solução salina tamponada com fosfato ("STF"). O sedimento de células foi novamente suspenso em MEM, soro bovino fetal inactivado pelo calor ("SBF") a 2 %, HEPES 20 mM, L-glutamina 2 mM e penicilina/estreptomicina a 1 %. Determinou-se o número total de células utilizando um hemo-citómetro e ajustou-se a suspensão de células para 2 X 106 células/mL.

Adicionou-se, a cada poço, de uma placa de cultura de células de 96 poços, 0,1 mL da suspensão de células. Adicionou-se uma solução do composto do ensaio (30 yL) e as células foram incubadas numa incubadora, a 37 °C/CC>2 a 5 %, 52 durante 1 hora e, em seguida, adicionou-se, a cada poço, 20 pL de 7,5 ng/mL de lipopolissacárido (LPS, K-235 de E. Coli) e as células voltaram à incubadora, a 37 °C/C02 a 5 %, durante 16-20 horas. As células foram centrifugadas durante 15 minutos, a 1100 FCR. Aproximadamente 0,12 mL do sobrenadante foi transferido para uma placa limpa de polipropileno de 96 poços. As amostras ou foram analisadas imediatamente ou foram armazenadas a -80 °C até estarem prontas para o ensaio. Os níveis de FNT-α foram determinados em cada amostra utilizando um ensaio por ELISA de FNT-cx humano, tal como descrito a seguir.

Os níveis de FNT-α foram determinados utilizando o ensaio seguinte. Preparam-se placas revestidas com anticorpo de FNT-alfa pela adição de 150 pL de 2 pg/mL de uma IgG monoclonal de rato purificada anti-FNT-cx em tampão de carbonato-bicarbonato (pacote de tampão de carbonato-bicarbonato BupH™) a poços de uma placa de 96 poços Immulon 4 (placa de fundo plano para ELISA Immulon 4; Dynex, número de catálogo 011-010-3855) e incubou-se, durante a noite, a 2-8 °C. Eliminou-se a solução de revestimento e adicionou-se 200 pL de tampão de bloqueio (HEPES 20 mM, a pH 7,4, NaCl 150 mM, ASB a 2 %) e as placas foram armazenadas a 2-8 °C até estarem prontas para serem utilizadas. Preparou-se uma curva padrão de FNT-α humana recombinante de dez pontos, por meio de uma série de diluições a 1:2 em diluente de amostra (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM, ASB a 1 %) com uma concentração superior a 6000 pg/mL.

Eliminou-se a solução de bloqueio das placas de ELISA de FNT-cx, por lavagem, cinco vezes, com 300 pL de "tampão de lavagem" (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM, Tween-20 a 0,02 %) . Adicionou-se 50 pL de diluente de 53 amostra a todos os poços e, em seguida, adicionou-se a todos os poços quer 50 pL de uma solução da curva padrão de FNT-α, quer sobrenadante do composto de ensaio. A placa foi incubada, à temperatura ambiente, durante uma hora com agitação (300 rpm). A placa foi lavada cinco vezes com 300 pL de tampão de lavagem. Adicionou-se, a cada poço, 100 pL de 0,2 pg/mL de FNT-α de cabra anti-humano biotinilado em "diluente de anticorpo" (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM, ASB a 1 %, Tween-20 a 0,02 %) e a placa foi incubada, à temperatura ambiente, durante uma hora, com agitação (300 rpm). A placa foi lavada cinco vezes com 300 pL de tampão de lavagem por poço. Adicionou-se, a cada poço, 100 pL de 0,02 pg/mL de estreptavidina/f osf atase alcalina em diluente de anticorpo e a placa foi incubada, à temperatura ambiente, durante uma hora, com agitação (300 rpm). A placa foi lavada cinco vezes com 300 pL por poço de tampão de lavagem. Adicionou-se, a cada poço, 200 pL de 1 mg/mL de pNPP (fosfato de p-nitrofenilo) em tampão de dietanolamina com MgCl2 0,5 mM e a placa foi incubada, durante 30 a 45 minutos, à temperatura ambiente, com agitação (300 rpm). 0 progresso da reacção foi monitorizado por determinação da densidade óptica: quando o padrão de topo atingiu uma DO entre 2,0 e 3,0, adicionou-se, a cada poço, 50 pL de NaOH 2N. Determinou-se a densidade óptica de cada poço, no prazo de 30 minutos, utilizando um leitor de microplacas tituladoras fixado para 405 nm. Os dados foram analisados num ajuste de XL usando o ajustamento de curva de 4 parâmetros.

Os reagentes que se seguem foram utilizados nos ensaios descritos antes. Solução salina de Dulbecco tamponada com fosfato sem cálcio nem magnésio (número de catálogo da Gibco 14.190); meio essencial de Eagle minimo (MEM; número de catálogo da Gibco 11.090); penicilina- 54 estreptomicina (número de catálogo da Gibco 15140); L-glutamina 200 mM (número de catálogo da Gibco 25.030); HEPES 1M (Número de Catálogo da Gibco 15.630); soro de bovino fetal ("SBF"; número de catálogo da HyClone SH30070.03); lipopolissacáridos de K-235 de Escherichia coli ("LPS"; número de catálogo da Sigma L2018); IgG monoclonais purificadas de rato, anti-FNT-α (número de catálogo da R & D Systems MAB210); pacote de tampão de carbonato-bicarbonato BupH™ (número de catálogo da Pierce 28382); HEPES (FW 238,3; número de catálogo da Sigma H3575); NaCl (número de catálogo da Sigma S7653); albumina de soro bovino ("ASB"; número de catálogo da Jackson ImmunoReseach 001-000-162); monolaurato de polioxietileno 20 e sorbitano (número de catálogo da Sigma P2287); cloreto de magnésio hexa-hidratado (número de catálogo da Sigma M2670); FNT-α humano recombinante (número de catálogo da R & D Systems 210TA010); IgG de cabra, purificada com afinidade de FNT-α biotinilado (número de catálogo da R & D Systems BAF210); estreptavidina/fosfatase alcalina (número de catálogo da Jackson Immuno Research 016-050-084); tampão de substrato de dietanolamina (número de catálogo da Pierce 34064); fosfato de p-nitrofenilo (número de catálogo da Sigma N2765).

Exemplo C:

Actividade do composto 72 contra várias cinases A actividade de p38a do composto 72, utilizando um ensaio interno da cinase radioactiva de p38a, explorou-se AFT-2 como substrato. A selectividade do composto 72 foi determinada por um ensaio da actividade das proteína-cinases 202, na presença do composto 72 1 μΜ. As determinações de CI50 foram posteriormente feitas para as 55 no écran inicial (concentração cinases inibidas em > 80 % de ATP a Km) por protocolos estabelecidos.

Como se mostra no quadro 1, o composto 72 é um potente inibidor da tirosina cinase citoplásmica p38cx de Abelson (ABI), gene relacionado com Abelson (grA) e o receptor de tirosina cinase Tie-2. Para além destas actividades, o composto 72 é também moderadamente potente contra a forma de BCR-ABl T315L resistente a imatinib, a familia das tirosina-cinases src-HCK, Lin e Fin e o receptor de tirosina cinases RI FCF (receptor 1 do factor de crescimento de fibroblastos; RI FCF) e R2 FCEV (receptor 2 do factor de crescimento endotelial vascular; KDR) .

Quadro 1

Cinase Ciso p38a < 2 nM Abl 4 nM grA 10 nM Tie2 1 nM Abl (T315I) 68 nM Hck 2 6 nM Lin 2 5 nM Fin 41 nM RI FCF 2 8 nM RFCEV 7 4 nM A titulo de comparação, os compostos dos exemplos 94 e 138 da WO 2004/078116 também foram ensaiados. 56

Exemplo 138

Os resultados estão ilustrados no quadro la a seguir.

Quadro la

Exemplo 94 Exemplo 138 Cinase CI50 CI50 P38a < 2 nM < 2 nM Abl 1 OnM > 500 nM Tie2 4 nM > 500 mM 57

Os resultados mostram que o composto 72 é um inibidor significativamente mais potente de Abl e Tie2 do que os compostos dos exemplos 94 e 138 da WO 2004/078116.

Exemplo D

Actividade das células do composto 72 contra a via de p38

As células HeLa foram tratadas com o composto 72, durante 60 minutos, antes da estimulação com 1 yg/mL de anisomicina, durante 60 minutos, para induzir a activação da via de p38. As células foram marcadas com anticorpos contra a forma fosforilada de HSP27 (Ser78) e GAPDH como um controlo de normalização. As células foram visualizadas e quantificadas utilizando um visualizador de imagens Aeriustm LI-COR.

Os resultados demonstraram que o composto 72 é um inibidor potente da via de p38 nas células, com uma CI50 aparente de 2 nM. Num ensaio de células funcionais, este composto foi também analisado quanto à sua capacidade para inibir a produção de FNT-α em sangue completo tratado com lipopolissacárido (LPS) bacteriano para induzir a produção de citocinas (tal como detectado por ELISA), gerando uma CI50 aparente de30 nM.

Exemplo E

Actividade celular do composto 72 contra o receptor de Tie2

No decurso da experiência, retirou-se o soro das CEVUH durante 2 horas, em seguida estimulou-se com 200 ng/mL do agonista do receptor de Tie2 angiopoietina-1 (Ang-1). As células foram colhidas nos momentos indicados e 58 imunomarcadas com anticorpos contra fosfo-AKT, fosfo-Erk, fosfo-HSP27, fosfo-p38 e GAPDH. Os sinais foram quantificados e normalizados para GAPDH para avaliar a extensão da indução como resultado da activação do receptor de Tie2. Os resultados foram demonstrados como um "immunoblot" e um gráfico que mostram o tempo decorrido até à activação da via de p38 e de Erk e AKT em resposta ao agonista do receptor de Tie2, Ang-1 nas células endoteliais vasculares umbilicais humanas (CEVUH). Os resultados mostram que apenas os percursos de Akt e de Erk são activados em resposta à activação do receptor de Tie2.

Para o estudo da activação de Tie2, retirou-se o soro às CEVUH, durante 2 horas e em seguida trataram-se com várias concentrações do composto 72, durante 60 minutos, antes da estimulação com 200 ng/mL de Ang-1, durante 10 minutos. Tie2 foi então imunopurifiçado (IP) e "immunoblotted" com anticorpos anti-fosfotirosina (ptir) e anti-Tie2 para avaliar o grau de autofosforilação de Tie2. Os lisados foram "immunoblotted" com anticorpos anti-fosfo-Erk e anti-fosfo-AKT (Ser473), respectivamente. Os sinais foram quantificados e normalizada para GAPDH como um controlo de carregamento. Os resultados foram ilustrados numa imunomarcação e num gráfico. Os resultados do tratamento com o composto 72, numa inibição dependente da dose tanto da autof osf orilação de Tie2 bem como dos seus efectores Erk e AKT a jusante com uma CI50 < 33 nM para o primeiro e < 11 nM para o último. 59

Exemplo F

Actividade celular do composto 72 contra BCR-Abl A linha celular de leucemia mielogénica crónica

positiva para BCR-Abl, K562, foi tratada com várias concentrações de Imatinib ou com composto 72, como indicado, durante 72 horas, a 37 °C, sob C02 a 5 %. A viabilidade celular foi subsequentemente medida usando CellTiter Blue (azul de titulação de células) (Promega) para determinar os valores de CI5o para cada composto. Os valores de CI50 foram determinados como sendo 27 8 nM e 62 nM para Imatinib e o composto 72, respectivamente.

Os extractos das células K562, tratados com várias concentrações tanto de Imatinib como do composto 72, durante 2 horas, a 37 °C, em C02 a 5 % foram preparados e imunomarcados para Abl autofosforilado (p-Abl, Tir245) e substratos de Abl, STATS (pSTAT5, Tir694) e CrkL (pCrkL, Tir207). Os resultados mostram que o composto 72 é mais do que quatro vezes mais potente do que Imatinib, na inibição da proliferação na linha de células estimulada por BCR-Abl, K562. Mediram-se os resultados da imunomarcação de extractos de K562 tratados com pBCR-Abl, pSTATS, pCrkL ou GAPDH, nas concentrações de Imatinib ou de composto 72 de 5000, 1000, 333, 111, 37 e 0 nM . Este ensaio mostra que tanto o composto 72 como o Imatinib são capazes de inibir a autofosforilação de BCR-Abl, bem como os seus substratos STAT5 CrkL. O composto 72, em conformidade com os dados de proliferação, é mais potente na inibição da fosforilação destes substratos. 60

Exemplo G

Propriedades físicas, perfil metabólico e perfil de segurança dos compostos 72 e 74 1. Determinação da solubilidade

Os resultados da determinação da solubilidade estão ilustrados no quadro 2.

Quadro 2: Solubilidade

Composto 72 Composto 74 (Pró-fármaco) pH 3,0 < 0,005 mg/mL pH 1,2 < 1 mg/mL pH 7,4 < 0,005 mg/mL pH 6,5 > 1000 mg/mL pH 7,4 ~940 mg/mL A título de comparação, verificou-se que as solubilidades dos compostos dos exemplos 94 e 138 da WO 2004/078116 eram <0,001 mg/mL, a pH 6,5 e 7,4. 2. Ensaios de inibição de CYP (Fluorescente, CL-EM)

Os valores de CI5o para CYP3A4, CYP2C19 e CYP2C9 foram derivados por medição da taxa de formação de metabolitos de um substrato específico em relação ao padrão interno comparado com o controlo por cromatografia em líquido/ espectrometria de massa (CL/EM) utilizando um agregado de microssomas de fígado humano (n = 1) . Os valores de CI50 para CYP2D6 e CYP1A2 foram derivados por medição da 61 fluorescência relativa comparado com o controlo de sondas fluorescentes especificas da isoforma de P450, comercialmente disponível e a proteina recombinante (n = 1). Os resultados estão ilustrados no quadro 3.

Quadro 3: Perfil de inibição de CYP (composto 72) 72) CI50 CYP3A4 Midazolam: ~8 μΜ Testosterona: ~10 μΜ CYP2D6 3 μΜ CYP2C9 5 μΜ (LC/MS) CYPC19 25 μΜ (LC/MS) CYP1A2 2 5 μΜ 3. Ensaios de toxicidade fora do alvo 0 composto 72 foi analisado quanto à ligação (ensaio de deslocamento de ligando) a 10 μΜ contra o painel que se segue de 28 receptores, canais de iões e veículos.

Das 28 entidades moleculares rastreadas, apenas o canal de sódio (local 2) mostrou interagir significativamente (> 50 % de deslocamento) com o composto. 4. Ensaios de avaliação da segurança 62 0 ensaio de hERG foi realizado utilizando um protocolo-padrão de registo da corrente iónica. 0 ensaio de AMES (ensaio de mutação bacteriana inversa) foi realizado de acordo com o protocolo. 0 composto 72 foi ensaiado a 0,5-5000 yg/placa de ensaio com/sem activação de S9. Realizaram-se ensaios de micronúcleos in vitro e in vivo, de acordo com o protocolo. Os resultados estão ilustrados no quadro 4.

Quadro 4: Segurança

Ensaio Composto 72 Corrente iónica de hERG 64 % de inibição a 10 μΜ Mutagenicidade de AMES Negativa Micronúcleo (in vitro) Negativa 5. Estudo de tolerabilidade

Deram-se doses do composto 72 (como composto 74) a ratos (estirpe CD-I, n = 5 por grupo de dose) a 10, 30 ou 100 mg/kg BID, durante 14 dias. A perda de peso foi avaliada ao longo do estudo. O sangue foi colhido no último dia para as análises clinicas de produtos quimicos (albumina, fosfatase alcalina, ALT, amilase, BUN, cálcio, colesterol, creatinina, glicose, fosfato, bilirrubina total, TP, globulina) . Os resultados estão ilustrados no quadro 5.Não se observou mortalidade relacionada com o composto. Neste estudo, mesmo a 100 mg/kg, não se observou toxicidade limitativa da dose (TLD) e, portanto, não se identificou uma dose máxima tolerada (DMT).

Quadro 5: Tolerabilidade (in vivo)

Espécies

Rato (CD-I) 63

Dosagem 10, 30 e 100 mg/kg BID Duração do estudo 14 dias Perda de peso < 5 % (todos os grupos das doses) Químicos clínicos Dentro do intervalo normal (todos os grupos das doses) Comentários: Não se observou mortalidade relacionada com o composto, não se atingiram TLD nem DMT.

Exemplo Η

Farmacocinética do composto 72 em roedores e primatas

Utilizaram-se processos não compartimentados (modelo independente) para analisar as curvas de concentração no plasma, derivadas de todas as espécies, ao longo do tempo, tal como descrito a seguir. A clearance (Cl), os rácios percentuais de extracção calculados (RE%), o volume de distribuição (Vz) , o tempo até a H da concentração máxima (tii) e os valores de exposição (ASC, área sob a curva) são dados a seguir para murganhos, ratos e macacos respectivamente. 1. Rato: A farmacocinética do composto 72 foi examinada após uma administração por injecção em bólus intravenosa (IV, 1 mg/kg) ou oral (PO, 10 mg/kg) em ratos fêmeas Balb/c (n = 3/em cada momento) . As amostras de sangue foram obtidas aos 15 e aos 30 minutos e às 1, 2, 4, 8 e 24 horas após a dosagem PO e aos 15 e 30 minutos e às 1, 2, 4, e 8 horas para a administração IV. IV:1 mg/kg

Cl = 2,6 mL/min/kg RE = 2,8 %

Vz = 0,085 L/kg

Oral: 10 mg/kg ASC = 10,5 yg-hr/kg F = 16 %

Cmax — 1,8 yg/mL 64 tn = 3,9 h ASC = 6,6 yg-h/kg 2. Rato: A farmacocinética do composto 72 foi examinada em ratos machos Sprague-Dawley (n = 3/cada momento) no seguimento da administração em bólus IV (2 mg/kg) ou PO (30 mg/kg). Colheram-se amostras de sangue em diversos momentos ao longo do tempo tal como listado para o estudo farmacocinético do rato. IV:1 mg/kg Cl = 3,2 mL/min/kg RE = 4,6 % Vz = 0,048 L/kg tií=3, 9 h ASC =4,7 yg-h/kg

Oral: 30 mg/kg ASC = 35 yg-h/kg F = 15 % Cmax = 4,5 yg/mL 3. Macaco: A farmacocinética do composto 72 foi examinada em macacos Cynomologus (n = 3/em cada momento) na sequência da administração em bólus IV (2 mg/kg) ou PO (10 mg/kg). Colheram-se amostras ao longo do tempo, tal farmacocinético do rato. IV: 1 mg/kg

Cl = 8,8 mL/min/kg RE = 20 %

Vz = 3,2 L/kg t^=4,6 h

ASC =4,1 yg-h/kg Exemplo I de sangue em diversos momentos como listado para o estudo

Oral: 10 mg/kg ASC =7,6 yg-hr/kg F = 38 %

Cmax = 0,26 yg/mL 65

Composto 72 num modelo de artrite induzida por colaqénio (CIA) em ratos 0 composto 72 foi administrado sob a forma de um pró-fármaco (composto 74) no presente estudo. Injectaram-se ratos fêmeas Lewis (200 g) ; n = 8 por grupo de tratamento com colagénio/adjuvante de Freund incompleto de tipo II (injecção de 300 yL de 0,6 mg de colagénio, na superfície dorsal no dia 0 e no dia 6). Os animais foram tratados com: (1) Veículo: 5 mL/kg, PO, BID x 7; (2) Composto 72: 0,3, 1, 3 ou 10 mg/kg, PO, BID x 7; ou (3) ENBREL®: 10 mg/kg, SC, dias 1 e 4. ENBREL® serviu como controlo positivo. Os compostos foram administrados nos dias 11-18. Mediu-se o diâmetro do tornozelo no dia 11 e em todos os dias que se seguiram (figura 70). No fim do estudo determinou-se o peso da pata e determinou-se microscopicamente a histologia. Tanto as patas traseiras como os joelhos foram removidos, pesaram-se as patas traseiras e, em seguida, colocaram-se, com os joelhos, em formalina. Após os dias 1 e 2 em fixador e os dias 4 e 5 em descalcificante, trataram-se as articulações dos tornozelos e dos joelhos, embeberam-se, seccionaram-se e coraram-se com azul de toluidina. Atribuíram-se pontuações aos tornozelos e aos joelhos de 0-5 para a inflamação, formação de pano e reabsorção óssea.

Os resultados mostram que o composto 72 melhorou todos os parâmetros associados com este modelo de doença dependentes da dose. Para o diâmetro do tornozelo e a histopatologia, o composto 72 tinha uma DE50 aparente de 1,5 e 3,0 mg/kg, respectivamente. A 10 mg/kg, o composto 72 induziu a regressão da doença no final do estudo.

Exemplo J 66 0 composto 72 inibe a angiogénese in vivo 0 composto 72 foi administrado em doses sob a forma de pró-fármaco (composto 74) no presente estudo. Implantou-se, subcutaneamente, ratos fêmea CD-I (19-22 g), com n = 4 por grupo de tratamento, com 500 yL de matrigel reduzido com factor de crescimento contendo 1500 ng/mL de bFCF ou 0 ng/mL de bFCF como um controlo negativo. Os compostos do ensaio foram administrados por toma oral forçada nas doses e horários indicados. Administrou-se aos animais doses com (1) Veiculo: tampão de fosfato 30 mM, 10 mL/kg, PO, BID x 7; (2) Composto 72: 10, 30 ou 100 mg/kg de fármaco activo, PO, BID x 7; ou (3) SU11248: (Sutent) 40 mg/kg, PO, QD x 7. Sutent é um inibidor da KDR e serviu como um controlo positivo do fármaco no presente estudo. Os animais foram sacrificados no dia 7. Recolheu-se o Matrigel, pesou-se e homogeneizou-se em solução salina tamponada com fosfato, a pH 7,4. As amostras foram centrifugadas e o lisado resultante foi analisado quanto à concentração de hemoglobina por reacção colorimétrica. O composto 72 inibiu a angiogénese induzida por bFCF de uma forma dependente da dose. A 100 mg/kg, a angiogénese foi significativamente inibida em 72 % (p < 0,05, teste de comparação múltipla de Dunnett).

Exemplo K 0 composto 72 inibe tumores estimulados por BCR-Abl O composto 72 foi administrado em doses sob a forma de pró-fármaco (composto 74) no presente estudo. Implantou-se, subcutaneamente, em ratos fêmea SCID bege (17-20 g) , em grupos com n = 8, 107 células K562, no flanco direito. Os compostos do ensaio foram administrados por administração 67 oral forçada, nas doses e nos horários indicados, quando os tumores atingiram uma dimensão de 200 ± 50 mmt

Administrou-se aos animais doses com (1) Veiculo: Trappsol a 20 %, 10 mL/kg, PO, BID x 7; (2) Composto 74: 30 ou 100 mg/kg de fármaco activo, PO, BID ou QD x 7) ou (3) Imatinib (GLEEVEC®) : 400 mg/kg, PO, BID x 7. O Imatinib é um inibidor conhecido de Abl e serviu como um controlo positivo do fármaco no presente estudo. O tamanho do tumor e o peso corporal foram monitorizados ao longo do estudo. Os resultados estão ilustrados no quadro 6.

Quadro 6

Tratamento % de regressão e respostas completas Imatinib 400 mg/kg BID 98 % R (6/8) Composto 72 30 mg/kg BID Estase (0/8) 100 mg/kg BID 93 % R (5/8) 100 mg/kg QD Estase (0/8) O composto 74 foi eficaz neste modelo. A administração de 30 mg/kg BID ou 100 mg/kg QD resultou na estase do tumor e ocorreu uma regressão de 94 % do tumor e 5 ou 8 animais tiveram uma resposta completa (100 % de regressão do tumor) quando a dose foi aumentada para 100 mg/kg BID. O composto 72 foi bem tolerado causando menos de 10 % de perda de peso corporal ao longo de todo o tratamento.

Exemplo L

Composto 72 num modelo de mieloma múltiplo 68 0 composto 72 foi administrado em doses sob a forma de um pró-fármaco (composto 74) no presente estudo. Implantou-se, em ratos fêmeas beges SCID (17-20 g) , n = 8 por cada grupo, 15 x 106 células 8226 RPMI por via subcutânea, no flanco direito, quer com veiculo (Trappsol a 20 %, 10 mL/kg, PO, BID x 14) quer com o composto 74 (100 mg/kg de fármaco activo, PO, BID x 14). Os compostos do ensaio foram administrados por administração oral forçada, nas doses e horários indicados, quando os tumores atingiram uma dimensão de 200 ± 50 mm3. O tamanho do tumor e o peso corporal foram monitorizados ao longo do estudo e o composto 72 foi avaliado com base na capacidade para inibir o crescimento do tumor (% IGT = (1-T/C) x 100). Os resultados estão ilustrados no quadro 7. O composto 72 (doseado na sua forma de pró-fármaco como composto 74) produziu um efeito estatisticamente significativo no crescimento do tumor ao longo deste estudo. Estes dados sugerem que o efeito do composto 72 observado no presente estudo é, além disso, independente da sua capacidade para inibir p38. O composto 72 foi bem tolerado causando menos de 10 % de perda de peso corporal ao longo do tratamento.

Quadro 7

Grupo % de inibição de crescimento do tumor (ICT) Controlo 0 % Composto 37d 60 mg/kg 31 % Composto 72 100 mg/kg 67 %

A linha de células de mieloma múltiplo RPMI 8226 foi tratada com várias concentrações do inibidor proteossómico MG-132 (para servir como um controlo positivo) ou o composto 72, durante 72 horas, a 37 °C, sob CO2 a 5 %. A 69 viabilidade celular foi então medida usando CellTiter Blue (azul de titulação de células) (Promega) para determinar os valores de CI50 para cada composto (quadro 8). 0 tratamento com o composto 72 não foi anti-proliferativo em toda a gama de concentração indicada. MG-132 produziu uma CI5o dentro dos intervalos históricos do ensaio interno (quadro 8) . Estes dados indicam fortemente que o efeito da ICT observado para o composto 72 visto in vivo é provavelmente devido a efeitos extra-tumorais. Tal papel é consistente com relatórios publicados que sugerem que a actividade tanto de p38 como de Tie2 pode ser critica para o crescimento/sobrevivência deste tipo de tumor in vivo.

Quadro 8:

Composto CI5o da proliferação MG-132 114 nM Composto 72 > 10.000 nM

Exemplo M

Actividade celular do composto 72 contra R2 FCEV

Retirou-se o soro das CEVUH durante 2 horas, em seguida trataram-se com várias concentrações de composto 72 ou o inibidor controlo de R2 FCEV ((Z)-3-[(2,4-dimetil-3-(etoxicarbonil)-pirrol-5-il)metilidenil]indolin-2-ona) , durante 60 minutos antes da estimulação com 20 ng/mL de FCEV, durante 5 minutos. Os lisados de vários tratamentos foram preparados e imunomarcados com anticorpos específicos para R2 FCEV fosforilado em Tirll75. As machas da marcação (blots) resultantes para o composto 72 e para o inibidor de controlo RI FCEV foram então visualizadas e quantificadas por meio do equipamento de visualização LI-COR Aeriustm. O 70 sinal de fosfo-R2 FCEV foi normalizado com GAPDH como um controle de carga. Estes valores foram então usados para gerar valores de CI50 para o composto 72 e RI FCEV, inibidor de controlo de R2 FCEV, utilizando um protocolo ajustamento da curva de 4 parâmetros. 0 composto 72 inibe a autofosforilação do receptor endotelial vascular do tipo II (R2 FCEV) em CEVUH. Os resultados mostram que 0 tratamento com 0 composto 72 resulta numa inibição, dependente da dose, da autofosforilação de R2 FCEV no resíduo de tirosina 1175 com uma CI50 de 48 nM.

EXEMPLOS PREPARATIVOS

Nos exemplos descritos a seguir, a menos que indicado de outra forma, todas as temperaturas são dadas em graus Celsius. Os reagentes foram comprados a fornecedores comerciais tais como Aldrich Chemical Company, Lancaster, TCI ou Maybridge e foram utilizados sem purificação adicional, salvo indicação em contrário. 0 tetra-hidrofurano (THF), a N,N-dimetilformamida (DMF), o diclorometano (DCM), o tolueno, o dioxano e o 1,2-difluoroetano foram adquiridos à Aldrich, em frascos selados e seguros e utilizados tal como recebidos.

As reacções indicadas a seguir foram realizadas geralmente a uma pressão positiva de azoto ou de árgon ou com um tubo de secagem (salvo indicação em contrário) em dissolventes anidros e os frascos de reacção estavam normalmente equipados com tampas de borracha para a introdução de substratos e de reagentes por via de uma seringa. 0 material de vidro foi seco em estufa e/ou com calor. 71 A cromatografia em coluna foi realizada num sistema Biotage (fabricante: Dyax Corporation) com uma coluna de gel de silica ou com um cartucho de silica SepPak (Waters). 0 espectro de RMN do ΧΗ foi registado num equipamento Varian a 400 MHz. Os espectros de RMN 1 2H do foram obtidos como soluções de CDC13 (referidas em ppm), usando clorofórmio como o padrão de referência (7,25 ppm). Utilizaram-se outros dissolventes de RMN, conforme necessário. Quando se reportam muitos picos, utilizam-se as seguintes abreviaturas: s (singleto) , d (dupleto), t (tripleto), m (multipleto), br (alargado), dd (dupleto de dupleto), dt (dupleto de tripleto). As constantes de acoplamento, quando indicadas, são referidas em Hertz (Hz) .

Exemplo 1

Preparação de 1-(3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)-3-(5-fluoro-2- (1- (2-hidroxietil) -lff-indazol-5-iloxi) benzil) -ureia (72): Processo 1 72 1 A sintese do composto (72), de acordo com o processo 2 está ilustrada no esquema 1, etapas A a J.

Etapa A:Preparação de 2-(benziloxi)-5-fluorobenzo- nitrilo 62: Num frasco de 12 L, de fundo redondo, com 4 tubuladuras, equipado com um agitador mecânico e uma sonda de temperatura, adicionou-se, lentamente, a uma suspensão de hidreto de sódio (74 g, 1,82 mole) em DMF (1,95 L) , álcool benzilico (142 g, 1,3 mole) através de um funil de gotejamento, ao longo de 30 minutos, num banho de gelo e em atmosfera de azoto. Agitou-se a mistura num banho de gelo (0 °C) , durante 120 minutos, adicionou-se uma solução de 2,5-difluorobenzonitrilo (180 g, 1,3 mole) em DMF (650 mL), através de um funil de gotejamento, ao longo de 35 minutos. Aqueceu-se a mistura resultante até à temperatura ambiente. Após 2 horas, arrefeceu-se a mistura num banho de gelo (4 °C) e temperou-se com NH4C1 saturado (130 mL) , seguido da adição de água (2,6 L x 3). Agitou-se a pasta, à temperatura ambiente, durante a noite e filtrou-se o precipitado e lavou-se com água (650 mL x 3) . Secou-se o sólido em vácuo, durante 2 dias, para se obter 292 g (99,3 %) do composto desejado. RMN do ΧΗ (400 MHz, DMSO-de) δ 7,78 (dd, 1H, J= 3,2 Hz, J= 8,2 Hz), 7,5-7,76 (m, 1H) , 7,35-7,48 (m, 6H), 5,28 (s, 2H) .

Etapa B: Preparação de 5-fluoro-2-hidroxibenzonitrilo 63: colocou-se Pd/C anidro a 10 % (2,48 g) num frasco de 5 L em atmosfera de N2. Adicionou-se, lentamente, uma solução de 2-(benziloxi)-5-fluorobenzonitrilo (148 g, 651 mmole) em metanol (2,34 L) em atmosfera de N2. Retirou-se o ar do balão por vácuo e carregou-se o frasco com H2 (balão) por três vezes. Agitou-se a mistura, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Repetiu-se o processo anterior mais duas vezes, até à conclusão da reacção. Agitou-se a mistura, à temperatura ambiente, durante mais 2 horas. Filtrou-se a mistura através de uma almofada de Celite em atmosfera de N2 e lavou-se com EtOAc (150 mL x 2) . Os residuos de paládio foram enxaguados com água (50 mL) e descartados. Concentraram-se os filtrados para se obter (94,6 g, 106 %) do composto desejado sob a forma de um sólido amarelo.

Detectou-se por EM (APCI +) m/z 137 (M-l) . RMN do XH (400 MHz, DMSO-de ) δ 11,07 (alargado, 1H) , 7,58 (dd, 1H, J = 3,2 Hz, J = 8,2 Hz) , 7,43 (m, 1H) , 6, 91 -7,03 (dd, 1H J = 4,5

Hz, J = 9,2 Hz) . 73

Etapa C: Preparação de 5-fluoro-2-(4-metil-3-nitro-fenoxi)benzonitrilo 64: num balão de 5 L, de 3 tubuladuras, equipado com um agitador mecânico, um condensador e uma sonda de temperatura J-Kem, adicionou-se uma solução de 5-fluoro-2-nitrotolueno (158 g, 1,02 mole) em N,N-dimetil-acetamida (500 mL) a uma mistura de 5-fluoro-2-hidroxi-benzonitrilo (147 g, 1,07 mole) e carbonato de potássio (163 g, 1,2 mole) em N,N-dimetilacetamida (573 mL) , à temperatura ambiente. Aqueceu-se a mistura até 100 °C. Após 8 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional para a temperatura ambiente e adicionou-se água (3400 mL) , num banho de gelo. Filtrou-se o precipitado, lavou-se com água (1073 mL x 2) e secou-se em vácuo (40 °C) para se obter (264 g, 90 %) do composto desejado sob a forma de um sólido castanho. Detectou-se por EM (APCI -) m/z 272 (M-l). RMN do (400 MHz, CDC13) δ 8,10 (d, 1H, J= 9 Hz), 7,41-7,48 (m 1H) , 7,38 (m, 1H) , 7,07-7,14 (m, 1H) , 6,88-7,10 (m, 1H) 2, 63 (s, 3H) .

Etapa D: preparação de 2-(3-amino-4-metilfenoxi)-5-benzonitrilo 65: num balão de 12.000 ml, de 4 tubuladuras, de fundo redondo, equipado com um agitador mecânico, um condensador e uma sonda de temperatura J-Kem, colocou-se 2-(3-amino-4-metilfenoxi)-5-benzonitrilo (247 g, 907 mmole) e Zn em pó (297 g, 4,5 mole) e fez-se uma suspensão em MeOH/THF (2,2 L) a 1:1. Adicionou-se, lentamente, NH4C1 (1,6 L) saturado, durante 40 minutos, através de um funil de adição (mantendo a temperatura interna abaixo de 60 °C) . Arrefeceu-se a mistura reaccional, até à temperatura ambiente e agitou-se, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Eliminou-se o pó de zinco por filtração e lavou-se o bolo com EtOAc (450 mL x 3) . Adicionou-se NH4OAc aquoso saturado (1.500 mL, preparado a partir de 2 kg de NH4OAc e 4 L de H20) e H20 (1500 mL x 2) . Os filtrados foram 74 concentrados por evaporação rotativa até desaparecer a maior parte da água. 0 sólido castanho-amarelado foi filtrado e lavado com H2O (1500 mL x 4) e secou-se, em vácuo, para proporcionar 211,5 g (96 %) do composto desejado. Detectou-se por EM (APCI -) m/z 243 (M+l). RMN do ΧΗ (400 MHz, CDCI3) δ 7,38 (m, 1H) , 7,18 (m, 1H) , 6,65-6,85 (m, 5H), 3,60 (largo, 2H), 2,17 (s, 3H) .

Etapa E: preparação de 2-(lH-indazol-5-iloxi)-5-

fluorobenzonitrilo 66: num balão de 6 L, de fundo redondo, equipado com um agitador mecânico e uma sonda de temperatura J-KEM, tratou-se uma solução fria (0 °C) de 2-(3-amino-4-metilfenoxi)-5-benzonitrilo (209 g, 862 mmole) e NH4BF4 em ácido acético (1,75 L)/água (862 mL) com HC1 concentrado (359 mL), gota a gota, durante 2 minutos. Agitou-se a pasta num banho de gelo durante 30 minutos e adicionou-se nitrito de sódio. Agitou-se a mistura reaccional a 0 °C durante 1 hora e, em seguida, aqueceu-se até à temperatura ambiente. Após agitação, à temperatura ambiente, durante 3 horas, eliminaram-se os dissolventes por evaporação rotativa e azeotrópica com tolueno (200 mL x 2) . Secou-se o resíduo em vácuo durante a noite. O sólido foi suspenso em acetona (200 mL) e EtOAc (200 mL) e os dissolventes foram eliminados por evaporação rotativa. Fez-se uma suspensão do resíduo em EtOAc (200 mL) e eliminou-se por evaporação rotativa. O resíduo foi suspenso em EtOAc (1145 mL) e adicionou-se acetato de potássio (254 g, 2,6 mole) numa porção. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 20 horas e filtrou-se. Lavou-se o bolo foi lavado com EtOAc (500 mL x 6). Concentraram-se os filtrados combinados . Fez-se uma suspensão do resíduo em EtOAc (500 mL) e heptano (500 ml). Filtrou-se o sólido amarelo (141,3 g) . O licor mãe foi concentrado e recristalizou em MTBE/hexano (100 mL/100 mL) para dar origem a 20,1 g. O 75 segundo licor mãe foi concentrada e triturado com MTBE/heptano (100 mL/100 mL) para dar mais 14,28 g. As colheitas combinadas originaram 176 g (rendimento de 81 %) do composto desejado. Detectou-se por EM ((APCI -) m/z 254 (M+l). RMN do XH (400 MHz, DMSO-d6) δ 1338 (alargado, 1H), 807 (s, 1H) , 794 (dd, 1H, J = 3,1 Hz, J = 82 Hz) , 764 (d, 1H, J = 9 Hz), 754 (m, 2H) , 721 (dd, 1H, J = 9 Hz) , 696 (dd, 1H,, J = 43 Hz, J = 93 Hz).

Etapa F: Preparação de 2-(1-(2,2-dimetoxietil)-1H-indazol-5-iloxi)-5-fluorobenzonitrilo 67: Fez-se uma suspensão de 2-(lH-indazol-5-iloxi)-5-fluorobenzonitrilo (5.000 g, 19,7 mmole) em N, N-dimetilacetamida (50 mL) e adicionou-se, às porções, hidreto de sódio (0,684 g, 25,7 mmole), à temperatura ambiente. Adicionou-se, gota a gota, 2-bromo-l,1-dimetoxietano (3,49 mL, 29,6 mmole), numa porção e a mistura reaccional foi aquecida a 80 °C, durante 18 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e concentrou-se, a pressão reduzida, para originar o material impuro, o qual foi dividido entre EtOAc e NH4C1 aquoso saturado. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (3x), salmoura e secaram-se (MgS04) e depois concentrou-se a pressão reduzida, para produzir o material impuro. O produto impuro foi purificado por cromatografia rápida em coluna (eluente EtOAc/hexanos a 25 %) para originar 3,88 g (57,6 %) do composto desejado. O isómero de N-2 não foi isolado. Detectou-se por EM (APCI+) m/z 342 (M+l). RMN do XH (400 MHz, CDC13) δ 7,98 (s, 1H) , 7,54 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,36 (m, 2H) , 7,16 (m, 2H) , 6,82 (dd, 1H, J = 4,3 Hz, J= 9,3 Hz), 4,76 (t, 1H, J= 5,3 Hz), 4,49 (d, 2H, J= 5,3 Hz), 3,41 (s, 6H).

Etapa G: preparação de (2-(1-(2,2-dimetoxietil)-1H-indazol-5-iloxi)-5-fluorofenil)metanamina 68: adicionou-se 76 2-(1-(2,2-dimetoxietil)-lH-indazol-5-iloxi)-5-fluorobenzo-nitrilo (3,80 g, 11,13 mmole) em THF (100 mL), gota a gota, a uma suspensão agitada, a 0 °C, de hidreto de alumínio e lítio (0,6338 g, 16,70 mmole) em THF (100 mL). Manteve-se a mistura reaccional a 0 °C até se completar a adição do material inicial. Aqueceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e agitou-se até completar o consumo do material inicial, o que foi observado por análise por uma análise por CLAR. Adicionou-se a mistura reaccional, gota a gota, a uma solução agitada, à temperatura ambiente, de sal de Rochelle aquoso saturado. A mistura de duas fases foi agitada rapidamente durante 30 minutos enquanto houve sais de alumínio em solução. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com mais EtOAc. Os produtos orgânicos combinados foram secos (MgS04) e concentraram-se, a pressão reduzida, para dar origem a 3,73 g (97 %) do

produto impuro, que foi utilizado sem purificação adicional. Detectou-se por EM (APCI+) m/z 346 (M+l). RMN do (400 MHz, CDC13) δ 7,90 (s, 1H) , 7,48 (d, 1H, J= 9 Hz), 6,9-7,15 (m, 5H) , 4,76 (t, 1H, J= 5,3 Hz), 4,49 (d, 2H, J = 5,3 Hz), 3,88 (s, 2H) , 3,36 (s, 6H) .

Etapa H: preparação de 1-(3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)-3-(2-(1-(2,2-dimetoxietil)-lH-indazol-5-iloxi)-5-fluorobenzil)ureia 70: fez-se uma suspensão de (2-(1-(2,2-dimetoxietil)-lH-indazol-5-iloxi)-5-fluorofenil)-metanamina (2,00 g, 5,791 mmole), 3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-ilcarbamato de 2,2,2-tricloroetilo (3,516 g, 8,686 mmole) e N,N-di-isopropiletilamina (3,026 mL, 17,37 mmole) em N,N-dimetilacetamida (50 mL) e aqueceu-se, a 80 °C, durante a noite. Concentrou-se a mistura reaccional, a pressão reduzida e o resíduo foi diluído com EtOAc e NH4CI aquoso saturado. Os produtos orgânicos foram lavados com água (3x), salmoura, secos (MgS04) e depois concentraram- 77 se, a pressão reduzida, para produzir o material impuro, que foi purificado por cromatografia rápida em coluna (eluente EtOAc/hexanos a 35 - 45 %) . Após a evaporação do dissolvente, obteve-se o produto desejado sob a forma de

uma espuma amarela clara (2,57 g, 74 %). Detectou-se por EM ( (APCI + ) m/z 602 (M+l) . RMN do XH (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,88 (s, 1H), 7,43 (d, 1H, J= 9 Hz), 6, 72-7,30 (m, 9H) , 6,18 (s, 1H) , 6,01 (largo, 1H), 5,47 (t, 1H, J = 6,1 Hz), 4,76 (t, 1H, J= 5,3 Hz), 4,44 (t, 4H, J= 5,6 Hz), 3,38 (s, 6H) ; 2,37 (s, 3H) , 1,30 (s, 9H) .

Etapa I: Preparação de 1-(3-terc-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il)-3-(5-fluoro-2-(1-(2-oxietil)-lH-indazol-5-il-oxi)benzil)ureia 71: dissolveu-se 1-(3-terc-butil-l-p- tolil-lH-pirazol-5-il)-3-((2-(1-(2,2-dimetoxietil)-1H-indazol-5-iloxi)-5-fluorofenil)metil)ureia (0,500 g, 0,8324 mmole) em diclorometano, à temperatura ambiente e adicionou-se, gota a gota, à solução agitada, iodo-trimetilsilano (0,3554 mL, 2,497 mmole). Monitorizou-se a mistura reaccional por análise por meio de CLAR e, quando nenhum material inicial foi detectado, diluiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se com Na2S204 aquoso a 10 %, NaHCCb aquoso saturado, salmoura, secou-se (MgSCh) e concentrou-se, a pressão reduzida, para se obter 536 mg (rendimento quant.) do produto impuro, o qual foi utilizado sem mais purificação. RMN do 1H (400 MHz, DMSO-de) δ 9,76 (s, 1H) , 7,97 (s, 1H) , 6, 78-7,30 (m, 10H) , 6,17 (s, 1H) , 5,99 (largo, 1H) , 5,44 (q, 1H, J= 6,1 Hz), 4,46 (m, 4H) , H 2,35 (s, 3H) , 1,34 (s, 9H) .

Etapa J: preparação de 1-(3-terc-butil-l-p-tolil-lií-pirazol-5-il)-3-(5-fluoro-2-(1-(2-hidroxietil)-lH-indazol-5-iloxi)benzil)ureia 72: fez-se uma suspensão de 1-(3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)-3-((5-fluoro-2-(1-(2- 78 oxoetil)-lH-indazol-5-iloxi)fenil)metil)ureia (2,179 g, 3, 929 mmole) em MeOH (40 mL) e tratou-se com boro-hidreto de sódio (0,7432 g, 19,64 mmole), em porções, à temperatura ambiente. Agitou-se a mistura reaccional, à temperatura ambiente, até a conversão completa do material inicial que se observou por análise por CLAR. Concentrou-se a mistura reaccional a pressão reduzida e depois diluiu-se com NH4C1 aquoso saturado e extraiu-se com diclorometano. Secaram-se os produtos orgânicos (MgSCq) e concentraram-se a pressão reduzida para produzir o material impuro, que foi purificado por cromatografia rápida em coluna (eluente iPrOH/DCM a 2-6 %) para se obter 1,21 g (55 %) do composto desejado. Detectou-se por EM (APCI +) m/z 557 (M+l). RMN do XH (400 MHz, DMSO- d6) δ 8, 29 (s, 1H) , 7,97 (s, 1H) , 7, 68 (d, 1H, J = 9 , 1 Hz ) , 7,35 (s, 1H) , 6 ,85-7,4 (m, 8H) , 6,24 (s, 1H) , 4,87 (t, 1H, J = 5, 4 Hz) , 4,43 (t, 1H , J = = 5, 6 Hz) , 4, 28 (d, 1H, J= 5, 9 Hz) , 3, 80 (q, 1H, J = 5, 5 Hz) , 2,35 (s , 3H), 1,25 (s, 9H) .

Exemplo 2

Preparação de di-hidrogenofosfato de 2-(5-(2-((3-(3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)ureido)metil)-4-fluoro-fenoxi)-lH-indazol-l-il)etilo (74): processo 1 A sintese do composto (74), de acordo com o processo 1, está ilustrada no esquema 1, etapas K a L.

Etapa K: preparação de 2-(5-(2-((3-(3-tert-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il) ureido) metil) - 4-f luorofenoxi) -1H-indazol-5-il)etilfosfato de dibenzilo 73: 0,9620 mmole) e 2H-tetrazol (0, 07189 g, 1,026 mmole) em DMF (10 mL) e agitou-se, à temperatura ambiente, até que a análise por CCF (DCM-Et20 a 10:1) mostrou o consumo completo do 79 material inicial. Adicionou-se peróxido de t-butilo e hidrogénio (0,4439 mL, 3,207 mmole) e em seguida monitorizou-se a reacção por análise por CLAR. Após a conclusão da reacção, adicionou-se Na2S203 aquoso a 10 % e agitou-se a mistura reaccional durante 10 minutos. Verteu-se a mistura reaccional em NaHCC>3 saturado aquoso e extraiu-se com EtOAc. Lavaram-se as camadas orgânicas combinadas com água (2x) e salmoura. Secaram-se os produtos orgânicos (MgSCh) e concentraram-se, a pressão reduzida, para produzir o material impuro, que foi purificado por cromatografia rápida em coluna (eluente EtOAc/hexanos a 30-40 %) para se obter 458 mg (87 %) do composto desejado. Detectou-se por EM (APCI +) m/z 817 (M+l) . RMN do (400 MHz, CDCI3) δ 7,85 (s, 1H) , 6, 7-7,35 (m, 10H) , 6, 18 (s, 1H) , 6,16 (s, 1H) , 4,62 (s, 1H) , 5,36 (t, 1H, J = 6 Hz) , 4,81 (d, 4H, J = 8,2 Hz), 4,54 (t, 2H, J = 5,1 Hz) r 4,39 (m, 4H), 2,35 (s, 3H), 1,25 (s, 9H) .

Etapa L: preparação de di-hidrogenofosfato de 2-(5-(2-( (3 - (3-tert-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il) ureido) metil) -4-f luorofenoxi)-lfí-indazol-l-il) etilo 74: fez-se uma suspensão de 2-(5-(2-((3-(3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)ureido)metil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-1-il)etil-fosfato de dibenzilo (1,920 g, 2,35 mmole) em EtOH (0,05 M, 50 mL) e adicionou-se ciclo-hexa-1,4-dieno (3,56 ml, 82,14 mmole) e Pd/C a 10 % (20 %/peso, 0,384 g). Fez-se o refluxo da mistura reaccional durante a noite. Filtrou-se a mistura reaccional através de papel de FV e lavou-se com

MeOH. As camadas orgânicas foram concentradas, a pressão reduzida, para se obter o material impuro, que foi dissolvido em MeOH e passou através de um filtro Acrodisk da Gellman (0,45 um) para remover vestígios de contaminação de paládio. Após a evaporação do dissolvente, a goma resultante foi triturada em CH3CN e recolheram-se os 80 sólidos formados por filtração e secaram-se, em vácuo forte, durante 3 horas, para se obter 1,21 g (89 %) do composto desejado. Detectou-se por EM (APCI +) m/z 637 (M+l) . RMN do (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,30 (s, 1H); 8,00 (s, 1H), 7,71 (d, 1H, J = 9 Hz), 6,88-7,37 (m, 10H) , 6,24 (s, 1H), 4,61 (largo, 1H) , 4,28 (d, 2H, J = 5,7 Hz), 4,19 (dd, 2H, J = 5 ,2 Hz), 2,35 (s, 3H), 1,25 (s, 9H) .

Exemplo 3

Preparação de 1-(3-te-zrc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)-3-((5-fluoro-2-(1-(2-hidroxietil)-lff-indazol-5-iloxi)fenil)-metil)ureia (72): processo 2

Um processo alternativo para a síntese do composto (72), de acordo com o processo 2, está ilustrado no esquema 2, etapas A a F.

Etapa A:preparação de 2-(4-amino-3-metilfenoxi)-5-fluorobenzonitrilo 65: num balão de 3 L, de 4 tubuladuras, que tinha sido esvaziado e que foi novamente preenchido com árgon, dissolveu-se 2,5-difluorobenzonitrilo (295,3 ml, 812,0 mmole) e 4-amino-3-metilfenol (100,0 g, 812,0 mmole) em DMSO anidro (2,75 M) com agitação rápida, à temperatura ambiente. Esvaziou-se a solução/encheu-se novamente com árgon (3x) . Adicionou-se carbonato de potássio (185,2 g, 1340 mmole) (-325 mesh). A mistura reaccional foi esvaziada/encheu-se novamente o balão com árgon (3x) e aqueceu-se para 80 °C (sonda interna) durante 16 horas. A CCF indicou a conversão completa. Arrefeceu-se a mistura reaccional, até à temperatura ambiente e verteu-se lentamente em 2 L de água gelada com agitação rápida. O resíduo no balão de fundo redondo foi recolhido em água repetidamente e verteu-se em água gelada até se alcançar um 81 volume total de 3 L e todos os sólidos estarem na água gelada. A suspensão foi agitada rapidamente durante 2 horas à medida que retomava a temperatura ambiente. Os sólidos castanhos foram recolhidos por filtração, lavaram-se com água (3 L) , secaram-se ao ar, secaram-se com uma barreira de látex e secaram-se em vácuo forte, a 40 °C, durante 44 horas, para originar 194 g (99 %) do produto desejado, sob a forma de um sólido acastanhado. Detectou-se por EM ((APCI + ) m/z 243 (M+l) . RMN do ΧΗ (400 MHz, CDC13) δ 7,38 (m, 1H) , 7,18 (m, 1H) , 6, 65-6, 85 (m, 5H) , 3,60 (largo, 2H) , 2,17 (s, 3H).

Etapa B: preparação de 2-(lH-indazol-5-iloxi)-5- fluorobenzonitrilo 66: num balão de 500 mL, com uma tubuladura, contendo uma grande barra de agitação magnética, recolheu-se 2-(4-amino-3-metilfenoxi)-5-fluoro-benzonitrilo (274,5 ml, 219,6 mmole) em clorofórmio (0,8 M) e tratou-se com acetato de potássio (25,86 g, 263,5 mmole), a temperatura ambiente. A mistura reaccional foi arrefecida para 0 °C e tratada com anidrido acético (62,28 mL, 658,8 mmole), via um funil de adição, ao longo de 5 minutos. A reacção foi equipada com um condensador de refluxo, tratada com mais 100 mL de clorofórmio e aquecida a 40 °C. Adicionou-se, gota a gota, nitrito de isoamilo (58,74 mL, 439,2 mmole) através de um funil de adição. Lavou-se o funil de adição com 60 mL + 40 mL de clorofórmio, removeu-se e substituiu-se por uma rolha de vidro. Aqueceu-se a mistura reaccional, à temperatura de refluxo, durante 20 horas, arrefeceu-se até à temperatura ambiente e concentrou-se, em vácuo, até se obter um sólido castanho. Depois de se secar em vácuo forte, durante 30 minutos, o sólido castanho foi suspenso em 1 L de água, agitou-se vigorosamente durante 15 minutos e filtrou-se. O sólido castanho-alaranjado resultante (83 g) foi recolhido em 400 82 mL de MeOH e tratou-se com ácido clorídrico 1,0 M (241,6 mL, 241,6 mmole), à temperatura ambiente. A mistura foi equipada com um condensador de refluxo e aqueceu-se, até 70 °C, durante 20 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional para 0 °C e adicionou-se hidróxido de sódio 1,0 M (252,6 mL, 252, 6 mmole), seguido de água (250 mL) . A suspensão amarela resultante foi agitada num banho de gelo, durante 10 minutos e depois deixou-se assentar. Filtrou-se a suspensão, lavou-se com água (1 L), secou-se ao ar, secou-se com uma barreira de látex e secou-se em vácuo forte a 40 °C, durante 36 horas, para originar 50,7 g (91 %) do produto desejado, sob a forma de um sólido acastanhado fluindo livremente. Detectou-se por EM (APCI +) m/z 254 (M+l). RMN do ΧΗ (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,38 (alargado, 1H), 8,07 (s, 1H) , 7,94 (dd, 1H, J = 3,1 Hz, J = 8,2 Hz), 7,64 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,54 (m, 2H) , 7,21 (dd, 1H, J = 9 Hz), 6,96 (dd, 1H, , J= 4,3 Hz, J= 9,3 Hz).

Etapa C: Preparação de 2-(5-(2-ciano-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-l-il)acetato de metilo 77: dissolveu-se 2-(lH-indazol-5-iloxi)-5-fluorobenzonitrilo (40,7 g, 160,7 inmole) em 400 mL de DMF e colocou-se a solução num banho de água (temperatura ambiente). Adicionou-se carbonato de césio (157,1 g, 482,2 mmole). Depois de 30 minutos, num banho de água, adicionou-se, gota a gota, 2-bromoacetato de metilo (33,47 ml, 353,6 mmole). Agitou-se a mistura, à temperatura ambiente, durante 4 horas. À mistura adicionou-se água (400 mL, ligeiramente exotérmica) e transferiu-se toda a mistura para um funil de separação de 2 L (continha 400 mL de EtOAc). Separaram-se as camadas e extraíu-se a camada aquosa com EtOAc (3 X 200 mL) . Lavaram-se os extractos combinados com água e salmoura e separaram-se as camadas. Secou-se a camada orgânica sobre MgS04, filtrou-se através de uma almofada de Celite, concentrou-se a pressão reduzida 83 e secou-se em vácuo forte, durante 1 hora, para se obter 66,3 g de um sólido acastanhado. Dissolveu-se o sólido em 400 ml de EtOAc quente e tratou-se com carvão, durante 10 minutos, à temperatura de refluxo. Filtrou-se a mistura através de uma almofada de Celite e concentrou-se a pressão reduzida. Os materiais insolúveis foram eliminados por filtração. Dissolveu-se o sólido foi em 300 ml de EtOAc quente e adicionou-se 300 mL de hexanos. Arrefeceu-se a mistura para a temperatura ambiente. Recolheu-se o sólido castanho claro por filtração, 32,24 g (61,7 %). Detectou-se por EM (APCI +) m/z 326 (M+l) . RMN do (400 MHz, CDC13) δ 8,03, 1H) , 7,41 - 7,36 (m, 3H) , 7,22 - 7,16 (m, 2H) , 6,81 (dd, J= 4,29 Hz, 9,37 Hz, 1H) , 5,19 (s, 2H) , 3,79 (s, 3H) .

Etapa D: Preparação de dicloridrato de 2-(5-(2-aminometil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-l-il)acetato de metilo 78: colocou-se 2- (5- (2-ciano-4-fluorofenoxi)-1H-indazol-l-il)acetato de metilo (10,00 g, 30,74 mmole) num recipiente de hidrogenação de Parr de 2500 mL. Adicionou-se etanol (0,1 M, 310 mL) e HC1 concentrado (25, 62 ml, 307,4 mmole). Adicionou-se Pd/C a 10 % (2, Og, do tipo Degussa) e purgou-se o recipiente com hidrogénio gasoso (três vezes, não se fez evacuação por vácuo). O recipiente foi carregado com hidrogénio gasoso, a 40 psi e deixou-se no agitador durante 18 horas. Adicionou-se à mistura mais l,0g de Pd/C a 10 % e colocou-se de novo a mistura no hidrogenador de Parr durante um periodo adicional de 18 horas. Filtrou-se a mistura através de uma almofada de Celite e concentrou-se a pressão reduzida (manteve-se a temperatura do banho a 20 °C) . O resíduo foi misturado azeotrópicamente com MeOH (3X100 mL). Aumentou-se a temperatura do banho para 40 °C, após a terceira mistura azeotrópica. Secou-se o resíduo (óleo) em vácuo forte durante, 2 horas, para se obter o produto desejado sob a forma de um sólido amarelo (11,6 g, 84 93,8 %). Detectou-se por EM (APCI +) m/z 330 (M+l). RMN do ΧΗ (400 MHz, DMSO-de) δ 8,08 (s, 1H) , 6, 84-7,76 (m, 6H) , 5,43 (s, 2H) , 4,8 (largo, 2H) , 4,105 (q, 2H, J= 5,6 Hz), 3, 68 (s, 3H) .

Etapa E: preparação de 2-(5-(2-((3-(3-tert-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il) ureido) metil) - 4-f luorofenoxi) -1H-indazol-l-il)acetato de metilo 79: tratou-se uma solução de dicloridrato de 2-(5-(2-(aminometil)-4-fluorofenoxi)-1H-indazol-l-il) acetato de metilo (17,5 g, 43,51 mmole) em dimetilacetamida (0,5 M, 88 mL) com 2,2,2-tricloroetilo-3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-ilcarbamato (17,96 g, 44,38 mmole), seguido de di-isopropiletilamina (30,3 mL, 174 mmole), à temperatura ambiente. Aqueceu-se a mistura, a 80 °C durante a noite. A mistura foi concentrada em vácuo e o resíduo foi distribuído entre EtOAc e NH4C1 aquoso saturado. Separou-se a camada orgânica e lavou-se com salmoura, filtrou-se através de papel 1PS, evaporou-se in vacuo até se obter uma espuma castanha. A espuma foi triturada em éter e recolheram-se os sólidos precipitados por filtração para se obter 22,55 g (89 %) do composto desejado. Detectou-se por EM (APCI +) m/z 585 (M+l). RMN do ΧΗ (400 MHz, DMSO-de) δ 8,3 (s, 1H) , 8,07 (s, 1H) , 7,68 (d, 1H, J= 8,9 Hz), 6, 85-7,37 (m, 8H) , 6,24 (s, 1H) , 5,4 (S, 2H), 4,28 (d, 2H, J= 5,8 Hz), 3,68 (s, 3H), 2,35 (s, 3H) , 1,25 (s, 9H).

Etapa F: preparação de 1-(3-terc-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il) -3- (5-fluoro-2- (1- (2-hidroxietil) -líí-indazol-5-iloxi)fenil)metil)ureia 72: tratou-se uma solução de 2-(5-(2-((3-(3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)-ureido)-metil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-l-il)acetato de metilo (4,6 g, 7,87 mmole) em metanol (0,1 M, 80 mL) com boro-hidreto de sódio (893 mg, 23,6 mmole), em porções, à 85 temperatura ambiente. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 18 horas e o dissolvente evaporou-se in vacuo até se obter um resíduo amarelo escuro. 0 resíduo foi distribuído entre diclorometano e NH4C1 aquoso saturado. A camada orgânica foi filtrada através de papel 1PS, evaporou-se in vacuo e purificou-se com uma eluição de Biotage com iPrOH/DCM a 2-10 %. As fracções desejadas evaporaram-se in vacuo até se obter uma espuma branca, 2,97 g (68 % ). Detectou- -se por EM (APCI +) m/z 557 (M+l). RMN do (400 MHz, DMSO- •d6) δ 8 ,29 (s, 1H) , 7, 97 (s, 1H) , 7, 68 (d , 1H, J = 9,1 Hz) , 7,35 (s, 1H) , 6 , 85- 7,4 (m, 8H) , 6, 24 (s , 1H) , 4,87 (t, 1H, J = = 5, 4 Hz), 4,43 (t, 1H , J = 5 ,6 Hz ), 4, 28 (d, 1H, J= 5,9 Hz) , 3, 80 (q, 1H, J = 5, 5 Hz ) , 2, 35 (s , 3H), 1,25 (Sf 9H) e

Exemplo 4

Preparação de di-hidrogenofosfato de 2-(5-(2-((3-(3-tert-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)ureido)metil)-4-fluoro-fenoxi)-lH-indazol-l-il) etilo (74): processo 2

Um processo alternativo para a síntese do composto (72), de acordo com o processo 2, está ilustrado no esquema 2, etapas G a H.

Etapa G: Preparação de 2-(5-(2-((3-(3-terc-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il) ureido) metil) - 4-f luorofenoxi) -1H-indazol-l-il)etilo-fosfato de di-terc-butilo 80: tratou-se uma solução de 1-(3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)-3-((5-fluoro-2-(1-(2-hidroxietil)-lH-indazol-5-iloxi)-fenil)metil)ureia (1,5 g, 2,69 mmole) em DMF (0,2 M, 15 mL) com imidazol (183 mg, 2,69 mmole) e cloridrato de imidazol (423 mg, 4,04 mmole), à temperatura ambiente. Depois de se observar que a dissolução estava completa, adicionou-se di- 86 terc-butil-di-isopropilfosforamidite (1,28 mL, 4,04 iranole). Agitou-se continuamente, à temperatura ambiente, durante 18 horas. Adicionou-se, lentamente, peróxido de hidrogénio (aquoso a 50 %, 0,535 mL, 9,43 iranole) , à temperatura ambiente e continuou-se a agitação durante 1 hora. A reacção estava completa como detectado por CL e CCF. O resíduo foi distribuído entre diclorometano e Na2S203 aquoso saturado a 10 %. A fase aquosa foi extraída com AcOEt (2x). Lavaram-se os extractos orgânicos combinados com salmoura, filtraram-se através de papel 1PS, evaporaram-se in vacuo para se obter um óleo amarelo. O óleo foi purificado por meio de um tampão de gel de sílica eluindo-se com DCM, MeOH/DCM a 3-5 %. As fracções desejadas evaporaram-se in vacuo para se obter o produto desejado, sob a forma de uma espuma branca, 1,59 g (79 %). Detectou-se por EM (APCI +) m/z 749 (M+). RMN do (400 MHz, DMSO- d6) δ 8,29 (s, 1H) , 8,01 (s, 1H), 7,73 (d, 1H, J = 9,1 Hz) , 6,79-7,35 (m, 8H) , 6, 23 (s, 1H), 4,62 (t, 2H, J = 4,7 Hz), 4,26 (m, 4H) , 2,35 (s, 3H), 1,43, s, 9H), 1,25 (s, 18H). Etapa H: Preparação de di-hidrogenofosfato de 2- (5 - (2- ((3-(3-tert-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)ureido)metil)- 4- f luorofenoxi)-lfí-indazol-l-il) etilo 74: tratou-se uma solução de 2-(5-(2-((3-(3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol- 5- il)-ureido)-metil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-l-il) etil-fosfato de di-terc-butilo (3,66 g, 4.89 mmole) em EtOH (0,2 M, 24 mL) com HCl/iPrOH 5N (2,93 mL, 14,7 mmole), à temperatura ambiente. Continuou-se a agitação, à temperatura ambiente, durante a noite. O dissolvente evaporou-se in vacuo e o resíduo co-evaporou-se a partir de tolueno e éter (2x) . Recolheu-se a espuma bege em MeOH e verteu-se lentamente num copo contendo água. Recolheram-se os sólidos precipitados por filtração para se obter 2,83 g (91 %) do produto desejado. Detectou-se por EM (APCI +) m/z 87 637 (M+l) . RMN do (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,30 (s, 1H) 8,00 (s, 1H), 7,71 (d, 1H, J = 9 Hz), 6, 88-7,37 (m, 10H) 6, 24 (s, 1H), 4, 61 (largo, 1H) , 4,28 (d, 2H, J = 5,7 Hz) 4,19 (dd, 2H, J = 5 ,2Hz), 2 , 35 (s, 3H), 1,25 (s, 9H) .

Exemplo 5

CN HO^·1 5-Fluoro-2-(1-(2-hidroxietil)-lH-indazol-5-iloxi)benzo-nitrilo (78A) A uma solução de 2-(5-(2-ciano-4-fluorofenoxi)-1H-indazol-l-il) acetato de metilo 77 (preparada como no

Exemplo 3) (60,0 g, 184,4 mmole) em MeOH (370 mL) adicionou-se NaBH4 (24,42 g), em porções de 5 gramas, durante 90 minutos. A temperatura subiu de 25 °C para 44,7 °C, no final da adição de NaBH4. Concentrou-se a mistura em vácuo. Adicionou-se ao concentrado NH4C1 saturado (600 mL) e EtOAc (600 mL) e agitou-se a mistura vigorosamente durante 1 hora. Separaram-se as camadas e extraiu-se a camada aquosa com EtOAc (2 X 100 mL). Lavaram-se as camadas orgânicas combinadas com NH4C1 saturado (2 X 100 mL) , água (200 mL), salmoura (500 mL), secaram-se sobre MgS04, filtraram-se através de papel FV/F e concentrou-se para se obter um sólido cor-de-laranja brilhante. Dissolveu-se o 88 sólido impuro em CH2CI2 (1 L) e hexanos (2,25 L) com agitação. Formou-se um sólido castanho claro e, após agitação, durante 30 min, recolheu-se o sólido e secou-se em vácuo forte para produzir 45,5 g. O filtrado foi concentrado a pressão reduzida. Este material foi dissolvido novamente em CH2C12 (100 mL) e adicionaram-se hexanos (200 mL) . Recolheu-se o sólido resultante (6,2 g) através de filtração. As duas colheitas foram combinadas para originar 51,7 g (94,3 %) de 78A . RMN do (400 MHz CDCI3 ) δ 7,99 (s, 1H) , 7,49 (d, 1H), 7,39 - 7 ,36 (m, 2H) 7,21 - 7,16 (m, 2H) , 6, 90 (dd, 1H), 4,49 (t, 2H) , 4, 17 4,13 (m, 2H), 2,81 (t, 1H) .

Exemplo 6

F

2- (5- (2-Aminometil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-l-il)etanol (79A) (Processo A) A um agitador de Parr, de 250 mL, adicionou-se 5-fluoro-2-(1-(2-hidroxietil)-lH-indazol-5-iloxi)benzonitrilo 78A (preparado como no exemplo 5) (80,0 g, 269,1 mmole), Pd(OH)2 (32 g, carga de 40 %), EtOH (5 L) e HCl concentrado (224 mL, 2.691 mmole). Selou-se o recipiente, purgou-se com hidrogénio, ventilou-se a carregou-se com hidrogénio até 180 PSI. Baixou-se a temperatura interna para 18 °C e, após 89 agitação, durante 23 horas, verificou-se que a reacção estava completa por meio de CLAR. Retirou-se a mistura reaccional anterior e repetiu-se toda a sequência, duas vezes, com 80 g de material inicial e, em seguida, com 53,2 g do material inicial. As misturas reaccionais combinadas (4 reacções) foram filtradas através de FV/F e concentrou-se o filtrado a pressão reduzida. Dissolveu-se o residuo em HC1 IN (3,0 L) e lavou-se com EtOAc (3 x 2L). Adicionou-se à camada aquosa EtOAc (2 L) e agitaram-se vigorosamente as fases durante 10 minutos e depois eliminou-se a camada orgânica. Repetiu-se esta etapa mais 2 vezes e a camada aquosa foi transferida para um balão arrefecido (banho de gelo). Adicionou-se à mistura aquosa ácida péletes de NaOH (40 g x 11) de uma maneira tal que a temperatura não subiu acima de 35 °C. Quando o pH era de ~14, a mistura foi transferida para um funil de separação e extraida com CH2CI2 (4 X 1L) . Lavaram-se os extractos combinados com água (2 X 1 L) e salmoura (2 X 1 L) . Secou-se o extracto sobre MgS04 (~250 g) , filtrou-se através de filtros FV/F e concentrou-se a pressão reduzida. Dissolveu-se o concentrado em CH2C12 (3,5 L) e adicionaram-se hexanos (4 L) . Após se terem adicionado os primeiros 2 L de hexanos formou-se um sólido castanho. Após agitação, durante 1 hora, o sólido foi recolhido através de filtração e o bolo foi lavado com CH2Cl2/hexanos a 1:2 (500 mL) . Secou-se o bolo em vácuo para se obter 165,1 g (55,6 %) de 79A. RMN do (400 MHz, CDCI3) δ 7, 90 (s, 1H) , 7,42 (d, 1H), 7,17-7,12 (m, 3H) , 6,87 (td, 1H) , 6, 80 (dd, 1H) , 4,46 (t, 2H) , 4,12 (t, 2H) , 3, 86 s (2H) , 1,87 (s largo , 1H) •

Exemplo 7 90

HO---J 2-(5-(2-Aminometil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-l-il)etanol (79A) (Processo B) A uma solução de (5-fluoro-2-(1-(2-hidroxietil)-1H-indazol-5-iloxi) benzonitrilo (1,0 g, 3,36 mmole) e NiCl2'6H20 (148 mg, 0,336 mmole) em MeOH (30 mL) adicionou-se NaBH4 (636 mg, 16,8 mmole), em porções (2-3) e agitou-se a mistura reaccional durante 3 horas. Adicionou-se, lentamente, uma solução de Na2CC>3 saturado (15 mL) e agitou-se a mistura durante 75 minutos, tempo durante o qual se formou um sólido fino. Filtrou-se a mistura reaccional através de filtros FV/F e lavou-se o bolo com MeOH (20 mL) . Concentrou-se o filtrado até cerca de 15 mL, em vácuo, adicionou-se acetato de isopropilo (20 mL) e concentrou-se a mistura. Adicionou-se ao concentrado acetato de isopropilo (20 mL) e agitou-se a mistura durante 5 minutos. Separaram-se as fases e lavou-se a camada orgânica com salmoura a 10 % (20 mL) . Adicionou-se ácido cítrico (0,1 M, 20 mL) e as fases foram vigorosamente misturadas. Eliminou-se a camada orgânica e lavou-se a fase aquosa com acetato de isopropilo (20 mL) e EtOAc (20 mL) . Adicionou-se à camada aquosa acetato de isopropilo (20 mL) 91 e NaOH a 50 % (1 mL). Misturaram-se vigorosamente as fases e retirou-se a fase aquosa. Lavou-se a fase orgânica com salmoura a 10 % (20 mL) , secou-se sobre Na2S04 e concentrou-se até 850 mg (85 %).

Exemplo 8

3-Terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-ilcarbamato de fenilo A uma solução de 3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-amina (102,9 g, 448, 9 mmole) em EtOAc (1 L) a 10,9 °C adicionou-se uma solução de NaOH (2,5 M5 269 mL) e aqueceu-se a mistura reaccional bifásica para 15, 9 e, em seguida, estabilizou-se. Adicionou-se cloroformiato de fenilo (98,4 g, 156,5 mmole), numa porção e a temperatura subiu para 25,5 e, em seguida, estabilizou. Retirou-se o banho de gelo e a reacção foi monitorizada por CLAR. Passada 1 hora, adicionou-se mais 25 mL adicional de NaOH 2,5 M. Agitou-se a mistura reaccional, durante a noite e, em seguida, diluiu-se com EtOAc (200 mL). Lavou-se a camada orgânica com salmoura (1 L) , secou-se sobre Na2S04 (200 g) e concentrou-se até cerca de 400 a 500 mL de EtOAc. Aqueceu-se a solução concentrada para 60 °C. Depois de os sólidos se terem dissolvido, adicionou-se, lentamente, heptano (2 92 L), tempo durante o qual se formaram sólidos. Após agitação, durante 30 minutos, recolheu-se o sólido através de filtração e lavou-se o bolo com 400-500 mL de heptano. Secou-se o bolo num forno de vácuo, à temperatura ambiente, para se obter 156,9 g (95,0 %) do composto do titulo. RMN do NMR (400 MHz, CDC13) δ 7,39 - 7,31 (m, 6H) , 7,26- 7,225 (m, 2H), 7,13 (s largo, 2H), 6,96 (s largo, 1H), 6,47 (s largo, 1H), 2,42 (s, 3H), 1,34 (s, 9H).

Exemplo 9

HO 1-(3-rerc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-il)-3-(5-fluoro-2-(1-(2-hidroxietil)-lH-indazol-5-iloxi)benzil)ureia (72): A uma solução de 2-(5-(2-(aminometil)-4-fluorofenoxi) -lH-indazol-l-il)etanol (71,55 g, 237 mmole) em DMA (350 mL) , a 4,1 °C, adicionou-se uma solução, em DMA (350 mL), de 3-terc-butil-l-p-tolil-lH-pirazol-5-ilcarbamato de fenilo (80,5 g, 230 mmole). A temperatura subiu para 18,4 °C e estabilizou. Retirou-se o banho de gelo e a agitou-se a mistura reaccional durante 2 horas. Adicionou-se mais uma porção de 2-(5-(2-(aminometil)-4-fluorofenoxi)-lH-indazol-1-il)etanol e agitou-se a mistura reacional durante 2 horas. Repartiu-se a mistura reaccional entre acetato de 93 isopropilo (1,6 L) e água (2.4 L) . A camada aquosa foi removida e a camada orgânica foi lavada com NaOH 0,5 N (2 X 2,4 L) e depois foi saturada com salmoura (1 X 2,4 L) . Secou-se a camada orgânica sobre Na2S04 (300 g) e concentrou-se para se obter 110,8 g (86,6 %) . A descrição anterior é considerada como meramente ilustrativa dos princípios da presente invenção. Além disso, uma vez que numerosas modificações e alterações serão evidentes para os especialistas na matéria, não é desejável limitar a presente invenção à construção exacta e ao processo ilustrado como descrito antes.

As palavras "compreende", "compreendendo", "incluir" e "incluindo", quando usadas na presente memória descritiva e nas reivindicações que se seguem, destinam-se a especificar a presença das caracteristicas indicadas, números inteiros, componentes ou etapas, mas não excluem a presença ou a adição de uma ou mais caracteristicas, números inteiros, componentes, etapas ou grupos dos mesmos.

Lisboa, 2 de Abril de 2012. 94

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto caracterizado por ter a fórmula (I):

   I ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
2. 2. Processo para a preparação de um composto, tal como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender: (a) o acoplamento de um composto de fórmula II F

   1 II ou um seu sal, em que P1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo protector de hidroxilo, com um composto de fórmula III

   em que Z representa um grupo eliminável ou o isocianato correspondente; ou (b) a redução de um composto de fórmula IV

   Re 2 IV em que Re representa um átomo de hidrogénio ou um residuo de um álcool; seguido da eliminação de qualquer grupo de protecção e, se desejado, formando um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
3. 3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um composto de acordo com a reivindicação 1 e um veiculo ou um diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
4. 4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como um medicamento.
5. 5. Utilização de um composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento para o tratamento de um estado clinico mediado por cinase num mamífero.
6. 6. Utilização, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de o referido estado clinico mediado por cinase ser uma doença inflamatória, doença autoimune, doença óssea destrutiva, distúrbio proliferativo, doenças infecciosa, doenças virais ou doença neurodegenerativa.
7. 7. Composto de fórmula II 3

   II de P1 grupo ou um seu sal, caracterizada pelo facto representar um átomo de hidrogénio ou um protector de hidroxilo.
8. 8. Composto de fórmula IV

   Re

   4 IV caracterizado pelo facto de Re representar um átomo de hidrogénio ou um resíduo de um álcool.
9. 9. Utilização de um pró-fármaco de um composto de acordo com a reivindicação 1 no fabrico de um medicamento para o tratamento com um composto de acordo com a reivindicação 1 de um estado clínico mediado por uma cinase, num mamífero, caracterizada pelo facto de o pró-fármaco ser di-hidrogenofosfato de 2- (5- (2-((3-(3-tert-butil-l-p-tolil-líí-pirazol-5-il) ureido) -metil) -4-fluorofenoxi)-lH-indazol-l-il)etilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
10. 10. Utilização, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de o referido estado clínico mediado por cinase ser uma doença inflamatória, doença autoimune, doença óssea destrutiva, distúrbio proliferativo, doença infecciosa, doença virai ou doença neurodegenerativa.
11. 11. Di-hidrogenofosfato de 2-(5-(2-((3-(3-tert-butil-l-p-tolil-lfí-pirazol-5-il) ureido) metil) - 4-f luorofenoxi) -1H-indazol-l-il)etilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
12. 12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um composto de acordo com a reivindicação 11 e um veículo ou diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
13. 13. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de Z representar um grupo ariloxi eventualmente substituído com um ou mais grupos seleccionados entre F, Cl, Br e NO2. 5
14. 14. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido composto de fórmula (II) ter sido preparado pelo processo que compreende: (i) a redução de um composto de fórmula (V)

    em que P2 representa hidrogénio ou um grupo protector de hidroxilo, em condições de hidrogenação catalítica ou na presença de boreto de níquel. Lisboa, 2 de Abril de 2012. 6