PT1971680E

PT1971680E - Método para gerar células dendríticas utilizando temperatura diminuída

Info

Publication number: PT1971680E
Application number: PT06818153T
Authority: PT
Inventors: Alexei Kirkin; Karine Djandjougazian; Jesper Zeuthen
Original assignee: Dandrit Biotech As
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2012-05-23
Also published as: NO20083023L; IL191782A0; ATE545698T1; NZ569343A; IL191782A; EA015266B1; WO2007065439A1; CN101321861B; AU2006322451A1; US20090196856A1; ES2382565T3; CA2640836C; BRPI0619520A2; EP1971680A1; MY145814A; CN101321861A; CA2640836A1; DK1971680T3; CY1113016T1; EP1971680B1

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA GERAR CÉLULAS DENDRÍTICAS UTILIZANDO TEMPERATURA DIMINUÍDA"

CAMPO TÉCNICO A divulgação é destinada aos métodos e meios úteis para induzir respostas imunológicas contra doenças malignas e infeciosas. Mais particularmente, a invenção pertence aos métodos melhorados para geração de antigeno presentes em células.

TÉCNICA ANTERIOR

As terapias imunológicas baseadas em células dendriticas que exploram os mecanismos naturais de apresentação de antigenos representam o método não-tóxico mais promissor no tratamento do cancro. Esse pode ser utilizado como um tratamento único, ou como um auxiliar para outros tipos de terapias, tais como por exemplo, cirurgia, irradiação e quimioterapia. A estratégia é baseada na manipulação ex vivo e na reintrodução de produtos celulares para contornar competências imunológicas para o propósito de indução de respostas imunológicas especificas do tumor. Desse modo, o objetivo final dessas terapias imunológicas baseadas em células dendriticas é a indução de células efetoras especificas do tumor in vivo e os avanços recentes focaram-se nos linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTL) capazes de reconhecer e matar as células do tumor. Além disso, o tratamento de doenças infeciosas, como por exemplo, o VIH pode beneficiar de estratégias de vacinação baseadas em células dendriticas.

APRESENTAÇÃO DE ANTIGENOS 2 A indução de respostas imunológicas específicas do tumor requer a ligação de células com antígeno profissional (APC), expressando moléculas de Maior Complexo de Histocompatibilidade (MHC), bem como membrana delimitada e moléculas co-estimuladoras segregadas. Além disso, tal APC deve ser capaz de acionar, processar e apresentar antígenos em associação com as moléculas de MHC.

As células dendríticas (DC) são APC profissionais do sistema imunitário com a capacidade de ativar tanto as células sem memória como as células de memória T. As fases que conduzem à maturação das DC estão associadas com certas propriedades da célula. As DC imaturas são particularmente boas ao trocarem os antígenos extracelulares por fagocitoses ou pinocitoses e ao processarem os antígenos em peptídeos no compartimento endocítico tais como endossomas e fagosomas. Aqui os peptídeos são ligados a moléculas MHC de classe II. As DC imaturas também têm a capacidade única de carregarem os peptídeos das proteínas exógenas para o percurso de apresentação de MHC de classe I, um processo denominado apresentação cruzada. A capacidade de estimular eficazmente uma resposta imunológica através da ativação das células T auxiliares CD4+ do tipo 1 (células Thl) e as células T citotóxicas CD8+ (CTL) está crucialmente dependente das DC maturas. Apenas DC totalmente maturas equipadas com um painel de membrana delimitada de moléculas co-estimuladoras e acessórias, tais como por exemplo, CD40, CD80, CD83, CD86 e MHC classe II podem induzir efetivamente a proliferação e a diferenciação dos linfócitos T específicos de antígeno1. 3

Um papel significativo da atividade co-estimuladora das DC é conferido por citocinas segregadas em particular por IL-12p70. 0 seu papel na ativação das células T e a sua polarização para uma resposta do tipo Thl foi claramente demonstrado por Heufler e outros (1996)1. Além disso, foi relatado por Inoue e outros (2005) uma boa correlação entre a presença de DC maturas com IL-12 no tumor e a sobrevivência do paciente. As DC maturas para efeito de vacinação devem produzir quantidades limitadas da célula Thl inibidora da IL-10. CCR7 é o recetor para as quemoquinas CCL19 e CCL21 que são produzidas por células do estroma nos gânglios linfáticos. As DC que expressam níveis suficientes de CCR7 ativado migram para o gânglio linfático em resposta a CCL19 ou a CCL212. Aqui encontram linfócitos T e podem iniciar uma resposta imune.

PROTOCOLOS PARA GERAÇÃO DE DC MATURAS Têm sido descritos muitos protocolos para a geração de DC maturas. Os mais frequentes atualmente utilizaram protocolo "padrão" para a indução de DC utilizam uma mistura de maturação consistindo em IL-lbeta, IL-6, TNF-alfa e prostaglandina E2. Apesar da atividade migratória devida a CCR7 e à atividade imuno-estimuladora in vivo, as DC madurecidas por esta mistura geram DC com reduzida capacidade para produzir IL12p70 .

Um segundo grupo de protocolos de maturação de DC compreende poliinosínico: ácido policitidílico, poli-(I:C). Esse é geralmente utilizado em combinação com citocinas tais como a TNF alfa, a IL-lbeta, a IFN-gama e a IFN-alfa. As DC geradas por este método produzem IL-12p70, mas essas 4 geralmente expressam baixos níveis de CCR7. Baixos níveis de expressão de CCR7 caracterizados pelas DC obtidas na presença de poli-(I:C) restringem a sua migração in vivo para os gânglios linfáticos.

Recentemente, um pedido de patente publicado US2005/0003533A1 divulgou um método para a maturação de células dendríticas expressando CCR7 que posteriormente com a estimulação de CD40L poderiam ser induzidas a produzir IL-12p7 0. Há ainda, por isso, um requisito que não foi satisfeito para o desenvolvimento de métodos padronizados para geração de células dendríticas maturas expressando elevados níveis de CCR7 ativado e que também produzem quantidade suficiente de IL-12p70.

Além disso, apesar dos esforços de muitos investigadores, as vacinas baseadas em célula dendríticas para utilização na terapia do cancro conferem em geral respostas imunológicas com modesta eficácia clínica. Estas vacinas têm, principalmente, sido produzidas por manipulação ex vivo e carregamento de antígeno das DC autólogas. 0 aumento da procura em relação à segurança dos doentes exige elevado nível de reprodutibilidade e conformidade com questões regulamentares. Desse modo, existe uma forte necessidade para métodos que gerem DC adequadamente equipadas que induzam eficientemente respostas imunológicas e que forneçam, em especial, melhores respostas clínicas.

Além disso, DC geradas em ex vivo também poderiam ser implementadas como vacina terapêutica no tratamento de algumas doenças infeciosas crónicas tais como o VIH e a 5 hepatite B e C, onde a abordagem da vacina tradicional não é formulada com eficiência. Os resultados dos estudos pré-clínicos e os primeiros estudos clínicos4-5 indicam que a imunoterapia com base em DC poderia ser uma estratégia promissora para o tratamento de pacientes com infeções crónicas por VIH-1 e hepatite B e C. Quanto à imunoterapia do cancro, a resposta clínica eficaz contra estes agentes infeciosos intracelulares é associada com a indução da resposta de Thl auxiliar necessária para o desenvolvimento das células efetoras CD8+5. Desse modo, pode-se esperar que as células dendríticas geradas ex vivo devam ter as mesmas características tanto para o tratamento do cancro como das doenças infeciosas crónicas.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspeto a presente invenção é destinada a um método para gerar células dendríticas através da utilização de temperaturas abaixo de 37 °C durante o desenvolvimento de células progenitoras e de células dendríticas imaturas.

Num segundo aspeto a divulgação é destinada a uma população de células dendríticas, em que as referidas células são geradas através do método para geração de células dendríticas através da utilização de temperaturas abaixo de 37 °C durante o desenvolvimento de células progenitoras e de células dendríticas imaturas.

Num terceiro aspeto a divulgação é destinada a uma composição farmacêutica compreendendo uma população de células dendríticas em que as referidas células são geradas pelo método de geração de células dendríticas através da utilização de temperaturas abaixo de 37 °C durante o 6 desenvolvimento de células progenitoras e de células dendríticas imaturas.

Num quarto aspeto a divulgação é destinada à utilização da população de células, em que as referidas células são geradas pelo método de geração de células dendriticas,

através da utilização de temperaturas abaixo de 37 °C durante o desenvolvimento de células progenitoras e de células dendriticas imaturas, para a estimulação e/ou expansão das células T.

Num quinto aspeto a divulgação é destinada à utilização da população de células, em que as referidas células são geradas pelo método de geração de células dendriticas,

através da utilização de temperaturas abaixo de 37 °C durante o desenvolvimento de células progenitoras e de células dendriticas imaturas, para a indução de uma resposta imunológica num indivíduo.

Num sexto aspeto a divulgação é destinada à utilização da população de células, em que as referidas células são geradas pelo método de geração de células dendriticas, através da utilização de temperaturas abaixo de 37 °C durante o desenvolvimento de células progenitoras e de células dendriticas imaturas, para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou para a prevenção do cancro ou de doenças infeciosas. BREVE DESCRIÇÃO DO(S) DESENHO(S) A invenção é explicada abaixo detalhadamente com referência aos desenhos, nos quais 7 A Figura 1 ilustra o efeito da temperatura sobre importantes moléculas de superfície co-estimuladoras e acessórias das DC. A Figura 2 ilustra o efeito da temperatura na quantidade de IL-10 produzida pelas DC durante os dias iniciais da cultura (A) e produzida por DC imaturas (B) e DC maturas (C) . A Figura 3 ilustra o efeito das temperaturas 31 °C, 34 °C e 37 °C na produção de IL-12p70 através de células dendríticas imaturas (A) e maturas (B, C) geradas pelo novo método e por um método padrão. A Figura 4 ilustra o efeito da temperatura baixa na expressão de CCR7. A Figura 5 ilustra o fenótipo de DC imaturas e maturas geradas pelo método de acordo com a invenção (A) e em comparação com um método "padrão" (B). A Figura 6 ilustra a estabilidade fenotípica das DC maturas ao longo do tempo. A Figura 7 ilustra o fenótipo e a atividade alo-estimuladora (MLR) das DC no dia 7 e no dia 10.

A Figura 8 ilustra a atividade alo-estimuladora das DC geradas com o método de acordo com a invenção e com um método "padrão". A Figura 9 ilustra a apresentação funcional do antígeno CMV medido pela indução de IFN-γ (ensaio ELISPOT).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é descrita em detalhe abaixo. Para propósitos de interpretação aplicam-se as seguintes definições e sempre que apropriado, os termos utilizados no singular também incluirão o plural e vice-versa.

DEFINIÇÕES utilizado conforme neste "Etapa de diferenciação" documento, significa a etapa em que se permite que as células se diferenciem em resposta a fatores de diferenciação definidos. "Etapa de maturação" conforme utilizado neste documento, significa a etapa em que se permite que as células maturem em resposta à presença de fatores de maturação. "Temperatura diminuída" ou "temperatura baixada" conforme utilizado neste documento, significa que a temperatura é inferior a 37 °C.

Um método para geração de células dendríticas é o método bem conhecido de J. H. Peters, que foi o primeiro a descrever a capacidade dos monócitos de se transformarem em células do tipo DC in vitro, primeiro espontaneamente e depois na presença de GM-CSF e IL-46. Depois de publicações de Romani e outros, (1994)7 e Sallusto e Lanzavecchia (1994) 8 os monócitos cultivados na presença destas duas citocinas passaram a ser amplamente utilizadas para a preparação das DC. 0 procedimento começa com isolamento dos monócitos do sangue periférico e da sua cultura na presença de GM-CSF e IL-4, durante 5-7 dias. As células obtidas têm propriedades das DC imaturas caracterizadas por baixos níveis de moléculas co-estimuladoras e elevada atividade endocítica, durante a maturação induzida por LPS, o TNF-alfa ou outros agentes de maturação das células sobre-regulam de forma significa as moléculas co-estimuladoras e acessórias, tais como por exemplo, CD40, CD80, CD83 e CD86 e sub-regulam a atividade endocítica. 9 A cultura de tecidos in vitro é geralmente realizada a 37 °C. É sabido que as células de Langerhans são funcionalmente ativas à temperatura ambiente da pele de 29 31 °C, e alguns estudos têm documentado o efeito biológico in vitro das temperaturas de cultura diminuídas em sistemas de célula, como, por exemplo, nas células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) e em macrófagos alveolares de suinos.

Em contraste com o trabalho de Basu e outros (2003) Int. Immunol. 15(9): 1053-61 ao investigar o efeito das temperaturas do tipo febril na ativação e maturação das DC, as temperaturas diminuídas foram apenas testadas em poucos casos pelos seus efeitos no crescimento de células de mamíferos. Dexter e outros (1977) sugeriram a utilização de 33 °C para a cultura de células estaminais hematopoéticas9. Athanasas-Platsls e outros (1995) descobriram que a expressão do marcador de células de Langerhans, CDla em monócitos foi sobre-regulada durante uma cultura de 24 horas a 34 °C, em comparação com 37 °C10.

Que tenhamos conhecimento ninguém divulgou como gerar células dendriticas maturas ou imaturas, através da utilização de temperaturas diminuídas.

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método para geração de células dendriticas, através da utilização de temperaturas abaixo de 37 °C durante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendriticas imaturas. O IL-10 é um regulador negativo do desenvolvimento das DC e é produzido durante a ativação de uma linha celular monócita na presença de GM-CSF11. Kirkley e outros (2003) 10 relataram que a produção de IL-10 através de uma linha de células macrófagas estimuladas com LPS foi significativamente reduzida em resposta a uma diminuição na temperatura de incubação de 37 °C para 31 °C12. A temperatura reduzida compreendida no método da presente invenção pode desse modo fornecer condições melhoradas para a geração de DC por meio de, por exemplo, baixa concentração de IL-10. O efeito da cultura de monócitos na presença de GM-CSF e de IL-4 em diferentes temperaturas (31 °C, 34 °C e 37 °C) foi testado no nivel de expressão de CDla de DC imaturas, uma molécula extremamente sensivel ao efeito inibitório de IL-10. Descobrimos que DC geradas a temperaturas mais baixas tinham niveis mais elevados da sua expressão. Todas as restantes experiências foram realizadas a 34 °C. A próxima observação principal foi que niveis de IL-10 detetados nos sobrenadantes das culturas foram, de facto, significativamente menores depois da cultura a temperatura mais baixa.

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método, em que as células dendriticas geradas são as células dendriticas maturas.

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método, em que o desenvolvimento de células progenitoras e de células dendriticas imaturas compreende a diferenciação das células referidas.

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método, em que a temperatura é inferior a 37 °C durante a diferenciação. 11

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método, em que a temperatura é de 31 °C a 37 °C. A temperatura pode ser qualquer uma das temperaturas 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C ou 36 °C.

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método, em que a temperatura é de 34 °C.

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método, em que as células progenitoras são células autólogas progenitoras.

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método, em que as células progenitoras são selecionadas a partir de células progenitoras mielóides ou células estaminais.

Numa forma de realização a invenção é destinada a um método, em que as células progenitoras mielóides são monócitos.

Numa outra forma de realização a invenção é destinada a uma população de células dendriticas que são geradas pelo método de acordo com a invenção.

Numa forma de realização a divulgação é destinada a uma população de células dendriticas, em que as células referidas expressam CCR7 e/ou IL-12p70. , CD83, CD86 e IL-10 é destinada a uma células referidas baixo

Numa forma de realização a divulgação população de dendriticas, em que as expressam CDla, CD14baix0 12

Numa forma de realização a divulgação é destinada a uma população de células dendriticas, compreendendo também pelo menos um antigeno apresentado em associação com uma molécula de MHC na superfície da célula.

Numa forma de realização a divulgação é destinada a uma população de células dendriticas, em que o referido pelo menos um antigeno é um antigeno do tumor.

Numa forma de realização a divulgação é destinada a uma população de células dendriticas, em que o referido antigeno do tumor é selecionado de um grupo que inclui; Antigeno de cancro da próstata, antigeno de diferenciação especifica de linhagem, antigeno de tumor sobre-expressado, antigeno expressado mutado ou aberrante e antigeno virai.

Numa outra forma de realização a divulgação é destinada à utilização da população de células dendriticas conforme acima definido, para a estimulação e/ou expansão das células T.

Numa forma de realização a divulgação é destinada à utilização da população de células dendriticas para a estimulação ou expansão das células T, em que as referidas células T são células T autólogas.

Numa forma de realização a divulgação é destinada à utilização da população de células dendriticas para a estimulação ou para a expansão de células T, em que a referida utilização é uma utilização in vitro. 13

Ainda numa outra forma de realização a divulgação é destinada à utilização da população de células dendriticas para indução de uma resposta imunológica num indivíduo.

Ainda numa outra forma de realização a divulgação é destinada a uma composição farmacêutica que compreende uma população de células dendriticas em que a referida população é conforme definido acima.

Numa forma de realização a divulgação é destinada à utilização da composição farmacêutica como um medicamento.

Numa forma de realização a divulgação é destinada a uma composição farmacêutica compreendendo uma população de células dendriticas que também inclui adjuvantes e excipientes convencionais.

Numa forma de realização alternativa a divulgação é destinada à utilização de células dendriticas para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção do cancro ou de doenças infeciosas.

Numa forma de realização a divulgação é destinada à utilização da população de células dendriticas para o fabrico de medicamentos para o tratamento ou prevenção do cancro ou de doenças infeciosas, em que o referido cancro é selecionado a partir do grupo constituído por: melanoma, cancro da mama, cancro do cólon e cancro do pulmão, ou pode ser qualquer tipo de cancro.

Numa forma de realização a divulgação é destinada à utilização da população de células dendriticas para o fabrico de medicamento para o tratamento ou prevenção de 14 cancro ou doenças infeciosas, em que as doenças infeciosas são selecionadas a partir do grupo constituido por: VIH e hepatite ou outras doenças de infeções crónicas.

EXEMPLOS

Esta invenção é agora ilustrada através dos seguintes exemplos que não se pretende que sejam limitativos de alguma forma.

Exemplo 1: Geração de células dendriticas através da utilização de temperatura diminuída

As células dendriticas tipicamente foram geradas a partir da camada leucocitária, obtida a partir do banco de sangue. 60 mL de camada leucocitária foram diluídos com 60 mL de Ca livre e Mg livre da Dulbecco's Phospate Buffered Saline(DPBS, produto N° . BE17-512F, Cambrex, Bélgica) e aplicado a quatro tubos de 50 mL contendo cada 15 mL de

Lymphoprep (produto N° 1053980, AXIS-SHIELD PoC AS, Noruega) . Depois da centrifugação (460 g, 30 min, 20 °C) , 10-20 mL da camada superior do plasma foram transferidas para tubos separados. Foi estimado que isto é

aproximadamente 40% de plasma (plasma diluído). A preparação final do plasma inclui a adição de heparina (25 IU/mL) e centrifugação (1.500 g, 15 min, 4 °C) . Foram colhidas células mononucleares na interface, diluídas duas vezes com DPBS que contém EDTA e lavadas por 4-5 centrifugações, a primeira a 250 g, a segundo a 200 g e a seguinte a 150 g, todas as centrifugações a 4 °C, 12 min. Antes das últimas células de centrifugação terem sido contadas utilizando um Contador de Coulter (Beckman Coulter, modelo Z2), e a quantidade de monócitos foi estimada como o número de células com um tamanho médio de cerca de 9 ym) . As células podem ser armazenadas a -80 °C 15 (no plasma diluído com 10% DMSO, 107 monócitos por frasco), ou imediatamente utilizadas em experiências.

As células foram resuspensas no meio de adsorção (RPMI 1640 (Cambrex) suplementado com 2 mM de L-glutamina e 2% de plasma) a uma concentração de 2 x 106 monócitos/mL. Foram colocados 5 mL da suspensão de célula em frascos de Falcon T25 não tratados com TC. Depois de 1 hora de adsorção a 37 °C, foram removidas células não-aderentes, células aderentes foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 morno e foram adicionados, a cada balão, meios de cultivo de 7 mL (RPMI 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina e 1% de plasma).

Os balões foram colocados a diferentes temperaturas: 31 °C, 34 °C e 37 °C em incubadoras de CO2 separadas. Foram adicionados fatores de diferenciação GM-CSF e IL-4 em concentrações finais de 100 ng/mL e 50 ng/mL, respetivamente, no dia 1, 3 e 5.

Foi adicionado TNF-alfa a uma concentração final de 10 ng/mL no dia 6 de forma a induzir a maturação, e a temperatura foi aumentada para 37 °C durante as últimas 24 hrs de incubação.

No dia 7, as células foram recolhidas e o seu fenótipo foi determinado pela análise de FACS. As células foram coradas utilizando os anticorpos conjugados diretos CDla-ficoeritrina (PE), isotiocianato de fluoresceína CD14 (FITC), CD83-PE, CD86-PE, HLA-DR, - P, -Q -FITC (todos da Pharmingen, Beckton Dickinson, Brçndby, Dinamarca) e CCR7-FITC (R&D Systems Europe, Abington, Reino Unido). Foram utilizados isótopos de controlo apropriados. Foram 16 analisadas amostras utilizando o Citómetro de Fluxo FACSCalibur (Beckton Dickinson) e o software CELLQuest (Beckton Dickinson). 0 resultado das experiências representativas é mostrado na Figura 1. Mais células cultivadas a temperaturas reduzidas expressam CDla, quando comparadas com células cultivadas a 37 °C, enquanto foram observadas menos células positivas CD83 e CD86 para populações de células cultivadas a temperaturas inferiores. 0 indice médio de fluorescência (IFM) para CDla foi duas vezes mais elevado nas culturas a 31 °C e 34 °C, em comparação com as de 37 °C. 0 grau de maturação conforme refletido pela percentagem de CD83 e CD86 expressando DC foi menor a 31 - 34 °C. Isto reflete tanto uma inferior sensibilidade a fatores de maturação das células cultivadas a temperatura reduzida, ou que o próprio processo de maturação requer uma temperatura de 37 °C.

Exemplo 2: O efeito da temperatura diminuída na produção de IL-10 A produção de IL-10, que é um regulador negativo das DC, foi investigada durante a diferenciação dos monócitos em células dendríticas. Foi medida a sua concentração na cultura sobrenadante recolhida nos dias 1, 3 e 5. A produção de IL-10 foi medida pela prova ELISA que incluia a recolha do anticorpo (Ab), padrão ou amostra, deteção biotinilada de Ab, e estreptavidina de HRP utilizando o kit "Ready-Set-Go" da eBioscience essencialmente de acordo com as recomendações dos fabricantes com algumas modificações. Depois da ligação de captura de Ab durante a noite para as placas de 96 poços Nunc maxisorp e da lavagem, a etapa de bloqueio foi prolongada até pelo menos 3 hrs à Temperatura Ambiente. Foi gerada uma curva padrão por sete diluições 17 padrão em série, começando com 200 pg/mL de IL-10. Os padrões e as amostras foram incubados à Temperatura Ambiente durante 2 hrs seguidas pela incubação a 4 °C durante a noite. As etapas seguintes foram executadas de acordo com o protocolo dos fabricantes. Na reação enzimática do conjugado HRP, foi utilizada solução de substrato de tetrametilbenzidina do mesmo kit, e depois de terminar a reação, a densidade ótica foi medida com correção do comprimento de onda como diferença entre leituras a 4 90 e 620 nm. Os resultados de uma dessas experiências são apresentados na Figura 2A. A produção espontânea de IL-10 pelos monócitos foi baixa durante o primeiro dia, e foi significativamente sobre-regulada depois da adição de GM-CSF e IL-4 no dia 1. As células cultivadas a 34 °C até ao dia 5 produzem em geral quantidades significativamente mais baixas de IL-10 em comparação com as células cultivadas a 37 °C. O teste de várias culturas de DC no dia 5 mostrou um padrão semelhante (Figura 2B) . A reduzida produção de IL-10 a 34 °C, em comparação com 37 °C continuou mesmo depois de lavar as células no dia 5, colocando-as a 37 °C, adicionando agente de maturação no dia 6 e recolhendo sobrenadantes no dia 8 (Figura 2c). Estes resultados indicam que células cultivadas a temperaturas abaixo de 37 °C adquiriram um fenótipo estável de IL-10 de baixa produção.

Exemplo 3: O efeito da temperatura diminuída sobre a produção de IL-12p70.

Nós também investigámos o efeito da temperatura na produção de IL-12p70. A produção de IL-12p70 foi medida pela prova ELISA que inclui a recolha de Ab, padrão ou amostra, deteção biotinilada de Ab, e estreptavidina de HRP. Os kits "DuoSet ELISA development System" para IL-12p70 (R&D 18

Systems) foram essencialmente utilizados de acordo com as recomendações dos fabricantes com algumas modificações. Depois da ligação de captura de Ab durante a noite para as placas de 96 poços Nunc maxisorp e da lavagem, a etapa de bloqueio foi prolongada até pelo menos 3 hrs à Temperatura Ambiente. Uma curva padrão foi gerada por sete diluições padrão em série, começando com 500 pg/mL de IL-12p70. Os padrões e as amostras foram incubados à Temperatura Ambiente durante 2 hrs seguidas pela incubação a 4 °C durante a noite. As etapas seguintes foram executadas de acordo com o protocolo dos fabricantes. Foi utilizada mistura de peróxido de hidrogénio-tetrametilbenzidina como uma solução de substrato de HRP, e depois de terminar a reação enzimática foi medida a densidade ótica com correção do comprimento de onda como diferença entre as leituras a 490 e 620 nm. TABELA 1. Efeito da temperatura durante os primeiros 5 dias de cultura na produção de IL-12p70 durante a maturação induzida por MCM mimico.

Cultura de Temperatura Produção de IL- DC de incubação 12p70 durante a até ao dia 5 maturação, pg/mL 36/04-3-3 34 °C 35, 1 36/04-3-4 37 °C 14,1 17/05-2-1 34 °C 55,2 17/05-2-3 37 °C 35,7 18/05-2-1 34 °C 19, 0 18/05-2-3 37 °C 3,7

Conforme pode ser visto (tabela 1), as células geradas a 34 °C, produziram niveis significativamente mais elevados de IL-12p70 . 19

Exemplo 4: Seleção de plástico de cultura de tecidos Nós comparámos dois tipos de plásticos de cultura de tecidos: poliestireno de cultura de não tecidos (PS) (Produto n° 353813, T25 BD-Bioscience, EUA) e plástico Primaria™ (Produto n ° 353813, T25 BD-Bioscience, EUA). As experiencias foram preparadas da mesma forma que o procedimento descrito no exemplo 1, utilizando superfícies de plástico pré-tratadas durante 15-45 min com 2% de plasma autólogo como uma fonte de componentes, tais como por exemplo componentes extracelulares tais como o fibrinogénio e a fibronectina, no meio AIM-V sem soro a 34 °C, até ao dia 5, depois do qual as culturas foram colocadas a 37 °C. Os agentes de maturação; TNF alfa, IL-1 beta, IL-6 e prostaglandina E2 foram adicionados no dia 6, e as culturas foram colhidas no dia 8.

As células progenitoras têm, dependendo da condição de crescimento, a opção para se transformarem em macrófagos ou DC. Depois de alguns dias em cultura, as células destinadas a se transformarem em macrófagos irão formar culturas de células aderentes onde as células destinadas a se transformarem em DC irão formar culturas celulares ligadas de forma mais liberta. Inicialmente foi semeado um número igual de células e aderiu ao diferente plástico de cultura de tecidos. A inspeção das culturas das DC desde o dia 6 através de microscopia de luz revelou um número significativamente menor de células aderentes em plástico Primaria™ em comparação com as células cultivadas noutro tipo de plástico. Em geral, as culturas cultivadas em plástico Primaria™ também apareceram mais "limpas" ou seja, com menos detritos, refletindo menor extensão de morte celular durante a maturação. 20

Testámos a utilização de diferente concentração de plasma para pré-tratamento de plástico. Não foram observadas diferenças significativas nas propriedades das DC depois do tratamento do plástico Primaria™ com 2%, 10%, 20% ou 40% de plasma (dados não mostrados). No entanto, verificámos que a quantidade de linfócitos contaminantes diminuiu com o aumento da concentração de plasma acima de 10%. Dessa forma, incluimos a etapa de tratamento do plástico Primaria™ com 10% de plasma no método descrito na experiência 1 nas experiências seguintes.

Nas experiências seguintes comparámos o método da invenção de um "método padrão" que é executado conforme descrito abaixo, salvo indicação em contrário.

As células dendriticas foram tipicamente geradas a partir de uma camada leucocitária obtida a partir do banco de sangue. 60 mL da camada leucocitária foram diluídos com 60 mL de Ca livre e de Mg livre de Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS, produto N°. BE17-512F, Cambrex, Bélgica) e aplicados a quatro tubos de 50 mL, cada um contendo 15 mL de Lymphoprep (produto N° 1053980, AXISSHIELD PoC AS, Noruega). Depois da centrifugação (460g, 30 min, 20 °C) , 10-20 mL da camada superior do plasma foram transferidos para tubos separados. Células mononucleares foram colhidas a partir da interface, diluídas duas vezes com PBS EDTA sem cálcio e sem magnésio e lavadas em 3 centrifugações, a primeira a 250 g, a segunda a 175 g e a última a 110 g, todas as centrifugações a 4 °C, 12 min. Antes da última centrifugação as células foram contadas utilizando um contador Coulter (Beckman Coulter, modelo Z2), e a quantidade de monócitos foi 21 estimada como o número de células com um tamanho médio de cerca de 9 ym).

As células foram ressuspensas no meio de adsorção (RPMI 1640 (Cambrex) suplementado com 2 mM de L-glutamina e 1% de plasma autólogo inativado pelo calor) a uma concentração de 2 x 106 monócitos/mL. Foram colocados 5 mL da suspensão da célula em frascos de Primaria™ T25 não tratados. Depois de 1 hora de adsorção a 37 °C, foram removidas células não- aderentes e a cada balão foram adicionados 5 mL de meio de cultura (RPMI 1640 complementado com 2 mM de L-glutamina e 1% de plasma).

No dia 1 o meio foi trocado por meio fresco. No dia 3 foram adicionados 2 mL de meio. No dia 5 todas as células não-aderentes foram colhidas e colocadas em frascos Primaria™ T25 com meio fresco.

Os balões foram colocados a 37 °C, na Incubadora de C02.

Nos dias 1, 3 e 5 foram adicionados, os fatores de diferenciação GM-CSF e IL-4 em concentrações finais de 100 ng/mL e 50 ng/mL, respetivamente.

Uma mistura de TNF-α ou Citocina (IL-1, IL-6, TNF-α e PGE- 2) foi adicionada no dia 6 de forma a induzir a maturação.

No dia 7, as células foram colhidas e o seu fenótipo foi determinado pela análise FACS.

Exemplo 5: Produção de IL-12p70. A Figura 3 ilustra a medição da produção de IL-12p70 durante dois dias (dias 7 e 8), fomos também capazes de mostrar que as células dendríticas geradas pelo novo método 22 produziram quantidades significativamente mais elevadas de IL-12p70 do que as células dendriticas geradas por um método padrão.

Exemplo 6: Expressão de CCR7.

De modo a investigar o efeito da baixa temperatura na expressão de CCR7, utilizámos uma mistura de maturação consistindo em IL-lbeta, IL-6, TNF-alfa e prostaglandina E2 em vez de utilizarmos apenas TNF-alfa. 0 resultado das experiências apresentado na Figura 4 compara três temperaturas diferentes com o novo método e um método padrão. Poder-se-á verificar que a expressão de CCR7 é mais elevada com o método novo, em comparação com o método padrão.

Também testámos a funcionalidade da expressão de recetor de CCR7 pela célula dendritica gerada pelo método novo num ensaio de migração padrão (Chemotx Disposable Chemotaxis System (Modelo 116-5) da Neuro RProbe, Gaithersburg, MD, EUA) . Aqui vimos a migração de células dendriticas no sentido das quimiocinas CCL19 com DC geradas pelo novo método (dados não mostrados) verificando a expressão de um recetor de CCR7 funcional.

Exemplo 7: Rendimento celular. 0 novo método descrito neste documento também mostrou melhorado rendimento celular em comparação com o método padrão. Em três ciclos diferentes encontrámos um maior rendimento celular para todas as temperaturas testadas (31 °C, 34 °C e 37 °C) com o novo método em comparação com o método padrão Ver Tabela 2. 23 TABELA 2

Temperatura/Método 31 °C 34 °C 37 eC Método Novo 1) 2,2 x 10b 12,0 x 106 2, 6 x 10b 2) 2,6 x 106 1,8 x 106 1,3 x 106 3) UD O \—1 X r- \—1 2, 0 x 106 31,6 x 106 Método Padrão D 1,7 x 106 1,1 x 106 0,9 x 106 2) 1,3 x 106 1,6 x 106 0,6 x 106 3) 0,8 x 106 1,0 x 106 0,6 x 106

Exemplo 8: Variações de marcador entre lotes de DC geradas pelo método novo.

Em conformidade com os requisitos de GMP para a produção de células dendriticas para fins médicos, deverão existir, entre lotes, baixas variações nas propriedades das células dendriticas. Para esse propósito realizámos a preparação de células dendriticas originadas do sangue de 8 doadores diferentes durante o periodo de três semanas, utilizando os mesmos lotes de todos os reagentes utilizados e 0,5% de plasma autólogo como adição ao meio AIM-V. Para a comparação, foi efetuada a produção das DC utilizando o método "padrão" (37 °C) . As experiências foram realizadas em PBMC descongelada. A Tabela 3 resume as propriedades das DC geradas nestas experiências. Em contraste com a elevada variabilidade nas propriedades das DC geradas pelo método "padrão", foi observado um muito baixo grau de variabilidade nas propriedades das DC obtidas pelo método novo. 24 TABELA 3. Diferentes marcadores expressos em percentagem de células dendriticas geradas tanto por um método padrão como pelo novo método. CDla CD14 CD 8 6elevado HLA—D CD83 CCR7 Doador S N S N s N S N S N S N 23/05 56 44 73 18 28 70 98 100 28 70 ND ND 24/05 41 85 2 1 49 99 99 100 75 99 ND ND 25/05 10 0 17 1 80 99 99 100 83 99 63 98 26/05 50 69 9 1 90 99 100 100 91 99 85 98 27/05 53 86 9 1 93 100 100 100 93 100 90 99 28/05 69 73 37 12 25 86 97 100 41 86 18 81 29/05 66 84 60 2 43 96 98 100 43 99 17 95 30/05 86 89 25 1 63 99 100 100 63 99 56 98 X: 53 68 29 5 59 94 99 100 65 94 55 95 S: Método Padrão, N: método de acordo com a invenção, ND: Não determinado, X: Valor médio.

Finalmente, a figura 5A representa fenótipos de células dendriticas imaturas (dia 5) e maturas (dia 8) geradas pelo método novo. Aqui também medimos a expressão de CD80, o recetor de manose (MR) e os dois marcadores de células Langerhans - CD207 (langerina) e E-caderina. Conforme pode ser visto, as células geradas pelo método de acordo com a invenção não são células Langerhans. A Figura 5B representa o fenótipo de células dendriticas imaturas (dia 5) e maturas (dia 8) geradas pelo método novo e por um método padrão. Aqui marcámos as células para a expressão de marcadores DC padrão. As células imaturas (dia 5) mostram uma população CDla mais limpa. A população matura (dia 8) mostra uma expressão HLA D, CD83 e CD86 mais elevada e uniforme nas células geradas pelo novo método, quando comparado com o método padrão. Também a expressão CCR7 é mais uniformemente expressa com o novo método. 25

Exemplo 9. Estabilidade das células dendriticas geradas pelo novo método.

Depois da injeção no organismo, as células dendriticas devem migrar e chegar ao gânglio linfático de modo a estimularem as células T. É, por isso, muito importante que as DC mantenham o seu fenótipo durante vários dias. Uma forma comum de realização do teste de estabilidade é colher as células no dia 8, remover por lavagem as citocinas e continuar a cultura das células na ausência de citocinas estimuladoras. Efetuámos este tipo de experiências através da cultura de células sem citocinas durante dois dias. A Figura 6 representa os resultados da análise FACS das DC colhidas no dia 8 e depois de dois dias adicionais da cultura. Parece evidente que a expressão dos parâmetros medidos: CDla, CD14, CD83, HLA-D e CCR7 permanece praticamente inalterada e, desse modo, o fenótipo permanece estável.

Numa experiência semelhante, sem remover por lavagem as citocinas no dia 8, testámos tanto o fenótipo como a atividade alo-estimuladora das células dendriticas no dia 7 ou no dia 10. As Figuras 7A e 7B mostram, respectivamente, o fenótipo e a atividade alo-estimuladora. Os resultados mostram que o efeito alo-estimulador ainda é elevado depois de 10 dias de cultura e o perfil fenotípico no dia 10 é idêntico ao perfil medido no dia 7 verificando a elevada estabilidade das células dendriticas geradas.

Exemplo 10. Alo-estimulação por células dendriticas geradas pelo método novo.

Comparámos as capacidades alo-estimuladoras das DC obtidas pelo método "padrão" e pelo método de acordo com a invenção. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 26 5% de soro humano AB. As células resposta foram células mononucleares obtidas a partir de doadores saudáveis através da separação de densidade da camada leucocitária do sangue periférico. As células estimuladoras foram irradiadas células dendriticas maturas obtidas depois de uma exposição de 2 dias para a maturação da mistura de citocina conforme descrito no exemplo 4. As células estimuladoras, 0,1 x 106 células em ΙΟΟμΙ, foram misturadas com números de células estimuladas tituladas (em ΙΟΟμΙ) conforme mostrado na Figura 8 e cultivadas durante 5 dias em placas de microtitulação de fundo em U de 96 poços. Foi adicionada 3H-timidina (0,1 pCurie/mL) durante as últimas 18 h. Posteriormente, as células foram colhidas para a contagem da cintilação. Os dados são apresentados como os valores de cpm médio de quatro culturas replicadas. O teste Wilcoxon foi utilizado de modo a estimar as diferenças entre os dois métodos utilizados para a geração das DC. Conforme pode ser visto, as células dendriticas obtidas pelo método de acordo com a invenção têm atividade alo-estimuladora 3-10 vezes superiores.

Exemplo 11. Apresentação de antigenos pelas células dendriticas geradas pelo método novo.

Para elucidar o potencial das DC para apresentar os antigenos às células T, foi efetuado um ensaio INFy ELISPOT com as células T estimuladas por DC não carregadas ou pulsadas com um peptideo de CMV. O ensaio INFy ELISPOT foi escolhido uma vez que o ensaio confere um resultado claro num nivel de célula única e que as células T depois de encontrarem o antigeno apresentado pela versão APC libertam INFy. O peptideo de CMV utilizado é restrito a HLA-A2 e o material doador era conhecido por ser HLA-A2 positivo, e uma vez que 80% da população tem uma resposta CMV, foi 27 escolhido este modelo de vírus. A Figura 9 apresenta os resultados de um ensaio ELISPOT mostrando que existe uma forte resposta das células T estimuladas com DC carregadas com o peptídeo CMV a indicar que estas DC são capazes de apresentar os antígenos às células T.

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Lisboa, 10 de Maio de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de geração de células dendríticas maturas, através da utilização de temperaturas abaixo de 37 °C durante o desenvolvimento de células progenitoras e de células dendriticas imaturas.

2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o desenvolvimento das células progenitoras e das células dendriticas imaturas compreende a diferenciação das referidas células.

3. 0 método de acordo com as reivindicações 1-2, em que a temperatura é de 31 °C a 37 °C.

4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, em que a temperatura é de 34 °C.

5. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 4, em que as células progenitoras são células autólogas progenitoras.

6. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que as células progenitoras são selecionadas a partir de células progenitoras mielóides ou células estaminais.

7. O método de acordo com a reivindicação 6, em que as células progenitoras mielóides são monócitos. Lisboa, 10 de Maio de 2012