BRPI0619520A2

BRPI0619520A2 - método para gerar células dendrìticas empregando temperatura reduzida

Info

Publication number: BRPI0619520A2
Application number: BRPI0619520-2A
Authority: BR
Inventors: Alexei Kirkin; Karine Djandjogazian; Jesper Zeuthen
Original assignee: Dandrit Biotech As
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2011-10-04
Also published as: NO20083023L; IL191782A0; ATE545698T1; NZ569343A; IL191782A; EA015266B1; WO2007065439A1; CN101321861B; AU2006322451A1; US20090196856A1; ES2382565T3; CA2640836C; EP1971680A1; MY145814A; CN101321861A; CA2640836A1; DK1971680T3; CY1113016T1; EP1971680B1; EA200801385A1

Abstract

MéTODO PARA GERAR CéLULAS DENDRìTICAS EMPREGANDO TEMPERATURA REDUZIDA. A invenção refere-se, em certas modalidades, a um método para gerar células dendríticas empregadondo temperaturas abaixo de 37<198>C durante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendríticas imaturas. Em algumas modalidades, a invenção se refere a populações de células dendríticas e seu uso.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA GERAR CÉLULAS DENDRÍTICAS EMPREGANDO TEMPERATU- RA REDUZIDA".

Campo Técnico

A invenção refere-se a métodos e meios para induzir imunorres- postas contra doenças malignas e infecciosas. Mais particularmente, a in- venção pertence a métodos aperfeiçoados para gerar células apresentado- ras de antígenos. Antecedentes da Invenção

Imunoterapias com base em células dendríticas que exploram mecanismos naturais de apresentação de antígenos representam o método atóxico mais promissor de tratamento de câncer. Ele pode ser usado como um tratamento único, ou como um adjuvante para outras terapias, tais como, por exemplo, cirurgia, irradiação e quimioterapia. A estratégia é baseada em manipulação ex-vivo para contornar imunocompetências com a finalidade de induzir imunorrespostas específicas tumorais. Assim, a meta final de tais imunoterapias com base em células dendríticas é a indução de células efeto- ras específicas de tumor in vivo e avanços recentes têm focado em linfócitos T citotóxicos (CTL) CD8+ capazes de reconhecer e matar células tumorais. Além disso, o tratamento de doenças infecciosas, tal como, por exemplo, HIV, podem se beneficiar de estratégias de vacinação com base em células dendríticas.

Apresentação de Antígenos

Indução de imunorrespostas específicas requer o engajamento de células apresentadoras de antígenos (APC) profissionais que expressam moléculas do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC), bem como moléculas ligadas à membrana e co-estimuladoras secretadas. Além disso, tais APC são capazes de captar, processar e apresentar antígenos em as- sociação com células do MHC.

Células dendríticas (DC) são as APC profissionais do sistema imunológico com capacidade para ativar tanto as células simples (naíve) como de memória. Os estágios levando à maturação de DC são associados a certas propriedades da célula. DC imaturas são particularmente boas para captar antígenos extracelulares por fagocitose ou pinocitose e processar os antígenos para peptídeos no compartimento endocitótico, tais como endos- somos e fagossomos. Aqui, os peptídeos estão ligados a moléculas da clas- se II do MHC. DC imaturas têm também a capacidade única de carregar os peptídeos provenientes de proteínas exógenas para a via de classe I de MHC de apresentação, um processo chamado apresentação cruzada.

A capacidade de estimular eficientemente uma imunorresposta por ativação de célula T auxiliares tipo 1 CD4+ (células Th1) e células T cito- tóxicas CD8+ (CTL) é crucialmente dependente de uma DC madura. Somen- te DC inteiramente maduras equipadas com um painel de moléculas co- estimuladoras e acessórias ligadas à membrana, tais como CD40, CD80, CD83, CD86 e a classe II de MHC induzem a proliferação e diferenciação dos linfócitos específicos de antígenos1.

Um papel significante da atividade co-estimuladora de DC é pro- porcionado pelas citocinas secretadas em particular IL-12p70. Seu papel na ativação de células T e sua polarização para uma reposta tipo Th1 foram claramente demonstradas por Heufler et al. (1996)1. Além disso, uma boa correlação entre a presença de DC maduras que expressam IL-12 no tumor e na sobrevivência do paciente foi reportada por Inoue et al. (2005). DC ma- duras com fins de vacinação devem produzir quantidades limitadas da cito- cina IL-10 inibidora de células Th1.

CCR7 é o receptor para as quimiocinas CCL19 e CCL21, que são produzidas por células estromais nos linfonodos. DC que expressam níveis suficientes de CCR7 ativado migram para o Iinfonodo em resposta a CCL19 ou CCL212. Aqui, encontram os linfócitos T e podem iniciar uma imu- norresposta.

Protocolos para geração de DC maduras

Muitos protocolos para a geração da DC maduras foram descri- tas. O protocolo "padrão" mais freqüentemente usado correntemente para indução de DC emprega um coquetel de maturação que consiste em IL- 1beta, IL-6, TNF-alfa e prostaglandina E2. Apesar da atividade migratória devido à atividade do CCR7 e à atividade imunoestimuladora in vivo, DC amadurecidas por esse coquetel geram DC com reduzida capacidade de produzir IL12p703.

Um segundo grupo de protocolos de maturação de DC compre- ende ácido (poiinosfnicoipolicitidílico, poli-(l:C). É usualmente usado em combinação com citocinas tais como TINF alfa, IL-lbeta, IFN-gama e IFN- alfa. DC geradas por esse método produzem IL-12p70, mas elas usualmente expressam baixos níveis de CCR7. Baixos níveis de expressão de CCR7 caracterizada para DC obtidas em presença de poli-(l:C) restringem sua mi- gração in vivo para linfonodos.

Recentemente, um pedido de patente publicado 1,1 US2005/0003533A1 descreveu um método para maturação de células den- dríticas que expressam CCR7 que mediante subseqüente estimulação de CD40L poderiam ser induzidas para produzir IL-12p70.

Há ainda, portanto, uma exigência não satisfeita para o desen- volvimento de métodos padronizados para gerar células dendríticas maduras que expressam alto níveis de CCR7 ativado e que também produzem quan- tidade suficiente de IL-12p70.

Além disso, apesar dos esforços de vários investigadores, vaci- nas com base em células dendríticas para uso em terapia de câncer têm, em geral, proporcionado imunorrespostas com modesta eficácia clínica. Essas vacinas têm sido produzidas principalmente por manipulação ex vivo e car- regamento de antígenos de DC autólogas. Exigências crescentes com res- peito à segurança do paciente requerem nível alto de reprodutibilidade e cumprimento com questões reguladoras. Assim, há uma forte necessidade por métodos que geram DC propriamente equipadas, que induzem eficien- temente imunorrespostas e, em particular, respostas clínicas aperfeiçoadas.

Além disso, DC geradas ex vivo poderiam ser também imple- mentadas como vacina terapêutica no tratamento de algumas doenças in- fecciosas crônicas tais como HIV e hepatite B e C, onde a abordagem de vacina tradicional não está funcionando de forma eficaz. Os resultados dos estudos pré-clínicos e primeiros clínicos4"5 indicam que imunoterapia com base em DC poderia ser uma estratégia promissora para o tratamento de pacientes com infecções crônicas por HIV e hepatite B e C. Como com imu- noterapia de câncer, a resposta clínicas eficaz contra esses agentes infec- ciosos intracelulares está associada à indução de reposta de auxiliadoras de Th1 requeridas para o desenvolvimento de células efetoras CD8+5. Portanto, pode se esperar que células dendríticas geradas ex vivo devem ter as mes- mas características tanto para tratamento de câncer como de doenças infec- ciosas crônicas.

Descrição da Invenção

Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para gerar células dendríticas por emprego de temperaturas abaixo de 37°C, du- rante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendríticas imaturas.

Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a uma população de células dendríticas, em que as ditas células são geradas pelo método para gerar células dendríticas por emprego de temperaturas abaixo de 37°C, durante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendríticas imaturas.

Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma população de células dendríticas em que as ditas células são geradas pelo método para gerar células dendríticas pelo emprego de temperaturas abaixo de 37°C durante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendríticas imaturas.

Em um quarto aspecto, a invenção se refere ao uso da popula- ção de células, em que as ditas células são geradas pelo método para gerar células dendríticas pelo emprego de temperaturas abaixo de 37°C, durante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendríticas, para a esti- mulação e/ou expansão de células T.

Em um quinto aspecto, a invenção refere-se ao uso da popula- ção de células, em que as ditas células são geradas pelo método para gerar células dendríticas pelo emprego de temperaturas abaixo de 37°C, durante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendríticas imaturas, para induzir uma imunorresposta em um paciente.

Em um sexto aspecto, a invenção refere-se ao uso da população de células dendríticas, em que as ditas células são geradas pelo método para gerar células dendríticas pelo emprego de temperaturas abaixo de 37°C, durante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendríti- cas imaturas, para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de câncer e doenças infecciosas.

Breve Descrição do(s) Desenho(s)

A invenção é explicada em detalhes abaixo com referência aos desenhos, nos quais:

A figura 1 ilustra o efeito de temperatura sobre importantes mo- léculas de superfície co-estimuladoras e acessórias de DC.

A figura 2 ilustra o efeito de temperatura sobre a quantidade de IL-10 produzida por DC durante os dias iniciais da cultura (A) e produzida por DC imaturas (B) e DC maduras (C).

A figura 3 ilustra o efeito das temperaturas a 310C, 34°C e 37°C sobre a produção de IL-12p70 por células dendríticas imaturas (A) e madu- ras (B, C) geradas pelo novo método e por um método padrão.

A figura 4 ilustra o efeito da baixa temperatura na expressão de CCR7.

A figura 5 ilustra o fenótipo de DC imaturas e maduras geradas pelo método de acordo com a invenção (A) e em comparação com um mé- todo (B) padrão.

A figura 6 ilustra a estabilidade de fenótipo de DC maduras com o tempo.

A figura 7 ilustra o fenótipo e a atividade alo-estimuladora (MLR) de DC no dia 7 e no dia 10.

A figura 8 ilustra a atividade alo-estimuladora de DC geradas com o método de acordo com a invenção e um método "padrão".

A figura 9 ilustra a apresentação funcional de antígeno de CMV medida por indução de IFN-γ (ensaio ELISPOT).

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção é descrita detalhadamente abaixo. Para o propósito de interpretação, as seguintes definições aplicar-se-ão, e sempre que necessário os termos usados incluirão também o plural e vice-versa.

Definições

"Etapa de Diferenciação", como usada aqui, significa a etapa em que as células são deixadas se diferenciarem em resposta a fatores de dife- renciação definidos.

"Etapa de maturação", como usada aqui, significa a etapa em que as células são deixadas amadurecerem em resposta à presença de fato- res de maturação.

"Temperatura reduzida" ou "Temperatura diminuída", como usa- das aqui, significam que a temperatura está abaixo de 37°C.

Um método para gerar células dendríticas é o método bem co- nhecido de J.H. Peters, que foi o primeiro a escrever sobre a capacidade dos monócitos de se transformarem em células similares às DC in vitro, inicial- mente de forma espontânea e mais tarde em presença de GM-CSF e IL-46. Depois das publicações por Romani et a\., (1994)7 e Sallusto & Lanzavec- chia (1994)8, monócitos cultivados em presença dessas duas citocinas se tornaram largamente usadas para a preparação de DC. O procedimentos começa com o isolamento dos monócitos do sangue periférico e sua cultura em presença de GM-CSF e IL-4, por 5 a 7 dias. As células obtidas têm pro- priedades de DC imaturas caracterizadas por baixos níveis de moléculas co- estimuladoras e alta atividade endocítica. Durante a maturação induzida por LPS, TNF-alfa ou outros agentes de maturação, as células supra-regulam significantemente células co-estimuladoras e acessórias, tais como, por e- xemplo, CD40, CD80, CD83 e CD86, e infra-regulam a atividade endocítica.

Cultura de tecido in vitro é, em geral, realizada a 37°C. É conhe- cido que as células de Langerhans são funcionalmente ativas na temperatu- ra ambiente da pele a 29-31 °C, e poucos estudos têm documentado o efeito biológico in vitro de temperaturas de cultura diminuídas em sistemas de célu- las tais como, por exemplo, célula do Ovário de Hamster Chinês (CHO) e macrófagos alveolares suínos. Em contraste ao trabalho de Basu et al. (2003) quando investiga- ram o efeito de temperaturas similares à febre sob a ativação de maturação de DC, temperaturas reduzidas foram somente em alguns casos testadas quanto a seu efeito sobre o crescimento celular mamífero. Dexter et al.

(1977) sugeriram o uso de 33°C para cultivar células-tronco hematopoeiéti- cas9. Athanasas-Platsis et al. (1995) verificaram que a expressão de marca- dor de células de Langerhans, CD1a sobre monócitos, foi supra-regulada durante 24 horas de cultura a 34°C, em comparação com 37°C10.

Ninguém tem, até onde é do nosso conhecimento, exposto como gerar células dendríticas imaturas ou maduras por emprego de temperaturas reduzidas.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para gerar células dendríticas por emprego de temperaturas abaixo de 37°C, du- rante o desenvolvimento de células progenitoras e células dendríticas imatu- ras.

IL-10 é um regulador negativo do desenvolvimento de DC e é produzido durante a ativação de uma linhagem de células monocíticas em presença de GM-CSF11. Kirkley et al. (2003) reportaram que a produção de IL-10 por uma linhagem de célula de macrófago estimulada com LPS foi sig- nificantemente reduzida em resposta a um decréscimo da temperatura de incubação de 37°C para 310C12. A temperatura reduzida compreendida no método da presente invenção pode assim proporcionar condições aperfeiço- adas para a geração de DC por meio de, por exemplo, baixa concentração de IL-10.

O efeito de cultivar monócitos em presença de GM-CSF e IL-4 em temperaturas diferentes (31 °C, 34°C e 37°C) sobre o nível de expressão de CD1a de DC imaturas, uma molécula extremamente sensitiva ao efeito inibidor de IL-10, foi testado. Foi verificado que DC geradas em temperaturas mais baixas tinham níveis mais altos de expressão. Todos os outros experi- mentos foram realizados a 34°C. A próxima observação em princípio foi que níveis de IL-10 detectados nos sobrenadantes das culturas foram certamen- te significantemente mais baixos mediante cultura em temperatura mais bai- xa.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método, em que as células dendríticas geradas são células dendríticas maduras.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método, em que o desenvolvimento de células progenitoras e de células dendríticas imaturas compreende diferenciação das ditas células.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método, em que a temperatura está abaixo de 37°C, durante a diferenciação.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método, em que a temperatura é de 310C a 37°C, A temperatura pode ser qualquer uma das temperaturas de 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, ou 36°C.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método, em que a temperatura é 34°C.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método, em que as células progenitoras são células progenitoras autólogas.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método, em que as células progenitoras são selecionadas de células progenitoras mielóides ou células-tronco.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método, em que as células progenitoras mielóides são monócitos.

Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a uma popula- ção de células dendríticas que são geradas pelo método de acordo com a invenção.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma população de células dendríticas, em que as ditas células expressam CCR7 e/ou IL-12p70.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma população de células dendríticas, em que as ditas células expressam CD1a, CD14ba,X0, CD83, CD86 e IL-IObaixo.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma população de células dendríticas, compreendendo ainda pelo menos um antígeno apre- sentado em associação com uma molécula de MHC na superfície da célula.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma população de células dendríticas, em que o dito pelo menos um antígeno é um antígeno de tumor.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma população de células dendríticas, em que o dito antígeno de tumor é selecionado de um grupo que compreende: antígeno de câncer/testículos, antígeno de diferen- ciação específica de linhagem, antígeno super-expresso em tumor, antígeno mutado ou aberrantemente expresso, e antígeno viral.

Em uma outra modalidade, a invenção refere-se ao uso da popu- lação de células dendríticas conforme definição acima, para a estimulação e/ou expressão de células T.

Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso da população 1,1 de células dendríticas para a estimulação ou expansão de células T, em que as ditas células T são células T autólogas.

Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso da população de células dendríticas para a estimulação ou expansão de células T, em que o dito uso é um uso in vitro.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção refere-se ao uso da população de células dendríticas para induzir uma imunorresposta em um paciente.

Em ainda uma outra modalidade, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma população de células den- dríticas, em que a dita população é como definida acima.

Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso da composi- ção farmacêutica como um medicamento.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma população de células dendríticas que ainda compreendem adjuvantes convencionais e excipientes.

Em uma modalidade alternativa, a invenção refere-se ao uso das células dendríticas para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de câncer ou de doenças infecciosas.

Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso da população de células dendríticas para a fabricação de um medicamento para o trata- mento ou a prevenção de câncer ou de doenças infecciosas, em que o dito câncer é selecionado do grupo que compreende: melanoma, câncer de ma- ma, câncer de cólon e câncer de pulmão, ou poderia ser ainda qualquer tipo de câncer.

Em uma modalidade, a invenção refere-se ao suo da população de células dendríticas para a fabricação de um medicamento para o trata- mento ou a prevenção de câncer ou de doenças infecciosas, em que as do- enças infecciosas são selecionadas do grupo que compreende: HIV e hepa- tite ou outras doenças infecciosas crônicas.

Exemplos

Essa invenção é agora ilustrada pelos seguintes exemplos que não são destinados, de modo algum, a serem limitativos. Exemplo 1: Geração das células dendríticas que emprega temperatura redu- zida

Células dendríticas foram tipicamente geradas a partir de creme leucocitário obtido do banco de sangue. 60 ml de creme leucocitário com 60 mL de Solução Salina Tamponada de Fosfato de Dulbecco isenta de Ca e isenta de Mg (DPBS, Produto N0 BE17-512F, Cambrex, Bélgica), e aplicados a quatros tubos de 50 mL, cada um contendo 15 mL de Lymphoprep (Produ- to N0 1053980, AXIS-SHIELD PoC AS, Noruega). Depois de centrifugação (460 g, 30 min, 20°C), 10-20 mL da camada de plasma superior foram trans- feridos para tubos separados. Foi estimado que isto é de aproximadamente 40% de plasma (plasma diluído). A separação final do plasma inclui a adição de heparina (25 Ul/ml) e centrifugação (1.500 g, 15 min, 4°C). Células mo- nonucleares foram colhidas da interface, diluídas duas vezes com DPBS contendo EDTA e lavadas por 4 a 5 centrifugações, a primeira em 250G, a segunda em 200G e a seguinte em 150G, todas as centrifugações a 4°C, 12 minutos. Antes da última centrifugação, as células foram contadas usando o Contador Coulter (Beckman Coulter, modelo Z2), e a quantidade de monóci- tos foi estimada como o número de células com um tamanho médio de cerca de 9 μm. As células podem ser armazenadas a -80°C (em plasma diluído com 10% de DMSO, 107 monócitos por frasco), ou usadas imediatamente em experimentos.

As células foram ressuspensas em meio de adsorção (RPMI 1640 (Cambrex) suplementados com 2mM de L-glutamina e 2% de plasma) em uma concentração de 2x106 de monócitos/mL. Cinco mililitros da sus- pensão de célula foram colocados em frascos Falcon não tratados com TC, T25. Depois de 1 hora de adsorção a 37°C, as células não aderentes foram removidas, as células aderentes foram enxaguadas duas vezes com RPMI 1640 morno, e 7 ml_ de meio de cultivo (RPMI 1640 suplementado com 2mM de L-glutamina e 1% de plasma) foram adicionados a cada frasco.

Os frascos foram colocados em temperaturas diferentes: 31 °C, 34°C e 37°C em incubadoras com CO2 separadas. Fatores de diferenciação GM-CSF e IL-4, em concentrações finais de 100 ng/mL e 50 ng/ml, respecti- vamente, foram adicionados nos dias 1, 3 e 5.

TNF-alfa em uma concentração final de 10 ng/mL foi adicionado no dia 6 para induzir a maturação e a temperatura foi elevada para 37°C, para as últimas 24 h de incubação.

No dia 7, as células foram colhidas e seu fenótipo foi determina- do por análise FACS. As células foram coloridas usando os anticorpos con- jugados diretos CD1a-ficoeritrina (PE), CD14-isotiocianato de fluoresceína (FITC), CD83-PE, CD86-PE, HLA-DR1-P1-Q- FITC (todos da Pharmingen1 Beckton Dickinson1 Brondby1 Dinamarca) e CCR7-FITC (R&D Systems Eu- rope, Abington1 UK). Controles de isótipos apropriados foram usados. As amostras foram analisadas usando Citômetro de Fluxo FACSCaIibur (Beck- ton Dickinson) e software CELLQuest (Beckton Dickinson).

O resultado dos experimentos representativos é mostrado na figura 1. Mais células cultivadas em temperaturas reduzidas expressam CD1 em comparação com as células cultivadas a 37°C, ao pas- so que menos células positivas CD83 e CD86 foram observadas para as populações de células cultivadas em temperaturas mais baixas. O índice de fluorescência médio (MFI) para CD1a foi duas vezes tão alto mediante cultu- ra a 31ºC e 34°C em comparação com 37°C. O grau de maturação conforme julgado pela percentagem de DC expressando CD83 e CD86 foi menor a 31 - 34°C. Isso reflete tanto uma sensitividade menor para fatores de maturação de células cultivadas em temperatura reduzida, como que o próprio processo de maturação requer uma temperatura de 37°C. Exemplo 2: O efeito de temperatura reduzida na produção de IL-10

A produção de IL-10, que é um regulador negativo de DC1 foi investigada durante a diferenciação de monócitos em células dendríticas. Sua concentração no sobrenadante da cultura, tomada nos dias 1, 3 e 5, foi medida. A produção de IL-10 foi medida por sanduíche ELISA que incluiu anticorpo de captura (Ab), um padrão ou amostra, Ab de detecção biotinila- da, e HRP-estreptavidina usando o kit "Ready-Set-Go" da eBioscience es- sencialmente de acordo com as recomendações dos fabricantes com algu- mas modificações. Depois de ligação durante a noite de Ab de captura às placas de 98 poços Nunc maxisorp e lavagem, a etapa de bloqueio foi es- tendida para pelo menos 3 horas, à temperatura ambiente. Uma curva pa- drão foi gerada por série de sete diluições, começando com 200 pg/mL de IL-10. Padrões e amostras foram incubados à temperatura ambiente, por duas horas, seguido por incubação a 4°C, durante a noite. As próximas eta- pas foram realizadas de acordo com o protocolo dos fabricantes. Solução de substrato de tetrametilbenzidina do mesmo kit foi usada na reação enzimáti- ca de HRP, e depois de terminada a reação, a densidade óptica foi medida com correção do comprimento de onda conforme diferença entre as leituras em 490 e 620 nm. Os resultados de um de tais experimentos são apresenta- dos na figura 2A. A produção espontânea de IL-10 por monócitos foi baixa durante o primeiro dia, e foi significantemente supra-regulada depois da adi- ção de GM-CSF e IL-4 no dia 1. As células cultivadas a 34°C até o dia 5 produziram em geral quantidades significantemente menores de IL-10 em comparação com as células cultivadas a 37°C. O teste de várias culturas de DC no dia 5 mostrou um padrão (figura 2B). A produção reduzida de IL-10 a 34°C em comparação com 37°C continuou mesmo depois da lavagem das células no dia 5, colocando as mesmas a 37°C, adicionando agente de ma- turação no dia 6 e coletando os sobrenadantes no dia 8 (figura 2C). Esses resultados indicam que as células cultivadas a temperaturas abaixo de 37°C adquirem um fenótipo estável de baixa produção de IL-10.

Exemplo 3: O efeito da temperatura reduzida na produção de IL-12p70.

Também investigamos o efeito da temperatura na produção de IL-12p70. A produção de IL-12p70 foi medida por sanduíche ELISA que in- cluiu Ab de captura, padrão ou amostra, Ab de detecção biotinilado, e HRP- estreptavidina. Kits "DuoSet ELISA development System" para IL-12p70 (R&D Systems) foram usados essencialmente de acordo com as recomen- dações dos fabricantes, com algumas modificações. Depois de ligação, du- rante a noite, de Ab de captura às placas de 98 cavidades Nunc maxisorp e lavagem, a etapa de bloqueio foi estendida para pelo menos 3 horas à tem- peratura ambiente. A curva padrão foi gerada por sete diluições em série do 1,1 padrão, começando com 500 pg/mL de IL-12p70. Padrões e amostras foram incubados à temperatura ambiente, por duas horas, seguida de incubação a 4°C, durante a noite. As próximas etapas foram realizadas de acordo com o protocolo dos fabricantes. Uma mistura de peróxido de hidrogênio- tetrametilbenzidina foi usada como uma solução de substrato para HRP, e depois de terminada a reação enzimática, a densidade óptica foi medida com correção de comprimento de onda como diferença entre as leituras em 490 e 620 nm.

Tabela 1. Efeito da temperatura durante os primeiros 5 dias de cultura na produção de IL-12p70 durante a maturação induzida por mimético MCM.

<table>table see original document page 14</column></row><table>

Como pode ser visto (Tabela 1), as células geradas a 34°C pro- duzem níveis significantemente mais altos da IL-12p70. Exemplo 4: Seleção de plástico para cultura de tecido. Compararam-se dois tipos de plásticos de cultura de tecido: Po- liestireno (PS) (Produto N0 353813, T25 BD-Bioscience,E.U.A.) de cultura não-tecidual e plástico Primaria® (Produto N0 352813, T25 BD-Bioscience, E.U.A.). O experimento foi preparado de forma similar ao procedimento des- crito no Exemplo 1, usando superfícies de plástico pré-tratadas por 15-45 minutos com 2% de plasma autólogo como uma fonte para componentes, tais como, por exemplo, componentes extracelulares como fibrinogênio e fibronectina, em meios AIM-V isentos de soro, a 34°C, até o dia 5, depois do que as culturas foram colocadas a 37°C. Os agentes de maturação, TNF- alfa, IL-1 beta, IL-6 e prostaglandina E2 foram adicionados no dia 5, e as culturas foram colhidas no dia 8.

Células progenitoras têm, dependendo da condição de cresci- mento, a opção de se desenvolver em macrófagos ou DC. Depois de poucos dias na cultura, as células destinadas a se desenvolverem em macrófagos formarão culturas de células aderentes, ao passo que as células destinadas a se desenvolverem em DC formarão culturas de células frouxamente liga- das. Inicialmente, um número igual de células foi sementado e aderido ao plástico de cultura de tecido diferente. Inspeção das culturas de DC a partir do dia 6 por microscópio de luz revelou um número significativamente menor de células aderentes sobre o plástico Primaria® em comparação com as cé- lulas crescidas em um outro tipo de plástico. Em geral, as culturas crescidas no plástico Primaria® pareceram também mais "limpas", ou seja, com menos fragmentos, refletindo menos extensão da morte celular durante a maturação.

Testou-se o uso de concentração diferente de plasma para pré- tratamento de plástico. Não foram observadas diferenças significantes nas propriedades de DC mediante tratamento do plástico Primaria® com 2%, 10%, 20% ou 40% de plasma (dados não mostrados). Contudo, notou-se que a quantidade de linfócitos contaminadores decresceu com a concentra- ção crescente de plasma até 10%. Portanto, incluímos a etapa de tratar o plástico Primaria® com 10% de plasma no método descrito no experimento 1 nos experimentos subseqüentes. Nos seguintes experimentos, comparou-se o método da inven- ção a um "método padrão", que é realizado conforme descrito abaixo, a me- nos que de outro modo indicado.

As células dendríticas foram tipicamente geradas de creme leu- cocitário obtido do banco de sangue. Sessenta mililitros de creme leucocitá- rio foram diluídos com 60 mL de Solução Salina Tamponada de Fosfato de Dulbecco isenta de cálcio e isenta de Mg (DPBS, Produto N° BE17-512F, Cambrex, Bélgica), e aplicados a quatro tubos de 50 mL, cada um contendo 15 mL de Lymphoprep (Produto N° 1053980, AXI-SHIELD PoC AS, Norue- ga). Depois da centrifugação (460G, 30 minutos, 20°C), 10-20 mL da cama- da de plasma superior foram transferidos para tubos separados. Células u mononucleares foram colhidas da interface, diluídas duas vezes com PBS EDTA sem cálcio e sem magnésio e lavadas por 3 centrifugações, a primeira em 250G, a segunda em 175G, e a última em 110G, todas as centrifugações a 4°C, 12 minutos. Antes da última centrifugação, as células foram contadas usando um Contador Coulter (Beckman Coulter, modelo 72), e a quantidade de monócitos foi estimada como o número de células com um tamanho de partícula de cerca de 9 μιτι.

As células foram ressuspensas em meio de absorção (RPMI 1640 (Cambrex) suplementado com 2mM de L-glutamina e 1% de plasma autólogo inativado com aquecimento) em uma concentração de 2x106 de monócitos/mL. 5 mL da suspensão de células foram colocados em frascos de Primaria® não tratados T25. Depois de 1 hora de adsorção, a 37°C, as células não aderentes foram removidas, e 5 mL de meio de cultivo (RPMI 1640 suplementado com 2mM de L-glutamina e 1% de plasma) foram adi- cionados a cada frasco.

No dia 1, os meios foram trocados por meios frescos. No dia 3, 2 mL de meios foram adicionados. No dia 5, todas as células não aderentes foram colhidas e colocadas em frascos de Primaira™ T25

Os frascos foram colocados a 37°C em incubadora com CO2. Os fatores de diferenciação GM-CSF e IL-4 nas concentrações finais de 100 ng~mL e 50 ng/mL, respectivamente, foram adicionados nos dias 1, 3 e 5. Tnf-α ou Coquetel de citocina (IL-1, IL-6, TNF- μ e PGE-2) foi adicionado no dia 6 para induzir maturação.

No dia 7, as células foram colhidas e seu fenótipo foi determina- do por análise FACS.

Exemplo 5: produção de IL-12p70.

A figura 3 ilustra a medição de produção de IL-12p70 em dois dias (dia 7 e dia 8); mostra-se que as células dendríticas geradas pelo novo método produzem quantidades significantemente maiores de IL-12p70 que as células dendríticas geradas pelo método padrão.

Exemplo 6: Expressão de CCR7.

Para investigar o efeito da temperatura baixa na expressão de CCR7, empregou-se o coquetel de maturação de IL-lbeta, IL-6, TNF-alfa e prostaglandina em vez de usar somente TNF-alfa. O resultado dos experi- mentos apresentados na figura 4 é comparado a três temperaturas diferen- tes com o novo método e um método padrão. Pode ser visto que a expres- são de CCR7 é maior com o novo método em comparação com o método padrão.

Também testamos a funcionalidade da expressão do receptor de CCR7 por célula dendrítica gerada pelo novo método em um ensaio de mi- gração padrão (Sistema de Quimitaxia Descartável Chemotx (Modelo 116-5) da Neuro Probe, Gaithersburg, MD, E.U.A.). Aqui, vimos migração de células dendríticas em direção às quimiocinas CCL19 com DC geradas pelo novo método (dados não mostrados) verificando a expressão de um receptor de CCR7 funcional.

Exemplo 7: Rendimento de células.

O novo método descrito aqui mostrou também rendimento de célula aumentado em comparação com o método padrão. Em três corridas diferentes, constatou-se um rendimento de células maior em todas as tem- peraturas testadas (31 °C, 34°C e 37°C) com o novo método em comparação com o método padrão. Vide Tabela 2. Tabela 2

<table>table see original document page 18</column></row><table>

Exemplo 8: Variações de marcadores batelada-para-batelada de DC aera- das pelo novo método.

Em cumprimento com as exigências de GMP para a produção de células dendríticas para propósitos médicos, deve haver baixas variações de batelada para batelada nas propriedades das células dendríticas. Com essa finalidade, realizou-se a preparação de células dendríticas a partir do sangue de oitos doadores diferentes, durante o período de três semanas, usando os mesmos lotes de todos os reagentes empregados e 0,5% de plasma autólogo como adição para o meio AIM-V. Para comparação, foi rea- lizada a produção de DC usando o método "padrão" (37°C). Os experimen- tos foram realizados em PBMC descongelado. A Tabela 3 sumariza as pro- priedades de DC geradas nestes experimentos. Em contraste com a alta variabilidade das propriedades de DC geradas pelo método "padrão", foi ob- servado um grau muito baixo de variabilidade nas propriedades de DC obti- das pelo novo método. Tabela 3

<table>table see original document page 19</column></row><table> Finalmente, a figura 5A representa fenótipos de células dendríti- cas imaturas (dia 5) e maduras (dia 8) geradas pelo novo método. Aqui me- diu-se também a expressão de CD80, receptor de manose (MR) e dois mar- cadores de células de Langerhans - CD207 (Iangerina) e E-caderina. Como podem ser vistas, as células geradas pelo método de acordo com a presente invenção não são células de Langerhans.

A figura 5B representa o fenótipo de células dendríticas imaturas (dia 5) e maduras (dia 8) geradas pelo novo método e por um método pa- drão. Aqui, colorimos as células para a expressão de marcadores de DC pa- drão. As células imaturas (dia 5) mostram uma população de CD1a mais limpa. A população madura (dia 8) está mostrando uma expressão de HLA 1,1 D, CD83 e CD86 alta e uniforme em células geradas pelo novo método em comparação com o método padrão. Também, a expressão de CCR7 é mais uniformemente expressa com o novo método.

Exemplo 9. Estabilidade das células dendríticas geradas pelo novo método.

Depois de injeção no organismo, as células dendríticas puderam migrar e chegar ao Iinfonodo de modo a estimular as células T. É, portanto, muito importante que as DC mantenham o seu fenótipo por vários dias. Um modo comum de realizar o teste de estabilidade é colher as células no dia 8, lavar das citocinas e continuar cultivando as células em ausência de citoci- nas estimuladoras. Realizamos esse tipo de experimento por cultivo das cé- lulas sem citocinas por dois dias. A figura 6 representa os resultados da aná- lise FACS das DC colhidas no dia 8 e depois de dois dias adicionais de cul- tura. Parece, claramente, que a expressão de parâmetros medida: CD1a, CD14, CD83, HLA-D e CCR7, permanecem altamente inalterados, e assim o fenótipo permanece estável.

Em um experimento similar, sem lavagem das citocinas no dia 8, testou-se tanto o fenótipo como a atividade alo-estimuladora das células dendríticas no dia 7 ou no dia 10. As Figuras 7A e 7B mostram os fenótipos e a atividade alo-estimuladora, respectivamente. Os resultados mostram que o efeito alo-estimulador é também alto depois de 10 dias de cultura e o perfil do fenótipo no dia 10 lembra o perfil medido no dia 7, verificando alta estabi- lidade das células dendríticas geradas.

Exemplo 10. Alo-estimulacão por células dendríticas geradas pelo novo mé- todo.

Compararam-se as capacidades alo-estimuladoras de DC obti- das pelo "método padrão" e pelo método de acordo com a invenção. As cé- lulas foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 5% de AB do soro humano. As células respondedoras eram células mononucleares obtidas de doadores saudáveis pela separação por densidade do creme leucocitário do sangue periférico. Células estimuladoras eram células dendríticas maduras irradia- das obtidas depois de dois dias de exposição ao coquetel de citocinas de maturação conforme descrito no Exemplo 4. As células estimuladoras, 0,1 χ 10^6 células em 100 μL, foram misturadas com números titulados de células estimuladoras (em 100 μL) como mostrado na figura 8 e cultivadas por 5 di- as em placas de microtitulação de 96 poços de fundo em U. 3H-timidina (0,1 μCurie/mL.) foi adicionada nas últimas 18 horas. Subseqüentemente, as célu- las foram colhidas para contagem por cintilação. Os dados são fornecidos como os valores médios de quatro culturas replicadas. O teste de Wilcoxon foi usado para estimar as diferenças entre os dois métodos usados para a geração de DC. Como pode ser visto as células dendríticas obtidas pelo mé- todo de acordo com a invenção têm de 3 a 10 vezes mais atividade alo- estimuladora.

Exemplo 11. Apresentação de antíqenos pelas células dendríticas geradas pelo novo método.

Para elucidar o potencial de DC para apresentar antígeno para células T, um ensaio INFy ELISPOT foi conduzido com células T estimula- das por DC "naked" ou pulsadas com peptídeo de CMV. O ensaio INFy E- LISPOT foi escolhido, pois este ensaio proporciona um resultado claro em um nível de célula simples e células T mediante encontro com o antígeno apresentado por INFy de liberação de APC. O peptídeo de CMV usado é restrito a HLA-A2, e o material de doador era conhecido como sendo HLA- A2 positivo, e como 80% da população têm uma resposta a CMV, este mo- delo de vírus foi escolhido. A figura 9 mostra os resultados de um ensaio ELISPOT mostrando que há uma forte resposta das células T estimuladas com DC carregadas com o peptídeo de CMV indicando que estas DC são capazes de apresentação de antígeno a células T. Referências

1. Heufler, C, Koch, F., Stanzl1 U., Topar, G., Wysocka, M., Trin- chieri, G., Enk, A., Steinman, R. M., Romani1 N., e Schuler, G. "lnterleukin-12 is produced by dendritic cells and mediates T helper 1 development as well as interferon-gamma production by T helper 1 cells". Eur.J.Immunol., 26: 659-668,1996.

2. Scandella, E., Men, Y., Gillessen, S., Forster, R., and Groet- trup, M. "Prostaglandin E2 is a key factor for CCR7 surface expression and migration of monocyte-derived dendritic cells." Blood, 100: 1354-1361,2002.

3. Jonuleit, H., Kuhn, U., Muller, G., Steinbrink, K., Paragnik, L., Schmitt, E., Knop, J., e Enk, A. H. "Pro-inflammatory cytokines and prosta- glandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions." Eur.J.Immunol., 27: 3135-3142, 1997.

4. Chen, M., Li, Y. G., Zhang, D. Z., Wang, Z. Y., Zeng, W. Q., Shi, X. F., Guo, Y., Guo, S. H., e Ren, H. "Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B: a clinicai study." World J.Gastroenteroi, 11:1806-1808, 2005.

5. Lu, W., Arraes, L. C, Ferreira, W. T., e Andrieu, J. M. "Thera- peutic dendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection." Nat.Med., 10: 1359- 1365,2004.

6. Peters, J. H., Xu1 H., Ruppert, J., Ostermeier, D., Friedrichs, D., and Gieseler, R. K. "Signals required for differentiating dendritic cells from human monocytes in vitro". Adv.Exp.Med.BioL, 329: 275-280,1993.

7. Romani, N., Gruner, S., Brang, D., Kampgen, E., Lenz, A., Trockenbacher, B., Konwalinka, G., Fritsch, P. O., Steinman, R. M., e Schu- ler, G. "Proliferating dendritic cell progenitors in human blood." J. Exp. Med., 180:83-93,1994.

8. Sallusto, F. e Lanzavecchia, A. "Efficient presentation of solu- ble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocy- te/macrophage colony- stimulating factor plus interleukin 4 and downregula- ted by tumor necrosis factor a." J.Exp.Med., 179: 1109-1118,1994.

9. Dexter, T. M., Allen, T. D., e Lajtha, L. G. "Conditions control- ling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro." J. Cell Physiol1 91:335-344,1977.

10. Athanasas-Platsis, S., Savage, N. W., Winning, Τ. A., e Wal- sh, L. J. "Induction of the CD1a Langerhans cell marker on human monocy- tes." Arch. Oral Biol., 40:157-160, 1995.

11. Lehmann, Μ. H. "Recombinant human granulocyte- macrophage colony- stimulating factor triggers interleukin-10 expression in the monocytic cell Iine U937." Mol.lmmunol., 35: 479-485, 1998.

12. Kirkley, J. E., Thompson, B. J., e Coon, J. S. "Temperature alters lipopolysaccharide-induced cytokine secretion by RAW 264.7 cells." Scand. J. Immunol., 58: 51-58, 2003.

Claims

1. Método para gerar células dendríticas pelo emprego de tem- peraturas abaixo de 37°C, durante o desenvolvimento de células progenito- ras e células dendríticas imaturas.

2. Método, de acordo c6om a reivindicação 1, em que as células dendríticas geradas são células dendríticas maduras.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o de- senvolvimento de células progenitoras e células dendríticas imaturas com- preende a diferenciação das ditas células.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que a tempera- tura está abaixo de 37°C durante a diferenciação.

5. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 4, em que a temperatura é de 310C a 37°C.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -4, em que a temperatura é 34°C.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em que as células progenitoras são células progenitoras autólogas.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em que as células progenitoras são selecionadas de células progenitoras mielóides ou células-tronco.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que as células progenitoras mielóides são monócitos.

10. População de células dendríticas, em que as ditas células são geradas pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9.

11. População de células, de acordo com a reivindicação 10, em que as ditas células expressam CCR7 e/ou IL-12p70.

12. População de células, de acordo com a reivindicação 10 ou -11, em que as ditas células expressam CD1a, CD14baix0, CD83, CD86 e IL- -10baixo.

13. População de células, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 10 a 12, que compreende ainda pelo menos um antígeno apre- sentado em associação com a molécula de MHC na superfície da célula.

14. População de células, de acordo com a reivindicação 13, em que o dito pelo menos um antígeno é um antígeno de tumor.

15. População de células, de acordo com a reivindicação 14, em que o dito antígeno de tumor é selecionado de um grupo que compreende: antígeno de câncer/testículos, antígeno de diferenciação específica de linha- gem, antígeno superexpresso no tumor, antígeno mutado ou aberrantemente expresso, e antígeno viral.

16. Uso da população de células conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 15, para estimulação e/ou expansão de células T.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, em que as ditas cé- lulas T são células T autólogas.

18. Uso, de acordo com as reivindicações 16 a 17, em que o dito uso é uso invitro.

19. Uso da população de células conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 15, para induzir uma imunorresposta em um paciente.

20. Composição farmacêutica, que compreende uma população de células dendríticas.

21. Uso da população de células conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 15, para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de câncer ou doenças infecciosas.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, em que o dito câncer é selecionado do grupo que compreende: mèlanoma, câncer da mama, cân- cer do cólon e câncer do pulmão.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 21, em que as doenças infecciosas são selecionadas do grupo que compreende: HIV e hepatite.