PT1931366E - Composição herbal para desordens inflamatórias - Google Patents

Description

ΕΡ 1 931 366/ΡΤ DESCRIÇÃO "Composição herbal para desordens inflamatórias"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente divulgação refere-se a uma composição herbal compreendendo um extracto de cabeças de floração e de frutificação de uma planta, Sphaeranthus indicus. Refere-se ainda a uma composição herbal contendo um extracto obtido das cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus, compreendendo um composto, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (7-

Hidroxi-4,11(13)-eudesmadien-12,6-ólido) (composto 1) como marcador bioactivo, e opcionalmente outros activo(s) para o tratamento eficaz de desordens inflamatórias. A presente divulgação também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona (composto 1) como ingrediente activo e transportadores farmaceuticamente aceitáveis, para utilização no tratamento de desordens inflamatórias. Refere-se também a um método de fabrico das composições. As composições da presente invenção estão adaptadas para o tratamento de desordens inflamatórias. A invenção também se refere a actividade inibidora do factor de necrose tumoral-α (TNF-a) e interleucina (IL-1, IL-6, IL-8) das composições. A presente invenção refere-se ainda à inibição da expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), da molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e da E-Selectina pelas composições. A invenção também divulga utilizações médicas das composições para tratamento de desordens inflamatórias. Opcionalmente, o extracto ou a composição compreendendo o composto 1 podem ser utilizados em combinação com pelo menos um outro agente anti-inflamatório.

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO A inflamação desempenha um papel fundamental nas defesas do hospedeiro e na progressão de doenças imunomediadas. A resposta inflamatória é iniciada em resposta a uma lesão (e.g. 2 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ traumatismo, isquemia e partículas estranhas) e a infecção (e.g. infecção bacteriana ou virai) através de eventos múltiplos, incluindo mediadores químicos (e.g. citoquinas e prostaglandinas) e células inflamatórias (e.g. leucócitos). E caracterizada por fluxo sanguíneo aumentado ao tecido, causando pirexia, eritema, induração e dor. Um delicado jogo bem equilibrado entre os elementos imunitários humoral e celular na resposta inflamatória permite a eliminação de agentes prejudiciais e a iniciação da reparação de tecido danificado. Quando este jogo delicadamente equilibrado é perturbado, a resposta inflamatória pode resultar em consideráveis danos para o tecido normal e pode ser mais prejudicial do que o insulto original que iniciou a reacção. Nestes casos de respostas inflamatórias não controladas, é necessária intervenção clinica para prevenir danos nos tecidos e a disfunção de órgãos. Doenças como artrite reumatóide, osteoartrite, doença de Crohn, asma, alergias, síndrome de choque séptico, aterosclerose, doença inflamatória do intestino, entre outras condições clínicas, são caracterizadas por inflamação crónica.

As citoquinas, especialmente IL-Ιβ, IL-6, IL-8 e TNF-a, desempenham um importante papel no processo inflamatório. 0 TNF-α, uma citoquina pleiotrópica, é produzido principalmente por macrófagos, mas pode ser também produzido por outros tipos de células. 0 TNF-α demonstra actividades benéficas bem como patológicas. Tem simultaneamente efeitos estimulantes do crescimento e propriedades inibidoras do crescimento, para além de ser auto-regulador. As funções benéficas do TNF-α incluem a manutenção da homeostasia por regulação do ritmo circadiano do corpo, montagem de uma resposta imunitária a infecções bacterianas, virais, fúngicas e parasíticas, por substituição ou remodelação do tecido lesionado através de estimulação do crescimento de fibroblastos e, como o nome sugere, morte de determinados tumores.

Embora o TNF-α desempenhe um papel crítico em respostas imunitárias inatas e adquiridas, a produção inapropriada de TNF-α pode produzir alterações patológicas resultantes em inflamação crónica e danos nos tecidos. Mostrou-se que o TNF-a 3 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ desempenha um papel crucial na patogénese de muitas doenças inflamatórias crónicas tais como doença inflamatória do intestino, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumatóide refractária, artrite crónica não reumatóide, osteoporose/reabsorção óssea, doença cardíaca coronária, vasculite, colite ulcerosa, psoríase, síndrome da dificuldade respiratória do adulto, diabetes, desordens de hipersensibilidade cutânea do tipo retardado e Doença de Alzheimer. A interleucina-1 (IL-1) é uma parte importante do sistema imunitário inato, que regula funções do sistema imunitário adaptativo. 0 equilíbrio entre IL-1 e antagonista do receptor de IL-1 (IL-lra) em tecidos locais influencia o possível desenvolvimento de uma doença inflamatória e danos estruturais resultantes. Na presença de uma quantidade excessiva de IL-1, podem-se desenvolver desordens inflamatórias e auto-imunes em articulações, nos pulmões, no tracto gastrointestinal, no sistema nervoso central (SNC) ou vasos sanguíneos.

Entre as várias desordens inflamatórias, a artrite reumatóide (AR) é uma desordem auto-imune. A AR é uma doença inflamatória articular sistémica, crónica, de etiologia desconhecida. Na AR, o revestimento sinovial normalmente fino das articulações é substituído por um tecido de fibrocolagenase invasivo (pano), altamente vascularizado, inflamatório, que é destrutivo tanto para a cartilagem como para o osso. Áreas que podem ser afectadas incluem as articulações das mãos, pulsos, pescoço, mandíbula, cotovelos, joelho, pés e tornozelos. A destruição da cartilagem na AR está ligada a expressão aberrante de citoquinas e factor do crescimento nas articulações afectadas.

Duas citoquinas clinicamente importantes libertadas no sinóvio são IL-Ιβ e TNF-α. 0 TNF-a pode supra-regular a sua própria expressão bem como facilitar a expressão de outros genes implicados na AR, incluindo IL-Ιβ, IL-6, IL-8, ciclo-oxigenase-2 (COX-2), óxido nítrico-sintetase indutível (iNOS), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e E-Selectina. Este tipo de ciclo regulatório positivo pode amplificar e perpetuar respostas inflamatórias locais. Portanto, a expressão inapropriada ou 4 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ sobre-expressão de TNF-α conduz a um aumento coordenado na expressão de muitos genes cujos produtos medeiam respostas inflamatórias e imunitárias e desse modo conduzem às manifestações clinicas da AR. 0 recrutamento e a retenção de leucócitos constituem um evento critico na patogénese de todas as desordens inflamatórias crónicas incluindo AR. Adicionalmente, a adesão de leucócitos circulantes, especialmente monócitos, ao endotélio vascular é também um evento crucial no desenvolvimento de aterosclerose. Este processo depende da interacção entre as moléculas de adesão expressas na superfície de células endoteliais tais como ICAM-1, VCAM-1 e E-Selectina e seus ligandos cognatos em leucócitos. Portanto, a ICAM-1, a VCAM-1 e a E-Selectina são responsáveis pelo recrutamento de células inflamatórias, tais como neutrófilos, eosinófilos e linfócitos T, a partir da circulação para o local da inflamação. Estas proteínas de adesão estão normalmente em nível baixo na superfície de células endoteliais mas são grandemente induzidas por várias citoquinas pró-inflamatórias tais como TNF-a. A terapia mais comum para tratamento de desordens inflamatórias envolve a utilização de fármacos anti-inflamatórios não esteróides (ΑΙΝΕ) e.g. naproxeno, diclofenac, ibuprofeno para aliviar sintomas tais como a dor. Contudo, apesar do uso disseminado dos ΑΙΝΕ, muitos indivíduos não conseguem tolerar as doses necessárias para tratar a desordem ao longo de um período prolongado de tempo como os ΑΙΝΕ que se sabe causarem erosões gástricas. Adicionalmente, os ΑΙΝΕ meramente tratam sintomas da desordem e não a causa.

Quando os pacientes não respondem aos ΑΙΝΕ, são utilizados outros fármacos tais como metotrexato, sais de ouro, D-penicilamina e corticosteróides. Estes fármacos também têm efeitos tóxicos significativos.

Os fármacos de anticorpos monoclonais tais como infliximab, etanercept e adalimumab são úteis como agentes anti-inflamatórios, mas têm desvantagens tais como a via de administração (apenas parentérica), custo elevado, indução de 5 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ alergias, activação de tuberculose latente, risco acrescido de cancro e doença cardíaca congestiva.

Portanto, existe uma necessidade de desenvolvimento de medicamentos melhorados e alternativos com efeitos secundários reduzidos para a prevenção e tratamento de desordens inflamatórias causadas por IL-1 e TNF-α aumentados.

As ervas são conhecidas e têm sido utilizadas em todo o mundo para tratamento de muitas condições. Existem evidências de que produtos derivados de plantas possuem potenciais efeitos farmacológicos e terapêuticos sobre os mamíferos e tendem a ter menos efeitos secundários prejudiciais do que fármacos sintéticos. A presente invenção descreve uma nova composição herbal, que compreende extracto de cabeças de floração e de frutificação da planta Sphaeranthus indicus. A composição pode ser utilizada para o tratamento de várias desordens inflamatórias com efeitos secundários mínimos. A Sphaeranthus indicus é uma erva vulgar encontrada nos campos de arroz. Pertence à família Asteraceae e na literatura aiurvédica, é conhecida como mahamundi ou gorakhmundi. A planta, disponível em toda a índia, é uma erva ramificada com flores púrpura. É utilizada em desordens hepáticas e gástricas. É utilizada na medicina popular como remédio para várias maleitas incluindo disenteria, dor no útero e na vagina, doenças do peito, purificação e enriquecimento do sangue, infecções do tracto urinário, cura de feridas e várias outras doenças.

Foi desenvolvida uma formulação poli-herbal, "RV-08", contendo Sphaeranthus indicus com vista em contrariar desordens de imunodeficiência (Indian Journal of Pharmacology, 33, 454-55, (2001)) .

Foi reportado o isolamento de um novo glicósido de sesquiterpeno, o "sfaerantanólido" (" sphaeranthanolide"), a partir das flores de Sphaeranthus indicus. O composto isolado, o "sfaerantanólido", exibia actividade imunoestimulante. (Phytochemistry, 29(8), 2573-76, (1990)). 6 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Foi reportada actividade imunomoduladora de extracto metanólico de cabeças de flores de Sphaeranthus indicus (Ars Pharmaceutica 45:3; 281-91, (2004)). O extracto aquoso obtido de raízes de Sphaeranthus indicus reportado como sendo moderadamente activo na infra-regulação de Propionibacterium acnes induziu produção TNF-α e IL-8. A Sphaeranthus indicus causou uma supressão menor, mas ainda significativa, de espécies de oxigénio reactivas (Phytomedicine, 10(1), 34-38, (2003)).

Tanto quanto sabemos, não existe nenhum relatório de nenhum medicamento contendo extracto de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus para tratamento de desordens inflamatórias. Para ultrapassar os problemas de efeitos secundários da linha de tratamento corrente, tais como indução de alergia, activação de tuberculose latente, mielossupressão, risco acrescido de cancro e doença cardíaca congestiva, associados às composições do estado da técnica, os presentes inventores prepararam uma nova composição herbal eficaz contra a inflamação, possuindo actividade inibidora contra TNF-α, interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8) e a expressão de molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e E-Selectina. As composições da presente invenção podem também ser utilizadas em combinação com pelo menos um outro agente anti-inflamatório.

OBJECTOS DA INVENÇÃO

Um objecto da presente divulgação refere-se a proporcionar uma composição herbal compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extracto de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus como ingrediente activo conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis.

Um outro objecto consiste em proporcionar uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona (composto 1) como ingrediente 7 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ activo conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis, para o tratamento de desordens inflamatórias.

Outro objecto adicional da presente divulgação consiste em proporcionar um método de fabrico das composições.

Um objecto da presente invenção consiste em proporcionar uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1, para utilização no tratamento de desordens mediadas por TNF-α e interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).

Ainda outro objecto adicional da presente invenção consiste em proporcionar uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1, para utilização no tratamento de desordens mediadas pela molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), pela molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e pela E-Selectina.

Um outro objecto da presente divulgação consiste em proporcionar uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1 para utilização no tratamento de desordens inflamatórias.

Ainda um outro objecto da presente divulgação consiste em proporcionar uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1, para tratar desordens inflamatórias mediadas por TNF-α.

Ainda um outro objecto da presente divulgação consiste em proporcionar uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1, para tratar desordens inflamatórias mediadas por interleucinas (IL-1, IL-6, IL—8). 8 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Ainda um outro objecto da presente invenção consiste em proporcionar uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1, para tratar desordens inflamatórias mediadas pela molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), pela molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e pela E-Selectina.

Ainda um outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1 em combinação com pelo menos uma substância bioactiva para obter um efeito sinérgico.

Ainda um outro objectivo da invenção consiste em proporcionar a utilização das referidas composições isoladamente ou em combinação com pelo menos um outro agente anti-inflamatório para tratar desordens inflamatórias incluindo artrite reumatóide.

Outros objectos e âmbito de aplicação adicionais da presente invenção serão evidentes da descrição detalhada que se segue.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição herbal compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extracto de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus como ingrediente activo conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis.

De acordo com outro aspecto da presente divulgação, é proporcionada uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto [1,2-b]furan-2-ona (composto 1) como ingrediente activo conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis, para o tratamento de desordens inflamatórias. 9 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

De acordo com um aspecto adicional da presente divulgação, é proporcionado um método de fabrico das composições.

De acordo com outro aspecto da presente divulgação, é proporcionada uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1 para o tratamento de desordens inflamatórias.

De acordo com outro aspecto da presente divulgação, é proporcionada uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1, para tratar desordens inflamatórias mediadas por TNF-a.

De acordo com outro aspecto da presente divulgação, é proporcionada uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1, para tratar desordens inflamatórias mediadas por interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).

De acordo com outro aspecto da presente divulgação, é proporcionada uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1, para tratar desordens inflamatórias mediadas por molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e E-Selectina.

De acordo com outro aspecto adicional, é proporcionada uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo seleccionado entre o extracto de Sphaeranthus indicus ou o composto 1 em combinação com pelo menos uma substância bioactiva para obter um efeito sinérgico.

De acordo com outro aspecto adicional, é proporcionada uma utilização das composições isoladamente ou em combinação com pelo menos um outro agente anti-inflamatório para tratar desordens inflamatórias incluindo artrite reumatóide. 10 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um perito na especialidade, com base na presente descrição, pode utilizar a presente invenção na sua plenitude. As concretizações especificas que se seguem devem ser entendidas como meramente ilustrativas, e de modo nenhum limitativas do restante da divulgação. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é vulgarmente entendido por uma pessoa competente na matéria a que a invenção pertence. A expressão "desordem inflamatória", como aqui se utiliza, refere-se a uma doença ou a uma condição caracterizadas por inflamação crónica incluindo, mas não se lhes limitando, artrite reumatóide, osteoartrite, artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática, artrite reumatóide refractária, artrite crónica não reumatóide, osteoporose/reabsorção óssea, doença cardíaca coronária, aterosclerose, vasculite, colite ulcerosa, psoríase, doença de Crohn, sindrome da dificuldade respiratória do adulto, síndrome de choque séptico e doença inflamatória do intestino. A expressão "farmaceuticamente aceitável", como aqui se utiliza, significa que o transportador, o diluente, os excipientes e/ou o sal têm que ser compatíveis com os outros ingredientes da formulação, e não prejudiciais para o seu recebedor. A expressão "transportador farmaceuticamente aceitável", como aqui se utiliza, significa um sólido, semi-sólido, diluente, material de encapsulação ou formulação auxiliar de qualquer tipo, inertes, não tóxicos. Alguns exemplos de materiais que podem servir como transportadores farmaceuticamente aceitáveis são os açúcares tais como lactose, glucose e sacarose; os amidos tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; malte; gelatina; talco; bem como outros lubrificantes não tóxicos compatíveis tais como laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, 11 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ agentes de libertação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes; conservantes e antioxidantes podem também estar presentes na composição, de acordo com a opinião do formulador. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz", como aqui se utilize, significa uma quantidade de composto ou composição (e.g., do extracto de Sphaeranthus indicus) suficiente para significativamente induzir uma modificação positiva na condição que se pretende regular ou tratar, mas suficientemente baixa para evitar efeitos secundários, se algum (com uma relação risco/beneficio razoável), no âmbito de uma opinião médica idónea. A quantidade terapeuticamente eficaz do composto ou da composição variará consoante a condição particular que se pretende tratar, com a idade e condição fisica do utilizador final, com a gravidade da condição que se pretende tratar/prevenir, com a duração do tratamento, com a natureza de terapias simultâneas, com o composto ou composição específicos empregues, com o transportador farmaceuticamente aceitável particular utilizado, e com factores similares. Como aqui se utilizam, todas as percentagens são em peso a menos que de outro modo seja especificado. A expressão "marcador bioactivo" é aqui utilizada para definir uma característica (ou um perfil fitoquímico) que está correlacionada com um grau aceitável de actividade farmacêutica. A "dose máxima praticável" é a maior quantidade de um fármaco que um adulto pode tomar com segurança.

Deverá notar-se que, como utilizadas na descrição e reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os respectivos plurais, a menos que o contexto dite claramente de outro modo. "Extracto de Sphaeranthus indicus " ou "um extracto de Sphaeranthus indicus", aqui mencionados, significam uma mistura de compostos presentes na planta Sphaeranthus indicus. Estes compostos são extraídos das cabeças de floração e de frutificação da planta secas utilizando procedimentos de 12 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ extracção bem conhecidos na especialidade (e.g., a utilização de solventes orgânicos tais como álcoois inferiores, ésteres de alquilo, éteres de alquilo, alquilcetonas, clorofórmio, éter de petróleo, hexano e/ou solventes inorgânicos tais como água) . 0 presente processo para a extracção de fitoconstituintes derivados de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus pode ser aumentado de escala para a preparação em larga escala. A expressão "ingrediente activo", como aqui se utiliza, refere-se a "extracto de Sphaeranthus indicus" ou "o composto 1" ou "um extracto enriquecido de Sphaeranthus indicus contendo uma mistura de dois ou mais compostos activos". 0 extracto de Sphaeranthus indicus pode ser normalizado utilizando técnicas convencionais tais como Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) ou Cromatografia em Camada Fina de Alta resolução (HPTLC).

Numa concretização, é proporcionada uma composição herbal compreendendo extracto normalizado de Sphaeranthus indicus conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos marcadores bioactivos podem ser isolados do extracto de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus por purificação cromatográfica em coluna guiada por bioactividade e HPLC preparativa. Os compostos podem ser caracterizados por análise dos dados espectrais. A composição herbal compreende um extracto de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus, compreendendo 2-9% de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona (composto 1), como marcador bioactivo e opcionalmente outros activo(s).

Numa concretização, a divulgação proporciona uma composição compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona 13 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ (composto 1) como ingrediente activo, conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis.

Numa concretização, é proporcionada a utilização da composição compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto [1,2-b]furan-2-ona (composto 1), para o fabrico de um medicamento para o tratamento de desordens inflamatórias. A divulgação refere-se adicionalmente a um método de fabrico de composições úteis para o tratamento de desordens inflamatórias. 0 extracto normalizado de Sphaeranthus indicus é misturado com transportadores farmaceuticamente aceitáveis e formulado em formas de dosagem terapêutica. A dose a administrar diariamente deve ser seleccionada de forma a se adequar ao efeito pretendido.

Numa concretização, a composição herbal compreendendo o extracto normalizado de Sphaeranthus indicus é proporcionada para o tratamento de desordens inflamatórias.

Em outra concretização, a composição compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona (composto 1), conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis, é proporcionada para o tratamento de desordens inflamatórias. 0 composto 1, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno- 3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona, foi isolado do extracto de Sphaeranthus indicus através de um procedimento conhecido no estado da técnica e foi caracterizado por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrometria de Massa. A composição compreendendo o composto 1, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona, composto este que pode também ser obtido a partir de outras fontes de plantas ou pode ser fabricado por métodos de sintese convencionais conhecidos de um perito na especialidade.

Deste modo, a presente divulgação abrange no seu âmbito uma composição farmacêutica compreendendo o composto 1, que 14 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ pode ser obtido de outras fontes, para utilização no tratamento de desordens inflamatórias.

Em ainda outra concretização, é proporcionado um método de fabrico de uma composição farmacêutica compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8, 9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona (composto 1) por mistura do composto 1 com um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis e formulação em formas de dosagem terapêutica. A dose a administrar diariamente deve ser seleccionada de forma a se adequar ao efeito pretendido.

As composições da presente divulgação podem ser administradas oralmente, por exemplo na forma de pílulas, comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas, grânulos, elixires ou xarope. 0 extracto de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus é utilizado para preparar preparações orais contendo 3-70% em peso do extracto, que é completamente misturado numa base convencional como será adiante descrito em detalhe. 0 extracto de cabeças de floração e de frutificação contendo 2-9% (p/p) de composto 1 como marcador bioactivo, é suficiente para se conseguirem os resultados pretendidos. 0 composto 1, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona, é utilizado para preparar preparações orais contendo 3-99% em peso do composto, que é completamente misturado numa base convencional como será adiante descrito em detalhe.

As composições podem ser utilizadas para administração tópica e transdérmica. As composições tópicas úteis na presente invenção envolvem formulações adequadas para aplicação tópica na pele. As composições podem ser formuladas numa ampla variedade de tipos de produtos que incluem, mas não se lhes limitam, loções, cremes, géis, sticks, sprays ou unguentos. O extracto de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus é utilizado para preparar preparações tópicas contendo 1-15% em peso do extracto que é completamente 15 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ misturado numa base convencional como será adiante descrito em detalhe. O extracto de cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus, contendo aproximadamente 2-9% (p/p) de composto 1 como marcador bioactivo, é suficiente para se conseguirem os resultados pretendidos.

Numa concretização, as composições são proporcionadas para o tratamento de desordens inflamatórias mediadas por TNF-α e interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).

Numa concretização, as composições são proporcionadas para o tratamento de desordens inflamatórias mediadas pela molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), pela molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e pela E-Selectina.

Os niveis de dosagem reais do ingrediente activo, "extracto de Sphaeranthus indicus" ou o composto 1, nas composições da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente activo que seja eficaz para se conseguir a resposta terapêutica pretendida para um paciente, uma composição e um modo de administração particulares. 0 nivel de dosagem seleccionado dependerá de uma variedade de factores incluindo a actividade do ingrediente activo particular empregue, "extracto de Sphaeranthus indicus" ou "o composto 1", da via de administração, do momento da administração, da taxa de excreção da composição particular que está a ser empregue, da duração do tratamento, da utilização em combinação com os outros extractos, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e historial médico anterior do paciente que está a ser tratado, e de factores similares bem conhecidos nas especialidades médicas.

Em outra concretização, a invenção proporciona uma composição compreendendo o ingrediente activo, "extracto de Sphaeranthus indicus" ou o composto 1, em combinação com pelo menos um outro extracto herbal exibindo actividade anti-inflamatória, para obter um efeito sinérgico. Esta outra planta pode ser seleccionada entre plantas tais como Curcuma longa e Zingiber officinale. 16 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Em ainda outra concretização, a composição compreende ainda o ingrediente activo, "extracto de Sphaeranthus indicus" ou o composto 1, em combinação com pelo menos uma substância bioactiva para obter um efeito sinérgico.

Em ainda outra concretização, a composição da presente invenção compreendendo o ingrediente activo, "extracto de Sphaeranthus indicus" ou o composto 1, pode opcionalmente conter pelo menos um outro agente anti-inflamatório ou pode também ser utilizada em combinação com um agente anti-inf lamatório convencional. 0 agente anti-inflamatório pode ser seleccionado de entre esteróides tais como prednisolona, hidrocortisona; fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (ARMD) tais como metotrexato, sulfasalazina; ou os ΑΙΝΕ tais como naproxeno, diclofenac, ibuprofeno e similares.

Numa concretização, a composição herbal compreendendo o ingrediente activo, "extracto de Sphaeranthus indicus" ou o composto 1 isolado do extracto de Sphaeranthus indicus, é proporcionada para o tratamento de artrite reumatóide.

Outra concretização da presente divulgação também se refere à actividade inibidora de TNF-α e interleucina (IL-1, IL-6, IL-8) das composições compreendendo o ingrediente activo.

Outra concretização também se refere à inibição da expressão na superfície celular de moléculas de adesão tais como a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), a molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e a E-Selectina, pelas composições compreendendo o ingrediente activo.

As composições da presente divulgação são adequadas para utilização no tratamento de ambas as formas, aguda e crónica, de desordens inflamatórias mediadas por TNF-α, interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8) e ICAM-1, VCAM-1 e E-Selectina, em particular, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumatóide refractária, artrite crónica não reumatóide, osteoporose/ reabsorção óssea, doença cardíaca coronária, vasculite, colite ulcerosa, psoríase, sindrome da dificuldade respiratória do adulto, Doença de Alzheimer, em seres humanos. Igualmente, as 17 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ composições da presente invenção podem ser utilizadas para tratamento de inflamação em doenças como a doença inflamatória do intestino, a doença de Crohn, a sindrome de choque séptico, a aterosclerose, e várias doenças auto-imune entre outras condições clinicas. A presente divulgação refere-se também a um método de tratamento de desordens inflamatórias compreendendo a administração das composições selectivamente por via oral, por aplicação tópica, por aplicação transdérmica.

Os exemplos que se seguem ilustram, mas não limitam, o âmbito da invenção. As pessoas competentes na material deverão entender que a presente discussão é de concretizações apenas exemplificativas, e não se destina a limitar os aspectos mais amplos da presente invenção, aspectos mais amplos estes que são concretizados na construção exemplificativa.

Exemplo 1

Preparação de extracto metanólico de Sphaeranthus indicus.

Pulverizaram-se cabeças de floração e de frutificação de

Sphaeranthus indicus secas (200 g) . Extractou-se o material pulverizado utilizando metanol (2,5 L) por agitação a 60°C durante 3 h. Filtrou-se o extracto sob vácuo. Repetiu-se este processo de extracção mais duas vezes. Combinaram-se e concentraram-se os extractos.

Rendimento: 23,29 g (11,65% p/p).

Verificou-se que o extracto do exemplo 1 contém 6% de composto 1 (descrito no exemplo 4), como estimado por HPTLC.

Exemplo 2

Preparação de extracto em acetato de etilo de Sphaeranthus indicus.

Pulverizaram-se cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus secas (350 g) . Extractou-se o material pulverizado utilizando acetato de etilo (3 L) por agitação a 60°C durante 3 h. Filtrou-se o extracto sob vácuo. Repetiu-se este processo de extracção mais duas vezes. Combinaram-se e concentraram-se os extractos. 18 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Rendimento: 19 g (9,5% ρ/ρ).

Exemplo 3

Preparação de extracto aquoso de Sphaeranthus indicus.

Pulverizaram-se cabeças de floração e de frutificação de Sphaeranthus indicus secas (200 g). Extractou-se o material pulverizado utilizando água (1,2 L) por agitação a 80°C-90°C durante 3 h. Filtrou-se o extracto sob vácuo. Repetiu-se este processo de extracção. Combinaram-se e concentraram-se os extractos para remover a água. Adicionalmente secou-se o extracto bruto por criodessecagem.

Rendimento: 21 g (10,5% p/p).

Exemplo 4

Isolamento de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno- 3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona (composto 1).

Purificou-se o extracto metanólico (32 g), preparado pelo método descrito no Exemplo 1, por cromatografia em coluna (silica-gel, metanol em clorofórmio). A purificação final foi conseguida por HPLC preparativa (coluna de silica, hexano:isopropanol, 95:5) para obter o composto em titulo. XH RMN (CDC13, 500 MHz) : δ 1,085 (3H, CH3) , 4, 997 (1 H, s), 5,801 (1 H, s), 6,270 (1 H, s); MS: m/e (ES) 248 (M+). O composto foi caracterizado por comparação dos dados espectrais obtidos com a literatura reportada (Indian Journal of Chemistry, Vol. 25B, 233-238, (1986); J. Chem Soc. Perkin

Trans. 1 :(2), 157-160, (1988); J. Chem. Research (M) , 0501-0509, 1989) .

RESULTADOS FARMACOLÓGICOS ensaios A eficácia dos presentes extractos de plantas, compostos isolados por purificação do extracto e formulações, na inibição da actividade de TNF-α e interleucinas (IL-1, IL-6, e IL-8) foi determinada através de vários 19 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ farmacológicos, bem conhecidos na especialidade e descritos adiante.

Rastreio in vitro para identificar inibidores de TNF-a Exemplo 5

Rastreio primário - Células mononucleares de sangue periférico humano (hPBMC). Mediu-se a produção de TNF-α por lipopolissacáridos (LPS) em hPBMC de acordo com o método descrito por Jansky, L. et al. (Physiol. Res. 52: 593-598, (2003)). Colheu-se sangue de dadores saudáveis para tubos Vacutainer com EDTA de potássio (BD Vacutainer) . Isolaram-se as PBMC utilizando centrifugação em gradiente em solução Histopaque-1077 (Sigma). Suspenderam-se as PBMC isoladas em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco BRL, Pasley, RU) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) (Hyclone, Utah, EUA), 100 U/ml de penicilina (Sigma Chemical Co. St Louis, MO) e 100 pg/ml de estreptomicina (Sigma Chemical Co. St Louis, MO). Ajustou-se a concentração de células para lxlO6 células/ml. A viabilidade determinada por exclusão com corante azul de tripano foi uniformemente ^98%. Adicionou-se a suspensão celular (100 μΐ) aos poços de uma placa de cultura de 96 poços. Após plaqueamento das células, adicionaram-se às células 79 μΐ do meio de cultura e 1 μΐ de oito concentrações diferentes das amostras de teste (concentração final de 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μg/ml) dissolvidas em DMSO (dimetilsulfóxido,

Sigma, MO, EUA). Ajustou-se a concentração final de DMSO a 0,5%. Utilizou-se veiculo (DMSO a 0,5%) como controlo. Utilizou-se rolipram (100, 300 μΜ) como padrão. Incubaram-se as placas durante 30 min a 37°C numa atmosfera de 5% CO2. Finalmente, adicionaram-se 20 μΐ (10 pg/ml) por poço de LPS, (Escherchia coli 0127:B8, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), para obter uma concentração final de 1 pg/ml. Incubaram-se as placas a 3 7°C durante 5 h numa atmosfera de 5% de C02. Para determinar o efeito citotóxico dos extractos de planta, realizou-se o teste de viabilidade celular utilizando reagente MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfonil)-2H-tetrazólio) após 5 h de incubação. Colheram-se os sobrenadantes e ensaiaram-se quanto ao TNF-α por ELISA como descrito pelo fabricante (conjuntos de ELISA OptiEIA, BD Biosciences, Pharmingen). Registou-se a % de inibição. 20 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Avaliou-se a percentagem de citotoxicidade das amostras de teste amostras comparativamente com o controlo.

Os resultados estão resumidos no quadro 1.

Quadro 1: Inibição de TNF-α em células mononucleares de sangue periférico humano

Amostra Cone. (pg/ml) % Inibição de TNF % Toxicidade às 5h Extracto do exemplo 1 0,1 0, 0 0 1 14, 0 0 10 96, 0 7 100 97, 0 0 Extracto do exemplo 2 0,1 0, 0 20 1 34, 0 13 10 97, 0 22 100 97, 0 8 Extracto do exemplo 3 0,1 0, 0 0 1 0,0 11 10 4,0 0 100 96,0 0 Rolipram (μΜ) 100 84, 0 2 300 O O <y> 21

Exemplo 6

Efeito sobre citoquinas pró-inflamatórias libertadas por hPBMC estimuladas com LPS 0 efeito do extracto de planta sobre as citoquinas pró-inflamatórias: TNF-a, interleucina-ΐβ (IL-Ιβ), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8); foi medido utilizando os sobrenadantes gerados no ensaio de rastreio primário. Os níveis destas citoquinas foram estimados por ELISA como descrito pelo fabricante. (conjuntos de ELISA OptiEIA, BD Biosciences, Pharmingen). Os valores da concentração inibitória a 50% (IC50) foram calculados através de um método 21 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ de regressão não linear utilizando software GraphPad (Prism 3.03) .

Quadro 2: Efeito do extracto do exemplo 1 sobre as citoquinas pró-inflamatórias N. 0 Citoquinas Pró-inflamatórias Extracto do exemplo 1, IC5o pg/ml, (hPBMC) 01 TNF -a 5,1 02 IL 1β 4, 9 03 IL-6 26,8 04 IL-8 31,0

Conclusão: verificou-se que o extracto do exemplo 1 inibe citoquinas pró-inflamatórias (TNF-a, IL-Ιβ, IL-6 e IL-8) libertadas por hPBMC estimuladas com LPS.

Exemplo 7

Efeito do composto 1 sobre citoquinas pró-inflamatórias libertadas por hPBMC estimuladas com LPS 0 composto 1 foi obtido utilizando o procedimento do exemplo 4. A avaliação da bioactividade foi realizada seguindo o procedimento do exemplo 6. O efeito do Composto 1 sobre as citoquinas pró-inflamatórias: TNF-α interleucina-1β (IL-Ιβ), interleucina-6 (IL—6) e interleucina-8 (IL-8); foi medido utilizando os sobrenadantes gerados no ensaio de rastreio primário. Os níveis destas citoquinas foram estimados por ELISA como descrito pelo fabricante. (conjunto de ELISA OptiEIA, BD Biosciences, Pharmingen). Os valores da concentração inibitória a 50% (IC5o) foram calculados através de um método de regressão não linear utilizando software GraphPad (Prism 3.03) . Os resultados estão resumidos no quadro 3. 22 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 3: Efeito do Composto 1 sobre as citoquinas pró-inflamatórias N. 0 Citoquinas Pró-inflamatórias Composto 1, IC5o μΜ, (hPBMC) 01 TNF -a 0, 7 02 IL 1β 0,4 03 IL-6 1,6 04 IL-8 8,9

Conclusão: verificou-se que o Composto 1 inibe citoquinas pró-inflamatórias (TNF-a, IL-Ιβ, IL-6 e IL-8) libertadas por hPBMC estimuladas com LPS.

Exemplo 8

Efeito sobre citoquinas pró-inflamatórias produzidas por células sinoviais obtidas de um paciente de AR A produção de citoquinas por células sinoviais obtidas de um paciente com artrite reumatóide (AR) submetido a cirurgia de substituição do joelho foi medida de acordo com o método descrito por Brennan, F.M. et al. (The Lancet, July 29: 244-247, (1989)). 0 tecido da membrana sinovial foi digerido em DMEM (Gibco) contendo 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina, 4 mg/ml de colagenase tipo I (Worthington), 1,5 pg/ml de ADNase tipo I (Sigma) e 15 U/ml de heparina e incubado a 37°C durante 3 horas. Após incubação, o tecido digerido foi filtrado através de uma membrana de 70 pm e as células foram lavadas 3 vezes com meio completo (DMEM com 10% de FBS) . As células sinoviais foram cultivadas a 1 x 106 células/ml na presença/ausência da amostra de teste durante 10 horas. Os sobrenadantes foram colhidos por centrifugação e os níveis das citoquinas (TNF-a, IL-Ιβ, IL-6, IL-8) foram medidos por ELISA. Para determinar o efeito citotóxico dos extractos de planta, realizou-se o teste de viabilidade celular utilizando o reagente MTS. Os valores da concentração inibitória a 50% (IC5o) foram calculados através de um método de regressão não linear utilizando software GraphPad (Prism 3.03). 23 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Conclusão: Verificou-se que o extracto do exemplo 1 inibe citoquinas pró-inflamatórias (TNF-a, IL-Ιβ, IL-6 e IL-8) produzidas por células sinoviais obtidas de um paciente com AR.

Exemplo 9

Efeito do composto 1 sobre citoquinas pró-inflamatórias produzidas por células sinoviais obtidas de um paciente com AR. 0 efeito sobre citoquinas pró-inflamatórias produzidas por células sinoviais obtidas de um paciente com AR foi estudado para o composto 1 como descrito pelo procedimento do exemplo 8.

Os resultados foram resumidos no quadro 4.

Quadro 4: Efeito do composto 1 sobre citoquinas pró-inflamatórias produzidas por células sinoviais. N. 0 Citoquinas Pró-inflamatórias Composto 1, IC50 (μΜ) , Sinovial 01 TNF-a O > co 03 IL-6 1,4 04 IL-8 10,9

Conclusão: Verificou-se que o Composto 1 inibe citoquinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-8) produzidas por células sinoviais obtidas de um paciente com AR.

Exemplo 10 ELISA Celular para expressão de moléculas de adesão 0 ensaio foi desenhado com base na referência Transplantatíon, Vol 63(5), 759-764, 1997 com modificações.

Cultura Celular e Reagentes:

As células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVEC) foram obtidas de Cascade Biologics e foram mantidas em M200 (Cascade Biologics, Portland, OR) suplementado com suplemento de crescimento de baixo teor de soro (LSGS) a 37°C numa 24 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ incubadora com 5% de CO2. As células U937 (ATCC, Manassas, VA) foram crescidas no meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS (Hyclone, Logan, UT) . O TNFa humano recombinante, os anticorpos contra VCAM-1, ICAM-1 e E-Selectina, foram obtidos de R&D Systems e o LPS foi obtido de Sigma (St. Louis, MO). ELISA Celular para a expressão de moléculas de adesão

As HUVEC foram plaqueadas a 7 x 105 células/poço em placas de 96 poços revestidas com fibronectina. As células foram estimuladas com TNF-a (10 ng/ml) ou LPS (1 pg/ml), 30 min após a adição de composto de teste. Após a estimulação, fixaram-se as células (E-Selectina e ICAM-1) com paraformaldeido em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Bloqueou-se a ligação não especifica com albumina sérica bovina (BSA) a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 h, e incubaram-se as células com anticorpo primário durante 2 h. Para a detecção de VCAM-1, as células foram bloqueadas, incubadas com anticorpo primário durante a noite, e depois fixadas. Lavaram-se as células com BSA a 0,1% em PBS, e incubaram-se com anticorpo (Ab) conjugado com peroxidase para imunoglobulina G (IgG) de ratinho adicionado durante 90 min. Após lavagem, sete vezes, adicionou-se substrato liquido 3,3'5,5'-tetrametilbenzidina (substrato TMB) e determinou-se a densidade óptica de cada poço a 450 nm utilizando um leitor de placas de microtítulo (Spectramax, Molecular Devices, CA). Utilizou-se BAY 11-7082 [(E)-3-(4- metilfenilsulfonil)-2-propenonitrilo] como padrão e DMSO como controlo de veículo. É avaliada a percentagem de inibição da amostra de teste comparativamente com o controlo. Os valores da concentração inibitória a 50% (IC50) para cada amostra comparativamente com o controlo são determinadas através de um método de regressão não linear. Os resultados estão resumidos no quadro 5.

Quadro 5: ELISA Celular para a expressão de moléculas de adesão para o extracto do exemplo 1 e o composto 1

Extracto do exemplo 1 IC50 (pg/ml) Composto 1 IC50 (μΜ) ICAM-1 7,6 0,52 VCAM-1 6,4 O > E-Selectina 3,5 0,2 25 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Conclusão: 0 extracto do exemplo 1 e o composto 1 reduziram de modo dependente da dose a expressão na superfície induzida por TNF-α de moléculas de adesão celular endoteliais tais como ICAM-1, VCAM-1 e E-Selectina.

Exemplo 11

Adesão de Células Mononucleares THP-1 a Monocamadas de HUVEC

Estudos de adesão foram realizados com a linha celular promonocítica THP-1, que foi estabelecida como um modelo útil para monócitos em estudos de adesão em Circ. Res., 97, 236- 243, 2005, com modificações. As células THP-1 foram lavadas duas vezes com meio de marcação (M200 mais LSGS) . As células THP-1 (6xl05 células por ml) foram marcadas com 10 pg/ml de acetoximetiléster de bis-carboxietil-carboxifluoresceina (uma sonda fluorescente, BCECF-AM; Sigma) durante 30 min à TA. Após extinção com BSA a 0,1%, ressuspendeu-se a pelete em meio de marcação. Para avaliar a adesão de monócitos, trataram-se monocamadas de HUVEC com TNF-α (1 ng/ml) na presença ou na ausência de várias concentrações de amostra de teste. Removeu-se o meio, lavou-se e adicionaram-se as células marcadas com THP-1 aos poços (6xl04 células por poço) e incubou-se durante 10 minutos à TA no escuro. Após co-incubação, lavaram-se os poços, encheram-se com tampão de lise (Triton-X a 0,1% em tampão Tris 1,5M) e incubaram-se durante 30 min. Mediu-se a fluorescência utilizando um leitor de fluorescência (PolarStar Óptima, BMG Labtech) com um pico de excitação de 485 nm e um pico de emissão de 520 nm. Os valores são médias + EPM, representando dados de adesão fluorescente.

Utilizou-se BAY 11-7082 [(E)-3-(4-metilfenilsulfonil)-2- propenonitrilo] como padrão e DMSO como controlo de veículo. Os resultados estão resumidos no quadro 6. 26 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 6: Adesão de células mononucleares THP-1 a monocamadas de HUVEC para extracto do exemplo 1 e composto 1 N. 0 Amostra de Teste Concentração Intensidade de Fluorescência Ν.0 de vezes relativamente ao controlo 01 Extracto do 1 (pg/ml) 39768 23 exemplo 1 3 (pg/ml) 35302 21 10 (pg/ml) 13183 6 30 (pg/ml) 10236 5 02 Composto 1 0,1 (μΜ) 33421 13 0,3 (μΜ) 34024 13 1 (μΜ) 10195 4 3 (μΜ) 5728 2 03 BAY 11-7082 0,5 (μΜ) 18442 10 1 (μΜ) 14271 8 04 Controlo de DMSO 2544 1 não estimulado Controlo de DMSO 30791 18 estimulado

Conclusão: 0 extracto do exemplo 1 e o composto 1 inibiram a adesão de células THP-1 monocíticas estimulada por TNF-α a HUVEC a 10 pg/ml e 1 μΜ, respectivamente.

Como estes compostos inibem a expressão na superfície celular de moléculas de adesão em HUVEC assim como a adesão de monócitos às HUVEC, podem deste modo dificultar a migração de leucócitos, que é um evento chave em doenças inflamatórias crónicas e podem-se provar benéficos em numerosas desordens inflamatórias. 27 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Estudos in vivo Exemplo 12

Libertação de factor de necrose tumoral (TNF)-a induzida por lipopolissacárido (LPS) em ratinhos BALB/c.

Seguiu-se o protocolo descrito por Fukuda T. et al. (Eur. J. Pharmacol.r 391: 317-320, (2000)). Dividiram-se ratinhos BALB/c em grupos de dez. A amostra de teste, suspensa em

Tween 80 e carboximetilcelulose (CMC) a 0,5%, foi administrada oralmente (p.o.) aos ratinhos. Uma hora mais tarde, LPS dissolvido em solução salina estéril, isenta de pirogénios, foi administrado i.p. na dose de 1 mg/kg. 0 grupo de controlo negative recebeu solução salina sob a forma de uma injecção i.p., enquanto todos os outros grupos receberam LPS.

Utilizou-se rolipram (30 mg/kg, p.o.) como fármaco padrão. Uma hora e meio mais tarde, sob anestesia com uretano (1,5 g/kg, i.p.) colheu-se sangue da artéria abdominal utilizando uma seringa de 1 ml lavada com heparina (500 IU/ml). Utilizou-se heparina (5 μΐ) como anticoagulante nos tubos de colheita de sangue. Separou-se o plasma por centrifugação a 10 000 rpm à temperatura ambiente, dividiu-se em alíquotas e armazenou-se a -70°C até à análise. Os níveis de TNF-α nas amostras de sangue foram ensaiados utilizando um ELISA e calculou-se a percentagem de inibição da libertação de TNF-a comparativamente com o grupo de controlo. Os resultados estão resumidos no quadro 7.

Quadro 7: Libertação de factor de necrose tumoral (TNF)-oí induzida por lipopolissacárido (LPS) em ratinhos BALB/c para extracto do exemplo 1 e para composto 1. N. ° Amostra de teste Dose mg/kg % de inibição 01 Extracto do exemplo 1 100 43,21±14,52 02 Composto 1 10 28,69±13,71 30 39,98±10,32 100 87,10±3,67

Conclusão: O extracto do exemplo 1 e o composto 1 inibem a libertação de TNF-α em ratinhos BALB/c. 28 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Exemplo 13

Artrite induzida por colagénio (AIC) em ratinhos DBA/1J

Ratinhos DBA/1J machos, de 8 - 10 semanas de idade, foram imunizados com 200 yg de colagénio tipo II sob a forma de uma emulsão em Adjuvante de Freund Completo, através de uma injecção intradérmica na base da cauda. Vinte e um dias mais tarde administrou-se aos ratinhos um reforço de 100 yg de colagénio tipo II. Um conjunto de ratinhos naive foi também mantido paralelamente.

Do Dia 23 em diante, os ratinhos foram avaliados quanto inicio de artrite reumatóide utilizando o índice Articular como parâmetro. Os ratinhos com uma pontuação mínima de 2 na pata traseira foram introduzidos no estudo. Administrou-se extracto do exemplo 1 numa dose de 400 m.p.k (miligramas por quilograma de peso corporal) por via oral duas vezes por dia durante 12 dias. O Composto 1 foi administrado numa dose de 50 m.p.k. e 100 m.p.k. por via oral duas vezes por dia durante 12 dias. Utilizou-se Enbrel (3 mg/kg) como padrão e foi dado por via subcutânea uma vez por dia. Registaram-se diariamente o volume da pata e o índice articular. Os dados foram analisados quanto a significância estatística.

No término da experiência as patas dos ratinhos foram processadas para avaliação histopatológica.

Os dados para a redução na espessura das patas e redução no índice articular estão resumidos no quadro 8. 29 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 8: Eficácia de extracto do exemplo 1 e composto 1 no modelo de AIC

Amostra de teste Parâmetros AIC Dose mg/kg Redução na espessura da pata Redução no índice articular Extracto do exemplo 1 400 Estatisticamente significativa relativamente ao controlo para um nível de significância de 0,01 Estatisticamente significativa relativamente ao controlo para um nível de significância entre 0,05 e 0,06 Composto 1 50 Estatisticamente significativa relativamente ao controlo para um nível de significância de 0,05 Estatisticamente significativa relativamente ao controlo para um nível de significância de 0, 05 100 Estatisticamente significativa relativamente ao controlo para um nível de significância de 0,01 Estatisticamente significativa relativamente ao controlo para um nível de significância de 0, 01

Análise histopatológica:

Foi avaliado o efeito benéfico do extracto do exemplo 1 e do composto 1 sobre a patologia de ratinhos DBA/1J artríticos (AIC). Foi realizada uma microscopia após coloração com hematoxilina e Eosina, assim como coloração com Safranina 0, de articulações sinoviais. A análise histopatológica mostrou que tanto o extracto do exemplo 1 como o composto 1 exerceram efeitos benéficos em termos de redução da destruição da cartilagem, da destruição do osso e da sinovite, comparativamente com o grupo tratado com veiculo.

Conclusão: Tanto o extracto do exemplo 1 como o AIC de composto 1 exerceram efeitos benéficos no modelo artrite 30 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ ESTUDOS DE TOXICIDADE Exemplo 14

Toxicidade oral aguda O extracto do exemplo 1 foi testado quanto a toxicidade oral aguda para ratos Sprague Dawley cumprindo as orientações em "Schedule Y" de Drugs and Cosmetics Act, 1940. (índia) O extracto do exemplo 1, suspenso em Tween 80 a 0,5% em água, foi administrado oralmente por tubo endogástrico numa única dose a um grupo de cinco ratos machos e cinco fêmeas na dose máxima praticável de 2000 mg/kg de peso corporal.

Observaram-se os animais quanto a mortalidade e sinais de intoxicação durante um período de 14 dias após a dosagem e registaram-se também os seus pesos corporais. Foi realizada necropsia em todos os ratos após terminação do estudo.

Conclusão: No presente estudo, a administração oral única de extracto do exemplo 1 a ratos Sprague Dawley na dose máxima praticável de 2000 mg/kg, não causou qualquer mortalidade nos ratos tratados. A dose letal mediana (LD50) de extracto do exemplo 1 após administração oral numa dose única a ratos Sprague Dawley, tanto machos como fêmeas, verificou-se ser superior a 2000 mg/kg de peso corporal.

Exemplo 15

Toxicidade oral subaguda 0 estudo da toxicidade oral subaguda (28 Dias) do extracto do exemplo 1 em ratos Sprague Dawley foi realizado cumprindo as orientações em "Schedule Y" de Drugs and Cosmetics Act, 1940. (índia)

Administraram-se a grupos de seis ratos Sprague Dawley machos e seis fêmeas, diariamente, doses de 0, 250, 500 ou 1000 mg/kg de peso corporal de extracto do exemplo 1 por tubo endogástrico oral durante 28 dias e sacrificaram-se os ratos no 29.° dia para avaliar a sua toxicidade. Examinaram-se os ratos diariamente quanto a sinais de toxicidade. Registaram-se 31 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ ο peso corporal e ο consume de alimentos para os ratos individuais durante o período experimental conjuntamente com todas as incidências de mortalidade e sinais de falta de saúde. Realizaram-se investigações laboratoriais em sangue no término do estudo.

Todos os animais, quando sacrificados no término, foram submetidos a uma necropsia completa e registaram-se os pesos de determinados órgãos. A avaliação histopatológica foi realizada em todos os tecidos enumerados no protocolo em todos os animais dos grupos de controlo e de dosagem elevada.

Todos os animais que receberam o extracto do exemplo 1 em, e até, uma dose de 1000 mg/kg sobreviveram ao período de tratamento. Não foi observado nenhum sinal clínico de toxicidade em nenhum dos animais tratados. Os dados de ganho de peso corporal e ingestão de alimento não indicaram efeito adverso devido ao artigo de teste em, e até, uma dose de 1000 mg/kg.

Conclusão: Com base nas verificações deste estudo verificou-se que o nivel de efeitos adversos não observáveis (NOAEL) do extracto do exemplo 1 em ratos, após administração oral durante 28 dias, é superior a 1000 mg/kg de peso corporal. FORMULAÇÕES Exemplo 16

Preparação de cápsula

Procedimento geral: os ingredientes 01 a 05 foram pesados numa quantidade especificada e transferidos para uma misturadora adequada. Os conteúdos foram bem misturados e os ingredientes 09, 10 & 11 foram adicionados e continuou-se a mistura. A esta mistura foram adicionados os ingredientes 06, 07 & 08 e a massa foi misturada durante 30-45 minutos. A mistura foi passada através de um peneiro de 40 mesh, e foi utilizada para enchimento em cápsulas. 32 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 9: Formulação de cápsula de Sphaeranthus indicus Cada cápsula contém N. 0 INGREDIENTE QUANTIDADE % P/P 01 Extracto do Exemplo 1 69, 72 02 Metilparabeno de sódio 0,39 03 Propilparabeno de sódio 0, 13 04 Bromerol 0, 18 05 Benzoato de sódio 0,39 06 Talco 2, 61 07 Estearato de magnésio 1, 74 08 Aerosil 0, 87 09 Amido-glicolato de sódio 2, 18 10 Lactose 8, 72 11 Fosfato de cálcio dibásico 13, 07

Exemplo 17

Preparação de comprimido

Procedimento geral: os ingredientes 01 a 05 foram pesados numa quantidade especificada e transferidos para uma misturadora adequada. Adicionou-se o ingrediente 13 e a massa húmida foi bem misturada. Adicionaram-se-lhe os ingredientes 09, 10, 11 & 12 e a mistura continuou até se obter uma massa homogeneizada. Esta massa húmida foi passada através de um peneiro de 16 mesh e os grânulos húmidos foram secos a 70°C±5°C. Os ingredientes 06, 07 & 08 foram adicionados aos grânulos anteriores e a massa foi misturada durante 30-45 minutos. A mistura foi então passada através de um peneiro de 40 mesh e os comprimidos prensados utilizando um punção adequado. 33 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 10: Formulação de comprimido de Sphaeranthus indicus Cada comprimido contém N. 0 INGREDIENTE QUANTIDADE % P/P 01 Extracto do Exemplo 1 66,53 02 Metilparabeno de sódio 0,37 03 Propilparabeno de sódio 0,12 04 Bromerol 0,17 05 Benzoato de sódio 0,37 06 Talco 2,50 07 Estearato de magnésio 1,66 08 Aerosil 0, 83 09 Amido-glicolato de sódio 2,50 10 Lactose 8, 32 11 Fosfato de cálcio dibásico 12, 47 12 Amido 4, 16 13 Isopropanol * * apenas para granulação

Exemplo 18

Preparação de xarope Procedimento geral O ingrediente 01 foi pesado e adicionou-se-lhe o ingrediente 15 sob agitação continua. Adicionaram-se-lhes quantidades pesadas dos ingredientes 03, 04, 05, 06, 08, 09, 10, 11, 12 e 14 com agitação continua para dissolução. Os ingredientes 02 e 13 foram pesados e dissolvidos no ingrediente 07. Adicionou-se água purificada para ajustar o volume para 10 ml. A solução obtida foi filtrada através de um filtro-prensa / pano de nylon. 34 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 11: Formulação de xarope de Sphaeranthus indicus Cada 10 ml de xarope contém N. 0 INGREDIENTE QUANTIDADE % P/P 01 Extracto do Exemplo 1 4 02 Mentha piperita em pó 0, 025 03 Mel 0,25 04 Açúcar 50 05 Solução de sorbitol a 70% 5 06 Glucose liquida 10 07 Propilenoglicol 5 08 Mono-hidrato de ácido cítrico 0,5 09 Metilparabeno de sódio 0,2 10 Propilparabeno de sódio 0,02 11 Benzoato de sódio 0,2 12 Bronopol 0, 02 13 Aromatizante de meta fresca (Cool mint 'S') 0,25 14 Corante caramelo de açúcar 0, 75 15 Água purificada q.s para 10 ml

Exemplo 19

Preparação de formulação de creme Procedimento geral O ingrediente 01 foi pesado e suspenso no ingrediente 17. Os ingredientes 02 a 07 foram fundidos. Os ingredientes 08, 09, 10, 11, 13 e 14 foram pesados e misturados com parte de 18. O ingrediente 12 foi pesado e adicionado à parte restante do ingrediente 18 e foi misturado com os ingredientes 15 e 16. Os conteúdos de todas as etapas foram misturados a 55°C e homogeneizados, deixados arrefecer e embalados num tubo adequado. 35 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 12: Formulação de Creme de Sphaeranthus indicus Cada 100 g de creme contém N. 0 INGREDIENTE QUANTIDADE % P/P 01 Extracto do Exemplo 1 05, 00 02 Álcool cetoestearilico - 12,0 g 12,00 03 Cetomacragol - 1000 03,00 04 Mono-oleato de sorbitano 02,00 05 Monoestearato de glicerol S.E. 03, 00 06 Miristato de isopropilo 02,50 07 Ácido esteárico 02,50 08 Metilparabeno de sódio 00,40 09 Propilparabeno de sódio 00,08 10 Fenoxietanol 00,52 11 EDTA Dissódico 00, 02 12 Carbomer - 940 00, 75 13 Laurilsulfato de sódio 00, 75 14 Simeticona 01, 00 15 Trietanolamina 01,00 16 Propilenoglicol 05, 00 17 Isopropanol 10, 00 18 Água 50, 48

Exemplo 20

Preparação de formulação de gel Procedimento geral 0 ingrediente 01 foi pesado e foi suspenso no ingrediente 06. 0 ingrediente 04 foi dissolvido no ingrediente 07. Os ingredientes 05 e 08 foram misturados. Os ingredientes 02 e 03 foram misturados. A mistura foi bem misturada e foi embalada num tubo adequado. 36 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 13: Formulação de gel de Sphaeranthus indicus Cada 100 g gel contém N. 0 INGREDIENTE QUANTIDADE % P/P 01 Extracto do Exemplo 1 05, 00 02 Hidroxitolueno butilado 00,025 03 Hidroxianisole butilado 00,025 04 Carbopol - 940 02,95 05 Polietilenoglicol-400 30,00 06 Isopropanol O O LO o 07 Propilenoglicol 55, 00 08 Mono-oleato de sorbitano 02,00

Exemplo 21

Preparação de formulação de unguento Procedimento geral

Os ingredientes 02 a 06 foram pesados e fundidos num recipiente adequado. O ingrediente 01 foi-lhes adicionado. Os ingredientes 07 e 08 foram adicionados a esta mistura. Os conteúdos foram bem misturados e embalados num tubo adequado.

Quadro 14: Formulação de unguento de Sphaeranthus indicus Cada 100 g de unguento contém N. ° INGREDIENTE QUANTIDADE % P/P 01 Extracto do Exemplo 1 5, 00 02 Cera branca de abelha 15, 00 03 Parafina dura 25, 00 04 Cera microcristalina 15, 00 05 Parafina branca mole 30, 00 06 Parafina liquida leve 09, 95 07 Hidroxitolueno butilado 0,025 08 Hidroxianisole butilado 0,025 37 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Exemplo 22

Preparação de comprimido Procedimento geral

Os ingredientes 01 e 02 foram pesados separadamente e passados num peneiro de 20 mesh e misturados. Os ingredientes 03 a 07 foram pesados e passados num peneiro de 40 mesh. Os ingredientes 03, 04, 05 e 07 foram misturados e a esta mistura de ingredientes adicionaram-se 01 e 02. A esta mistura, adicionou-se o ingrediente 06 e misturaram-se. A mistura lubrificada obtida foi comprimida com ferramenta mecânica adequada.

Quadro 15: Formulação de comprimido de composto 1 Cada comprimido contém N. 0 Ingredientes Quantidade % p/p 01 Composto 1 58,33 02 Celulose microcristalina 35,97 03 Talco 2,50 04 Amido-glicolato de sódio 1,60 05 Dióxido de silício coloidal 0,80 06 Estearato de magnésio 0,50 07 Corante amarelo de quinolina 0,30

Exemplo 23

Preparação de comprimido Procedimento geral

Os ingredientes 01 e 02 foram pesados separadamente e passados num peneiro de 20 mesh. O ingrediente 04 foi dissolvido no ingrediente 08 com agitação. A mistura anterior foi granulada utilizando solução aglutinante. A massa húmida foi passada através de um peneiro adequado. A massa peneirada foi seca à temperatura ambiente (25°C) e em seguida a cerca de 40 °C. A massa seca foi passada num peneiro adequado. Os ingredientes 03, 05 e 07 foram passados separadamente num peneiro de 40 mesh e misturados. Adicionaram-se a esta massa seca e misturaram-se. A esta mistura adicionou-se o ingrediente 06 e a mistura lubrificada foi comprimida com ferramenta mecânica adequada. 38 ΕΡ 1 931 366/ΡΤ

Quadro 16: Formulação de comprimido de composto 1 Cada comprimido contém N. 0 Ingredientes Quantidade % p/p 01 Composto 1 61,40 02 Mono-hidrato de lactose 35, 15 03 Croscarmelose de sódio 1,40 04 Polivinilpirrolidona 0, 85 05 Dióxido de silício coloidal 0,35 06 Estearato de magnésio 0,50 07 Corante amarelo de quinolina 0,35 08 Álcool isopropílico Quantidade suficiente

Exemplo 24

Preparação de cápsula Procedimento geral

Os ingredientes 01 e 02 foram pesados separadamente e passados num peneiro de 20 mesh e misturados. O ingrediente 03 foi pesado e passado num peneiro de 40 mesh. Todos os ingredientes foram misturados e lubrificados utilizando o ingrediente 04. A mistura foi inserida numa cápsula de gelatina dura vazia utilizando ferramentas mecânicas adequadas.

Quadro 17: Formulação de cápsula de composto 1 Cada cápsula contém N. 0 Ingredientes Quantidade % p/p 01 Composto 1 98,59 02 Celulose microcristalina 0, 75 03 Dióxido de silício coloidal 0, 47 04 Estearato de magnésio 0,19

Lisboa, 2013-08-29

Claims (13)

1. ΕΡ 1 931 366/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória mediada por TNF-α, interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8) e molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e E-Selectina, em que a referida composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extracto de cabeças de floração e de frutificação da planta Sphaeranthus indicus como inqrediente activo conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
2. 2. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com a reivindicação 1, em que o extracto de Sphaeranthus indicus contém 3a-hidroxi-5a, 9-dimeti1-3-metileno-3a,4,5,5a,6, 7,8, 9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2 —b]furan-2-ona (composto 1) como marcador bioactivo.
3. 3. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com a reivindicação 2, em que o extracto de Sphaeranthus indicus contém 2-9% do composto 1.
4. 4. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória mediada por TNF-α, interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8) e molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e E-Selectina, em que a referida composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octa-hidro-3H-nafto[1,2-b]furan-2-ona (composto 1) como ingrediente activo conjuntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
5. 5. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a referida composição é formulada para administração oral, tópica ou transdérmica.
6. 6. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a desordem inflamatória é seleccionada do grupo que consiste em doença inflamatória do ΕΡ 1 931 366/ΡΤ 2/3 intestino, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumatóide refractária, artrite crónica não reumatóide, osteoporose/ reabsorção óssea, doença cardiaca coronária, aterosclerose, vasculite, colite ulcerosa, psoriase e sindrome da dificuldade respiratória do adulto.
7. 7. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a desordem inflamatória é artrite reumatóide.
8. 8. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a desordem inflamatória é a doença inflamatória do intestino.
9. 9. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a desordem inflamatória é colite ulcerosa.
10. 10. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a desordem inflamatória é aterosclerose.
11. 11. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a desordem inflamatória é psoriase.
12. 12. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo ainda pelo menos um agente anti-inflamatório.
13. 13. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de uma desordem inflamatória tal como reivindicada na reivindicação 12 em que o agente anti-inflamatório é seleccionado de entre prednisolona, hidrocortisona, ΕΡ 1 931 366/ΡΤ 3/3 ou metotrexato, sulfasalazina, naproxeno, diclofenac ibuprofeno. Lisboa, 2013-08-29