BRPI0616724A2 - composição herbal para distúrbios inflamatórios - Google Patents

Abstract

Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios sendo uma invenção que refere-se a uma nova composição herbal compreendendo um extrato de cabeças de flores e frutas da planta, Sphaeranthus indicus. O extrato de Sphaeranthus indicus contém um composto, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-n afto[1,2-b]furan-2-ona(7-Hidroxi-4,11(13)-eudesmadien-12,6-olida) (composto 1) como marcador bioativo. A invenção também se refere a uma composição compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-n afto[1,2-b]furan-2-ona (composto 1) como componente ativo. A invenção também se refere a métodos de produção das composições. A invenção também se refere a métodos de administração das composições a um indivíduo com necessidade de tratamento para um distúrbio inflamatório. A invenção também à atividade inibitória do fator-<244> de necrose tumoral (TNF-<244>) e de interleucina 1 (ICAM-1), das composições. A invenção também se refere à inibição da expressão da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), da molécula de adesão celular vascular (VCAM-1), e E-selectina pelas composições. As composições podem opcionalmente conter pelo menos um agente antiinflamatório ou podem ser usadas em combinação com pelo menos um agente antiinflamatório.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ComposiçãoHerbal para Distúrbios Inflamatórios".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma nova composição herbalcompreendendo um extrato de cabeças de flores e frutas de umaplanta, Sphaeranthus indicus. A presente invenção refere-se aindaa uma composição herbal contendo um extrato obtido das cabeçasde flores e frutas de Sphaeranthus indicus, compreendendo umcomposto, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (7-Hidroxi-4,11(13)-eudesmadien-12,6-olida) (composto 1) como marcador bioativo, eopcionalmente outros ativos para o tratamento eficaz de distúrbiosinflamatórios. A presente invenção também se refere a umacomposição farmacêutica compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (composto 1) como componente ativo e carreadoresfarmaceuticamente aceitáveis, para uso no tratamento de distúrbiosinflamatórios. A presente invenção também se refere a um métodode produção das composições. As composições da presenteinvenção são adaptadas para o tratamento de distúrbiosinflamatórios. A invenção também se refere à atividade inibitóriado fator-α de necrose tumoral (TNF-α) e de interleucina (IL-1, IL-6, IL-8) das composições. A presente invenção também se refere àinibição da expressão da molécula de adesão intercelular (ICAM-1), molécula de adesão celular vascular 1. (VCAM-1), e E-selectinapelas composições.

A invenção também descreve métodos de administração dascomposições para o tratamento de distúrbios inflamatórios.Opcionalmente, o extrato ou a composição compreendendo oreferido extrato ou a composição compreendendo o composto 1pode ser usado em combinação com pelo menos um outro agenteantiinflamatório.

Fundamentos da Invenção

A inflamação desempenha um papel fundamental nas defesas dohospedeiro e na progressão de doenças imuno-mediadas. Aresposta inflamatória tem início em resposta a uma lesão (porexemplo trauma, isquemia, e partículas estranhas) e à infecção(por exemplo infecção bacteriana ou viral) por múltiplos eventos,que incluem mediadores químicos (por exemplo citocinas eprostaglandinas) e células inflamatórias (por exemplo leucócitos).Ela é caracterizada por fluxo sangüíneo aumentado para o tecido,causando pirexia, eritema, endurecimento e dor.Uma interação bem equilibrada e delicada entre os elementosimunes humorais e celulares na resposta inflamatória permite aeliminação de agentes nocivos e o início da restauração do tecidodanificado. Quando esta interação delicadamente equilibrada érompida, a resposta inflamatória pode resultar em danoconsiderável ao tecido normal e pode ser mais nociva do que oinsulto original que deu início à reação. Nos casos de respostasinflamatórias descontroladas, é necessária uma intervenção clínicapara impedir dano ao tecido e disfunção do órgão. Doenças taiscomo artrite reumatóide, osteoartrite, doença de Crohn, asma,alergias, síndrome do choque séptico, aterosclerose, doença dointestino inflamado entre outras condições clínicas sãocaracterizadas por inflamação crônica.

As citocinas, especialmente IL-Ibj IL-6, IL-8 e TNF-a,desempenham um papel importante no processoinflamatório.

TNF-α, uma citocina pleiotrópica, é produzida principalmente pormacrófagos, mas também pode ser produzido por outros tipos decélulas. O TNF-α demonstra atividades benéficas bem comopatológicas. Ele possui efeitos estimulantes de crescimento epropriedades inibitórias de crescimento, além de ser auto-regulador. As funções benéficas do TNF-α incluem manter ahomeostasia regulando o ritmo circadiano do corpo, produzir umaresposta imune para infecções bacterianas, virais, fungicas eparasitárias, substituir ou remodelar o tecido danificadoestimulando o crescimento de fibroblastos e como o nome sugere,combater certos tumores..Embora o TNF-α desempenhe um papel crítico emrespostas imunes congênitas e adquiridas, a produçãoinadequada de TNF-α pode produzir alteraçõespatológicas resultando em inflamação crônica e dano aotecido. Foi mostrado que o TNF-α desempenha um papelcrucial na patogênese de muitas doenças inflamatóriascrônicas tais como doença do intestino inflamado, artritereumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática,osteoartrite, artrite reumatóide refratária, artrite não-reumatóide crônica, osteoporose/reabsorção óssea, doençacardíaca coronariana, vasculite, colite ulcerativa,psoríase, síndrome da angústia respiratória do adulto,diabetes, distúrbios de hipersensibilidade de pele do tiporetardado e mal de Alzheimer.

A interleucina-1 (IL-I) é uma parte importante do sistemaimune congênito, que regula funções do sistema imuneadaptativo. O equilíbrio entre IL-I e antagonista dereceptores de IL-I (IL-Ira) em tecidos locais influencia opossível desenvolvimento de uma doença inflamatória edo dano estrutural resultante. Além da presença de umaquantidade excessiva de IL-1, distúrbios inflamatórios eautoimunes podem ser desenvolvidos nas articulações,nos pulmões, no trato gastrointestinal, no sistema nervosocentral (SNC) ou nos vasos sangüíneos.

Entre vários distúrbios inflamatórios, a artrite reumatóide(RA) é um distúrbio autoimune. A RA é uma doençainflamatória articular sistêmica crônica de etiologiadesconhecida. Na RA,. o revestimento sinovialnormalmente fino das articulações é substituído por umtecido de fibrocolagenase invasivo, altamentevascularizado e inflamatório (pano), que é destrutivotanto para a cartilagem como para o osso. As áreas quepodem ser afetadas incluem as articulações das mãos,punhos, pescoço, mandíbula, cotovelos, joelhos, pé etornozelos. A destruição da cartilagem na RA estáassociada a citocinas aberrantes e à expressão do fator decrescimento nas articulações afetas.

Duas citocinas clinicamente importantes liberadas nasinóvia são IL-Ib e TNF-α. O TNF-a pode supra-regularsua própria expressão assim como facilitar a expressão deoutros genes envolvidos em RA, inclusive IL-lb, IL-6,IL-8, ciclooxigenase-2 (COX-2), óxido nítrico sintetaseinduzível (iNOS), molécula de adesão intercelular 1(ICAM-1), molécula de adesão' celular vascular 1(VCAM-1), e E-selectina. Este tipo de circuito reguladorpositivo pode amplificar e perpetuar respostasinflamatórias locais. Por conseguinte, a expressãoinadequada ou a superexpressão de TNF-α leva a umaumento coordenado na expressão de muitos genes cujosprodutos medeiam respostas inflamatórias e imunes edessa forma leva à manifestações clínicas de RA.

O recrutamento e a retenção de leucócitos é um eventocrítico na patogênese de todos os distúrbios inflamatórioscrônicos inclusive RA. Além disso, a adesão de leucócitoscirculantes, especialmente monócitos, ao endotéliovascular também é um evento crucial no desenvolvimentode aterosclerose. Este processo depende da interação entreas moléculas de adesão expressas na superfície de célulasendoteliais tais como ICAM-1, VCAM-1, e E-selectina eseus ligandos cognatos em leucócitos. Portanto, ICAM-1,VCAM-1, e E-selectina são responsáveis pelorecrutamento de células inflamatórias, tais comoneutrófilos, eosinófilos, e linfócitos T, da circulação parao local de inflamação. Essas proteínas de adesãonormalmente estão em um nível baixo na superfície dascélulas endoteliais mas são bastante induzidas por váriascitocinas proinflamatórias tais comò TNF-α.A terapia mais comum para tratamento de distúrbiosinflamatórios envolve o uso de drogas antiinflamatóriasnão-esteróides (NSAIDs) por exemplo naproxeno,diclofenaco, ibuprofeno para aliviar sintomas tais comodor. No entanto, apesar do uso difundido de NSAIDs,muitos indivíduos podem não tolerar as doses necessáriaspara tratar o distúrbio durante um período de tempo deprolongado uma vez que se sabe que os NSAIDs causamerosões gástricas. No entanto, os NSAIDs simplesmentetratam os sintomas do distúrbio e não a causa.Quando os pacientes não respondem a NSAIDs, sãousadas outras drogas tais como metotrexato, sais de ouro,D-penicilamina e corticosteróides. Estas drogas tambémtêm efeitos tóxicos significativos.

Drogas à base anticorpos monoclonais tais comoinfliximab, etanercept e adalimumab são úteis comoagentes antiinflamatórios, mas apíesentam desvantagenstais como via de administração (somente parenteral), altocusto, indução de alergia, ativação de tuberculose latente,risco aumentado de câncer e doença cardíaca congestiva.Por conseguinte, faz-se necessário o desenvolvimento demedicamentos aperfeiçoados e alternativos com efeitoscolaterais reduzidos para a prevenção e o tratamento dedistúrbios inflamatórios causados por IL-I e TNF-aaumentados.

Ervas são conhecidas e usadas em todo o mundo para otratamento de muitas condições. Existem evidências deque produtos derivados de plantas possuem efeitosfarmacológicos e terapêuticos potenciais em mamíferos etendem a apresentar menos efeitos colaterais nocivos queas drogas sintéticas.

A presente invenção descreve uma nova composiçãoherbal, que compreende extrato de cabeças de flores efrutas da planta, Sphaeranthus indícus. A composiçãopode ser usada para tratamento de vários distúrbiosinflamatórios com efeitos colaterais mínimos.Sphaeranthus indicus é uma erva comum encontrada emplantações de arroz. Ela pertence à família Asteraceae ena literatura de Ayurveda, ela é conhecida comomahamundi ou gorakhmundi. A planta, disponível em todaa índia, é uma erva ramificada com flores roxas. Ela éusada em distúrbios hepáticos e gástricos. Ela é usada namedicina popular como um remédio para vários males queincluem disenteria, dor no útero e vagina, doenças dopeito, purificação e enriquecimento do sangue, infecçõesdo trato urinário, cicatrização de feridas e várias outrasdoenças.

Foi desenvolvida uma formulação poli-herbal "RV-08",contendo Sphaeranthus indicus com a finalidade deneutralizar distúrbios imunodeficientes (Indian Journal ofPharmacology, 33, 454-55, (2001)).

Foi reportado o isolamento de um novo glicosídeo desesquiterpeno, esfaerantanolida, das flores deSphaeranthus indicus. O composto isolado,Esfaerantanolida, apresentou atividade imunoestimulante.(Phytochemistry, 29(8), 2573-76, (1990)).

Foi reportada a atividade imunomoduladora do extratometanólico de cabeças de flores de Sphaeranthus indicus(Ars Pharmaceutica 45:3; 281-91, (2004)).

O extrato aquoso obtido de raízes de Sphaeranthusindicus é apresentado como sendo moderadamente ativona infra-regulação da produção de TNF-α e IL-8 induzidapor Propionibacterium acnes. Sphaeranthus indicuscausou uma supressão menor mas ainda significativa daespécie de oxigênio reativo (Phytomedicine, 10(1), 34-38,(2003)).

Até onde temos conhecimento, não existe qualquer relatode qualquer medicamento contendo extrato de cabeças deflores e frutas de Sphaeranthus indicus para tratamento dedistúrbios inflamatórios. Para superar os problemas deefeitos colaterais da atual linha de tratamento, tais comoindução de alergia, ativação de tuberculose latente,mielossupressão, risco aumentado de câncer e doençacardíaca congestiva, associados às composições datécnica anterior, os presentes inventores prepararam umnova composição herbal eficaz contra inflamação, tendoatividade inibitória contra TNF-α, interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8) e a expressão da molécula de adesão intercelular1 (ICAM-1), da molécula de adesão celular vascular 1(VCAM-1), e da E-selectina. As composições da presenteinvenção também podem ser usadas em combinação compelo menos um outro agente antiinflamatório.Objetivos da InvençãoConstitui um objetivo da presente invenção fornecer umanova composição herbal compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um extrato de cabeças deflores e frutas de Sphaeranthus indicus como componenteativo junto com carreadores farmaceuticamente aceitáveis.Constitui um outro objetivo da presente invenção forneceruma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (composto 1) como componente ativo juntocom carreadores farmaceuticamente aceitáveis, para otratamento de distúrbios inflamatórios.Constitui um outro objetivo da pres.ente invenção fornecerum método para a produção das composições.Constitui ainda um outro objetivo da presente invençãofornecer uma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz do componente ativo selecionadodo extrato de Sphaeranthus indicus ou do composto 1para o tratamento de distúrbios mediados por TNF-α e porinterleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).Constitui ainda um outro objetivo da presente invençãofornecer uma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz do componente ativo selecionadodo extrato de Sphaeranthus indicus ou do composto 1,para o tratamento de distúrbios mediados pela moléculade adesão intercelular 1 (ICAM-1), pela molécula deadesão celular vascular 1 (VCAM-1), e pela E-selectina.Constitui um outro objetivo da presente invenção forneceruma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz do componente ativo selecionadodo extrato de Sphaeranthus indicus ou do composto 1para o tratamento de distúrbios inflamatórios.Constitui ainda um outro objetivo da presente invençãofornecer uma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz do componente ativo selecionadodo extrato de Sphaeranthus indicus ou do composto 1,para tratar distúrbios inflamatórios mediados por TNF-a.Constitui ainda um outro objetivo da presente invençãofornecer uma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz do componente ativo selecionadodo extrato de Sphaeranthus indicus ou do composto 1,para tratar distúrbios inflamatórios mediados porinterleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).

Constitui ainda um outro objetivo da presente invençãofornecer uma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz do componente ativo selecionadodo extrato de Sphaeranthus indicus ou do composto 1,para tratar distúrbios inflamatórios mediados pelamolécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), pelamolécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), e pelaE-selectina.

Constitui ainda um outro objetivo da presente invençãofornecer uma composição compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz do componente ativo selecionadodo extrato de Sphaeranthus indicus ou do composto 1 emcombinação com pelo menos uma substância bioativa paraobter um efeito sinergístico.

Constitui ainda um outro objetivo da invenção fornecer ouso das referidas composições isoladas ou em combinaçãocom pelo menos um outro agente antiinflamatório paratratar distúrbios inflamatórios inclusive artritereumatóide.

Outros objetivos e outra área de aplicabilidade dapresente invenção tornar-se-ão aparentes a partir dadescrição detalhada a seguir.

Sumário da Invenção

Por conseguinte de acordo com um aspecto da presenteinvenção, fornecemos uma nova composição herbalcompreendendo uma quantidade terapeuticamente eficazde um extrato de cabeças de. flores e frutas deSphaeranthus indicus como componente ativo junto comcarreadores farmaceuticamente aceitáveis.De ácordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (composto 1) como componenteativo junto com carreadores farmaceuticamente aceitáveis,para o tratamento de distúrbios inflamatórios.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos um método para a produção das composições.De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz do componente ativoselecionado do extrato de Sphaeranthus indicus ou docomposto 1 para o tratamento de distúrbios mediados peloTNF-α e pelas interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz do componente ativoselecionado do extrato de Sphaeranthus indicus ou docomposto 1, para o tratamento de distúrbios mediadospela molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), pelamolécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), e pelaE-selectina.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz do componente ativoselecionado do extrato de Sphaeranthus indicus ou docomposto 1 para o tratamento de distúrbios inflamatórios.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz do componente ativoselecionado do extrato de Sphaeranthus indicus ou docomposto 1, para tratar distúrbios inflamatórios mediadospor TNF-cc.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz do componente ativoselecionado do extrato de Sphaeranthus indicus ou docomposto 1, para tratar distúrbios inflamatórios mediadospor interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).

De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz do componente ativoselecionado do extrato de Sphaeranthus indicus ou docomposto 1, para tratar distúrbios inflamatórios mediadospela molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), pelamolécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), e pelaE-selectina.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos uma composição compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz do componente ativoselecionado do extrato de Sphaeranthus indicus ou docomposto 1 em combinação com pelo menos umasubstância bioativa para obter um efeito sinergístico.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção,fornecemos o uso das composições isoladas ou emcombinação com pelo menos um outro agenteantiinflamatório para tratar distúrbios inflamatóriosinclusive artrite reumatóide.Descrição Detalhada da Invenção

Deve ficar entendido que a descrição detalhada e osexemplos específicos, embora indiquem modalidades dainvenção, são dados a título ilustrativo apenas, visto quevárias alterações e modificações dentro do espírito eescopo da invenção tornar-se-ão aparentes para osespecialistas na técnica. O especialista na técnica, combase na descrição contida neste relatório, pode utilizar apresente invenção em toda a sua extensão. Asmodalidades específicas a seguir devem ser interpretadascomo meramente ilustrativas, e de forma alguma nãocomo limitativos do restante da descrição.A menos que de outra forma definido, todos os termostécnicos e científicos usados neste relatório têm ossignificados comumente entendidos pelo especialista natécnica à qual a invenção pertence.

O termo "distúrbio inflamatório" conforme usado nesterelatório refere-se a uma doença ou condiçãocaracterizada por inflamação crônica incluindo porém semlimitação artrite reumatóide, osteoartrite, artritereumatóide juvenil, artrite psoriática, artrite reumatóiderefratária, artrite não-reumatóide crônica,osteoporose/reabsorção óssea, doença cardíacacoronariana, aterosclerose, vasculite, colite ulcerativa,psoríase, doença de Crohn, síndrome da angústiarespiratória do adulto, distúrbios de hipersensibilidade depele do tipo retardado, síndrome do choque séptico anddoença do intestino inflamado.

O termo "farmaceuticamente aceitável" conforme usadoneste relatório significa que o carreador, diluente,excipientes, e/ou sal devem ser compatíveis com os outroscomponentes da formulação, e não prejudiciais para oreceptor da mesma.

O termo "carreador farmaceuticamente aceitável"conforme usado neste relatório significa um material ouauxiliar de formulação atóxico, sólido inerte, semi-sólido,diluente, encapsulante de qualquer tipo. Alguns exemplosde materiais que podem servir como carreadoresfarmaceuticamente aceitáveis são açúcares tais comolactose, glicose, e sacarose; amidos tais como amido demilho e amido de batata; celulose e seus derivados taiscomo carboximetil celulose sódica, etil celulose e acetatode celulose; malte, gelatina; talco; assim como outroslubrificantes compatíveis atóxicos tais como lauril sulfatode sódio e estearato de magnésio, assim como agentescorantes, agentes de liberação, agentes de revestimento,agentes adoçantes, flavorizantes e perfumantes;preservativos e antioxidantes também podem estarpresentes na composição, a critério do formulador.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" conformeusado neste relatório significa uma quantidade decomposto ou composição (por exemplo, do extrato deSphaeranthus indicus) suficiente para induzir de formasignificativa uma modificação positiva na condição a serregulada ou tratada, porém baixa o suficiente para evitarefeitos colaterais se houver (em uma proporçãorisco/benefício razoável), segundo critério médiorazoável. A quantidade terapeuticamente eficaz docomposto ou composição vai variar com a condiçãoparticular sendo tratada, a idade e a condição física dousuário final, a severidade da condição sendotratada/prevenida, a duração do tratamento, a natureza daterapia concorrente, o composto ou composição específicaempregada, o carreador farmaceuticamente aceitávelparticular utilizado, e fatores similares. Conforme usadoneste relatório, todas as percentagens estão em peso amenos que de outra forma especificado.

O termo "marcador bioativo" é usado neste relatório paradefinir uma característica (ou um perfil fitoquímico) que écorrelacionado com um grau aceitável de atividadefarmacêutica.

A "dose máxima praticável" é a maior quantidade de umadroga que um adulto pode tomar com segurança.

Deve ser observado que, conforme usado no relatóriodescritivo e nas reivindicações anexas, as formassingulares "um", "uma", e "o/a" incluem os referentesplurais a menos que o texto indique nitidamente ocontrário.

"Extrato de Sphaeranthus indicus" ou "um extrato deSphaeranthus indicusmencionado neste relatóriosignifica uma mistura de compostos presentes na plantaSphaeranthus indicus. Tais compostos são extraídos dascabeças de flores e frutas secas da planta usandoprocedimentos de extração bastante conhecidos naliteratura (por exemplo, o uso de solventes orgânicos taiscomo álcoois inferiores, ésteres alquílicos, éteresalquílicos, alquil cetonas, clorofórmio, éter de petróleo,hexano e/ou solventes inorgânicos tais como água). Opresente processo para extração de derivadosfitoconstituintes de cabeças de flores e frutas deSphaeranthus indicus pode ser ampliado para preparaçãoem grande escala.

O termo "componente ativo" conforme usado nesterelatório refere-se a "extrato de Sphaeranthus indicus" ou"o composto 1" ou "um extrato enriquecido deSphaeranthus indicus contendo uma mistura de dois oumais compostos ativos".

O extrato de Sphaeranthus indicus pode ser padronizadousando técnicas convencionais tais como cromatografialíquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia emcamada fina de alta eficiência (HPTLC).

Em uma modalidade, a invenção fornece uma composiçãoherbal compreendendo extrato padronizado deSphaeranthus indicus junto com carreadoresfarmaceuticamente aceitáveis.Compostos marcadores bioativos podem ser isolados doextrato de cabeças de flores e frutas de Sphaeranthusindicus por purificação cromatográfica em coluna guiadapor bioatividade e HPLC preparatória. Os compostospodem ser caracterizados por análise dos dadosespectrais.

A composição herbal da presente invenção compreendeum extrato de cabeças de flores e frutas de Sphaeranthusindicus, compreendendo 2-9% de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (composto 1), como marcador bioativo eopcionalmente outros ativos.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma composiçãocompreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona(composto 1) como componente ativo, junto comcarreadores farmaceuticamente aceitáveis.

Em uma modalidade, a invenção fornece o uso dacomposição compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (composto 1), para a produção de ummedicamento para o tratamento de distúrbiosinflamatórios.

A invenção refere-se ainda a um niétodo para a produçãode composições úteis para o tratamento de distúrbiosinflamatórios. O extrato padronizado de Sphaeranthusindicus é misturado com carreadores farmaceuticamenteaceitáveis e formulado em formas de dosagemterapêuticas. A dose a ser administrada diariamente deveser selecionado de forma a adequar-se ao efeito desejado.

Em uma modalidade a composição herbal compreendendoo extrato padronizado de Sphaeranthus indicus éfornecida para o tratamento de distúrbios inflamatórios.

Em uma outra modalidade da invenção, a composiçãocompreendendo 3a-hidroxi-5^,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona(composto 1), junto com carreadores farmaceuticamenteaceitáveis, é fornecida para o tratamento de distúrbiosinflamatórios.

O composto 1, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona,foi isolado do extrato de Sphaeranthus indicus por umprocedimento conhecido na literatura relacionada e foicaracterizado por ressonância magnética nuclear (NMR) eespectrometria de massa.

A composição compreendendo o composto 1, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona, composto este que também podeser obtido de outras fontes vegetais ou pode ser produzidopor métodos de síntese convencionais conhecidos pelosespecialistas na técnica.

Por conseguinte a presente invenção abrange em seuescopo uma composição farmacêutica compreendendo ocomposto 1, que pode ser obtido de outras fontes, parauso no tratamento de distúrbios inflamatórios.

Em ainda uma outra modalidade da invenção, fornecemosum método para a produção de uma composiçãofarmacêutica compreendendo 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (composto 1) por mistura do composto 1com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveise formulação em formas de dosagem terapêuticas. A dosea ser administrada diariamente de,ve ser selecionado deforma a adequar-se ao efeito desejado.

As composições da presente invenção podem seradministradas por via oral, por exemplo na forma depílulas, comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas,grânulos, elixires ou xarope.

O extrato de cabeças de flores e frutas de Sphaeranthus indicus éusado para preparar preparações orais contendo 3-70% em peso doextrato, que é transformado em uma base convencional por misturavigorosa como será descrita abaixo em detalhes. O extrato decabeças de flores e frutas contendo 2 - 9% (p/p) do composto 1como marcador bioativo é suficiente para obter os resultadosdesejados.

O composto 1, 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona, é usadopara preparar preparações orais contendo 3-99% em peso docomposto, que é transformado em uma base convencional pormistura vigorosa como será descrita abaixo em detalhes.

As composições da presente invenção podem ser usadaspara.administração tópica e transdérmica. As composiçõestópicas úteis na presente invenção envolvem formulaçõesadequadas para aplicação tópica à pele. As composiçõespodem ser formuladas em uma ampla variedade de tiposde produtos que incluem porém sem limitação loções,cremes, géis, bastões, sprays ou pomadas.O extrato de cabeças de flores e frutas de Sphaeranthus indicus éusado para preparar preparações tópicas contendo 1 - 15% empeso do extrato que é transformado em uma base convencional pormistura vigorosa como será descrita abaixo em detalhes. O extratode cabeças de flores e frutas de Sphaeranthus indicus, contendoaproximadamente 2 - 9% (p/p) do composto 1 como marcadorbioativo, é suficiente para obter os resultados desejados.Em uma modalidade as composições são fornecidas para otratamento de distúrbios inflamatórios mediados por TNF-α e interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).

Em uma modalidade as composições são fornecidas para otratamento de distúrbios inflamatórios mediados pelamolécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), pelamolécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), e pelaE-selectina.

Os níveis de dosagem efetivos do componente ativo,"extrato de Sphaeranthus indicus" ou do composto 1 nascomposições desta invenção podem ser variados demaneira a obter uma quantidade do componente ativo queé eficaz para obter a resposta terapêutica desejada paraum paciente, uma composição', e um modo deadministração particulares.

O nível de dosagem selecionado vai depender de diversosfatores que incluem a atividade do componente ativoparticular, "extrato de Sphaeranthus indicus" ou "ocomposto 1" empregado, da via de administração, dotempo de administração, da taxa de excreção dacomposição particular sendo empregada, da duração dotratamento, do uso em combinação com os outros extratos,da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e históricomédico anterior do paciente sendo tratado, e fatoressimilares bastantes conhecidos nas artes médicas.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma composiçãocompreendendo o componente ativo, "extrato de Sphaeranthusindicus" ou o composto 1, em combinação com pelo menos umoutro extrato herbal apresentando atividade antiinflamatória paraobter um efeito sinergístico. Esta outra planta pode ser selecionadade plantas tais como Curcuma longa e Zingiber officinale.

Em ainda uma outra modalidade, a composição compreende aindao componente ativo, "extrato de Sphaeranthus indicus" ou ocomposto 1, em combinação com pelo menos uma substânciabioativa para obter um efeito sinergístico.

Em ainda uma outra modalidade, a composição da presenteinvenção compreendendo o componente ativo, "extrato deSphaeranthus indicus" ou o composto 1, pode opcionalmentecontei pelo menos um outro agente antiinflamatório ou tambémpode ser usada em combinação com um agente antiinflamatórioconvencional. O agente antiinflamatório pode ser selecionado deesteróides tais como prednisolona, hidrocortisona; drogas anti-reumáticas modificadoras de doenças (DMARDs) tais comometotrexato, sulfasalazina; ou NSAIDS tais como naproxeno,diclofenaco, ibuprofeno e outros.

Em uma modalidade, a composição herbal compreendendo ocomponente ativo, "extrato de Sphaeranthus indicus ou ocomposto 1 isolado do extrato de Sphaeranthus indicus, éfornecida para o tratamento de artrite reumatóide.

Uma outra modalidade da presente invenção também serefere à atividade inibitória de TNF-α e interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8) das composições compreendendo ocomponente ativo.

Uma outra modalidade da presente invenção também serefere à inibição da expressão da superfície celular demoléculas de adesão tais como molécula de adesãointercelular 1 (ICAM-1), molécula de adesão celularvascular 1 (VCAM-1), e E-selectina pelas composiçõescompreendendo o componente ativo.

As composições da presente invenção são adequadas parauso no tratamento das formas agudas e crônicas dedistúrbios inflamatórios mediados por TNF-a,interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8) e ICAM-1, VCAM-I e E-selectina, em particular, artrite reumatóide, artritereumatóide juvenil, artrite psoriática, osteoartrite, artritereumatóide refratária, artrite não-reumatóide crônica,osteoporose/reabsorção óssea, doença cardíacacoronariana, vasculite, colite ulcerativa, psoríase,síndrome da angústia respiratória do adulto, mal deAlzheimer em humanos. Também as composições dapresente invenção podem ser usadas para tratamento deinflamação em doenças como doença do intestinoinflamado, doença de Crohn, síndrome do choque séptico,aterosclerose, e várias doenças autoimunes entre outrascondições clínicas. A presente invenção também se referea um método de tratamento de distúrbios inflamatórioscompreendendo a administração das composiçõesseletivamente por viá oral, por aplicação tópica, poraplicação transdérmica.

Os exemplos a seguir ilustram mas não limitam o escopoda invenção. Deve ficar entendido pelos especialistas natécnica que a presente discussão consiste em modalidadesexemplificativas apenas, e não pretende ser limitativa dosaspectos mais amplos da presente invenção, que estãoincorporados na construção exemplificativa.

Exemplo 1

Preparação de extrato metanólico de Sphaeranthusindicus.

Cabeças de frutas e flores secas de Sphaeranthus indicus(200 g) foram reduzidas a pó. O material em pó foiextraído usando metanol (2,5 1) com agitação a 60°C por 3horas. O extrato foi filtrado a vácuo. Este processo deextração foi repetido mais duas vezes. Os extratos foramcombinados e concentrados.

Rendimento: 23,29 g (11,65 % p/p).

Foi verificado que o extrato do exemplo 1 continha 6% docomposto 1 (descrito no exemplo 4), conforme estimadopor HPTLC.

Exemplo 2

Preparação de extrato em etil acetato Sphaeranthusindicus.

Cabeças de frutas e flores secas de Sphaeranthus indicus(350g) foram reduzidas a pó. O material em pó foiextraído usando etil acetato (3 1) com agitação a 60°C por3 horas. O extrato foi filtrado a vácuo. Este processo deextração foi repetido mais duas vezes. Os extratos foramcombinados e concentrados.

Rendimento: 19 g (9,5 % p/p).

Exemplo 3

Preparação de extrato aquoso de Sphaeranthus indicus.Cabeças de frutas e flores secas de Sphaeranthus indicus(200 g) foram reduzidas a pó. O material em pó foiextraído usando água (1,2 1) com agitação a 80°C-90°Cpor 3 horas. O extrato foi filtrado a vácuo. Este processode extração foi repetido. Os extratos foram combinados econcentrados para remover a água. Em seguida, o extratobruto foi secado por liofilização.

Rendimento: 21 g (10.5 % p/p).

Exemplo 4

Isolamento de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona(composto 1).

O extrato metanólico (32 g), preparado pelo métododescrito no exemplo 1, foi purificado por cromatografia(sílica gel, metanol em clorofórmio). A purificação finalfoi obtida por HPLC preparatória (sílica gel,hexano:isopropanol, 95:5) para obter o composto título.IH NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 1,085 (3H, CH3), 4,997 (1H, s),5,801 (1H, s), 6,270 (1H, s); MS: m/e (ES) 248 (M+).

O composto foi caracterizado por comparação dos dadosespectrais obtidos com a literatura reportada (IndianJournal of Chemistry, Vol. 25B, 233-238, (1986); J. ChemSoe. Perkin Trans. 1:(2), 157-160, (1988); J. Chem.Research (M), 0501-0509, 1989).

RESULTADOS FARMACOLÓGICOS

A eficácia dos presentes extratos de planta, doscompostos isolados por purificação do extrato e dasformulações na inibição da atividade de TNF-α einterleucinas (IL-1, IL-6, e IL-8) foi determinada porinúmeros ensaios farmacológicos, bastante conhecidos aliteratura e descritos abaixo.

Rastreamento in vitro para identificar inibidores de TNF-α

Exemplo 5

Rastreamento primário — Células mononucleares desangue periférico humano (hPBMCs).

A produção de TNF-α por lipopolissacarídeos (LPS) em hPBMCsfoi medida de acordo com o método descrito por Jansky, L. et al.(Physiol. Res. 52: 593-598, (2003)). Sangue de doadoressaudáveis foi coletado em tubos vacutainer contendo EDTApotássico (BD vacutainer). As PBMCs foram isoladas usandocentrifugação por gradiente em solução de Histopaque-1077(Sigma). As PBMCs isoladas foram suspendidas no meio decultura RPMI 1640 (Gibco BRL, Pasley, UK) contendo 10% desoro bovino fetal (FBS) (Hyclone, Utah, USA), 100 U/ml depenicilina (Sigma Chemical Co. St Louis, MO) e 100 mg/ml deestreptomicina (Sigma Chemical Co. St Louis, MO). Aconcentração de células foi ajustada em IxlO6 células/ml Aviabilidade determinada por exclusão com o corante trypan bluefoi uniformemente > 98%. A suspensão de células (100 ml) foiadicionada aos compartimentos de uma placa de cultura de 96compartimentos. Subsequente ao plaqueamento das células, 79 mldo mieio de cultura e 1 ml de oito concentrações diferentes dasamostras de teste (concentração final 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30,100 μ^πιΐ) dissolvidas em DMSO (dimetil sulfóxido, Sigma, MO,EUA) foram adicionados às células. A concentração final deDMSO foi ajustada em 0,5%. O veículo (0,5% de DMSO) foiusado como controle. Rolipram (100, 300 mM) foi usado comoreferência. As placas foram incubadas por 30 minutos a 37°C emuma atmosfera de 5% CO2. Por fim, foram adicionados 20 ml (10mg/ml) por compartimento de LPS, (Escherchia coli 0127:B8,Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), pára uma concentração finalde 1 mg/ml. As placas foram incubadas a 37°C por 5 horas emuma atmosfera de 5% CO2. Para avaliar o efeito citotóxico dosextratos de planta, o teste de viabilidade celular foi conduzidousando o reagente MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfonil)-2H-tetrazólio) depois de 5horas de incubação. Os sobrenadantes foram recolhidos eanalisados quanto à presença de TNF-α por ELISA da maneiradescrita pelo fabricante (OptiEIA ELISA sets, BD Biosciences,Pharmingen). A % de inibição foi anotada. A percentagem decitotoxicidade das amostras de testes comparadas ao controle foiavaliada.

Os resultados estão resumidos na tabela 1Tabela 1: Inibição de TNF-α em células mononuclearesde sangue periférico humano<table>table see original document page 23</column></row><table>

Exemplo 6

Efeito em citocinas proinflamatórias liberadas porhPBMCs estimuladas por LPS

O efeito do extrato de planta nas citocinasproinflamatórias: TNF-α, interleucina-lb (IL-lb),interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8) foi medidousando os sobrenadantes gerados no ensaio derastreamento primário. Os níveis dessas citocinas foramestimados por ELISA da maneira descrita pelo fabricante.(OptiEIA ELISA sets, BD Biosciences, Pharmingen). Osvalores da concentração inibitória' de 50% (IC50) foramcalculados por um método de regressão não linear usandoo software GraphPad (Prism 3.03).

Tabela 2: Efeito do extrato do exemplo 1 nas citocinasproinflamatórias

<table>table see original document page 23</column></row><table>Conclusão: Foi verificado que o extrato do exemplo 1 inibecitocinas proinflamatórias (TNF-α, IL-lb, IL-6 e IL-8) liberadaspor hPBMCs estimuladas por LPS.

Exemplo 7

Efeito do composto 1, em citocinas proinflamatóriasliberadas por hPBMCs estimuladas por LPS

O composto 1 foi obtido usando o procedimento doexemplo 4. A avaliação da bioatividade foi feita pelomesmo procedimento do exemplo 6.

O efeito do composto 1 nas citocinas proinflamatórias:TNF-α, interleucina-lb (IL-lb), interleucina-6 (IL-6) einterleucina-8 (IL-8) foi medido usando os sobrenadantesgerados no ensaio de rastreamento primário. Os níveisdessas citocinas foram estimados por ELISA da maneiradescrita pelo fabricante. (OptiEIA ELISA sets, BDBiosciences, Pharmingen). Os valores da concentraçãoinibitória de 50% (IC50) foram calculados por um métodode regressão não linear usando o software GraphPad(Prism 3.03). Os resultados estão resumidos na tabela 3.

Tabela 3: Efeito do composto 1, nas citocinas proinflamatórias

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Conclusão: Foi verificado que o composto 1 inibe citocinasproinflamatórias (TNF-α, IL-lb, IL-6 e IL-8) liberadas porhPBMCs estimuladas por LPS.

Exemplo 8

Efeito em citocinas proinflamatórias produzidas porcélulas sinoviais obtidas de um paciente com RA

A produção de citocinas por células sinoviais obtidas deum paciente com artrite reumatóide (RA) passando poruma cirurgia de reposicionamento do joelho foi medida deacordo com o método, descrito por Brennan, F. M. et al.(The Lancet. July 29: 244-247, (1989)). O tecido damembrana sinovial foi digerido em DMEM (Gibco)contendo 10% de FBS, 100 de U/ml de penicilina e 100 emg/ml estreptomicina, 4 mg/ml de colagenase tipo I(Worthington), 1,5 μg/ml de Dnase tipo I (Sigma) e 15U/ml de heparina e incubado a 37°C por 3 horas. Depoisda incubação, o tecido digerido foi filtrado através deuma membrana de 70 μηι e as células foram lavadas 3vezes em meio completo (DMEM com 10% de FBS). Ascélulas sinoviais foram cultivadas a 1 χ IO6 células/ml napresença/ausência da amostra de teste por 10 horas. Ossobrenadantes foram recolhidos por centrifugação e osníveis das citocinas (TNF-α, IL-lb, IL-6, IL-8) forammedidos por ELISA. Para avaliar o efeito citotóxico dosextratos de planta, o teste de viabilidade celular foirealizado usando o reagente MTS. Os valores daconcentração inibitória de 50% (IC50) foram calculadospor um método de regressão não linear usando o softwareGraphPad (Prism 3.03).

Conclusão: Foi verificado que o extrato do exemplo 1inibe citocinas proinflamatórias (TNF-α, IL-lb, IL-6 e IL-8) produzidas por células sinoviais obtidas de um pacientecom RA.

Exemplo 9

Efeito do composto 1 em citocinas proinflamatóriasproduzidas por células sinoviais obtidas de um pacientecom RA.

O efeito em citocinas proinflamatórias produzidas porcélulas sinoviais obtidas de um paciente com RA foiestudado para o composto 1 da maneira descrita peloprocedimento do exemplo 8.

Os resultados estão resumidos na tabela 4.

Tabela 4: Efeito do composto 1, em citocinasproinflamatórias produzidas por células sinoviais.<table>table see original document page 26</column></row><table>

Conclusão: Foi verificado que o composto 1 inibe citocinas- proinflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-8) produzidas por célulassinoviais obtidas de um paciente com RA.Exemplo 10

ELISA de células quanto à presença de expressão demoléculas de adesão

O ensaio foi desenhado com base na referênciaTransplantation, Vol. 63(5), 759-764, 1997 commodificações.

Cultura de células e reagentes:Células endoteliais do cordão umbilical Jiumano (HUVECs) foramadquiridas na Cascade Biologics e foram mantidas em M200(Cascade Biologics, Portland, Or) suplementado com suplementode crescimento pobre em soro (LSGS) a 37°C em uma incubadoracom 5% CO2. Células U937 (ATCC, Manassas, VA) foramcultivadas no meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS(Hyclone, Logan, UT). TNF-α recombinante humano, anticorpospara VCAM-1, ICAM-1, E-selectina foram adquiridos na R&DSystems e LPS foi adquirido na Sigma (St. Louis, MO).ELISA de células quanto à presença de expressão demoléculas de adesão

HUVECs foram plaqueadas a 7 χ IO5 células/compartimento emplacas de 96 compartimentos revestidás com fibronectina. Ascélulas foram estimuladas com TNF-α (10 ng/ml) ou LPS (1μg/ml), 30 minutos depois da adição do composto de teste.Depois da estimulação, as células (E-selectina e ICAM-1) foramfixadas com paraformaldeído em solução salina tamponada comfosfato (PBS). A ligação inespecífica foi bloqueada por 2% dealbumina sérica bovina (BSA) em solução salina tamponada comfosfato (PBS) por 1 hora, e as células foram incubadas comanticorpo primário por 2 horas. Para detecção de VCAM-Iascélulas foram bloqueadas, incubadas com anticorpo primário poruma noite, e em seguida fixadas. As células foram lavadas com0,1% de BSA em PBS, e incubadas com anticorpo conjugado àperoxidase (Ab) para imunoglobulina G (IgG) de camundongo foiadicionada por 90 minutos. Depois de lavagem, sete vezes, osubstrato líquido 3,3'5,5'-tetrametilbenzidina (substrato TMB) foiadicionado e a densidade ótica de cada compartimento foideterminada a 450 nm usando unia leitora de placa demicrotitulação (Spectramax, Molecular Devices, CA). BAY 11-7082 [(E)-3-(4-metilfenilsulfonil)-2-propenonitrila] foi usadocomo referência e DMSO como veículo de controle. Apercentagem de inibição da amostra de teste comparada aocontrole é avaliada. Os valores da concentração inibitória de 50%(IC50) para cada amostra comparados com o controle sãodeterminados por um método de regressão não linear. Osresultados estão resumidos na tabela 5.

Tabela 5: ELISA de células quanto à presença de expressão demoléculas de adesão para o extrato do exemplo 1 e para ocomposto.

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Conclusão:

O extrato do exemplo Ieo composto 1 reduziram de forma dose-dependente a expressão superficial induzida por TNF-α demoléculas de adesão celular endotelial tais como ICAM-1,YCAM-I e E-selectina.

Exemplo 11

Adesão de células mononucleares THP-I a monocamadasde HUVEC

Foram realizados estudos de adesão com a linhagem celularpromonocítica THP-1, que foi estabelecida como um modelo útilpara monócitos em estudos de adesão em Circ. Res., 97, 236-243,2005, com modificações. As células THP-I foram lavadas duasvezes com meio de marcação (M200 mais LSGS). As célulasTHP-I (6x105 células por ml) foram marcadas com 10 μ^ιηΐ deacetoximetil éster de bis-çarboxietil-carboxifluoresceína (umasonda fluorescente, BCECF-AM; Sigma) por 30 minutos àtemperatura ambiente. Depois de esfriar bruscamente com 0,1%de BSA, a pelota foi ressuspendido no meio de marcação. Paraavaliar a adesão de monócitos, monocamadas de HUVEC foramtratadas com TNF-α (1 ng/ml) na presença ou ausência de váriasconcentrações da amostra de teste. O meio foi removido, lavado ecélulas THP-I marcadas foram adicionadas aos compartimentos(6x104 células por compartimento) e incubadas por 10 minutos àtemperatura ambiente no escuro. Depois de co-incubação, ascélulas foram lavadas, enchidas com tampão de Iise (0,1% deTriton-X e, lm5 M de tampão Tris) e incubadas por 30 minutos.

A fluorescência foi medida usando uma leitora fluorescente(PolarStar Optima, BMG Labtech) a um pico de excitação de 485nm e um pico de emissão de 520 nm. Os valores são as médias +SEM, representando dados de adesão fluorescente.

BAY 11-7082 [(E)-3-(4-metilfenilsulfonil)-2-propenonitrila] foiusado como referência e DMSO como veículo de controle. Osresultados estão resumidos na tabela 6.

Tabela 6: Adesão de células mononucleares THP-I amonocamadas de HUVEC para o extrato do exemplo 1 e para ocomposto 1

<table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table>

Conclusão: O extrato do exemplo Ieo composto 1 inibiram aadesão de células THP-I monocíticas estimuladas por TNF-α aHUVECs a 10 μg/ml e 1 μΜ respectivamente.

Como estes compostos inibem a expressão de superfíciesde células de moléculas de adesão em HUVEC assimcomo a adesão de monócitos a HUVECs, eles podemportanto impedir a migração de leucócitos, que é umevento essencial em doenças inflamatórias crônicas emostraram-se benéficos em numerosos distúrbiosinflamatórios.

Estudos in vivo

Exemplo 12

Liberação do fator de necrose tumoral (TNF)-a induzidapor lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos BALB/c.Foi: seguido o protocolo descrito por Fukuda T. et al.(Eur. J. Pharmacol., 391: 317-320, (2000)).

Camundongos BALB/c foram divididos em grupos de dez,cada. A amostra de teste, suspendida em Tween 80 e 0,5%de carbóxi metilcelulose (CMC), foi administrada por vialoral (p.o.) aos camundongos. Uma hora depois, LPSdissolvido em solução salina estéril e livre de pirogêniofoi administrado i.p. a uma dose de 1 mg/kg. O grupo decontrole negativo recebeu solução salina como umainjeção i.p., ao passo que todos os outros gruposreceberam LPS. Rolipram (30 mg/kg, p.o.) foi usado comoa droga de referência. Uma hora e meia mais tarde, sobanestesia de uretano (1,5 g/kg, i.p.) sangue foi coletadoda artéria abdominal usando uma seringa de 1 ml enchidacom heparina (500 IU/ml). Heparina (5 μΐ) foi usada comoanticoagulante nos tubos de coleta de sangue. O plasmafoi separado por centrifugação a 10000 rpm à temperaturaambiente, dividido em alíquotas e armazenado a -70°C atéanálise. Os níveis de TNF-α nas amostras de sangue foianalisadas usando ELISA e a percentagem de inibição deliberação de TNF-α comparada com o grupo de controlefoi calculada. Os resultados estão resumidos na tabela 7.

Tabela 7: Liberação do fator de necrose tumoral (TNF)-ainduzida por IipopoliSsacarideo (LPS) em camundongos

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Conclusão: O extrato do exemplo Ieo composto inibem aliberação de TNF-α em camundongos BALB/c.

Exemplo 13

Artrite induzida por colágeno (CIA) em camundongosDBA/IJ

Camundongos DBA/1 J machos, com idade de 8 - 10 semanas,foram imunizados com 200 μg de colágeno tipo II como umaemulsão em adjuvante completo de Freund, por uma injeçãointradérmica na base do rabo. Vinte e um dias depois, oscamundongos receberam uma dose de reforço de 100 μg decolágeno tipo II. Um grupo de camundongos naíve também foimantido para comparação.

Do 23° dia em diante, os camundongos foram avaliadosquanto ao aparecimento de artrite reumatóide usando índice Articular como parâmetro. Camundongos com umescore mínimo da pata traseira igual a 2 foramintroduzidos no estudo. O extrato do exemplo 1 foiadministrado a uma dose de 400 m.p.k (miligrama porquilo de peso corporal) por via oral duas vezes ao diadurante 12 dias. O composto 1 foi administrado a umadose de 50 m.p.k. e 100 m.p.k. por via oral duas ao diadurante 12 dias. Enbrel (3 mg/kg) foi usado comoreferência e aplicado por via subcutânea uma vez ao dia.O volume da pata e o índice articular foram medidosdiariamente. Os dados foram analisados quanto àsignificância estatística.

Ao término da experiência as patas dos camundongosforam processadas para avaliação histopatológica.

Os dados quanto a redução na espessura das patas equanto à redução no índice articular estão resumidos natabela 8.

Tabela 8: Eficácia do extrato do exemplo 1 e do composto1 no modelo de CIA

<table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table>

Análise histopatológica:

Foi avaliado o efeito benéfico do extrato do exemplo 1 edo composto 1 na patologia de camundongos DBA/1Jartríticos (CIA). Foi realizada microscopia depois decoloração com hematoxilina e eosina assim como depoisde coloração com safranina O das articulações sinoviais.

A análise histopatológica mostrou que tanto o extrato doexemplo 1 quanto o composto 1 exerceram efeitosbenéficos em termos de redução da destruiçãocartilaginosa, destruição óssea e sinovite em comparaçãocom o grupo tratado com veículo.

Conclusão: tanto o extrato do exemplo 1 quanto ocomposto 1 exerceram efeitos benéficos no modelo de CIA

ESTUDOS DE TOXICIDADE

Exemplo 14

Toxicidade oral aguda

O extrato do exemplo 1 foi testado quanto à toxicidadeoral aguda para ratos Sprague Dawley segundo asdiretrizes apresentadas nà "Relação Y" ("Schedule Y") daLei de Drogas e Cosméticos ("Drugs and Cosmetics Act'),1940. (índia)

O extrato do exemplo 1, suspendido em 0,5% de Tween80 em água, foi administrado por via oral por gavagemcomo dose única a um grupo de cinco ratos machos e 5ratos fêmeas na dose máxima praticável de 2000 mg/kg depeso corporal. Os animais foram observados quanto àmortalidade e sinais de intoxicação por um período de 14dias após administração da dose e seus pesos corporaistambém foram anotados. Necrópsia foi efetuada em todosos ratos após o término do estudo.

Conclusão: No presente estudo, a administração oralúnica de extrato do exemplo 1 a ratos Sprague Dawley nadose máxima praticável de 2000 mg/kg não causoumortalidade nos ratos tratados.

A dose letal média (LD50) de extrato do exemplo 1 depoisde administração oral como dose única em ratos SpragueDawley, tanto machos quanto fêmeas, mostrou ser maiorque 2000 mg/kg de peso corporal.

Exemplo 15

Toxicidade oral subaguda

O estudo de toxicidade oral subaguda (28 dias) do extratodo exemplo 1 em ratos Sprague Dawley foi realizadosegundo as diretrizes apresentadas na "Relação Y"("Schedule Y") da Lei de Drogas e Cosméticos ("Drugsand Cosmetics Act'), 1940. (índia)

Grupos de seis ratos Sprague Dawley machos e seis ratosSprague Dawley fêmeas receberam diariamente doses de0, 250, 500 ou 1000 mg/kg de peso corporal de extrato doexemplo 1 por gavagem oral durante 28 dias e foramsacrificados no 29° dia para avaliar sua toxicidade. Osratos foram examinados diariamente quanto a sinais detoxicidade. O peso corporal e o consumo de alimentospara os ratos individuais foram' anotados durante operíodo experimental junto com todas as incidências demortalidade e sinais de saúde e doença. As investigaçõeslaboratoriais foram efetuadas no sangue ao término doestudo.

Todos os animais, quando finalmente sacrificados, foramsubmetidos a uma necrópsia completa e os pesos de certosórgãos foram anotados. A avaliação histopatológica foiefetuada em todos os tecidos listados no protocolo emtodos os animais dos grupos de controle e de dosagemalta.

Todos os animais que receberam o extrato do exemplo 1 àdose de 1000 mg/kg e até esta dose sobreviveram peloperíodo de tratamento. Não foram observados sinaisclínicos de toxicidade em nenhum dos animais tratados.

Os dados sobre ganho de peso corporal e ingestão dealimentos não indicaram efeito adyerso devido ao artigode teste à dose de 1000 mg/kg e até esta dose.

Conclusão: Com base nos achados deste estudo, Ioiverificado que o nível sem efeitos adversos observáveis(NOAEL) do extrato do exemplo 1 em ratos, subsequenteà administração oral durante 28 dias, era superior a 1000mg/kg de peso corporal.

FORMULAÇÕES

Exemplo 16

Preparação de cápsulas

Procedimento geral: Os componentes 01 a 05 em umaquantidade específica foram pesados e transferidos paraum misturador adequado. O conteúdo foi bem misturado eos componentes 09, IOell foram adicionados e a misturacontinuou. A esta mistura foram adicionados oscomponentes 06, 07 e 08 e a massa foi misturada por 30 -45 minutos. A mistura foi passada por uma peneira demalha 40, e foi usado para encher cápsulas.

Tabela 9: Formulação de cápsula de Sphaeranthus indicus

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Exemplo 17

Preparação de comprimidos

Procedimento geral: Os componentes Ol a 05 em umaquantidade específica foram pesados e transferidos paraum misturador adequado. O componente 13 foi adicionadoe a massa molhada foi bem misturada. À mesma foramadicionados os componentes 09, 10, 11 e 12 e a misturacontinuou até ser obtida uma massa homogeneizada. Estamassa molhada foi passada por uma peneira de malha 16 eos grânulos molhados foram secados a 70° ± 5°C. Oscomponentes 06, 07 e 08 foram misturados aos grânulosacima e a massa foi misturada por 30 - 45 minutos. Amistura foi então passada por uma peneira de malha 40 eos comprimidos foram prensados usando uma prensaadequada.

Tabela 10: Formulação de comprimido de Sphaeranthus indicusCada comprimido contém

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Exemplo 18Preparação de xarope

Procedimento geral

O componente 01 foi pesado e ao mesmo foi adicionado ocomponente 15 com agitação contínua. A esta misturaforam adicionadas quantidades pesadas dos componentes03, 04, 05, 06, 08, 09, 10, 11, 12 e 14 com agitaçãocontínua para dissolver. Os componentes 02 e 13 forampesados e dissolvidos no componente 07. A esta misturafoi adicionada água purificada para ajustar o volume em10 ml. A solução obtida foi filtrada por um filtro prensa /tecido de nylon.

Tabela 11: Formulação de xarope de Sphaeranthusindicus

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Exemplo 19

Preparação de formulação de creme

Procedimento geral

O componente 01 foi pesado e suspendido no componente17. Os componentes 02 a 07 foram derretidos. Oscomponentes 08, 09, 10, 11, 13 e 14 foram pesados emisturados com uma porção de 18. O componente 12 foipesado e adicionado à porção restante do componente 18e foi misturado com os componentes 15 e 16. Osconteúdos de todos os estágios foram misturados a 55°C ehomogeneizados, deixados esfriar e acondicionados emum tubo adequado.

Tabela 12: Formulação de creme de Sphaeranthus indicusCada 10O g de creme contém

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Exemplo 20

Preparação de formulação de gelProcedimento geralO componente 01 foi pesado e foi suspendido no componente 06.O componente 04 foi dissolvido no componente 07. Oscomponentes 05 e 08 foram misturados. Os componentes 02 e 03foram misturados. A mistura foi bem misturada e foiacondicionada em um tubo adequado.

Tabela: Formulação de gel de Sphaeranthus indicusCada 100 g de gel contém

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Exemplo 21

Preparação de formulação de pomada

Procedimento geral

Os componentes 02 a 06 foram pesados e derretidos emum vaso adequado. A esta mistura foi adicionado ocomponente 01. Os componentes 07 e 08 foramadicionados a esta mistura. O conteúdo foi bem mistura eacondicionado em um tubo adequado.

Tabela 14: Formulação de pomada de Sphaeranthus indicusCada 100 g de pomada contém

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Exemplo 22

Preparação de comprimido

Procedimento geral

Os componentes 01 e 02 foram pesados separadamente epeneirados por uma malha 20 e misturados. Os componentes 03 a07 foram pesados e misturados por uma malha 40. Oscomponentes 03, 04, 05 e 07 foram misturados e à esta mistura foiadicionada a mistura dos componentes 01 e 02. A esta mistura ocomponente 06 foi adicionado e misturado. A mistura lubrificadaobtida foi prensada com a ferramenta de máquina adequada.

Tabela 15: Formulação de comprimido do composto 1Cada comprimido contém

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Exemplo 23

Preparação de comprimido

Procedimento geral

Os componentes 01 e 02 foram pesados separadamente epeneirados por uma malha 20. O componente 04 foidissolvido no componente 08 com agitação. A misturaacima foi granulada usando uma solução aglutinante. Amassa molhada foi passada por uma peneira adequada. Amassa peneirada foi secada à temperatura ambiente (25°C)e em seguida a cerca de 40°C.' A massa secada foipeneirada por uma peneira adequada. Os componentes 03,05 e 07 foram separadamente peneirados por uma malha40 e misturados. A esta mistura a massa seca foiadicionada e misturada. A esta mistura foi adicionado ocomponente 06 e a mistura lubrificada foi prensada emuma ferramenta de máquina adequada.

Tabela 16: Formulação de comprimido do composto 1Cada comprimido contém

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Exemplo 24

Preparação de cápsula

Procedimento geralOs componentes 01 e 02 foram pesados separadamente epeneirados por uma malha 20 e misturados. Ocomponente 03 foi pesado e peneirado por uma malha 40.Todos os componentes foram misturados e lubrificadosusando o componente 04. A mistura foi introduzida emcápsulas de gelatina dura vazias usando ferramentas demáquina adequadas.

Tabela 17: Formulação de cápsula do composto 1Cada cápsula contém

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Claims (35)

1. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios"caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um extrato de cabeças de flores e frutas da plantaSphaeranthus indicus como componente ativo junto comcarreadores farmaceuticamente aceitáveis.

2. "Composição Herbal para Distúrbios,Inflamatórios", de acordocom a reivindicação 1, caracterizada onde o extrato deSphaeranthus indicus contém um marcador bioativo.

3. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", de acordocom a reivindicação 2, caracterizada onde o marcador bioativocontido no extrato de Sphaeranthus indicus é 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (composto 1).

4. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", de acordocom a reivindicação 3, caracterizada onde o extrato deSphaeranthus indicus contém 2-9% do composto 1.

5. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios"caracterizada por compreender' uma quantidadeterapeuticamente eficaz de 3a-hidroxi-5a,9-dimetil-3-metileno-3a,4,5,5a,6,7,8,9b-octahidro-3H-nafto[l,2-b]furan-2-ona (composto 1) como componente ativo juntocom carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

6. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizada onde a composição é oferecida para otratamento de um distúrbio mediado pelo fator-α denecrose tumoral (TNF-α) e por interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8).

7. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizada onde a composição é adaptada para otratamento de um distúrbio inflamatório.

8. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", de acordocom a reivindicação 7, caracterizada onde o distúrbioinflamatório é um distúrbio mediado por TNF-a.

9. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", de acordocom a reivindicação 7, caracterizada onde o distúrbioinflamatório é um distúrbio mediado por interleucinas QL-I IL-6IL-8).

10. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 7, caracterizada onde o distúrbioinflamatório é um distúrbio mediado pela molécula de adesãointercelular 1 (ICAM-1), pela molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), e E-selectina.

11. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadaonde a composição é administrada por via oral, tópica outransdérmica a um indivíduo com necessidade do tratamento paraum distúrbio inflamatório.

12. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 11, caracterizada onde acomposição é formulada para administração oral na formade um comprimido, cápsula ou xarope.

13. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 11, caracterizada onde acomposição é formulada para administração tópica naforma de um creme, gel ou pomada.'

14. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 7 a' 13caracterizada onde o distúrbio inflamatório é selecionadode doença do intestino inflamado, artrite reumatóideartrite reumatóide juvenil, artrite psoriática, osteoartrite'artrite reumatóide refratária, artrite não-reumatóidecrônica, osteoporose/reabsorção óssea, doença cardíacacoronariana, aterosclerose, vasculite, colite ulcerativapsoríase, síndrome da angústia respiratória do adulto'diabetes, distúrbios de hipersensibilidade de pele do tiporetardado e mal de Alzheimer.

15. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13,caracterizada onde o distúrbio inflamatório é artritereumatóide.

16. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13,caracterizada onde o distúrbio inflamatório é doença dointestino inflamado.

17. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13,caracterizada onde o distúrbio inflamatório é coliteulcerativa.

18. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13,caracterizada onde o distúrbio inflamatório éaterosclerose.

19. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios"caracterizada por ser um método para o tratamento de umdistúrbio inflamatório compreendendo administrar a umindivíduo com necessidade do mesmo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma composição de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

20. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 19, caracterizada onde acomposição é formulada para administração oral.

21. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 19, caracterizada onde acomposição é formulada para administração tópica.

22. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 19, caracterizada onde acomposição é formulada para administração transdérmica.

23. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 19, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é selecionado de doença dointestino inflamado, artrite reumatóide, artrite reumatóidejuvenil, artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumatóiderefratária, artrite não-reumatóide crônica,osteoporose/reabsorção óssea, doença cardíacacoronariana, aterosclerose, vasculite, colite ulcerativa,psoríase, síndrome da angústia respiratória do adulto,diabetes, distúrbios de hipersensibilidade de pele do tiporetardado and mal de Alzheimer.

24. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 19,, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é artrite reumatóide.

25. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 19, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é doença do intestino inflamado.

26. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 19, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é colite ulcerativa.

27. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 19, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é aterosclerose.

28. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizada por compreender ainda pelo menos umagente antiinflamatório.

29.- "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 28, caracterizada onde oagente antiinflamatório é selecionado de prednisolona,hidrocortisona, metotrexato, sulfasalazina, naproxeno,diclofenaco, ibuprofeno.

30. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizada pelo uso da composição para a produção deum medicamento para o tratamento de um distúrbioinflamatório.

31. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 30, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é selecionado de doença dointestino inflamado, artrite reumatóide, artrite reumatóidejuvenil, artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumatóiderefratária, artrite não-reumatóide crônica,osteoporose/reabsorção óssea, doença cardíacacoronariana, aterosclerose, vasculite, colite ulcerativa,psoríase, síndrome da angústia respiratória do adulto,diabetes, distúrbios de hipersensibilidade de pele do tiporetardado and mal de Alzheimer.

32. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 31, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é artrite reumatóide.

33. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 31, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é doença do intestino inflamado.

34. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 31, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é colite ulcerativa.

35. "Composição Herbal para Distúrbios Inflamatórios", deacordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizada onde odistúrbio inflamatório é aterosclerose.