PT1919947E - Análogos de α-msh terapeuticamente activos - Google Patents

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PT1919947E
PT1919947E PT57738015T PT05773801T PT1919947E PT 1919947 E PT1919947 E PT 1919947E PT 57738015 T PT57738015 T PT 57738015T PT 05773801 T PT05773801 T PT 05773801T PT 1919947 E PT1919947 E PT 1919947E
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glu
seq
ser
msh
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PT57738015T
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Bjarne Due Larsen
Thomas Engelbrecht Norkild Jonassen
Soren Nielsen
Jorgen Frokiaer
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Abbvie Inc
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Description

1
DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DE α-MSH TERAPEUTICAMENTE ACTIVOS"
Campo da invenção A invenção refere-se a análogos peptídicos da hormona estimulante de melanócitos α (α-MSH), que possuem uma maior eficácia em comparação com o péptido α-MSH nativo. Os análogos de α-MSH exibem maiores efeitos anti-inflamatórios e maior capacidade para tratar ou prevenir danos corporais, dos órgãos ou celulares associados a isquemia ou isquemia seguida de perfusão vascular em comparação com a-MSH.
Antecedentes
Sabe-se que o péptido hormona estimuladora dos melanócitos α (α-MSH) é um agonista nativo para o receptor de melanocortina (MC) de tipo 1, tipo 3, tipo 4 e tipo 5. Os receptores de MC pertencem à classe de receptores acoplados a proteína G. Todos os subtipos do receptor são acoplados a uma proteína G estimuladora, o que significa que a estimulação do receptor envolve maior produção de AMPc. ACTH é o ligando nativo para o Receptor de tipo 2 (MC2).
Uma série de estudos foi realizada nos receptores de MC numa variedade de tecidos. Sabe-se que o receptor de tipo 1 (MCI), ao qual α-MSH se liga com grande afinidade, é expresso em vários tecidos e células tais como cérebro, incluindo astrócitos, testículos, ovário, macrófagos e neutrófilos. É provável que MCI seja expresso, no entanto, numa gama ainda maior de tecidos, embora isto ainda não 2 esteja estabelecido. A seletividade para os receptores de MC se ligarem a diferentes péptidos MSH varia. MCI liga-se com grande afinidade a α-MSH e com menor afinidade também a β-MSH, γ-MSH e ACTH. Foi relatado que MC2 apenas se liga a ACTH, mas não a nenhum dos péptidos MSH. A afinidade mais elevada para os ligandos dos outros receptores inclui γ-MSH (receptor MC3), e β-MSH (receptor MC4) . Em contraste, MC5 liga-se com uma afinidade muito menor aos péptidos MSH, com o mesmo padrão que MCI (i.e., a afinidade mais elevada para α-MSH).
Os péptidos MSH que atuam através da estimulação dos receptores de MC têm uma variedade de funções, incluindo imunomodulação, anti-inflamação, regulação da temperatura corporal, percepção da dor, sintese de aldosterona, regulação da pressão sanguínea, frequência cardíaca, tónus vascular, fluxo sanguíneo cerebral, crescimento dos nervos, desenvolvimento da placenta, síntese/libertação de uma variedade de hormonas tais como aldosterona, tiroxina, prolactina, FSH. ACTH tem um efeito principal na estimulação da esteroidoneogénese. α-MSH também induz formação de pigmento na pele. É importante salientar que várias ações dos péptidos MSH, especialmente α-MSH, não estão completamente estabelecidas em relação a que receptores estão envolvidos. Tem-se especulado que a ação anti-inflamatória de α-MSH envolve uma variedade de processos, incluindo interferência com a produção de NO, ação da endotelina-1, formação de interleucina-10, que está novamente ligada a receptores MCI expressos nos macrófagos e monócitos. 3
Foi mostrado que a estimulação de receptores de MC com a-MSH é importante numa variedade de processos inflamatórios (Lipton e Catania, 1997) : 1) Inibe a migração quimiotativa de neutrófilos (Catania 1996). 2) α-MSH, incluindo análogos, inibe a libertação de citocinas (IL-1, TNF-α) em resposta a tratamento com LPS (Goninard 1996). 3) Inibe TNF-α em resposta a endotoxina bacteriana (Wong, KY et al., 1997) . 4) A administração ICV ou IP de α-MSH inibe a produção central de TNF-α através de LPS administrado localmente. 5) Foi mostrado que α-MSH reduz a inflamação em doença inflamatória do intestino experimental (Rajora, N. et al., 1997), insuficiência renal aguda induzida por isquemia (Star, R.A. et al., 1995). 6) α-MSH tem também algum efeito protetor através da inibição da indução e desencadeamento de hipersensibilidade de contacto e induz tolerância a haptenos, e especula-se que α-MSH possa mediar uma importante regulação negativa de inflamação cutânea e doenças de pele hiper-proliferativas (Luger, TA, 1997). Para este fim, α-MSH provoca um aumento de libertação de IL-8 a partir de células endoteliais da microvasculatura dérmica (Hartmeyer, M., 1997).
Tanto as lesões de hipóxia (isquemia) como de reperfusão são fatores importantes na patofisiologia humana. Exemplos de hipóxia dos tecidos que predispõe a lesão durante reperfusão incluem choque circulatório, isquemia do miocárdio, acidente vascular cerebral, isquemia renal temporária, grande cirurgia e transplante de órgãos. Como as doenças decorrentes de isquemia são causas extremamente comuns de morbidez e mortalidade e como o transplante de órgãos é cada vez mais frequente, estratégias de tratamento com o potencial de limitar lesões de reperfusão são muito necessárias, a fim de melhorar a saúde pública. A 4 patofisiologia subjacente de lesões de reperfusão de isquemia é complexa e envolve não só uma resposta de reperfusão inflamatória clássica com infiltração de neutrófilos, como também a expressão de genes de citocinas, incluindo fator de necrose tumoral-α (TNF-a), interleucina (ΙΙι)-Ιβ, IL-6, IL-8, interferão-γ, e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) no interior do tecido/órgão de reperfusão. Além disso, foi sugerido que o TNF-α produzido localmente contribui para disfunção pós-isquémica dos órgãos, como no coração pós-enfarte através da depressão direta da contractilidade e indução de apoptose. Devido à natureza complexa das lesões de isquemia e/ou reperfusão, tem sido mostrado que simples conceitos de tratamento anti-inflamatório são ineficazes: A maioria dos estudos experimentais aponta, portanto, para o facto de que é necessária interação concomitante com mais do que uma das vias ativadas para proteger contra lesões de reperfusão. Foi mostrado que α-MSH tem capacidades anti-inflamatórias, anti-oxidativas e anti-apoptóticas, o que dá uma boa explicação para a eficácia deste composto, para proteger contra lesões de reperfusão.
Sabe-se que certas modificações de resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de α-MSH resultam num aumento da afinidade do receptor (p.ex., o receptor MC4), numa atividade biológica prolongada ou num perfil de ligação do péptido mais específico do receptor (Schiõth et al., 1998, Hruby et al. 1995, Sawyer et al. 1980, Hiltz et al. 1991, Scardenings et al. 2000). No entanto, quando se aponta para a geração de fármacos peptídicos, estes péptidos têm ainda problemas com a baixa estabilidade à degradação enzimática. 5 WO 0190140 divulga derivados de melanocortinas incluindo a-MSH que se tornam resistentes à degradação in vivo. Esta resistência é alcançada pela substituição da fenilalanina da sequência central de α-MSH -Glu-His-Phe-Arg-Trp- por um D-aminoácido, substituindo adicionalmente a arginina e o aminoácido seguinte por blocos de construção de aminoácidos N-substituídos.
Tal como afirmado acima, o problema no desenvolvimento de fármacos peptídicos ativos terapêuticos é que os péptidos são rapidamente e muito eficazmente degradados por enzimas, em geral com semividas no intervalo de minutos. As proteases e outras enzimas proteoliticas são ubiquas, particularmente no trato gastrointestinal, e, portanto, os péptidos são geralmente suscetíveis de degradação em múltiplos locais após administração oral, e em certa medida no sangue, no figado, no rim, e no endotélio vascular. Além disso, um dado péptido é geralmente suscetível de degradação em mais do que uma ligação na estrutura; cada locus de hidrólise é mediado por uma certa protease. Mesmo se tais obstáculos forem superados, em particular para os neuropéptidos têm sido encontradas dificuldades no seu transporte através da barreira hematoencefálica.
Para aumentar a estabilidade metabólica de péptidos, uma tecnologia chamada SIP (Sonda de Indução Estrutural) foi desenvolvida por Larsen et ai. 1999 (WO 99/46283). A tecnologia SIP baseia-se na utilização de sondas de indução estrutural, que são representadas por sequências peptídicas curtas, isto é, (Lys)6 adicionado ao terminal C ou ao terminal N ou a ambos os terminais C e N do péptido parental. A sonda de indução estrutural constrange o péptido parental numa conformação mais ordenada com base em 6 ligações intramoleculares de hidrogénio, pelo que a quimera peptidica (péptido ligado à sonda) é menos suscetível a proteases, em contraste com os péptidos na conformação em enrolamento aleatório. Como resultado da estruturação, é muito mais dificil que uma protease degrade a quimera peptidica. A adição de uma SIP a um péptido biologicamente ativo resulta geralmente num aumento na estabilidade enzimática do péptido ao mesmo tempo que é mantida a atividade biológica (Rizzi et al. 2002).
Sumário da invenção O presente inventor demonstrou surpreendentemente que a modificação de SIP da α-MSH e de análogos de α-MSH na extremidade N-terminal dos péptidos aumenta a eficácia máxima dos péptidos em comparação com o péptido a-MSH nativo. Os péptidos da invenção apresentam maiores efeitos anti-inflamatórios e maior capacidade para prevenir condições isquémicas em comparação com o α-MSH nativo.
Assim, a presente invenção refere-se a péptidos específicos compreendendo uma modificação SIP na parte N-terminal do péptido e uma sequência de aminoácidos de α-MSH ou uma variante de α-MSH na parte C-terminal do péptido.
Num primeiro aspeto, a descrição proporciona um péptido totalizando de 12 a 19 resíduos de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos:
X—Aai-Aa2-Aa3_ Aa4_ Aàs-Y—Aa6_ Aa7_ Z em que X compreende seis resíduos de aminoácidos R1-R2-R3-R4-R5-R6, em que Rl, R2, R3, R4, R5 e R6 podem ser independentemente Lys ou Glu, e 7 em que Y compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de His-Phe-Arg, His-(D-Phe)-Arg, His-Nal-Arg e His-(D-Nal)-Arg, e em que Z compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de Lys-Pro-Val e Lys-Pro-(D-Val), e em que Aai, Aa2, Aa3, Aa4, Aas, Aa6 e Aa7 podem ser independentemente qualquer residuo de aminoácido natural ou não natural ou ausente, e em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C (=0)-Bl, em que BI é selecionado a partir de OH, NH2, NHB2, N(B2) (B3), 0B2, e B2, em que B2 e B3 são, independentemente, selecionados a partir de alquilo Ci-6 opcionalmente substituído, alcenilo C2-6 opcionalmente substituído, arilo Ce-io opcionalmente substituído, aralquilo C7-16 opcionalmente substituído, e alquilarilo C7-i6 opcionalmente substituído; e em que o terminal amino do referido péptido é (B4)HN-, (B4)(B5)N-, ou (B6)HN-, em que B4 e B5 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquilo C1-6 opcionalmente substituído, alcenilo C2-s opcionalmente substituído, arilo C6-io opcionalmente substituído, aralquilo C7-16 opcionalmente substituído, e alquilarilo C7-16 opcionalmente substituído; B6 é B4-C(=0)-. A presente invenção proporciona um péptido consistindo na sequência:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-
Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 1), em que o terminal amino do referido péptido é CH3-C(=0)-.
Também, a presente invenção proporciona um péptido consistindo na sequência: 8
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 2), em que o terminal amino do referido péptido é CH3-C(=0)-.
Também, a presente invenção proporciona um péptido selecionado a partir do grupo que consiste em :
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 3),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 4), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 5),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 6), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 7), Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 8),
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 9),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 10),
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val) (SEQ IDNO: 11),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val) (SEQ ID NO: 12), em que o terminal amino do referido péptido é (B4)HN-, (B4) (B5)N-, ou (B6)HN-, em que B4 e B5 são independentemente selecionados a partir de H, alquilo Ci-6, alcenilo C2_6, arilo C6-io, aralquilo C7-ie, e alquilarilo C7-16; B6 é B4-C(=0)-; e em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-Bl, em que BI é selecionado a partir de OH, NH2, NHB2, 9 Ν(Β2) (Β3), 0Β2, e Β2, em que B2 e B3 são independentemente selecionados a partir de alquilo Ci-6, alcenilo C2-6, arilo C6-10, aralquilo C7_i6, e alquilarilo C7-16. A invenção refere-se também à utilização dos referidos péptidos para o fabrico de composições farmacêuticas para o tratamento ou a profilaxia de uma condição no tecido de um ou mais órqãos de um mamifero. Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição, p.ex., uma composição farmacêutica, compreendendo um ou mais péptidos de acordo com a invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável, a péptidos de acordo com a invenção para utilização em medicina, e a métodos para tratamento de uma condição no tecido de um ou mais órgãos de um mamifero compreendendo a administração de uma dose eficaz de um péptido de acordo com a invenção. Especificamente, a invenção é dirigida a um método para tratamento de condições causadas por isquemia, inflamação e/ou efeitos tóxicos de envenenamento ou tratamento com fármacos.
Descrição da invenção A presente invenção refere-se a péptidos terapeuticamente ativos possuindo os efeitos de melhorar ou prevenir a disfunção de órgãos induzida por isquemia, inflamação e/ou efeitos tóxicos de envenenamento ou tratamento com fármacos.
Tal como aqui definido, uma sequência peptidica é "terapeuticamente ativa" se puder ser utilizada para 0 tratamento, a remissão ou a atenuação de um estado de doença, condição fisiológica, sintomas ou indicação ou indicações etiológicas ou avaliação ou diagnóstico destes. 10
Uma sequência peptídica é "profilaticamente ativa" se puder ser usada para prevenir um estado de doença, condição fisiológica, sintomas ou indicações etiológicas. Um agente farmacologicamente ativo é também fisiologicamente e/ou biologicamente ativo. A atividade farmacológica mede o efeito de uma substância (péptido) em sistemas fisiológicos e/ou biológicos in vitro, in vivo ou ex vivo e pode ser ensaiada utilizando ensaios padrão in vitro, in vivo ou ex vivo conhecidos na técnica para um determinado péptido ou um péptido com uma função fisiológica semelhante.
Os péptidos da invenção A presente invenção refere-se a péptidos compreendendo a sequência de aminoácidos de oí-MSH ou uma variante de a-MSH na parte C-terminal do péptido e uma sonda de indução estrutural (SIP) na parte N-terminal do péptido. Os péptidos da invenção são designados análogos de α-MSH. Na presente descrição e reivindicações, estes termos são utilizados como sinónimos.
Aas, Aa6 e Aa7 podem A α-MSH variante é definida como uma sequência de aminoácidos que é modificada em comparação com a α-MSH de ocorrência natural (Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val, SEQ ID NO: 101) tendo pelo menos uma deleção, substituição, adição ou modificação de um resíduo de aminoácido na sequência. A variante de α-MSH tem de preferência a estrutura: Aai-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Y-Aa6-Aa7-Z, em que Y compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de His-Phe-Arg, His-(D-Phe)-Arg, His-Nal-Arg e His-(D-Nal)-Arg, e em que Z compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de Lys-Pro-Val e Lys-Pro-(D-Val) , e em que Aai, Aa2, Aa3, Aa4, 11 ser, independentemente, qualquer resíduo de aminoácido natural ou não natural ou ausente.
No presente contexto, o termo "resíduo de aminoácido" significa qualquer resíduo de aminoácido de ocorrência natural (resíduo de aminoácido natural) ou resíduo de aminoácido de ocorrência não natural (resíduo de aminoácido não natural).
Um resíduo de aminoácido natural é definido como um resíduo de aminoácido existente na natureza, tal como Ala, Arg,
Asn, Asp, Cys, Gin, Glu f Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Tyr, Thr, Trp, Vai.
Exemplos de resíduos de aminoácidos naturais preferidos em relação à estrutura variante de α-MSH, são Ser, Tyr, Met, Glu, Ile, Trp e Gly.
Um resíduo de aminoácido não natural é definido como um resíduo de aminoácido não existente na natureza, mas criado experimentalmente. Os resíduos de aminoácidos não naturais incluem resíduos de aminoácidos α, β, ou γ sintéticos (na configuração L ou na configuração D) bem como aminoácidos de cadeia lateral modificada tais como tirosinas modificadas em que o anel aromático é ainda substituído com p.ex., um ou mais halogéneos, grupos sulfono, grupos nitro, etc., e/ou o grupo fenol é convertido num grupo éster, etc., incluindo aminoácidos de cadeia lateral protegida, em que as cadeias laterais dos aminoácidos são protegidas de acordo com métodos conhecidos dos peritos em química de péptidos, tal como descrito em, p.ex., Bodanszky et ai. 1994, e J. Jones, e Jones 1991. Exemplos de resíduos de aminoácidos não naturais preferidos são Norleucina (Nle), 12
Nal (beta-2-naftil-alanina) , D-Nal (beta-2-naftil-d- alanina), D-fenilalanina (D-Phe) e D-valina (D-Val). A presente invenção proporciona um péptido consistindo na sequência:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 1), em que o terminal amino do referido péptido é CH3-C(=0)-.
Além disso, a presente invenção proporciona um péptido consistindo na sequência:
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 2), em que o terminal amino do referido péptido é CH3-C(=0)-.
Também, a presente invenção proporciona um péptido selecionado a partir do grupo que consiste em:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 3),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 4),
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 5),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 6),
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 7), Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-Hls-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 8),
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 9),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 10), 13
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 11),
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 12), em que o terminal amino do referido péptido é (B4)HN-, (B4)(B5)N-, ou (B6)HN-, em que B4 e B5 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquilo Ci_6, alcenilo C2-6, arilo C6-io, aralquilo C7-i6, e alquilarilo C7_ 16/ B6 é B4-C(=0)-; e em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-
Bl, em que Bl é selecionado a partir de OH, nh2, NHB2 N(B2) (B3) , 0B2, e B2, em que B2 e B3 são independentemente, selecionados a partir de alquilo Ci_6, alcenilo C2-6, arilo C6-10, aralquilo C7_i6, e alquilarilo C7- 16 ·
No contexto da presente invenção, o termo "opcionalmente substituído" pretende significar que o grupo em questão pode ser substituído uma ou mais vezes, tais como 1 a 5 vezes, de preferência 1 a 3 vezes, de maior preferência uma a duas vezes, com um ou mais grupos selecionados a partir de alquilo Ci_8, alcoxilo Ci_8, oxo (que pode ser representado na forma enol tautomérica) , carboxilo, amino, hidroxilo (que quando presente num sistema enol pode ser representado na forma tautomérica ceto), nitro, ciano, di-halogéneo-alquilo Ci_8, tri-halogéneo-alquilo Ci_8, halogéneo. Em geral, os substituintes acima podem ser suscetíveis de mais substituição opcional.
No presente contexto, o termo "alquilo Ci-61' pretende significar uma cadeia saturada linear ou ramificada de hidrato de carbono em que as cadeias mais longas têm de um de um a seis átomos de carbono, tais como metilo, etilo, n- 14 propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, heptilo e octilo. Uma cadeia de hidrato de carbono ramificada pretende significar um alquilo Ci-6 substituído em qualquer carbono com uma cadeia de hidrato de carbono.
No presente contexto, o termo "alcenilo C2-6" pretende significar um grupo hidrato de carbono de cadeia linear ou ramificada possuindo de dois a seis átomos de carbono e contendo uma ou mais ligações duplas. Exemplos ilustrativos de grupos alcenilo C2-6 incluem alilo, homo-alilo, vinilo, crotilo, butenilo, pentenilo, e hexenilo. Exemplos ilustrativos de grupos alcenilo C2-6 com mais do que uma ligação dupla incluem grupos butadienilo, pentadienilo, hexadienilo, e hexatrienilo, bem como formas ramificadas destes. A posição da insaturação (a ligação dupla) pode estar em qualquer posição ao longo da cadeia de carbonos.
No presente contexto o termo "cicloalquilo C3-8" pretende cobrir anéis com três, quatro, cinco, seis, sete e oito membros compreendendo apenas átomos de carbono enquanto o termo "heterociclilo" pretende significar anéis com três, quatro, cinco, seis, sete e oito membros em que os átomos de carbono juntamente com de 1 a 3 heteroátomos constituem o referido anel. Os heteroátomos são, independentemente, selecionados a partir de oxigénio, enxofre e azoto.
Os anéis cicloalquilo C3-s e heterociclilo podem opcionalmente conter uma ou mais ligações insaturadas situadas de tal modo que, no entanto, não surja um sistema aromático de eletrões n. 15
Exemplos ilustrativos de "cicloalquilo C3-8" preferidos são os carbociclos ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclopentadieno, ciclo-hexano, ciclo-hexeno, 1.3- ciclo-hexadieno, 1,4-ciclo-hexadieno, ciclo-heptano, ciclo-hepteno, 1,2-ciclo-heptadieno, 1,3-ciclo-heptadieno, 1.4- ciclo-heptadieno e 1,3,5 ciclo-heptatrieno.
Exemplos ilustrativos de "heterociclilos" são os heterociclos 2H-tipirano, 3H-tipirano, 4H-tipirano, tetra-hidrotiopirano, 2/í-pirano, 4í/-pirano, tetra-hidropirano, piperidina, 1,2-ditiina, 1,2-ditiano, 1,3-ditiina, 1,3-ditiano, 1,4-ditiina, 1,4-ditiano, 1,2-dioxina, 1,2-dioxano, 1,3-dioxina, 1,3-dioxano, 1,4-dioxina, 1,4-dioxano, piperazina, 1,2-oxatiina, 1,2-oxatiano, 4íf —1,3 — oxatiina, 1,3-oxatiano, 1,4-oxatiina, 1,4-oxatiano, 2H-1,2-tiazina, tetra-hidro-1,2-tiazina, 2H-1,3-tiazina, 4H-1,3-tiazina, 5,6-di-hidro-4ff-tiazina, 4H-1,4-tiazina, tetra-hidro-1, 4-tiazina, 2H-1,2-oxazina, 4H-1,2-oxazina, 6H-1,2-oxazina, 2H1,3-oxazina, 4H-1,3-oxazina, 4H-1,4-oxazina, maleimida, succinimida, imidazol, pirazol, pirrol, oxazol, furazano, ácido barbitúrico, ácido tiobarbitúrico, dioxopiperazina, isoxazole, hidantoina, di-hidrouracilo, morfolina, trioxano, 4H-1,2,3-tritiina, 1,2,3-tritiano, 1,3,5-tritiano, hexa-hidro-1,3,5-triazina, tetra-hidrotiofeno, tetra-hidrofurano, pirrolina, pirrolidina, pirrolidona, pirrolidiona, pirazolina, pirazolidina, imidazolina, imidazolidina, 1,2-dioxole, 1,2-dioxolano, 1.3- dioxole, 1,3-dioxolano, 3íí-l, 2-ditiol, 1,2-ditiolano, 1.3- ditiol, 1,3-ditiolano, isoxazolina, isoxazolidina, oxazolina, oxazolidina, tiazolina, tiozolidina, 3Jí-l,2-oxatiol, 1,2-oxatiolano, 5H-1,2-oxatiol, 1,3-oxatiol, 1,3-oxatiolano, 1,2,3-tritiol, 1,2,3-tritiolano, 1,2,4-tritiolano, 1,2,3-trioxol, 1,2,3-trioxolano, 1,2,4- 16 trioxolano, 1,2,3-triazolina e 1,2,3-triazolidina. A ligação ao heterociclo pode estar na posição do heteroátomo ou ser através do átomo de carbono do heterociclo.
No presente contexto o termo "arilo" pretende significar um anel aromático carbociclico ou sistema de anéis. Além disso, o termo "arilo" inclui sistemas de anéis fundidos em que pelo menos dois anéis arilo, ou pelo menos um arilo e pelo menos um cicloalquilo C3-8, ou pelo menos um arilo e pelo menos um heterociclilo, partilham pelo menos uma ligação química. Exemplos ilustrativos de anéis "arilo" incluem fenilo, naftalenilo, fenantrenilo, antracenilo, acenaftilenilo, tetralinilo, fluorenilo, indenilo, indolilo, coumaranilo, coumarinilo, cromanilo, isocromanilo e azulenilo opcionalmente substituído. Um grupo arilo preferido é fenilo.
No presente contexto "aralquilo C7-16" pretende significar um arilo C6-10 substituído com alquilo Ci-6·
No presente contexto "alquilarilo C7-16" pretende significar um alquilo C1-6 substituído com arilo C6-10. A descrição também se refere a um péptido totalizando de 12 a 19 resíduos de aminoácidos compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em X-Y-Z, X-Aai-Y-Z, X-Aai_Aa2-Y-Z, X-Aai-Aa2-Aa3-Y-Z, X-Aai-Aa2-Aa3_Aa4-Y-Z, X-Aai-Aa2-Aa3_Aa4-Aa5-Y-Z, X-Aai~Y_Aa6-Z, 17 X—Aui~Au2~Y~Au6~Z , X~A3.2~A3.2~A3.3~Y~A3.5~Z , X~ A3i ~ A32“ A33 ~ A34~ Y~ A35~ Z , X-A3i-A32-Aa3-A34-A35-Y-Aa6~Z, X~Aai~ Y~Aa6~A37~Z , X~A3i~A32“Y~A36~A37~Z , X-Aai-Aa2~Aa3-Y-Aa6-Aa7~Z,
Χ~Α3ι“Α32“Α33~Α34-Υ-Α36~Α37~Ζ , Θ X-Aai-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Y-Aa6-Aa7-Z em que X compreende seis resíduos de aminoácidos R1-R2-R3-R4-R5-R6, em que Rl, R2, R3, R4, R5 e R6 podem ser independentemente Lys ou Glu, e em que Y compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de His-Phe-Arg, His-(D-Phe)-Arg, His-Nal-Arg e His-(D-Nal)-Arg, e em que Z compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de Lys-Pro-Val e Lys-Pro-(D-Val), e em que Aai, Aa2, Aa3, Aa4, Aa5, Aa6 e Aa7 podem ser independentemente qualquer resíduo de aminoácido natural ou não natural ou ausente, e em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)~ Bl, em que Bl é selecionado a partir de OH, NH2, NHB2, N(B2)(B3), 0B2, e B2, em que B2 e B3 são, independentemente, selecionados a partir de alquilo C1-5 opcionalmente substituído, alcenilo C2-6 opcionalmente substituído, arilo C6-io opcionalmente substituído, aralquilo C7-16 opcionalmente substituído, e alquilarilo C7_ 16 opcionalmente substituído; e em que o terminal amino do referido péptido é (B4)HN-, (B4)(B5)N~, ou (B6)HN-, em que B4 e B5 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquilo C1-6 opcionalmente substituído, alcenilo C2-6 opcionalmente substituído, arilo C6-io opcionalmente substituído, 18 aralquilo C7-16 opcionalmente substituído, e alquilarilo C7_ i6 opcionalmente substituído; B6 é B4-C(=0)-.
Numa forma de realização preferida, a descrição refere-se a um péptido, em que o péptido compreende a sequência de aminoácidos:
X- Aâi - Aa2- Aa3 - Aa4 - Aas - Y—Aa6- Aa7 - Z em que Aai, Aa2, Aa3, Aa4, Aa5, Aa6 e Aa7 podem ser independentemente qualquer aminoácido natural ou não natural. Assim, Aai, Aa 2, Aa3, Aa4, Aas, Aa6 e Aa7 estão todos presentes no péptido da invenção.
Numa forma de realização, a invenção refere-se a péptidos de acordo com a invenção, em que o terminal amino é (B4)HN-, em que B4=H.
Noutra forma de realização, a invenção refere-se a péptidos de acordo com a invenção, em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-B1, em que BI = OH. Vários métodos podem ser utilizados para estabilizar péptidos contra degradação e para diminuição da capacidade dos péptidos para reagir com outros compostos, agentes e/ou péptidos/proteínas, p.ex. no plasma. A invenção também se refere a péptidos de acordo com a invenção, modificados por métodos conhecidos na técnica. Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se a péptidos de acordo com a invenção, em que o terminal amino do péptido é modificado através de acetilação. Assim, numa forma de realização preferida, a invenção refere-se a péptidos de acordo com a invenção, em que o terminal amino é (B6)HN-, em que B6 = B4-C(=0)-, e B4 = CH3. Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a péptidos de acordo com a 19 invenção, em que o terminal carboxilo do péptido é modificado através de amidação. Assim, a invenção refere-se a péptidos de acordo com a invenção, em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-B1, em que BI = NH2.
No aspeto mais amplo da descrição, X é selecionado a partir de Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 37), Glu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 38), Lys-Glu-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 39), Lys-Lys-Glu-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 40), Lys-Lys-Lys-Glu-Lys-Lys (SEQ ID NO: 41), Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-Lys (SEQ ID NO: 42), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu (SEQ ID NO: 43), Glu-Glu-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 44), Glu-Lys-Glu-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 45), Glu-Lys-Lys-Glu-Lys-Lys (SEQ ID NO: 46), Glu-Lys-Lys-Lys-Glu-Lys (SEQ ID NO: 47), Glu-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu (SEQ ID NO: 48), Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 49), Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Lys (SEQ ID NO: 50), Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Lys (SEQ ID NO: 51), Lys-Glu-Lys-Lys-Lys-Glu (SEQ ID NO: 52), Lys-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53), Lys-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys (SEQ ID NO: 54), Lys-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu (SEQ ID NO: 55), Lys-Lys-Lys-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 56), Lys-Lys-Lys-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 57), Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO: 58), Glu-Glu-Glu-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 59) , Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Lys (SEQ ID NO: 60), Glu-Glu-Lys-Lys-Glu-Lys (SEQ ID NO: 61), Glu-Glu-Lys-Lys-Lys-Glu (SEQ ID NO: 62), Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys (SEQ ID NO: 63), Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys (SEQ ID NO: 64), Glu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu (SEQ ID NO: 65), Glu-Lys-Lys-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 66) , Glu-Lys-Lys-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 67), Glu-Lys-Lys-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO: 68), Lys-Lys-Lys-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO: 69), Lys-Lys-Glu-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO: 70), Lys-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 71), Lys-Lys-Glu-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 72), Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO: 73) , Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu (SEQ 20 ID NO: 74), Lys-Glu-Lys-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 75), Lys-
Glu-Glu-Lys-Lys-Glu (SEQ ID NO: 76), Lys-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys (SEQ ID NO: 77), Lys-Glu-Glu-Glu-Lys-Lys (SEQ ID NO: 78), Lys-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO: 79), Lys-Glu-Lys-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO: 80), Lys-Glu-Glu-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO: 81), Lys-Glu-Glu-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 82), Lys-
Glu-Glu-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 83), Glu-Lys-Lys-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO: 84), Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO: 85), Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 86), Glu-Lys-Glu-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 87), Glu-Glu-Lys-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO: 88), Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 89), Glu-
Glu-Lys-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 90), Glu-Glu-Glu-Lys-Lys-Glu (SEQ ID NO: 91), Glu-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys (SEQ ID NO: 92), Glu-Glu-Glu-Glu-Lys-Lys (SEQ ID NO: 93), Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO: 94), Glu-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO: 95), Glu-Glu-Lys-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO: 96), Glu-
Glu-Glu-Lys-Glu-Glu (SEQ ID NO: 97), Glu-Glu-Glu-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 98), Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 99), Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu (SEQ IDNO: 100).
Os péptidos presentemente preferidos da invenção são compostos estabilizados com as seguintes sequências peptidicas:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 1) G1u-G1u-G1u-G1u-G1u-G1u-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 2)
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 3)
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 4) Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 5) 21
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 6)
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 7) Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 8) Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 9)
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 10)
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val) (SEQ ID NO: 11)
Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val) (SEQ IDNO: 12). A estabilização pode ser efetuada por modificação do terminal N e/ou do terminal C do péptido, tal como descrito acima, tal como p.ex., para acetilar o terminal N do péptido da invenção e/ou para amidar o terminal C do péptido da invenção.
As sequências de aminoácidos são dadas pelo código de três letras conhecido para os aminoácidos naturais. Modificações e substituições de resíduos de aminoácidos naturais são abreviadas como se segue: Nle é a abreviatura para Norleucina. D-Nal é a abreviatura para beta-2-naftil-d-alanina. D-Val (D-valina) é a abreviatura para a configuração D de valina. D-Phe (D-fenilalanina) é a abreviatura para a configuração D de fenilalanina.
Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se a um péptido, que é um composto acetilado no terminal N e amidado no terminal C de: 22
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 1).
Ainda numa outra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um péptido de acordo com a invenção, que é um composto acetilado no terminal N e amidado no terminal C de: Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 2).
Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um péptido de acordo com a invenção, que é um composto acetilado no terminal N e amidado no terminal C de: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 3).
Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um péptido de acordo com a invenção, que é um composto acetilado no terminal N e amidado no terminal C de: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His- (D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 5).
Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um péptido de acordo com a invenção, que é um composto acetilado no terminal N e amidado no terminal C de: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His- (D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 9).
Tal como descrito acima, os péptidos da invenção possuem um maior efeito terapêutico e/ou uma maior resposta máxima e/ou maior eficácia máxima em comparação com o péptido a-MSH de ocorrência natural. 23 0 inventor examinou os efeitos biologicos cie cLlcjuns cios péptidos da invenção:
Ac- (Lys)6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 1 *acetilada no terminal N e amidada no terminal C),
Ac- (Glu) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 2 *acetilada no terminal N e amidada no terminal C),
Ac-(Lys)e-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)-NH2 (SEQ ID NO: 3 *acetilada no terminal N e amidada no terminal C),
Ac- (Lys) e-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 5 *acetilada no terminal N e amidada no terminal C),
Ac- (Lys)6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 9 *acetilada no terminal N e amidada no terminal C).
Em geral, "Ac-" indica que o péptido da invenção é acetilado no terminal N, e "-NH2" indica que o péptido da invenção é amidado no terminal C.
Numa suspensão de leucócitos humanos (configuração experimental 1), todos os sete péptidos inibem, de forma dependente da dose, acumulação de TNF-α induzida por LPS (Exemplos 1-7). Surpreendentemente, verificou-se que todos os sete péptidos foram mais eficazes, definido como o máximo efeito inibitório sobre a produção de TNF-α, bem como mais potentes, definido como a concentração de composto necessária para obter a inibição máxima da acumulação de TNF-α, que a hormona estimuladora de melanócitos nativa, α-MSH (Exemplos 1-7). 24 0 inventor investigou também o efeito dos sete péptidos listados acima (SEQ ID NO: 1*, SEQ ID NO: 2*, SEQ ID NO: 3*, SEQ ID NO: 5*, SEQ ID NO: 9*, SEQ ID NO: 13* e SEQ ID NO: 17*, todas *acetiladas no terminal N e amidadas no terminal C) numa configuração em que foi induzida inflamação sistémica por infusão intravenosa de LPS em ratos (configuração experimental 2). Os péptidos de SEQ ID No: 13 e SEQ ID No: 17 estão listados para fins de referência. Foi demonstrado que os péptidos inibem significativamente a acumulação de TNF-α induzida por LPS no sangue circulante. Surpreendentemente, todos os sete péptidos (SEQ ID NO: 1*, SEQ ID NO: 2*, SEQ ID NO: 3*, SEQ ID NO: 5*, SEQ ID NO: 9*, SEQ ID NO: 13* e SEQ ID NO: 17*, todas *acetiladas no terminal N e amidadas no terminal C) foram capazes de inibir a concentração de TNF-α no sangue em circulação até um grau mais elevado que o da hormona estimuladora de melanócitos α-MSH nativa (Exemplos 1-7). 0 inventor investigou também o efeito dos péptidos:
Ac- (Lys)6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 1* acetilada no terminal N e amidada no terminal C), e Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 5* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) numa configuração em que foi induzida inflamação por inalação de LPS em ratos (configuração experimental 3) , e demonstrou que os dois péptidos (SEQ ID N0:1* e 5*) inibem significativamente a acumulação de eosinófilos induzida por LPS dentro dos pulmões (Exemplos 1 e 2). Surpreendentemente, o péptido (SEQ ID NO: 5*) além deste efeito nos eosinófilos também inibiu notoriamente a infiltração de neutrófilos até um grau muito mais elevado que o verificado em ratos tratados 25 com a hormona estimuladora de melanócitos nativa (Exemplo 2) . A isquemia temporal do rim é frequentemente vista como uma consequência da redução da pressão sanguínea, hipovolemia, intervenções cirúrgicas que envolvem redução no fluxo de sangue renal e/ou da aorta, ou associada a septicemia. Isto resulta em insuficiência renal aguda induzida por isquemia, o que para uma grande parte se deteriora em insuficiência renal crónica. Atualmente não existe tratamento eficaz para prevenir o desenvolvimento de insuficiência renal. Uma descoberta comum na fase pós-isquémica é o desenvolvimento de defeitos na concentração urinária, com a formação de maior produção de urina livre de solutos.
Sabe-se que a insuficiência renal aguda experimental induzida por isquemia (IRA) induzida por isquemia e reperfusão em ratos causa alterações estruturais caracteristicas no epitélio tubular renal em associação com uma diminuição do mecanismo de concentração urinária. Este modelo de IRA induzida por isquemia proporciona uma configuração apropriada para avaliar o efeito de um análogo de MSH em lesão induzida por isquemia. 0 presente inventor investigou o efeito do péptido Ac- (Lys)6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 1* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) e comparou o efeito do péptido com o efeito do péptido nativo α-MSH em insuficiência renal aguda grave induzida por oclusão bilateral temporal das artérias renais (configuração experimental 6). Quando avaliados cinco dias após a oclusão da artéria renal temporal, os ratos tratados com veiculo desenvolveram poliúria definida por uma diurese superior a 101% que os ratos de controlo, que haviam sido submetidos a 26 falsa oclusão das artérias renais. Surpreendentemente, o composto (SEQ ID NO: 1* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) , dado na mesma quantidade molar que o péptido nativo cx-MSH, normalizou completamente a diurese, indicando que o péptido tem a capacidade de proteger contra IRA induzida por isquemia, enquanto o tratamento com o péptido nativo nesta configuração foi incapaz de normalizar a produção de urina. 0 enfarte agudo do miocárdio (IAM) é uma das causas mais comuns de morte nos países desenvolvidos. 0 IAM ocorre quase sempre em pacientes com ateroma coronário devido a trombose coronária súbita. Atualmente, a terapia fibrinolítica ou angioplastia coronária transluminal percutânea primária (PTCA) são tratamentos padrão e podem atingir reperfusão precoce em 50-70% dos pacientes (a taxa de reperfusão espontânea é inferior a 30%) . O objetivo da reperfusão é o de reduzir o tamanho do enfarte, reduzindo assim o desenvolvimento de função diminuída do miocárdio. O efeito global da fibrinólise/PTCA é uma redução de 20% na mortalidade a curto e a longo prazo. No entanto, o IAM está associado a uma reação inflamatória, que é um pré-requisito para a cura e formação de cicatriz. A oclusão da artéria coronária reduz, de forma crítica, o fluxo de sangue à porção do miocárdio o que prejudica significativamente o metabolismo energético. Uma duração significativa da isquemia (>2 0 min) induz enfarte e resulta numa resposta inflamatória, que é tanto acelerada como aumentada quando o miocárdio isquémico é reperfundido. como também a expressão de A isquemia/reperfusão do miocárdio (IRM) ativa não só uma resposta de reperfusão inflamatória clássica com infiltração de neutrófilos, 27 genes de citocinas do miocárdio incluindo fator de necrose tumoral-cx (TNF-α), interleucina (IL)-ip, IL-6, IL-8, interferão-γ, e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1). Esta sobre-expressão local de citocinas do miocárdio pode desempenhar um papel critico, não só na modulação do tamanho do enfarte, como também na progressão da disfunção do miocárdio, incluindo remodelação da parede vascular, insuficiência cardiaca, e hipertrofia cardiaca. Além disso, tem sido sugerido que o TNF-α produzido localmente contribui para disfunção pós-isquémica do miocárdio através de depressão direta da contractilidade e indução de apoptose.
Um número crescente de estudos experimentais mostrou que estratégias anti-inflamatórias/anti-oxidativas/anti- apoptóticas têm a capacidade de reduzir o tamanho do enfarte em modelos animais de IRM. No entanto, não existem estudos clinicos que demonstrem efeitos significativos em seres humanos.
Num modelo de isquemia/reperfusão do miocárdio em ratos em que a artéria coronária anterior esquerda foi ocluida durante 60 minutos, o tratamento com um péptido de acordo com a invenção foi dado imediatamente antes da remoção da oclusão da artéria coronária e os ratos foram então seguidos durante outras três horas. Em seguida, a capacidade dos péptidos para reduzir o tamanho do enfarte foi avaliada e comparada com o efeito do péptido nativo a-MSH (configuração experimental 5).
Surpreendentemente, todos os três péptidos:
Ac- (Lys)6_Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 1 28 *acetilada no terminal N e amidada no terminal C),
Ac- (Lys)6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 5 *acetilada no terminal N e amidada no terminal C), e Ac- (Lys)6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO: 9 *acetilada no terminal N e amidada no terminal C) reduziram o tamanho do enfarte para um nivel mais elevado que o péptido nativo α-MSH (exemplos 1, 3-4). À luz das propriedades funcionais dos péptidos descritos acima e nos exemplos, a invenção refere-se a péptidos possuindo pelo menos uma das seguintes propriedades:
a) inibe a produção de TNF-α por leucócitos humanos induzida por LPS b) inibe a infiltração de eosinófilos nos pulmões induzida por inflamação c) inibe a infiltração de neutrófilos nos pulmões induzida por inflamação d) inibe a acumulação de TNF-α no sangue circulante induzida por inflamação e) reduz a insuficiência renal aguda induzida por isquemia f) reduz o tamanho do enfarte do miocárdio g) reduz o grau de insuficiência cardiaca pós-enfarte do miocárdio h) reduz a hipertensão vascular pulmonar i) reduz a insuficiência renal induzida por cisplatina 0 péptido pode ter mais de uma destas propriedades, tais como p.ex. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou todas as propriedades acima. Estas propriedades podem ser testadas tal como é delineado nos exemplos. 29
Tal como descrito acima, os análogos de α-MSH da invenção são caracterizados por terem uma maior eficácia em comparação com a α-MSH nativa.
Nesta especificação e reivindicações, o termo "eficácia" é definido como a resposta máxima obtida por um composto. Os análogos de α-MSH da invenção são capazes de produzir uma maior resposta máxima em comparação com a α-MSH nativa nas várias experiências descritas nos exemplos.
De preferência, um análogo de α-MSH da invenção inibe a produção de TNF-α por leucócitos humanos induzida por LPS num mínimo de 10%, de maior preferência em 25% e ainda de preferência em 40% em comparação com a-MSH.
Além disso, um análogo de α-MSH da invenção pode inibir infiltração de eosinófilos nos pulmões induzida por inflamação medida pela capacidade para reduzir o número de eosinófilos no fluido colhido por lavagem bronco-alveolar ou um método comparável. O efeito mínimo esperado é uma redução de 10%, de maior preferência de 25% e ainda de preferência de 50% nos eosinófilos verificada quando comparada com a-MSH.
Além disso, um análogo de α-MSH da invenção pode inibir infiltração de neutrófilos nos pulmões induzida por inflamação medida através da capacidade para reduzir o número de neutrófilos em fluido colhido através de lavagem bronco-alveolar ou um método comparável. O efeito mínimo esperado é uma redução de 10%, de maior preferência de 20% e ainda de preferência de 40% nos neutrófilos verificada quando comparada com a-MSH. 30
Um análogo de α-MSH da invenção pode também inibir a acumulação de TNF-α no sangue em circulação induzida por inflamação num minimo de 10%, de preferência em 25% e de maior preferência em 40% em comparação com a-MSH.
Além disso, um análogo de α-MSH da invenção pode reduzir a insuficiência renal aguda induzida por isquemia medida através da capacidade para reduzir o grau de pós-poliúria isquémica. O efeito minimo esperado é uma redução de 10%, de preferência de 30% e de maior preferência de 50% na poliúria verificada em comparação com a-MSH.
Além disso, um análogo de α-MSH da invenção pode reduzir o tamanho do enfarte do miocárdio tal como evidenciado pela capacidade para reduzir o tamanho da área necrótica no miocárdio isquémico. O efeito minimo esperado é uma redução de 10%, de preferência de 20% e de maior preferência de 30% no tamanho do enfarte verificada quando comparada com a-MSH.
Noutro aspeto, um análogo de α-MSH da invenção pode reduzir o grau de insuficiência cardíaca pós-enfarte do miocárdio tal como evidenciado pelo desempenho cardíaco avaliado através da medição direta da pressão diastólica ventricular final esquerda ou uma medição quantitativa semelhante. O efeito mínimo esperado é uma redução de 10%, de preferência de 20% e de maior preferência de 25% no grau de insuficiência cardíaca verificada quando comparada com a-MSH.
Ainda noutro aspeto, um análogo de α-MSH da invenção pode reduzir a hipertensão vascular pulmonar. O efeito mínimo esperado é uma redução de 10%, de preferência de 20% e de 31 maior preferência de 30% na pressão arterial pulmonar verificada quando comparada com a-MSH.
Noutro aspeto, um análogo de α-MSH da invenção pode reduzir a insuficiência renal induzida por cisplatina. O efeito minimo esperado é uma redução de 10%, de preferência de 20% e na configuração mais preferida de 30% na hipomagnesia e/ou na taxa de filtração glomerular verificada quando comparada com a-MSH.
Tal como descrito anteriormente, sabe-se que o péptido nativo hormona estimuladora de melanócitos α (α-MSH) é o agonista nativo para o receptor de melanocortina (MC) de tipo 1, tipo 3, tipo 4 e tipo 5, enquanto ACTH é o ligando nativo para o receptor de Tipo 2 (MC2) . Uma vez que os péptidos compreendem a sequência de aminoácidos de α-MSH ou um análogo desta, os péptidos da invenção têm a capacidade para estimular um ou mais receptores de melanocortina, i.e receptor de melanocortina de tipo 1, 3, 4, ou 5. Métodos de preparação de péptidos da invenção
Os péptidos da invenção podem ser preparados através de métodos conhecidos por si na técnica. Assim, o α-MSH, e variantes de α-MSH, análogos de α-MSH e o motivo X podem ser preparados através de técnicas padrão de preparação de péptidos tais como sintese em solução ou sintese em fase sólida do tipo Merrifield.
Numa estratégia de sintese possível, os péptidos da invenção podem ser preparados através de síntese de fase sólida através primeiro da construção da sequência peptídica farmacologicamente ativa (α-MSH, variante de a- 32 MSH ou análogo de α-MSH) utilizando procedimentos padrão bem conhecidos de proteção, conjugação e desproteção, depois disso conjugando sequencialmente a sequência de aminoácidos do motivo X no péptido ativo de um modo semelhante ao da construção do péptido ativo, e finalmente clivando o péptido inteiro do transportador. Esta estratégia rende um péptido, em que a sequência peptidica X é covalentemente ligada ao péptido farmacologicamente ativo no átomo de azoto N-terminal do péptido.
Outra estratégia possivel é preparar a sequência do péptido/análogo de α-MSH e do motivo X (ou partes destas) separadamente por sintese em solução, sintese em fase sólida, técnicas recombinantes, ou sintese enzimática, seguida de conjugação das duas sequências através de procedimentos de condensação de segmentos bem conhecidos, em solução ou utilizando técnicas em fase sólida ou uma combinação destas. Numa forma de realização, o péptido/análogo de α-MSH pode ser preparado através de métodos de ADN recombinante e o motivo X pode ser preparado através de síntese de fase sólida. A conjugação do péptido/análogo de α-MSH e do motivo X pode ser realizada através da utilização de ligação química. Esta técnica permite a montagem de segmentos peptídicos totalmente desprotegidos de um modo altamente específico (Liu et al., 1996). A conjugação pode também ser efetuada através de formação de ligações peptídicas catalisadas por proteases, que oferece uma técnica altamente específica para combinar segmentos peptídicos totalmente desprotegidos através de uma ligação peptidica (Kullmann, 1987).
Exemplos de materiais de suporte sólido adequados (SSM) são, p.ex., resinas funcionalizadas tais como poliestireno, 33 poliacrilamida, polidimetilacrilamida, polietilenoglicol, celulose, polietileno, polietilenoglicol enxertado em poliestireno, látex, dynabeads, etc.
Deve entender-se que pode ser necessário ou desejável gue o aminoácido C-terminal da seguência peptídica do motivo X ou o aminoácido C-terminal do α-MSH, variante de α-MSH, ou análogo de α-MSH esteja ligado ao material de suporte sólido por meio de um ligador comum tal como 2,4-dimetoxi-4'-hidroxi-benzofenona, ácido 4-(4-hidroxi-metil-3- metoxifenoxi)-butírico, ácido 4-hidroxi-metilbenzóico, ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético, ácido 3-(4- hidroximetilfenoxi)propiónico, e ácido p-[(R,S)-a[1-(9H-fluoren-9-il)metoxiformamido]-2,4-dimetoxibenzil]-fenoxi-acético.
Os péptidos da invenção podem ser clivados do material de suporte sólido por meio de um ácido tal como ácido trifluoroacético, ácido trifluorometanossulfónico, brometo de hidrogénio, cloreto de hidrogénio, fluoreto de hidrogénio, etc., opcionalmente em combinação com um ou mais "limpadores" adequados para a finalidade, p.ex., etanoditiol, triisopropilsilano, fenol, tioanisole, etc., ou o conjugado peptídico da invenção pode ser clivado do suporte sólido por meio de uma base tal como amónia, hidrazina, um alcóxido, tal como etóxido de sódio, um hidróxido, tal como hidróxido de sódio, etc.
Os péptidos da invenção podem também ser preparados por meio de tecnologia de ADN recombinante utilizando métodos gerais e princípios conhecidos do perito na técnica. Uma sequência de ácido nucleico codificando o péptido da invenção pode ser preparado sinteticamente através de 34 métodos padrão estabelecidos, p.ex., o método de fosfoamidite. De acordo com o método de fosfoamidite, são sintetizados oligonucleótidos, p.ex., num sintetizador de ADN automático, purificados, fundidos, ligados e clonados em vetores adequados. A sequência de ácido nucleico codificando o péptido da invenção é então inserida num vetor de expressão recombinante, que pode ser qualquer vetor que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de ADN recombinante. A escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual vai ser introduzida. Assim, o vetor pode ser um vetor de replicação autónoma, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossómica, cuja replicação é independente da replicação cromossómica, p.ex., um plasmideo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido numa célula hospedeira, seja integrado no genoma da célula hospedeira e replicado juntamente com o cromossoma ou cromossomas em que foi integrado.
No vetor, a sequência de ácido nucleico codificando o péptido da presente invenção deve ser operativamente ligada a uma sequência promotora adequada. 0 promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que mostre atividade de transcrição na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes codificando proteinas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da sequência de ácido nucleico codificando o referido péptido em células de mamifero são o promotor SV4 0, o promotor MT- 1 (gene da metalotioneina) OU 0 promotor principal tardio de adenovirus 2, um promotor do virus do sarcoma de Rous 35 (RSV), promotor de citomegalovírus (CMV) e um promotor do vírus do papiloma bovino (BPV). Um promotor adequado para utilização em células de inseto é o promotor da poliedrina. Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da sequência de ácido nucleico que codifica o péptido da invenção, especialmente numa célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do operão lac de E. coli, do gene da agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), do gene da levansacarase de Bacillus subtilis (sacB), do gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), do gene da amilase maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), do gene da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), do gene da penicilinase de Bacillus licheniformis (penP) , dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e do gene procariótico da beta-lactamase, bem como o promotor tac. Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinant bactéria" em Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.
Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da sequência de ácido nucleico codificando o péptido do invento numa célula hospedeira fúngica filamentosa são promotores obtidos a partir dos genes que codificam a amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger ou glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose-fosfato-isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, protease semelhante a tripsina de Fusarium oxisporum (como descrito na Patente U.S. No. 4,288, 627, que é aqui incorporada por referência), e híbridos destes. Promotores particularmente 36 preferidos para utilização em células hospedeiras fúngicas filamentosas são os promotores da amilase TAKA, NA2-tpi (um hibrido dos promotores dos genes codificando a amilase a neutra de Aspergillus niger e triose-fosfato-isomerase de Aspergillus oryzae), e glaA.
Num hospedeiro levedura, promotores úteis são obtidos a partir do gene da enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), do gene da galactocinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), dos genes da álcool-desidrogenase/gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, e do gene da 3-fosfoglicerato-cinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. A sequência de ácido nucleico codificando o referido péptido da invenção pode também ser operativamente ligada a um terminador adequado, tal como o terminador da hormona de crescimento humana. Terminadores preferidos para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes codificando a amilase TAKA de Aspergillus oryzae, a glucoamilase de Aspergillus niger, a antranilato-sintetase de Aspergillus nidulans, a alfa-glucosidase de Aspergillus niger, e a protease semelhante a tripsina de Fusarium oxisporum.
Terminadores preferidos para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes codificando a enolase de Saccharomyces cerevisiae, o citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), ou a gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros 37 terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra. 0 vetor pode ainda compreender elementos tais como sinais de poliadenilação (p.ex., de SV40 ou a região Elb de adenovirus 5), sequências estimuladoras da transcrição (p.ex., o estimulador de SV40) e sequências estimuladoras da tradução (p.ex., aquelas codificando ARN do adenovirus VA). Além disso, as sequências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes codificando amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato-sintetase de Aspergillus nidulans, e alfa-glucosidase de Aspergillus niger. As sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. O vetor de expressão recombinante pode ainda compreender uma sequência de ADN que permita que o vetor se replique na célula hospedeira em questão. Exemplos de tal sequência (quando a célula hospedeira é uma célula de mamífero) é a origem de replicação de SV40 ou de polioma. Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYCl77, pACYC184, pUBUO, pE194, pTA1060, e ρΑΜβ 1. Exemplos de origens de replicação para utilização numa célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 micrómetros, a combinação de CEN6 e ARS4, e a combinação de CEN3 e ARS1. A origem de replicação pode ser uma possuindo uma mutação para tornar a sua função sensível à temperatura na célula hospedeira (ver, p.ex., Ehrlich, 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 1433). 38 0 vetor pode também compreender um marcador selecionável, p.ex., um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira, tal como o gene que codifica para a di-hidrofolato-redutase (DHFR) ou um que confira resistência a um fármaco, p.ex., neomicina, geneticina, ampicilina, ou higromicina. Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Um marcador seleccionável para utilização numa célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser selecionado a partir do grupo incluindo, mas não limitado a, amdS (acetamidase), argB (ornitina-carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina-acetiltransferase), hygB (higromicina-fosfotransferase), niaD (nitrato-redutase), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilase) , sC (sulfato-adeniltransferase) , trpC (antranilato-sintetase), e marcadores de resistência a glufosinato, bem como equivalentes de outras espécies. Preferidos para utilização numa célula de Aspergillus são os marcadores amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o marcador bar de Streptomyces hygroscopicus. Além disso, a seleção pode ser alcançada através de co-transformação, p.ex., tal como descrito em WO 91/17243, onde o marcador seleccionável está num vetor separado.
Os procedimentos utilizados para ligar as sequências de ácido nucleico codificando o péptido da invenção, o promotor e o terminador, respetivamente, e para inseri-los em vetores adequados contendo a informação necessária para a replicação, são bem conhecidos dos peritos na técnica (cf., por exemplo, Sambrook et al., op. cit.). A célula hospedeira na qual o vetor de expressão é introduzido pode ser qualquer célula que seja capaz de 39 produzir o péptido do invento e pode ser uma célula eucariótica, tal como células de invertebrado (inseto) ou células de vertebrado, p.ex., oócitos de Xenopus laevis ou células de mamífero, em particular células de inseto e de mamífero. Exemplos de linhas celulares de mamífero adequadas são as linhas celulares COS (p.ex., ATCC CRL 1650), BHK (p.ex., ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) ou CHO (p.ex., ATCC CCL 61).
Os métodos para transfecção de células de mamífero e expressão das sequências de ADN introduzidas nas células podem ser quaisquer métodos conhecidos na técnica (p.ex., MANIATIS, T., E. F. FRITSCH e J. SAMBROOK, 1982 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. A célula hospedeira pode também ser um patogénio unicelular, p.ex., um procariota, ou um patogénio não unicelular, p.ex., um eucariota. Células unicelulares úteis são células bacterianas, tais como bactérias gram-positivas, incluindo, mas não se limitando a, uma célula de Bacillus, p.ex., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis; ou uma célula de Streptomyces, p.ex., Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram-negativas tais como espécies de E. coli e Pseudomonas. A transformação de uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efetuada através de transformação de protoplastos, utilizando células competentes, através de electroporação ou por conjugação. 40 A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como aqui utilizado inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos. Grupos representativos de Ascomycota incluem, p.ex., Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium (=Aspergillus) , e as leveduras verdadeiras listadas acima. A célula hospedeira fúngica pode também ser uma célula de levedura. "Levedura" tal como é aqui utilizado inclui leveduras ascosporogéneas (Endomycetales), leveduras basidiosporogéneas, e leveduras pertencentes aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes) . Os meios utilizados para cultivar as células podem ser qualquer meio convencional adequado para a cultura de células de mamifero, tal como um meio contendo soro ou isento de soro contendo os suplementos apropriados, ou um meio adequado para o crescimento de células de inseto, de levedura ou fúngicas. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). O péptido da invenção produzido pelas células pode então ser recuperado do meio de cultura através de procedimentos convencionais incluindo separação das células hospedeiras do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteináceos do sobrenadante ou filtrado por meio de um sal, p.ex., sulfato de amónio, purificação através de uma variedade de procedimentos cromatográficos, p.ex., cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, ou semelhantes. 41
Assim, a presente invenção refere-se a métodos para a preparação dos péptidos de acordo com a invenção, por meio de tecnologia de ADN recombinante compreendendo os passos de (a) introdução de uma sequência de ácido nucleico codificando o referido péptido numa célula hospedeira e (b) cultura da referida célula hospedeira e (c) isolamento do referido péptido a partir da cultura ou (a) cultura de uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando o referido péptido sob condições que permitam a produção do referido péptido e (b) isolamento do referido péptido a partir da cultura.
Utilização A invenção refere-se também a péptidos de acordo com a invenção para utilização em medicina, em particular para utilização em ligação com um ou mais das condições, distúrbios ou doenças mencionados acima ou no seguinte.
Numa forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um ou mais péptidos de acordo com a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a profilaxia de uma condição no tecido de um ou mais órgãos de um mamífero. 0 órgão não está limitado a, mas pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em rim, fígado, cérebro, coração, músculos, medula óssea, pele, esqueleto, pulmões, o trato respiratório, baço, glândulas exócrinas, bexiga, glândulas endócrinas, órgãos reprodutores incluindo as trompas de Falópio, olho, ouvido, sistema vascular, oo trato gastrointestinal incluindo intestino delgado, cólon, reto e canal anal, e próstata. 42
Tal como descrito acima, os péptidos da invenção apresentam maiores efeitos anti-inflamatórios e maior capacidade para prevenir condições isquémicas em comparação com oí-MSH.
Assim, a presente invenção refere-se à utilização de um ou mais péptidos de acordo com a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a profilaxia de uma condição no tecido de um ou mais órgãos de um mamífero, em que a referida condição é uma condição isquémica ou condição inflamatória. A condição pode também ser devida a insuficiência celular, de tecidos ou de órgãos induzida por toxina ou fármaco.
Na presente especificação e reivindicações, o termo "tratamento" incluirá geralmente tratamento de uma condição existente bem como prevenção de tal condição (tratamento profilático) a menos que o texto exclua especificamente esta interpretação.
No seu conceito mais amplo, a invenção refere-se a qualquer condição em que a função normal do órgão(s) ou tecido(s) é alterada devido a isquemia ou inflamação. A lesão pode incluir lesão aguda e/ou crónica. A lesão crónica inclui situações de lesões repetitivas alternando com períodos de recuperação completa ou parcial da função do órgão (s) ou tecido (s) .
Isquemia
Na presente especificação e reivindicações, a isquemia é definida como um fluxo sanguíneo reduzido para um ou mais órgãos resultando numa reduzida distribuição de oxigénio e/ou utilização pelos tecidos. A isquemia pode ocorrer num 43 ou mais órgãos, incluindo (lista não limitante) : cérebro, coração, extremidades, rim, baço, figado, intestino, estômago, pulmão, olho, pele, músculos, pâncreas, órgãos endócrinos e outros. A isquemia induz, por fornecimento reduzido/paragem completa do fornecimento de sangue arterial, múltiplas reações dos tecidos incluindo acumulação de neutrófilos, outras respostas inflamatórias e morte celular. A isquemia está envolvida em múltiplas doenças, associada a grande cirurgia e secundária a outras doenças graves. A identificação de compostos que possam inibir ou prevenir (totalmente ou parcialmente) muitas das deficiências ou destruições de células/tecidos/órgãos que ocorrem em resultado de isquemia são de grande benefício. A condição a tratar pode ser devida a, ou causada por, isquemia do tecido tal como em estenose arterial ou qualquer outra restrição completa ou parcial no fornecimento de sangue. A isquemia pode ser aguda ou crónica dependendo da gravidade da doença e, além disso, a condição pode ser reversível ou irreversível. Um exemplo de uma condição reversível pode ser devido a queda da pressão sanguínea durante cirurgia ou outra intervenção, o que afeta a perfusão sanguínea do órgão. Por conseguinte, a condição a tratar pode ser qualquer diminuição do fluxo sanguíneo sistémico, tal como hipotensão, que pode afetar o fluxo sanguíneo sistémico ao intestino, coração, rim ou qualquer outro órgão.
Numa forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um péptido de acordo com a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de isquemia, 44 em que a referida condição é causada por isquemia aguda, subaguda ou crónica. A isquemia aguda, subaguda ou crónica de um órgão ou de uma extremidade ou um tecido pode ser causada por uma ampla variedade de doenças. Isto inclui (lista não limitante) doença ateromatosa com trombose, embolia do coração ou de um vaso sanguíneo de qualquer órgão, vasoespasmo, aneurisma aórtico ou aneurismas noutros órgãos, aneurisma aórtico torácico ou abdominal ou de dissecção, hipotensão devida a doença cardíaca, hipotensão devida a uma doença sistémica incluindo infeção ou reações alérgicas, hipotensão devida a um ou mais compostos tóxicos ou veneno(s) ou fármaco(s).
Numa segunda forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um péptido de acordo com a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de isquemia, em que a referida condição é causada por isquemia secundária. A isquemia secundária a uma doença ou condição pode ser observada em uma ou mais das doenças e condições selecionadas a partir de: diabetes mellitus, hiperlipidemia, tromboangeíte obliterante (doença de Buerger), síndroma de Takayasu, arterite temporal, síndroma do nódulo linfático mucocutâneo (doença de Kawasaki), sífilis cardiovascular, distúrbios do tecido conjuntivo como doença de Raynaud, flegmasia cerúlea dolens, traumatismo de vasos sanguíneos incluindo traumatismo iatrogénico tal como canulação ou cirurgia ou transplante de órgãos. Além disso a lista inclui isquemia causada por cirurgia de um ou mais órgãos, transplante de um ou mais órgãos, transplantes de inserção cirúrgica, dispositivos, 45 enxertos, próteses ou outros compostos ou dispositivos biomédicos.
Numa terceira forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um péptido de acordo com a invenção, em que a referida condição é causada por isquemia devido a choque séptico ou a condições associadas a hipotensão sistémica.
Condição inflamatória
Pelo termo "condição inflamatória" entenda-se, no presente contexto, uma condição em que mecanismos tais como a reação de linfócitos T específicos ou de anticorpo com antigénio causam o recrutamento de células inflamatórias e de mediadores químicos endógenos. Nalguns casos, a função normal do órgão ou tecido será alterada através de um aumento na permeabilidade vascular e/ou através da contração do músculo liso visceral. Tais condições inflamatórias podem dar origem a doenças inflamatórias.
Numa forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um ou mais péptidos de acordo com a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou profilaxia de uma condição no tecido de um ou mais órgãos de um mamífero, em que a referida condição é uma condição inflamatória. Uma condição inflamatória pode ser causada por doenças inflamatórias incluindo (lista não limitante): Artrite, (incluindo as doenças associadas a artrite), osteoartrite, artrite reumatoide; espondilartropatias (p.ex., espondilite anquilosante) , artrite reativa (incluindo artrite na sequência de febre reumática), púrpura de Henoch-Schonlein, e doença de Reiter. Além disso, as doenças inflamatórias incluem distúrbios do 46 tecido conjuntivo, tais como lúpus eritematoso sistémico, polimiosite/dermatomiosite, esclerose sistémica, doença mista do tecido conjuntivo, sarcoidose e síndroma primária de Sjõgren, incluindo ceratoconjuntivite seca, polimialgia reumática, e outros tipos de vasculite, doenças de deposição de cristais (incluindo gota), artropatia de pirofosfato, periartrite calcificada aguda. Além disso, as doenças inflamatórias incluem artrite juvenil (doença de Still), psoríase, osteoartrite, osteoartrite secundária a hipermobilidade, displasias congénitas, deslizamento da epífise femoral, doença de Perthes, fraturas intra-articulares, meniscectomia, obesidade, luxação recorrente, ações repetitivas, deposições de cristais e doenças e anomalias metabólicas da cartilagem incluindo artropatia de pirofosfato, ocronose, hemocromatose, necrose avascular incluindo doença de células falciformes, terapia com corticoides ou outros fármacos, doença de Caisson, artrite séptica ou infeciosa (incluindo artrite tuberculosa, artrite meningocócica, artrite gonocócica, artrite de salmonela), endocardite infecciosa (incluindo endocardite induzida por Streptococcus viridans, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylocossus epidermidis, espécies de Histoplasma, Brucella, Candida e Aspergellus e Coxiella Burnetii), artrite virai (incluindo infeção com rubéola, papeira, hepatite B, HIV ou Parvovírus), ou hemartrose recorrente. Além disso, as doenças inflamatórias incluem vasculite tal como vasculite infeciosa devido a infeções com espécies bacterianas incluindo doenças de espiroquetas tais como a doença de Lyme, sífilis, infeções por rickettsia e micobactérias, infeções fúngicas, virais ou por protozoários. Além disso, as doenças inflamatórias incluem vasculite não-infeciosa incluindo arterite de Takayasu, Arterite de Células Gigantes (Arterite temporal e 47 polimialgia reumática), doença de Buerger, poliartrite nodosa, poliarterite microscópica, granulomatose de Wegener, síndroma de Churg-Strauss, vasculite secundária a doenças do tecido conjuntivo incluindo Lúpus Eritematoso Sistémico, Polimiosite/Dermatomiosite, Esclerose Sistémica, Doença Mista do Tecido Conjuntivo, sarcoidose e Síndroma de Sjõgren primária. Além disso, as doenças inflamatórias incluem vasculite secundária a artrite reumatoide.
Além disso, as doenças inflamatórias incluem vasculite secundária a hipersensibilidade não infeciosa e vasculite leucocitoplásica incluindo Doença do Soro, púrpura de Henoch-Schõnlein, Vasculite induzida por fármacos, crioglobulinemia essencial mista, hipocomplementemia, Vasculite associada a outros tipos de malignidades, doença inflamatória dos intestinos e cirrose biliar primária, síndroma de Goodpasture.
Além disso, as doenças inflamatórias incluem todos os tipos de artrite em crianças tais como artrite Juvenil Crónica incluindo doença de Still, artrite reumatoide juvenil, espondilite anquilosante juvenil.
Além disso, as doenças inflamatórias incluem doenças das vias aéreas superiores e inferiores tais como doenças pulmonares obstrutivas crónicas (DPOC), asma alérgica e não alérgica, rinite alérgica, conjuntivite alérgica e não alérgica. Além disso, as doenças inflamatórias incluem dermatite alérgica e não alérgica.
Além disso, as doenças inflamatórias incluem todos os tipos de doenças de deposição tais como Gota, artopatia de pirofosfato e periartrite calcificada aguda. 48
Além disso, as doenças inflamatórias incluem todo o tipo de condições inflamatórias causando dores de costas incluindo infeções, discite séptica, tuberculose, doenças malignas (tais como metástases, mieloma e outras) , tumores espinais, espondilite anquilosante, hérnia discai aguda, doença discai crónica/osteoartrite, osteoporose e osteomalacia. Inclui também doença de Paget, hiperparatiroidismo, osteodistrofia renal, espondilolistese, anomalias congénitas de estenose espinal e fibromialgia.
Além disso, as doenças inflamatórias incluem todos os tipos de reumatismo dos tecidos moles incluindo bursite, tenosinovite ou peritendonite, entesite, compressão dos nervos, periartrite ou capsulite, tensão muscular e disfunção muscular.
Além disso, as doenças inflamatórias incluem doenças inflamatórias do sistema gastrointestinal (incluindo estomatite de todos os tipos, pênfigo, penfigoide bolhoso e penfigoide benigno da membrana mucosa), doenças das glândulas salivares (tais como sarcoidose, obstrução do dueto salivar e síndroma de Sjõgren), inflamação do esófago (p.ex. devido a refluxo gastro-esofágico ou infeções com espécies de Candida, herpes simplex e citomegalovírus), doenças inflamatórias do estômago (incluindo gastrite aguda e crónica, infeção por Helicobacter pylori e doença de Mentriers), inflamação do intestino delgado (incluindo doença celíaca, enteropatia sensível ao glúten, dermatite herpitiforme, diarreia tropical, doença de Whipple, enterite de radiação, amiloidose sistémica, distúrbios do tecido conjuntivo, incluindo lúpus eritematoso sistémico, polimiosite/dermatomiosite, esclerose sistémica, doença 49 mista do tecido conjuntivo e sarcoidose) , gastroenterite eosinofilica, limpangiectasia intestinal, doença inflamatória dos intestinos (incluindo doença de Crohn e colite ulcerosa), doença diverticular do cólon, e sindroma do intestino irritável.
Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se à utilização de um ou mais péptidos de acordo com a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a profilaxia de uma condição no tecido de um ou mais órgãos de um mamífero, em que a condição é uma condição inflamatória selecionada a partir de inflamação pulmonar, artrite, dermatite, pancreatite e doenças inflamatórias do intestino.
Insuficiência celular, de tecidos e órgãos induzida por fármacos
Numa forma de realização, a presente invenção refere-se à utilização de um ou mais péptidos de acordo com a invenção para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou profilaxia insuficiência celular, de tecidos ou órgãos induzida por toxina ou fármaco.
Na presente descrição e reivindicações, "insuficiência celular, de tecidos e órgãos induzida por fármacos" é definido como mudanças na função e/ou morfologia de uma célula, um tecido ou órgão induzida por um composto farmacológico. 0 composto farmacológico inclui, mas não se restringe a agentes quimioterapêuticos do cancro incluindo cisplatina, carboplatina, dacarbezina, procarbazina, altretamina, semustina, lomustina, carmustina, bussulfano, tiotepa, melfalano, ciclofosfamida, clorambucilo, 50 mecloretamina, azacitidina, cladribina, citorabina, fludarabina, fluorouracilo, mercaptopurina, metotrexato, tioguanina, alopurinol, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina , docetaxel, doxorrubicina (adriamicina), etopósido, idarrubicina, irinotecano, mitomicina, paclitaxel, plicamicina, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorrelbina, amassacrina, asparaginase, hidroxiureia, mititano, mitoxantrona; Antibióticos tais como aminoglicósidos incluindo estreptomicina, neomicina, canamicina, amicacina, gentamicina, tobramicina, sisomicina e nitilmicina; compostos imunodepressivos tais como ciclosporina, antidepressivos tricíclicos, sais de lítio, prenilamina e derivados de fenotizina.
Condições em que a função normal da célula, do tecido ou órgão é alterada incluem condições associadas a isquemia, inflamação aguda e/ou crónica, alergia, doenças reumáticas, infeção incluindo infeções virais, fúngicas, bacterianas, por priões ou outros micróbios e agentes infeciosos conhecidos na técnica, todas as formas de reações tóxicas incluindo induzidas por fármacos, toxicidade e lesão aguda e crónica. Lesão crónica inclui situações de lesões repetitivas alternando com períodos de recuperação completa ou parcial da função do órgão(s) ou do tecido(s). Condições em que a função normal da célula, do tecido ou órgão é alterada podem também incluir lesão, a qual está associada a implantação de um ou mais órgãos ou outros dispositivos para transplante e está contemplado que os péptidos da invenção serão também úteis no tratamento ou na prevenção de tais condições. O órgão pode ser do próprio indivíduo, do próprio animal ou de outros indivíduos ou animais. Isto inclui: transplantes de órgãos, transplantes de osso, implantes de tecidos moles (implantes de silicone), 51 implantes metálicos e de plástico, ou outros dispositivos médicos implantáveis. 0 indivíduo representa humanos bem como outros mamíferos. A condição a tratar pode também ser causada por um cancro ou um distúrbio pré-maligno possuindo um impacto no órgão, p.ex. no sistema respiratório, incluindo pulmão, bronquíolos, vias aéreas superiores, e/ou no coração e/ou no rim e/ou no sistema gastrointestinal, incluindo leucemia aguda, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, doença de Hodgkin, linfossarcoma, mieloma, carcinoma metastizante de qualquer origem. Está contemplado que os péptidos da invenção serão também úteis no tratamento ou na prevenção de tais condições.
Além disso, a condição a tratar pode ser causada por qualquer doença selecionada a partir de diabetes mellitus, condições com níveis em jejum aumentados de LDL-Colesterol, condições com aumento combinado dos níveis em jejum de LDL-Colesterol e triglicéridos, condições com níveis em jejum aumentados de triglicéridos, condições com níveis em jejum aumentados de HDL-Colesterol, fibrose retroperitoneal, lúpus eritematoso, poliarterite nodosa, esclerodermia, polimiosite, dermatomiosite, artrite reumatoide, anafilaxia, doença do soro, anemia hemolítica e agranulocitose alérgica. Está contemplado que os péptidos da invenção serão também úteis no tratamento ou na prevenção de tais condições.
Muitas infeções podem ter uma influência no tecido e perturbarem a função normal resultando numa redução do desempenho, que pode ser melhorada através da administração de uma dose eficaz de um péptido da invenção. Tais infeções 52 incluem infeções por protozoários, virus, bactérias e fungos e incluem condições tais como SIDA, septicemia bacteriana, infeções fúngicas sistémicas, doenças de Rickettsias, sindroma de choque tóxico, mononucleose infeciosa, Chlamydia thrachomatis, Chlamydia psittaci, infeção por citomegalovírus, Campylobacter, salmonela, gripe, poliomielite, toxoplasmose, Febre de Lassa, Febre-amarela, bilharziose, coliformes, enterococos, proteus, klebsiella, pseudomonas, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Candida albicans, tuberculose, papeira, mononucleose infeciosa, hepatite e virus Coxackie. A condição a tratar pode estar associada a um traumatismo quimico envolvendo uma ou mais substâncias tóxicas e/ou fármacos. Tais fármacos incluem antidepressivos tricíclicos, sais de lítio, prenilamina, derivados de fenotizina, quimioterapêuticos do cancro, incluindo cisplatina, carboplatina, dacarbezina, procarbazina, altretamina, semustina, lomustina, carmustina, bussulfano, tiotepa, melfalano, ciclofosfamida, clorambucilo, mecloretamina , azacitidina, cladribina, citorabina, fludarabina, fluorouracilo, mercaptopurina, metotrexato, tioguanina, alopurinol, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, docetaxel, doxorrubicina (adriamicina) , etopósido, idarrubicina, irinotecano, mitomicina, paclitaxel, plicamicina, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorrelbina, amassacrina, asparaginase, hidroxiureia, mititano, mitoxantrona; Antibióticos como aminoglicósidos incluindo estreptomicina , neomicina, canamicina, amicacina, gentamicina, tobramicina, sisomicina e nitilmicina; e compostos imunodepressivos tais como ciclosporina. Também traumatismos físicos incluindo radiação eletromagnética podem causar danos, que podem ser 53 aliviados através da administração de uma dose eficaz de um análogo de α-MSH de acordo com a presente invenção. A condição a tratar de acordo com a presente invenção pode ainda incluir doença do tecido conjuntivo, tal como esclerodermia, lúpus eritematoso sistémico ou distúrbios neuromiopáticos tais como distrofia muscular progressiva do tipo de Duchenne, ataxia de Friedreich, e distrofia miotónica. A condição pode p.ex. estar relacionada com o tecido do intestino do mamifero. A invenção refere-se também à utilização de um péptido de acordo com a invenção, em que a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em isquemia do miocárdio, angina, pericardite, enfarte do miocárdio, isquemia do miocárdio, miocardite, mixodemia e endocardite.
Numa forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um péptido de acordo com a invenção, em que a condição está associada a arritmia cardiaca. Métodos de tratamento A invenção refere-se também a métodos para o tratamento ou a prevenção de uma condição no tecido de um ou mais órgãos de um mamifero individual com necessidade destes, o método compreendendo a administração de uma dose eficaz de um ou mais péptidos de acordo com a invenção. A referida condição pode ser uma condição isquémica ou inflamatória e/ou resultar de efeitos tóxicos de envenenamento ou tratamento com fármacos. 54 0 método de tratamento da invenção pode ser de especial beneficio em relação a condições causadas por ou associadas a transplantação de qualquer órgão ou vaso, incluindo prevenção da reação de enxerto versus hospedeiro. Em tais condições, o órgão inteiro é extremamente sensivel a todas as alterações em relação a nutrição, metabolismo, perfusão etc., e crê-se que o tratamento de acordo com a presente invenção estabilize a condição e torne o tecido mais resistente a qualquer situação stressante da função do órgão. 0 método de acordo com a presente invenção engloba também a administração de uma dose eficaz de um péptido da invenção ao transplante de órgão durante o transporte para o recipiente, incluindo a adição de uma dose eficaz de um péptido da invenção ao meio de transporte.
Além disso, o presente pedido proporciona provas de que o tratamento com um análogo de α-MSH de acordo com a invenção em doenças graves, tais como isquemia do miocárdio, previne dramaticamente a morte e a disfunção de órgãos.
Uma das condições cardíacas mais comuns é a angina intermitente ou dor no peito, em que o tratamento de acordo com a invenção pode ser de especial interesse. Condições relacionadas com angina incluem angina instável, angina estável e angina variante de Prinzmetal.
Noutro aspeto, a prevenção e o tratamento podem ser utilizados em situações causadas por pericardite, enfarte do miocárdio, isquemia do miocárdio, miocardite, mixodemia e endocardite. A condição a tratar pode estar associada a arritmia cardiaca. Tanto como doença primária ou secundária a outra 55 condição do indivíduo. Exemplos de causas diversas de arritmia incluem infeções agudas particularmente as que afetam os pulmões, embolia pulmonar, hipotensão, choque, anoxemia, ou anemia que pode precipitar isquemia do miocárdio e, assim, causar arritmia. A arritmia agravará o distúrbio circulatório e, portanto, criará um circulo vicioso auto-perpetuado.
Acredita-se que o tratamento de acordo com a presente invenção aumentará o limiar para o desenvolvimento de arritmia, impedindo assim o desenvolvimento da arritmia. 0 efeito pode ser diretamente sobre o sistema de condução ou indiretamente através da ação sobre uma condição enganando ou sendo a causa da arritmia.
Uma síndroma ou uma arritmia que pode ser aliviada de acordo com o presente método pode ser primária ou secundária e pode ser selecionada a partir de taquiarritmias ventriculares ou supraventriculares, bloqueio auriculoventricular, doença do nódulo sinusal, síndroma de Wolff-Parkinson-White, doença de Lenégres, doença de Lev, qualquer síndroma envolvendo uma ligação do miocárdio anormal entre aurícula e ventrículo. A terapia antiarrítmica realizada com o objetivo de suprimir uma arritmia está sempre associada a um risco de criação de novas arritmias. As arritmias podem ocorrer como uma reação tóxica, devido a uma sobredosagem do fármaco. No entanto, especialmente durante tratamento com o grupo de fármacos conhecidos como fármacos de classe IA, as arritmias podem ocorrer como um efeito secundário não dependente da dose - uma reação idiossincrática desenvolvendo-se a concentrações de fármaco bem dentro do 56 intervalo terapêutico. De acordo com uma outra forma de realização, a condição pode ser causada por um ou mais fármacos antiarritmicos, incluindo glicósidos cardíacos, quinidina, disopiramida, adenosina, aprindina, flecainida, amiodarona, sotalol, meciletina, agentes bloqueadores beta, e verapamil.
Está contemplado que o tratamento com um análogo de a-MSH de acordo com a invenção reduzirá o risco de desenvolvimento de arritmias devido ao tratamento concomitante com outro ou outros medicamentos antiarritmicos.
Noutro aspeto da invenção, a condição pode ser caracterizada por uma ou mais anomalias medidas através de eletrocardiografia (ECG). A anomalia no ECG pode relacionar-se com uma alteração selecionada a partir de uma ou mais alterações na configuração selecionada a partir da onda P, do segmento ST, da onda T, do complexo QRS, da onda Q, da onda delta, e da onda U.
Outras condições que podem ser aliviadas através da administração de uma dose eficaz de um péptido de acordo com a invenção são o efeito de desarranjo eletrolitico no órgão (p.ex. o coração), bem como o próprio desarranjo, incluindo anomalias nas concentrações relativas de iões individuais de um para o outro. Tal condição inclui uma concentração sérica anormal de um ou mais dos eletrólitos selecionados a partir do grupo que consiste em potássio, cálcio, sódio, e magnésio.
De acordo com a presente invenção, o tecido que pode ser afetado inclui um ou mais tipos celulares presentes no 57 órgão e pode ser selecionado a partir de células epiteliais, macrófagos, monócitos do sistema reticulo-endotelial, granulócitos neutrófilos, granulócitos eosinófilos, granulócitos basófilos, células T, células B, mastócitos e células dendríticas. Especialmente, as células T, células B e mastócitos podem ser de certo interesse a este respeito.
Um aspeto preferido da invenção refere-se a prevenção ou tratamento em que a dose de um análogo de α-MSH de acordo com a invenção é administrada profilaticamente para prevenção de um progresso da condição ou de qualquer sintoma da condição.
Um tratamento preventivo ou profilático pode ser um tratamento continuo durante p.ex. cirurgia ou para a prevenção de ataques cardíacos num paciente que sofra de estenose coronária. 0 tratamento preventivo pode também ser durante um período limitado. 0 perito será capaz de avaliar o programa de tratamento específico com base na situação real. Numa forma de realização preferida, o tratamento ou a prevenção é capaz de reduzir o tamanho do enfarte após isquemia das artérias coronárias. Tal tamanho do enfarte pode ser reduzido em 20%, tal como pelo menos 30%, de preferência em pelo menos 50% em comparação com o indivíduo não tratado.
Por conseguinte, a dose de um análogo de α-MSH de acordo com a invenção é administrada profilaticamente para prevenção do estabelecimento da condição ou de qualquer sintoma da condição. 58 A dose de um análogo de α-MSH de acordo com a invenção pode ser administrada como uma dosagem única, administração regular ou continuada, ou como uma administração sequencial. A administração pode ser administração sistémica, administração local incluindo a utilização de sistemas de direccionamento de fármacos, cateteres e implantes, administração oral, administração parentérica, tal como subcutânea, intramuscular, administração intravenosa, administração intraperitoneal, administração intratecal, administração pulmonar, p.ex. através de inalação, administração tópica, administração transmucosa, administração transdérmica.
Por conseguinte, a administração inclui administração sistémica; injeção no tecido ou numa cavidade do corpo, incluindo articulações; implantação em tecido ou numa cavidade do corpo; aplicação tópica na pele ou em qualquer superfície gastrointestinal, ou a uma superfície mucosa, incluindo o revestimento de cavidades corporais.
Tal como é evidente a partir do de acima, a presente invenção refere-se à utilização de um péptido de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de qualquer uma das condições aqui divulgadas através de qualquer via de administração relevante.
Formulações e composições farmacêuticas A invenção refere-se também a composições farmacêuticas compreendendo um ou mais péptidos de acordo com a invenção. 59
As referidas composições farmacêuticas podem ainda compreender um ou mais transportadores farmacêuticos. Além disso, as referidas composições farmacêuticas podem ainda compreender um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser, mas não se limitam a, uma composição parentérica, oral, tópica, trans-mucosa ou trans-dérmica.
Nos seguintes exemplos, são dadas composições adequadas contendo um ou mais péptidos de acordo com a invenção. Para a administração a um indivíduo (um animal ou um ser humano), a substância ou substâncias são formuladas de preferência numa composição farmacêutica contendo a substância ou substâncias e, opcionalmente, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
As composições podem estar na forma de, p.ex., composições sólidas, semissólidas ou líquidas, tais como, p.ex., mas não se limitando a adesivos bioabsorvíveis, poções, pensos, pensos de hidrogel, pensos de hidrocolóides, filmes, espumas, folhas, ligaduras, emplastros, dispositivos de distribuição, implantes, pós, grânulos, granulados, cápsulas, contas de agarose ou quitosano, comprimidos, pílulas, pastilhas, microcápsulas, microesferas, nanopartícuias, sprays, aerossóis, dispositivos de inalação, géis, hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, sabões, supositórios, comprimidos vaginais, pastas dentífricas, soluções, dispersões, suspensões, emulsões, misturas, loções, colutórios, champôs, enemas, estojos contendo p.ex. dois recipientes separados, em que o primeiro dos recipientes contém um péptido de acordo com a invenção e o 60 segundo recipiente contém um meio adequado destinado a ser adicionado ao primeiro recipiente antes da sua utilização, para obter uma composição pronta-a-usar; e em outras formas apropriadas, tais como, p.ex., implantes ou revestimentos de implantes ou numa forma adequada para utilização em ligação com implantação ou transplantação.
As composições podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional, ver, p.ex., "Remington: The Science and practice of pharmacy" 20a ed. Mack Publishing, Easton PA, 2000 ISBN 0-912734-04-3 e "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", editada por Swarbrick, J. & J. C. Boylan, Mareei Dekker, Inc., New York, 1988 ISBN 0-8247-2800-9.
Uma composição farmacêutica compreendendo uma substância ativa serve como um sistema de distribuição de fármacos. No presente contexto o termo "sistema de distribuição de fármacos" denota uma composição farmacêutica (uma formulação farmacêutica ou uma forma de dosagem) , que após administração apresenta a substância ativa ao corpo de um humano ou um animal. Assim, o termo "sistema de distribuição de fármacos" abrange composições farmacêuticas simples tais como, p.ex., cremes, pomadas, liquidos, pós, comprimidos, etc., bem como formulações mais sofisticadas tais como sprays, emplastros, ligaduras, pensos, dispositivos, etc.
Tal como mencionado acima, uma composição farmacêutica para utilização de acordo com a invenção pode compreender excipientes farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitáveis. 61 A escolha de excipientes farmaceuticamente aceitáveis numa composição para utilização de acordo com a invenção e a concentração ótima destes não pode em geral ser prevista e tem de ser determinada com base numa determinação experimental desta. Também, se um excipiente farmaceuticamente aceitável é adequado para utilização numa composição farmacêutica, é geralmente dependente de qual o tipo de forma de dosagem escolhida. No entanto, um perito na técnica de formulação farmacêutica pode encontrar orientação em, p.ex., "Remington: The Science and practice of pharmacy" 20a ed. Mack Publishing, Easton PA, 2000 ISBN 0-912734-04-3.
Um excipiente farmaceuticamente aceitável é uma substância que é substancialmente inofensiva para o indivíduo ao qual a composição será administrada. Um tal excipiente preenche normalmente os requisitos das agências nacionais de fármacos. Farmacopeias oficiais tais como a Farmacopeia Britânica, a Farmacopeia dos Estados Unidos da América e a Farmacopeia Europeia estabelecem padrões para excipientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos.
No seguinte é dada uma revisão sobre composições farmacêuticas relevantes para utilização de acordo com a invenção. A revisão baseia-se na via de administração particular. No entanto, reconhece-se que nos casos em que um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser empregue em diferentes formas de dosagem ou composições, a aplicação de um determinado excipiente farmaceuticamente aceitável não se limita a uma determinada forma de dosagem ou a uma determinada função do excipiente.
Composições parentéricas 62
Para aplicação sistémica, as composições de acordo com a invenção podem conter convencionalmente transportadores e excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo microesferas e lipossomas.
As composições para utilização de acordo com a presente invenção incluem todos os tipos de composições sólidas, semissólidas e liquidas. Composições de particular relevância são p.ex. soluções, suspensões, emulsões, géis, comprimidos de implantação e implantes.
Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem incluir solventes, agentes de tamponamento, conservantes, humectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizadores, agentes emulsionantes, agentes de suspensão, agentes de formação de gel, diluentes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, lubrificantes e agentes molhantes. Para exemplos dos diferentes agentes ver abaixo.
Composições tópicas, transmucosas e transdérmicas
Para aplicação na mucosa ou na pele, as composições para utilização de acordo com a invenção podem conter convencionalmente transportadores não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis e excipientes incluindo microesferas e lipossomas.
As composições para utilização de acordo com a invenção incluem todos os tipos de composições sólidas, semissólidas e liquidas. Composições de particular relevância são p.ex. pastas, pomadas, pomadas hidrófilas, cremes, géis, 63 hidrogéis, soluções, emulsões, suspensões, loções, linimentos, comprimidos sublinguais, supositórios, enema, pessários, pessários moldados, cápsulas vaginais, comprimidos vaginais, champôs, geleias, sabonetes, barras, sprays, pós, filmes, espumas, almofadas, esponjas (p.ex. esponjas de colagénio), almofadas, pensos (tais como, p.ex., pensos absorventes de feridas), poções, ligaduras, emplastros e sistemas de distribuição transdérmica.
Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem incluir solventes, agentes de tamponamento, conservantes, humectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizadores, agentes emulsionantes, agentes de suspensão, agentes de formação de gel, bases para pomadas, bases para supositórios, intensificadores de penetração, perfumes, agentes protetores da pele, diluentes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, lubrificantes e agentes molhantes. Para exemplos dos diferentes agentes ver abaixo.
Composições orais
Para aplicação à mucosa ou à pele, as composições para utilização de acordo com a invenção podem conter convencionalmente transportadores não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis e excipientes incluindo microesferas e lipossomas. A composição para utilização de acordo com a invenção inclui todos os tipos de composições sólidas, semissólidas e fluidas. Composições de particular relevância são p.ex. soluções, suspensões, emulsões, comprimidos não revestidos, comprimidos de libertação modificada, comprimidos gastro- 64 resistentes, comprimidos orodispersiveis, comprimidos efervescentes, comprimidos mastigáveis, cápsulas moles, cápsulas duras, cápsulas de libertação modificada, cápsulas gastro-resistentes, grânulos não revestidos, grânulos efervescentes, grânulos para a preparação de líquidos para utilização oral, grânulos revestidos, grânulos gastro-resistentes, grânulos de libertação modificada, pós para administração oral e pós para a preparação de líquidos para utilização oral.
Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem incluir solventes, agentes de tamponamento, conservantes, humectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensão, agentes de formação de gel, diluentes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, lubrificantes, agentes de revestimento e agentes molhantes. Para exemplos dos diferentes agentes ver abaixo.
Exemplos de vários agentes
Exemplos de solventes são, mas não se limitam a, água, álcoois, óleos vegetais ou marinhos (p.ex. óleos comestíveis como óleo de amêndoa, óleo de rícino, manteiga de cacau, óleo de coco, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de linhaça, azeite, óleo de palma, óleo de amendoim, óleo de papoila, óleo de colza, óleo de sésamo, óleo de soja, óleo de girassol e óleo de camélia), óleos minerais, óleos gordos, parafina líquida, polietilenoglicóis, propilenoglicóis, glicerol, polialquilsiloxanos líquidos, e misturas destes. 65
Exemplos de agentes de tamponamento são, mas não se limitam a, ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido hidrogenofosfórico, dietilamina, etc.
Exemplos de conservantes para utilização em composições são, mas não se limitam a, parabenos, tais como metilo, etilo, propilo p-hidroxibenzoato, butilparabeno, isobutilparabeno, isopropilparabeno, sorbato de potássio, ácido sórbico, ácido benzóico, benzoato de metilo, fenoxietanol, bronopol, bronidox, MDM hidantoína, butilcarbamato de iodopropinilo, EDTA, cloreto de benzalcónio, e álcool benzílico, ou misturas de conservantes.
Exemplos de humectantes são, mas não se limitam a, glicerina, propilenoglicol, sorbitol, ácido láctico, ureia, e misturas destes.
Exemplos de agentes quelantes são, mas não se limitam a, EDTA de sódio e ácido cítrico.
Exemplos de antioxidantes são, mas não se limitam a, butil-hidroxi-anisol (BHA), ácido ascórbico e derivados destes, tocoferol e derivados destes, cisterna e misturas destes.
Exemplos de agentes emulsionantes são, mas não se limitam a, gomas de ocorrência natural, p.ex. goma acácia ou goma adraganta; fosfatídeos de ocorrência natural, p.ex. lecitina de soja; derivados de monooleato de sorbitano; gorduras da lã; álcoois da lã; ésteres de sorbitano; monoglicéridos; álcoois gordos; ésteres de ácidos gordos (p.ex. triglicéridos de ácidos gordos); e misturas destes. 66
Exemplos de agentes de suspensão são, mas não se limitam a, celuloses e derivados de celulose, tais como, p.ex., carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carragenano, goma acácia, goma-arábica, goma adraganta e misturas destes.
Exemplos de bases de gel e aumento da viscosidade são, mas não se limitam a, parafina liquida, polietileno, óleos gordos, silica ou aluminio coloidal, sabonetes de zinco, glicerol, propilenoglicol, goma adraganta, polímeros de carboxivinilo, silicatos de magnésio-alumínio, Carbopol®, polímeros hidrófilos tais como, p.ex., amido ou derivados da celulose, tais como, p.ex., carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose e outros derivados de celulose, hidrocolóides que podem inchar com água, carragenanos, hialuronatos (p.ex. gel de hialuronato contendo opcionalmente cloreto de sódio), e alginatos incluindo alginatos de propilenoglicol.
Exemplos de bases de pomadas são, mas não se limitam a, cera de abelha, parafina, cetanol, palmitato de cetilo, óleos vegetais, ésteres de sorbitano de ácidos gordos (Span), polietilenoglicóis, e produtos de condensação entre ésteres de sorbitano de ácidos gordos e óxido de etileno, p.ex. monooleato de polioxietileno-sorbitano (Tween).
Exemplos de bases de pomadas hidrófobas são, mas não estão limitados a, parafinas, óleos vegetais, gorduras animais, glicerídeos sintéticos, ceras, lanolina, e polialquilsiloxanos líquidos. 67
Exemplos de bases de pomadas hidrófilas são, mas não se limitam a, macrogóis sólidos (polietilenoglicóis).
Exemplos de componentes em pó são, mas não se limitam a, alginato, colagénio, lactose, pó que é capaz de formar um gel quando aplicado a uma ferida (absorve o liquido/exsudado da ferida).
Exemplos de diluentes e agentes de desintegração são, mas não se limitam a, lactose, sacarose, Emdex, fosfatos de cálcio, carbonato de cálcio, sulfato de cálcio, manitol, amidos e celulose microcristalina.
Exemplos de agentes aglomerantes são, mas não se limitam a, sacarose, sorbitol, goma acácia, alginato de sódio, gelatina, amidos, celulose, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilcelulose, polivinilpirrolidona e polietilenoglicol.
Exemplos de agentes molhantes são, mas não se limitam a, laurilsulfato de sódio e polissorbato 80.
Exemplos de lubrificantes são, mas não se limitam a, talco, estearato de magnésio, estearato de cálcio, óxido de silicio, precirol e polietilenoglicol.
Exemplos de agentes de revestimento são, mas não se limitam a, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpropilidona, etilcelulose e polimetilacrilatos.
Exemplos de bases para supositórios são, mas não se limitam a, manteiga de cacau, Adeps solidus e polietilenoglicóis. 68 0 análogo de oí-MSH pode estar presente no medicamento numa quantidade de 0,001-99%, tipicamente 0,01-75%, mais tipicamente 0,1-20%, especialmente 1-15% tal como 1-10% em peso do medicamento. A dose depende da condição a tratar. Os fármacos individuais podem ser utilizados nas doses conhecidas na técnica. Contempla-se que a dose de um ou mais péptidos de acordo com a invenção estará no intervalo de 1 ng a 100 mg por kg de peso corporal, tipicamente de 1 pg a 10 mg por kg de peso corporal, tipicamente de 10 pg a 1 mg por kg de peso corporal, tal como 50-500 pg por kg de peso corporal.
Ainda noutro aspeto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica tal como descrito acima compreendendo um ou mais péptidos de acordo com a invenção opcionalmente com um transportador farmaceuticamente aceitável.
As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser preparadas através da utilização de técnicas convencionais conhecidas na técnica e com transportadores farmacêuticos convencionais. Além disso, a composição farmacêutica pode estar em qualquer forma adequada para qualquer uma das utilizações tal como aqui descritas. A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no seu âmbito pelas formas de realização especificas aqui divulgadas, uma vez que se pretende estas formas de realização como ilustrações de vários aspetos da invenção. Pretende-se que quaisquer formas de realização equivalentes estejam dentro do âmbito desta invenção. De 69 facto, várias modificações da invenção além das mostradas e descritas tornar-se-ão aparentes aos peritos na técnica a partir da descrição anterior. Pretende-se que tais modificações recaiam dentro do âmbito das reivindicações anexas. Várias referências são aqui citadas, cuja divulgação é incorporada por referência na sua totalidade.
Ao longo desta descrição, a palavra "compreender", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou passo, ou grupo de elementos, inteiros ou passos, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou passo, ou grupo de elementos, inteiros ou passos.
No que diz respeito à descrição acima dos vários aspetos da presente invenção e das formas de realização especificas destes aspetos, deve ser entendido que qualquer particularidade e caracteristica descrita ou mencionada acima, em ligação com um aspeto e/ou uma forma de realização de um aspeto do invenção se aplica também por analogia a qualquer ou a todos os outros aspetos e/ou formas de realização da invenção descritos. A invenção será a seguir descrita por meio das seguintes Figuras e Exemplos não limitantes.
Exemplos
No seguinte os métodos para testar os péptidos da invenção são descritos em geral. Os resultados para os péptidos 70 testados são apresentados nos exemplos 1-7. O objetivo dos métodos é o de testar os péptidos da invenção quanto a efeitos anti-inflamatórios e capacidade para inibir ou prevenir a disfunção ou destruição de células/tecidos/órgãos que ocorre em resultado de isquemia, inflamação ou efeitos tóxicos de um fármaco.
Uma resposta inflamatória ou uma exacerbação na inflamação crónica é caracterizada pela produção de mediadores derivados de células, tais como fator de necrose tumoral α (TNF)-a, interleucinas (IL-Ιβ, IL-8), óxido nítrico (NO), e radicais livres de oxigénio, que eventualmente induzirá danos endoteliais muito difundidos com perda do tónus das artérias em vasos sistémicos, maior permeabilidade capilar, hipotensão sustida e disfunção de órgãos, que no pulmão está associada a acumulação de leucócitos incluindo neutrófilos e eosinófilos dentro do espaço alveolar. O lipopolissacárido (LPS) libertado de agentes infeciosos tem um papel central na resposta inflamatória a infeção através da indução de vários mediadores inflamatórios incluindo TNF-α. Acredita-se que tratamentos com a capacidade de inibir a produção de TNF-α têm, portanto, marcados efeitos anti-inflamatórios. O inventor utiliza estimulação com LPS para produzir uma resposta inflamatória em várias configurações (ver configurações experimentais 1-3) e o marcador primário para um efeito anti-inflamatório dos péptidos de acordo com a invenção é a capacidade para inibir a produção de TNF-a. A isquemia induzida por paragem reduzida/completa no fornecimento de sangue arterial induz múltiplas reações dos tecidos incluindo acumulação de neutrófilos, outras respostas inflamatórias e morte celular. A identificação de 71 compostos que possam inibir ou prevenir (completamente ou parcialmente) muitas das deficiências ou destruições de células/tecidos/órgãos que ocorrem em resultado de isquemia/inflamaçao é de grande beneficio. 0 inventor utiliza dois modelos de isquemia temporária: 1) o modelo de isquemia-reperfusão do miocárdio em ratos, que imita o desenvolvimento de enfarte agudo do miocárdio seguido de restauração do fornecimento de sangue, uma vez que é atingido através de terapia fibrinolitica ou angioplastia coronária (Configuração experimental 4); 2) oclusão da artéria renal bilateral, que induz insuficiência renal aguda (IRA) comparável com a IRA induzida por redução temporária no fornecimento de sangue renal tal como observado em pacientes submetidos a grandes intervenções cirúrgicas (um exemplo pode ser intervenção cirúrgica devida a aneurisma da aorta abdominal) (Configuração experimental 5). A nefrotoxicidade é um efeito secundário bem conhecido do tratamento com cisplatina. Embora não necessariamente, a dose limitante de toxicidade renal afeta mesmo assim a maioria dos pacientes, e é observada uma diminuição significativa da taxa de filtração glomerular durante o tratamento. A toxicidade renal da cisplatina é considerada como um dano citotóxico direto nos nefrónios na medula externa, especialmente no segmento S3 dos túbulos proximais e no membro ascendente espesso da ansa de Henle. Assim, o tratamento com cisplatina resulta frequentemente em defeitos de reabsorção tubular incluindo uma capacidade diminuida para diluir a urina. Hipomagnesemia é observada em aproximadamente 50% dos pacientes tratados com cisplatina e é provavelmente devida a um defeito na reabsorção renal de magnésio (Mg). Um estudo recente 72 sugeriu que a suplementação de Mg é um fator crucial na proteção contra as ações nefrotóxicas da ciclosporina A e uma possivel relação entre a perda de Mg e a nefrotoxicidade induzida pela cisplatina foi recentemente sugerida. 0 tratamento destinado a prevenir hipomagnesemia teria, por conseguinte, efeitos benéficos não só para reduzir a necessidade de suplementação de Mg, como também para reduzir a toxicidade renal da cisplatina. 0 efeito dos péptidos de acordo com a invenção sobre a nefrotoxicidade induzida por cisplatina é examinado na configuração experimental 6. Métodos e Materiais
Os péptidos da presente invenção são os compostos de teste nos métodos descritos abaixo.
Configuração experimental 1
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos in vitro
20 mL de sangue humano são recolhidos em tubos Vacutainer contendo EDTA. Os PBMC são isolados utilizando Ficoll-Paque Plus como nas Instruções de Amersham 71-7167-00 AD, 2002-06. Os PBMC são contados utilizando Solução de Azul Tripano (Sigma) e incubados em RPMI 1640, (Applichem), suplementado com Hepes 10 mM (Sigma), L-glutamina 2 mM (Sigma), BSA a 0,1% (Sigma) e Penicilina/Estreptomicina a 50 U/50 yg/mL (Sigma) na concentração de 5*105 células/mL. Os PBMC isolados são incubados numa atmosfera húmida com C02 a 5%, ar a 95%, a 37°C, em placas de 24 poços de fundo plano (Corning Incorporated) com meio, 10 ng de LPS/mL (Sigma), e 73 composto de teste. Após 18 horas, as amostras são centrifugadas, e o TNF-oí no sobrenadante é medido utilizando Fator de Necrose Tumoral alfa [(h) TNF-oí] de Human Biotrak ELISA System (Amersham).
As amostras são incubadas como se segue por dador: PBMC em RPMI (Controlo de Tempo) PBMC com LPS a 10 ng/mL (Veiculo)
-17 M -15 M -13 M -11 M -9 M -7 M PBMC, 10 ng de LPS/mL, α-MSH ou análogo de a-MSH 10 PBMC, 10 ng de LPS/mL, a-MSH ou análogo de a-MSH 10 PBMC, 10 ng de LPS/mL, a-MSH ou análogo de a-MSH 10 PBMC, 10 ng de LPS/mL, a-MSH ou análogo de a-MSH 10 PBMC, 10 ng de LPS/mL, a-MSH ou análogo de a-MSH 10 PBMC, 10 ng de LPS/mL, a-MSH ou análogo de a-MSH 10
Todas as reserva soluções proteger frascos. amostras são diluidas a partir de uma solução de inicial entre 1,4χ10"4 M e 1,8*10"3 M. Todas as são manipuladas em frascos revestidos com BSA para contra a ligação do composto à superfície dos
Os dados são apresentados como média ± EP. O efeito dos compostos de teste na libertação de TNF-α induzida por LPS é expresso como a percentagem de acumulação de TNF-α no grupo de LPS-veiculo. Todas as comparações são analisadas com teste t de Student não emparelhado. As diferenças são consideradas significativas a niveis de probabilidade (p) de 0,05.
Configuração experimental 2
Inibição da produção de TNFa induzida por LPS em ratos in vivo 74
Animais experimentais. Ratos Wistar fêmeas (220-240 g) são obtidas em Charles River, Sulzfeld, Alemanha, e alojados numa sala de temperatura (22-24°C) e humidade (40-70%) controladas, com um ciclo de luz-escuridão de 12 h (luzes ligadas das 6h00 às 18h00) . Os ratos são mantidos numa dieta padrão de roedores com 140 mmol/kg de sódio, 275 mmol/kg de potássio e proteína a 23% (Altromin International, Lage, Alemanha) e têm livre acesso a água.
Preparação dos animais. Em anestesia com isoflurano-óxido nitroso, são implantados nos animais cateteres Tygon permanentes de grau médico na aorta abdominal e veia cava inferior, respetivamente, através de uma artéria e veia femorais. Depois da instrumentação, os animais são alojados individualmente durante 7-10 dias até ao dia da experiência.
Protocolo experimental. Antes das experiências todos os ratos são adaptados à gaiola de restrição utilizada para as experiências treinando-os durante dois períodos de duas horas cada. No dia da experiência, o animal é transferido para uma gaiola de restrição, e é iniciada uma infusão intravenosa de solução de veículo contendo glicose 150 mM. A velocidade de infusão é de 0,5 mL/h ao longo da experiência. Após um curto período de adaptação, é iniciada a infusão de lipopolissacárido (LPS) . É dado LPS (E. coli serotipo 0127 B8, L 3129, Sigma, St. Louis, USA) a uma dose de 4 mg/kg de peso corporal distribuída como uma infusão i.v. ao longo de 1 hora. Amostras de sangue arterial de 0,3 mL são tomadas 60, 90, e 120 minutos após o início da infusão de LPS e substituídas imediatamente com sangue heparinizado de um rato dador normal. 75
Grupos experimentais:
Além da infusão de LPS, todos os ratos são tratados com uma injeção em bolo de:
Veículo (0,5 mL de solução salina isotónica); α-MSH numa das seguintes doses: 50 μg/kg de p.c.; 200 pg/kg de p.c. ou 1000 pg/kg de p.c.;
Composto de teste numa das seguintes doses: 50 pg/kg de p.c.; 200 pg/kg de p.c. ou 1000 pg/kg de p.c.
Medição de TNF-α no plasma: As amostras de sangue são colhidas num tubo de ensaio pré-refrigerado com EDTA 0,5 mM, pH 7,4, e 20><106 UI/mL de aprotinina. Após centrifugação a 4°C, as amostras de plasma são transferidas para tubos de ensaio pré-refrigerados e armazenadas a -20°C para medições posteriores do TNF-α. O TNF-a no plasma é determinado através de um teste ELISA (Biotrak, Amersham, UK) .
Análises estatísticas. Os resultados são apresentados como médias ± EP. Um ANOVA de duas vias para medições repetidas é utilizado para testar as diferenças entre os grupos. No caso de P<0,05, as diferenças entre períodos correspondentes são avaliadas através de testes t não emparelhados com correção de Bonferroni do nível de significância.
Configuração experimental 3
Inibição da infiltração de neutrófilos e eosinófilos após inalação de LPS em ratos. 76
Ratos Sprague-Dawley machos (peso *200 g) de M&B A/S, DK-8680 Ry, Dinamarca, são usados para todas as experiências. Os ratos são enjaulados em gaiolas padrão de tipo 3 e alojados numa sala de temperatura (22-24°C) e humidade controladas (40-70%), com um ciclo de luz-escuridão de 12 h (luzes acesas das 6h00 às 18h00) . A dieta é formulação especial Altromin 1324 autoclavada, Produzida por Altromin Denmark, Chr. Pedersen A/S, 4100 Ringsted, Denmark. A dieta e a água são administradas ad libitum.
Após aclimatação, os ratos são alocados aleatoriamente a grupos experimentais e é-lhes administrado i.v. composto de teste no inicio da indução com LPS e novamente 8 horas após a indução com LPS.
Os ratos em grupos de 3 são anestesiados com 0,1 mL de Hypnorm/Dormicum por 100 g e é-lhes administrado i.v. o composto de teste. Imediatamente após a administração, são colocados na câmara de inalação onde são sujeitos a uma solução nebulizada de LPS. A concentração de LPS é de 1 mg/mL. O tempo de dosagem é de 15 minutos. Os ratos são eutanasiados 24 horas após a administração da substância de teste. No término, os ratos são eutanasiados com CO2/O2.
Em seguida, é realizada lavagem broncoalveolar através da instilação e retirada de 6x2,5 mL de PBS no pulmão direito. A lavagem é feita com os pulmões permanecendo no tórax após remoção do esterno e costelas. A conexão ao pulmão esquerdo é cortada por atadura durante este procedimento. O lavado broncoalveolar (LLBA) é centrifugado a 1000 rpm a 4°C durante 10 minutos. Após remoção do sobrenadante, o sedimento celular é ressuspenso em 0,5 mL de PBS e é efetuada a contagem total de células. São feitas duas 77 manchas de LLBA coradas com corante May-Gruwald Giemsa a partir de cada rato. 0 LLBA de cada rato é submetido a contagem das células totais e a contagem diferencial de leucócitos.
Grupos experimentais:
Além da infusão de LPS todos os ratos são tratados com injeções de bolo de:
Veiculo (0,5 mL de solução salina isotónica); a-MSH: 200 pg/kg/p.c.
Análogo de a-MSH: 200 pg/kg/p.c.
Finalmente, um grupo de controlo do tempo sem inalação de LPS é tratado com veiculo.
Estatística
Os dados são apresentados como média ± EP. As comparações entre grupos são realizadas através de análise de variância de uma via seguida de teste de Diferença Minima Significativa de Fisher. As diferenças são consideradas significativas ao nivel 0,05.
Configuração experimental 4
Inibição de libertação de citocina induzida por LPS e hipertensão pulmonar em porcos in vivo.
Porcos Landrace fêmeas («30 kg) são privados de alimento durante a noite mas é-lhes permitido acesso livre a água. Em seguida, os porcos são pré-medicados com cetamina
intramuscular (10 mg/kg) e midazolam (0,25 mg/kg). A anestesia é induzida com cetamina intravenosa (5 mg/kg). Os 78 porcos são entubados oralmente, e a anestesia é mantida com uma infusão intravenosa continua de fentanilo (60 pg/kg/h e midazolam (6 mg/kg/h). Os animais são ventilados com um ventilador de volume controlado (ventilador Servo 90 0; Siemens Elema, Solna, Suécia), com uma pressão expiratória positiva de 5 cm de H20. O volume corrente é mantido a 10-15 mL/kg, e a frequência respiratória ajustada (20-25 respirações/min) para manter normocapnia (tensão de dióxido de carbono arterial [PaC02] no intervalo de 34-45 mmHg). A ventilação é realizada com oxigénio no ar com o objetivo de atingir uma tensão de oxigénio arterial (Pa02) superior a 105 mmHg. Uma bainha arterial e 2 venosas são colocadas na artéria carótida e veias correspondentes para infusão, medições da pressão sanguínea através de cateter cheio de fluido, amostragem de sangue e para introdução de cateteres.
Um cateter de Swan-Ganz (Edwards Lifescience Corp., Irvine, CA) é inserido na artéria pulmonar através da veia cava superior direita. A localização do cateter com ponta de balão é determinada através da observação do traçado caracteristico da pressão no monitor, à medida que avança através do lado direito do coração para a artéria pulmonar, bem como através de raios X. Outro cateter (5 French; St. Jude Medicai Company, St. Paul, MN) é inserido na artéria carótida esquerda para monitorização continua da pressão sanguínea e amostragem de sangue. Um cateter de urina é inserido para colheita de urina. Um cateter de ritmo temporário é inserido através da bainha venosa até ao átrio direito (guiado por raios X) para padronizar a frequência cardíaca, quando se avalia o desempenho cardíaco. 79
Monitorização Hemodinâmica. São realizadas observações contínuas da pressão sanguínea arterial, frequência cardíaca (a partir do eletrocardiograma) e pressão da artéria pulmonar (PAP). Infusão de lipopolissacárido.
Endotoxina lipopolissacárida de Escherichia coli (Bacto Lipopolissacáridos de E. coli 026:_6; Difco Laboratories, Detroit, MI) é dissolvida em solução salina 120 min antes de cada experiência para dissolver qualquer precipitado. Após um período de estabilização, a infusão de lipopolissacárido é iniciada no limiar a uma taxa de 2,5 pg/kg/h e aumentada gradualmente até 15 pg/kg/min durante 30 min. Depois disso, a fusão foi mantida a uma taxa de 2,5 pg/kg/h durante 150 min e em seguida interrompida.
Grupos de intervenção: Ao grupo de controlo é dado veículo num volume igual ao do grupo de intervenção imediatamente antes da infusão de LPS ser iniciada. Ao grupo de intervenção é dada uma dose de análogo de a-MSH, 200 pg/kg, como uma única injeção intravenosa em bolo. Citocinas. Amostras frescas de plasma congelado (-80°C) obtidas a partir de sangue estabilizado com EDTA são utilizadas para medições de TNF-α através da utilização de ensaios imunossorventes ligados a enzimas comercialmente disponíveis de acordo com as instruções do fabricante.
Estatística. Os dados são apresentados como média ± EP. As comparações entre grupos são efetuadas através de uma análise de variância de uma via seguida por teste de Diferença Mínima Significativa de Fisher. As diferenças são consideradas significativas ao nível de 0,05. 80
Configuração experimental 5
Inibição do tamanho do enfarte do miocárdio, induzido por 60 minutos de oclusão da artéria coronária descendente anterior esquerda em ratos.
Ratos Wistar fêmeas criados em barreira e livres de patogénios específicos (250 g) são obtidos em Charles River, Hannover, Alemanha. Os animais são alojados numa sala de temperatura (22-24°C) e humidade (40-70%) controladas com um ciclo de luz-escuridão de 12 horas (luzes acesas das 6h00 às 18h00) . É dado livre acesso a todos os animais a água da torneira e a uma dieta de granulado para ratos contendo aproximadamente 140 mmol/kg de sódio, 275 mmol/kg de potássio e proteina a 23% (n°. de catálogo Altromin 1310, Altromin International, Lage, Alemanha).
Os ratos são instrumentados com cateteres permanentes Tygon de grau médico na veia cava inferior e na aorta abdominal através da veia e artéria femorais. Uma semana depois os Ratos são anestesiados numa câmara de inalação com isoflurano a 4% em 02. Após a inserção de um tubo endotraqueal, o animal é ventilado artificialmente com isoflurano a 1,0% em 02 utilizando um ventilador Hugo Basile Rodent. O volume corrente é de 8-10 mL/kg p.c. e a frequência respiratória de 75 min"1, o que mantém o pH arterial entre 7,35 e 7,45. Durante a cirurgia o animal é colocado numa mesa aquecida que mantém a temperatura retal a 37-38°C. O ECG padrão (segundo) é medido utilizando um Hugo Sachs ECG Coupler e colhido em linha a 4000 Hz em PowerLab. Após toracotomia para-esternal e abertura do pericárdio, a artéria coronária descendente anterior 81 esquerda (DAE) é localizada visualmente. Uma sutura de seda 6-0 atraumática com um oclusor que permite a reabertura da ligadura é colocada à volta da DAE entre o tronco pulmonar e a extremidade inferior direita da auricula esquerda. Após 10 minutos, a artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE) está obstruida. A oclusão bem-sucedida é confirmada por alterações no ECG (elevação do segmento ST e aumento da amplitude da onda R) e pela queda da PAM. A reperfusão é feita após 60 minutos através da abertura do oclusor. Os ratos de controlo são sujeitos a operação simulada.
Os ratos são sujeitos a um dos seguintes tratamentos i.v.: Veiculo: 0,5 mL de NaCl 150 mM. a-MSH: 200 pg ou 1000 pg de hormona estimulante de melanócitos α/kg de p.c. em 0,5 mL de NaCl 150 mM.
Composto de teste: 2 00 pg ou 1000 pg de composto de teste/kg de p.c. em 0,5 mL de NaCl 150 mM. O tratamento é administrado 5 minutos antes da reperfusão.
Determinação do tamanho do miocárdio isquémico e necrótico
Os ratos são mantidos anestesiados após a isquemia/reperfusão e a re-oclusão da DAE é realizada após três horas de reperfusão. Durante este período o ECG e a PAM são medidos continuamente. Em seguida, corante azul de Evans (1 mL, 2% p/v) é administrado i.v. para determinar o tamanho da área isquémica. O coração é removido e cortado em fatias horizontais para determinar o tamanho da área isquémica e para separar o miocárdio isquémico do miocárdio não isquémico. A área isquémica é isolada e incubada numa solução de cloreto de trifeniltetrazólio a 0,5% durante 10 minutos a 37°C. O tamanho do tecido necrótico é então 82 medido através da utilização de um programa de imagem computorizado. Um conjunto adicional de animais são tratados com buprenorfina após cirurgia e regressam às gaiolas para medição da pressão diastólica ventricular final esquerda (PDVFE) duas semanas mais tarde, para avaliar o efeito do tratamento farmacológico no desenvolvimento de insuficiência cardíaca congestiva. A PDVFE é medida utilizando um cateter 2F microtip inserido no ventrículo esquerdo através da artéria carótida direita. A concentração de isoflurano é ajustada para estabilizar a pressão arterial média (PAM) a 85-90 mmHg.
Estatística
Os dados são apresentados como média ± EP. As comparações dentro dos grupos são analisadas com teste t de Student emparelhado. As comparações entre grupos são realizadas através de uma análise de variância seguida pelo teste da Diferença Mínima Significativa de Fisher. As diferenças são consideradas significativas ao nível de 0,05.
Configuração experimental 6
Inibição de insuficiência renal induzida por 40 minutos de oclusão bilateral das artérias renais em ratos
Ratos Wistar fêmeas criados em barreira e livres de patogénios específicos (250 g) são obtidos em Charles River, Hannover, Alemanha. Os animais são alojados numa sala de temperatura (22-24°C) e humidade (40-70%) controladas com um ciclo de luz-escuridão de 12 horas (luzes acesas desde a 6h00 até às 18h00). É dado a todos os animais livre acesso a água da torneira e a uma dieta de 83 granulado para ratos contendo aproximadamente 140 mmol/kg de sódio, 275 mmol/kg de potássio e proteína a 23% (n°. de catálogo Altromin 1310, Altromin International, Lage, Alemanha).
Os ratos, que foram previamente instrumentados com um cateter venoso crónico, são colocados em gaiolas metabólicas e após um período de aclimatação de dois dias às gaiolas metabólicas, IRA experimental é induzida por oclusão de ambas as artérias renais durante 60 minutos. Durante a cirurgia os ratos são anestesiados com isoflurano-óxido nitroso e colocados numa mesa aquecida para manter a temperatura rectal a 37°C. Ambos os rins são expostos através de incisões nos flancos, mobilizados ao serem dissecados da gordura peri-renal, em seguida uma pequena porção da artéria renal é suavemente dissecada da veia. As artérias renais são obstruídas com um grampo vascular de superfície lisa (60 g de pressão, World Precision Instruments, UK) durante 40 min. A isquemia total é confirmada através da observação de branqueamento da superfície total do rim. Durante o período de isquemia, as feridas são fechadas temporariamente para manter a temperatura corporal. Após os grampos serem removidos, os rins são observados durante mais 2-5 minutos para assegurar mudança de cor, indicando o refluxo de sangue. Em seguida, a ferida é fechada com ligaduras de seda 3-0. Os ratos regressaram às gaiolas metabólicas, e foram medidos diariamente a produção de urina e a ingestão de água em 24 h durante cinco dias. Como grupo de controlo, os ratos são submetidos a operações simuladas idênticas às utilizadas para os ratos de IRA sem oclusão das artérias renais. Os ratos sujeitos a operação simulada são monitorizados em paralelo com os ratos de IRA. 84
Os ratos são submetidos a um dos seguintes tratamentos i . v. :
Veiculo: 0,5 mL de NaCl 150 mM. a-MSH: 200 pg de hormona estimuladora de melanócitos a/kg de p.c. em 0,5 mL de NaCl 150 mM.
Composto de teste: 200 pg de composto de teste/kg de p.c. em 0,5 mL de NaCl 150 mM. O tratamento é administrado 5 minutos antes da reperfusão do rim e subsequentemente 6 e 24 horas mais tarde.
Estatística
Os dados são apresentados como média ± EP. As comparações dentro dos grupos são analisadas com teste t de Student emparelhado. As comparações entre os grupos são realizadas através de análise de variância de uma via seguida pelo teste da Diferença Mínima Significativa de Fisher. As diferenças são consideradas significativas ao nível de 0,05.
Configuração experimental 7
Inibição de insuficiência renal induzida por Cisplatina
Ratos, que anteriormente foram instrumentados com um cateter venoso crónico, são colocados em gaiolas metabólicas e após um período de aclimatação às gaiolas metabólicas, os ratos são tratados com uma injeção intraperitoneal de cisplatina a 5,0 mg/kg de p.c. em 0,5 mL de NaCl 150 mM ou veículo (0,5 mL de NaCl 150 mM) . Cinco dias depois os ratos são então devolvidos às gaiolas metabólicas, e são medidas diariamente a produção de urina 85 e a ingestão de água em 24 e recolhidas durante os cinco dias seguintes. Todos os ratos são então anestesiados em halotano/N20 e é colhida uma amostra de sangue arterial em frascos revestidos com EDTA pré-refrigerados. As amostras de sangue são colhidas num tubo de ensaio pré-refrigerado com EDTA 0,5 mM, pH 7,4, e 20xl06 UI/mL de aprotinina. Após centrifugação a 4°C, as amostras de plasma são transferidas para tubos de ensaio pré-refrigerados e armazenadas à temperatura de -20°C para medições posteriores de creatinina e magnésio (Mg) . Além disto, a creatinina é também medida na urina recolhida no último periodo de 24 horas antes da colheita de sangue. A eliminação da creatinina (Ccr) , utilizada como indice da taxa de filtração glomerular (TFG) , pode então ser calculada como CCr=VuxUcr/Pcr, onde Vu é a produção de urina de 24 horas; Ucr é a concentração da creatinina na urina e Pcr é a concentração de creatinina no plasma. A medição de creatinina na urina e no plasma é realizada através da utilização de sistemas de química clínica VITROS 950 (Ortho-Clinical Diagnostics Inc., Johnson & Johnson, NJ) e Roche Hitachi Modular (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha).
Os ratos são sujeitos a um dos seguintes tratamentos i.v.: Veículo: 0,5 mL de NaCl 150 mM a-MSH: 200 yg de hormona estimuladora de melanócitos a/kg de p.c. em 0,5 mL de NaCl 150 mM.
Composto de teste: 200 yg de composto de teste/kg de p.c. em 0,5 mL de NaCl 150 mM. O tratamento é dado 5 minutos antes da reperfusão do rim e subsequentemente 6 e 24 horas depois. 86
Estatística
Os dados são apresentados como média ± EP. As comparações dentro dos grupos são analisadas com teste t de Student emparelhado. As comparações entre grupos são efectuadas através de análise de variância de uma via seguida de teste da Diferença Minima Significativa de Fisher. As diferenças são consideradas significativas ao nivel de 0,05.
Resultados
Exemplo 1 O composto de teste é o análogo de a-MSH #1: Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO. 1* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) O composto é testado na configuração experimental 1-7.
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos in vitro
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) reduziram de forma dependente da dose a acumulação de TNF-a induzida por LPS na suspensão de leucócitos humanos. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido α-MSH nativo, a-MSH inibe a acumulação de TNF-α para 73±9% da resposta máxima (LPS-Veículo). Em contraste com isto o análogo de a-MSH #1 87 (SEQ ID NO. 1*) é capaz de reduzir a acumulação de TNF-a para 47±2% de veículo (P<0,01 vs α-MSH) (ver figura 1).
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS em ratos in vivo
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) reduzem a acumulação de TNF-α em ratos durante a infusão iv de LPS. 0 efeito inibitório máximo de α-MSH, assim como do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) é alcançado a uma dose de 200 pg/kg de peso corporal e o efeito inibidor máximo na produção de TNF-α é mostrado 120 minutos após o início da infusão de LPS. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido a-MSH nativo. Enquanto α-MSH inibe a concentração de TNF-α no plasma de ratos para 1713% da resposta máxima (LPS-Veículo) , o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) é capaz de reduzir a acumulação de TNF-α para 911% do veículo (P=0,05 vs α-MSH) (ver figura 2) .
Inibição da infiltração de neutrófilos e eosinófilos após inalação de LPS em ratos
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) reduzem a resposta inflamatória à inalação de LPS no espaço alveolar, tal como mostrado por uma redução acentuada de eosinófilos no LLBA recolhido 24 horas após a inalação de LPS. O tratamento com α-MSH reduz o número de eosinófilos no LLBA para 26,7i4,3xl05 células (P vs Veículo<0,05) e o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) reduz o número de eosinófilos para 49,0110,5^105 células (P vs VeículocO, 05) em comparação com ratos tratados com veículo onde o número 88 de eosinófilos no LLBA é de 164,β±42,2xl05 células (ver figura 3) . De acordo com o de cima, o efeito do número de neutrófilos no LLBA é semelhante para α-MSH e o análogo de Oí-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) .
Inibição da libertação de citocina induzida por LPS e hipertensão pulmonar em porcos in vivo. 0 análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) tem efeitos anti-inflamatórios acentuados mostrados por uma redução acentuada nas concentrações plasmáticas de TNFa após infusão de LPS em porcos tratados com o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*). Além deste efeito anti-inflamatório, o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) tem também surpreendentemente a capacidade para proteger contra o desenvolvimento de hipertensão pulmonar tal como evidenciado por uma atenuação acentuada dos aumentos em PAP induzidos por LPS verificados nos ratos tratados com análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) (aumento máximo em PAP: Veiculo: 22±4 mmHg vs análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) : 8±2 mmHg; p=0,05) (Ver figura 4).
Inibição do tamanho do enfarte do miocárdio, induzido por 60 minutos de oclusão da artéria coronária descendente anterior esquerda em ratos
Em contraste com α-MSH, o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) reduz surpreendentemente o tamanho do enfarte do miocárdio expresso como a área necrótica como fração da área de risco medida 3 horas após a reperfusão de DAE. 0 efeito inibitório máximo do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) é alcançado a uma dose de 200 pg/kg de peso corporal onde a redução no tamanho do enfarte é de *30% em 89 comparação com ratos tratados com Veículo (Veículo: 50,612,6% da área de risco vs análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*): 35,715,6% da área de risco, p=0,01). Na dose de 1000 pg/kg de peso corporal a redução no tamanho do enfarte é também ~30% em comparação com ratos tratados com Veículo (análogo de oí-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*): 35,014,4% área de risco, p<0,01 vs Veículo) (Ver figura 5). A medição da pressão diastólica ventricular final esquerda (PDVFE) num conjunto adicional de animais 14 dias após a oclusão de 60 minutos de DAE, mostra que o efeito benéfico do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) do tamanho dos enfartes estava associado a uma redução acentuada na PDVFE e, assim, o desenvolvimento de insuficiência cardíaca congestiva pós-enfarte (PDVFE: análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*): 10,412,9 mmHg; vs Veículo: 20,012,2 mmHg; P<0,01; vs Controlo do tempo: 7,512,3 mmHg; NS) (ver figura 6).
Inibição de insuficiência renal induzida por oclusão bilateral de 40 minutos das artérias renais em ratos A isquemia renal bilateral (RIR) de 60 minutos induz acentuada poliúria pós-isquémica. Os ratos de RIR têm poliúria sustida, que 5 dias após a agressão isquémica aumenta em 101% em comparação com os ratos sujeitos a operação simulada (RIR-Veículo: 34,8+3,3 mL/24 horas vs controlo de tempo: 17,312,1 mL/24 horas, p<0,01). O tratamento com α-MSH é incapaz de reduzir a poliúria (RIR-a-MSH: 29,012,9 mL/24 horas; NS vs RIR-Veículo).
Surpreendentemente, o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) é capaz de induzir uma normalização completa do caudal de urina (RIR-análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*): 18,813,6 mL/24 horas; NS vs controlo do tempo, P<0,01 vs RIR-Veículo) (ver figura 7) . 90
Inibição de insuficiência renal induzida por Cisplatina 0 tratamento com cisplatina induz acentuada hipomagnesemia e nefrotoxicidade tal como evidenciado pela queda da TFG. De acordo com isto os ratos tratados com cisplatina e veiculo induziram hipomagnesemia (Mg no Plasma: 0,6110,04 mM vs ratos de controlo: 0,7710,05 mM, P<0,05) e uma diminuição acentuada na TFG. O Mg no plasma é também reduzido nos ratos tratados com cisplatina e a-MSH (0,3710,04 mM, P<0,05 vs ratos de controlo). Surpreendentemente, o tratamento com o análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) previne hipomagnesemia induzida por cisplatina (0,8410,04 mM, NS vs ratos de controlo) e previne a queda na TFG induzida por cisplatina.
Exemplo 2 O composto de teste é o análogo de a-MSH #2: Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ. NO. 5* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) O análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5) difere do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) pela substituição de Met por Nle na posição 10 e pela substituição estereoquimica de Phe por (D-Phe) na posição 13. O composto é testado na configuração experimental 1-3 e 5-7. 91
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos in vitro
Tanto oí-MSH como o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) reduzem de forma dependente da dose a acumulação de TNF-a induzida por LPS na suspensão de leucócitos humanos. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) é marcadamente mais pronunciado do que o efeito anti-inflamatório do péptido α-MSH nativo. a-MSH inibe a acumulação de TNF-α para 73+9% da resposta máxima (LPS-Veiculo). Em contraste com isto, o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) é capaz de reduzir a acumulação de TNF-α para 42±11% de veiculo (P<0,01 vs α-MSH) (ver figura 8).
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS em ratos in vivo
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) reduzem a acumulação de TNF-α em ratos durante infusão iv de LPS. 0 efeito inibitório máximo de α-MSH, bem como do análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) é alcançado a uma dose de 200 yg/kg de peso corporal. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti- inf lamatório do péptido α-MSH nativo. Enquanto α-MSH inibe a concentração de TNF-α no plasma dos ratos para 17±3% da resposta máxima (LPS-Veiculo), o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) é capaz de reduzir a acumulação de TNF-α para 9+1% de veiculo (P<0,05 vs α-MSH) (ver figura 9).
Inibição da infiltração de neutrófilos e eosinófilos após inalação de LPS em ratos 92
Tanto oí-MSH como o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) reduzem a resposta inflamatória a inalação de LPS no espaço alveolar tal como mostrado por uma redução acentuada dos eosinófilos no LLBA colhido 24 horas após inalação de LPS. 0 tratamento com α-MSH reduz o número de eosinófilos no LLBA para 26,7 + 4,3χ105 células (P vs Veículo<0,05) e o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) reduz o número de eosinófilos para 34,018,6^105 células (P vs Veículo<0,05) em comparação com ratos tratados com veiculo onde o número de eosinófilos dentro do LLBA é de 164,6+42,2χ105 células (ver figura 10). Surpreendentemente, o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) tem efeitos inibitórios muito mais pronunciados nos neutrófilos no LLBA que α-MSH (análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*): 9,1±2,4χ105 células vs a-MSH: 20,l±2,5xl05 células; P<0,05) (ver figura 11).
Inibição do tamanho do enfarte do miocárdio, induzido por 60 minutos de oclusão da artéria coronária descendente anterior esquerda em ratos
Em contraste com α-MSH, o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) reduz surpreendentemente o tamanho do enfarte do miocárdio expresso como a área necrótica como fração da área de risco medida 3 horas após reperfusão de DAE. O efeito inibitório máximo do análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) é alcançado a uma dose de 200 yg/kg de peso corporal onde a redução no tamanho do enfarte é de ~27% em comparação com ratos tratados com veiculo (Veiculo: 51,412,1% da área de risco vs análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*): 37,4+5,1% da área de risco, p=0,01) (Ver figura 12). A medição da pressão diastólica ventricular final esquerda (PDVFE), num grupo adicional de animais 14 dias após os 60 minutos de oclusão da DAE, mostra que o efeito benéfico do análogo de a-MSH #2 93 (SEQ. NO. 5*) no tamanho dos enfartes está associado a uma redução acentuada na PDVFE e, assim, ao desenvolvimento de insuficiência cardiaca congestiva pós-enfarte.
Inibição de insuficiência renal induzida por 40 minutos de oclusão bilateral das artérias renais em ratos A isquemia renal bilateral (RIR) de 60 minutos induz marcada poliúria pós-isquémica. Os ratos de RIR têm poliúria sustida, que aos 5 dias após a agressão isquémica está aumentada em 101% em comparação com os ratos de controlo sujeitos a operação simulada (RIR-Veiculo: 34,813,3 mL/24 horas vs controlo do tempo: 17,312,1 mL/24 horas, p<0,01) . O tratamento com oí-MSH é incapaz de reduzir a poliúria (RIR-aMSH: 29,012,9 mL/24 horas; NS vs RIR-
Veiculo) em contraste com este tratamento com o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) que reduz acentuadamente o grau de poliúria verificado após RIR.
Inibição de insuficiência renal induzida por Cisplatina 0 tratamento com cisplatina induz acentuada hipomagnesemia e nefrotoxicidade tal como evidenciado pela queda na TFG. De acordo com isto os ratos tratados com cisplatina e veiculo desenvolvem hipomagnesemia (Mg no plasma: 0,6110,04 mM vs ratos de controlo: 0,7710,05 mM, P<0,05) associada a uma queda na TFG. O Mg no plasma é também reduzido nos ratos tratados com cisplatina e a-MSH (0,3710,04 mM, P<0,05 vs ratos de controlo). Em contraste com isto, o análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5*) previne hipomagnesemia induzida por cisplatina bem como a queda na TFG induzida por cisplatina.
Exemplo 3 94 0 composto de teste é o análogo de a-MSH #3: Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ ID NO. 9* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) 0 análogo de a-MSH #3 (SEQ. NO. 9) difere do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) pela substituição de Met por Nle na posição 10 e pela substituição de Phe por D-Nal na posição 13. O composto é testado na configuração experimental 1, 2 e 5.
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos in vitro
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) reduzem de forma dependente da dose a acumulação de TNF-a induzida por LPS na suspensão de leucócitos humanos. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido nativo α-MSH. a-MSH inibe a acumulação de TNF-α para 73±9% da resposta máxima (LPS-Veiculo). Em contraste com isto, o análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) é capaz de reduzir a acumulação de TNF-a para 53±13% do veiculo (P<0,05 vs α-MSH) (ver figura 13).
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS em ratos in vivo
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) reduzem a acumulação de TNF-α em ratos durante infusão iv de LPS. O efeito inibitório máximo de α-MSH, assim como do análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) é alcançado a uma dose 95 de 200 yg/kg de peso corporal. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido α-MSH nativo. Enquanto α-MSH inibe a concentração de TNF-α no plasma dos ratos para 17±3% da resposta máxima (LPS-Veiculo), o análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) é capaz de reduzir a acumulação de TNF-α para 11±3% de veiculo (P<0,05 vs aMSH) (ver figura 14).
Inibição do tamanho do enfarte do miocárdio, induzido por 60 minutos de oclusão da artéria coronária descendente anterior esquerda em ratos
Em contraste com α-MSH, o análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) reduz surpreendentemente o tamanho do enfarte do miocárdio expresso como a área necrótica como fração da área de risco medida 3 horas após reperfusão de DAE. O efeito inibitório máximo do análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) é alcançado a uma dose de 200 yg/kg de peso corporal onde a redução no tamanho do enfarte é «24% em comparação com ratos tratados com Veículo (Veículo: 51,312,1% da área de risco vs análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*): 39,013,4% da área de risco, p=0,05) (Ver figura 15). A medição da pressão diastólica ventricular final esquerda (PDVFE) num conjunto adicional de animais 14 dias após os 60 minutos de oclusão de DAE, mostra que o efeito benéfico do análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) no tamanho dos enfartes está associado a uma redução acentuada na PDVFE e, assim, ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca congestiva pós-enfarte.
Exemplo 4 96 0 composto de teste é o análogo de a-MSH #4: Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Ser-Ile-Ile-Ser-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ. NO. 13* acetilada no N-terminal e amidada no terminal C) O análogo de a-MSH #4 (SEQ. NO. 13) difere do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) pela substituição de Tyr por Ser na posição 8, pela substituição de Ser por Ile na posição 9, pela substituição de Met por Ile na posição 10 e pela substituição de Glu por Ser na posição 11. O composto é testado na configuração experimental 1 e 2.
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos in vitro
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #4 (SEQ. NO. 13*) reduzem de forma dependente da dose a acumulação de TNF-a induzida por LPS na suspensão de leucócitos humanos.
Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #4 (SEQ. NO. 13*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido nativo a-MSH.
Inibição da produção de TNF-α induzida por LPS em ratos in vivo
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #4 (SEQ. NO. 13*) reduzem a acumulação de TNF-α em ratos durante infusão iv de LPS. O efeito inibitório máximo de α-MSH, assim como do análogo de a-MSH #4 é alcançado a uma dose de 200 yg/kg de peso corporal. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #4 é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido nativo α-MSH. Enquanto 97 oí-MSH inibe a concentração de TNF-α no plasma de ratos para 17±3% da resposta máxima (LPS-Veiculo), o análogo de a-MSH #4 (SEQ ID NO. 13*) é capaz de reduzir a acumulação de TNF-α para 12±2% do veiculo (P<0,05 vs α-MSH) (ver figura 16).
Exemplo 5 0 composto de teste é o análogo de a-MSH #5: Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Ser-Ile-Ile-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ. NO. 17* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) 0 análogo de a-MSH #5 (SEQ. NO. 17) difere do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) através da substituição de Tyr com Ser na posição 8, através da substituição de Ser com Ile na posição 9, através da substituição de Met com Ile na posição 10, através da substituição de Glu com Ser na posição 11 e através de substituição estereoquimica de Phe com (D-Phe) na posição 13. O composto é testado na configuração experimental 1 e 2.
Inibição de produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos in vitro
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #5 (SEQ. NO. 17*) reduzem de forma dependente da dose a acumulação de TNF-a induzida por LPS na suspensão de leucócitos humanos. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #5 (SEQ. NO. 17*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido nativo a-MSH. 98
Inibição de produção de TNF-α induzida por LPS em ratos in vivo
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #5 (SEQ. NO. 17*) reduzem a acumulação de TNF-α em ratos durante infusão iv de LPS. 0 efeito inibitório máximo de α-MSH bem como do análogo de a-MSH #5 (SEQ. NO. 17*) é alcançado a uma dose de 200 yg/kg de peso corporal. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #5 (SEQ. NO. 17*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti- inflamatório do péptido nativo a-MSH.
Exemplo 6 O composto de teste é o análogo de a-MSH #6: Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (SEQ. NO. 2* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) O análogo de a-MSH #6 (SEQ. NO. 2) difere do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) pela substituição de (Lys)6 por (Glu)6 na posição 1-6 O composto é testado na configuração experimental 1 e 2.
Inibição de produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos in vitro
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #6 (SEQ. NO. 2*) reduzem de forma dependente da dose a acumulação de TNF-a induzida por LPS na suspensão de leucócitos humanos. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH 99 #6 (SEQ. NO. 2*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido nativo a-MSH.
Inibição de produção de TNF-α induzida por LPS em ratos in vivo
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #6 (SEQ. NO. 2*) reduzem a acumulação de TNF-α em ratos durante infusão iv de LPS. 0 efeito inibitório máximo de α-MSH bem como do análogo de a-MSH #6 (SEQ. NO. 2*) é alcançado a uma dose de 200 pg/kg de peso corporal. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #6 (SEQ. NO. 2*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti- inflamatório do péptido nativo a-MSH.
Exemplo 7 O composto de teste é o análogo de a-MSH #7: Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)-NH2 (SEQ. NO. 3* acetilada no terminal N e amidada no terminal C) O análogo de a-MSH #7 (SEQ. NO. 3) difere do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) pela substituição estereoquimica de Phe por (D-Val) na posição 19. O composto é testado na configuração experimental 1 e 2.
Inibição de produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos in vitro
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #7 (SEQ. NO. 3*) reduzem de forma dependente da dose a acumulação de TNF-a 100 induzida por LPS na suspensão de leucócitos humanos. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #7 (SEQ. NO. 3*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti-inflamatório do péptido nativo a-MSH.
Inibição de produção de TNF-α induzida por LPS em ratos in vivo
Tanto α-MSH como o análogo de a-MSH #7 (SEQ. NO. 3*) reduzem a acumulação de TNF-α em ratos durante infusão iv de LPS. O efeito inibitório máximo de α-MSH bem como do análogo de a-MSH #7 (SEQ. NO. 3*) é alcançado a uma dose de 200 yg/kg de peso corporal. Surpreendentemente, o efeito inibitório do análogo de a-MSH #7 (SEQ. NO. 3*) é marcadamente mais pronunciado que o efeito anti- inflamatório do péptido nativo a-MSH.
Legendas das figuras
Figura 1 Acumulação de TNF-α induzida por LPS em suspensão de leucócitos humanos A figura mostra o efeito anti-inflamatório máximo do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) (MCA#1) na configuração experimental 1. O efeito inibitório máximo na produção de TNF-α induzida por LPS foi alcançado por 1CT7 M tanto para α-MSH como MCA#1. Média ± EP (N=6-9 em cada grupo)*: p<0,05 vs Veiculo#: p<0,05 vs a-MSH.
Figura 2 Acumulação de TNF-α induzida por LPS no plasma A figura mostra o efeito anti-inflamatório máximo do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) (MCA#1) na configuração 101 experimental 2. O efeito inibitório máximo na produção de TNF-α induzida por LPS em ratos foi alcançado por 200 yg/kg de p.c. dado iv tanto para α-MSH como MCA#1. Média ± EP (N=4-6 em cada grupo).*: p<0,05 vs Veiculo#: p<0,05 vs a-MSH.
Figura 3 Eosinófilos A figura mostra o efeito de α-MSH e do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) (MCA#1) na acumulação de eosinófilos nos pulmões na configuração experimental 3. Ambos os compostos foram dados numa dose de 200 yg/kg de p.c. dado iv duas vezes por dia. Média ± EP (N=6-9 em cada grupo). *: diferente do veiculo.
Figura 4 Pressão arterial pulmonar A figura mostra o efeito do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) (MCA#1) nas alterações na pressão arterial pulmonar induzidas por LPS em porcos. Média ± EP (N=3 e 6 nos dois grupos). *: Diferente do veiculo.
Figura 5 Tamanho do enfarte 3 horas após reperfusão A figura mostra o efeito protetor do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) (MCA#1) no tamanho do enfarte do miocárdio na configuração experimental 4. O efeito máximo de MCA#1 foi alcançado por 200 yg/kg do peso corporal dado iv. Média ± EP (N=5-10 em cada grupo). *:diferente do veiculo.
Figura 6 PDVFE duas semanas após oclusão de 60 min de DAE 102 A figura mostra o efeito protetor do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) (MCA#1) no desenvolvimento de insuficiência cardíaca congestiva pós-enfarte na configuração experimental 4. O efeito de MCA#1 foi alcançado por 200 yg/kg de p.c. Média ± EP (N=6-9 em cada grupo). *: p<0,05 vs Falso; #: p<0,05 vs veículo.
Figura 7 Diurese A figura mostra o efeito protetor do análogo de a-MSH #1 (SEQ ID NO. 1*) (MCA#1) no desenvolvimento de poliúria pós- isquémica na configuração experimental 5. O efeito de MCA#1 foi alcançado através de 200 yg/kg de p.c. dado iv. Média ± EP (N=5-7 em cada grupo). *: diferente do veículo.
Figura 8 Acumulação de TNF-α induzida por LPS em suspensão de linfócitos humanos A figura mostra o efeito anti-inflamatório máximo do análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5) (MCA#2) na configuração experimental 1. 0 efeito inibitório máximo na produção de TNF-α induzida por LPS foi alcançado através de 10“7 M tanto para α-MSH como MCA#2. Média ± EP (N=6-9 em cada grupo).*: p<0,05 vs Veículo; #: p<0,05 vs a-MSH.
Figura 9 Acumulação de TNF-α induzida por LPS no plasma A figura mostra o efeito anti-inflamatório máximo de a-MSH e do análogo de a-MSH #2 (SEQ. NO. 5) (MCA#2) na configuração experimental 2. O efeito inibitório máximo na produção de TNF-α induzida por LPS em ratos foi alcançado por 200 yg/kg de p.c. dado iv tanto para α-MSH como MCA#2. 103 Média ± EP (N=4-6 em cada grupo). *: p<0,05 vs Veículo; #: p<0,05 vs cx-MSH.
Figura 10 Eosinófilos A figura mostra o efeito de α-MSH e do análogo de cx-MSH #2 (SEQ ID NO. 5*) (MCA#2) na acumulação de eosinófilos nos pulmões na configuração experimental 3. Ambos os compostos foram dados numa dose de 200 yg/kg de p.c. dado iv duas vezes por dia. Média ± EP (N=6-9 em cada grupo). *: diferente do veículo.
Figura 11 Neutrófilos A figura mostra o efeito de α-MSH e do análogo de a-MSH #2 (SEQ ID NO. 5*) (MCA#2) na acumulação de neutrófilos nos pulmões na configuração experimental 3. Ambos os compostos foram dados numa dose de 200 yg/kg de p.c. dado iv duas vezes por dia. Média ± EP (N=6-9 em cada grupo). *: diferente do veículo.
Figura 12 Tamanho do enfarte 3 horas após reperfusão A figura mostra o efeito protetor do análogo de a-MSH #2 (SEQ ID NO. 5*) (MCA#2) no tamanho do enfarte do miocárdio na configuração experimental 4. O efeito de MCA#3 foi alcançado por 200 yg/kg de p.c. dado iv. Média ± EP (N=5-10 em cada grupo). *: diferente do veículo.
Figura 13 Acumulação de TNF-α induzida por LPS em suspensão de linfócitos humanos 104 A figura mostra o efeito anti-inflamatório máximo do análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) (MCA#3) na configuração experimental 1. O efeito inibitório máximo na produção de TNF-cx induzida por LPS foi alcançado por 10”7 M tanto para α-MSH como MCA#3. Média ± EP (N=6-9 em cada grupo). *: p<0,05 vs Veiculo; #: p<0,05 vs a-MSH.
Figura 14 Acumulação de TNF-α induzida por LPS no plasma A figura mostra o efeito anti-inflamatório máximo de análogo de a-MSH #3 (SEQ. NO. 9) (MCA#3) na configuração experimental 2. O efeito inibitório máximo na produção de TNF-α induzida por LPS em ratos foi alcançado por 200 yg/kg de p.c. dado iv tanto para α-MSH como MCA#3. Média ± EP (N=4-6 em cada grupo). *: p<0,05 vs Veiculo; #: p<0,05 vs a-MSH.
Figura 15 Tamanho do enfarte 3 horas após reperfusão A figura mostra o efeito protetor do análogo de a-MSH #3 (SEQ ID NO. 9*) (MCA#3) no tamanho do enfarte do miocárdio na configuração experimental 4. O efeito de MCA#3 foi alcançado através de 200 yg/kg de p.c. dado iv. Média ± EP (N=5-10 em cada grupo). *: diferente do veiculo.
Figura 16 Acumulação de TNF-α induzida por LPS no plasma A figura mostra o efeito anti-inflamatório máximo do análogo de a-MSH #4 (SEQ. NO. 13) (MCA#4) na configuração
experimental 2. O efeito inibitório máximo na produção de TNF-α induzida por LPS em ratos foi alcançado por 200 yg/kg de p.c. dado iv tanto para α-MSH como MCA#4. Média ± EP 105 (N=4-6 em cada grupo). *: p<0,05 vs Veículo; #: p<0,05 vs a-MSH.
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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> REQUERENTE: Action Pharma A/S et al. <120> TÍTULO: Análogos de alfa-MSH terapeuticamente ativos <130> REFEREÊNCIA DO REGISTO/FICHEIRO: 39325PC01 107 <160> NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 101 <170> SUPORTE LÓGICO: FastSEQ para Windows Verão 4.0
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Glu Glu Glu Glu GIu Glu Ser Tyr Ser Xaa Glu His Phe Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:9 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: beta-2-naftil-d-alanina <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 112 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=NIe <4 0 0> SEQ ID NO:9
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Tyr Ser Xaa Glu His Xaa Arg Trp Gly 1 5 10 15
Lys Pro Vai <210> SEQ ID NO:10 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: beta-2-naftil-d-alanina <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=NIe <4 0 0> SEQ ID NO:10
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Tyr Ser Xaa Glu His Xaa Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai <210> SEQ ID NO:11 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: 113
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: beta-2-naftil-d-alanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 19 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=NIe <400> SEQ ID NO:11
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Tyr Ser Xaa Glu His' Xaa Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:12 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: beta-2-naftil-d-alanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 19 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina 114
<221> ΝΟΜΕ/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=NIe <400> SEQ ID NO:12
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Tyr Ser Xaa Glu His Xaa Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:13 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:13
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Ile Ile Ser His Phe Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:14 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:14
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Ile Ile Ser His Phe Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai 115
<210> SEQ ID NO:15 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 19 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Ile Ile Ser His Phe Arg Trp Gly 1 '5 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:16 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 19 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:16
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Ile Ile Ser His Phe Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai 116
<210> SEQ ID NO:17 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-fenilalanina <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:17
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Ile Ile Ser His Phe Arg Trp Gly 1 .5 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:18 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-fenilalanina <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:18
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Ile Ile Ser His Phe Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai 117
<210> SEQ ID NO:19 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-fenilalanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 19 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:19
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Ile Ile Ser His Phe Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:20 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-fenilalanina <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 19 118 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:20
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Ile Ile Ser His Phe Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:21 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=beta-2-naftil-d-alanina <400> SEQ ID NO:21
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Ile Ile Ser His Xaa Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai <210> SEQ ID NO:22 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH 119 <221> ΝΟΜΕ/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=beta-2-naftil-d-alanina <400> SEQ ID NO:22
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Ile Ile Ser His Xaa Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:23 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 19 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=beta-2-naftil-d-alanina <400> SEQ ID NO:23
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Ile Ile Ser His Xaa Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai <210> SEQ ID NO:24 <211> COMPRIMENTO: 19 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial 120 <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 19 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 13 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=beta-2-naftil-d-alanina <400> SEQ ID NO:24
Glu Glu GIu Glu Glu Glu Ser Ser Ile Ile Ser His Xaa Arg Trp Gly 15 10 15
Lys Pro Vai
<210> SEQ ID NO:25 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:25
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Vai 15 10 15
<210> SEQ ID NO:26 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial 121 <220> CARACTERÍSΤICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:26
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Mat Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Vai 15 10 15
<210> SEQ ID NO:27 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 16 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:27
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro.Vai 1 5 10 15
<210> SEQ ID NO:28 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 16 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH 122 <4 Ο Ο> SEQ ID ΝΟ:2 8
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Vai 15 10 15
<210> SEQ ID NO:2 9 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-fenilalanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 7 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=Nle <4 0 0> SEQ ID NO:2 9
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Xaa Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Vai 15 10 15
<210> SEQ ID NO:30 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO 123 <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-fenilalanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 7 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=Nle <400> SEQ ID NO:30
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Xaa Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Vai 1 5 10 15
<210> SEQ ID NO:31 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-fenilalanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 16 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 7 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=Nle <400> SEQ ID NO:31
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Xaa Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Vai 1 5 10 15 124
<210> SEQ ID NO:32 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-fenilalanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 16 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 7 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=Nle <400> SEQ ID NO:32 GIu Glu Glu Glu Glu Glu Xaa Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Vai 15 10 15
<210> SEQ ID NO:33 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH 125 <221> ΝΟΜΕ/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=beta-2-naftil-d-alanina <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xa=Nle <400> SEQ ID NO:33
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Xaa Glu His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Vai 15 10 15
<210> SEQ ID NO:34 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=beta-2-naftil-d-alanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 7 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=Nle <400> SEQ ID NO:34
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Xaa Glu His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Vai 1 5 10 15
<210> SEQ ID NO:35 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial 126 <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=beta-2-naftil-d-alanina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 16 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 7 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=Nle <400> SEQ ID NO:35
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Xaa Glu His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Vai 15 10 15
<210> SEQ ID NO:36 <211> COMPRIMENTO: 16 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 10
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=beta-2-naftil-d-alanina <221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO 127 <222> LOCALIZAÇÃO: 16 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: d-valina
<221> NOME/CHAVE: MUTAGÉNIO <222> LOCALIZAÇÃO: 7 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: Xaa=Nle <400> SEQ ID NO:36
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Xaa Glu His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Vai 15 10 15
<210> SEQ ID NO:37 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:37
Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:38 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:38
Glu Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 128
<210> SEQ ID NO:39 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:39
Lys Glu Lys Lys Lys Lys I 5
<210> SEQ ID NO:40 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:40
Lys Lys Glu Lys Lys Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:41 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:41 129
Lys Lys Lys Glu Lys Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:42 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:42
Lys Lys Lys Lys Glu Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:43 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:43
Lys Lys Lys Lys Lys Glu 1 5
<210> SEQ ID NO:44 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH 130 <4 0 0> SEQ ID NO:44 Glu Glu Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:45 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:45 Glu Lys Glu Lys Lys Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:4 6 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:46 Glu Lys Lys Glu Lys Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:47 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial 131 <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:47
Glu Lys Lys Lys Glu Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:48 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:48
Glu Lys Lys Lys Lys Glu 1 5
<210> SEQ ID NO:4 9 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:4 9
Lys Glu Glu Lys Lys Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:50 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT 132 <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:50
Lys Glu Lys Glu Lys Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:51 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:51 Lys Glu Lys Lys Glu Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:52 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:52 Lys Glu Lys Lys Lys Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:53 133
<211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:53
Lys Lys Glu Glu Lys Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:54 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:54
Lys Lys Glu Lys Glu Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:55 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:55
Lys Lys Glu Lys Lys Glu 1 5 134
<210> SEQ ID NO:56 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:56
Lys Lys Lys Glu Glu Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:57 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:57
Lys Lys Lys Glu Lys Glu 1 5
<210> SEQ ID NO:58 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: SEQ ID NO:58 <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> 135
Lys Lys Lys Lys Glu Glu 1 5
<210> SEQ ID NO:59 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:59
Glu Glu Glu Lys Lys Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:60 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:60
Glu Glu Lys Glu Lys Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:61 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH 136 <4 0 0> SEQ ID NO:61 Glu Glu Lys Lys Glu Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:62 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:62 Glu Glu Lys Lys Lys Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:63 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:63
Glu Lys Glu Glu Lys Lys 1 5
<210> SEQ ID NO:64 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial 137 <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:64 Glu Lys Glu Lys Glu Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:65 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:65
Glu Lys Glu Lys Lys Glu 1 5
<210> SEQ ID NO:66 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA:
<223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:66
Glu Lys Lys Glu Glu Lys 1 5
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Glu Lys Lys Glu Lys Glu 1 5
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Glu Lys Lys Lys Glu Glu 1 5
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Lys Lys Lys Glu Glu Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:70 139 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:70 Lys Lys Glu Lys Glu Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:71 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:71 Lys Lys Glu Glu Lys Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:72 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:72 Lys ! Lys Glu Glu Glu Lys 1 5 140
<210> SEQ ID NO:73 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:73 Lys Glu Lys Lys Glu Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:74 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <4 0 0> SEQ ID NO:74 Lys Glu Lys Glu Lys Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:75 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:75 141
Lys Glu Lys Glu Glu Lys 1 5
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Lys Glu Glu Lys Lys Glu 1 5
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Lys Glu Glu Lys Glu Lys 1 5
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Lys Lys Glu Glu Glu Glu 1 5
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Lys Glu Lys Glu Glu Glu 1 5
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Lys Glu Glu Lys Glu Glu 1 5
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Lys Glu Glu Glu Lys Glu 1 5
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Lys Glu Glu Glu Glu Lys 1 5
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Glu Glu Lys Glu Lys Glu 1 5 146
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Glu Glu Lys Glu Glu Lys 1 5
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Glu Glu Glu Lys Lys Glu 1 5
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Glu Glu Glu Lys Glu Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:93 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa <4 0 0> SEQ ID NO:93 Glu Glu Glu Glu Lys Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:94 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa <4 0 0> SEQ ID NO:94 Lys Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:95 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa 148 <4 0 0> SEQ ID NO:95 Glu Lys Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:96 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa <4 0 0> SEQ ID NO:96 Glu Glu Lys Glu Glu Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:97 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa <4 0 0> SEQ ID NO:97 Glu Glu Glu Lys Glu Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:98 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial 149
<22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa <4 0 0> SEQ ID NO:98 Glu Glu Glu Glu Lys Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:99 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa <4 0 0> SEQ ID NO:99 Glu Glu Glu Glu Glu Lys 1 5 <210> SEQ ID NO:100 <211> COMPRIMENTO: 6 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <22 0> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa <4 0 0> SEQ ID NO:100 Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> SEQ ID NO:101 <211> COMPRIMENTO: 13 <212> TIPO: PRT 150 <213> ORGANISMO: Sequência Artificial <220> CARACTERÍSTICA: <223> OUTRA INFORMAÇÃO: análogo de alfa-MSH <400> SEQ ID NO:101
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Vai 1 5 10

Claims (33)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido consistindo na sequência: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 1), em que o terminal amino do referido péptido é CH3-C(=0)-.
2. Péptido consistindo na sequência: Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 2), em que o terminal amino do referido péptido é CH3-C(=0)-.
3. Péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-0H.
4. Péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-NH2.
5. Péptido selecionado a partir do grupo que consiste em: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 3), Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 4), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 5), Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 6), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 7), 2 Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 8), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 9), Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 10), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 11), Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ IDNO: 12), em que o terminal amino do referido péptido é (B4)HN-, (B4) (B5)N-, ou (B6)HN-, em que B4 e B5 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquilo Ci_6, alcenilo C2-6, arilo C6-10/ aralquilo C7-16/ e alquilarilo C7-16; B6 é B4-C(=0)-; e em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-B1, em que Bl é selecionado a partir de OH, NH2, NHB2, N(B2) (B3), OB2, e B2, em que B2 e B3 são, independentemente, selecionados a partir de alquilo C1-6, alcenilo C2-6, arilo C6-icu aralquilo C7-16, e alquilarilo C7-16.
6. Péptido de acordo com a reivindicação 5, em que o referido péptido consiste na sequência: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val) (SEQ ID NO: 3).
7. Péptido de acordo com a reivindicação 5, em que o referido péptido consiste na sequência: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 5). 3
8. Péptido de acordo com a reivindicação 5, em que o referido péptido consiste na sequência: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (SEQ ID NO: 9).
9. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8, em que o terminal amino do referido péptido é (B4)HN-, em que B4 é H.
10. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8, em que o terminal amino do referido péptido é (B6)HN-, em que B6 é B4-C(=0)- e em que B4 é alquilo Cl-6 ·
11. Péptido de acordo com a reivindicação 10, em que B4 é alquilo Ci.
12. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-11, em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-B1, em que BI é OH.
13. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-11, em que o terminal carboxilo do referido péptido é -C(=0)-B1, em que BI é NH2.
14. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o péptido tem a capacidade para estimular um ou mais receptores de melanocortina selecionados a partir do receptor de melanocortina de tipo 1, 3, 4 e 5. 4
15. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o péptido tem pelo menos uma das seguintes propriedades: a) inibe a produção de TNF-α induzida por LPS por leucócitos humanos, b) inibe a infiltração de eosinófilos induzida por inflamação nos pulmões, c) inibe a infiltração de neutrófilos induzida por inflamação nos pulmões, d) inibe a acumulação de TNF-α induzida por inflamação no sangue circulante, e) reduz a insuficiência renal aguda induzida por isquemia, f) reduz o tamanho do enfarte do miocárdio, g) reduz o grau de insuficiência cardiaca pós-enfarte do miocárdio, h) reduz a hipertensão vascular pulmonar, i) reduz a insuficiência renal induzida por cisplatina.
16. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para utilização em medicina.
17. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a profilaxia de isquemia do miocárdio.
18. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a profilaxia de angina ou enfarte do miocárdio. 5
19. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a profilaxia de uma condição inflamatória selecionada a partir do grupo que consiste em inflamação pulmonar, artrite, dermatite, pancreatite, doenças inflamatórias do intestino, vasculite, septicemia bacteriana, pericardite, miocardite e endocardite.
20. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para redução de hipertensão vascular pulmonar.
21. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para redução de insuficiência renal aguda induzida por isquemia.
22. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para redução do tamanho de enfarte do miocárdio induzido por isquemia.
23. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para redução do grau de insuficiência cardíaca pós-enfarte do miocárdio.
24. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento de isquemia causada por cirurgia. 6
25. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento de isquemia causada por transplante de órgãos.
26. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento de isquemia causada por transplantes, dispositivos, enxertos ou próteses de inserção cirúrgica.
27. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 para o fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento de isquemia causada por choque séptico.
28. Utilização de um péptido de acordo com a reivindicação 19 para o fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento de doença inflamatória do intestino.
29. Utilização de um péptido de acordo com a reivindicação 19 para o fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento de artrite selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, osteoartrite e artrite reativa.
30. Composição farmacêutica compreendendo um péptido tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1-15.
31. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 30 compreendendo ainda um ou mais transportadores farmacêuticos. 7
32. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 30 ou 31 compreendendo ainda um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
33. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-32, em que a composição é uma composição parentérica, oral, tópica, trans-mucosa ou transdérmica.
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