PT86288B

PT86288B - Processo de preparacao de octapeptidos ciclicos antagonistas de vasopressina e de composicoes farmaceuticas

Info

Publication number: PT86288B
Application number: PT86288A
Authority: PT
Inventors: Fadia El-Fehail Ali
Original assignee: Smithkline Beckman Corp
Priority date: 1986-12-04
Filing date: 1987-12-03
Publication date: 1990-11-07
Also published as: AU8202587A; US4766108A; PT86288A; EP0270371A3; ZA879080B; IE873286L; DK628687D0; JPS63154699A; EP0270371A2; DK628687A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

O presente invento refere-se ao processo de preparação de compostos octapeptídos cíclicos que exibem uma poten te actividade antagonista de vasopressina. O presente inven to refere-se também ao processo de preparação de derivados que compreendem uma combinação de aminoácidos neutros e básicos ligados ao anel do hexapeptídeo cíclico.

Os compostos a cujo processo de preparação se refere o presente invento exibem uma actividade antagonista de vasopressina e/ou V₂· Sabe-se que a vasopressina contribui para o mecanismo de acções anti-diuréticas do rim. A acção destes compostos antagoniza a da hormona anti-diurética natural (ADH) fazendo com que o organismo excrete água.

M. Manning et al., (9th American Peptide Symposium) págs. 599-602 refere-se ao facto de,da substituição da glicinamida pela tirosinamida na cauda tripeptídica completa, i.e. Pro-Arg-GlyNH₂, resultarem compostos que exibem actividade antagonista de vasopressina.

O A

As Patentes do E.U.A. n—. 4 481 193 e 4 481 194 referem-se ao facto de, da remoção da prolina da posição 7, ou da remoção da prolina e da glicina das posições 7 e 9 das estruturas de compostos antagonistas de vasopressina, resultaram compostos que retêm uma actividade antagonista substan ciai, embora algo reduzida,

Pedido de Patente dos E.U.A. ns, de série 877 571 descreve antagonistas do tipo da vasopressina que compreendem duas unidades aminoácido básicas, tais como a arginina ou a lisina, ligadas directamente ao anel do tipo da vasopressina de dissulfureto cíclico.

presente invento refere-se ao processo de preparação de octapeptídeos cíclicos que exibem uma potente actividade antagonista de vasopressina . As estruturas destes octa peptídeos distinguem-se pelo facto de compreenderem uma cauda dipeptídica composta por uma combinação de uma unidade aminoácido neutra com uma básica, e que está directamente li

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SKB CASE 143 50 sr- - · * g 'ç?***

f. f

-4gada à unidade cisteína de um anel do tipo da vasopressina de dissulfureto.

Os compostos a cujo processo de preparação se refere o presente invento são representados pelas fórmulas estrutu rais seguintes:

CH₂CO - X - Z - Y - Asn - Cys - P - A - B

II onde

P é um isómero D ou L da Tyr, MeTyr, 0-AlkTyr, Trp, MeTrp, Vai, MeVal, phe, MePhe, Ile, Melle, Leu, MeLeu, Sar, Ser, ou MeSer;

A é um Isómero D ou L da Arg, Lys, HArg, MeArg, Orn, MeLys ou MeHArgy

B é OH, NH₂ OU NHAlq;

Z é Phe, 4’-AlkPhe, 0-AlkTyr, Ile ou Tyr;

X é um isómero D ou L da Phe, 4‘-AlkPhe, Vai, Nva,

Leu, Ile, Pba, prle, Cha, Abu, Met, Chg, Tyr ou 0-AlkTyr;

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SKB CASE 14350 ._r.·.....>·^!** > . -«H**

-5Y é Vai, ile, Abu, Ala, chg, Gin, Lys, Cha, Nle, Thr,

Phe, Leu ou Gly; e ^R1 ^{e R}2 são cada um hidrogénio, metilo, etilo, ou formam, juntamente com o carbono |b ao qual se ligam, anel cicloalquileno de 4-6 membros» um

Um grupo subgenérico preferido de compostos do presente invento compreende os compostos de fórmula i onde P é Tyr, A é Arg, e B é nh₂. Nas fórmulas I e H, e R₂, juntamente com o átomo de carbono p ao qual se ligam são prefe rivelmente ciclopentametileno.

presente invento inclui também o processo de prepa ração de sais, complexos ou pródrogas adicionais tais como ésteres dos compostos da invenção quando B é OH, especialmen te de sais de adição de ácido farmacêuticamente aceitáveis não tóxicos. Os sais de adição de ácido são preparados da forma convencional num solvente adequado, a partir do composto original e de um excesso de um ácido, tal como o ácido clorídrico, bromídrico, sulfuríco, fosfórico, acético, maleico, succínico, etanodissulfónico, ou metanossulfónico. Os produtos finais com as fórmulas I e II são constituídos por uma combinação de um grupo aminoácido neutro e de um básico nas suas estruturas, e deste modo, os seus sais de adição de ácido derivados podem ser fácilmente preparados. Os ésteres derivados da forma ácida dos produtos finais, tais como os ésteres de metilo, etilo, ou benzilo, são preparados como é conhecido na arte.

Na presente descrição e nas reivindicações usa-se a nomenclatura comum na arte dos péptidos e na química da vaso pressina. Quando não se menciona a configuração,, a unidade aminoácido está na configuração natural L. Em certas fórmulas estruturais adicionam-se, para maior clareza, os grupos tio das unidades Cap, Mpa e Cys.

As designações da arte dos péptidos aqui utilizadas são as seguintes: Cap, ácido |3 -mercapto- p> , p -cicloalquilenopropiónicoy Pmp, ácido 1¾ -mercapto- “p> , A -ciclopentame66 881

SKB CASE 14350

-6tilenopropiónico; Mpr, ácido -mercaptopropiónico; dPen_#ácido p -mercapto- p , j?> -dimetilpropiónico ou desaminopeni cilamina; 0-AlkTyr, O-alquiltirosina; Abu, ácido $-aminon-butírico; Chg^ ciclo-hexilglicina; Cha, ciclo-hexilalamina; Pba, ácido ol-aminofenilbutírico; Gin amida do ácido glu tâmico ou glutamina; Gly, glicina; Tyr, tirosina; Phe^ feni lalamina; MePhe, N-metilfenilalamina; 4’-AlkPhe, 4^r-alquilfenilalamina; MeAla, N-metilalaminaγ Vai, valina; MeVal, N-metilvalinaγ Ile, isoleucina; Nle, norleucina; Leu, leucina; MeLeu, N-metileucina; Ala, alanina; Arg, arginina; HArg, homoargininaγ MeArg, N-metilarginina; MeHArg, N-metil-homoar ginina; MeTyr, N-metiltirosina; Met, metionina· Asn, asparazina; Sar, sarcosina; Ser, serina; MeSer, N-metilserina; ile, isoleucina; Melle, N-metil-isoleucinaγ Trp, triptofano; MeTrp N-metiltriptofano; Orn, ornitina; Nva, norvalina; Lys, Usina; Tos,, tosilato; Clz, 2-clorobenzilbxicarbonilo; BHA, benzi drilamina; DMAP, 4-dimetilaminopiridina; DIEA, di-isopropiletilamina; HF, ácido fluorídrico; 4-MeBzl, 4-metilbenzilo; TFA, ácido trifluoroacético; DCC, diciclo-hexilcarbodiimida; Boc, terbutilóxicarbonilo; Z, benzilóxicarbonilo; VSP> vasopressina; HBT, hidróxibenzotriazolo; ACM, acetamidometilo; Mpa, ácidos p -mercaptopropiónicos não ciclícos; D-Tyr(Et), D-Phe(4*-0-etilo). Nas definições anteriores por exemplo na de MeArg, Me representa um metilo localizado no azoto/amido da unidade peptídica respectiva»

Alk representa um alquilo de cadeia curta com 1 a 4 carbonos. Estes podem estar, por exemplo, facultativamente ligados ao substituinte oxigénio de uma unidade tirosina na posição 2, ao azoto N-terminal da cauda, ou à posição 4’ de uma unidade Phe na posição 3. Estes substituintes alquilo in cluem metilo, etilo, n-propilo, isopropilo ou butilo. O substituinte alquilo preferido é o etilo.

Os produtos finais (I e II) são, de acordo com o presente invento, preparados por oxidação dos octapeptídos lineares seguintes, respectivamente:

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X - Z - Y - Asn

A

-7C - ch₂

II c

III e

^R1

R

C - CH₂

II c

- Cys - A

TV onde

X, Z, Y, P, a fórmula i

A, B, e R₂ têm o anterior. Os grupos posições 1 e 6 significado mercapto são membros Cada Q é um hidrogénio ou definido para das unidades nas um grupo protector removível tal como o acetamidometilo (ACM). O ditiol com a fórmula II pode também ser oxidado na forma de um derivado éster ou amida na posição 8. Por exemplo, a amida pode ser um dos peptídeos com a fórmula n onde B é -NHAlk ou -NH₂. Os ésteres podem incluir B onde B é O-Alk ou 0-benzilo.

A oxidação é realizada usando um excesso de um ferri cianeto de metal alcalino, tal como ferricianeto de potássio ou sódio, na presença do intermediário linear II. usa-se um solvente inerte adequado, preferivelmente um solvente mis cível com água, a um pH neutro, de cerca de 7 a cerca de 7,5. A reacção é realizada à temperatura ambiente ou inferior, até a reacção estar substancialmente completa. Preferivelmente, as concentrações do péptido dimercaptano linear e do agente oxidante são baixas, p.e._A de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 molar para a concentração de agente oxidante para vários litros de solução aquosa, para ciclizar de cerca de 1 acerca

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-8de 5 gramas de dimercaptano.

Podem também usar-se outros agentes oxidantes modera dos, com um potencial de oxidação grosseiramente equivalente ao do ferrocianeto, para a reacção de fecho do anel. Como alternativas pode usar-se a passagem de oxigénio através da mistura reaccional durante vários dias, iodo em metanol, peróxido de hidrogénio ou oxidação na presença de sais cúpricos, A ciclização ocorre também quando se substitui intramolecularmente um grupo tiol-protector removível tal como o grupo mercapto, da unidade Pmp.

Um grupo tio-protector especialmente útil é o grupo acetamidometilo (ACM). 0 iodo/álcool é usado para a cicliza ção directa num único passo do peptido linear bis-ACM-S.

Claro que, como um perito na arte reconhecerá, certos métodos de ciclização não são apropriados se estiver presente na estrutura do material de partida com a fórmula II, um centro reaccional interferente. 0 mercaptano linear de partida pode ter grupos protectores comuns temporariamen te presentes nas várias unidades lineares.

A cadeia peptídica dos peptídos lineares é normalmen te construída por passos a partir da unidade A na fórmula I e da unidade P na fórmula n e trabalhando no sentido das unidades Mpa ou Pmp. Cada unidade é adequadamente protegida como é conhecido na arte dos peptídos e como a seguir se des creve. A sequência reaccional por passos é convenientemente realizada num sintetizador de peptídos Beckman 990B ou num dispositivo equivalente sem isolamento de peptido linear in termediário. Os pormenores do procedimento encontram-se nos exemplos experimentais que aqui depois se apresentam.

Os vários aminoácidos (AA) que se adicionam consecutivamente à cadeia suportada na resina, são protegidos como é conhecido na arte. Por exemplo, o grupo protector Boc é usado para um grupo amino, especialmente na posição có ; um grupo benzilo facultativamente substituído para os grupos mercapto das unidades Pmp. Mpa ou Cys; Tosilo para as unida

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-9des Arg, Harg ou MeArg; e um grupo benziloxicarbonilo facul^ tativamente substituído (Z) para as unidades Tyr. Como grupos protectores usam-se muito convenientemente aqueles que não são fácilmente removidos por tratamento com um ácido mo derado, tal como se utiliza para remoção do grupo Boc. Em vez disso é preferível usar fluoreto de hidrogénio, amónia líquida-sódio ou, para os grupos benzilo ou benziloxicarbonilo, a hidrogenação catalítica.

Pode tratar-se o peptído suportado na resina com um excesso de fluoreto de hidrogénio anidro, com um composto extractor apropriado, tal como o anisolo, para preparar o peptído linear intermediário com as fórmulas III e IV com um bom rendimento.

Podem também preparar-se compostos com a fórmula I fazendo reagir a amida da arginina (ArgNH₂) ^{com uraa} forma protegida de P por qualquer processo convencional de preparação de peptidos. Podem também preparar-se os compostos com a fórmula li fazendo reagir a amida da tirosina (TyrNH^) com uma forma protegida de A por qualquer processo convencional de preparação de peptidos. Os materiais de partida, os ácidos 7-arginina, tais como os compostos com a fórmula II nos quais A é uma unidade do tipo arginina definida como anterior mente; são preparados como anteriormente se descreve, por uma sequência reaccional suportada na resina ou em solução.

Os compostos finais preparados de acordo com o presente invento têm uma actividade antagonista de vasopressina v^ e/ou V₂. á conhecido que a vasopressina contribui para o meca nismo de acção antidiuética do rim. Quando a acção destes com postos antagoniza a da hormona antidiuética natural, (ADH), o organismo excreta água devido a uma permeabilidade aumentada das partes terminais do túbulo renal, o mecanismo de acção re side nos receptores de vasopressina (receptores v₂) localizados na membrana plasmática de certas células do epitélio renal. o efeito farmacodinâmico mais notável dos antagonistas de ADH do presente invento é um efeito aquo-diurético ou aqua rético, em vez de um natriurético tal como o da hidroclorotia

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-10zida.

A actividade antagonista em relação à hormona anti diurética normal (actividade anti-ADH) é determinada, in vjtro, no tecido medular dos rins do porco ou do homem, e in vivò na ratazana hidropénica. 0 procedimento para os ensaios in vitro de activação da adenilatociclase estimulada pela va sopressina ou de activação de ligação da vasopressina, são descritos por F. Stassen et al., J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 223, 50-54 (1982). A actividade antagonista é determinada por procedimentos usando tecido de aorta torácica de ratazana e membranas plasmáticas do figado de ratazana. Estes procedimentos estão descritos na referida s t publicação de Stassen e numa publicação da ⁿl— International Conference ou Diuretics, Miami Florida_t E.U.A., de Março (1984). 0 antagonismo de oxitocina é determinado como é descrito por W. Sawyer et al., Endocrinology, 106 81 C1979).

Qualquer paciente sofrendo do sindroma de secrecção inadequada de hormona antidiurética (SIADH) ou de uma condição edematosa indesejável, é um utilizador potencial dos compostos a cujo processo de preparação se refere o presente invento. Exemplos de estados clínicos para os quais se podem usar os compostos do presente invento incluem a hiper tensão, a cirrose hepática, a hiponatremia, a insuficiência cardiaca congestiva ou um componente de qualquer condição traumática resultante de lesão ou doença graves, os compostos com as fórmulas I e II onde R^. e Rj formam, conjuntamen te com o átomo de carbono^ ao qual se ligam, um anel de 5 ou 6 membros são antagonistas especialmente potentes.

segundo grupo de centros receptores de vasopressisão os centros pressores vasculares (receptores V^) locja Estes podem tamna lizados no próprio sistema cardiovascular bém ser antagonizados pelos compostos do presente invento

Os congéneres com as fórmulas I e II, onde R^ e Rj são hidrogénio ou metilo são potentes antagonistas V^. Estes compostos tem também uma actividade anti-oxitócica substancial.

Deste modo, os compostos do presente invento são usa

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......

*:í’

-lidos especialmente para induzir actividade anti-hipertensora anti-oxitócica ou diurética em pacientes que necessitem de um tal tratamento. Estes compreende a administração interna, parenteral,. bucal ou por insuflação de uma quantidade não tóxica mas eficaz, de um composto escolhido,preferivelmente disperso num transportador farmacêutico. As unidades de dosagem de ingrediente activo são seleccionadas na gama de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/Kg, preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 1 mg/Kg, com base num paciente de 70 Kg. As unidades de dosagem são administradas a um paciente huma no ou animal de cerca de 1 a cerca de 5 vezes ao dia.

A composição farmacêutica que contém um ingrediente antagonista activo com as fórmulas I ou II, compreende uma unidade de dosagem dissolvida ou em suspensão num transportador liquido convencional, tal como soro fisiologico isotó nico,e está contida numa ampola ou num frasco de dose múlti pia, adequados para uma injecção parenteral por exemplo para administração intravenosa subcutânea ou intramuscular. Uma composição para insuflação pode ser similar mas é usual mente administrada num aplicador ou inalador de dose centro lada. As composições de pó pulverizado podem também ser uti. lizadas, conjuntamente com preparações oleosas, geles, tampões para preparações isotónicas, trociscos bucais pomadas dérmicas e emulsões ou aerossóis.

Protocolo da Ratazana Hidropénica teste para determinação da actividade anti-ADH in vivo consiste no protocolo da ratazana hidropénica descrito nos exemplos seguintes.

No período de aproximadamente 18 horas antes do teste não se administrou comida e água às ratazanas macho a utilizar no teste. As ratazanas são colocadas numa gaiola numa proporção de 4 por cada gaiola de metabolismo.

À hora 0, administra-se o composto teste intraperito nealmente ao grupo teste enquanto se administra um volume

.....••SBí·*

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-12equivalente de veículo a ambos os grupos de controlo (em je jum e não em jejum)· Mede-se de hora a hora durante 4 horas o volume de urina e a osmolalidade dos grupos teste e de con trolo. Os valores de teste são registados como nrl de urina excretada (cumulativa), mBg/ratazana de electrólito excretado# mg/ratazana de ureia excretada e osmolalidade em miliosmo les/Kg de H₂0. Para determinar a significância usa-se um tes te de tolerância. Define-se o valor de ΕΏ^θ como sendo a do se de composto (g/Kg) necessária para baixar a osmolalidade da urina a 300 m-Osmoles/Kg.

A Tabela I seguinte mostra a potente actividade antagonista de vasopressina do octapeptídeo do presente invento com uma cauda dipeptídiaa composta por uma combinação de uma unidade de aminoácido neutra e básica tal como a tirosina e a arginina.

Tabela I

Actividade Biológica de Análogos da Vasopressina

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-VaΙ-Asn Cys-X s---------------------------1

NO.	X	^Kligâ	Ki-	^SD5oo£	K. . lig
		nM	nM	ug/Kg	de fígado hu

mano , (receptor V,)— nM ¹

1	Tyr-ArgNH₂	14	2,1	5,6
2	Arg-TyrNH^	23	4,2	68,6	1,8
3	Arg-ArgNH₂	2,7	2 ,0	6,3	1,27
4	Lys-ArgNH₂	8,8	4,2	7,9
5	ArgNH₂	11	1,4	18,8	1,2
6	Arg-GlyNH₂	17	2,7	11,4

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-13Q — K, . é uma medida da afinidade do ligando pelo receptor x iy · na membrana da medula renal do porco, á derivado da equação de inibição competitiva K_lig=IC_5o/(1+L/K_D) onde ICç-θ ® ^aconcentração de ligando para uma inibição de 50% da ligação do Z H_7-LVP, L é a concentração de ligando, e é a cons tante de dissociação do _/-LVP. é a constante de inibição medida para a inibição de adenilatocíclase estimulada por LVP da membrana da medula do rim do porco e é deri vada da equação de inibição competitiva anterior. -, Εϋ,-θθ é a dose (g/Kg) necessária para diminuir a osmolalidade da urina em ratazanas dos níveis hidropénicos (1500 mOsm/Kg de

H₂0) a 500 mOsm/Kg de H₂0. -, da membrana do fígado humano.

K.. refere-se a actividade lig

Exemplos

Pretende-se que os exemplos seguintes ilustrem o pre sente invento para uma melhor compreensão do mesmo. Os mate riais particulares utilizados, espécies e condições são ilustrativos e não limitativos do campo razoável do presente invento.

Exemplo I

A fórmula estrutural seguinte representa o composto antagonista de vasopressina a £“l-(ácido^> -mercapto- , J3 -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-vali na-7-tirosina-8-arginina-9-desglicina _/vasopressina:

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Va1-Asn-Cys-Tyr-Arg(NH₂) s--s

Sintetizou-se o intermediário peptído protegido-resi— na Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Tyr-Arg (Tos)-BHA por processos de fase sólida no sintetisador auto—

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-14 — mático Beckman 99OB usando 1,0 g de resina benzidrilamina (aprox. 0,45 mmole). Todos os aminoâcidos foram protegidos com ter-butiloxicarbonilo (Boc) no azoto e activados com DCC/HBT para acoplamento sequencial, o pmp-(4-MeBzl) foi acoplado usando DJfAP. Separou-se o peptído da resina com desprotecção simultânea dos grupos protectores de cadeia la teral usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a 0°C durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até à secura, lavou-se o resíduo contendo o peptído com éter anidro. Extractou-se o peptído em bruto com ácido acético (HOAc) (100 ml) para 3,5 litros de água desgaseifiçada cujo pH tinha sido ajustado a 4,5. A mistura aquosa diluída de octapeptido dissulfidrilo foi oxidativamente ciclizada com 30 ml de ferricianeto de potássio (K₃Fe(CN)₆), (0,01 M) a pH 7,2. Ajustou-se o pH da solução a 4,5 com ácido acético glacial (HOAc). Fez-se passar a solução através de uma coluna de resina acrilica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Eluiu -se a coluna.com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridi na/ ácido acético glacial/água V/V). Removeu-se o acetato de piridina por destilação in vacuo. Liofilizou-se o resíduo a partir de ácido acético diluído tendo-se obtido 35 mg de peptido bruto parcialmente purificado. 0 baixo rendimento obti do foi atribuído à extracção incompleta do péptido da resina como é evidenciado a partir da análise de aminoâcidos da resina restante.

Purificação:

1) Coluna de Partição:

Amostra: 35 mg, n-butanol/ácido acético/água (n-BuOH/HOAc/ /H₂°b 4:1:5 v/v (a) 18,7 (b) 7,2 mg

2) Cromatografia líquida de Elevada pressão (HPLC):

Amostra: 18,0 mg, Altes Ultrasphere ODS 1-A, 10 mm x

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-15x25 cm, 5, caudal 4 ml/mn, TFA aquoso a O,1%:CH₃CHF (55:45), isocratica; 229 (2,0 AUFS), obtendo-se 13 mg de amostra pura .

Dados Físicos:

F.M. : ^C55^H76^K12°11^S2

P.M. : 1144,505

FAB : (,M+H)⁺ 1145, (M-H) 1143

AAA : Asp (1,00), Cys (0,42),- Vai (0,96),

Tyr (2,05), Phe (0,92), Arg (1,03)

Teor em Peptídeos 56,7% pados de Cromatografia;

1. Cromatografia de camada fina (TLC) (a) n-butanol/ácido acético/água/acetato de etilo (B/A/W/ /E) (1:1:1:1 v/v) R_f=O,74 (b) n-butanol/ácido acético/água (b/A/W) (4:1:5 v/v)

R_f=O,52

2. Cromatografia líquida de elevada pressão (HPLC), altex Ultrasphere ODS, 5, 0,45 mmx25 cm, (a) Gradiente de 80:20 a 50:50 de TFA aquoso a 0,1%/ /CHgCN em 15 minutos.

K'=1O,32 (b) Isocrática 55:45 de TFA aquoso a O,1%/CH₃CN

K'=4,93

Exemplo 2

A fórmula estrutural seguinte representa o composto antagonista de vasopressina, a Z”l-(ácido /3 -mercapto- /3 _t

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...../

Λ'Λ

-16p -ciclopent ametilenopropiónico)-2-(O-etil)-D-tirosina-4-valina-7-arginina-8-tirosina-9-desglicina _7vasopressina:

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-Tyr(NH₂)

S ----------------------------S

Sintetizou-se o intermediário peptido protegido-resi na Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl) -Arg(Tos_)_ -Tyr-BHA por processos de fase sólida no sintetizador automá tico Beckman 99OB usando 1,0 g de resina benzidrilamina (aprox. 0,3 mmole). Todos os aminoácidos foram protegidos com ter-butilóxicarbonílo (Boc) no azoto e activados com DCC/HBT para acoplamento sequêncial. 0 Pmp(4-MeBzl) foi acoplado usando DMAP. Separou-se o peptido da resina com desprc? tecção simultânea dos grupos protectores de cadeia lateral usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a 0°C durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até à secura, lavou-se o resíduo contendo o peptido com éter anidro. Extractou-se o peptido em bruto com dimetilformamida (DMF) (100 ml) e com ácido acético a 40% (HOAc) (100 ml) para 3,5 litros de água desgaseifiçada cujo pH tinha sido ajustado a 4,5. A mistura aquosa diluída de octapeptído dissulfidrilo foi oxidativamente ciclizada com 36 ml de ferricianeto de po tássio (KgFe(CN)g), (0,01 M) a pH 7,2. Ajustou-se o pH da so luçâo a 4,5 usando ácido acético glacial (HOAc). Fez-se passar a solução através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Eluiu-se a coluna com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/água v/v). Removeu-se o acetato de piridina por destilação in vacuo. Bifilizou-se o resíduo a partir de ácido acético diluído tendo-se obtido 128 mg (45%) de peptido bruto parcialmente purificado.

Purificação:

1) Coluna de Partição:

Amostra: 128 mg, n-butanol/ácido acético/água (N-BuOH/

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8_Z27 mg (a amostra A estava pura para ser testada);

-17/H0Ac/H₂0)/ 4tl:5 (a) (b)

85/22 mg;

(c)

10/44 mg.

Dados Físicos:

KM ^C55^H76^N12°11^S2

P.M.

1144/505

FAB (M+H)⁺ 1144/ (M-H)” 1143

AAA

Asp

Tyr (1/02)/ Cys (0/39); Vai (1,026) (01/84), Phe (0,94)/ Arg (1,00)

Teor em peptidos 69,8%

Dados de Cromatografia

1. Cromatografia de camada fina (TLC) (a) n-butanol/ácido acético/água/acetato de etilo (B/A/w/ /E) (l:líl:l v/v) R_f=0,70 (b) n-butanol/ácido acético/água (B/A/W) (4:1:5 superior) R_f= 0,56

2. Cromatografia líquida de elevada pressão (HPLC), Altex Ultrasphere ODS, 5, 0,45 mmx25 cm.

(a) Gradiente 80:20 a 50:50 de TFA aquoso a o,l%/CH₃CN em 15 minutos

K'=ll,9 (b) Isocrática

K'=10,13

60:40 de TFA aquoso a O,1%/CH₃CN

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SKB CASE 1435C

Λ- κ' .....

<^!·''· '

-18Exemplo 3

Substituindo Boc-D-Tyr(Et) por uma quantidade estequiométrica de Boc-L-Tyr(Et) na unidade 2 da síntese de péptido do Exemplo I obtém-se o péptido ciclizado Pmp-L—Tyr(Et)-Phe-Va1-Asn-Cys-Tyr-Arg(NH₂)·

S---------------------------S

Substituindo no Exemplo 1, Boc-D-Tyr(Et) por Boc-D-Ue na unidade 2 obtém-se

Pmp—D—Ile—Phe—Va1-Asn-Cys—Tyr—Arg(NH₂)►

S-----------------------S

Usando Boc-L-Phe(4-Me) como aminoácido na unidade 3 e Boc-Nle na unidade 4 nas reacções sequenciais de síntese do Exemplo 1 obtém-se

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-( 4-Me)-Nle-Asn-Cys-Tyr-ArgfNH^) *

SS

Usando Boc-Cha na unidade 4 do Exemplo 1 obtém-se Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Cha-Asn-Cys-Tyr-Arg(NH₂)·

S -------------S

Usando Gin não protegido na posição 4 do Exemplo 1, utilizando HBT obtém-se

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Gln-Asn-Cys-Tyr-Arg(NH₂).

ss

Usando Boc-D-Pba na unidade 2 e Boc-Chg na unidade da sequência reaccional detalhada do Exemplo I obtém-se

Pmp-D-Pba-phe-Chg-Asn-Cys-Tyr-Arg(NH₂).

S s

881

SKB CASE 14350

-19Exemplo 4

Substituindo Boc-D-Tyr(Et) por uma quantidade estequiométrica de Boc-L-Tyr(Et) na unidade 2 da síntese do pé ptido do Exemplo 2 obtém-se o péptido ciclizado Pmp-L-Tyr(Et)-Phe-VaI-Asn-Cys-Arg-Tyr(NH ₉) ·

II

Ss

Substituindo no Exemplo 2, Boc-D-Tyr(Et) por Boc-D-Ile na unidade 2 obtém-se

Pmp-D-Ile-Phe-Va1-As η-Cys-Arg-Tyr(NH₂)

S-S

Usando Boc-L-Phe(4-Me) como aminoácido na unidade 3 e Boc-Nle na unidade 4 nas reacções sequenciais de síntese do Exemplo 2 obtém-se

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-(4-Me)-Nle-Asn-Cys-Arg-Tyr(NH₂)·

S -------------------------------------s

Usando Boc-Cha na unidade 4 do Exemplo 2 obtém-se

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Cha-Asη-Cys-Arg-Tyr(NH₂)*

S---------------------------S

Usando Gin não protegido na posição 4 do Exemplo 2 utilizando HETobtém-se

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Gln-Asn-Cys-Arg-Tyr(NH₂) .

Usando Boc-D-Pba na unidade 2 e Boc-Chg na unidade 4 da sequência reaccional detalhada do Exemplo 2 obtém-se

Pmp-D-Pba-Phe-Chg-Asn-Cys-Arg-Tyr(NH₂)

S-----------------------_s

881

SKB CASE 14350 ,*#*⁶'

-20Exemplo5

Usahdo as unidades de anel protegido apropriadas nas sequências sintéticas dos compostos de fórmulas I e II obtém-se octapéptído respectivo ou um seu sal como se se gue:

a. Acetato de Zl-desaminopenicilamina-2-(0-etil)-D-tiro sina-3-(4*-metilfenilalanina)-7-tirosina-8-arginina-9-desglicina/vasopressina y

b. /TL—(ácido -mercaptopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosi^ na-4-(ácido cb -aminobutírico)-7-tirosina-8-arginina-9-desglicina/vasopressina;

c. hidrocloreto de £1-(ácido -mercaptopropiónico)-2-

-valina-4-c iclo-hexilglic ina-7-tirosina —8-arginina-9-desgM c ina/va sopre s s inay

d. /1-(ácido ]3 -mercaptopropiónico)-4-glutamina-7-tirosi na-8-homoarginina-9-desglicina7vasopressina;

e. Zl-desaminopenicilamina~2-fenilalamina-7-tirosina-8-h omoa r gin ina - 9 -de s g 1 ic ina/va s opre s s ina y

f. /l-desaminopenicilamina-2-D-ácido só -aminofenilbutírico-4-isoleucina-7-tirosina-8-arginina-9-desglicinamida7v<3 sopressina;

g. /1-desaminopenicilamina-2-triptofano-4-glutamina-7-ti rosina-8-D-arginina-9-desglicina/vasopressina;

h. /1-(ácido p> -mercapto- β> , β -ciclopentametilenopropiónico)-2-tirosina-3-(4’-metilfenilalanina)-7-tirosina-8-arginina-9-desglicina7vasopressina y

i.

acetato de £1-(ácido R -mercaptopropiónico)-2-(0-etil)

881

SKB CASE 14350

-21-D-tirosina-3-isoleucina-4-treonina-7-tirosina-8-arginina-9-desglicina7^vasoP^ressi^na·

Exemplo 6

A fórmula estrutural seguinte representa o composto antagonista de vasopressina, a /I-fácido -mercapto- p , p -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-va lina-7-triptofano-8-arginina-9-desglicina7vasopressina:

Pmp-D-Tyr(Ξ t)-Phe-Va1-Asn-Cys-Trp-Arg(NH₂)

S---------------------------S

Sintetizou-se o intermediário peptido protegido-res^L na Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Va1-Asn-Cys(4-MeBzl)-Trp-Arg(Tos)-BHA por processos de fase sólida no sintetizador automático Beckman 99OB usando 1,0 g de resina benzidrilami na. Todos os aminoácidos foram protegidos com ter-butilóxi— carbonilo (Boc) no azoto e activados com DCC/HBT para acoplamento sequêncial. o Pmp(4-MeBzl) foi acoplado usando DMAp. Usou-se ácido trifluoroacético como extractor para desproteger os grupos protegidos com (Boc) por forma a evitar a formação de produtos secundários da Trp durante a síntese. Sepa rou-se o peptido da resina com desprotecção simultânea dos grupos protectores de cadeia lateral usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a 0°C durante 60 minutos. Após evaporação in vácuo até à secura, lavou-se o resíduo contendo o peptido com éter anidro. Extractou-se o pept_í do bruto com ácido acético a 50% (HOAc) (100 ml) para 3,5 li tros de água desgaseifiçada cujo pH tinha sido ajustado a 4,5. A mistura aquosa diluída de octapeptído dissulfidrilo foi oxidativamente ciclizada com ferricianeto de potássio (K₃Fe(CN)g), (0,01 M) a pH 7,2. Ajustou-se o pH da soluçãoa 4,5 usando ácido acético glacial (HOAc). Fez-se passar a solução através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Eluiu-se a coluna com tampão de piridina^ -acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/água v/v).

881

SKB CASE 14350

-22Removeu-se o acetato de piridina por destilação in vacuo. Liofilizou-se o resíduo a partir de ácido acético diluído tendo-se obtido o produto de peptído bruto parcialmente purificado.

Exemplo 7

Os compostos antagonistas de vasopressina seguintes:

ZI-(ácido -mercapto- p , jE> -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D—tiros ina-4-valina-7-valina-8-arginina-9-desgIi c ina/va s opre s s ina;

Pmp-D-Tyr(Et)-phe-Val-Asn-Cys-Val-Arg(NH₂) s----------------------------s

Zl-(ácido |?> -mercapto- -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil}-D-tirosina-4-valina-7-fenilalanina-8-arginina-9-desglicina/vasopressina;

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Va1-As n-Cys-Phe-Arg(NH₂)

S ---------------------------S /1-(ácido p> -mercapto- _t p -ciclopentametilenopropiónico)-2-(O-etil)-D-tirosina-4-valina-7-isoleucina-8-arginina-9-desglicina/vasopressina;

Pmp-D-Tyr (Et) —Phe—V a 1-Asn-Cys -I le -Arg CNFT₂)

S----------------------------S

Zl-(ácido p> -mercapto-, p -ciclopentametilenopropiónico)2-(O-etil)-D-tirosina-4-valina-7-leucina-8-arginina-9-desgM cina/vasopressina;

Pmp-D-Tyr(Et)-phe-va1-Asn-Cys-Leu-Arg(NH₂)

----------------------------S

Λ 4 X/ ' ' 'Λ..., ,r, ,/< yt*>

X, Α

881

SKB CASE 14350

-23Zl-(ácido ·ρ -mercapto-jB ,ρ -ciclopentametilenopropiónico) -2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-sarcosina-8-arginina-9-desglicina/vasopressina;

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Sar-Arg(NH₂)

S----------------------------s /1-(ácido -mercapto- jò _t -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-serina-8-arginina-9-desgli cina7vasopressina;

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Ser-Arg(NH₂) s-----------------------------s

ZI-(ácido -mercapto- p , p-ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina—7—tirosina-8-ornitina-9-des— glicina7vasopressina j

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Vai-As n-Cys-Tyr-Orn(NH₂)

S-----------------------------_s

Zl-(ácido p -mercapto- p , p -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil) -D—tirosina—4-va lina-7-t ir os ina—8—lisina-9-desgldÍ c ina/va sopressina;

Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Tyr-Lys(NH₂) s----------------------------s são preparados como se descreve no procedimento do Exemplo

6, pela preparação dos intermediários péptido protegido-resina respectivas Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Vai-Asn-Cys-(4-MeBz1)-Va1-Arg(Tos)-BHA, Pmp-(4-MeBz1)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Phe-Arg(Tos)-BHA, Pmp-(4-MeBzl)-D— Tyr(Et)-Phe-Va1-As n-Cys(4-MeBz1)-Ile-Arg(Tos)-BHA, Pmp66 881

SKB CASE 14350

-24-(4-MeBz1)-D-Tyr(Ξt)-Phe-Va1-Asn-Cys-(4-MeBz1)-Leu-Arg-(Tosj_ -BHA, Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Va1-Asn-Cys-(4-MeBz1)-Sar-Arg(Tos)-BHA, Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Va1-Asn-Cys-(4-MeBz1)-Ser(OBz1)-Arg(Tos)-BHA, Pmp-(4-MeBz1)-D-Tyr(Et)-Phe-Va1-Asn-Cys(4-MeBz1)-Tyr-Orn(Clz)-BHA e Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Tyr-Lys(C1Z) (Tos)-BHA co mo aí se descreve, a que se segue o acoplamento, ciclização, e liofilização também aí descritas.

Exemplo 8

Composições de unidades de dosagem parenteral:

Uma preparação que contém 0,10 mg do péptido do Exem pio 1 na forma de um pó anidro estéril para injecção parenteral é preparada como se segue: dissolvem-se 0,5 mg de péptido em I ml de uma solução aquosa de 20 mg de manitol. Fil tra-se a solução sob condições assépticas para uma ampola de 2 ml e liofiliza-se. Administra-se a solução reconstituída a um paciente que necessite de um tratamento com um antagonista de vasopressina na quantidade necessária, de 1-5 vezes ao dia por injecção, ou numa quantidade equivalente por injecção i.v. contínua.

Composições de unidades de dosagem nasal:

Suspendem-se 2,5 mg de um péptido finamente dividido preparado de acordo com o presente invento, tal como o produto do Exemplo 2 numa mistura de 75 mg de álcool benzílico e 1,395 g de um agente de suspensão tal como uma mistura comercial de glicéridos semi-sintéticos de ácidos gordos de ca_ deia longa. Coloca-se a suspensão num recipiente de aerosol de 10 ml que é fechado com uma válvula doseadora e carregado com propulsores de aerosol. 0 recipiente compreende 100 doses unitárias que são administradas intranasalmente a um sujeito que o necessite de 1-6 vezes ao dia.

881

SKB CASE 14350

Claims

REIVINDICAÇÕES ;íf

1 - Processo de preparação de um composto com a fór- mula :

CH₂C0 - X - Z - Y - Asn - Cys - R - B onde

R é um grupo PA ou AP;

P é um isómero D ou L da Tyr, MeTyr, O-AlkTyr, Trp, MeTrp, Vai, MeVal, Phe, MePhe, Ile, Melle, Leu MeLeu, Sar, Ser ou MeSer;

A é um isómero D ou L da Arg, Lys, HArg, MeArg, Orn, MeLys ou MeHArg;

B é OH, NH₂ ou NHAlk;

Z e Phe, 4^r-AlkPhe, 0-AlkTyr, Ile ou Tyr;

X é um isómero D ou L de Phe, 4'-AlkPhe, Vai, Wva,

Leu, Ile, Pba, Nle, Cha, Abu, Met, Chg, Tyr ou 0-AlkTyr;

Y é Vai, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Nle, Thr, Phe, Leu ou Gly; e e R₂ são cada um, hidrogénio, metilo, etilo ou for mam conjuntamente com o carbono ao qual estão ligados, um anel cicloalquileno de 4-6 membros, e onde Alk é um grupo al^ quilo de 1 a 4 carbonos, ou de um seu sal ou prodroga farmacêuticamente aceitáveis, que compreende:

(a) a ciclização de um composto com a fórmula:

S-Q

- X - Z — Y - Asn - Cys - R - B

S-Q

66 881

SKB CASE 14350

-26ou de um seu derivado éster ou amida, onde R, X, Ζ, Υ, Ρ, A, B, e R₂ são definidos como anteriormente e Q é hidrogénio ou um grupo protector removível, ou (b) a reacção de ArgNH₂, ou de TyrNH₂, respectivamente, com um composto adequadamente protegido com a fórmula:

CH₂CO - X - Z - Y - Asn - Cys - R

S onde R é definido como anteriormente, por qualquer método convencional de síntese de peptídeos; e depois (c) a conversão facultativa do composto preparado num seu sal farmaceuticamente aceitável.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de R^ e R₂, juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados, formarem um anel espiropentameti lo.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de R-B ser Tyr-Arg(NH₂).
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de R-B ser Arg-Tyr(NH₂).
5 - Processo de acordo com as reivindicações de 1-4 caracterizado pelo facto de o composto preparado ser um composto seleccionado de um grupo consistindo em /1-(ácido β -mercapto- F < F '^c iclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-tirosina-8-arginina-9-desglicina7vaso pre s sina

Zl-(ácido p -mercapto-, ^-ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-arginina-8-tirosina-9-des66 881

SKB CASE 14350

-27 — glicina/vasopressina;

Zl-(ácido p -mercapto-jS , /3-ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-D-arginina-8-tirosina-9-desglicina/vasopressina /TL-(ácido p -mercapto—, p -ciclopentametilenopropiónico) — _2-(0-etil)-L-tirosina-4-valina-7-arginina-8-D-tirosina-9-desglicina7vasopressina;

Zl-(ácido j3> -mercapto-p , P -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-N-metilarginina-8-tirosina -9-desglicina/vasopressina ;

Zl-(ácido -mercapto-p , -ciclopentametilenopropiónico)-2- (0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-D-tirosina-8-arginina-9-desglicina_7vasopressina ;

Zl-(ácido p -mercapto- p , -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-lisina-8-tirosina-9-desgli c ina/va s opre s s ina γ

Zl-(ácido p -mercapto-p , ]3 -ciclopentametilenopropiónico)-2 —(0-etil)-D-tiros ina-4-valina-7-tiros ina-8-lis ina-9-desgli cina7vasopressina γ

ZI-(ácido p -mercapto-p , p -ciclopentametilenopropiónico)—2 -(0-e t i1)-D-t iros ina-4-valina-7-D-tiros ina-8-D-arginina-9-desglicina/vasopressina ;

e seus sais de adição de ácido farmacêuticamente aceitáveis.
6 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo um composto preparado de acordo com as reivindicações anteriores em associação com um transportador farmacêuticamente aceitável de modo que a unidade de dosagem contenha ingrediente activo numa quantidade tal que proporcione ao paciente de cerca de 0,01 mg a cerca de 10 mg de in grediente activo por Kg do peso do mesmo.