CN116390938A - 毒蜥外泌肽-4类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含毒蜥外泌肽‑4及其功能变体以及一个或多个支链氨基酸探针的毒蜥外泌肽‑4类似物。

Description

毒蜥外泌肽-4类似物
技术领域
本发明涉及包含毒蜥外泌肽-4(exendin-4)和一个或多个支链氨基酸探针的毒蜥外泌肽-4类似物。
背景技术
蛋白质和肽以其天然形式、变体形式或其类似物广泛用于治疗目的。蛋白质治疗剂往往对其靶标具有特异性，产生的潜在副作用较少，但与小分子相比通常具有较低的生物利用度、较差的膜渗透性和代谢不稳定性。基于蛋白质的药物通常称为“生物制品(biologics)”，包括诸如胰岛素、生长因子和工程化抗体的分子。
蛋白性分子通常需要注射，但无论如何，生物制品都是一类非常成功的治疗剂，包括用于治疗关节炎和各种癌症的抗体，用于糖尿病、骨髓抑制和肾性贫血的可溶性蛋白，以及用于多发性硬化、癌症、子宫内膜异位和纤维瘤以及肢端肥大症的短的可注射肽。
肽代表一类分子，其具有较大蛋白质生物制品的特异性和效力，但尺寸较小且更易获得，并且使用化学方法制造更便宜，因此潜在结合了蛋白质的一些优点与小分子的一些优点。
蛋白质和肽化合物可以以各种方式修饰，以便改善化合物的一种或多种特征，或解决化合物的一种或多种潜在缺点。例如，可将稳定肽序列添加到在药理学上有活性的肽的N-端和/或C-端，这可能使它们较不易降解(WO 99/46283)。此外，与天然肽相比，将选自Lys或Glu的6个氨基酸的线性氨基酸探针添加到α-MSH的N端可能增加效力(WO 07/22774)。已知的肽-药物缀合物进一步包括添加聚阳离子肽CPP(细胞穿透肽)，以改善跨细胞脂双层的转运。WO 2014/060606和EP 2722340中公开了包含N-端支链氨基酸探针的α-MSH和γ-MSH的类似物。WO/2015/162485中公开了具有支链氨基酸探针的肽类似物。
发明内容
本发明提供了包含一个或多个支链氨基酸探针(本文缩写为BAP)的毒蜥外泌肽-4类似物。
已知氨基酸探针如线性结构诱导探针(Structure Induced Probe，SIP)或支链氨基酸探针与感兴趣的生物活性肽的结合(attachment)可改善或改变活性肽的外部效应(包括例如增加稳定性、减少降解、改变构型和/或改变溶解性)，以及具有潜力改善或增加活性肽的固有效应。例如，已经测试了将(Lys)6添加到α-MSH的N-端和将(Lys)6添加到des-pro38-毒蜥外泌肽-4(利司那肽(lixisenatide))的C-端，并产生了有前景的结果。添加支链氨基酸探针也显示出前景。
本发明人在此证明，通过结合支链氨基酸探针而修饰的毒蜥外泌肽-4的性质得到改善，使激动剂活性增加了令人惊讶的高程度。如本文所示，通过结合C-端BAP而修饰的des-pro38-毒蜥外泌肽-4比C-端SIP-结合(利司那肽)强力10倍，并且比GLP-1的BAP-结合更强力(7-37)。
一方面提供了一种包含毒蜥外泌肽-4和一个或多个支链氨基酸探针的毒蜥外泌肽-4类似物，
其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基烷基氨基酸残基，
所述第一氨基烷基氨基酸残基任选地与第二氨基烷基氨基酸残基共价连接或与第二和第三氨基烷基氨基酸残基共价连接，以形成2或3个氨基烷基氨基酸残基的直链，
其中所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链各自通过使侧链氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；
其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，AAA为氨基烷基氨基酸残基，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物的N-端，共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物的C-端，和/或共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基，
条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成，和
其中所述毒蜥外泌肽-4选自des-Pro38-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：1)、des-Ser39-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：2)和毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：3)或其功能变体。
还涵盖了包含如本文所公开的毒蜥外泌肽-4类似物的药物组合物，以及毒蜥外泌肽-4类似物用作药物。
在一个实施方案中，提供了毒蜥外泌肽-4类似物用于治疗2型糖尿病或肥胖症。
附图说明
图1：支链氨基酸探针Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-的图示，其中显示第一氨基烷基氨基酸残基是赖氨酸残基(Lys1)，其通过常规肽键共价连接至肽序列的N-端，所述第一赖氨酸是乙酰化的(COCH3)，并且所述第一赖氨酸通过将两个另外的赖氨酸残基(其中一个(最外面的)也是乙酰化的)结合至所述第一赖氨酸残基的ε-氨基而被修饰。
图2：GLP-1类似物的针对人GLP-1受体的受体效力：
GLP-1(7-36)，其具有序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(SEQ ID NO:6)；
利司那肽(Lyxumia)：des-Pro38-毒蜥外泌肽-4-SIP，其具有序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2(SEQID NO:5)；以及
类似物1：des-Pro38-毒蜥外泌肽-4-BAP，其具有序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2(SEQID NO:1-(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2)
结果和细节见实施例2。
图3：GLP-1类似物的针对人GLP-1受体的受体效力：
GLP-1(7-36)，其具有序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(SEQ ID NO:6)；
类似物2：其具有序列Ac-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2；以及
类似物3：其具有序列Ac-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2。
数据包括在并详述于PCT/IB2015/000553(WO/2015/162485)中。
发明详述
毒蜥外泌肽-4类似物
毒蜥外泌肽-4最初从希拉巨蜥(Heloderma suspectum)毒液中分离，是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，即它与GLP-1受体(GLP-1R)相互作用。
已知毒蜥外泌肽-4模拟响应于食物摄入从肠释放的肠降血糖素激素GLP-1的作用，作用包括增加胰岛素分泌、减少胰高血糖素释放、增加饱腹感和减慢胃排空。
毒蜥外泌肽-4(1-39)具有序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO:3)。它是从87个氨基酸的较长肽加工而来的，该87个氨基酸的较长肽包含信号肽(氨基酸1-23)、前肽(氨基酸24-45)和对应于成熟形式的毒蜥外泌肽-4(1-39)的肽(氨基酸48-86)。毒蜥外泌肽-4在UniProtKB-P26349(EXE4_HELSU)中有详细描述。
艾塞那肽(exenatide)是毒蜥外泌肽-4的合成形式，被批准用于治疗2型糖尿病。艾塞那肽(Byetta)每天施用两次，或每周施用一次(Bydureon，延长释放的艾塞那肽)。
利司那肽(商品名Lyxumia)是用于治疗糖尿病的每日一次的可注射的GLP-1受体激动剂。利司那肽(des-Pro38-毒蜥外泌肽-4-SIP)是毒蜥外泌肽-4的变体，其在第38位缺失脯氨酸，并且在C端添加六个线性赖氨酸残基。所述6个赖氨酸被称为结构诱导探针或SIP。
利司那肽具有序列H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2(SEQ ID NO:5)。
本发明的一个方面提供了通过添加一个或多个支链氨基酸探针而修饰的毒蜥外泌肽-4。因此，在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物是包含毒蜥外泌肽-4和一个或多个支链氨基酸探针的缀合物(conjugate)。毒蜥外泌肽-4是指天然毒蜥外泌肽-4的片段和变体，如本文具体说明的。
在一些实施方案中，本文提供的毒蜥外泌肽-4类似物与相应的天然或非缀合的毒蜥外泌肽-4相比，和/或与另外的修饰的毒蜥外泌肽-4相比，具有某些改善的性质。在一个实施方案中，本文提供的毒蜥外泌肽-4类似物具有增加的对一种或多种相关受体(例如GLP-1R)的结合亲和力和/或激活。在另一个实施方案中，本文提供的毒蜥外泌肽-4类似物更稳定，例如对蛋白酶较不敏感。更进一步地，在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物具有较高的溶解度。
一方面提供了一种包含毒蜥外泌肽-4和一个或多个支链氨基酸探针的毒蜥外泌肽-4类似物，
其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基烷基氨基酸残基，
所述第一氨基烷基氨基酸残基任选地与第二氨基烷基氨基酸残基共价连接或与第二和第三氨基烷基氨基酸残基共价连接，以形成2或3个氨基烷基氨基酸残基的直链，
其中所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链各自通过使侧链氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p，
其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，AAA为氨基烷基氨基酸残基，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的N-端，共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的C-端，和/或共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基，
条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成；以及
其中所述毒蜥外泌肽-4选自des-Pro38-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：1)、des-Ser39-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：2)和毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：3)或其功能变体。
在一个实施方案中，所述分子的N-端氨基酸残基在α氨基处是乙酰化的。
在一个实施方案中，所述第一氨基烷基氨基酸残基通过肽键(酰胺)连接，所述肽键(酰胺)通过所述第一氨基烷基氨基酸的羧酸或其衍生物与所述毒蜥外泌肽-4的N-端氨基酸残基的α氨基的反应形成；通过肽键与所述毒蜥外泌肽-4的C-端氨基酸残基连接，所述肽键通过使所述氨基烷基氨基酸残基的α氨基与所述C-端氨基酸残基的羧酸或其衍生物反应而形成；和/或通过酰胺与所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基连接，所述酰胺通过所述第一氨基烷基氨基酸残基的羧酸或其衍生物与所述氨基烷基氨基酸残基的烷基氨基反应而形成。
在一个实施方案中，所述第一氨基烷基氨基酸残基与所述毒蜥外泌肽-4的N-端氨基酸共价连接，与所述毒蜥外泌肽-4的C-端氨基酸共价连接，和/或与所述毒蜥外泌肽-4内的Lys或Orn残基的侧链氨基共价连接。
在一个实施方案中，与另外的氨基酸残基和/或肽共价连接的氨基酸残基在一个实施方案中是指存在肽键。在另一个实施方案中，与所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基共价连接的氨基酸残基是指存在酰胺键。
肽键(酰胺键)是当一个分子的羧基与另一个分子的氨基反应时在两个分子之间形成的共价化学键，其引起H2O分子的释放。该过程通常发生在氨基酸之间。
如果支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的N-端，则支链氨基酸探针主链的N-端氨基烷基氨基酸残基优选是乙酰化的。
如果支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基，则支链氨基酸探针主链的N-端氨基烷基氨基酸残基优选是乙酰化的。
如果支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的C-端，则支链氨基酸探针主链的C-端氨基烷基氨基酸残基优选是羧酸、醛、酯或酰胺，例如伯酰胺，最优选是酰胺化的。
氨基烷基氨基酸残基(或AAA)和氨基酸残基(aa3)可以各自相同(同一)或不同(不同一)。
支链氨基酸探针
氨基烷基氨基酸残基
如本文所定义的，“氨基烷基氨基酸残基”(或AAA)是具有常规的胺(-NH2)和羧酸(-COOH)官能团以及共价连接至第一(α-)碳原子的侧链的氨基酸，其中所述侧链包括氨基烷基(-CnH2nNH2)。
因此，氨基烷基氨基酸残基(或AAA)是具有包含氨基烷基(-CnH2nNH2)或由其组成的侧链的氨基酸，在一个实施方案中表示为侧链氨基烷基。
在一个实施方案中，侧链烷基衍生自由以下组成的组：甲基(CH3-)、乙基(C2H5-)、丙基(C3H7-)、丁基(C4H9-)、戊基(C5H11-)、己基(C6H13-)、庚基(C7H15-)、辛基(C8H17-)、壬基(C9H19-)、癸基(C10H21-)、十一烷基(C11H23-)和十二烷基(C12H25-)。在提及具有特定碳数的烷基残基时，旨在涵盖具有该碳数的所有几何异构体，因此，例如，“丁基”意为包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。
在一个实施方案中，所述氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基(NH2)是甲胺的胺、乙胺的胺、丙胺的胺、正丁胺的胺、戊胺的胺、正己胺的胺、庚胺的胺、辛胺的胺、壬胺的胺、癸胺的胺、十一胺的胺或十二胺的胺。
在一个实施方案中，侧链氨基烷基选自甲胺(-CH2NH2)、乙胺(-C2H4NH2)、丙胺(-C3H6NH2)、正丁胺(-C4H8NH2)、戊胺(-C5H10NH2)、正己胺(-C6H12NH2)、庚胺(-C7H14NH2)、辛胺(-C8H16NH2)、壬胺(-C9H18NH2)、癸胺(-C10H20NH2)、十一胺(-C11H22NH2)和十二胺(-C12H24NH2)。
在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基(NH2)各自通过与分子结合而被修饰。
在一个实施方案中，所述氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基选自以下：
β(beta)氨基(侧链中有1个亚甲基，甲胺)；
γ(gamma)氨基(侧链中有2个亚甲基，乙胺)；
δ(delta)氨基(侧链中有3个亚甲基，丙胺)；＝鸟氨酸
ε(epsilon)氨基(侧链中有4个亚甲基，正丁胺)；＝赖氨酸
ζ(zeta)氨基(侧链中有5个亚甲基，戊胺)；
η(eta)氨基(侧链中有6个亚甲基，正己胺)；
θ(theta)氨基(侧链中有7个亚甲基，庚胺)；
ι(iota)氨基(侧链中有8个亚甲基，辛胺)；
κ(kappa)氨基(侧链中有9个亚甲基，壬胺)；
λ(lambda)氨基(侧链中有10个亚甲基，癸胺)；
μ(mu)氨基(侧链中有11个亚甲基，十一胺)；以及
v(nu)氨基(侧链中有12个亚甲基，十二胺)。
例如，ε-氨基共价连接至从(包括)α-碳开始的第五个碳，所述α-碳共价连接至羧基(C＝OOH)基团。
其中侧链为正丁胺且侧链氨基为ε(epsilon)氨基的氨基烷基氨基酸残基为赖氨酸(Lys，K)。
同样，δ-氨基共价连接至从α-碳开始的第四个碳。
其中侧链为丙胺且侧链氨基为δ(delta)氨基的氨基烷基氨基酸残基为鸟氨酸(Orn)。
鸟氨酸是通过精氨酸的去胍化(deguanidation)在细胞中形成的。虽然它不用于体内蛋白生成，但它参与几种酶途径，似乎在体内氮平衡中起作用，因为它可以酶促胍化(gaunidated enzymatically)形成精氨酸。
本文定义的任何氨基酸都可以是L-或D-构型。如果没有指明，优选表示L-异构体形式。
因此，在一个实施方案中，本文公开的氨基烷基氨基酸残基单独地是L-或D-构型。在一个实施方案中，氨基烷基氨基酸残基是L-构型。
在一个实施方案中，包含在支链氨基酸探针中的氨基烷基氨基酸残基单独地选自赖氨酸和鸟氨酸。
在一个实施方案中，氨基烷基氨基酸残基选自赖氨酸和D-赖氨酸。在一个具体实施方案中，本发明的氨基烷基氨基酸残基是赖氨酸残基。
在一个实施方案中，氨基烷基氨基酸残基选自鸟氨酸和D-鸟氨酸。
在一个实施方案中，提供了包含毒蜥外泌肽-4和一个或多个支链氨基酸探针的毒蜥外泌肽-4类似物，
其中所述支链氨基酸探针包含选自赖氨酸和鸟氨酸的第一氨基酸残基，
所述第一氨基酸残基任选地与选自赖氨酸或鸟氨酸的第二氨基酸残基或第二和第三氨基酸残基共价连接，以形成2或3个赖氨酸或鸟氨酸残基的直链，
其中所述第一、第二和/或第三赖氨酸或鸟氨酸残基中的一个或多个的侧链通过使δ-氨基(鸟氨酸)或ε-氨基(赖氨酸)结合独立地选自以下的分子而被修饰：Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p、[Lys-(aa3)]p、Ornq-Orn、(aa3)p-Ornq、Ornq-(aa3)p、[(aa3)-Orn]p和[Orn-(aa3)]p、Ornp-Lysp、Lysp-Ornp、[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
其中所述第一赖氨酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的N-端，共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的C-端，和/或共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的赖氨酸的ε-氨基或鸟氨酸残基的δ-氨基，
条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
在一个实施方案中，提供了包含毒蜥外泌肽-4和一个或多个支链氨基酸探针的毒蜥外泌肽-4类似物，
其中所述支链氨基酸探针包含第一赖氨酸残基，
所述第一赖氨酸残基任选地与第二赖氨酸残基共价连接或与第二和第三赖氨酸残基共价连接，以形成2或3个赖氨酸残基的直链，
其中所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的一个或多个的侧链通过使所述赖氨酸的ε-氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p、[Lys-(aa3)]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
其中所述第一赖氨酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的N-端，共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的C-端，和/或共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的赖氨酸的ε-氨基或鸟氨酸残基的δ-氨基，
条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
将探针支链化
在一个实施方案中，本文定义的支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成。
在一个实施方案中，所述一个或多个支链氨基酸探针中的每一个均由2至3个氨基酸残基、例如3至4个氨基酸残基、例如4至5个氨基酸残基、例如5至6个氨基酸残基、例如6至7个氨基酸残基、例如7至8个氨基酸残基、例如8至9个氨基酸残基组成。
在一个实施方案中，所述一个或多个支链氨基酸探针中的每一个均由2个氨基酸残基、例如3个氨基酸残基、例如4个氨基酸残基、例如5个氨基酸残基、例如6个氨基酸残基、例如7个氨基酸残基、例如8个氨基酸残基、例如9个氨基酸残基组成。在一个具体实施方案中，所述一个或多个支链氨基酸探针中的每一个均由3个氨基酸残基组成。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含第一氨基烷基氨基酸残基(也称为AAA1)，所述第一氨基烷基氨基酸残基与毒蜥外泌肽-4连接以产生如本文定义的毒蜥外泌肽-4类似物。
在一个实施方案中，所述一个或多个支链氨基酸探针(的每一个)的第一氨基烷基氨基酸与所述毒蜥外泌肽-4的N-端共价连接，与所述毒蜥外泌肽-4的C-端共价连接，和/或与所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基共价连接。
在一个实施方案中，所述一个或多个支链氨基酸探针(的每一个)的第一氨基烷基氨基酸残基与所述毒蜥外泌肽-4的N-端氨基酸共价连接，与所述毒蜥外泌肽-4的C-端氨基酸共价连接，和/或与所述毒蜥外泌肽-4内的Lys或Orn残基的侧链共价连接。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含第一氨基烷基氨基酸残基。在一个实施方案中，所述第一氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使侧链氨基与如本文定义的分子结合而被修饰。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸在α氨基处是乙酰化的。在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸残基的N-端是乙酰化的。
在一个实施方案中，当包含第一氨基烷基氨基酸残基的支链氨基酸探针共价连接至毒蜥外泌肽-4的N-端时，或当包含第一氨基烷基氨基酸残基的支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基时，支链氨基酸探针的所述第一氨基烷基氨基酸残基的N-端是乙酰化的。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸残基的C-端是羧酸、醛、酯或酰胺，例如伯酰胺(CONH2)。在优选的实施方案中，第一氨基烷基氨基酸残基的C-端是酰胺化的。
在一个实施方案中，当包含第一氨基烷基氨基酸残基的支链氨基酸探针共价连接至毒蜥外泌肽-4的C-端时，支链氨基酸探针的所述第一氨基烷基氨基酸残基的C-端是酰胺。
在一个实施方案中，所述第一氨基烷基氨基酸残基与第二氨基烷基氨基酸残基共价连接，形成2个氨基烷基氨基酸残基的直链。在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第二氨基烷基氨基酸残基的α氨基是乙酰化的。在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第二氨基烷基氨基酸残基的N-端是乙酰化的。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第二氨基烷基氨基酸残基的C-端是羧酸、醛、酯或酰胺，例如伯酰胺(CONH2)。在优选的实施方案中，第二氨基烷基氨基酸残基的C-端是酰胺化的。
在一个实施方案中，所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至第二氨基烷基氨基酸残基和(共价连接至)第三氨基烷基氨基酸残基，以形成3个氨基烷基氨基酸残基的直链。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第三氨基烷基氨基酸残基的α氨基是乙酰化的。在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第三氨基烷基氨基酸残基的N-端是乙酰化的。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第三氨基烷基氨基酸残基的C-端是羧酸、醛、酯或酰胺，例如伯酰胺(CONH2)。在优选的实施方案中，第三氨基烷基氨基酸残基的C-端是酰胺化的。
在一个实施方案中，第一氨基烷基氨基酸残基具有在其胺基处结合的第二和第三氨基烷基氨基酸残基。在一个实施方案中，第一氨基烷基氨基酸残基具有共价连接至其羧酸基团的第二和第三氨基烷基氨基酸残基。在一个实施方案中，第一氨基烷基氨基酸残基具有在其胺基处结合的第二氨基烷基氨基酸残基和在其羧酸基团处结合的第三氨基烷基氨基酸残基。
第二和第三氨基烷基氨基酸残基可以分别表示为AAA2和AAA3。
在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的每一个均是具有选自以下的侧链氨基烷基的氨基酸：甲胺(-CH2NH2)、乙胺(-C2H4NH2)、丙胺(-C3H6NH2)、正丁胺(-C4H8NH2)、戊胺(-C5H10NH2)、正己胺(-C6H12NH2)、庚胺(-C7H14NH2)、辛胺(-C8H16NH2)、壬胺(-C9H18NH2)、癸胺(-C10H20NH2)、十一胺(-C11H22NH2)和十二胺(-C12H24NH2)。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的每一个单独地选自赖氨酸、D-赖氨酸、鸟氨酸和D-鸟氨酸。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基中的每一个均是赖氨酸残基(包括L-赖氨酸和D-赖氨酸)。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一、第二或第三氨基烷基氨基酸残基在α氨基处是乙酰化的(Ac-AAA)(COCH3)。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一，第一和第二以及第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基称为支链氨基酸探针的氨基烷基氨基酸主链(AAA1、AAA1-2、AAA1-3)。
在一个实施方案中，第一，第一和第二以及第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基各自是赖氨酸残基。在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一，第一和第二以及第一、第二和第三赖氨酸残基称为支链氨基酸探针的赖氨酸主链(Lys1、Lys1-2、Lys1-3)。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的赖氨酸主链的第一赖氨酸残基或第二赖氨酸残基或第三赖氨酸残基在α氨基处是乙酰化的(Ac-Lys)。
在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基之一的侧链通过使侧链氨基结合本文定义的分子而被修饰。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含第一氨基烷基氨基酸残基，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使侧链氨基结合本文定义的分子而被修饰。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含第一和第二氨基烷基氨基酸残基，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使侧链氨基结合本文定义的分子而被修饰。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含第一和第二氨基烷基氨基酸残基，其中所述第二氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使侧链氨基结合本文定义的分子而被修饰。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含第一和第二氨基烷基氨基酸残基，其中所述第一和第二氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使侧链氨基结合本文定义的分子而被修饰。
在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的两个的侧链通过使侧链氨基结合本文定义的分子而被修饰。
在一个实施方案中，第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基的所有三个的侧链通过使侧链氨基结合本文定义的分子而被修饰。
在一个实施方案中，i)第一氨基烷基氨基酸残基，ii)第二氨基烷基氨基酸残基，iii)第三氨基烷基氨基酸残基，iv)第一和第二氨基烷基氨基酸残基，v)第一和第三氨基烷基氨基酸残基，vi)第二和第三氨基烷基氨基酸残基，或vii)第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使侧链氨基基团结合本文定义的分子而被修饰。
在一个实施方案中，支链氨基酸的赖氨酸主链的第一赖氨酸残基，或第二赖氨酸残基，或第三赖氨酸残基，或第一和第二赖氨酸残基，或第一和第三赖氨酸残基，或第二和第三赖氨酸残基，或第一、第二和第三赖氨酸残基，通过使分子结合至ε-氨基而被修饰。
在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的每一个的一个或多个的侧链通过使侧链氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，AAA为氨基烷基氨基酸残基，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述分子的N-端AAA或(aa)3在α氨基处是乙酰化的。
在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的每一个的一个或多个的侧链通过使侧链氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p、[Lys-(aa3)]p、Ornq-Orn、(aa3)p-Ornq、Ornq-(aa3)p、[(aa3)-Orn]p和[Orn-(aa3)]p、Ornp-Lysp、Lysp-Ornp、[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述分子的N-端Lys、Orn或(aa)3在α氨基处是乙酰化的。
在一个实施方案中，所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的每一个的一个或多个的侧链通过使侧链氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，Lys是选自L-Lys和D-Lys的赖氨酸残基，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述分子的N-端Lys或(aa)3在α氨基处是乙酰化的。
在一个实施方案中，赖氨酸主链的所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的每一个的一个或多个的侧链通过使侧链的ε-氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，Lys是选自L-Lys和D-Lys的赖氨酸残基，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述分子的N-端Lys或(aa)3在α氨基处是乙酰化的。
在一个实施方案中，赖氨酸主链的所述第一、第二和/或第三赖氨酸残基中的每一个的一个或多个的侧链通过使侧链的ε-氨基结合Lysq-Lys分子而被修饰，其中q是选自0、1、2和3的数字。在一个实施方案中，所述分子的N-端Lys在α氨基处是乙酰化的。
在一个实施方案中，与支链氨基酸探针的赖氨酸主链的一个或多个赖氨酸残基的ε-氨基共价连接的分子独立地选自Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p，其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述分子的N-端Lys或(aa)3在α氨基处是乙酰化的。
因此，在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一赖氨酸残基，或第二赖氨酸残基，或第三赖氨酸残基，或第一和第二赖氨酸残基，或第一和第三赖氨酸残基，或第二和第三赖氨酸残基，或第一、第二和第三赖氨酸残基各自通过使ε-氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p，其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述分子的N-端Lys或(aa)3在α氨基处是乙酰化的。
在一个具体的实施方案中，(aa3)是独立地选自Gly和Ala的氨基酸残基。在另一个实施方案中，(aa3)是Gly。
在一个实施方案中，与所述第一、第二和/或第三烷基胺基氨基酸残基的侧链氨基共价连接的分子在N-端氨基酸残基的α氨基处是乙酰化的。
在一个实施方案中，所述分子独立地选自以下：Ac-AAAq-AAA、Ac-(aa3)p-AAAq、Ac-AAAq-(aa3)p、Ac-[(aa3)-AAA]p和Ac-[AAA-(aa3)]p，和/或AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p。
在一个实施方案中，所述分子独立地选自以下：Ac-Ornq-Orn、Ac-(aa3)p-Ornq、Ac-Ornq-(aa3)p、Ac-[(aa3)-Orn]p、Ac-[Orn-(aa3)]p、Ac-Ornp-Lysp、Ac-Lysp-Ornp、Ac-[Orn-Lys]p和Ac-[Lys-Orn]p，和/或Ornq-Orn、(aa3)p-Ornq、Ornq-(aa3)p、[(aa3)-Orn]p和[Orn-(aa3)]p、Ornp-Lysp、Lysp-Ornp、[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p。
因此，在一个实施方案中，所述分子独立地选自以下：Ac-Lysq-Lys、Ac-(aa3)p-Lysq、Ac-Lysq-(aa3)p、Ac-[(aa3)-Lys]p和Ac-[Lys-(aa3)]p，和/或Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p。
在一个具体实施方案中，与侧链氨基共价连接的分子是Ac-AAAq-AAA或AAAq-AAA，其中q是选自0、1、2和3的数字。
因此，在一个实施方案中，支链氨基酸探针由2至9个氨基烷基氨基酸残基组成。在一个实施方案中，所述2至9个氨基烷基氨基酸残基单独地选自赖氨酸、D-赖氨酸、鸟氨酸和D-鸟氨酸。
在一个具体实施方案中，与侧链氨基共价连接的分子是Ac-Lysq-Lys或Lysq-Lys，其中q是选自0、1、2和3的数字。
因此，在一个实施方案中，支链氨基酸探针由2至9个赖氨酸残基组成。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含选自Arg、His、Gly和Ala的最多1、2、3或4个氨基酸(aa3)，其中其余的氨基酸是氨基烷基氨基酸残基。在另一个实施方案中，支链氨基酸探针包含最多1个Arg残基，和/或包含最多1个His残基，和/或包含最多1个Gly残基，和/或包含最多1个Ala残基。
在一个实施方案中，与第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链氨基共价连接的分子选自AAA、Ac-AAA、AAA-AAA、Ac-AAA-AAA、AAA-AAA-AAA、Ac-AAA-AAA-AAA、AAA-AAA-AAA-AAA、Ac-AAA-AAA-AAA-AAA、AAA-Gly-AAA、Ac-AAA-Gly-AAA、AAA-AAA-Gly、Ac-AAA-AAA-Gly、AAA-Gly、Ac-AAA-Gly、AAA-Ala-AAA、Ac-AAA-Ala-AAA、AAA-AAA-Ala、Ac-AAA-AAA-Ala、AAA-Ala、Ac-AAA-Ala、AAA-His-AAA、Ac-AAA-His-AAA、AAA-AAA-His、Ac-AAA-AAA-His、AAA-His、Ac-AAA-His、AAA-Arg-AAA、Ac-AAA-Arg-AAA、AAA-AAA-Arg、Ac-AAA-AAA-Arg、AAA-Arg和Ac-AAA-Arg，其中AAA是如本文所详细说明的氨基烷基氨基酸残基。上文提到的AAA、Gly、Ala、His和Arg氨基酸残基可以各自为L-或D-构型。
在一个实施方案中，与第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基的一个或多个的侧链氨基共价连接的分子选自Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
在一个具体的实施方案中，与第一、第二和/或第三赖氨酸残基的一个或多个的ε-氨基共价连接的分子选自Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
在一个具体的实施方案中，支链氨基酸探针包含选自Lys和D-Lys的第一赖氨酸残基或由选自Lys和D-Lys的第一赖氨酸残基组成，所述第一赖氨酸残基任选地是N-端乙酰化或C-端酰胺化的，其中所述第一赖氨酸残基通过使所述第一赖氨酸残基的ε-氨基结合选自以下的分子而被修饰：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
在一个具体的实施方案中，支链氨基酸探针包含各自选自Lys和D-Lys的第一和第二赖氨酸残基或由各自选自Lys和D-Lys的第一和第二赖氨酸残基组成，所述第二赖氨酸残基任选地是N-端乙酰化或C-端酰胺化的，其中i)所述第一赖氨酸残基、ii)所述第二赖氨酸残基或iii)所述第一和第二残基各自通过使所述赖氨酸残基的ε-氨基结合选自以下的分子而被修饰：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
在一个具体的实施方案中，支链氨基酸探针包含各自选自Lys和D-Lys的第一、第二和第三赖氨酸残基或由各自选自Lys和D-Lys的第一、第二和第三赖氨酸残基组成，所述第三赖氨酸残基任选地是N-端乙酰化或C-端酰胺化的，其中i)所述第一赖氨酸残基，ii)所述第二赖氨酸残基，iii)所述第三赖氨酸残基，iv)所述第一和第二赖氨酸残基，v)所述第一和第三赖氨酸残基，vi)所述第二和第三赖氨酸残基或vii)所述第一、第二和第三赖氨酸残基各自通过使所述赖氨酸残基的ε-氨基结合选自以下的分子而被修饰：Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含下式或由下式组成：Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-(等同于Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-)，其中Lys1是乙酰化的第一赖氨酸残基，其共价连接至肽如毒蜥外泌肽-4的N-端，(Ac-Lys-Lys)是共价连接至所述第一赖氨酸残基Lys1的ε-氨基的分子。图1说明了该式/结构。
在一个实施方案中，Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-共价连接至毒蜥外泌肽-4的N-端和/或所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含下式或由下式组成：Ac-(Ac-Lys)Lys1-。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含下式或由下式组成：(Ac-Lys-Lys)Lys1-NH2(等同于(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2)，其中Lys1是第一赖氨酸残基，其在C-端酰胺化(-NH2)，(Ac-Lys-Lys)是与所述第一赖氨酸残基Lys1的ε-氨基结合的分子。在一个实施方案中，(Ac-Lys-Lys)Lys1-NH2结合至毒蜥外泌肽-4的C-端。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含选自以下的式或由选自以下的式组成：(AAA)AAA1-、(AAA-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-AAA-AAA)AAA1-、(AAA-Gly-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-Gly)AAA1-、(AAA-Gly)AAA1-、(AAA-Ala-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-Ala)AAA1-、(AAA-Ala)AAA1-、(AAA-His-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-His)AAA1-、(AAA-His)AAA1-、(AAA-Arg-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-Arg)AAA1-和(AAA-Arg)AAA1-。在一个实施方案中，所述第一氨基烷基氨基酸残基(AAA1-)是N-端乙酰化或C-端酰胺化的。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含选自以下的式或由选自以下的式组成：(Lys)Lys1-、(Lys-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、(Lys-Gly-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Gly)Lys1-、(Lys-Gly)Lys1-、(Lys-Ala-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Ala)Lys1-、(Lys-Ala)Lys1-、(Lys-His-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-His)Lys1-、(Lys-His)Lys1-、(Lys-Arg-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Arg)Lys1-和(Lys-Arg)Lys1-。在一个实施方案中，所述第一赖氨酸残基(Lys1-)是N-端乙酰化或C-端酰胺化的。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含选自以下的式或由选自以下的式组成：Ac-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Ala-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Ala)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Ala)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-His-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-His)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-His)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Arg-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Arg)Lys1-和Ac-(Ac-Lys-Arg)Lys1-。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含选自以下的式或由选自以下的式组成：(Ac-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Gly)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Ala-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Ala)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Ala)Lys1-NH2、(Ac-Lys-His-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-His)Lys1-NH2、(Ac-Lys-His)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Arg-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Arg)Lys1-NH2和(Ac-Lys-Arg)Lys1-NH2。
更具体地说，在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含选自以下的式或由选自以下的式组成：Ac-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-和Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys1-。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含以下式或由以下式组成：Ac-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-，其中Lys1是第一赖氨酸残基，Lys2是乙酰化的并通过肽键共价连接至Lys1的第二赖氨酸残基，(Ac-Lys)是共价连接至所述第二赖氨酸残基Lys2的ε-氨基的分子。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针包含以下式或由以下式组成：Ac-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-，其中分子(Ac-Lys)共价连接至所述第一赖氨酸残基Lys1的ε-氨基。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自以下：
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-、(Ac-Lys)Lys-Lys-、Ac-(Lys)Lys-Lys-、(Lys)Lys-Lys-、(Ac-Lys)Lys-Lys-NH2、(Lys)Lys-Lys-NH2；
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-、Lys-(Ac-Lys)Lys-、Ac-Lys-(Lys)Lys-、Lys-(Lys)Lys-Lys-(Ac-Lys)Lys-NH2、Lys-(Lys)Lys-NH2；
Ac-(Ac-Lys-Lys)-Lys-、(Ac-Lys-Lys)-Lys-、Ac-(Lys-Lys)-Lys-和(Lys-Lys)-Lys-(Ac-Lys-Lys)-Lys-NH2、和(Lys-Lys)-Lys-NH2。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自Ac-(Ac-Lys)Lys-、Ac-(Lys)Lys-、(Ac-Lys)Lys-NH2、(Lys)Lys-NH2和(Lys)Lys-。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自Ac-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Gly)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-和Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-。
更具体地说，在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自Ac-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys2-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Gly)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-和Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针选自Ac-Lys3-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-Lys3-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys3-Lys2-Lys1-、Ac-Lys3-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys3-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-和Ac-(Ac-Lys)Lys3-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-。
在一个具体实施方案中，支链氨基酸探针选自Ac-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys2-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Lys)-Lys1-、Ac-Lys2-(Ac-Lys-Gly)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys2-(Ac-Lys-Lys-)-Lys1-、Ac-Lys3-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-Lys3-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys3-Lys2-Lys1-、Ac-Lys3-(Ac-Lys)Lys2-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys)Lys3-(Ac-Lys)Lys2-Lys1-和Ac-(Ac-Lys)Lys3-Lys2-(Ac-Lys)Lys1-。在一个实施方案中，所述支链氨基酸探针共价连接至毒蜥外泌肽-4的N-端和/或所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个具体实施方案中，支链氨基酸探针由2或3个赖氨酸残基(选自Lys和D-Lys)组成。
在一个具体实施方案中，支链氨基酸探针由3个赖氨酸残基组成。在另一个实施方案中，支链氨基酸探针由2个赖氨酸残基组成。
在一个具体的实施方案中，支链氨基酸探针由选自Lys和D-Lys的第一和第二赖氨酸残基组成，其中所述第一和第二赖氨酸残基之一或两者通过使所述第一和/或第二赖氨酸残基的ε-氨基结合一个选自Lys和D-Lys的赖氨酸残基而被修饰；其中所述赖氨酸残基的每一个任选地在α氨基处是乙酰化的。
在一个具体的实施方案中，支链氨基酸探针由选自Lys和D-Lys的第一赖氨酸残基组成，其中所述第一赖氨酸残基通过使所述第一赖氨酸残基的ε-氨基结合选自Lys和D-Lys的两个赖氨酸残基而被修饰；其中所述赖氨酸残基的每一个任选地在α氨基处是乙酰化的。
连接支链氨基酸探针和毒蜥外泌肽-4
如本文所公开的，所述一个或多个支链氨基酸探针中的每一个的第一氨基烷基氨基酸残基与毒蜥外泌肽-4的N-端共价连接，与毒蜥外泌肽-4的C-端共价连接，和/或与毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基共价连接。
使一个或多个支链氨基酸探针与毒蜥外泌肽-4结合会产生毒蜥外泌肽-4/BAP-缀合物。
术语共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的N-端意指支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至毒蜥外泌肽-4的最N-端氨基酸残基的α氨基。
术语共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的C-端意指支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸残基的α氨基共价连接至毒蜥外泌肽-4的最C-端氨基酸残基。
此外，应理解，在一个实施方案中，支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个具体的实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4序列内的所述氨基烷基氨基酸残基选自鸟氨酸残基和赖氨酸残基。在一个具体的实施方案中，所述肽序列内的所述氨基烷基氨基酸残基是赖氨酸残基。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的鸟氨酸残基的δ-氨基或所述毒蜥外泌肽-4内的赖氨酸残基的ε-氨基。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的赖氨酸残基的ε-氨基。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的N-端。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4的C-端。
应当理解，所述肽序列内的氨基烷基氨基酸残基意指氨基烷基氨基酸残基不构成支链氨基酸探针本身的一部分，而是存在于毒蜥外泌肽-4的现有氨基酸序列内的残基。所述氨基烷基氨基酸残基可以位于毒蜥外泌肽-4的任何位置。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内第27位Lys(Lys27)的侧链氨基。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内第12位Lys(Lys12)的侧链氨基。
在一个实施方案中，包含一个或多个支链氨基酸探针的肽类似物意指在一个实施方案中肽类似物包含1个支链氨基酸探针，例如2个支链氨基酸探针，例如3个支链氨基酸探针，例如4个支链氨基酸探针，例如5个支链氨基酸探针，例如6个支链氨基酸探针。
原则上，肽类似物可以包含任意数量的支链氨基酸探针，只要它们可以与所述肽(所述毒蜥外泌肽-4内的N-端、C-端和/或一个或多个氨基烷基氨基酸残基)共价连接。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含1个支链氨基酸探针。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含1个支链氨基酸探针，该支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的N-端。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含1个支链氨基酸探针，该支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的C-端。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含1个支链氨基酸探针，该支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物包含多于一个(两个或更多个)支链氨基酸探针。在所述毒蜥外泌肽-4类似物包含多于一个支链氨基酸探针的实施方案中，应当理解的是，所述多于一个支链氨基酸探针可以分别相同(同一)或不同(不同一)。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物包含2个支链氨基酸探针。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含2个支链氨基酸探针，其中一个支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的N-端，另一个支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的C-端。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含2个支链氨基酸探针，其中一个支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的N-端，另一个支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含2个支链氨基酸探针，其中一个支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的C-端，另一个支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个实施方案中，所述肽类似物包含2个支链氨基酸探针，其中两个支链氨基酸探针中的每一个共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内的不同(或单独的)氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物包含3个支链氨基酸探针。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物包含3个支链氨基酸探针，其中第一支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的N-端，第二支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的C-端，第三支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含3个支链氨基酸探针，其中第一支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的N-端，第二和第三支链氨基酸探针各自共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内不同氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物包含3个支链氨基酸探针，其中第一支链氨基酸探针共价结合至毒蜥外泌肽-4的C-端，第二和第三支链氨基酸探针各自共价连接至所述毒蜥外泌肽-4内不同氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
毒蜥外泌肽-4
本文所公开的毒蜥外泌肽-4类似物包含毒蜥外泌肽-4和一个或多个支链氨基酸探针，其中所述毒蜥外泌肽-4选自des-Pro38-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO:1)、des-Ser39-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO:2)和毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO:3)或其功能变体。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4为His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-X1(SEQ ID NO:4)，其中X1选自Ser和Pro。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4是des-Pro38-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：1)或des-Ser39-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：2)。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4是毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：3)或其功能变体。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的C-端是羧酸、醛、酯或酰胺，例如伯酰胺(CONH2)或仲酰胺。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的C-端是未修饰的C-端羧基。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4是C-端酰胺化的(-NH2)。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4不是C-端酰胺化的，尤其是当结合C-端支链氨基酸探针时。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4是C-端酰胺化的，尤其是当未结合C-端支链氨基酸探针时。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4是N-端乙酰化的(COCH3或Ac-)。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4不是N-端乙酰化的，尤其是当结合N-端支链氨基酸探针时。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4是N-端乙酰化的，尤其是当未结合N-端支链氨基酸探针时。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的N-端是游离氨基部分(H-)。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的N-端His是游离氨基部分(H-His)。
在一个实施方案中，N-端His是乙酰化的。
在一个实施方案中，C-端是酰胺化的。在一个实施方案中，C-端Ser是酰胺化的。在一个实施方案中，C-端Pro是酰胺化的。
如本文所用，毒蜥外泌肽-4(1-39)肽(SEQ ID NO：3)从N-端到C-端的每个氨基酸被称为第1位、第2位、第3位等，直到第39位。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的功能变体是具有一个或多个氨基酸取代的变体。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的功能变体是具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的功能变体是具有一个氨基酸取代的变体。一个氨基酸取代意指原始序列和变体序列之间在一个位置的氨基酸不同。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的功能变体是具有两个氨基酸取代的变体。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的功能变体是具有三个氨基酸取代的变体。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的功能变体是具有四个氨基酸取代的变体。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4的功能变体是具有五个氨基酸取代的变体。
本文所定义的毒蜥外泌肽-4的功能变体原则上可以在一个或多个位置具有一个或多个取代。毒蜥外泌肽-4中的各个氨基酸残基可以用任何给定的蛋白氨基酸(proteinogenic amino acid)或非蛋白氨基酸(non-proteinogenic amino acid)取代。
遗传密码描述了天然掺入多肽中的20种标准氨基酸(蛋白氨基酸)：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、GIn、GIu、GIy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Tyr、Thr、Trp、Val，以及2个通过独特的合成机制引入蛋白质的氨基酸：Sec(硒代半胱氨酸或U)和Pyl(吡咯赖氨酸，O)。这些都是L-立体异构体。
除了22种标准或天然氨基酸之外，还有许多其它非天然存在的氨基酸(非蛋白的或非标准的)。它们要么不在蛋白质中发现，要么不是通过标准细胞机制直接产生和分离的。非标准氨基酸通常通过对标准氨基酸的修饰，例如翻译后修饰而形成。非天然氨基酸残基的实例是Abu、Aib、Nle(正亮氨酸)、DOrn(D-鸟氨酸，去鸟苷酸化精氨酸)、Nal(β-2-萘基-丙氨酸)、D-Nal(β-2-萘基-D-丙氨酸)、DArg、DTrp、DPhe和DVal。
本文定义的任何氨基酸可以是L-或D-构型。如果没有指明，优选意指L-异构体形式。
术语肽还包括通过化学或酶催化反应引入的翻译后修饰，如本领域已知的。如果需要，可在分配(partitioning)之前引入此类翻译后修饰。而且，功能等同物可以包括化学修饰，例如泛素化、标记(例如，用放射性核素、各种酶等)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或通过氨基酸的插入(或通过化学合成进行取代)，其通常不在人蛋白质中发生。
具有N-端烷基化和C-端酯化的毒蜥外泌肽-4也涵盖在本公开内容中。功能等同物还包括用相同分子形成的糖基化且共价或聚集的缀合物，包括二聚体或不相关的化学部分。通过本领域已知的方法，通过将官能团(functionality)连接到片段(包括在N-端和C-端的任何一个或两个)中发现的基团上，来制备此类功能等同物。
在一些实施方案中，本文公开的毒蜥外泌肽-4通过乙酰化，例如N-端乙酰化进行修饰。在一些实施方案中，本文公开的毒蜥外泌肽-4通过C-端酰胺化进行修饰。
毒蜥外泌肽-4的功能变体意指该变体至少在一定程度上保留了非变体序列或原始序列的功能。
本文定义的毒蜥外泌肽-4及其功能变体包括结合并优选激活GLP-1R的任何毒蜥外泌肽-4。
在一个实施方案中，功能性毒蜥外泌肽-4是毒蜥外泌肽-4或其功能变体，其是GLP-1R的激动剂。
本文中的术语“激动剂”是指本文定义的毒蜥外泌肽-4，其能够结合至受体，或在一些实施方案中能够至少在一定程度上结合和/或激活受体，或在一些实施方案中至少在一定程度上激活受体。例如，GLP-1R激动剂因此能够结合和/或激活GLP-1R。
激动剂可以是几种不同类型受体的激动剂，并且因此能够结合和/或激活几种不同类型的受体。所述激动剂还可以是选择性激动剂，其仅结合和激活一种类型的受体。本文中的术语“拮抗剂”是指能够抑制受体激动剂作用的物质。
完全激动剂(full agonist)结合(具有亲和力)并激活受体，对该受体显示完全效力。本文中的“部分激动剂(partial agonist)”是能够结合并激活给定受体，但相对于完全激动剂对受体仅具有部分效力的肽。当与完全激动剂竞争受体占位(receptor occupancy)并与使用单独的完全激动剂所观察到的作用或活化相比产生受体活化的净降低时，部分激动剂可用作拮抗剂。
本文中的“选择性激动剂”是选择性的并因此主要结合和激活一种类型的受体的化合物。因此，选择性的GLP-1R激动剂对GLP-1R是选择性的。
在一个实施方案中，本文定义的毒蜥外泌肽-4能够在一定程度上结合并激活GLP-1R。亲和力是指肽配体与其受体之间的分子间力的数量和大小，以及配体在其受体结合位点的停留时间；受体活化效力是指肽配体在结合靶受体后产生生物学应答的能力和该应答的定量量级。在一些实施方案中，亲和力和受体活化功效上的此类差异通过本领域常规的受体结合/活化研究来确定，例如得到在表达一种或几种本文所述受体类型的细胞中或在表达不同类型受体的组织上的配体结合刺激的EC50和Emax值。高亲和力表示与具有较低亲和力的配体肽相比，需要较低浓度的配体来获得50％的受体结合；高受体活化效力表示与具有较低亲和力和/或受体活性效力(较高EC50值)的肽相比，需要较低浓度的肽来获得50％受体活化应答(低EC50值)。
在一个具体的实施方案中，功能性毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-4的变体是对GLP-1R具有结合亲和力和/或受体效力的毒蜥外泌肽-4。这可以使用常规方法或如实施例2和3中概述的方法进行测试。
在一个具体的实施方案中，毒蜥外泌肽-4能够结合并活化至少GLP-1R。在进一步的实施方案中，所述肽是GLP-1R的完全激动剂。
在一个实施方案中，本文定义的毒蜥外泌肽-4，包括其功能变体在内，能够具有以下一种或多种：
-增强/刺激胰腺β-细胞的葡萄糖依赖性胰岛素分泌，
-增强响应于进食食物的胰腺应答(即增加胰岛素分泌)；结果是释放更高、更适量的胰岛素，其有助于降低进食引起的血糖升高，
-降低哺乳动物的血糖，
-增加胰腺中β细胞的数量，
-抑制响应于进食的胰腺的胰高血糖素释放，这有助于阻止肝脏在不需要的时候过量产生糖，防止了高血糖症，
-减慢胃排空并因此降低血流中出现膳食衍生的葡萄糖的速率，
-降低食欲，通过下丘脑受体促进饱感，和/或
-降低肝脏脂肪含量。
制备方法
本文公开的毒蜥外泌肽-4类似物可以通过本领域已知的任何合适方法制备。因此，在一些实施方案中，毒蜥外泌肽-4和支链氨基酸探针各自通过标准肽制备技术制备，例如溶液合成或固相肽合成(SPPS)，例如Merrifield-型固相合成。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物通过固相合成制备，首先使用熟知的标准保护、偶联和去保护程序构建在药理学上有活性的毒蜥外泌肽-4序列，然后以与活性毒蜥外泌肽-4构建相似的方式将支链氨基酸探针依次偶联到活性毒蜥外泌肽-4上，最后从载体上切下整个毒蜥外泌肽-4类似物。该策略产生了毒蜥外泌肽-4，其中支链氨基酸探针在毒蜥外泌肽-4的N-端氮原子处与在药理学上有活性的毒蜥外泌肽-4共价结合。
在一个实施方案中，在活性毒蜥外泌肽-4上偶联支链氨基酸序列之前或之后，使用标准酰化技术，将支链氨基酸序列中最后一个氨基酸上的α-氮用乙酰基加帽。
在合成期间促进氨基酸偶联的N-和C-端的反应性部分，以及反应性侧链官能团，可以在合成和肽延伸期间与游离末端或其它侧链基团相互作用，并且负面地影响产率和纯度。因此，开发了与特定氨基酸官能团结合并阻断或保护该官能团免于非特异性反应的化学基团。将纯化的单独的氨基酸在合成之前与这些保护基团反应，然后在肽合成的特定步骤期间选择性地去除。N-端保护基团的实例是t-Boc和Fmoc，它们通常用于固相肽合成。C-端保护基团主要用于液相合成。因为N-端去保护在肽合成过程中连续发生，建立了保护方案，其中不同类型的侧链保护基团(苄基Bzl或叔丁基tBu)分别与Boc或Fmoc匹配，用于优化的去保护。
在一个具体的实施方案中，当制备支链氨基酸探针，例如Ac(Ac-Lys-Lys)Lys-时，Lys的保护基团是Mtt，其作为Fmoc保护的氨基酸是可商购的(Fmoc-Lys(Mtt)-OH；N-α-Fmoc-N-ε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸，CAS#167393-62-6)。Lys(Mtt)允许用乙酰基将Lys加帽或在赖氨酸的α氨基处延伸序列，因为其在切割Fmoc的条件下不被切割，并且可以在不切割其它侧链保护基团的情况下被去除。
在一个具体的实施方案中，当制备支链氨基酸探针，例如(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2时，Lys的保护基团是ivDde，其作为Fmoc保护的氨基酸是可商购的(Fmoc-Lys(ivDde)-OH；N-α-Fmoc-N-ε-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基-L-赖氨酸，CAS#204777-78-6)。Lys(ivDde)允许在赖氨酸的α氨基处延伸序列或用乙酰基将Lys加帽，因为其在切割Fmoc的条件下不被切割，并且可以在不切割其它侧链保护基团的情况下被去除。
在一些实施方案中，通过本领域的常规方法优化所述制备方法，这可以提高由此制备的合成毒蜥外泌肽-4的产率和/或质量。例如，在含丝氨酸和苏氨酸的肽的Fmoc SPPS中使用假脯氨酸(噁唑烷)二肽可导致粗产物的质量和产率的改善，并且可有助于避免失败序列的不必要的重复合成。这些二肽易于使用：用适当的假脯氨酸二肽简单地取代肽序列中的丝氨酸或苏氨酸残基以及前面的氨基酸残基。在切割和去保护时再生天然序列。
在一个实施方案中，在药理学上有活性的毒蜥外泌肽-4的序列和支链氨基酸探针(或其部分)各自分别通过例如溶液合成、固相合成、重组技术或酶促合成来制备，然后通过公知的片段缩合(segment condensation)方法在溶液中或使用固相技术或其组合将(至少)两个序列偶联。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4通过重组DNA方法制备，支链氨基酸探针通过固相或液相合成制备。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4和支链氨基酸探针的缀合通过使用化学连接进行。该技术允许以高度特异性的方式组装完全未保护的肽片段。在另一个实施方案中，缀合通过蛋白酶催化的肽键形成来进行，其提供了高度特异性的技术用以经由肽键结合完全未保护的肽片段。
在一个实施方案中，支链氨基酸探针的C-端氨基酸或毒蜥外泌肽-4的C-端氨基酸通过常用连接物共价连接至固体支持材料，所述常用连接物例如2,4-二甲氧基-4'-羟基-二苯甲酮、4-(4-羟基-甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁酸、4-羟基-甲基苯甲酸、4-羟甲基-苯氧基乙酸、3-(4-羟甲基苯氧基)丙酸或对-{(R,S)-α-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰氨基]-2,4-二甲氧基苄基}-苯氧基乙酸(Rink酰胺连接物)。
合适的固体支持材料(SSM)的实例是例如官能化树脂，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、接枝在聚苯乙烯上的聚乙二醇、胶乳(latex)、dynabeads等。
在一些实施方案中，通过酸，例如三氟乙酸、三氟甲磺酸、溴化氢、氯化氢、氟化氢等，任选地与一种酚、茴香硫醚(thioanisole)等进行组合，将产生的毒蜥外泌肽-4类似物从固体支持物上切割，或者在其它实施方案中，通过碱，例如氨、肼、醇盐如乙醇钠、氢氧化物如氢氧化钠等，将肽缀合物从固体支持物上切割。
在一个实施方案中，所产生的毒蜥外泌肽-4类似物以盐的形式被分离，例如乙酸盐或马来酸盐或本领域技术人员已知的任何其它盐。
在其它实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物可以通过重组技术制备或生产。因此，在一个方面，所述肽由宿主细胞产生，所述宿主细胞包含编码毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-4类似物的第一核酸序列，该序列与能够指导在所述宿主细胞中表达的第二核酸可操作地结合。在一些实施方案中，第二核酸序列包含指导感兴趣的蛋白质在所述细胞中表达的启动子，或甚至由其组成。技术人员将能够容易地鉴定用于给定宿主细胞的有用的第二核酸序列(例如，载体和质粒)。
生产重组肽的方法通常包括以下步骤：提供宿主细胞；制备基因表达构建体，所述构建体包含编码所述肽的第一核酸，所述第一核酸与能够指导所述感兴趣的蛋白质在宿主细胞中表达的第二核酸有效连接；用所述构建体转化宿主细胞和培养宿主细胞，从而获得所述肽的表达。在一个实施方案中，重组产生的肽由宿主细胞分泌。宿主细胞包括本领域已知的任何合适的宿主细胞，包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，由此生产的重组肽通过任何常规方法分离，并且可以通过常规肽键形成化学与任何适当保护的支链氨基肽部分连接。技术人员将能够鉴定用于纯化肽的合适的蛋白质分离步骤。
治疗方法
一方面提供了如本文所定义的毒蜥外泌肽-4类似物，用作药物。
在另一方面，本发明提供了治疗、预防或减轻医学病况的方法。在一个实施方案中，此类方法包括向有此需要的个体施用或释放有效量的毒蜥外泌肽-4类似物或包含一种或多种此类毒蜥外泌肽-4类似物的药物组合物的一个或多个步骤。在一个实施方案中，本发明的此类施用或释放步骤是同时的、顺序的或分开的。
在一个实施方案中，本文提及的有需要的个体是受益于本发明毒蜥外泌肽-4类似物或药物组合物的施用的个体。在一个实施方案中，这样的个体患有疾病或病症或处于患疾病或病况的风险中。在一个实施方案中，所述个体是任何人，男性或女性、婴儿、中年或老年人。在一个实施方案中，个体中待被治疗或预防的病症涉及个体的年龄、个体的整体健康状况、用于治疗个体的药物以及个体是否具有患有可能已经或已经诱发个体中的所述病况的疾病或病症的在前病史。
如本文所用，术语“治疗”是指为了对抗病况、疾病或病症而对患者进行的管理和护理。所述术语意在包括针对患者所患的给定病况的全谱(full spectrum)治疗，例如出于以下目的施用毒蜥外泌肽-4类似物：减轻或缓解症状或并发症，延缓病况的进展，部分阻止临床表现、疾病或病症，治愈或消除病况、疾病或病症，和/或预防或降低获得病况、疾病或病症的风险，其中“预防”应理解为是指为了阻碍病况、疾病或病症的发展而对患者进行的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防或降低症状或并发症发作的风险。待治疗的患者优选是哺乳动物，尤其是人。
医学适应症
在一个实施方案中，本发明涉及如本文公开的毒蜥外泌肽-4类似物，用于治疗局部缺血病(ischemic condition)、炎性病(inflammatory condition)、感染和/或代谢病(metabolic condition)。
在一个实施方案中，本发明涉及本文公开的毒蜥外泌肽-4类似物在制备用于治疗局部缺血病、炎性病、感染和/或代谢病的药物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗局部缺血病、炎性病、感染和/或代谢病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的毒蜥外泌肽-4类似物。
在一个实施方案中，提供了本文公开的毒蜥外泌肽-4类似物，用于治疗哺乳动物的一个或多个器官的组织中的局部缺血病和/或炎性病。
在一个实施方案中，一个或多个器官的组织中的局部缺血病和/或炎性病是急性、亚急性或慢性病。在另一个实施方案中，一个或多个器官的组织中的局部缺血病是继发性缺血。
在一个实施方案中，所述一个或多个器官的组织中的局部缺血病和/或炎性病是由于选自以下的病所导致(或由其引起)：卒中、损伤(injury)、脓毒性休克(septicshock)、全身性低血压、由于心脏病发作引起的心搏停止、心律失常、伴有血栓形成的动脉粥样化疾病、心脏的栓塞或任何器官的血管的栓塞、血管痉挛、主动脉瘤或其它器官中的动脉瘤、冠状动脉狭窄、心肌梗死、心绞痛、心包炎、心肌炎、软皮病(myxodemia)或心内膜炎。
在一个具体实施方案中，所述一个或多个器官的组织中的局部缺血病和/或炎性病与再灌注损伤相关。再灌注损伤是缺血或缺氧一段时间后血液供应回到组织时引起的组织损伤。
在一个实施方案中，所述局部缺血病和/或炎性病与肾损伤相关，例如急性肾损伤(AKI)、肾毒性和/或慢性肾衰竭(CRF)。
在一个实施方案中，所述局部缺血病和/或炎性病与肝损伤相关。
在一个实施方案中，提供了本文所公开的毒蜥外泌肽-4类似物，用于治疗2型糖尿病。
在一个实施方案中，提供了本文所公开的毒蜥外泌肽-4类似物，用于治疗肥胖症。
在一个实施方案中，提供了本文所公开的毒蜥外泌肽-4类似物，用于诱导/促进/增强饱腹和/或饱腹感，和/或降低食欲。
在一个实施方案中，提供了本文所公开的毒蜥外泌肽-4类似物，用于以下一种或多种方法：
-血糖控制，
-降低血糖，
-刺激胰腺β-细胞的葡萄糖依赖性胰岛素分泌，
-增加响应进食的胰岛素分泌，和/或
-抑制响应进食的胰高血糖素释放。
在一个实施方案中，本发明涉及毒蜥外泌肽-4类似物在制备治疗2型糖尿病和/或肥胖症和/或促进饱腹和/或血糖控制的药物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗2型糖尿病和/或肥胖症和/或促进饱腹和/或血糖控制的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用毒蜥外泌肽-4类似物，例如施用治疗有效量的毒蜥外泌肽-4类似物。
在一个实施方案中，所述治疗是预防性的、改善性的和/或治愈性的。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人(智人)。
另外的活性成分(further active ingredient)
在一些实施方案中，本文公开的毒蜥外泌肽-4类似物与一种或多种另外的活性成分组合或包含一种或多种另外的活性成分，所述另外的活性成分理解为其它治疗化合物或其药学上可接受的衍生物。
因此，在一个实施方案中，本发明的治疗方法进一步包括同时或依次、并以任何合适的比例施用一种或多种另外的活性成分的一个或多个步骤。
在一个实施方案中，本发明的治疗方法包括一个步骤，其中将本文所定义的药物组合物或毒蜥外泌肽-4类似物与一种或多种另外的活性成分组合来同时、依次或分别施用。
在一个具体实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物与一种或多种选自口服降葡萄糖化合物和/或胰岛素的另外的活性成分组合施用，和/或配制成组合产品。
施用和剂量
在一个实施方案中，将包含本文定义的毒蜥外泌肽-4类似物的组合物以药学有效剂量或治疗有效量施用于有此需要的个体。
在一个实施方案中，治疗有效量的毒蜥外泌肽-4类似物是足以治愈、预防给定疾病或病症及其并发症、降低其风险、减轻或部分阻止其临床表现的量。对于特定治疗目的有效的量将取决于病症的严重性和种类以及受试者的体重和整体状况。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效量”。
在一个实施方案中，组合物以1μg/天至100mg/天的剂量施用；例如1μg/天至10μg/天，例如10μg/天至100μg/天，例如100μg/天至250μg/天，例如250μg/天至500μg/天，例如500μg/天至750μg/天，例如750μg/天至1mg/天，例如1mg/天至2mg/天，例如2mg/天至5mg/天，或例如5mg/天至10mg/天，例如10mg/天至20mg/天，例如20mg/天至30mg/天，例如30mg/天至40mg/天，例如40mg/天至50mg/天，例如50mg/天至75mg/天，或例如75mg/天至100mg/天。
在一个实施方案中，施用一个单剂量的组合物，其可以包含1μg/kg体重至100mg/kg体重；例如1至10μg/kg体重，例如10至100μg/kg体重，例如100至250μg/kg体重，例如250至500μg/kg体重，例如500至750μg/kg体重，例如750μg/kg体重至1mg/kg体重，例如1mg/kg体重至2mg/kg体重，例如2至5mg/kg体重，例如5至10mg/kg体重，例如10至20mg/kg体重，例如20至30mg/kg体重，例如30至40mg/kg体重，例如40至50mg/kg体重，例如50至75mg/kg体重，或例如75至100mg/kg体重。
在一个实施方案中，剂量每天施用一次或几次，例如每天1至6次，例如每天1至5次，例如每天1至4次，例如每天1至3次，例如每天1至2次，例如每天2至4次，例如每天2至3次。在一个实施方案中，剂量以少于每天一次，例如每两天一次或每周一次施用。
施用途径
应当理解，优选的施用途径将取决于待治疗的受试者的整体状况和年龄、待治疗的病况的性质、待治疗的组织在体内的位置和所选择的活性成分。
全身治疗
在一个实施方案中，施用途径允许将肽类似物引入血流中以最终靶向期望作用的位点。
在一个实施方案中，施用途径是任何合适的途径，例如肠内途径(包括口服、经直肠、经鼻、经肺、经颊、舌下、透皮、脑池内和腹膜内施用)，和/或胃肠外途径(包括皮下、肌内、鞘内、静脉内和皮内施用)。
用于这样的施用的合适剂型可以通过常规技术制备。
胃肠外施用
胃肠外施用是任何不是口服/肠内途径的施用途径，药物由此避免了在肝脏中的首过降解。因此，胃肠外施用包括任何注射和输注，例如快速浓注(bolus injection)或连续输注，如静脉内施用、肌内施用或皮下施用。此外，胃肠外施用包括吸入和局部施用(topical administration)。
因此，在一个实施方案中，肽类似物或组合物局部施用以穿过被给予所述物质或肽的动物的任何粘膜，例如鼻、阴道、眼、口、生殖道、肺、胃肠道或直肠中的粘膜，例如鼻或口的粘膜，并且因此胃肠外施用还可以包括经颊、舌下、经鼻、经直肠、经阴道和腹膜内施用以及通过吸入或安装设备的经肺和经支气管施用。在一些实施方案中，肽类似物局部施用以穿过皮肤。
在一个实施方案中，采用静脉内、皮下和肌内形式的胃肠外施用。
局部治疗
在一个实施方案中，肽类似物或组合物用作局部治疗，即直接引入作用位点。因此，所述肽可以直接施用于皮肤或粘膜，或者所述肽可以注射到作用部位，例如注射到患病组织或注射到直接通向患病组织的末端动脉。
药物制剂
在一个实施方案中，所述毒蜥外泌肽-4类似物或其药学上可接受的衍生物单独施用或与药学上可接受的载体或赋形剂组合施用，以单剂量或多剂量施用。本文定义的药物组合物或肽可以与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的佐剂和赋形剂根据常规技术配制，常规技术例如公开在Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第20版,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,2000中的那些。
本文中的术语“药学上可接受的衍生物”包括药学上可接受的盐，其表示对患者无害的盐。此类盐包括药学上可接受的碱或酸加成盐以及药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。药学上可接受的衍生物还包括可生物代谢为活性化合物的化合物的药学上可接受的酯、前药或其它前体，或化合物的晶体形式。
药物组合物或药学上可接受的组合物可以专门配制用于通过任何合适的途径施用，例如肠内途径、口服、经直肠、经鼻、经肺、经颊、舌下、透皮、脑池内、腹膜内和胃肠外(包括皮下、肌内、鞘内、静脉内和皮内)途径。
在一个实施方案中，药物组合物或毒蜥外泌肽-4类似物被配制用于穿过血脑屏障。在另一个实施方案中，药物组合物或毒蜥外泌肽-4类似物被配制用于不穿过血脑屏障。
用于口服施用的药物组合物包括固体剂型，例如硬或软胶囊、片剂、锭剂(troche)、糖衣剂(dragee)、丸剂、糖锭(lozenge)、粉末剂和颗粒剂。在适当的情况下，根据本领域公知的方法，它们可以用包衣如肠溶衣制备，或者它们可以被配制以提供活性成分的控释，如持续或延长释放。在相同的固体剂型中，可以将两种活性成分组合以提供一种活性成分的控释和另一种活性成分的速释。
口服施用的液体剂型包括溶液、乳剂、水性或油性混悬剂、糖浆和酏剂。
用于胃肠外施用的药物组合物包括无菌水性和非水性可注射溶液、分散液、混悬液或乳液，以及在使用前在无菌可注射溶液或分散液中重构的无菌粉末，和储库型可注射制剂。
其它合适的施用形式包括栓剂、喷雾剂、软膏剂、霜剂(cremes)/洗剂、凝胶剂、吸入剂、皮肤贴剂、植入物等。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物通常以游离物质或以药学上的衍生物如其药学上可接受的酯或如其盐的形式使用。后者的实例有具有游离碱官能团的化合物的酸加成盐和具有游离酸官能团的化合物的碱加成盐。术语“药学上可接受的盐”是指本文所定义的毒蜥外泌肽-4类似物的无毒盐，该盐通常通过使游离碱与合适的有机或无机酸反应，或通过使酸与合适的有机或无机碱反应来制备。当毒蜥外泌肽-4类似物含有游离碱官能团时，此类盐通过用药学上可接受的酸的化学等同物处理所述化合物的溶液或混悬液，以常规方式制备。当毒蜥外泌肽-4类似物含有游离酸官能团时，此类盐通过用药学上可接受的碱的化学等同物的处理所述化合物的溶液或混悬液，以常规方式制备。具有羟基的毒蜥外泌肽-4类似物的生理学上可接受的盐包括所述化合物的阴离子形式与合适的阳离子如钠或铵离子的组合。其它非药学上可接受的盐可用于制备毒蜥外泌肽-4类似物，这些形成另一方面。药学上可接受的酸加成盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐(glucaronate)、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4类似物为结晶形式，例如共结晶形式或结晶形式的水合物。
术语“前药(prodrug)”是指在体内快速转化以产生上式的母体化合物的肽，例如通过在血液中水解或通过在细胞如基底神经节细胞中代谢。全面的讨论可见T.Higuchi和VStella,"Pro-drugs as Novel Delivery Systems,"Vol.14,A.C.S.Symposium Series，和Bioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press,1987，两者均通过引用并入本文。前药的实例包括本文公开的化合物的药学上可接受的无毒酯。化合物的酯可以根据常规方法"March's Advanced Organic Chemistry,5th Edition".M.B.Smith&J.March,JohnWiley&Sons,2001来制备。
在一个实施方案中，对于胃肠外施用，使用毒蜥外泌肽-4类似物在无菌水性溶液中、在水性丙二醇中或在芝麻油或花生油中的溶液。在适当的情况下，水性溶液应该被适当地缓冲，并且液体稀释剂用例如足够的盐水或葡萄糖等渗。水性溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。所用的无菌水性介质均可用本领域技术人员已知的标准技术容易地获得。
合适的药物载体包括惰性固体稀释剂或填充剂、无菌水性溶液和各种有机溶剂。固体载体的实例有乳糖、石膏粉(terraalba)、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶(acacia)、硬脂酸镁、硬脂酸和纤维素的低级烷基醚。液体载体的实例有糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。此外，载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何持续释放物质，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡混合。然后，通过将本发明化合物和药学上可接受的载体组合而形成的药物组合物易于以适合于所公开的施用途径的各种剂型施用。制剂可以方便地通过药学领域已知的方法以单位剂型存在。
适于口服施用的制剂可以以分散的单位存在，例如胶囊或片剂，其各自含有预定量的活性成分，并且其可以包括合适的赋形剂。
此外，可口服的制剂可以是粉末或颗粒、在水性或非水性液体中的溶液或混悬液、或水包油或油包水液体乳剂的形式。
用于口服使用的组合物可以根据任何已知的方法制备，并且此类组合物可以含有选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的一种或多种剂，以提供药学上精细且可口的制备物。片剂可以含有活性成分与适于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物。这些赋形剂可以是，例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知技术包衣以延缓在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供较长时间的持续作用。例如，可以使用时间延迟物质如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可以通过美国专利号4,356,108、4,166,452和4,265,874(其内容通过引用并入本文)中描述的技术进行包衣，以形成用于控释的渗透性治疗片剂。
口服使用的制剂还可以以硬明胶胶囊的形式存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土(kaolin)混合，或者以软明胶胶囊的形式存在，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。水性混悬剂可以含有与适于制备水性混悬剂的赋形剂混合的本发明化合物。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶(tragacanth)和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七亚乙基氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性混悬剂还可以含有一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精(saccharin)。
油性混悬剂可以通过将活性成分混悬在植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或混悬在矿物油例如液体石蜡中来配制。油性混悬剂可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂(例如上述那些)和调味剂，以产生可口的口服制备物。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存。
适于通过添加水来制备水性混悬液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性化合物。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂的示例是上文已经提到的那些。也可存在其它赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
包含毒蜥外泌肽-4类似物的药物组合物还可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油如橄榄油或花生油，或矿物油如液体石蜡，或其混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可以用甜味剂配制，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。此类制剂还可以含有缓和剂(demulcent)、防腐剂和调味剂以及着色剂。药物组合物可以是无菌可注射水性或油性混悬液的形式。该混悬液可以根据已知方法使用上述的合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制备物也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介物和溶剂中，可以使用的有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油可方便地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用合成的甘油单酯或甘油二酯来使用任何温和的不挥发油。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
组合物也可以是栓剂的形式，用于化合物的经直肠施用。这些组合物可以通过将毒蜥外泌肽-4类似物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。此类物质包括例如可可脂和聚乙二醇。
本文公开的毒蜥外泌肽-4类似物也可以以脂质体递送系统的形式施用，例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂形成，例如但不限于胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱。
此外，本文公开的一些毒蜥外泌肽-4类似物可以与水或普通有机溶剂形成溶剂化物(solvate)。
因此，另一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含毒蜥外泌肽-4类似物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
序列的实例
Figure BDA0004173630200000401
下列BAP化的毒蜥外泌肽-4-类似物是作为具有结合至N-端、C-端和/或序列内的2-氨基酸BAP、3-氨基酸BAP或4-氨基酸BAP的肽的非限制性实例。
2-氨基酸BAP
Ac-(Ac-Lys)Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
Ac-(Ac-Lys)Lys-SEQ ID NO:2
Ac-(Ac-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
Ac-(Ac-Lys)Lys-SEQ ID NO:3
Ac-(Ac-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
C-端可以是酰胺化的(-NH2)。
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys)Lys-NH2:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys)Lys-NH2
SEQ ID NO:2-(Ac-Lys)Lys-NH2:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-(Ac-Lys)Lys-NH2
SEQ ID NO:3-(Ac-Lys)Lys-NH2:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys)Lys-NH2
N-端可以是乙酰化的(Ac)或H-。
SEQ ID NO:1-[(Ac-Lys)Lys-NH2]Lys27:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-[(Ac-Lys)Lys]Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:2-[(Ac-Lys)Lys-NH2]Lys27:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-[(Ac-Lys)Lys]Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
SEQ ID NO:3-[(Ac-Lys)Lys-NH2]Lys27:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-[(Ac-Lys)Lys]Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-[(Ac-Lys)Lys-NH2]Lys12:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-[(Ac-Lys)Lys]Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:2-[(Ac-Lys)Lys-NH2]Lys12:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-[(Ac-Lys)Lys]Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
SEQ ID NO:3-[(Ac-Lys)Lys-NH2]Lys12:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-[(Ac-Lys)Lys]Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-SerN-端可以是乙酰化的(Ac)或H-，C-端可以是酰胺化的(-NH2)。
3-氨基酸BAP
Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-SEQ ID NO:2:
Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-SEQ ID NO:3:
Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-SEQ ID NO:2:
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-SEQ ID NO:3:
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-SEQ ID NO:2:
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-SEQ ID NO:3:
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
C-端可以是酰胺化的(-NH2)。
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys)Lys
SEQ ID NO:2-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-(Ac-Lys-Lys)Lys
SEQ ID NO:3-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys)Lys
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys)Lys-Lys-:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys)Lys-Lys
SEQ ID NO:2-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-(Ac-Lys)Lys-Lys
SEQ ID NO:3-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys)Lys-Lys
SEQ ID NO:1-Lys-(Ac-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-(Ac-Lys)Lys
SEQ ID NO:2-Lys-(Ac-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-(Ac-Lys)Lys
SEQ ID NO:3-Lys-(Ac-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(Ac-Lys)LysN-端可以是乙酰化的(Ac)，C-端BAP可以是酰胺化的(-NH2)。
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys)Lys
SEQ ID NO:2-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-(Ac-Lys-Lys)Lys
SEQ ID NO:3-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys)Lys
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys)Lys-Lys-:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys)Lys-Lys
SEQ ID NO:2-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-(Ac-Lys)Lys-Lys
SEQ ID NO:3-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys)Lys-Lys
SEQ ID NO:1-Lys-(Ac-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-(Ac-Lys)Lys
SEQ ID NO:2-Lys-(Ac-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-(Ac-Lys)Lys
SEQ ID NO:3-Lys-(Ac-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-(Ac-Lys)Lys
N-端可以是乙酰化的(Ac)或H-，C-端可以是酰胺化的(-NH2)。
SEQ ID NO:1-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys12:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:2-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys12:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
SEQ ID NO:3-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys12:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys27:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:2-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys27:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro
SEQ ID NO:3-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys27:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-[Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys]Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-SerN-端可以是乙酰化的(Ac)或H-，C-端可以是酰胺化的(-NH2)。
4-氨基酸BAP
Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys
Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys-:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys
Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys-Lys)Lys-Lys-:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys)Lys-Lys
Ac-Lys-(Ac-Lys-Lys)Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-Lys-(Ac-Lys-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-Lys-(Ac-Lys-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-(Ac-Lys-Lys)Lys
Ac-(Ac-Lys)Lys-(Ac-Lys-)Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys)Lys-(Ac-Lys-)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys)Lys-(Ac-Lys-)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys)Lys-(Ac-Lys-)Lys
Ac-Lys-Lys-(Ac-Lys)Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-Lys-Lys-(Ac-Lys)Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-Lys-Lys-(Ac-Lys)Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-(Ac-Lys)Lys
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-Lys-(Ac-Lys)Lys-Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-(Ac-Lys)Lys-Lys
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys)Lys-Lys-Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys)Lys-Lys-Lys
Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys-Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys-Gly)Lys-Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Gly)Lys-Lys
Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys-Lys-SEQ ID NO:1:
Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1-(Ac-Lys-Gly)Lys-Lys:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Gly)Lys-Lys
SEQ ID NO:1–[(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys-]Lys12:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-[Ac-Lys-Lys-Lys)Lys]Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser
SEQ ID NO:1–[(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys-]Lys27:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-[Ac-Lys-Lys-Lys)Lys]-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-SerN-端可以是乙酰化的(Ac)或H-，C-端可以是酰胺化的(-NH2)。
实施例
实施例1：BAP修饰的毒蜥外泌肽-4类似物的合成
BAP修饰的肽是使用标准Fmoc化学合成的，使用1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸(HATU)或2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸(HCTU)作为偶联试剂，以及Hunig碱(N,N-二异丙基乙胺，DIPEA)。对于下文更详细描述的赖氨酸支化，使用正交保护的赖氨酸的组合，包括Fmoc-Lys(MTT)-OH、Fmoc-Lys(ivDde)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH。
肽用标准的包含三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的切割混合物进行切割，并用冰冷却的乙醚进行沉淀。所有粗肽通过反相层析在C-18功能性(C-18functionality)柱上纯化，使用梯度的乙腈、去离子水和三氟乙酸作为运行缓冲液。通过高压液相色谱和质谱(MS)测定纯度，并使用nanospray质谱仪获得序列(串联MS)信息。
BAP结合在序列的C-端
C-端赖氨酸的支化(方法1)：哌啶脱保护后，将N-α-Fmoc-N-ε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸或N-α-Fmoc-N-ε-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基-丁基-L-赖氨酸添加到Rink酰胺树脂中。添加靶肽的剩余序列，用乙酸酐将全长序列乙酰化。然后用含1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液(Mtt)或含盐酸羟胺/咪唑的NMP(ivDde)去除赖氨酸侧链保护。然后将另外的Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-赖氨酸添加至侧链，并在需要时乙酰化。
除C-端赖氨酸以外的支化：类似于将BAP结合至序列中N-端和C-端之间的的烷基胺(方法2)。
BAP共价连接至序列中N-端和C-端之间的赖氨酸
方法2：将N-α-Fmoc-N-ε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸或N-α-Fmoc-N-ε-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基-L-赖氨酸添加至肽序列，在完成序列和任选的N-端乙酰化后去除赖氨酸侧链保护基团。依次添加合适的赖氨酸类似物如Fmoc-Lys(MTT)-OH、Fmoc-Lys(ivDde)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH，并选择性地脱保护，然后乙酰化以确保合适的侧链和乙酰基添加。
通过类似地使用Fmoc/4-甲基三苯甲基保护的氨基烷基氨基酸，将BAP添加至除赖氨酸以外的其它氨基烷基残基上。
BAP结合在序列的N-端
N-端赖氨酸的支化(方法3)：将N-α-Fmoc-N-ε-4-甲基三苯甲基-L-赖氨酸添加至序列的N端，去除Fmoc，将序列在N-端乙酰化，并去除三甲苯基。然后将另外的Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-赖氨酸添加至侧链，并在需要时乙酰化。
除N-端赖氨酸以外的支化：类似于将BAP结合至序列中N-端和C-端之间的赖氨酸(方法2)。
实施例2：BAP修饰的毒蜥外泌肽-4类似物的药理学表征
毒蜥外泌肽-4类似物的效力和功效可以使用不同的药理学方法来测定。参考以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不旨在以任何方式限制本发明所要求保护的范围。
在无抗生素的培养基中生长的表达人GLP-1受体的CHO-K1细胞通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)轻柔冲洗而分离，通过离心回收，并重悬于测定缓冲液(KRH：5mM KCl，1.25mMMgSO4，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mM KH2PO4，1.45mM CaCl2，0.5g/lBSA)中。
将12μl细胞与12μl浓度渐增的测试化合物(溶解于PBS/0.5％ BSA中，最后由1mM的储备溶液稀释)在96孔板中混合，然后在室温下温育30分钟。添加裂解缓冲液并温育1小时后，通过使用穴状化合物(cryptate)标记的抗cAMP和d2标记的cAMP的竞争性免疫测定(来自CisBio的HTRF试剂盒)来测定cAMP产生，ΔF百分比值根据生产商说明书计算。剂量响应曲线与测试化合物和参考化合物平行进行。
HTRF技术是一种滴定测定，其基于标记的cAMP(外源性)和受体活化后由细胞产生的cAMP之间的竞争。该测定的动态范围是3-4倍，这意味着线性范围(其能够使原始数据转化为cAMP的nM)在该范围内。曲线顶部和底部之间的窗口较高(约100)，这意味着转化为cAMP的nM，cAMP的测定窗口从1nM(基础)至约30nM(Emax)。所有实验都在非选择性磷酸二酯酶抑制剂IBMX(终浓度为1mM)的存在下进行。
在10-14至10-7M的浓度范围内检测测试化合物
数据表示为平均值。EC50(即诱导最大反应的50％的浓度)通过使用Graph pad软件(版本6.0)进行对数转换后的最佳拟合分析来确定。
参考化合物/对照肽1：GLP-1(7-36)：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ ID NO：6)
参考化合物/对照肽2：
SEQ ID NO：1-(Lys)6-NH2；或
具有序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2(SEQ ID NO：5)的des-Pro38-毒蜥外泌肽-4-SIP
测试化合物-类似物1：
SEQ ID NO：1-(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2；或
具有序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2(SEQ ID NO:1-(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2)的des-Pro38-毒蜥外泌肽-4-BAP
结果(也参见图2)：
对照肽1: 对照肽2: 类似物1:
EC50(nM) 0.011 0.011 0.003
令人惊讶地，当与对照肽1和2两者相比时，毒蜥外泌肽-4(类似物1)除了显示出完全激动剂活性外，还被证明是GLP-1受体的非常有效的激动剂，其EC50比两种对照肽的EC50低几乎十倍。尤其令人惊讶的是，当与用(Lys)6-NH2修饰SEQ ID NO：1的C-端相比时，用C-端-(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2对SEQ ID NO：1进行BAP修饰与增加的效力有关。
实施例3
PCT/IB2015/000553(WO/2015/162485)中包括并详述了图3中所示的数据；
对照肽1: 类似物2: 类似物3:
EC50(nM) 0.02 0.02 0.04
对照肽1：GLP-1(7-36)，具有序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(SEQ ID NO:6)；
类似物2：具有序列Ac-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2；以及
类似物3：具有序列Ac-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-(Lys-Lys-Ac)Lys-NH2。
这些结果证明，不是所有的肽通过C端BAP的存在都能够具有更强的效力或者甚至是保留它们的效力。
序列表
<110> TXP制药股份有限公司（TXP PHARMA AG）
<120> 毒蜥外泌肽-4类似物
<130> P4117PC00
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽（Synthetic peptide）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(38)
<223> des-Pro38-毒蜥外泌肽-4(1-39)
<400> 1
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser
35
<210> 2
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽（Synthetic peptide）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(38)
<223> des-Ser39-毒蜥外泌肽-4
<400> 2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro
35
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 希拉巨蜥（Heloderma suspectum）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(39)
<223> 毒蜥外泌肽-4 (1-39)
<400> 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 4
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽（Synthetic peptide）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<223> des-Pro38 / des-Ser39
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> Xaa = Ser 或 Pro
<400> 4
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Xaa
35
<210> 5
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽（Synthetic peptide）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(44)
<223> 利司那肽 (Lyxumia): des-Pro38-毒蜥外泌肽-4-SIP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> C-端酰胺化的 (-NH2)
<400> 5
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
35 40
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> GLP-1 (7-36)
<400> 6
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30

Claims (67)

1.一种毒蜥外泌肽-4类似物，其包含毒蜥外泌肽-4和一个或多个支链氨基酸探针，
其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基烷基氨基酸残基，
所述第一氨基烷基氨基酸残基任选地与第二氨基烷基氨基酸残基或与第二和第三氨基烷基氨基酸残基共价连接，以形成2或3个氨基烷基氨基酸残基的直链，
其中所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链各自通过使侧链氨基结合独立地选自以下的分子而被修饰：AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；
其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，AAA为氨基烷基氨基酸残基，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，
其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物的N-端，共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物的C-端，和/或共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基，
条件是所述支链氨基酸探针由2至9个氨基酸残基组成，和
其中所述毒蜥外泌肽-4选自：des-Pro38-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO:1)、des-Ser39-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO:2)和毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO:3)，或其功能变体。
2.根据权利要求1所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述氨基烷基氨基酸残基是具有包含氨基烷基(-CnH2nNH2)的侧链的氨基酸，例如选自甲胺(-CH2NH2)、乙胺(-C2H4NH2)、丙胺(-C3H6NH2)、正丁胺(-C4H8NH2)、戊胺(-C5H10NH2)、正己胺(-C6H12NH2)、庚胺(-C7H14NH2)、辛胺(-C8H16NH2)、壬胺(-C9H18NH2)、癸胺(-C10H20NH2)、十一胺(-C11H22NH2)和十二胺(-C12H24NH2)的侧链氨基烷基。
3.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基选自β-氨基(甲胺)、γ-氨基(乙胺)、δ-氨基(丙胺)，ε-氨基(正丁胺)、ζ-氨基(戊胺)、η-氨基(正己胺)、θ-氨基(庚胺)、ι-氨基(辛胺)、κ-氨基(壬胺)、λ-氨基(癸胺)、μ-氨基(十一胺)和v-氨基(十二胺)。
4.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含：
a.第一氨基烷基氨基酸残基，
b.第一和第二氨基烷基氨基酸残基，或
c.第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基。
5.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含：
a.第一氨基烷基氨基酸残基，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基的N-端是乙酰化的，
b.第一和第二氨基烷基氨基酸残基，其中所述第二氨基烷基氨基酸残基的N-端是乙酰化的，或
c.第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基，其中所述第三氨基烷基氨基酸残基的N-端是乙酰化的。
6.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含：
a.第一氨基烷基氨基酸残基，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基的C-端是羧酸、醛、酯或酰胺，例如伯酰胺(CONH2)，
b.第一和第二氨基烷基氨基酸残基，其中所述第二氨基烷基氨基酸残基的C-端是羧酸、醛、酯或酰胺，例如伯酰胺(CONH2)，或
c.第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基，其中所述第三氨基烷基氨基酸残基的C-端是羧酸、醛、酯或酰胺，例如伯酰胺(CONH2)。
7.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述分子的N-端氨基酸残基在α氨基处乙酰化。
8.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含第一氨基烷基氨基酸残基，所述第一氨基烷基氨基酸残基任选地是N-端乙酰化或C-端酰胺化的，
其中所述第一氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基通过结合独立地选自以下的分子而被修饰：AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，AAA为氨基烷基氨基酸残基，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，并且所述分子的N-端AAA或(aa)3任选地是乙酰化的。
9.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含与第二氨基烷基氨基酸残基共价连接的第一氨基烷基氨基酸残基，以形成2个氨基烷基氨基酸残基的直链，
所述第二氨基烷基氨基酸残基任选地是N-端乙酰化或C-端酰胺化的，
其中所述第一和/或所述第二氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基通过结合独立地选自以下的分子而被修饰：AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，AAA为氨基烷基氨基酸残基，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，并且所述分子的N-端AAA或(aa)3任选地是乙酰化的。
10.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含第一和第二氨基烷基氨基酸残基，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至所述侧链氨基而被修饰。
11.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含第一和第二氨基烷基氨基酸残基，其中所述第二氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至侧链氨基而被修饰。
12.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含与第二和第三氨基烷基氨基酸残基共价连接的第一氨基烷基氨基酸残基，以形成3个氨基烷基氨基酸残基的直链，
所述第三氨基烷基氨基酸残基任选地是N-端乙酰化的或C-端酰胺化的，
其中所述第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基通过结合独立地选自以下的分子而被修饰：AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p；其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，AAA为氨基烷基氨基酸残基，(aa3)为独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，并且所述分子的N-端AAA或(aa)3任选地是乙酰化的。
13.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针包含第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基，其中
a.所述第一氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至侧链氨基而被修饰，
b.所述第二氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至侧链氨基而被修饰，
c.所述第三氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至侧链氨基而被修饰，
d.所述第一和第二氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至侧链氨基而被修饰，
e.所述第一和第三氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至侧链氨基而被修饰，
f.所述第二和第三氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至侧链氨基而被修饰，或
g.所述第一、第二和第三氨基烷基氨基酸残基的侧链通过使分子结合至侧链氨基而被修饰。
14.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针的氨基烷基氨基酸残基独立地选自赖氨酸和鸟氨酸。
15.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针的第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸中的每一个均独立地选自赖氨酸和鸟氨酸。
16.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中分子AAAq-AAA、(aa3)p-AAAq、AAAq-(aa3)p、[(aa3)-AAA]p和[AAA-(aa3)]p的每个AAA均独立地选自赖氨酸和鸟氨酸。
17.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针的所述氨基酸残基各自相同或不同。
18.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述侧链氨基独立地选自δ-氨基(鸟氨酸)和ε-氨基(赖氨酸)。
19.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中与所述侧链氨基共价连接的分子独立地选自Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p、[Lys-(aa3)]p、Ornq-Orn、(aa3)p-Ornq、Ornq-(aa3)p、[(aa3)-Orn]p和[Orn-(aa3)]p、Ornp-Lysp、Lysp-Ornp、[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p，其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基，并且N-端Lys、Orn或(aa)3氨基酸残基任选地在α氨基处乙酰化。
20.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中与所述侧链氨基共价连接的分子独立地选自Lysq-Lys、Ornq-Orn、Ornp-Lysp、Lysp-Ornp、[Orn-Lys]p和[Lys-Orn]p，其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，并且N-端Lys或Orn氨基酸残基任选地在α氨基处乙酰化。
21.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中与所述侧链氨基共价连接的分子独立地选自Lysq-Lys、(aa3)p-Lysq、Lysq-(aa3)p、[(aa3)-Lys]p和[Lys-(aa3)]p，并且N-端Lys或(aa3)残基任选地在α氨基处乙酰化。
22.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针的氨基烷基氨基酸残基是赖氨酸残基。
23.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中与所述侧链氨基共价连接的分子是Lysq-Lys，其中q是选自0、1、2和3的数字，并且所述N-端Lys残基任选地在α氨基处乙酰化。
24.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中与所述侧链氨基共价连接的分子独立地选自以下：
Ac-AAAq-AAA、Ac-(aa3)p-AAAq、Ac-AAAq-(aa3)p、Ac-[(aa3)-AAA]p、Ac-[AAA-(aa3)]p、Ac-Lysq-Lys、Ac-(aa3)p-Lysq、Ac-Lysq-(aa3)p、Ac-[(aa3)-Lys]p、Ac-[Lys-(aa3)]p、Ac-Ornq-Orn、Ac-(aa3)p-Ornq、Ac-Ornq-(aa3)p、Ac-[(aa3)-Orn]p、Ac-[Orn-(aa3)]p、Ac-Ornp-Lysp、Ac-Lysp-Ornp、Ac-[Orn-Lys]p和Ac-[Lys-Orn]p，
其中q是选自0、1、2和3的数字，p是选自1、2和3的数字，(aa3)是独立地选自Arg、His、Gly和Ala的氨基酸残基。
25.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针由2至3个氨基酸残基，例如3至4个氨基酸残基，例如4至5个氨基酸残基，例如5至6个氨基酸残基，例如6至7个氨基酸残基，例如7至8个氨基酸残基，例如8至9个氨基酸残基组成。
26.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针由2个氨基酸残基，例如3个氨基酸残基，例如4个氨基酸残基，例如5个氨基酸残基，例如6个氨基酸残基，例如7个氨基酸残基，例如8个氨基酸残基，例如9个氨基酸残基组成。
27.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中与第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链氨基共价连接的分子选自AAA、Ac-AAA、AAA-AAA、Ac-AAA-AAA、AAA-AAA-AAA、Ac-AAA-AAA-AAA、AAA-AAA-AAA-AAA、Ac-AAA-AAA-AAA-AAA、AAA-Gly-AAA、Ac-AAA-Gly-AAA、AAA-AAA-Gly、Ac-AAA-AAA-Gly、AAA-Gly、Ac-AAA-Gly、AAA-Ala-AAA、Ac-AAA-Ala-AAA、AAA-AAA-Ala、Ac-AAA-AAA-Ala、AAA-Ala、Ac-AAA-Ala、AAA-His-AAA、Ac-AAA-His-AAA、AAA-AAA-His、Ac-AAA-AAA-His、AAA-His、Ac-AAA-His、AAA-Arg-AAA、Ac-AAA-Arg-AAA、AAA-AAA-Arg、Ac-AAA-AAA-Arg、AAA-Arg和Ac-AAA-Arg，其中AAA为氨基烷基氨基酸残基。
28.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中与第一、第二和/或第三氨基烷基氨基酸残基中的一个或多个的侧链氨基共价连接的分子选自Lys、Ac-Lys、Lys-Lys、Ac-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys、Lys-Lys-Lys-Lys、Ac-Lys-Lys-Lys-Lys、Lys-Gly-Lys、Ac-Lys-Gly-Lys、Lys-Lys-Gly、Ac-Lys-Lys-Gly、Lys-Gly、Ac-Lys-Gly、Lys-Ala-Lys、Ac-Lys-Ala-Lys、Lys-Lys-Ala、Ac-Lys-Lys-Ala、Lys-Ala、Ac-Lys-Ala、Lys-His-Lys、Ac-Lys-His-Lys、Lys-Lys-His、Ac-Lys-Lys-His、Lys-His、Ac-Lys-His、Lys-Arg-Lys、Ac-Lys-Arg-Lys、Lys-Lys-Arg、Ac-Lys-Lys-Arg、Lys-Arg和Ac-Lys-Arg。
29.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针选自以下：
a.(AAA)AAA1-、(AAA-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-AAA-AAA)AAA1、(AAA-Gly-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-Gly)AAA1-、(AAA-Gly)AAA1-、(AAA-Ala-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-Ala)AAA1-、(AAA-Ala)AAA1-、(AAA-His-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-His)AAA1-、(AAA-His)AAA1-、(AAA-Arg-AAA)AAA1-、(AAA-AAA-Arg)AAA1-和(AAA-Arg)AAA1-，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基(AAA1-)任选地是N端-乙酰化的或C-端酰胺化的；
b.(Lys)Lys1-、(Lys-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、(Lys-Gly-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Gly)Lys1-、(Lys-Gly)Lys1-、(Lys-Ala-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Ala)Lys1-、(Lys-Ala)Lys1-、(Lys-His-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-His)Lys1-、(Lys-His)Lys1-、(Lys-Arg-Lys)Lys1-、(Lys-Lys-Arg)Lys1-和(Lys-Arg)Lys1-，其中所述第一赖氨酸残基(Lys1-)任选地是N端-乙酰化的或C-端酰胺化的；
c.Ac-(Ac-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Gly)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Ala-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Ala)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Ala)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-His-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-His)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-His)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Arg-Lys)Lys1-、Ac-(Ac-Lys-Lys-Arg)Lys1-和Ac-(Ac-Lys-Arg)Lys1-；或
d.(Ac-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Lys-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Gly-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Gly)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Gly)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Ala-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Ala)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Ala)Lys1-NH2、(Ac-Lys-His-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-His)Lys1-NH2、(Ac-Lys-His)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Arg-Lys)Lys1-NH2、(Ac-Lys-Lys-Arg)Lys1-NH2和(Ac-Lys-Arg)Lys1-NH2。
30.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针选自以下：
Ac-(Ac-Lys)Lys-Lys-、(Ac-Lys)Lys-Lys-、Ac-(Lys)Lys-Lys-、(Lys)Lys-Lys-、(Ac-Lys)Lys-Lys-NH2、(Lys)Lys-Lys-NH2；
Ac-Lys-(Ac-Lys)Lys-、Lys-(Ac-Lys)Lys-、Ac-Lys-(Lys)Lys-、Lys-(Lys)Lys-Lys-(Ac-Lys)Lys-NH2、Lys-(Lys)Lys-NH2；
Ac-(Ac-Lys-Lys)-Lys-、(Ac-Lys-Lys)-Lys-、Ac-(Lys-Lys)-Lys-和(Lys-Lys)-Lys-(Ac-Lys-Lys)-Lys-NH2和(Lys-Lys)-Lys-NH2。
31.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述支链氨基酸探针选自Ac-(Ac-Lys)Lys-、Ac-(Lys)Lys-、(Ac-Lys)Lys-NH2、(Lys)Lys-NH2和(Lys)Lys-。
32.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中(aa3)是选自Gly和Ala的氨基酸残基。
33.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物的N-端。
34.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的赖氨酸或鸟氨酸残基的侧链氨基。
35.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的赖氨酸残基的ε-氨基。
36.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物第27位的赖氨酸(Lys27)的侧链氨基。
37.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物第12位处的赖氨酸(Lys12)的侧链氨基。
38.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述第一氨基烷基氨基酸残基共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物的C-端。
39.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其包含1个支链氨基酸探针。
40.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其包含共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物N-端的1个支链氨基酸探针。
41.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其包含共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物C-端的1个支链氨基酸探针。
42.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其包含共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基，例如共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的鸟氨酸残基的δ-氨基或所述毒蜥外泌肽-4类似物内的赖氨酸残基的ε-氨基的1个支链氨基酸探针。
43.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其包含2个支链氨基酸探针。
44.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其包含2个支链氨基酸探针，其中
i)一个支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4的N-端，另一个支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4的C-端；或
ii)一个支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4的N-端，另一个支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基；或
iii)一个支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4的C-端，另一个支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基；或
iv)两个支链氨基酸探针中的每一个共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的不同的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
45.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其包含3个支链氨基酸探针。
46.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其包含3个支链氨基酸探针，其中：
i)所述第一支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4的N-端，所述第二支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4的C-端，所述第三支链氨基酸探针共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基；或
ii)所述第一支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4的N-端，所述第二和第三支链氨基酸探针各自共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的不同氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基；或
iii)所述第一支链氨基酸探针共价结合至所述毒蜥外泌肽-4的C-端，所述第二和第三支链氨基酸探针各自共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的不同氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基；或
iv)所述第一、第二和第三支链氨基酸探针中的每一个共价连接至所述毒蜥外泌肽-4类似物内的不同氨基烷基氨基酸残基的侧链氨基。
47.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4为His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-X1(SEQ IDNO:4)或其功能变体，其中X1选自Ser和Pro。
48.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4是des-Pro38-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：1)或其功能变体。
49.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4是des-Ser39-毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：2)或其功能变体。
50.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4是毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：3)或其功能变体。
51.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4是具有一个或多个氨基酸取代，例如一个或多个保守氨基酸取代的功能变体。
52.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4是C-端酰胺化的(-NH2)。
53.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4的C-端是未修饰的C-端羧基。
54.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4是N-端乙酰化的(COCH3或Ac-)。
55.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4的N-端His是游离氨基部分(H-His)。
56.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4或其功能变体：
i)至少在一定程度上保留了非变体或原始序列的功能，
ii)结合并活化GLP-1R，
iii)是GLP-1R的激动剂，
iv)对GLP-1R具有结合亲和力和/或受体效力，
v)刺激胰腺β-细胞的葡萄糖依赖性胰岛素分泌，
vi)降低哺乳动物的血糖，和/或
vii)减慢胃排空。
57.根据前述权利要求所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4类似物是SEQ ID NO：1-(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2
(His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Ac-Lys-Lys)Lys-NH2)。
58.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物。
59.前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物，用作药物。
60.前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物，用于治疗2型糖尿病。
61.前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物，用于治疗肥胖症。
62.前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物，用于增强饱腹感和/或降低食欲。
63.前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物，用于以下一种或多种方法中：
a.血糖控制，
b.降低血糖，
c.刺激胰腺β-细胞的葡萄糖依赖性胰岛素分泌，
d.增加响应进食的胰岛素分泌，和/或
e.抑制响应进食的胰高血糖素的释放。
64.前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物，用于治疗局部缺血病、炎性病、感染和/或代谢病。
65.根据前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4类似物与一种或多种另外的活性成分同时、依次或分别地组合施用。
66.根据前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物，其中所述毒蜥外泌肽-4类似物与一种或多种选自口服降葡萄糖化合物和胰岛素的另外的活性成分同时、依次或分别地组合施用。
67.一种用于治疗2型糖尿病、肥胖症和/或增强饱腹感的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用前述权利要求中任一项所述的毒蜥外泌肽-4类似物。
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