PT87528B - Processo de preparacao de antagonistas de vasopressina - Google Patents

Description

MEMCRIA descritiva

Campo da invenção presente invento refere-se ao processo de preparaçSo de compostos peptldicos cíclicos que exibem actividade antagonista da vasopressina, e que sSo substancial mente desprovidos de acti. uidade agonista da vasopressina. 0 presente invento refere-se também ao processo de preparaçSo de composições farmacêuticas e a métodos para produçSo de actividade antagonista da vasopressi. na, sem actividade agonista substancial, em pacientes que o necessitem.

Antecedentes da invenção

Os compostos do presente inventa exibem actividade antagonista e/ou V₂ da vasopressina sem actividade agonista subs tancial. E conhecido que a vasopressina contribui para o mecanismo de acções antidiuréticas no rim. A acção destes compostos antagoniza a da hormona antidiurética natural (ADH) provocando a excreção de água pelo organismo.

Manning et al., Nature 308, 652 (1984) descreveram o seguin te composto

CH₂C0-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH₂

CH -CH_?

CH₂-CH como tendo uma actividade,potente,antagonista da vasopressina. Tem também sido referido que este composto é desprovido de acti vidade agonista da vasopressina, detectável em ratazanas, in vivo. No homem porém, demonstrou-se que este composto possui ap_e nas actividade agonista (Dubb et al,, Kidney Int. 31, 267 Danei ro 1987). Um novo teste em cães demonstra agora que este composto produz de facto actividade agonista.

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Os compostos do presente invento possuem estruturas que se distinguem das da técnica anterior pelo facto de possuirem um substituinte 4'-metilo ligado ao grupo ácido ciclopentametilenopropiónico e estes compostos, tendo actividade antagonista da vasopressina, são substancialmente desprovidos de actividade agonista tal como se mostra pelos testes efectuados em cães.

Oá anteriormente se descreveu o efeito da remoção ou da substituição de grupos aminoácido na cauda do peptídeo. Manning et al., Nature 308 652 (1984) e a Patente dos E.ll.A. n9.

469 679 descrevem que a unidade terminal glicina na posição 9 de certos compostos l-(ácido -mercapto- β, /3-ciclopentametile nopropiónico)vasopressina, pode ser removida ou substituída por L ou D-Ala, Ser ou Arg sem afectar necessariamente a ligação aos receptores da vasopressina.

As Patentes dos E.U.A. n2. 4 481 194 e 4 481 193 descrevem que a remoção da prolina na posição 7, ou a remoção da prolina e da glicina nas posiçães 7 e 9 das estruturas de compostos antagonistas da vasopressina, produzirá compostos os quais retém uma actividade antagonista substancial, embora algo reduzida.

Descrição da Invenção

Os compostos da invenção são compostos com a seguinte fórmula estrutural:

CH₂C0-A-B-C-Asn-D-(W)_m-(X)_p-(Y)_c)-Z

CH

Fórmula I

A é o isómero D ou L da Phe, Phe(4'-Alq), Ile, Cha, Tyr ou Tyr(O-Alq);

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B	é Phe, Phe(	4’-Al	q),	Tyr(O-Alq),	Ile ou Tyr;
C	é Vai, Ile,	Abu,	Ch	ig, Gin,	Lys,	Cha, Nle, Leu,	Ala	ou
	Gly;
D	é o isómero	D ou	L	da Cys;
m,	p e q são	cada	um	0 ou 1;
W	é o isómero	D ou	L	da Pro,	Arg>	HArg, N-MeArg,	Lys	ou
	Orn;
X	é o isómero	D ou	L	da Arg,	Lys,	Orn ou Gin, ou	quando
	m é 1, X	pode	ser	Gly;
Y	é o isómero	D ou	L	da Arg,	Lys,	Orn, Ser, Gin,	T yr	ou

Ala, ou quando pelo menos um de m ou p é 1, Y pode ser Gly;

Z é NH-(CH₂) -NHR, ou um isómero D ou L da Arg-NH₂, Lys-NH₂ ou 0rn-NH₂, ou quando pelo menos um de m, p e q é 1, Z pode ser NHR,ou OH;

R ó H ou C(=NH)-NH₂;

R' é H ou Alq; n é 2-6 ; e

Alq é um alquilo com 1-4 átomos de carbono;

ou um seu sal de adição de ácido ou um seu éster de alquilo de cadeia curta ou de benzilo, farmaceuticamente aceitáveis.

Na preparação dos compostos do presente invento, tal como aqui depois se descreve , forma-se um isómero principal do intermediário do ácido 4•-metilciclopentametilenopropiónico, com um rendimento de cerca de 80-90/. Usa-se este isómero para preparar o isómero correspondente dos compostos com a fórmula I que têm uma potente actividade antagonista da vasopressina e que são substancialmente desprovidos de actividade agonista. 0 isómero que se forma em menor quantidade tem mais actividade agonista. Crê-se que o isómero principal seja o isómero cis; cis é definido como sendo o composto onde o 4'-metilo e o átomo de enxofre estão no mesmo lado da anel de ciclo-hexano.

Particularmente, o presente invento refere-se ao processo

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-6de preparação dos isómeros cis dos compostos com a fórmula I.

Um grupo subgenêrico dos compostos do presente invento é constituído pelos compostos com a fórmula I onde:

A é D-Tyr ou D-Tyr(Et);

B é Phe;

C é Vai;

m, p e q são cada um 0 ou 15

W é um isómero D ou L da Pro, Arg ou N-HeArg;

X é um isómero D ou L da Arg ou da Gly;

Y é Gly; e

Z é NHR ou um isómero 0 ou L da Arg-NH^.

Caudas (w) -(X) -(y) -Z particulares são por exemplo Pro-Arg-NH₂, Arg-Gly-NH₂, Pro-Arg-Gly-NH₂, Arg-D-Arg-NH₂, D-Arg -D-Arg-NH₂, Pro-NH(CH₂)HC(= NH)-NH₂, N-MeArg-Arg-NH₂, Pro-Arg-NH(CH₂)₂NH₂, Arg-NH₂, e Arg-Gly-Arg-NH,,.

Compostos particulares do presente invento são por exemplo a zT. cis-1-(ãcido 4 '-metil-y2 -mercapto-y3 , ys -ciclopentametilenopro piónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-8-arginina-9-desglicina_7vasopressina, /~cis-l-(ácido 4 '-metil-yj -mercapto-/3 , y3 -ciclopentametilenopro. piónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-8-arginina_7vasopressina, /~*cis-1-(ácido 4 '-metil-yJ -mercapto-y3 ,yi-ciclopentametilenopro piónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-arginina-8-D-arginina -9-desglicina_7vasopressina.

No presente invento incluem-se tambám sais de adição, complexos ou prodrogas, tais como ésteres dos compostos da invenção quando Z ê OH, e especialmente sais de adição de ácido, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis. Os sais de adição de ácido são preparados de um modo convencional num solvente adequado, a partir do composto original e de um excesso de um

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-7ácido, tal como o ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, maleico, succínico, etanodissulfónico ou metanossulfónico. Os derivados éster da forma ácida dos produtos finais, tais como os ésteres de metilo, de etilo ou de benzilo, são preparados como é conhecido na arte.

Na presente descrição e nas reivindicações usa-se a nomenclatura comum na arte dos peptídeos e na química da vasopres, sina. Quando não se indicar a configuração a unidade aminoácido está na forma natural L. Em certas fórmulas estruturais, tais como a Cys, indicam-se os membros tio com o propósito de as tornar mais claras.

As designações da arte dos peptídeos aqui utilizadas incluem as seguintes: Pmp, ácido (3> -mercapto- /3, ^i-ciclopentametilenopropiónico; Abu, ácido cZ-amino-n-butírico; Chg, cicl.0 -hexilglicina; Cha, ciclo-hexilalanina; Gin, amida do ácido glutâmico ou glutamina; Gly, glicina; Tyr, tirosinaj Phe, Fe nilalaninaj Uai, valina; Ile, isoleucina; Nle, norleucina; Leu, leucina; Ala, alanina; Lys, lisina; Arg, arginina;

HArg, homoarginina; Orn, ornitina; Ser, serina; USP, vasopressina; Tos, tosilato; Bzl, benzilo; MBzl, p-metoxibenzilo; Boc, t-butoxicarbonilo; C1Z, cloreto de 2-benziloxicarbonilo; DMAP/DCC, dimetilaminopiridina/diciclo-hexilcarbodiimida.

termo Alq representa um alquilo com 1 a 4 átomos de carbono. Estes substituintes alquilo incluem o metilo, etilo, n-propilo, isopropilo ou butilo. 0 substituinte alquilo preferido é o etilo.

Os compostos com a fórmula I são preparados por ciclização de um pêptídeo linear utilizando os dois grupos mercapto, na unidade cisteína na posição 6 e no ácido 4'-metil-^-mercapto-/3,/3-ciclopentametilenopropiónico (4'-MePmp) na posição 1. A reacção de ciclização ocorre na presença de um agente oxidante moderado, capaz de oxidar um mercaptano a dissulfureto. Assim, oxidam-se peptídeos lineares com a fórmula seguinte:

4'-MePmp-A-B-C-Asn-D-(w) -(χ)-(γ) -Z ^r ' m ' p ' q

Fórmula II ei 70ΐ

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-8onde A, B, C, D, W, X, Y, Z, m, p e q são definidos como na fór. mula I, sendo os grupos mercapto membros das unidades 4*-KePmp e D.

A oxidação realiza-se usando, por exemplo, um excesso de ferricianeto de um metal alcalino, tal como ferricianeto de potássio ou de sódio. Usa-se um solvente não reactivo adequado, preferivelmente um solvente aquoso, a pH neutro, cerca de 7-7,5. A reacção realiza-se à temperatura ambiente ou a uma temperatura inferior, até a reacção estar substancialmente completa. Usam-se preferivelmente pequenas concentrações de peptideo linear di. mercaptano e de agente oxidante, tais como uma concentração de agente oxidante de cerca de 0,01 a 0,1 molar, em vários litros de solução aquosa, para ciclizar cerca de 1-5 gramas de dimercaptano.

Para a reacção de fecho do anel podem também usar-se outros agentes de oxidação moderados com um potencial de oxidação aproximadamente equivalente ao potencial de oxidação do ferricia. neto, por exemplo fazendo passar oxigénio através da mistura reaccional durante vários dias. Adicionalmente pode usar-se io do em metanol no peptideo não protegido ou no derivado protegido no enxofre com acetamidometilo. A ciolização ocorre também quando se elimina intramolecularmente um grupo tiol-protector eliminável tal como um grupo protector no grupo mercaptano da unidade 4'-MePmp.

Claro que um perito na arte reconhecerá que quando um centro reaccional interferente está presente na estrutura do ma terial de partida com a fórmula Π, o mercaptano linear de parti, da pode ter grupos protectores comuns temporariamente presentes nas várias unidades aminoácido.

0s compostos com a fórmula I nos quais Z é NH-ÍCf^) -NHR são convenientemente preparadas de acordo con o procedimento se guinte:

4'-MePmp-A-B-C-Asn-D-(W) -(X) -(Y) (0H) + NH_o-(ChL) -NHR l ι ' ' m ^v ' p ^v q^v * 2 ' 2 n

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-9tal como ê descrito por Callahan et al., Patente dos E.U.A, nS. 4 543 349 e nos exemplos que aqui depois se descrevem.

Os peptídeos com a fórmula I são convenientemente isolados acidificando a mistura de oxidação aquosa, usando por exemplo ácido acético glacial e fazendo passar a mistura reaccional numa coluna de cromatografia de permuta iónica, por exemplo numa coluna de resina acrílica ligeiramente ácida, por eiuição com uma solução alcalina tamponada, ou por filtração em gel através de um gel constituído por partículas preparado por liga, ção cruzada de dextranc com epicloro-hidrina.

Os intermediários com a fórmula II, na sua forma livre ou protegida, são convenientemente preparados por métodos de fa se sólida de síntese de peptídeos, tal como se descreve em Manning et al., 3. Med. Chem. 25., 46 (1982). Usa-se uma resina de benzidrilamina comercial (BHA) como suporte para preparar os produtos finais amida com a fórmula I, e uma resina de clorometilo (CMR) como suporte para preparar os compostos ácidos com a fórmula I, i.e., onde Z é OH. Podem também usar-se métodos siri téticos em solução ou enzimáticos.

A cadeia peptídica dos peptídeos lineares é usualmente construída por passos a partir da última unidade (nas posiçães 7, 8, 9 ou 10) e trabalhando na direcção da unidade 4’-MePmp. Cada unidade é adequadamente protegida como ê conhecido na arte dos peptídeos e como a seguir se descreve. A sequência dos pas. sos reaccionais é convenientemente realizada num sintetizador de peptídeos Beckman 990B ou num seu equivalente sem isolamento de cada peptídeo intermediário. Os detalhes do procedimento eri contram-se nos exemplos que aqui depois se apresentam.

Os vários aminoácidos, que se adicionam consecutivamente à cadeia suportada na resina, são protegidos como é conhecido na arte. Pode usar-se, por exemplo, o grupo protector t-butoxi. carbonilo para um grupo amino, especialmente na posição oC; um benzilo facultativamente substituído ou acetamidometilo para os grupos mercapto nas unidades 4'-MePmp ou Cys; tosilo para as unidades Arg, HArg ou N-MeArg; e um benziloxicarbonilo facultai

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-10tivamente substituído para as unidades Tyr ou Lys. Como grupos protectores usam-se muito convenientemente aqueles que neto são facilmente removidos usando um tratamento com um ácido moderado. E preferível usar grupos protectores que se possam remover usari do sódio-amónia líquida, ou para os grupos benzilo ou benziloxi. carbonilo, por hidrogenação catalítica. Conhecem-se na arte ou. tros grupos protectores tais como os que se descrevem em Protective Groups in Organic Chemistry por J.F.W. McOmie (Plenum 1973).

Separa-se o intermediário peptídeo linear protegido, da matriz de resina transportadora, por exemplo, usando amónia num solvente miscível com água, e depois trata-se para remover os grupos protectores, por exemplo, usando sódio-amónia líquida. Obtém-se por este processo o derivado amida do peptideo linear intermediário.

Mais convenientemente combinam-se os dois passos por tratamento do peptídeo suportado na resina com ácido fluorídrico anidro, usando um extractor de carboiães adequado, tal como anisolo, obtendo-se um peptídeo linear intermediário com a fórmula II.

Prepara-se o intermediário de 4*-MePmp, protegido com benzilo no grupo mercapto, fazendo reagir 4’-metilciclo-hexilidenoacetato de etilo com benzilmercaptano de acordo com o proce. dimento descrito por Yim e Huffman, Int. 0. Peptide Protein Res. 21, 568 (1983) para a preparação do composto desmetilado, o áçi do /2>-(S-benzilmercapto)-/J ,/í-ciclopentametilenopropiónico. Pu. rifica-se o isómero principal obtido nesta preparação, por recristalização a partir de um solvente adequado tal como o hexano.

Os compostos com a fórmula I têm actividade antagonista e/ou da vasopressina. Sabe-se que a vasopressina contribui para o mecanismo da acção antidiurêtica no rim. Quando a ac. ção destes compostos antagoniza a da hormona antidiurêtica natu ral (ADH), o organismo excreta água devido a uma permeabilidade incrementada das partes terminais do túbulo renal. 0 mecanismo de acção situa-se nos receptores da vasopressina (receptores V₂)

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-11localizados na membrana plasmática de certas células dc epitélio renal. 0 efeito farmacodinâmico mais notável dos antagonistas da ADH do presente invento é um efeito aquo-diurético ou aquarético, em vez de um efeito natriurético tal como acontece com a hidroclorotiazida.

A actividade antagonista em relação à hormona antidiu rética natural (actividade anti-ADH) é determinada, in vitro, no tecido medular dos rins do porco ou do homem, e, in vivo, na ratazana hidropénica. Os procedimentos para testes in vitro p_a ra determinação da activação da adenilatociclase estimulada pela vasopressina ou actividade de ligação da vasopressina, são descritos por F. Stassen et al., 3. Pharmacology and Experimental Therapeutics 223, 50-54 (1982). A actividade antagonista é determinada por procedimentos usando tecido de aorta toráxica de ratazana e membranas plasmáticas de figado de ratazana. Estes procedimentos estão descritos na referida publicação de Stassen e numa publicação da l⁹ Conferência Internacional de Diurética, realizada em Março de (1984) em Miami, Florida, E.U. A.. 0 antagonismo de ocitocina é determinado tal como se descreve em W. Saujyer et al., Endocrinology 106, 81 (1979).

Um paciente sofrendo do sindroma de situação inadequada da hormona anti-diurêtica ou de uma situação edematosa indesejjS vel, é um alvo para os compostos da invenção. Exemplos de situaçães clínicas nas quais se podem usar os compostos do presej, te invento incluem a hipertensão, a cirrose hepática, a hiponatremia, a insuficiência cardíaca congestiva, ou um componente, tal como edema de qualquer condição traumática resultante de le são ou doença grave.

segundo grupo de centros receptores de vasopressina é constituído pelos centros pressores vasculares (receptores localizados no próprio sistema cardiovascular. Estes podem também ser antagonizados pelos compostos do presente invento.

Os compostos do presente invento são também antagonistas da ocitocina e como tal são úteis na prevenção do trabalho de parto, prematuro, e no tratamento de dismenorreia primária.

Deste modo, os compostos do presente invento são usados

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-12especialmente para induzir actividade anti-hipertensora, anti-ocitocínica ou diurética em pacientes que necessitem de tal tratamento. Os compostos são administrados internamente, parejn teralmente, bucalmente ou por insuflação, numa quantidade não t& xica mas eficaz, preferivelmente dispersos num transportador fa.r macêutico. As unidades de dosagem do ingrediente activo são s.e leccionadas na gama de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg, prefe rivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 1 mg/kg, de base para um paciente com 70 kg. As unidades de dosagem são administradas a um paciente humano ou animal de cerca de 1 a cerca de 5 vezes ao dia.

As composiçães farmacêuticas, que contêm um ingrediente com a fórmula I activo como antagonista, compreendem uma unidade de dosagem que está dissolvida ou suspensa num transportador líquido convencional, tal como solução salina isotónica, e está contida numa ampola ou num frasco com múltiplas doses, adequados para injecção parenteral tal como para administração intravenosa, subcutânea ou intramuscular. Uma composição para insuflação pode ser similar mas é usualmente administrada num aplicador ou inalador de dose controlada. Podem também usar-se cojn posiçães em pó pulverizado conjuntamente com preparaçães oleosas, geles, tampães para preparaçães isotónicas, pastilhas bucais, emplastros trans-dérmicos e emulsães ou aerossóis.

Para os compostos do presente invento demonstra-se a acti. vidade antagonista em relação â hormona anti-diurética natural (actividade anti-ADH), in vivo na ratazana hidropênica e in vitro no tecido medular do rim do porco. Conhscem-se na arte o ensaio com a ratazana hidropênica e o teste com o rim do porco, Huffman et al., Patente dos E.U.A. nS. 4 469 679.

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	-13- TABELA I
X Composto	4 '-MePmp- S-	-A-Phe-Val-Asn-Cys- 1 -s Ratazana in vivo	• Pro-A rg-Q Porco	in vitro
A	Q	ED300^ ^Ag)	Ki(nM)	Klig.(nM)
L-Tyr(Me)	Gly-NH2	165	44	130
D-Tyr(Et)	nh2	45	-	19
D-Tyr(Et)	Gly-NH2	13	4,2	13

Todos os compostos têm o isómero cis de 4’-MePmp.

Os compostos são testados, para determinar a actividade agonista parcial, de acordo com os procedimentos seguintes;

TESTE DE AGDWISMO PARCIAL

Retira-se a comida a cães híbridos, fêmeas, aproximadamente 18 horas antes do teste. Conduzem-se os estudos sob diure se da água, em estado estacionário, iniciada por uma carga de água de 5% em relação ao peso do corpo e por uma infusão de 3/ de dextrose. Na hora 0 administra-se indometacina, um inibidor da ciclooxigenase (2 mg/kg i.v. por injecção e 3 mg/kg/hora i.v. por infusão). Vinte minutos mais tarde administra-se i.v. o composto teste. Fedem-se o volume de urina e a osmolalidade em cada 10 minutos durante 4 horas.

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TABELA II

R-D-T yr(Et)-Phe-l/al-Asn-Cys-Pro-Arg-Q _S-s

osmolalii Composto*	dade (mOsm/kg H^0)X Controlo + INDO	volume	(ml/mn)*
Control	o +INDO
nenhum	43 86	5,7	3,1
ADH (3 ng/kg)	598 939	0,16	0,02
R=Pmp, q=NH2	284 1419	1,2	0,15
R=4’-MePmp, Q=NH2	70	-	2,0
R=Pmp, Q=Gly-NH2	399	-	0,55
R=4'-MePmp, Q=Gly-NH2	72	-	3,3
X Três horas após a dosagem	com compostos (ADH	, análoga	pepti-
deo).
# A náo ser onde se indica,	todos os análogos	foram tes	tados
a 10C ^iAg/kg. Todos os	análogos 4’-MePmp	continham	a oriejg

taçõo cis.

A tabela de resultados dos testes biológicos anteriormeri te apresentada demonstra que o tratamento com indometacina potência a actividade anticiurêtica (i.e. aumenta a osmolalidade da urina e diminui o volume) da ADH e potência a actividade ago, nista parcial do composto desmetilado (R=Pmp e Q=NH₂) de modo que se comporta subsequentemente como um agonista. Esta constatação é critica uma vez que no homem, o composto Pmp (3=ΐ\!Η₂) demonstrou apenas actividade agonista (Dubb et al*, Kidney Int.

31, 267, Janeiro de 1937) uma propriedade que nõo se observou em todos os modelos animais anteriormente testados. 0 modela da indometacina com cSes pode prever a actividade agonista de um composto no homem. A verificação de que os análogos 4’-f<ePmp n3o possuem actividade agonista parcial neste sistema de bio-teste sensível indica que os compostos 4^,-KePmp possuem propri edades vantajosas inesperadas quando comparados com o composto Pmp.

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-150s exemplos seguintes não são limitativos mas ilustrativos da invenção. Todas as temperaturas estão em graus centigra dos.

Exemplo 1

Preparação do ócido 4 ^l-Metil-/^-benzilmercapto-/3 ,/2> -ciclopentametilenopropiónico /~4'-MePmp(Bzl)_7 e do composto 4’-metilbenzilmercapto correspondente /~4'-MePmp(4-M,eBzl)_7

A uma mistura de 200 ml de tolueno e de 20,5 g de hidreto de sódio (59% em óleo mineral) adicionam-se 119,8 g de fosfo noacetato de trietilo, mantendo a temperatura abaixo dos 30-352C. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 horas. Adi. ciona-se lentamente 4-metilciclo-hexanona (50 g) mantendo uma temperatura de 253C (foi necessário algum arrefecimento). Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 32 horas e adiei, ona-se depois a água. Lava-se a fase orgânica com salmoura e depois concentra-se e destila-se obtendo-se o 4-metilciclo-hexili denoacetato de etilo.

A uma mistura de 200 ml de tolueno e de 11,1 ml de benzil mercaptano adicionam-se 0,5 g de hidreto de sódio (59/ em óleo mineral) e agita-se a mistura resultante durante 30 minutos, tra ta-se depois com dimetilformamida anidra e agita-se à temperatu ra ambiente durante 15 minutos. Adiciona-se 4-metilciclo-hexi1idenoacetato de etilo (9,1 g) e agita-se a solução durante 1,5 horas, deixando-a depois em repouso à temperatura ambiente de um dia para o outro. Adiciona-se a mistura a água e extracta-se com éter. Lavam-se os extractos orgânicos ccm salmoura e evapoi ram-se depois sob vácuo obtendo-se o 4'-metil- A benzilmercapto - p, ^S-ciclopentametilenopropionato de etilo. A este éster adi. cionam-se 100 ml de água, 300 ml de metanol e 50 g de carbonato de potássio. Leva-se a mistura ao refluxo durante 20 horas. Re move-se o metanol por evaporação; adiciona-se água; lava-se a fase aquosa com hexano, acetato de etilo 1:1 e acidifica-se depois com ácido clorídrico até pH 2. Por extracção com éter, la. vagem do extracto de éter com salmoura e secagem com sulfato de magnésio, concentração da solução orgânica e recristalização a

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-16partir de hexano, obtém-se o ácido 4'-metil-/3-benzilmercapto-/4-ciclopentametilenopropiénico, ponto de fusão, 75-7620.

Por recristalização a partir de diclorometano/hexano obtém-se o isómero cis do ácido 4’-metil-/J-benzilmercapto-/3 ,/S-ciclop επί ame til enopropiónico.

Pelo mesmo procedimento usando o 4-metilbenzilmercaptano em vez do benzilmercaptano, obtém-se o ácido 4'-metil-y4>-(4-metilbenzilmercapto)-^ ,/â-ciclopentametilenopropiónico, ponto de fusão 92-9420. Por recristalização a partir de hexano obtém-se o isómero cis.

Exemplo 2 composto antagonista da vasopressina, l-(ácido 4'-me til-/2>-mercapto-/j -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-8-arginina-9-desglicina__7vasopressina é re presentado pela seguinte fórmula estrutural:

4’-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2 S-S

Sintetiza-se o intermediário peptídeo proteçidc-resina,

4’-MePmp(4-MeBzl)-D-T yr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA por métodos de fase sólida no sintetizador automático Beckman 990B usando 1,0 g de resina benzidrilamina (aprox. 0,62 mmole). Todos os aminoácidos estão protegidos com t-butiloxicarbonilo (Boc) no azoto e são activados com DCC/HBT para acopla mento sequencial. 0 4’-MePmp-(4-MeBzl) é acoplado usando DMAP/ /DCC. Separa-se o peptídeo da resina, com desprotecção simultâ nea dos grupos protectores de cadeia lateral, usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (30 ml) a 02C durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até à secura, lava-se com éter anidro o resíduo contendo o peptídeo. Extracta-se o peptídeo bruto com dimetilformamida (100 ml) e com ácido acético a 40/ (100 ml) para 3,5 litros de água desgaseifiçada cujo pH se tinha pre, viamente ajustado a 4,5. Cicliza-se oxidativamente a mistura de octapeptídeo dissulfidrilo diluído em solução aquosa, com 110 ml de ferricianeto de potássio (0,01 M) a um pH de 7,2.

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-17Ajusta-se o pH da solução a 4,5 usando ácido acético glacial. Faz-se passar a solução através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/ /água v/v). Remove-se o tampão piridina-acetato por destilação in vacuo. Liofiliza-se o residuo a partir de ácido acético diluído obtendo-se o produto de peptídeo bruto parcialmente purificado.

Purificação:

Cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (HPLC) usando ultraesferas ODS de 5 yum (60/« de Η2θ/θ,1£ de TFA, 40/ de CH^CN/O,l/ de TFA) obtendo-se 13 mg (2,38/) de produto pu ro. Confirmou-se o produto por FAB-MS /“(M+H)⁺ = 1093_7 e por análise de aminoácidos (Asp = 1,0; Uai = 0,85; Tyr = 0,90;

Pbe = 0,83; Arg = 0,98), Confirmou-se a pureza por HPLC (Ultra esferas ODS de 5yum, 4,6 mm x 250 mm, 60/ de H₂0/0,l/ de TFA;

40/ de CH-jCI\l/O,l/ de TFA, K' = 8, gradiente de 80:20 até 50:50, 0,1/ de TFA aquoso/CH^CN K’ = 11,8) e por TLC com butanol:ácido acêticoságua (4:1:1) R^ = 0,538, butanol:acetato de etilo:ácido acético:água (l:l:l:l) R^ = 0,676.

Exemplo 3 composto antagonista da vasopressina, /~l-(ácido 4’-me til-/£ -mercapto-,/3-ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etilo)-D-tirosina-4-valina-8-arginina_/vasopressina é representado pe_ la seguinte fórmula estrutural:

'- MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-Ual-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NhL I l ^z s-s

Prepara-se o intermediário peptídeo protegido-resina 4'-MePmp(Bzl)-O-T yr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(MBzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-resina a partir da Boc-Gly-resina (3 mM/5,4 gramas de resina). Acoplam-se os aminoácidos adequadamente protegidos (todos os aminoácidos são protegidos com t-butiloxicarbonilo no azoto alfa) sequencialmente na resina Soc-Gly, preparada fazendo reagir a Boc-Gly, na forma do sal de césio, com resina Merrifield co67 701

SKB Case 14390

-18mercial (Cl-CF^-resina), como é conhecido na arte, usando um programa manual como se descreve nos passos seguintes.

1. lavagem com diclorometano (3 vezes, 1 minuto),

2. pré-lavagem com 33% de ácido trifluoroacêtico em diclorometano com 1% de índole (l vez, 1 minuto),

3. desprotecção com 33% de ácido trifluoroacêtico em diclorome, tano com 1% de indole (20 minutos),

4.	lavagem	com	diclorometano	(1	vez, 1	minuto),
5.	lavagem	com	etanol (l vez,	1	minuto)	j
6.	lavagem	com	diclorometano	(2	vezes,	1 minuto),

7. pré-lavagem com 10% de trietilamina em diclorometano (l vez, minuto),

8. neutralização com 10% de trietilamina em diclorometano (10 minutos),

9. adicionam-se o aminoácido protegido (10 mM) em trietilamina, em diclorometano e 0,5 M de N,N’-diciclo-hexilcarbodiimida em diclorometano (20 ml) e a reacção decorre por um período de até duas horas.

No caso do acoplamento do grupo Asn, adiciona-se 1-hidrç xibenzotriazolo (HBT, 10 mM) com Boc-Asn em dimetilformamida anidra. Utiliza-se o teste da ninidrina para verificar se cada reacção de acoplamento foi completa. Usa-se o grupo p-metoxibenzilo para proteger o grupo tiol da Cys e acopla-se o 4’-MePmp(Szl) usando DMAP/DCC. Sujeita-se o 4’-MePmp(Bzl)-D-Tyr(Et)-Phe -Val-Asn-Cys(MBzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-resina (4 g, aprox. 1,5 mM) a amonélise usando solução saturada de amónia/metanol (200 ml) à temperatura ambiente durante 48 horas. Após evaporação até quase à secura, extracta-se o resíduo com DMF. Concentram-se os extractos combinados até aproximadamente 5 ml e adiciona-se éter para precipitar o peptldeo que é recolhido e seco. Dissol. ve-se este peptídeo bruto em amónia líquida (250 ml) e trata-se com solução de sédio/amónia líquida obtendo-se o 4’-MePmp-D-Tyr(EtJ-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-Nl·^. Dissolve-se o peptídeo bruto em 3,5 litros de água desgaseificada contendo 10 ml de áci

701

SKB Case 14390

-19do acético glacial e ajusta-se a mistura a pH 7,2 com NH^OH. Cicliza-se oxidativamente a solução aquosa diluída de nonapepti deo dissulfidrilo com 110 ml de ferricianeto de potássio (0,01 M) a pH 7,2. Ajusta-se o pH da solução a pH 4,5 usando ácido acético glacial. Faz-se passar a solução através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/água v/v). Remove-se a solução de piridina-ace tato por destilação in vacuo. Liofiliza-se o resíduo a partir de ácido acético diluído obtendo-se o produto constituído por peptídeo bruto parcialmente purificado.

Purificação:

1. partição de CCD usando 4:1:5 (BuOH: HOActh^O)

2. filtração em gel:Sephadex G-15, 0,2 M de HOAc

Dados físicos:

Rendimento: 83 mg a partir de 1 mmole de Boc-Gly-resina (7%)

Teor em A.A.: 67/ por análise de A.A.; 88/ por análise de az_o to

Análise de A.A.: Asp (0,92), Pro (l,02), Gly (l,00);

Cys (0,56), Vai (0,94), Tyr (0,57),

Phe (0,92), Arg (0,88)

FA8 E.M.: (M+H)⁺ 1150, (M-H)“ 1148

Γ.Μ.: ^C54^H79^N13°11^S2

P.M.: 1150,420

HPLC: >95/ puro usando o seguinte sistema de gradiente:

80/20 -> 50/50 em 20 minutos de H₂0/CH₃CN (0,1% de

TFA); uma coluna C-18 de 5^Am.

TLC: 1:1:1:1, SuOH:HOAc:EtOA_c:H„0 R = 0,66 2 f ⁷

Exemplo 4 composto antagonista da vasopressina, /~l-(ácido 4’-metil-^ -mercapto-^ ,y5-ciclopentametilenopropiónico)-2- (0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-arginina-8-glicina-9-glicina-10-ajr

701

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-20ginina_7vasopressina ê representado pela seguinte fórmula estru tural:

'-MePmp-D-Tyr(E t)-Phe-Val~Asn-Cys-Arg-Gly-Gly-Arg-l\!H₉ I I ^z

S-g

Sintetiza-se o intermediário peptídeo protegido-resina, »-MePmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)~Arg(Tos)-Gly-Gly-Arg(Tos)-BHA por métodos de fase sólida, no sintetiza, dor automático Beckman 990B usando 1,0 g de resina benzidrilami na (aprox. 0,62 mmole). Todos os aminoácidos estão protegidos com t-butiloxicarbonilo no azoto e são actiuados com DCC/HBT pa. ra acoplamento sequencial. 0 4 ^l-l^viePmp(4-MeBzl) é acoplado usaj} do DMAP/DCC. Separa-se o peptídeo da resina, com desprotecção simultânea dos grupos protectores de cadeia lateral, usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a 02C durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até ã secura, lava-se o resí. duo contendo o peptídeo com éter anidro. Extracta-se o peptídeo bruta com dimetilformamida (100 ml) e com ácido acético a 40% (100 ml) e adiei onam-se os extractos a 3,5 litros de água desga. seificada. Cicliza-se oxidativamente a mistura de decapeptídeo dissulfidrilo diluído em solução aquosa, com 110 ml de ferricra neto de potássio (0,01 M) a um pH de 7,2. Ajusta-se o pH da sçi lução a 4,5 usando ácido acético glacial. Faz-se passar a solu ção através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/água v/v). Remove-se o tampão de piridina-acetato por destilação in vacuo. Liofiliza-se o resíduo a partir de ácido acético diluído obtendo-se o produto de peptídeo bruto parcialmente purificado.

Exemplo 5 composta antagonista de vasopressina, /~l-(ácido 4'-metil-^J -mercapto-/^ , /3-ciclcpentametilenoprcpiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-6-D-cisteína-7-N-metilarginina-B-arginina-9-desglicina_7vasopressina é representado pela seguinte fórmula estrutural:

7D1

SKB Case 14390

„...../

-214’-MePmp-D-T yr(Et)-Phe-l/al-Asn-D-Cys-N-MeArg-Arg-NH₉ I I s-s

Sintetiza-se o intermediário peptídeo protegido-resina, ’-MePmp(4-l^vieBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-D-Cys(4-MeBzl)-N-MeArg(Tos)-Arg(Tos)-BHA, por métodos de fase sólida no sintetizador automático Beckman 990B usando 1,0 g de resina benzidrilamina (aprox. 0,62 mmole). Todos os aminoácidos estão protegidos com t-butiloxicarbonilo no azoto e são activados com DCC/HST para acoplamento sequencial. 0 4 ’-FiePmp (4-MeBzl) é acoplado usando DMAP/DCC. Separa-se o peptídeo da resina, com desprotecção simultânea dos grupos protectores da cadeia lateral, usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a 02C durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até à secura lava-se o resíduo contendo o peptídeo com éter anidro. Extracta-se o produto bruto com dimetilformamida (100 ml) e com ácido acético a 40/ (100 ml) e adicionam-se os extractos a 3,5 litros de água desga seificada. Cicliza-se oxidativamente a mistura de octapeptideo dissulfidrilo diluído em solução aquosa, com 110 ml de ferricia neto de potássio (0,01 M) a um pH de 7,2. Ajusta-se o pH da sçi lução a 4,5 usando ácido acético glacial. Faz-se passar a solu ção através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/água v/v). Remove-se o tampão de piridina-acetato por destilação in vacuo. Liofiliza-se o resíduo a partir de ácido acético diluído obtendo-se o produto peptídeo bruto parcialmente purificado.

Exemplo 6 composto antagonista da vasopressina, l-(ácido 4'-metil-^-mercapto-^ -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-ualina-7-arginina~8-desarginina-9-desglicina_/vasopressina é representado pela seguinte fórmula estrutural:

’-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-l/al-Asn-Cys-Arg-NH2

Sintetiza-se o intermediário peptídeo protegido-resina,

701

SKB Case 14390

-224 ^,-MePmp(4-l^v!eBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-l/al-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)BHA, por métodos de fase sólida no sintetizador automático Beckman 990B usando 1,0 g de resina benzidrilamina (aprox. 0,62 mmole). Todos os aminoácidos estão protegidos com t-butiloxicarbonilo no azoto e são activados com DCC/HBT para o acoplamejg to sequencial. 0 4’-MePmp(4-MeBzl) é acoplado usando DMAP/DCC. Separa-se o peptídeo da resina, com desprotecção simultânea dos grupos protectores de cadeia lateral, usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a Q2C durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até à secura, lava-se o resíduo contendo o peptídeo com éter anidro. Extracta-se o peptídeo bruto com dimetilformamida (100 ml) e com ácido acético glacial a 40/ (100 ml) e adicionam-se os extractos a 3,5 litros de água desgaseifi cada. Cicliza-se oxidativamente a mistura de heptapeptldeo dis sulfidrilo, diluído em solução aquosa, com 110 ml de ferriciane to de potássio (0,01 M) a um pH de 7,2. Ajusta-se o pH da solu. ção a 4,5 usando ácido acético glacial. Faz-se passar a solução através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/água v/v). Remove-se □ tampão piridina-acetato por destilação in vacuo. Liofiliza-se o resíduo a partir de ácido acético diluído obtendo-se o produto de peptídeo bruto parcialmente purificado.

Exemplo 7 composto antagonista da vasopressina, /~l-(ácido 4'- me til-^3-mercapt 0-^/3 , /3-ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-0-tirosina-4-valina-7-arginina-8-D-arginina-9-desglicina_7vasopressina, é representado pela seguinte fórmula estrutural :

4’-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-D-Arg-NH₂

Sintetiza-se o intermediário peptídeo protegido-resina,

4’-MePmp(4-MeBzl)-D-T yr(Et)-Phe-Ual-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-D-Arg(Tos)-BHA, por métodos de fase sólida no sintetizador au67 701

SKB Case 14390 e o peptídeo-, glacial acético/a 40/

-2 3tomático Beckman 990B usando 1 g de resina benzidrilamina (aprox. 0,62 mmole). Todos os aminoácidos estão protegidos com t-buti1oxicarbonilo no azoto e são activados com DCC/HBT para acoplamento sequencial. 0 4-MePmp(4-MeBzl) ê acoplado usando DMAP/ /DCC. Separa-se o peptídeo da resina, com desprotecção simultâ nea dos grupos protectores de cadeia lateral, usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a OSC durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até à secura lava-se o resíduo contendo o peptídeo com éter anidro. Extracta-s bruto com dimetilformamida (100 ml) e com ácido (100 ml) e adicionam-se os extractos a 3,5 litros de água desga seificada. Cicliza-se oxidativamente a mistura de octapeptídeo dissulfidrilo diluído em solução aquosa, com 110 ml de ferricia neto de potássio (0,01 M) a um pH de 7,2. Ajusta-se o pH da so lução a 4,5 usando ácido acético glacial. Faz-se passar a solju ção através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/água v/v). Remove-se o tampão piridina-acetato por destilação in vacuo. Liofiliza-se o resíduo a partir de ácido acético diluído obtendo-se o produto de peptídeo parcialmente purificado.

Exemplo 8

Preparação do:

'-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-l/al-Asn-Cys-Pro( 0H)

I I

S-S

Prepara-se a Boc-Pro-rssina Merrifield por acoplamento da Boc-Pro à resina Merrifield usando o método do sal de césio, obtendo-se a Boc-Pro-0CH₂C₆H₄-resina que se usa como material de partida para a síntese. Realiza-se a síntese no sintetizado de peptídeos Beckman 990B usando o seguinte protocolo. Dissolvem-se tr6s equivalentes dos aminoácidos nos seus solventes apropriados /~os derivados Boc de Cys(MeBzl), Vai, Phe e 4'-MePmp(MeBzl) em diclorometano, Asn em dimetilformamida, X, tal co mo D-Tyr(Et) ou BrZ-D-Tyr em diclorometano/dimetilformamida e acoplam-se usando uma quantidade equimolar de diciclo67 701

SKB Case 14390

-24-hexilearbodiimida (DCC) e de l-hidroxibenzotriazolo (HBT) excepto para o acoplamento do 4^,-FíePmp-(4-l^vleBzl) onde se usa como catalisador 1,0 equivalente de dimetilaminopiridina. 0 grau de acoplamento ê determinado por análise qualitativa de ninidrina de cada amostra de alíquota e repetem-se os acoplamentos quando necessário. Removem-se os grupos Boc usando ácido trifluoroacé. tico/diclorometano 1:1 e, após lavagem gera-se a amina livre usando 5% de di-isopropiletilamina/diclorometano. Verifica-se a sequência do peptldeo usando sequenciação de fase sólida antes do acoplamento do 4'-MePmp(4’-MeBzl) e confirma-se a sua ho mogeneidade.

Agitam-se 1,1 gramas (0,5 mmole) de resina com o heptapeptídeo protegido, com 3 ml de anisolo em 25 ml de fluoreto de hidrogénio líquido anidro (HF) durante 60 minutos a 020 (banho de gelo). Remove-se depois o HF sob pressão reduzida a 02C. La va-se depois o resíduo com éter etílico (4 x 20 ml, desprezado) e extracta-se o peptídeo com dimetilformamida (3 x 10 ml), ácido acético a 20/ (3 x 10 ml) e hidróxido de amónio 0,3 N (3 x 10 ml).

Adicionam-se os extractos a 2 1 de água desgaseifiçada e ajusta-se o pH a 7,1 com hidróxido de amónio conc.. Adiciona-se depois, gota a gota, com agitação, uma solução de 0,01 M de ferricianeto de potássio até persistir uma cor amarelo pálido (41 ml). Ajusta-se a solução a pH 4,5.

Faz-se passar a solução resultante através de uma coluna flash (5 cm x 15 cm) de um enchimento de silica gel revestido com um silano C-18. Lava-se depois a coluna com 350 ml de água e elui-se o peptídeo com 500 ml de acetonitrilo/água 1:1 (0,25/ de ácido trifluoroacético) em fracçães de 20 ml.

Combinam-se as fracçães apropriadas e concentram-se. Dis. solve-se o resíduo em ácido acético conc., dilui-se com água e liofiliza-se obtendo-se o peptídeo do título que se usa, sem qualquer purificação adicional, na síntese dos peptídeos com a cauda modificada.

67701

SKB Case 14390

- .Tf-:

-25Exemplo 9

Preparação do:

4'-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-NH(CH2)^—NH^ _s-3

Dissolve-se 1,5-diaminopentano (14,0 ml, 120 mmole) em ter-butanol (70 ml) e trata-se gota a gota durante 10 minutos com dicarbonato de di-ter-butilo (9,2 ml, 40 mmole). Após a adição estar completa agita-se a mistura reaccional à temperatu ra ambiente durante 16,5 h. Trata-se depois a mistura reaccional com solução 1 N de hidróxido de sódio (aq) (90 ml), agita-se durante lhe extracta-se finalmente com clorofórmio. Secam-se os extractos de clorofórmio (MgSO^) e concentram-se sob vácuo. Dissolve-se o resíduo em água, acidifica-se (pH = 2) por adição gota a gota de ácido clorídrico 3 N a Oac e lava-se com éter para remover a diamina diprotegida. Alcaliniza-se a fase aquosa (pH = 10) com solução de carbonato de sódio a 5% e extracta-se com acetato de etilo obtendo-se 1,6 g (20%) de mono. -Boc-1,5-diaminopentano. Confirmou-se a estrutura por RMN-H e por CI-EM.

A uma solução do heptapeptideo preparado no Exemplo 8 e de mono-Boc-1,5-diaminopentano em dimetilformamida, adicionam-se diciclo-hexilcarbodiimida e hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo. Agita-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 19 horas. Remove-se depois a dimetilformamida sob vácuo. Trata-se o residuo com ácido trifluoroacético a Oac durante 2 horas. Após este periodo, remove-se o ácido trifluoroacético sob vácuo e faz-se passar o resíduo, em ácido acético a 1%, através de uma coluna de permuta iónica Bio-Rex 70 (H⁺). Removem-se os produtos básicos por lavagem da coluna de permuta iónica com tampão de piridina (h^O/pi ridina/HOAc, 66:30:4) e evapora-se obtendo-se o produto bruto.

701

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-26Exemplo 10

Preparação da:

4'-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-NH-(CH₉).NHC(=NH)NH₉ j j z 4 z _S-S

Trata-se o mono-Boc-1,4-diaminobutano (l,25 g, 6,6 mmole), preparado a partir da putrescina, em dioxano (2 ml) e água (6,5 ml), com hidrogenossulfato de O-metilisoureia (l,25 g, 7,26 mmo le) e com hidróxido de sódio 2 N (aq) (3,75 ml) à temperatura ambiente. Agita-se a solução resultante durante 6 dias. Remove-se o solvente sob pressão reduzida e alcaliniza-se o resíduo (pH = 12) por adição de hidróxido de sódio 2 N. Evapora-se de novo o resíduo, retoma-se com acetato de etilo, filtra-se e eva pora-se. Seca-se a guanidina em bruto por evaporação a partir de tolueno e usa-se sem outra purificação.

Trata-se a guanidina em bruto (410 mg, 1,78 mmole) em hi dróxido de sódio 2 N (aq) (2 ml) e em água (2 ml), à temperatura ambiente, com cloreto de p-toluenossulfonilo (340 mg, 1,78 mmole) durante 1B horas. Ajusta-se o pH a 8 com solução de carbonato de sódio a 5%. Extracta-se a mistura com acetato de etilo obtendo-se por evaporação 437 mg do produto bruto. Por purificação por cromatografia flash(leito de silica 3 x 15 cm, 80% de acetato de etilo/hexano) obtém-se 265 mg (39%) do produto to silado desejado, cuja identidade se confirma por RMN-H e por espectroscopia de massa-CI.

Trata-se o Tos-NHC(=NH)NH(CH2)₄-NH Boc (108 mg, 0,281 mmole) em diclorometano (l ml) com ácido trifluoroacético (l ml) a 09C durante 40 minutos. Evapora-se a mistura reaccional sob vácuo, ajusta-se o resíduo a pH 8 com solução de carbonato de sódio a 5% e evapora-se até ã secura. Retoma-se o resíduo com acetato de etilo, filtra-se e evapora-se. Seca-se o produto bruto des-Boc por evaporação a partir de tolueno obtendo-se 66 mg (82%). Confirma-se a identidade por RMN-H e usa-se sem outra purificação.

Trata-se a l-(ácido 4 ’-me til-/S-mercapto-^ -ciclo67 701

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-27pentametilenopropiánico)-2-D-(0-etil)tirosina-4-valina-8-desarginina-9-desglicinamida_7vasopressina, preparada como no Exemplo 8, em dimetilformamida à temperatura ambiente com a tosilguanidinobutilamina. Agita-se a mistura durante 43 horas. Remove-se o solvente sob pressão reduzida e dissolve-se o resíduo em ácido trifluoroacético e trata-se depois com ácido trifluome tanossulfônico e com anisolo, à temperatura ambiente com agitação durante 2 horas. Evapora-se a mistura reaccional atá à secura, dissolve-se em ácido acético a 10>ò, filtra-se e faz-se passar através de um coluna Bio-Rex 70. Elui-se a guanidina em bruto da coluna, com tampão de piridina (piridina/água/ácido acético, 30:66:4) e evapora-se obtendo-se o peptídeo em bruto. Exemplo 11

Substituindo a Boc-D-Tyr(Et) na segunda unidade da slnte se do peptídeo do Exemplo 2 por uma quantidade estequiométrica de Boc-L-Tyr(Et), obtém-se o peptídeo cíclico

4’-MePmp-L-T yr(Et)-Phe-Val-Asn~Cys-Pro-Arg-NH,

Substituindo no Exemplo 2 Soc-D-Tyr(Et) na segunda unida, de por Boc-D-Ile obtém-se

4'-MePmp-D-Ile-Phe-Ual-Asn-Cys-Pra-Arg-NH_o I I ² s-s

Substituindo o aminoácido da terceira unidade por Boc-L-Phe(4-Me) e o da quarta unidade por Boc-Nle, na sequência reaç, cional, no sintetizador,do Exemplo 2 obtém-se ’-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe(4-Me)-l\!le-Asn~Cys-Pro-Arg-NH2

Substituindo o aminoácido da quarta unidade por Boc-Cha obtém-se

4'-MePmp-D-T yr(Et)-Phe-Cha-Asn-Cys-Pro-Arg-NH₉ I I ² s_s

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-28Substituindo o aminoácido da quarta unidade por Gin não protegido usando HBT obtém-se

4'-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-MH₀

I ι ² s-s

Exemplo 12

Substituindo as unidades de anel protegidas apropriadas na sequência sintética do Exemplo 7 e usando os ácidos apropria dos obtêm-se os sais de peptídeo respectivos como se segue:

acetato de 4’-metil-/J-mercapto-/2,/3-ciclopentametilenopropiónico)-2-tirosina-3-(4'-metilfenilalanina)-7-arginina-8-D-arginina-9-desglicina_7 vasopressina, fosfato de ácido 4’-metil-/3-mercapto-/3j/3-ciclopentametilenopropiónico)-2-D-fenilalanina-4-isoleucina-7-argini na-8-D-arginina-9-desglicina__7vasopressina;

hidrocloreto de /~l-(ácido 4’-metil-/3-mercapto-fi> ,/£-çi clopentametilenopropiónico)-2-D-isoleucina-4-ciclo-hexilglicina-7-arginina-8-D-arginina-9-desglicina_7vasopressina.

Exemplo 13 composto antagonista da vasopressina, /”l-(ácido 4'-me til-yS-mercapto-,/3-ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-ornitina-8-ornitina-9-ornitina_7vasopres. sina, é representado pela seguinte fórmula estrutural:

4'-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-0rn-0rn-0rn-NH₉

Sintetiza-se o intermediário peptídeo protegido-resina,

4’-MePmp(4-MeBzl)-D-T yr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-0rn(ClZ)-0rn(Clz)-0rn(ClZ)-BHA, por métodos de fase sólida no sintetiza, dor automático Beckman 990B usando 1,0 g de resina benzidrilami. na (aprox. 0,62 mmole). Todos os aminoácidos estão protegidos com t-butiloxicarbonilo no azoto e são activados com DCC/HBT pja ra acoplamento sequencial. 0 4-MePmp(4-MeBzl) é acoplada usando DMAP/OCC. Separa-se o peptídeo da resina com desprotecção

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-29simultânea dos grupos protectores de cadeia lateral usando HF a nidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a 09C durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até à secura, lava-se o resíduo contendo o peptideo com éter anidro. Extracta-se o pepti deo bruto com dimetilformamida (100 ml) e com ácido acético a 40/ (100 ml) e adicionam-se os extractos a 3,5 litros de água desgaseificada. Cicliza-se oxidativamente a mistura de nonapeptideo dissulfidrilo, diluído em solução aquosa, com 110 ml de ferricianeto de potássio (0,01 M) a um pH de 7,2. Ajusta-se o pH da solução a 4,5 usando ácido acético glacial (HOAc). Faz. -se passar a solução através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/ /água v/v). Remove-se o tampão de piridina-acetato por destilação in vacuo. Liofiliza-se o resíduo a partir de ácido acéti co diluído obtendo-se o produto de peptideo bruto parcialmente purificado.

Exemplo 14 composto antagonista da vasopressina, /~l-(ácido 4'-me til-/3- mercapto-/3 ,/3 -ciclopentametilenopropiénico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-7-lisina-8-lisina-9-lisinaJ7vasopressina, é representado pela seguinte férmula estrutural:

4’-MePmp-D-T yr(Et)-Phe-Ual-Asn-Cys-Lys-Lys-Lys-NH„

I l g-5

Sintetiza-se o intermediário peptideo protegido-resina, 4'-MePmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Lys(ClZ)-Lys(ClZ)-Lys(ClZ)-BHA, por métodos de fase sólida no sintetizador automático Beckmann 990B usando 1,0 g de resina benzidril amina (aprox. 0,62 mmole). Todos os aminoácidos estão protegidos com t-butiloxicarbonilo no azoto e são activados com DCC/HBT para acoplamento sequencial. 0 4’-MePmp(4-MeBzl) ê acoplado usando DMAP/DCC. Separa-se o peptideo da resina, com desproteja ção simultânea dos grupos protectores de cadeia lateral, usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a OQC durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo até â secura, lava-se o

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-30resíduo contendo o peptídeo com éter anidro. Extracta-se o peptídeo bruto com dimetilformamida (100 ml) e com ácido acético a 40/ (100 ml) e adicionam-se os extractos a 3,5 litros de água desgaseificada. Cicliza-se oxidativamente a mistura de nonapeptídeo dissulfidrilo, diluído em solução aquosa, com 110 ml de ferricianeto de potássio (0,01 M) a um pH de 7,2. Ajusta-se o pH da solução a 4,5 usando ácido acético glacial (HOAc). Faz -se passar a solução através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/ /água v/v). Remove-se o tampão piridina-acetato por destilação in vacuo* Liofiliza-se o resíduo a partir de ácido acético diluído obtendo-se o produto de peptídeo bruto parcialmente purificado.

EXEMPLO 15 composto antagonista de vasopressina /~l-(ácido 4’-metil-/5-mercapto-(í -ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil)-D-tirosina-4-valina-8-arginina-9-arginina_/vasopressina, é representado pela seguinte fórmula estrutural:

’-MePmp-D-Tyr(Et)-Phe-l/al-Asn-Cys-Pro-Arg-Arg-NH₉ I I ^Z

S-s

Sintetiza-se o intermediário peptídeo protegido-resina 4 *-MePmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos) -Arg(Tos)-BHA por métodos de fase sólida no sintetizador automá tico Beckmann 990B usando 1,0 g de resina benzidrilamina (aprox. 0,62 mmole). Todos os aminoácidosestão protegidos com t-butiloxicarbonilo no azoto e são activados por DCC/HBT para acoplamento sequencial. 0 4'-MePmp(4-MeBzl) é acoplado usando DRAP/ /DCC. Separa-se o peptídeo da resina com desprotecção simultânea dos grupos protectores de cadeia lateral, usando HF anidro (30 ml) na presença de anisolo (3,0 ml) a OSC durante 60 minutos. Após evaporação in vacuo, até â secura, lava-se o resíduo contendo o peptídeo com éter anidro. Extracta-se o peptídeo bruto com dimetilformamida (100 ml) e com ácido acético a 40/ (l00 ml) e adicionam-se os extractos a 3,5 litros de água desga

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-31seificada. Cicliza-se oxidativamente a mistura de nonapeptídeo dissulfidrilo diluído em solução aquosa, com 110 ml de ferricia neto de potássio (0,01 M) a um pH de 7,2. Ajusta-se o pH da so lução a 4,5 usando ácido acético glacial (HOAc). Faz-se passar a solução através de uma coluna de resina acrílica ligeiramente ácida (Bio-Rex 70). Elui-se a coluna com tampão de piridina-acetato (30:4:66, piridina/ácido acético glacial/água v/v). Re move-se o tampão de piridina-acetato por destilação in vacuo. Liofiliza-se o resíduo a partir de ácido acético diluído obtendo-se o produto de peptídeo bruto parcialmente purificado. Exemplo 16

Composiçães para unidades de dosagem parenteral:

Uma preparação que contém 0,10 mg de peptídeo do Exemplo 2 na forma de um pó asséptico anidro para injecção parenteral é preparada como se segue: dissolve-se 0,5 mg de peptídeo em 1 ml de uma solução aquosa de 20 mg de manitol. Filtra-se a solu. ção sob condições assépticas para uma ampola de 2 ml e liofiliza-se. Administra-se a solução reconstituída a um paciente necessitado de tratamento com um antagonista de vasopressina, como necessário, de 1-5 vezes ao dia por injecção, ou numa quanti dade equivalente por injecção i.v. contínua.

Composiçães para unidades de dosagem nasal:

Suspendem-se 2,5 mg de um peptídeo da invenção finamente moído, tal como um peptídeo do Exemplo 3, numa mistura de 75 mg de álcool benzílico e de 1,395 g de um agente de suspensão tsl como uma mistura comercial de glicêridos semi-sintéticos de áci. dos gordos de cadeia lcnga. Coloca-se a suspensão num recipieri te de aerossol de 10 ml que ê fechado com uma válvula reguladora e carregado com propulsores de aerossol. 0 conteúdo compreende 100 unidades de dosagem que são administradas intranasalmente a um sujeito que o necessite, de 1-6 vezes ao dia.

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-32R. Ε I U I N D I C A Ç Ό E S

- Processo de preparação de um composto com a fórmula (I)

2 3 4 5 6

CH_oC0-A-B-C-Asn-D-(W) -(X)-(Y) -Z m p q

CH, CH„-CH_O \/ ^{2 2} c

/ \ / H CH_O-CH„ (I) onde

A é o isómero D ou L da Phe, Phe(4'-Alq), Ile, Cha, Tyr, ou Tyr(O-Alq);

B é Phe, Phe(4’-Alq), Tyr(O-Alq), Ile ou Tyr;

C é Uai, Ile, Abu, Chg, Gin, Lys, Cha, Nle, Leu, Ala ou Gly;

D ê o isómero D ou L de Cys;

m, p e q são cada um 0 ou 1;

W é o isómero D ou L da Pro, Arg, HArg, N-MeArg, Lys ou Orn;

X Ó o isómero D ou L da Arg, Lys, Orn ou Gin ou quando m é 1, X pode ser Gly;

Y é o isómero D ou L da Arg, Lys, Orn, Ser, Gin, Tyr ou Ala ou quando pelo menos um de m ou p é 1, Y pode ser Gly;

Z é NH-(CH₂)_n-NHR, ou um isómero D ou L da ftrg-MH₂, Lys-NH₂ ou 0rn-NH₂, ou quando pelo menos um de m, p e q é 1, Z pode ser NHR' ou OH;

R é H ou C(=NH)-NH₂;

R* é H ou Alq;

n á 2-6; e

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-33Alq é um grupo alquilo com 1-4 átomos de carbono; ou de um seu sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, ou de um seu éster de alquilo de cadeia curta ou de benzilo, que compreende a ciclização oxidativa de um composto, facultativamente protegido, com a fórmula (II)·*

4'-MePmp-A-B-C-Asn-D-(W) -(X) -(Y) -Z

I , I ^{p q} (II)

S-Q¹ s-g^z ,χ·' onde

Claims (10)

1. A, B, C, D, W, X, Y, Z, m, p e q são definidos como ante riormente;

   1 2

   Q e Q são, cada um, hidrogénio ou um grupo eliminável; e

   4'-MePmp ê um ácido 4’-metil-/3,^-ciclopentametilenopro piónico com o S-Q¹ ligado na posição e depois facultativamente, por qualquer ordem, (a) a remoção de quaisquer gruposprotectores, (b) quando Z é uma diamina, NH-(CH₉) -NHR, a reacção

   X ry Ζ Π dos referidos compostos Cys(OH) ou Αζ-(^χ)3-(Υ)9(0Η), quando presentes, com a diamina, H-Z, facultativamente numa forma protegida, ou (c) a formação de um seu sal farmaceuticamente aceitável ou de uma sua prodroga.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza, do por o grupo 4'-metilo do grupo ácido /3,/3-ciclopentametilenopropiónico estar na posição cis em relação ao átomo de enxofre

   A*
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado 1 2 por Q e Q serem ambos hidrogénio,
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri1 2 zado por Q e Q serem ambos acetamidometilo.

   67 701

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   -345 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se realizar na presença de iodo.
5. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se realizar na presença de ferricianeto.
6. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se fazer reagir, após a ciclização oxidativa, um composto Cys(0H)6 com a fórmula I, com a diamina, H-Z, na presença de uma carbodiimida, seguindo-se facultativamente a remoção de

   I quaisquer grupos protectores.
7. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se fazer reagir, após a ciclização oxidativa, um com7 8 9 posto (W)_jJ_|-(X)p-(Y)_q(OH) com a fórmula I, com a diamina, H-Z, na presença de uma carbodiimida, seguindo-se facultativamente a remoção de quaisquer grupos protectores.
8. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A ser D-Tyr(Et); B ser Phe; C ser Uai; D ser Cys; e (W) -(x)-(Y) -Z ser Pro-Arg-NH₉. m p q 2
9. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por A ser D-Tyr(Et); B ser Phe; C ser Uai; D ser Cys; e

   I (W)_m-(X)_p-(Y)_q-Z ser Pro-Arg-Gly-NH₂.
10. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por A ser D-Tyr(Et); B ser Phe; C ser Uai; D ser Cys; e (W)_m-(X)_p(Y)_q-Z ser Arg-D-Arg-NH₂.

    Lisboa, ?'AÍ ;.·ο·8

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