PT1767216E

PT1767216E - Fármaco tendo um ligando de células reguladoras contido num lipossoma

Info

Publication number: PT1767216E
Application number: PT05750814T
Authority: PT
Inventors: Yasuyuki Ishii; Risa Nozawa; Masaru Taniguchi
Original assignee: Riken
Priority date: 2004-06-11
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2012-08-27
Also published as: CA2569590A1; EP1767216A4; JP4889485B2; AU2005251589B2; JPWO2005120574A1; ES2389080T3; DK1767216T3; WO2005120574A1; EP1767216B1; US9387170B2; US20100104632A1; KR20070026796A; CA2569590C; US8920774B2; CN1997395A; CN1997395B; EP1767216A1; US20070104776A1; KR101215808B1; AU2005251589A1

Description

DESCRIÇÃO

FÁRMACO TENDO UM LIGANDO DE CÉLULAS REGULADORAS CONTIDO NUM LIPOSSOMA A presente invenção tem por objecto um fármaco para ser utilizado no tratamento de uma doença, seleccionada no grupo que consiste em doenças alérgicas, doenças autoimunes e doença do hospedeiro versus o enxerto, compreendendo um lipossoma contendo, como principio activo essencial, o KRN7000.

As doenças imunitárias, tais como doenças alérgicas, doenças auto-imunes e doença do hospedeiro versus o enxerto (doenças DHVE) são doenças causadas por anomalias ou incompatibilidades do sistema imunitário. Tendem a aumentar de ano para ano os doentes com alguma doença alérgica e já foi relatado que 70 % dos japoneses já foram afectados com alguma doença alérgica. As categorias de doenças alérgicas são vastas e incluem asma, dermatite atópica, rinite alérgica sazonal, alergia alimentar e doença alérgica da pele. Muitos dos doentes com alergia são conhecidos por desenvolverem várias doenças alérgicas sequencialmente, o que é referido como marcha alérgica. Nos últimos anos, no Japão, têm aumentado significativamente os doentes com rinite alérgica sazonal ou asma atópica pediátrica que tiveram complicações com rinite alérgica ou conjuntivite alérgica. Pensa-se que uma das razões para isso, tem sido a mudança do ambiente de vida, em especial a mudança do ambiente imunológico (diminuição de infecções bacterianas, aumento da densidade de pó em casa em casas herméticas) em lactentes em que o sistema imunitário está formado podendo aumentar a produção do anticorpo IgE. É evidente que as 1 doenças alérgicas definidas de uma forma mais restrita, tais como rinite alérgica, conjuntivite alérgica e asma atópica são causadas por uma reacção alérgica do tipo I em que estão envolvidos o anticorpo IgE e as células Th2 que induzem a produção do anticorpo. Tem sido frequentemente referido que o anticorpo IgE e as células Th2 predominantes estão profundamente envolvidos durante a fase de ocorrência de outras doenças alérgicas para além das referidas. Do exposto antes, prevê-se que a diminuição da produção do anticorpo IgE, que é responsável pela reacção alérgica do tipo I e a inibição da diferenciação das células Th2, podem ser procedimentos promissores para a terapêutica das doenças alérgicas. Para os doentes com doença alérgica, que se prevê que venham a aumentar ainda mais no futuro, pensa-se que a redução da alergia pode ser mais eficaz por meio de uma terapêutica causal, por meio de medicamentos feitos à base dos mecanismos de ocorrência da alergia ou um processo preventivo (vacina). É necessário assegurar para o remédio um perfil de elevada segurança (poucos efeitos secundários).

Um anticorpo anti-IgE humanizado (rhuMAb-E25, Genentech Inc.) tem mostrado ser altamente eficaz em ensaios clínicos com doentes com asma atópica (ver a literatura fora das patentes com a referência 1) . Numa tentativa para inibir a produção de um anticorpo IgE especifico do antigénio, usando um composto artificial, induziu-se uma resposta imunitária do tipo Thl em ratinhos BALB/c imunizados com um ADN de plasmido em que tinha sido incorporado um gene Cry jl de pólen de cedro. Como resultado, produziu-se um anticorpo IgG2a e, mesmo quando se reforçou o antigénio Cry jl e o alúmen, a produção de anticorpos IgE e de IgGl foi suprimida (ver a literatura fora das patentes com a referência 2) . Quando o rato foi 2 imunizado com uma proteína de fusão OVA-IL-12, induziu-se a resposta imunitária do tipo Thl especifica de OVA. A sua eficiência foi muito maior no caso da imunização com uma solução de uma mistura de OVA e IL-12 e produziu-se o anticorpo IgG2a especifico de OVA (ver a literatura fora das patentes com a referência 3). Este relatório indica que a resposta pode ser alterada para o tipo Thl pela imunização com um complexo do antigénio e um indutor de citocina e, simultaneamente, pode-se suprimir a produção do antigénio especifico do anticorpo IgE.

Para prevenir a doença alérgica ou levá-la à cura, pode ser eficaz um procedimento para controlar as células reguladoras que suprimem a diferenciação, a proliferação e as funções das células Th e das células B que produzem os anticorpos IgE. Crê-se que as células TAN (células T assassinas naturais, NKT em inglês) sejam células reguladoras que desempenha um papel importante nas células cancerosas, parasitas e protozoários e para eliminar as bactérias infectadas intracelularmente, tais como Listeria e germes da tuberculose (ver a literatura fora das patentes com a referência 4). Já foi demonstrado que a célula TAN é uma célula intermédia de TCR (célula TCRint) que expressa moderadamente um receptor de célula T (RCT) e é uma célula análoga a uma célula assassina natural (NA, NK em inglês) na medida em que exibe uma morfologia semelhante a linfócitos granulares grandes (LGG, LGL em inglês), expressando constitutivamente a cadeia de IL-2R β na superfície e tendo grânulos de perforina, mas sendo absolutamente diferente da célula AN pelo facto de ter RCT (ver a literatura fora das patentes com a referência 5) . Uma célula TAN Val4+ é um dos subconjuntos das células TAN anteriores, muitas das células TAN Vcxl4+ expressam o ARNm de Val4Jcx281 e têm-no como uma cadeia α do RCT. Uma cadeia 3

Vcx24JaQ, uma cadeia homóloga humana, que é homóloga da cadeia Voí14Joí281 de murino está presente a 20 a 50 % nas células T CD4”/CD8“ do sangue periférico em dadores saudáveis (ver a literatura fora das patentes com a referência 6) . A α-galactosil-ceramida, que é um composto do ligando destas células TAN, induz a produção de citocina tanto de IFN-γ como de IL-4. Assim, tem sido demonstrado que a célula TAN é a célula reguladora para a diferenciação de Thl/Th2 (ver a literatura fora das patentes com a referência 7). Quando se administra α-galactosil-ceramida a ratos C57BL/6, inibe-se a produção de anticorpo IgE induzida por DNP-OVA e alúmen. Na mesma experiência, utilizando ratos em que se eliminaram as células TAN Vai4, não se inibiu a produção de anticorpo IgE (ver a literatura fora das patentes com a referência 8). Nas experiências em que se administrou o composto de α-galactosil-ceramida a ratos com NOD, um modelo de diabetes do tipo I, observou-se uma melhoria sintomática. Assim, tem sido sugerida a possibilidade de a célula TAN Val4 aumentar a resposta imunitária através das células Th2 (ver a literatura fora das patentes com a referência 9) . No entanto, o efeito obtido apenas com um composto de α-galactosil-ceramida é limitado e são necessárias melhorias adicionais da eficácia médica.

Enquanto isso, as substâncias de β-galactosil-ceramida e de β-glicosil-ceramida estão presentes in vivo, mas tem sido demonstrado que têm uma actividade muito inferior, em comparação com a imunopotenciação e os efeitos anti-tumorais do composto de α-galactosil-ceramida (ver a literatura fora das patentes com as referências 10 a 12 e o documento 1 das patentes). 4

Além disso, a célula TAN tem sido conhecida por servir eficazmente para as doenças auto-imunes (ver a literatura fora das patentes com as referências 13 a 16). Portanto, se as funções de imunossupressão, por exemplo, a produção de IL-10 nas células TAN, podem ser aumentadas selectivamente, pensa-se que sejam eficazes para o tratamento, não só de doenças alérgicas, mas também de outras doenças imunitárias, tais como as doenças auto-imunes e DHVE. No entanto, não se conhece nenhum ligando que, por si só, possa aumentar selectivamente a função imunossupressora da célula TAN. Nenhum lipossoma tem sido utilizado com essa finalidade.

Documento 1 das patentes: Publicação JP Hei-1-93562 A; Literatura fora das patentes 1: Immunopharmacology, 48: 307 (2000);

Literatura fora das patentes 2: Immunology, 99: : 179 (2000) ; Literatura fora das patentes 3: (J. Immunol., 158: 4137, 1997) r Literatura fora das patentes 4: Clin. Immunol., . 28, 1069 (1996) r Literatura fora das patentes 5: J. Immunol., 155, 2972, (1995); Literatura fora das patentes 6: J. Exp. Med., 182, 1163 (1995); Literatura fora das patentes 7 : Nakayama. T., et al.,

Int. Arch. Allergy Immunol., 124: 38-42 (2001); Literatura fora das patentes 8: J. Exp. Med., 190, 783-792 (1999);

Literatura fora das patentes 9: Nat. Med. 7, 1052-1056 (2001) ;

Literatura fora das patentes 10: Biochem. Biophys. Acta, 280, 626 (1972); 5

Literatura fora das patentes 11: Biochem. Biophys.

Acta, 316, 317 (1973);

Literatura fora das patentes 12: Biol. Pharm. Buli., 18, 1487 (1995);

Literatura fora das patentes 13: J. Exp. Med.,186: 677 (1997);

Literatura fora das patentes 14: (Eur. J. Iinmunol., 166, 62, 2001);

Literatura fora das patentes 15: J. Exp. Med.,194: 1801 (2001); e

Literatura fora das patentes 16: Nature, 413: 531 (2001).

Neste contexto, Berson et al. (Berson, J. F. et al., Perspectives in Drug Discovery and Design, 5, p. 169-180, 1996) descrevem a interacção da proteína do envelope do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 com lipossomas contendo galactosil-ceramida. Além disso, a patente norte-americana 4.416.872 descreve um tratamento para interromper o ciclo de vida do parasita da malária compreendendo a administração de lipossomas contendo o fármaco 8-amino-quinolina. Além disso, a patente WO 99/33475 Al descreve a utilização de glicolípidos, incluindo galactosil-ceramida e os seus receptores específicos para serem utilizados na terapêutica da diabetes. Além disso, Long et al. (Long, D. et al., Journal of Virology, 68 (9), p. 5890-5898) descrevem a caracterização da ligação do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1, gpl20, a lipossomas contendo galactosil-ceramida. Finalmente, a patente WO 03/009812 A2 descreve processos e composições para aumentar a imunogenicidade de um antigénio, num mamífero, compreendendo a administração do antigénio em conjunto com um adjuvante, incluindo glicosil-ceramida. 6

Constitui um objecto da presente invenção proporcionar um fármaco dirigido a células reguladoras in vivo, para doenças imunitárias, incluindo doenças alérgicas, doenças auto-imunes e doença do enxerto versus o hospedeiro.

Os requerentes verificaram que uma composição com um ligando de células reguladoras tal como compostos de β-galactosil-ceramida e α-galactosil-ceramida contidos num lipossoma têm uma acção indutivel das células T que produzem IL-10 e uma acção inibidora na produção do anticorpo IgE, que não é exercida por uma solução destes compostos isoladamente e é eficaz como um agente preventivo ou terapêutico para as doenças auto-imunes, tais como doenças alérgicas. Os requerentes também verificaram que uma composição com α-galactosil-ceramida contida num lipossoma pode inibir a diferenciação e a proliferação de células T patogénicas, aumentando selectivamente as funções imunossupressoras de células TAN e, portanto, é eficaz como um agente preventivo ou terapêutico para doenças auto-imunes e doença do enxerto versus hospedeiro e completaram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção está definida nas reivindicações. A FIG. 1 mostra os resultados obtidos em experiências in vitro de produção de citocinas em que se adiciona uma composição de Lipo-β ou outras composições de lipossomas ou uma solução salina a um sistema de cultura de CD DCllc+ de baço de ratinhos BALB/c. 0 eixo vertical mostra as concentrações das várias citocinas nos sobrenadantes da cultura, após a adição. A FIG. 2 mostra os resultados obtidos em experiências de produção de citocinas in vitro em que se adiciona uma 7 composição de Lipo-β ou outras composições de lipossomas ou uma solução salina, a um sistema de cultura de CD, DCllc+ de baço de ratinhos C57BL/6. 0 eixo vertical mostra as concentrações de várias citocinas nos sobrenadantes da cultura, após a adição; A FIG. 3 mostra os resultados obtidos em experiências in vitro de produção de citocinas em que se adiciona uma composição de Lipo-β ou outras composições de lipossomas ou uma solução salina a um sistema de cultura de CD, DCllc+ de baço de ratinhos BALB/c. 0 eixo vertical mostra as concentrações de IL-10 nos sobrenadantes da cultura, após a adição; A FIG. 4 mostra os resultados da medição da produção do anticorpo especifico DNP-OVA, no plasma, por ELISA. Administrou-se, a ratinhos BDF1, Lipo-β ou solução salina, em seguida imunizaram-se com OVA-DNP e alúmen e, a seguir deu-se um reforço apenas com DNP-OVA. 0 ensaio por ELISA foi realizado após a imunização primária e após o reforço. A FIG. 5 mostra os resultados da medição das concentrações de citocinas em sobrenadantes de cultura após a cultura de células DCllc+ obtidas a partir do baço de ratinhos BALB/c, 7 dias após a administração de Lipo-β ou de solução salina (controlo negativo) e células T DC4+ derivadas de ratos DO11.10 (ratinhos transgénicos transfectados com ΤΟΙοίβ especifico de OVA) na presença do péptido de OVA, durante 4 dias. A FIG. 6 mostra os resultados da medição dos títulos de anticorpos no sangue, no 14° dia após a imunização com DNP-OVA e alúmen, depois das células que proliferaram nas experiências da fig. 5 terem sido transferidas adoptivamente para ratinhos BALB/c. A FIG. 7 mostra os resultados da medição da produção de citocinas in vitro. Adicionou-se meio, uma solução aquosa de a-galactosil-ceramida (cx-GalCer) , uma composição de lipossomas como controlo (Lipo-(-)) ou um lipossoma contendo α-galactosil-ceramida (Lipo-a-CG) às culturas de células inteiras de baço (painéis superiores) e as células do baço às quais se tinha adicionado o anticorpo de neutralização anti-DCld ou em que se tinham eliminado as células TAN (painéis inferiores), em ratinhos C57BL/6. 0 eixo horizontal representa a concentração de cada citocina no sobrenadante da cultura, 2 dias após a adição. A FIG. 8 mostra os resultados da análise do número de células Val4-TAN no baço, por citometria de fluxo, 3 dias ou 7 dias após se ter administrada a solução salina, Lipo-(-) ou Lipo-aGC a ratinhos C57BL/6. 0 eixo horizontal e o eixo vertical representam a intensidade de fluorescência do anticorpo anti-TCR3 marcado com FITC e do tetrâmero DCld marcado com PE + a-GalCer, respectivamente. A FIG. 9 mostra os titulos dos anticorpos anti-NP-IgE, anti-NP-IgGl e anti-NP-IgG2a no sangue. Administrou-se solução salina, α-GalCer, Lipo-(-) ou Lipo-aGC a ratos C57BL/6 (painéis superiores) ou a ratos com deficiência do gene de IL-10 (painéis inferiores) que, após 3 dias, foram imunizados com OVA-DNP e alúmen e mediram-se os títulos após 14 dias. A FIG. 10 mostra os títulos dos anticorpos anti-DNP-IgE, anti-DNP-IgGl, anti-DNP-IgG2a e os níveis de IgE total, IgGl total e IgG2a total. Administrou-se solução salina, α-GalCer, Lipo-(-) ou Lipo-aGC a ratos BDF1, passados 3 dias (dia 0), que foram imunizados com OVA-DNP e alúmen e que levaram um reforço apenas com DNP-OVA no 55° dia. Mediram-se os títulos nos dias 0, 14, 55 e 64. A FIG. 11 mostra os resultados da medição da capacidade de proliferação celular pelo método MTT. Administrou-se 9 solução salina, α-GalCer, Lipo- (-) ou Lipo-aGC a ratinhos BDF1 e, após 3 dias, foram imunizados com OVA-DNP e alúmen. Após 7 dias, estimularam-se as células T CD4+ de baço e as células do baço inteiras irradiadas com uma radiação, de ratos BDF1 intactos. com NDP-OVA ou PMA/ionomicina. Passadas 48 horas, mediu-se a capacidade de proliferação celular. Na figura da esquerda, o eixo horizontal e o eixo vertical representam a concentração de OVA-DNP e a densidade óptica a um comprimento de onda de 570 nm, respectivamente. A FIG. 12 mostra os resultados da análise das células por citometria de fluxo. Administrou-se solução salina, a-GalCer, Lipo-(-) ou Lipo-aGC a murganhos BALB/c. Passados 3 dias, coraram-se as células do baço com anticorpo anti-CDllc e anticorpo anti-CD45RB. A FIG. 13 mostra o número de células CDllcbaix0CD45RBelevad0 e o número de células CDllcelevacl0CD45RBba;LX0 obtidos multiplicando a proporção entre o número de células obtido na análise de memória de citometria de fluxo na fig. 11 e o número de células completas do baço. A FIG. 14 mostra os resultados da medição das citocinas nos sobrenadantes da cultura. Administrou-se Lipo-aGC a ratos BALB/c. Passados 3 dias, as células CD11 cbalx0CD4 5RBelewacl° e as células CDllcelevad0CD45RBbalx0, separadas das células do baço, foram estimuladas com LPS. Passados 2 dias, analisaram-se os sobrenadantes da cultura. O eixo horizontal representa a concentração da citocina no sobrenadante da cultura. A FIG. 15 mostra os resultados da medição da capacidade de proliferação celular pelo método MTT. As células CDl lcbaixoCD95RBelevado ou as células CDllcelevadoCD45RBbaixo, pulsadas com o péptido OVA323-339 foram co-cultivadas com células T CD4+ derivadas de baço de rato DO11.10 e, passadas 48 horas, avaliou-se a capacidade de 10 proliferação celular. 0 eixo horizontal representa a densidade óptica a um comprimento de onda de 570 nm. A FIG. 16 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo utilizando o anticorpo anti-CD4 e o anticorpo anti-CD25, anticorpo anti-CD28, anticorpo anti-CD152 ou anticorpo anti-ICOS. Analisaram-se as células que proliferaram por co-cultura das células CD11 cbaixoCD4 5RBelevad0 ou as células CDllcelevacloCD45RBbaixo pulsadas com o péptido de OVA323-339 com as células T CD4 + derivadas de baço de rato DO11.10. A FIG. 17 mostra os resultados da análise da expressão de citocinas intracelulares por citometria de fluxo. Estimularam-se as células que proliferaram por co-cultura das células CDllcbaix0CD45RBelevad0 ou as células CDllcelevad0CD45RBbaix0 pulsadas com o péptido de OVA323-339 com células T CD4+ derivadas de baço de rato DO11.10 com PMA e ionomicina e analisaram-se por citometria de fluxo. Os painéis superiores representam os padrões de coloração intracelular pelo anticorpo correspondente de controlo do isotipo. Os painéis inferiores representam os padrões de coloração intracelular pelo anticorpo especifico da citocina. A FIG. 18 mostra os resultados da análise da expressão de citocina intracelular por citometria de fluxo. As células T CD4+ de baço de rato BDF1, a que se administrou Lipo-oíGC-ou Lipo-oíGC + OVA, foram cultivadas in vivo com células de baço do mesmo BDF1, irradiadas com uma radiação, na presença de OVA e, passados 6 dias, estimularam-se as células da cultura com PMA e ionomicina. Os painéis superiores representam os padrões de coloração intracelulares de células T CD4+ do baço do rato a que se administrou Lipo-aGC e os painéis inferiores representam o padrão de coloração intracelular 11 de células T CD4+ do baço do rato a que se administrou Lipo-cxGC + OVA. A FIG. 19 mostra os títulos dos anticorpos anti-DNP-IgE, anti-DNP-IgGl, anti-DNP-IgG2a (painéis superiores) e os níveis de IgE total, IgGl total e IgG2a total (painéis inferiores) no sangue. Imunizaram-se ratos BDF1 com OVA-DNP e alúmen, nos dias 21, 28 e 35, administrou-se apenas lipossoma (veículo) , Lipo-cxGC ou Lipo-aGC + OVA e, em seguida, no 42° dia, deu-se um reforço aos ratos apenas com o antigénio de DNP-OVA. No 48° dia, avaliaram-se os anticorpos. * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,001.

Neste documento, "células reguladoras" incluem mas não se limitam a células TAN (células T assassinas naturais), células Trl que produzem IL-10 e células dendríticas (CD) e, entre elas, é particularmente preferida a célula TAN.

Um "ligando das células reguladoras" não está particularmente limitado desde que o ligando esteja ligado a um receptor da superfície celular da célula reguladora anterior para facilitar a diferenciação/proliferação ou a activação da célula reguladora e inclui o que se segue, mas, o ligando da célula reguladora não está limitado: (i) Galactosil-ceramidas tais como substâncias de oí-galactosil-ceramida e β-galactosil-ceramida que são os ligandos das células TAN. (ii) Vitamina D3, dexametasona, FCT-β e IL-10 que servem para a diferenciação/proliferação de células dendríticas (CD) reguladoras. (iii) Substâncias que induzem a expressão de IL-10 ou de FoxP3 que servem para a diferenciação/proliferação de células T reguladoras. 12

Um "agente indutor de células reguladoras" refere-se a um medicamento que induz a diferenciação/proliferação ou a activação das células reguladoras. A facilitação da diferenciação/proliferaçao ou da activação das células reguladoras pode ser identificada, por exemplo, como descrito nos exemplos, utilizando CD CDllc+ de baço e medindo a proliferação das células TAN ou das células Trl, que produzem a IL-10, nelas contidas ou quantificando as citocinas (IFN-γ, IL-10, IL-4) produzidas por células TAN e células Trl que produzem IL-10.

Como "lipossomas contendo ligandos de células reguladoras" preferem-se aqueles que induzem as células TAN e as células Trl que produzem IL-10 que são células reguladoras, possuindo ainda actividade para suprimir a activação de células T auxiliares e tendo uma acção inibidora na produção do anticorpo IgE libertado a partir de células B. Especificamente, são preferíveis os que contêm o "ligando de células reguladoras" como o anterior, no lipossoma e, entre eles, uma composição incluindo a-galactosil-ceramida ou β-galactosil-ceramida, numa membrana lipídica dupla do lipossoma. 0 "lipossoma contendo o ligando das células reguladoras" pode conter dois ou mais "ligandos de células reguladoras". 0 "lipossoma contendo o ligando de células reguladoras" pode ainda conter ligandos da família dos RST (receptores semelhantes a Toll, TRL em inglês) para além do ligando das células reguladoras. A adição dos ligandos da família dos RST pode aumentar a produção de citocinas que regulam a acção das "células reguladoras" e aumentar ainda mais o efeito. Os ligandos da família dos RST incluem o oligonucleótido CpG (CpGODN) e imiquimod (l-(2-metil-propil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina). 13 0 "lipossoma contendo o "ligando das células reguladoras" também pode conter alergenos. Alergeno refere-se a substâncias que causam a alergia e inclui, de preferência, um antigénio de pólen e um antigénio de ácaros. 0 alergeno inclui, especificamente, OVA (ovalbumina). A presente invenção providencia o lipossoma em que kRN7000 tenha sido incorporado como uma substância macromolcecular solúvel em água. Neste documento, uma dessas substâncias com uma estrutura vesicular onde tenha sido encerrada uma micela (particula solúvel em água obtida através da agregação de moléculas anfipáticas incluindo uma região hidrofilica e uma região hidrofóbica) é referida como o lipossoma. Um componente de lipossoma pode ser qualquer um desde que seja a molécula antipática que pode formar a micela por processos conhecidos e, de preferência, inclui lipidos. 0 lipido, na presente invenção, inclui fosfolipidos, tais como dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleilfosfatidilcolina (DOPC) e dioleilfosfatidil-etanol-amina (DOPE), esfingoglicolipidos e gliceroglicolipidos. São usados para produzir o lipossoma, sozinho ou em combinação de dois ou mais ou em combinação com um derivado de lipido em que uma substância não-polar, tal como o colesterol ou um polimero solúvel em água, tal como o polietileno-glicol tenha sido ligado ao lipido. 0 lipossoma pode ser preparado de acordo com processos conhecidos publicamente. Por exemplo, podem utilizar-se os processos descritos em Liposome Technology, vol. 1, 2a edição (por Gregory Gregoriadis (CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, Londres, Tóquio), capitulo 4, p 67-80, capitulo 10, p 167-184 e capitulo 17, p 261-276 (1993)). Mais especificamente, os processos incluem, mas não se limitam a 14 um processo de aplicação de ultrassons, um processo de injecção de etanol, um processo de prensa francesa, um processo de injecção de éter, um processo de ácido eólico, um processo de fusão de cálcio, um processo de liofilização e um processo de evaporação de fase inversa. 0 tamanho do lipossoma da presente invenção não está particularmente limitado e normalmente é, de preferência, de 100 a 200 nm e, mais preferivelmente, de 100 a 150 nm, em média. A estrutura do lipossoma não está particularmente limitada e pode ser qualquer lipossoma tal como unilamelar e multilamelar. Como solução encapsulada no interior do lipossoma, é possivel utilizar tampão e solução salina e outras, para além da água. É também possivel adicionar um dissolvente orgânico solúvel em água (por exemplo, glicerina), numa quantidade apropriada e usá-lo. 0 lipossoma utilizado para o fármaco da presente invenção pode ser um que se obtenha por modificação da superfície do lipossoma para direccionar o "lipossoma contendo o ligando de células reguladoras" para um sítio-alvo. 0 sitio-alvo inclui, por exemplo, o fígado, o baço, os nódulos linfáticos, a medula óssea, o pulmão, os olhos, a pele e o nariz. A substância que modifica a superfície do lipossoma inclui compostos de baixo peso molecular, compostos de elevado peso molecular, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas e cadeias de açúcar. O composto de elevado peso molecular inclui polietileno-glicol (ver patente No. 2.948.246). O ácido nucleico inclui, por exemplo, ARN de hélice simples e ADN de hélice simples que reconhecem RST-7 ou RST-9 do receptor semelhante a Toll na célula-alvo e derivados destes ácidos nucleicos. A proteína inclui, por exemplo, anticorpos e receptores que reconhecem as 15 moléculas expressas especificamente na superfície das células-alvo, tais como as células dendríticas (CD) que são células que apresentam o antiqénio ou células precursoras destas. A modificação com a cadeia de açúcar inclui a modificação com um lípido ligado a manose que pode estar ligado a um receptor de manose, expressos na superfície das CD (por exemplo, ver Copland, M. J., et al., (2003) Liposome delivery of antigen to human dendritic cells, Vaccine, 21: 883-890). A inclusão do ligando no lipossoma pode ser realizada por processos comuns. Por exemplo, como se mostra nos exemplos, o lipossoma contendo o ligando das células reguladoras pode ser obtido por dissolução separada do componente do lipossoma e do ligando no dissolvente orgânico, misturando-os e adicionando-lhes água. Mas o processo para produzir o lipossoma contendo o ligando das células reguladoras não está limitado ao descrito antes. O "lipossoma contendo o ligando das células reguladoras" pode ser usado como o princípio activo do fármaco.

Isto é, o medicamento da presente invenção é eficaz como agente preventivo ou agente terapêutico para as doenças alérgicas causadas pelo anticorpo IgE porque o "lipossoma contendo o ligando das células reguladoras" induz as células TAN ou as células Trl produtoras de IL-10, que são as células reguladoras, tem actividade para suprimir a activação das células T auxiliares e tem acção inibidora na produção do anticorpo IgE libertado das células B. O anticorpo IgE está particularmente e profundamente associado com as doenças alérgicas e assim, suprimindo a sua produção (secreção), é possível obter o 16 efeito preventivo ou terapêutico nas doenças alérgicas do tipo I. As doenças alérgicas associadas com o anticorpo IgE incluem asma brônquica atópica, dermatite atópica e alergia nasal, tal como rinite alérgica e polinose. Na presente invenção, a prevenção da doença alérgica abrange não só a isenção de animais mamíferos, incluindo seres humanos, de terem a doença alérgica, mas também fazem com que os doentes (animais mamíferos, incluindo seres humanos) com doença alérgica, que não tenham tido o sintoma, fiquem temporariamente livres do sintoma. 0 fármaco também é eficaz como agente preventivo ou agente terapêutico para uma doença, tal como hepatite fulminante, porque o "lipossoma contendo o ligando de células reguladoras" tem a acção de suprimir a activação das células T. 0 fármaco contendo o lipossoma contendo a-galactosil-ceramida como princípio activo é eficaz como fármaco com uma capacidade imunossupressora porque o lipossoma contendo α-galactosil-ceramida tem o efeito de aumentar selectivamente a função imunossupressora das células TAN. Especificamente, o fármaco é eficaz como um fármaco para doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico e doenças do colagénio e como fármaco para a rejeição após transplante, tal como DHVE. A α-galactosil-ceramida não está particularmente limitada desde que esteja ligada ao receptor de superfície da célula TAN para aumentar selectivamente a função imunossupressora da célula TAN, mas está preferivelmente ligada ao receptor composto por Voí24JoíQ em seres humanos ou 17

Val4Ja281 em ratos. Por isso, o peso molecular é, de preferência, de 400 a 2.000.

Enquanto isso, o peso molecular da β-galactosil-ceramida é, de preferência, de 400 a 2.000.

Tal como noutra modalidade de realização da presente invenção, providencia-se o fármaco compreendendo o lipossoma contendo imiquimod como principio activo. Por conter imiquimod no lipossoma, as quantidades de produção de IL-10 e IFNa aumentam, activando assim as células TAN, em comparação com o caso de utilização de imiquimod sozinho. Portanto, o fármaco que compreende o lipossoma contendo imiquimod como princípio activo é útil para a prevenção ou o tratamento das doenças alérgicas, tal como descrito antes.

Para uma via de administração do fármaco da presente invenção, o fármaco pode ser administrado tanto por via oral como parentérica e eventualmente a via é seleccionada por um médico. O "lipossoma contendo o ligando das células reguladoras" como princípio activo pode ser administrado sozinho ou em combinação com um veículo normalmente utilizado.

Quando o fármaco da presente invenção é administrado por via oral, uma forma do fármaco inclui formulações sólidas tais como comprimidos, comprimidos revestidos, agentes em pó, grânulos, cápsulas e pílulas, formulações líquidas, tais como agentes líquidos (por exemplo, gotas oculares, gotas nasais), suspensão, emulsão e xarope, produtos de inalação, tais como agentes de aerossóis, atomizadores e nebulizadores e agentes de inclusão de lipossomas. 18

Quando o fármaco da presente invenção é administrado parentericamente, a forma de fármaco inclui agentes injectáveis (agentes liquidos, suspensões) utilizados para injecção intravenosa, injecção subcutânea e injecção intramuscular, agentes liquidos, suspensões, emulsões e agentes de gotejamento.

Quando o fármaco da presente invenção é uma formulação liquida, o fármaco pode ser armazenado no estado congelado ou liofilizado, por eliminação da água. Adiciona-se água destilada injectável à formulação liofilizada para dissolver novamente a formulação antes da sua utilização.

Como veiculos, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, utilizados para o fármaco da presente invenção, é possivel exemplificar ligantes, desintegrantes, agentes tensioactivos, aceleradores de absorção, agentes de retenção da humidade, absorventes, lubrificantes, agentes de enchimento, aditivos, agentes que conferem humidade, conservantes, estabilizantes, emulsionantes, agentes solubilizantes, sais que controlam a pressão osmótica, agentes de diluição tais como tampões e excipientes normalmente utilizados, dependendo da forma de utilização da formulação. Eventualmente, seleccionam-se e utilizam-se consoante a dose unitária da formulação resultante.

Adicionalmente, podem estar contidos no fármaco da presente invenção agentes corantes, agentes conservantes, perfumes, aromatizantes e edulcorantes e outros produtos farmacêuticos, conforme necessário, para os preparar como agentes.

Uma quantidade eficaz do "lipossoma contendo o ligando de células reguladoras" pode ser facilmente determinada 19 pelos especialistas na matéria com referência à técnica convencional e é, por exemplo, de cerca de 0,1 a 100 mg por 1 kg de peso corporal e, de preferência, cerca de 1 a 10 mg e pode ser administrada dividindo-a em 1 a 3 vezes por dia. É preferível, eventualmente, regular a dose consoante a forma de cada formulação, o género, a idade e o estado clínico do doente.

EXEMPLOS A presente invenção será descrita com referência aos exemplos que se seguem, mas a presente invenção não está limitada a estes exemplos e não é necessário dizer que se podem fazer as mudanças habituais na técnica da presente invenção.

Exemplo 1 (exemplo comparativo) <Preparação do lipossoma contendo o ligando e medição da actividade> 1. Preparação do lipossoma contendo β-galactosil-ceramida (Lipo-β)

Dissolveu-se L-oí-fosfatidiletanolamina, dioleoílo (DOPE; Wako Pure Chemical #166-16183, 0,77 mg), 0,83 mg de cloridrato de 3β-Ν-(dimetilaminoetil)carbonato de colesterilo (DC-Chol; SIGMA-Aldrich) e 0,029 mg de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(poli-etileno-glicol)-2000] (AVANTI POLAR-LIPIDS, INC. #i88653) em 250 pL do dissolvente clorofórmio/metanol (1:1). Dissolveu-se separadamente β-galactosil-ceramida (β-D-galactósido de ceramida; Sigma-Aldrich #C4905, 0,16 mg) em 250 pL do dissolvente clorofórmio/metanol (1:1). 20

Misturaram-se ambos e evaporaram-se utilizando um evaporador e, subsequentemente secou-se durante a noite num exsicador, sob vácuo. Em seguida, adicionou-se 800 yL de água, tratou-se a mistura com ultrassons durante um minuto, em seguida seleccionaram-se os tamanhos das particulas por filtração com pressão usando uma extrusora (AVESTIN; LiposoFast-Basic) e esterilizaram-se as particulas com uma membrana com uma dimensão de poro de 0,22 ym. Esta composição de lipossoma (Lipo-β) foi ajustada para uma concentração final de 200 yL/mL. Pelo mesmo processo, preparou-se uma composição de lipossomas não contendo nenhuma β-galactosil-ceramida (Lipo-0). Transformou-se o produto eluido, recolhido através de uma coluna de precipitação por salificação NAP-10, após misturar o oligonucleótido CpGODN (1668) (fornecido pela SIGMA Genosis) com Lipo-β, numa proporção em peso de 5:1, em Lipo^-CpG. 2. Preparação de lipossoma contendo imiquimod

Dissolveu-se L-a-fosfatidiletanolamina, dioleoilo (DOPE; Wako Pure Chemical #166-16183, 0,77 mg), 0,83 mg de cloridrato de 3β-Ν-(dimetilaminoetil)carbonato de colesterilo (DC-Chol; SIGMA-Aldrich) e 0,029 mg de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(poli-etileno-glicol)-2000] (AVANTI POLAR-LIPIDS, INC. #i88653) em 250 yL do dissolvente clorofórmio/metanol (1:1). Dissolveu-se separadamente imiquimod (Sequoia Research Products Ltd.; SRP0058Í, 0,16 mg) em 250 yL de dissolvente de clorofórmio/metanol (1:1). Misturaram-se ambos e evaporaram-se utilizando um evaporador e, subsequentemente, secou-se durante a noite num exsicador, sob vácuo. Em seguida, adicionou-se 800 yL de água, tratou-se a mistura com ultrassons durante um minuto, em seguida seleccionaram- 21 se os tamanhos das partículas por filtração com pressão usando uma extrusora (AVESTIN; LiposoFast-Basic) e esterilizaram-se as partículas com uma membrana com uma dimensão de poro de 0,22 ym. Esta composição de lipossoma (Lipo-Imq) foi ajustada para uma concentração final de 200 yL/mL. Pelo mesmo processo que se utilizou na composição anterior, preparou-se uma composição de lipossomas (lipo-Imq^GC) contendo β-D-galactósido-ceramida (Sigma-Aldrich # C4905). Transformou-se o produto eluído, recolhido através de uma coluna de precipitação por salificação NAP-10 após misturar o oligonucleótido CpGODN (1668) (fornecido pela SIGMA Genosis) com Lipo-Imq, numa proporção em peso de 5:1, em Lipo-Imq-CpG. 3. Medição da actividade in vitro do lipossoma contendo o ligando para as células dendríticas (CD)

Injectou-se colagenase D (1 mg/mL, Roche) em baço de ratos BALB/c ou C57BL/6, que em seguida foi incubada numa incubadora de C02 durante 45 minutos. Em seguida, recolheram-se as células do baço, fez-se uma suspensão em 3 mL de HistoDenz (14,1 %, Sigma) e, em seguida, sobrepôs-se X-Vivo 15 (Takara Bio) contendo 2-mercaptoetanol (2ME) 50 μΜ. Após centrifugação a 1.500 rpm durante 5 minutos, colheram-se as células de uma camada intermédia e incubaram-se em meio X-VIVO 15 contendo 2ME 50 μΜ, soro de vitelo fetal a 0,5 % e 20 ng/mL de rmGM-CSF (Pharmingen) , na incubadora de C02 durante uma hora e meia. Depois de uma pipetagem suave, as células em suspensão foram removidas, adicionou-se o meio X-Vivo 15 contendo 2ME 50 μΜ, soro de vitelo fetal a 0,5 % e 20 ng/mL de rmGM-CSF (Pharmingen) e incubaram-se as células, na incubadora de C02 durante 18 horas. Recolheram-se as células em suspensão e recolheram-se as células ligadas a micropérolas (Miltenyi) magnéticas 22 de anticorpo anti-CDllc para restituir as CD CDllc+ de baço. Fez-se uma suspensão de 1 x 104 células CD CDllc+ em 200 pL de meio RPMI contendo soro de vitela fetal a 10 %, numa placa microtituladora de 96 poços, de fundo redondo, adicionou-se a composição de lipossoma a uma concentração final de 1 pg/mL e incubou-se a placa na incubadora contendo C02 a 5 %, a 37 °C. Após 48 horas, recolheram-se os sobrenadantes da cultura e mediram-se os niveis de IFN-a, IL-10 e IL-12, por ELISA (FIGS. 1 e 2). Os niveis de IL-10 e de IFN-α eram elevados enquanto os niveis de IL-12 eram baixos nos grupos de Lipo-β e de Lipo-Imq.

Inversamente, nos grupos de Lipo^-CpG e lipo-Imq-CpG, os niveis de IL-10 e de IFNoí eram baixos enquanto os niveis de IL-12 eram elevados. Enquanto isso, no grupo sem adição (controlo), os grupos da solução de Lipo-0 e de β-galactosil-ceramida (β-GalCer), não se detectou a produção de todas as citocinas ou a produção foi muito baixa. No mesmo processo de avaliação, mediram-se, os níveis de produção de IL-10 nas CD CDllc4" por Lipo-Imq^GC. Como resultado, verificou-se que Lipo-Imq^GC induziu a produção de IL-10 em níveis muito mais elevados do que Lipo-β sozinho ou Lipo-Imq sozinho (FIG. 3).

Exemplo 2 (exemplo comparativo) <Efeito inibidor de Lipo-β na produção do anticorpo IgE in vi vo>

Injectou-se, intraperitonealmente, Lipo-β (2 pg/rato) em ratinhos BDF1 (5 ratinhos/grupo) , após 7 dias (dia 0), ratos que tinham sido antes imunizados primariamente com 0,1 pg de DNP-OVA (Cosmobio) e 10 mg de alúmen. No 14° dia após a imunização primária, colheu-se sangue do plexo venoso orbital e mediram-se, por ELISA (14° dia na FIG. 4), 23 os títulos dos anticorpos anti-DNP-IgGl, anti-DNP-IgE e anti-DNP-IgG2a no plasma. Deu-se um reforço aos ratos apenas com DNP-OVA no 35° dia após a imunização primária e, 7 dias depois, mediram-se, por ELISA (42° dia na FIG. 4) os títulos dos anticorpos anti-DNP-IgGl e anti-DNP-IgE no plasma do sangue recolhido do plexo venoso orbital. No grupo do Lipo-β, no 14° dia, a produção do anticorpo IgG e do anticorpo IgE tendeu já a ser inibida e, no 42° dia, o aumento do anticorpo IgG e do anticorpo IgE foi completamente inibido após a imunização de reforço.

Exemplo 3 (exemplo comparativo) cindução das células T reguladoras por meio de células dendríticas (CD) derivadas de ratos a que se administrou Lipo-p>

1. Avaliação da capacidade de activação in vitro de células T

Administrou-se, intraperitonealmente, Lipo-β ou solução salina (2 yL/ratinho) a ratinhos BALB/c e, após 7 dias, o baço foi removido. Injectou-se colagenase D (1 mg/mL, Roche) no baço, que foi então incubado na incubadora de CO2 durante 45 minutos. Em seguida, recolheram-se as células do baço, fez-se uma suspensão em 3 mL de HistoDenz (14,1 %, Sigma) e, em seguida, sobrepôs-se X-Vivo 15 contendo 2-mercaptoetanol (2ME) 50 μΜ. Após centrifugação a 1.500 rpm durante 5 minutos, colheram-se as células de uma camada intermédia e incubaram-se em meio X-VIVO 15 contendo 2ME 50 μΜ, soro de vitelo fetal a 0,5 % e 20 ng/mL de rmGM-CSF (Pharmingen), na incubadora de CO2 durante uma hora e meia. Depois de uma pipetagem suave, as células em suspensão foram removidas, adicionou-se o meio 24 X-Vivo 15 contendo 2ME 50 μΜ, soro de vitelo fetal a 0,5 % e 20 ng/mL de rmGM-CSF (Pharmingen) e incubaram-se as células na incubadora de CO2 durante 18 horas. Recolheram-se as células em suspensão e recolheram-se as células ligadas a micropérolas (Miltenyi) magnéticas de anticorpo anti-CDllc para restituir as CD CDllc+ do baço. As células T CD4+ foram recolhidas de TCRaP específicos de OVA de ratos transgénicos DO11.10 (oferecidos pelo Dr. Toshinori Nakayama, Graduate School of Medicine, Chiba University, Science, 1990, vol 250, p 1720), utilizando micropérolas magnéticas de anticorpo (Miltenyi) . Em seguida, fez-se uma cultura de células DC CDllc+ a 2 x 104 e células T CD4+ a 1 x 105, na presença do péptido de OVA, na incubadora de CO2, durante 4 dias, em seguida, recolheu-se o sobrenadante da cultura e mediram-se, por ELISA, os níveis de IFNy, IL-4 e IL-10 (FIG. 5) . Como resultado, quando se utilizaram CD do baço do rato a que tinha sido administrado Lipo-β e quando se utilizaram CD do baço de ratos a que se tinha administrado solução salina (normal) , não se observaram diferenças nos níveis de produção de IL-4 e de IFN-γ. No entanto, observou-se a produção de IL-10 apenas para concentrações do péptido de OVA de 3 nM e 30 nM, quando se utilizaram CD do baço do rato a que se tinha administrado Lipo-β. Simultaneamente, também se identificou a proliferação das células reguladoras. 2. Avaliação do efeito inibidor na produção do anticorpo IgE in vivo, pelo processo de transferência adoptiva

Recolheram-se células T CD4+ de DO11.10 que tinham proliferado a concentrações do péptido de OVA de 3 nM ou 30 nM e as CD do baço do rato a que se tinha administrado Lipo-β na experiência 1 anterior e transferiram-se, intraperitonealmente, para murganhos BALB/c (3 ratos/ 25 grupo). Após uma hora, os ratinhos foram imunizados primariamente com DNP-OVA (10 pg) e alúmen (10 mg) e, no 14° dia, colheu-se o sangue a partir do plexo orbital venoso. Mediram-se os titulos dos anticorpos anti-DNP-IgGl, anti-DNP-IgE e anti-DNP-IgG2a, no plasma, por ELISA (FIG. 6). Como resultado, a produção do anticorpo IgE foi completamente inibida nos ratos em que as células T CD4+ de DO11.10 cresceram pela estimulação do péptido de OVA a 3 nM terem sido transferidas adotivamente. Entretanto, o efeito inibidor na produção do anticorpo IgE foi baixo nos ratos em que as células T CD4+ de DO11.10 cresceram pela estimulação do péptido de OVA a 30 nM terem sido adotivamente transferidas. A inibição da produção dos anticorpos IgGl e IgG2a não foi notável em ambos os grupos. Exemplo 4 <Preparação do lipossoma contendo o ligando e medição da actividade> 1. Preparação do lipossoma contendo a-galactosil-ceramida

Dissolveu-se L-a-fosfatidiletanolamina, dioleoilo (DOPE; Wako Pure Chemical # 166-16183, 0,77 mg) e 0,83 mg

de cloridrato de 3β-Ν-(dimetilaminoetil)carbonato de colesterilo (DC-Chol; Sigma-Aldrich # C2832) em 250 pL do dissolvente de clorofórmio/metanol (1:1). Dissolveu-se, separadamente, α-galactosilo-ceramida (0,16mg, fornecida pelo RIKEN Research Center for Allergy and Immunology; KRN7000, ver panfleto da publicação internacional WO 98/44928) em 250 pL do dissolvente clorofórmio/metanol (1:1). Misturaram-se ambos e evaporaram-se utilizando um evaporador e, subsequentemente, secou-se durante a noite, num exsicador, sob vácuo. Em seguida, adicionou-se 800 pL 26 de água, tratou-se a mistura com um pulverizador de ultrassons durante um minuto e passou-se através de uma membrana com uma dimensão de poro de 0,22 pm para a esterilização. Esta composição do lipossoma (Lipo-aGC) foi ajustada para uma concentração final de 200 pL/mL. Pelo mesmo processo preparou-se uma composição de lipossoma não contendo nenhuma α-galactosil-ceramida (Lipo-(-)) para controlo.

2. Medição da produção de citocinas por Lipo-aGC

Fez-se uma suspensão de células inteiras de baço, a 2 x 105, de ratos C57BL/6, em 200 pL de meio RPMI contendo soro fetal de vitelo (SFV) a 10 % ao qual se tinha adicionado 100 ng/mL de Lipo- (-), Lipo-aGC ou uma solução aquosa de a-galactosil-ceramida (α-GalCer) , em seguida, adicionou-se a suspensão celular a uma placa de cultura de fundo em U, de 96 poços e fez-se uma cultura na incubadora contendo CO2 a 5 %, a 37 °C, durante 2 dias. Mediram-se, por ELISA (figura 7 painéis superiores) , os niveis de IFN-γ, IL-4 e IL-10 produzidos no sobrenadante da cultura. Os niveis de IFN-γ e IL-4 foram equivalentes no grupo de Lipo-aGC e no grupo de aGalCer, mas o nivel de IL-10 no grupo de Lipo-α foi 5 vezes mais elevado do que no grupo de a-GalCer. Quando se realizaram as mesmas experiências na presença do anticorpo de neutralização anti-CDld (1B1, BD Bioscience PharMingen) , a uma concentração final de 10 pg/mL ou usando células completas de baço a partir de ratos deficientes em células Val4-NKT (C57BL/6 iniciais), não se detectaram IFN-γ, IL-4 e IL-10 no sobrenadante da cultura (fig. 7, painéis inferiores). 27

3. Avaliação da capacidade de proliferação celular de Val4-TAN por Lipo-aGC

Administrou-se, intraperitonealmente, Lipo-aGC (2 yg/ratinho) ou Lipo-(-) ou uma solução salina como controlo, a murganhos C57BL/6. No 3o dia (dia 3) e no 7o dia (dia 7), coraram-se as células do baço com o tetrâmero aGalCer/CDld e anticorpo 3η^-]30Τβ e analisou-se o número de células duplamente positivas (células Val4-TAN) , por citometria de fluxo. Como resultado, identificou-se o número de células Val4-TAN no baço do rato, 3 dias após a administração de Lipo-α, que tinha aumentado 2 vezes ou mais, em comparação com o do baço a que se tinha administrado uma solução salina, mas, no 7o dia, o número foi reduzido inversamente, em comparação com o dos ratos de controlo (fig. 8).

Exemplo 5 <Efeito inibidor de Lipo-aGC na produção do anticorpo in vivo> 1. Avaliação da actividade no sistema de produção de anticorpos in vivo utilizando ratos C57BL/6 e ratos deficientes em IL-10

Administrou-se, intraperitonealmente, solução salina, α-GalCer, Lipo-(-) ou Lipo-aGC (2 yg/rato) a ratos C57BL/6 (5 ratos/grupo) e, passados 3 dias, imunizaram-se primariamente com OVA-DNP e alúmen. No 14° dia após a imunização primária, colheu-se sangue do plexo venoso orbital e mediram-se, por ELISA, os títulos dos anticorpos anti-DNP-IgGl, anti-DNP-IgE e anti-DNP-IgG2a no plasma. Como resultado, o efeito inibidor na produção de 28 anticorpos, no grupo do Lipo-aGC, tendeu a ser superior ao do grupo α-GalCer para todos os isotipos examinados (fig. 9 painéis superiores). Realizou-se a mesma experiência utilizando ratos deficientes em IL-10 com antecedentes de C57BL/6. Como resultado, não se observou nenhum efeito inibidor na produção de anticorpos (fig. 9 painéis inferiores). 2. Avaliação da actividade no sistema de produção de anticorpos in vivo utilizando ratos BDF1

Administrou-se, por via intraperitoneal, solução salina, α-GalCer, Lipo- (-) ou Lipo-aGC (2 yg/rato) a ratos BDF1 (C57BL/6 x DBA/2F1) (5 ratos/grupo) , após 3 dias (dia 0), que foram imunizados primariamente com OVA-DNP e alúmen e depois deu-se um reforço aos ratos apenas com DNP-OVA no 55° dia (dia 55) após a imunização primária. Nos dias 0, 14, 55 e 64, colheu-se o sangue do plexo venoso orbital e mediram-se, por ELISA, os títulos dos anticorpos anti-DNP-IgE, anti-DNP-IgGl, anti-DNP-IgG2a e os níveis de IgE total, IgGl total e IgG2a total no plasma. Como resultado, identificou-se que o aumento dos títulos de anticorpos de todos os isotipos anti-DNP e a produção de IgE total foram quase completamente inibidos no grupo de Lipo-aGC (fig. 10) . Enquanto isso, as alterações de IgGl total e IgG2a total foram quase equivalentes no grupo de Lipo-aGC e no grupo de α-GalCer ou no grupo de Lipo-(-) (fig. 10). 3. Avaliação da capacidade de activação das células T utilizando ratos BDF1

Administrou-se, intraperitonealmente, solução salina, α-GalCer, Lipo-(-) ou Lipo-aGC (2 yg/rato) a ratos BDF1 e, após 3 dias, foram imunizados primariamente com OVA-DNP e 29 alúmen. Passados 7 dias, o baço foi removido e prepararam-se células T CD4+ utilizando micropérolas magnéticas (Miltenyi). Subsequentemente, as células que apresentam antigénios foram preparadas por irradiação de células completas do baço de ratos normais BDF1 com uma radiação de 20 Gy. As células T CD4 + , a 2 x 101 2 e as células que apresentam antigénios, a 2 xlO2, pulsadas com DNP-OVA em suspensão em 200 pL do meio, foram colocadas num poço de uma placa de cultura de fundo em U de 96 poços e fez-se a sua cultura na incubadora contendo CO2 a 5 %, a 37 °C. Passadas 48 horas, analisou-se a proliferação celular pelo processo MTT (Promega #G4000). Como resultado, as células T CD4+, derivadas do baço do rato a que se tinha administrado Lipo-aGC não proliferaram em resposta a DNP-OVA, em todas as concentrações examinadas, enquanto outras células T CD4+ proliferaram imensamente na ordem da α-GalCer, da solução salina e de Lipo- (-) (fig. 11 painel da esquerda). Por outro lado, quando as células T CD4+, a 2 x 102 foram estimuladas não especificamente em relação ao antigénio, com 50 ng/mL de 3-acetato de 12-miristato de forbol (PMA; Sigma-Aldrich # P-1585) e ionomicina 500 nM (Sigma-Aldrich, # 1-0634) na incubadora de CO 2 contendo 5 % C02, a 37 °c, durante 48 horas, as células T CD4 + derivadas do rato a que se tinha administrado Lipo- -aGC exibiram uma resposta proliferativa inferior, mas significativa, em comparação com outras células T CD4+ (fig. 11, painel da direita). 30 1

Análise de células dendriticas (CD) no baço de ratos a que se tinha administrado Lipo-aGC 2 4-1. Análise por citometria de fluxo

Administrou-se, intraperitonealmente, solução salina, α-GalCer, Lipo-(-) ou Lipo-aGC (2 pL/rato) a ratos BALB/c e, após 3 dias, o baço foi removido. Injectou-se colagenase D (1 mg/mL, Roche) no baço, que foi então incubado na incubadora de CO2 durante 45 minutos. Em seguida, recolheram-se as células do baço, fez-se uma suspensão em 3 mL de HistoDenz (14,1 %, Sigma-Aldrich) e, em seguida, sobrepôs-se meio X-Vivo 15 (CAMBREX Bio Science Walkerville, Inc.) contendo 2-mercaptoetanol (2ME) 50 μΜ. Após centrifugação, a 1.500 rpm, durante 5 minutos, recolheram-se as células da camada intermédia. As células foram lavadas com meio X-VIVO 15 contendo 2ME 50 μΜ e SFV a 10 % e fez-se uma suspensão em solução salina tamponada com fosfato (STF) contendo SFV a 0,5 %. Adicionaram-se os anticorpos anti-CD3, -CDllb, -CD19, -CD49b, -Gr-1, -TER-119 e -B220 (todos da BD Bioscience Pharmingen) à suspensão de células. As células foram incubadas, a 10 °C, durante 20 minutos, em seguida lavaram-se, uma vez, com STF contendo SFV a 0,5 % e, subsequentemente, adicionaram-se pérolas magnéticas conjugadas com estreptoavidina (SA) (Miltenyi). As células foram incubadas a 10 °C, durante 15 minutos, subsequentemente lavaram-se, duas vezes, com STF contendo SFV a 0,5 % e, em seguida, recolheram-se as células negativas das micropérolas magnéticas utilizando uma coluna de separação de micropérolas e um iman (Miltenyi) . As células resultantes foram coradas com o anticorpo anti-CDllc marcado com PE (BD Pharmingen Bioscience) e o anticorpo anti-CD45RB marcado com APC (BD Pharmingen Bioscience) e analisaram-se por citometria de fluxo. Como resultado, nas células derivadas do baço do rato a que se tinha administrado Lipo-aGC, a proporção de células CD45RBelevad0CDllcbaix0 era superior à taxa de células CD45RBbaix0CDllcelevad0, enquanto a proporção estava invertida nas células derivadas de ratos a que se tinha administrado solução salina, Lipo-(-) ou α-GalCer (fig. 12). As proporções foram comparadas em termos de número de células 31 no baço. Como resultado, demonstrou-se que o número de células CD45RBelevad0CDllcbaix0 no baço do rato a que se tinha administrado Lipo-aGC aumentou cerca de 3 vezes em relação ao número de células correspondentes no baço do rato a que se tinha administrado α-GalCer enquanto, inversamente, o número de células CD4 5RBbaix0CDllcelevad0 aumentou no rato a que se tinha administrado α-GalCer mais do que no rato a que se tinha administrado Lipo-aGC (fig. 13). A célula CD45RBelevad0CDllcbaix0 é o grupo de células relatado como células dendriticas controláveis e tem a função imunossupressora. Inversamente, a célula CD45RBbaix0CDllcelevad0 é a célula dendritica que activa a célula T e tem a função imunoestimulante. Assim, especulou-se que a função imunossupressora das células TAN era conferida pelo aumento do número das células CD4 5RBelevad0CDl 1 cbalx0 . 4-2. Avaliação da capacidade de produção de citocinas

Recolheu-se, separadamente, a população de células CD45RBelevad0CDllcbaix0 e a população de células CD45RBbaix0CDllcelevad0, separadas pelo processo descrito antes, usando citometria de fluxo (FACS Vantage SE, BD Bioscience) e adicionaram-se as células, a 1 x 105/200 pL do meio, a um poço de uma placa de cultura de fundo em U, com 96 poços. Fez-se uma cultura das células na presença ou na ausência de lipopolissacáridos (LPS; T3382, Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 1 yg/ml durante 2 dias. Mediram-se os niveis de citocinas IL-10 e IL-12 no sobrenadante da cultura, por ELISA. Como resultado, detectou-se a IL-10 e não se detectou a IL-12 no sobrenadante da cultura das células CD45RBelevad0CDl lcbaix0 estimuladas com LPS, enquanto se detectou IL-12 e não se 32 detectou IL-10 nos sobrenadantes da cultura das células CD45RBbaix0CDllcelevad0, independentemente da presença ou da ausência de LPS (fig. 14).

4-3. Avaliação da capacidade de activação de células T

Adicionaram-se células CD45RBelevad0CDllcbaix0 ou células CD45RBbaix0CDllcelevacl° que foram separadas pelo processo 2 descrito anteriormente, a um poço de uma placa de cultura de fundo em U, com 96 poços, a 1 x 104 células/200 yL do meio. As células T CD4 + , purificadas a partir do baço de DO11.10, por meio de micropérolas magnéticas (Miltenyi) , foram adicionadas, a 4 x 106 células/200 yL, ao respectivo meio. Fez-se a cultura das células na presença ou na ausência do péptido de OVA323-339, a uma concentração final de 600 nM, na incubadora contendo CO2 a 5 %, a 37 °C. Após 48 horas, a resposta proliferativa foi ensaiado pelo processo MTT (Promega #G4000). Como resultado, as células T CD4 + , estimuladas com as células CD4 5RBelevacl0CDllcba;LX0 e o péptido de OVA exibiram uma resposta proliferativa ligeiramente inferior, mas significativa, em comparação com a resposta proliferativa induzida pelas células CD45RBbaixoCDllcelevado (fig. 15) . As células T CD4+ cresceram por estimulação com as células CD45RBelevad0CDllcbaix0 e o péptido de OVA, durante 7 dias e foram recolhidos e postas em cultura com as células CD45RBelevad0CDllcbaix0 ou as células CD45RBbaix0CDllcelevad0 recentemente separadas/recolhidas na presença do péptido de OVA, durante 7 dias. Fez-se esta cultura mais uma vez e, no 5o dia, analisaram-se as células na cultura por citometria de fluxo. Como resultado, identificou-se que o grupo de células em crescimento era uma população de células quase homogénea com CD4+, CD25+, CD28+, CD152- e ICOS+ (fig. 16). Posteriormente, fez-se a cultura destas células, a 5 x 105, na presença de PMA, a 33 uma concentração final de 50 ng/mL, ionomicina 500 nM e monensina 2 μΜ (Sigma-Aldrich # M-5273) na incubadora contendo C02 a 5 %, a 37 °C, durante 4 horas. Recolheram-se as células, fez-se uma suspensão em 100 yL de uma solução de BD Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience) e incubaram-se, a 4 °C, durante 15 minutos. As células foram lavadas com BD Perm/Wash (BD Bioscience) e, simultaneamente, coraram-se intracelularmente com anticorpo anti-IFN-γ, marcado com FITC, anticorpo anti-IL-4 marcado com PE (BD Pharmingen Bioscience) e anticorpo anti-IL-10 marcado com APC (BD Pharmingen Bioscience) e coloração tripla intracelular utilizando anticorpos de controlo isotípicos marcados por fluorescência (fig. 17, painéis superiores). Em seguida, as células foram analisadas por citometria de fluxo. Como resultado, no grupo de células que expressam as citocinas, identificou-se que não havia quase nenhuma célula expressando apenas IL-4 e o número de células era grande, pela ordem de células que expressam apenas IFNy < células que expressam tanto IL-10 como IFNy < células que expressam apenas IL-10 (fig. 17, painéis inferiores).

Exemplo 6 (exemplo comparativo) <Efeito inibidor do lipossoma contendo alergeno e ligando das células reguladoras na produção do anticorpo IgE> 1. Preparação do lipossoma contendo ovalbumina e a-galactosil-ceramida

Dissolveu-se, separadamente, L-a-fosfatidiletanol-amina, dioleoilo (DOPC; Wako Pure Chemical #166-16183, 0,77 mg), 0,83 mg de cloridrato de 3β-Ν-(dimetilaminoetil)-carbonato de colesterilo (DC-Chol; Sigma-Aldrich) e 0,029 mg de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- 34 [metoxi(polietileno-glicol)-2000] (sal de amónio; PEG-PE; AVANTI POLAR-LIPIDS, INC. #i88653) em 250 yL do dissolvente de clorofórmio/metanol (1:1). Dissolveu-se separadamente a-galactosil-ceramida (0,16 mg, fornecido pelo RIKEN Research Center for Allergy and Immunology) em 250 yL do dissolvente de clorofórmio/metanol (1:1). Misturaram-se ambos e evaporaram-se utilizando um evaporador e, subsequentemente, secou-se durante a noite num exsicador, sob vácuo. Subsequentemente, adicionou-se 200 yL de uma solução aquosa contendo 0,4 mg/mL de ovalbumina (OVA; Seikagaku Kogyo), tratou-se a mistura utilizando um aparelho de ultrassons, durante 10 minutos e passou-se através de uma membrana com uma dimensão de poro de 0,22 ym para esterilização. Em seguida, seleccionaram-se os tamanhos das partículas por passagem, 25 vezes, através da extrusora LiposoFast-Basic (Avestin Inc.) equipada com uma membrana de policarbonato tendo uma dimensão de poro de 100 nm. A proteína OVA que não tinha sido encapsulada no lipossoma foi eliminada por concentração dos lipossomas nos quais a OVA tinha sido encapsulada, utilizando um filtro de centrifugação Amicon Ultra-4 (PL-100) (Millipore) e lavou-se com água purificada e, finalmente, preparou-se o lipossoma em 800 L de uma solução aquosa com água purificada. Esta solução aquosa contendo a composição de lipossomas (Lipo-aGC + OVA) foi analisada em electroforese de SDS e, consequentemente, identificou-se que a concentração da proteína OVA era de 50 yg/mL. Toda a α-GalCer deveria ser incorporada na membrana de lipossoma e a concentração final de α-GalCer na solução de Lipo-aGC + OVA passou a ser de 200 yg/mL. 35

2. Indução de células reguladoras T CD4+ produtoras de IL-10 por meio de Lipo-aGC + OVA

Administrou-se, por via intraperitoneal, Lipo-aGC ou Lipo-GC + OVA (2 yg em termos da quantidade de α-GalCer) a ratos BDF1 (C57BL/6 x DBA/2 Fl) . Após 7 dias, removeu-se o baço e prepararam-se as células T CD4+ utilizando as micropérolas magnéticas (Miltenyi). Subsequentemente, as células que apresentam antigénios foram preparadas por irradiação de células completas do baço de ratos normais BDF1, com uma radiação de 20 Gy. Em seguida, adicionou-se 3 ml do meio, as células T CD4+ a 1,5 x 106, as células que apresentam o antigénio a 7,5 x 106 e a proteína da OVA, numa concentração final de 100 yg/mL, a um poço de uma placa de cultura de fundo em U, de 6 poços e fez-se uma cultura na incubadora contendo CO2 a 5 %, a 37 °C, durante 6 dias. Posteriormente, fez-se a cultura destas células a 5 x 105, na presença de PMA, a uma concentração final de 50 ng/mL, ionomicina 500 nM e monensina 2 yM (Sigma-Aldrich) na incubadora contendo C02 a 5 %, a 37 °C, durante 4 horas. As células foram recolhidas e coradas com anticorpo anti-CD4 biotinilado e estreptoavidina-Per CP-Cy5.5 (BD Bioscience). Em seguida, fez-se uma suspensão das células em 100 yL de uma solução de BD Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience) e incubaram-se, a 4 °C, durante 15 minutos. As células foram lavadas com uma solução de BD Perm/Wash (BD Bioscience) e depois coraram-se intracelularmente com anticorpo anti-IFN-γ, marcado com FITC, anticorpo anti-IL-4 marcado com PE (BD Pharmingen Bioscience) e anticorpo anti-IL-10 marcado com APC (BD Pharmingen Bioscience) e analisaram-se por citometria de fluxo (fig. 18). Como resultado, nas células T CD4+ derivadas do baço do rato a que se tinha administrado Lipo-aGC, sem encapsulação de OVA, foi detectado 1,4 % de células que expressam apenas 36 IL-4 e 1,1 % de células que expressam apenas IFNy, mas mal se detectou a população de células T reguladoras de CD4+ que expressam apenas IL-10 ou tanto IFN-γ como IL-10. Por outro lado, na análise das células T CD4+ derivadas do baço do rato a que se tinha administrado Lipo-aGC + OVA, detectou-se a população de células T auxiliares que expressam apenas IL-4 (1,0 %) e apenas IFN-γ (9,9 %), a população de células T reguladoras de CD4+ que produzem IL-10 (14,1 %) e a população de células T reguladoras de CD4+ (9,1 %) que expressam tanto IL-10 e IFN-γ. A partir dos resultados anteriores, foi sugerido que o Lipo-aGC contendo alergeno poderia diferenciar e fazer proliferar, in vivo, as células T reguladoras de CD4+ especificas do alergeno que tenham o efeito inibidor na produção de IgE. 3. Efeito inibidor de Lipo-aGC + OVA na resposta secundária do anticorpo, em ratos

Os ratos BDF1 foram submetidos a uma imunização primária com DNP-OVA (0,1 yg) e gel de hidróxido de alumínio (2 mg) . Após 14 dias, mediram-se os títulos de anticorpos do anticorpo anti-DNP-IgE no sangue e prepararam-se 3 grupos (5 ratos por grupo) de modo que os títulos médios dos anticorpos fossem equivalentes entre si. Nos dias 21, 28 e 35, após a imunização primária, administrou-se, intraperitonealmente, apenas o lipossoma (veículo) , Lipo-aGC ou Lipo-aGC + OVA a 2 yg em termos da quantidade de α-GalCer. No 42° dia após a imunização primária, deu-se um reforço aos ratos apenas com DNP-OVA. No 48° dia, os títulos dos anticorpos anti-DNP-IgE, anti-DNP-IgGl, anti-DNP-IgG2a e os níveis de IgE total, IgGl total e IgG2a total no sangue foram medidos por ELISA (fig. 19) . Como resultado, no grupo de Lipo-a-GC + OVA, os títulos de anticorpos anti-DNP-IgE, anti-DNP-IgGl e anti- 37 DNP-IgG2a foram significativamente suprimidos. Por outro lado, no grupo de Lipo-a-GC não contendo OVA, não se observou nenhuma supressão significativa para além da do titulo de anticorpo anti-DNP-IgGl. A partir do resultado anterior, foi sugerido gue Lipo-a-GC, contendo o alérgeno, pode suprimir a resposta secundária do anticorpo induzida pelo alergeno. 0 "lipossoma contendo KRN7000" da presente invenção tem acções inibidoras sobre a acção de activação da célula T auxiliar e sobre a produção de anticorpos IgE, por meio da indução da diferenciação/proliferação e da activação das células reguladoras. Assim, o lipossoma da presente invenção é útil como agente preventivo e agente terapêutico para as doenças alérgicas causadas pela resposta alérgica do tipo I em que o anticorpo IgE está profundamente envolvido, em particular, asma brônquica atópica, dermatite atópica e rinite alérgica, tais como rinite alérgica sazonal e conjuntivite. 0 lipossoma é útil como fármaco para doenças autoimunes e para a doença do hospedeiro versus o enxerto porque o lipossoma pode inibir a diferenciação/proliferação das células T patogénicas por meio do aumento selectivo da função imunosupressora das células TAN.

Além disso, não há preocupação com nenhum efeito secundário do fármaco da presente invenção porque o fármaco retém a molécula ligada selectivamente à célula-alvo e tem, como principio activo, o lipossoma que inclui KRN7000 na membrana lipídica.

Lisboa, 21 de Agosto de 2012. 38

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Fármaco para ser utilizado no tratamento de uma doença, seleccionada no grupo que consiste em doenças alérgicas, doenças autoimunes e doença do hospedeiro versus o enxerto, caracterizado pelo facto de compreender um lipossoma contendo, como princípio activo essencial, o KRN7000 que é representado pela fórmula:

KRN7000
2. Fármaco, para ser utilizado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido lipossoma conter ainda o oligonucleótido CpG ou imiquimod.
3. Fármaco para ser utilizado de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a doença ser uma doença alérgica e o referido lipossoma conter ainda um alergeno.
4. Fármaco para ser utilizado de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de as doenças alérgicas serem asma brônquica, rinite 1 alérgica, rinite alérgica sazonal ou dermatite atópica. Lisboa, 21 de Agosto de 2012. 2