PT1750667E

PT1750667E - Combinação aerossolizada de fosfomicina/aminoglicósido para o tratamento de infecções respiratórias bacterianas

Info

Publication number: PT1750667E
Application number: PT05772820T
Authority: PT
Inventors: William Baker; Macleod David
Original assignee: Corus Pharma Inc
Priority date: 2004-05-17
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2011-03-11
Also published as: US8409549B2; ES2358024T3; BRPI0509026A; PT2316419E; IL225529A; TWI409074B; DK2316419T3; EP2266534A1; US20130071442A1; US20110117030A1; PL2266534T3; AU2009243536A1; AU2009243536B2; WO2005110022A3; US7943118B2; US20110189103A1; JP4745340B2; ES2388420T3; SI1750667T1; ES2392389T3

Description

ΡΕ1750667 1 DESCRIÇÃO "COMBINAÇÃO AEROSSOLIZADA DE FOSFOMICINA/AMINOGLICÓSIDO PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS BACTERIANAS"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a uma nova formulação de combinação de fosfomicina e aminoglicósido fisiologicamente compatível e não irritante adequada para o tratamento de infecções bacterianas respiratórias causadas por bactérias Gram-negativas, tais como Burkholderia cepacia, espécie Citrobacter, Escherichia coli, espécie Enterobacter, espécie Fusobacterium, Haemophilus influen-zae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Moraxella catarrhalis, Proteus mirabilis, espécie Prevotella, Pseudo-monas aeruginosa, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans, e bactérias Gram-positivas, tais como Staphylococcus aureus resistentes à meticilina, Staphylococcus aureus sensíveis à meticilina, Streptococcus pneumoniae, e espécies de Streptococcus β-hemolíticas.

Antecedentes da Invenção A terapia mais largamente aceite para o tratamento de infecções respiratórias causadas por bactérias Gram-negativas em pacientes com fibrose quística envolve a 2 ΡΕ1750667 administração intravenosa de um único antibiótico ou combinações de antibióticos (Gibson et al., 2003; Ramsey, 1996) . Este método de tratamento tem várias limitações significativas, incluindo: (1) espectro estreito de acti-vidade dos antibióticos existentes, (2) concentrações insuficientes de antibiótico que chegam ao tracto respiratório para assegurar uma rápida actividade e elevadas velocidades de letalidade nas bactérias, e (3) desenvolvimento de efeitos secundários adversos devido a elevadas concentrações sistémicas do fármaco. A administração por aerossol de antibióticos (Conway, 2005; 0'Riordan, 2000) aborda várias das limitações da administração parenteral (Flume e Klepser, 2002; Kuhn, 2001). Permite a administração tópica de elevadas concentrações de fármaco para os espaços endobronquiais e reduz os efeitos secundários através da diminuição da exposição sistémica ao antibiótico. No entanto, os pacientes com fibrose quistica tipicamente recebem terapias de antibióticos prolongadas e repetidas ao longo da totalidade da duração das suas vidas adultas (Gibson et al., 2003; Ramsey, 1996). Deste modo, a toxicidade cumulativa do aminoglicósido e o desenvolvimento de resistência permanece um problema significativo.

Fosfomicina A fosfomicina é um antibiótico de ácido fosfónico de largo espectro (Kahan et. al., 1974; Woodruff et al., 3 ΡΕ1750667 1977) que tem actividade bactericida contra bactérias Gram-negativas incluindo Citrobacter spp., E. coli, Enterobacter spp., K. pneumoniae, P. aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., e S. marcescens (Greenwood et. al., 1992; Grimm, 1979; Marchese et. al., 2003; Schulin, 2002), assim como contra bactérias Gram-negativas incluindo enterococos resistentes à vancomicina, S. aureus resistentes à meticilina (MRSA), S. aureus sensíveis à meticilina (MSSA), e S. pneumoniae (Greenwood et. al., 1992; Grimm, 1979; Perri et. al., 2002). A fosfomicina tem a actividade mais elevada contra E. coli, Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp., e S. marcescens que são geralmente inibidas a concentrações de fosfomicina ^64 pg/mL (Forsgren e Walder, 1983). A fosfomicina é moderadamente activa contra P. aeruginosa (Forsgren e Walder, 1983), particularmente quando comparada com a tobramicina (Schulin, 2002). A fosfomicina é bactericida mas apresenta um efeito letal dependente do tempo contra E. coli e S. aureus (Grif et al, ., 2001) . A velocidade e o grau de letalidade depende da duração do contacto da fosfomicina com 0 organismo alvo (Craig, 1998; Mueller et al., 2004) . 0 aumento da concentração da fosfomicina não produzirá um aumento correspondente na velocidade ou no grau de letalidade. Esta característica é significativa uma vez que é preferível tratar infecções de P. aeruginosa com antibióticos que apresentam actividade letal bactericida, dependente da concentração (Craig, 1998; Mueller et al., 2004) . 4 ΡΕ1750667 A monoterapia com fosfomicina é normalmente usada no tratamento de infecções do tracto urinário pouco complicadas causadas por E. coli, e menos frequentemente no tratamento de infecções respiratórias bacterianas incluindo em pacientes com fibrose quistica (Kamijyo et al., 2001; Katznelson et al., 1984; Kondo et al., 1996; Reeves, 1994; Bacardi et al., 1977; Bonora et al., 1977; Honorato et al., 1977; Menendez et al., 1977). No entanto, a fosfomicina isoladamente não foi grandemente usada para tratar infecções causadas por P. aeruginosa. A fosfomicina foi administrada por via parenteral em combinação com antibióticos de diferentes classes para tratar a endocardite (Moreno et al., 1986) e fibrose quistica (Mirakhur et al., 2003) mas não foi administrada directamente ao ambiente pulmonar por administração através de aerossol. A fosfomicina está disponível tanto em formulações orais (fosfomicina de cálcio e trometamol de fosfomicina) e intravenosas (fosfomicina dissódica) (Woodruff et al., 1977). O trometanol de fosfomicina é a formulação preferida para administração oral uma vez que é facilmente absorvida no sangue em comparação com a fosfomicina de cálcio. Após uma única dose intravenosa ou intramuscular de 2 g de fosfomicina, as concentrações no soro atingem picos na gama entre 25-95 yg/mL ao cabo de 1-2 horas (Woodruff et al., 1977). Em comparação, as concentrações atingem 1-13 yg/mL no pulmão normal após 5 ΡΕ1750667 administração parenteral de uma dose comparável de fosfomicina (Bonora et al., 1977) que é insuficiente para matar a maioria dos patogénios bacterianos, em particular P. aeruginosa (Forsgren e Walder, 1983; Schulin, 2002) . Os pacientes com fibrose quística têm uma farmacocinética alterada caracterizada por um aumento do volume de distribuição e da velocidade de depleção (Tan et al., 2003), que provavelmente diminuiria ainda mais a eficácia da fosfomicina administrada pro via parenteral. A fosfomicina encontra-se amplamente distribuída em vários tecidos e fluidos corporais mas não se liga significativamente às proteínas do plasma (Mirakhur et al., 2003). Consequentemente, a fosfomicina está disponível para exercer efeitos antibacterianos se atinge concentrações suficientes no local da infecção. O tracto respiratório de pacientes com fibrose quística está obstruído com secreções viscosas denominadas esputo (Ramsey, 1996) . A eficácia de várias classes de antibióticos tais como aminoglicósidos e β-lactamas é reduzida devido à fraca penetração no esputo. Adicionalmente, a actividade destes antibióticos é ainda reduzida através da ligação a componentes do esputo (Hunt et al., 1995; Kuhn, 2001; Ramphal et al., 1988; Mendelman et al., 1985). O desenvolvimento de resistência em bactérias isoladas de pacientes tratados com fosfomicina para infecções do tracto urinário ocorre com muito pouca 6 ΡΕ1750667 frequência (Marchese et al., 2003). A resistência cruzada com outras classes de antibióticos inibidores da parede celular não ocorre dado que a fosfomicina actua no enzima fosfoenolpiruvato (UDP-N-acetilglucosamina enolpiruval-transferase) que não é alvo por parte de outros antibióticos (Kahan et al., 1974; Woodruff et al., 1977). A fosfomicina é activamente assimilada em células bacterianas através de dois sistemas de transporte; um transporte de L-α-glicerofosfato funcional constitutivamente e o sistema de assimilação hexose-fosfato (Kahan et al., 1974). Quando ocorre resistência à fosfomicina, é tipicamente devida a uma mutação genética num ou em ambos os sistemas de transporte codificados cromossomicamente, e menos comummente através da modificação de enzimas (Arca et al., 1997; Nilsson et al., 2003).

Tobramicina. A tobramicina é um antibiótico aminoglicósido que é activo contra bacilos aeróbicos Gram-negativos incluindo P. aeruginosa, E. coli, Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., K. pneumoniae, Proteus spp., Salmonella spp., S. marcescens, e Shigella spp (Vakulenko e Mobashery, 2003) . Em particular, a tobramicina é altamente activa contra P. aeruginosa. As MICs de P. aeruginosa susceptiveis são tipicamente menos de 2 μρ/πΛ (Shawar et al., 1999; Spencker et al., 2002; Van Eldere, 2003). A maioria das bactérias Gram-positivas são resistentes à 7 ΡΕ1750667 tobramicina, com a excepção de S. aureus e S. epidermidis (Vakulenko e Mobashery, 2003). A tobramicina é rapidamente bactericida e apresenta uma letalidade dependente da concentração (Vakulenko e Mobashery, 2003) . O aumento da concentração da tobramicina aumenta tanto a velocidade como a extensão da morte bacteriana. Deste modo, para se atingir um sucesso terapêutico, é necessário administrar uma dose suficientemente elevada para produzir um pico no nível de tobramicina 5-10 vezes superior à MIC do organismo alvo no local da infecção. É preferível tratar infecções de P. aeruginosa com antibióticos que apresentam uma actividade bactericida, com letalidade dependente da concentração (Ansorg et al., 1990). A tobramicina é geralmente administrada para tratar infecções de bactérias Gram-negativas pouco graves (Vakulenko e Mobashery, 2003). No entanto, pode ser combinada com outras classes de antibióticos para tratar infecções graves do tracto urinário e abdominais, assim como endocardite e bacteremia (Vakulenko e Mobashery, 2003). A administração parenteral da tobramicina em combinação com antibióticos inibidores da parede bacteriana tem sido utilizada para tratar infecções respiratórias, em particular aquelas causadas por P. aeruginosa em pacientes com fibrose quística (Gibson et al., 2003; Lang et al., 2000; Ramsey et al., 1999; Ramsey et al., 1993; Smith et al., 1999; Spencker et al., 2003). ΡΕ1750667 A tobramicina apresenta uma fraca absorção oral e tem de ser administrada por via parentérica (Hammett-Stabler e Johns, 1998) . A tobramicina está disponível tanto em formulação intravenosa como em aerossol. Após administração por via parenteral, a tobramicina é principalmente distribuída pelo fluído extracelular. A tobramicina é rapidamente excretada por filtração glomerular resultando numa meia vida no plasma de 1-2 horas (Tan et al., 2003). A penetração da tobramicina para as secreções respiratórias é muito baixa e a sua actividade é ainda mais reduzida pela ligação ao esputo (Kuhn, 2001). A administração da tobramicina através de um aerossol resulta em níveis no esputo significativamente mais elevados de A 1000 pg/mL (Geller et al., 2002) em comparação com administração por via parenteral, mas a ligação ao esputo permanece um problema significativo (Hunt et al., 1995; Mendelman et al., 1985; Ramphal et al., 1988). A nefrotoxicidade e a ototoxicidade são reacções adversas associadas com a terapia com tobramicina (Al-Aloui et al., 2005; Hammett-Stabler e Johns, 1998). A nefrotoxicidade resulta da acumulação da tobramicina no interior de lisossomas de células epiteliais que revestem os túbulos proximais. Isto provoca uma alteração da função celular e por fim a necrose celular (Mingeot-Leclercq e Tulkens, 1999). Clinicamente, apresenta-se como uma insuficiência renal não oligúrica. A prevalência da nefrotoxicidade em 9 ΡΕ1750667 pacientes com fibrose quística é estimada ser de 31-42% (Al-Aloui et al., 2005). A incidência da ototoxicidade, que se caracteriza por uma perda da audição e por tonturas, está estimada atinqir 25% dos pacientes tratados com aminoglicósidos (Hammett-Stabler e Johns, 1998) . Ao contrário da nefrotoxicidade, a ototoxicidade é irreversível. O maior factor de risco para o desenvolvimento de toxicidade é a exposição cumulativa a doses elevadas de tobramicina (Hammett-Stabler e Johns, 1998; Mingeot-Leclercq e Tulkens, 1999). Os pacientes com fibrose quística são tratados com repetidas e prolongadas doses elevadas ao longo da sua vida (Tan et al., 2003) e têm um risco acrescido de desenvolver uma insuficiência renal cumulativa (Al-Aloui et al., 2005). A resistência bacteriana à tobramicina tornou-se crescentemente prevalente e é devida à monoterapia repetida e prolongada com antibiótico (Conway et al., 2003; Van Eldere, 2003; Mirakhur et al., 2003; Pitt et al., 2005; Schulin, 2002) . Por exemplo, os pacientes de fibrose quística são colonizados com estirpes de P. aeruginosa que são largamente resistentes à tobramicina, gentamicina, ceftazidima, piperacilina, e ciprofloxacina (Eldere, 2003; Pitt et al., 2005; Pitt et al., 2003; Weiss e Lapointe, 1995). Assim, as terapias com antibióticos existentes estão a tornar-se ineficazes para o tratamento de infecções de P. aeruginosa devido a resistência ao fármaco. 10 ΡΕ1750667 ΟΚΑΖΑΚΙ, Μ. ET AL: "Effectiveness of fosfomycin combined with other antimicrobial agents against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates using time index assay" J INFECT CHEMOTHER, vol. 8, 2002, páginas 37-42; TESSIER, F. ET AL: "In vitro activity of fosfomycin combined with ceftazidime, imipenem, amikacin and cipro-floxacin against Pseudomonas aeruginosa" EUR. J. CLIN. MICROBIOL. DIS., vol. 16, 1997, páginas 159-162; TAKA-HASHI, K. ET AL: "Synergistic Activities of combinations of Beta lactamns, fosfomycin and tobramycin against Pseudomonas aeruginosa" ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 26, no. 5, November 1984 (1984-11), páginas 789-791; WO 03/035030 A ; US 2003/191051 Al; TOUW, D.J. ET AL: "Inhalation of Antibiotics in Cystic Fibrosis" EUROPEAN RESPIRATORY JOURNAL, vol. 8, 1995, páginas 1594-1604; DO RING, G. ET AL: "Antibiotic therapy against Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: a European concensus" EUROPEAN RESPIRATORY JOURNAL, vol. 16,2000, páginas 749-767 . É claro que subsiste uma necessidade para um método melhorado para o tratamento de infecções respiratórias agudas e crónicas causadas por bactéricas Gram-negativas e Gram-positivas, particularmente P. aeruginosa multirresistente. Isto é particularmente evidente em pacientes de fibrose quistica em que as terapias actuais são limitadas por problemas com o desenvolvimento de resistência e toxicidade. Tal método de tratamento 11 ΡΕ1750667 compreenderia preferentemente a inalação de uma combinação de antibióticos aerossolizadas de fosfomicina e um aminoglicósido tal como a tobramicina que administra uma quantidade terapeuticamente eficaz dos fármacos directamente para o espaço endobronquial das vias aéreas ou para as vias nasais. Tal tratamento seria eficaz, reduziria a frequência da resistência ao fármaco, e melhoraria a segurança.

Seria altamente vantajoso proporcionar uma formulação e sistema para a administração de uma dose suficiente de fosfomicina com um aminoglicósido tal como tobramicina numa forma concentrada, contendo o menor volume possível de solução ou peso de pó seco que pode ser aerossolizado e administrado predominantemente para o espaço endobronquial.

Assim, é um objectivo desta invenção proporcionar uma formulação de líquido concentrado ou pó seco de fosfomicina e aminoglicósido que contém quantidades suficientes mas não excessivas de fosfomicina e aminoglicósido que podem ser eficientemente aerossolizados por nebulização em aerossol com tamanhos de partícula numa gama de 1 a 5 um e com uma salinidade que é ajustada para permitir a geração de um aerossol de fosfomicina e aminoglicósido bem tolerado por pacientes, e que tem um prazo de validade. 12 ΡΕ1750667

Sumário da Invenção

Um aspecto desta invenção é um método para o tratamento das infecções do tracto respiratório superior tais como sinusites bacterianas e infecções do tracto respiratório inferior (pulmonares) tais como infecções na fibrose quistica, infecção pulmonar crónica por Pseudomonas em pacientes de fibrose quistica, infecções de Pseudomonas após a primeira infecção, bronquiectasia, pneumonia adquirida na comunidade ou em ambiente hospitalar, e pneumonia associada à ventilação mecânica (VAP) causada por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas compreendendo o passo de administração de uma quantidade eficaz de uma formulação de aerossol compreendendo fosfomicina e tobramicina no espaço endobronquial ou nasal de pacientes que necessitem de tal tratamento.

Outro aspecto da presente invenção é uma formulação concentrada ou liquida ou um pó seco, adequado para a administração de uma combinação de fosfomicina e tobramicina para o espaço endobronquial ou nasal de pacientes para tratar infecções bacterianas respiratórias inferiores ou superiores.

Ainda outro aspecto da presente invenção é uma formulação, seja liquida ou um pó seco, adequada para administração de um aminoglicósido e fosfomicina para o espaço endobronquial e nasal de pacientes que reduz o desenvolvi- 13 ΡΕ1750667 mento da resistência a antibióticos em comparação com qualquer dos fármacos utilizados isoladamente.

Ainda outro aspecto da presente invenção é uma formulação, seja liquida ou um pó seco, adequada para a administração de um aminoglicósido e fosfomicina para os espaços endobronquial ou nasal de pacientes que aumenta o efeito após a administração do antibiótico (PAE) em comparação com o PAE de qualquer um dos fármacos utilizados isoladamente.

Ainda outro aspecto da presente invenção é uma formulação compreendendo de 1-300 mg de fosfomicina e de 1 a 300 mg de aminoglicósido em 0,5 a 7 mL de água com uma concentração de cloreto >30 mM em que a referida formulação tem um pH entre 4,5 e 8,0 e é administrada por aeros-solização. O aerossol contém partículas que têm um diâmetro médio de massa aerodinâmico predominantemente entre 1 a 5 μ e é administrado utilizando um nebulizador capaz de atomizar as partículas do tamanho necessário.

Ainda outro aspecto da presente invenção é uma formulação de pó seco compreendendo de cerca de 1 a cerca de 300 mg de fosfomicina, de cerca de 1 a cerca de 300 mg de aminoglicósido e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável numa forma de pó seco micronizado que administra partículas com um diâmetro médio de massa predominantemente de 1 a 5 μ aquando da aerossolização. 14 ΡΕ1750667 A invenção refere-se a uma formulação inalável compreendendo fosfomicina e um aminoglicósido adequada para o tratamento de infecções bacterianas agudas e crónicas, particularmente aquelas causadas por bactérias P. aeruginosa Gram-negativas multirresistentes que são resistentes ao tratamento com β-lactamas e aminoglicósidos. A formulação de aerossol tem um pequeno volume que no entanto administra uma dose terapeuticamente eficaz de fosfomicina e aminoglicósido para o local da infecção em quantidades suficientes para tratar infecções respiratórias bacterianas. O pó seco e formulações de aminoglicósidos e fosfomicina reconstituídas têm um longo prazo de validade e estabilidade ao armazenamento.

As formulações da presente invenção compreendem preferentemente de 5 a 9 partes em peso de fosfomicina e 1 a 5 partes em peso de aminoglicósido, preferentemente de cerca de 7 a 9 partes em peso de fosfomicina e 1 a 3 partes em peso de aminoglicósido e mais preferentemente cerca de 8 partes em peso de fosfomicina e cerca de 2 partes em peso de aminoglicósido. O aminoglicósido mais preferido é a tobramicina.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1 e 2 apresentam curvas de tempo de morte para uma combinação de fosfomicina:tobramicina 9:1 e 15 ΡΕ1750667 demonstram o rápido efeito bactericida letal de P. aeruginosa ATCC 27853 em comparação com o efeito bactericida letal da fosfomicina e tobramicina administradas isoladamente.

As Figuras 3 e 4 apresentam curvas de tempo de morte para uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2 e demonstram o rápido efeito bactericida letal de P. aeruginosa ATCC 27853.

As Figuras 5, 6 e 7 apresentam curvas de tempo de morte para combinações de fosfomicina:tobramicina a 7:3 e demonstram o rápido efeito bactericida letal de P. aeruginosa ATCC 27853.

As Figuras 8 e 9 comparam as curvas de tempo de morte para combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3 e apenas a tobramicina contra P. aeruginosa ATCC 27853.

As Figuras 10, 11 e 12 comparam as curvas de tempo de morte para combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3 contra P. aeruginosa ATCC 27853.

As Figuras 13, 14 e 15 apresentam a morte de E. coli no pulmão de ratos após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de, respectivamente, combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3.

As Figuras 16 e 17 demonstram que a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1 resultou numa morte > 5 log 10 de E. coli no pulmão de rato, comparado com 16 ΡΕ1750667 uma morte de menos de 1 log 10 com administração isolada de fosfomicina e tobramicina. A Figura 18 demonstra que a administração de aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação de fosfomicina : tobramicina a 8:2 resultou numa morte > 5 log 10 de E. coli no pulmão de rato, comparado com uma morte de 2 log 10 de através da administração por aerossol de uma solução a 40 mg/mL de tobramicina isoladamente.

As Figuras 19 e 20 demonstram que a administração de aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2 resultou numa morte de P. aeruginosa no pulmão de rato superior em comparação com a administração de fosfomicina e tobramicina isoladamente. A Figura 21 demonstra que a administração de um aerossol de uma solução a 60 e 90 mg/mL de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2 resultou numa significativa morte de P. aeruginosa no pulmão do rato.

Definição dos Termos

Tal como aqui utilizado: "Quarto de solução salina normal" ou "1/4 NS" significa a solução salina normal diluída até a um quarto da sua força contendo 0,225% (p/v) de NaCl. 17 ΡΕ1750667 "Fosfomicina:tobramicina a 9:1" significa uma formulação em solução de água ou em pó seco contendo uma razão 9:1 em peso de ácido de fosfomicina em relação à base de tobramicina. "Fosfomicina:tobramicina a 8:2" significa uma formulação em solução de água ou em pó seco contendo uma razão 8:2 em peso de ácido de fosfomicina em relação à base de tobramicina. "Fosfomicina:tobramicina a 7:3" significa uma formulação em solução de água ou em pó seco contendo uma razão 7:3 em peso de ácido de fosfomicina em relação à base de tobramicina. "Fosfomicina:tobramicina a 5:5" significa uma formulação em solução de água ou em pó seco contendo uma razão 5:5 em peso de ácido de fosfomicina em relação à base de tobramicina. "Concentração inibitória minima (MIC)" significa a concentração mais baixa de antibiótico (s) que previne o crescimento visível após incubação durante 18-20 horas a 35°C. "Concentração bactericida mínima (MBC)" significa a concentração de antibiótico mais baixa que resulta em h3 Logio de morte bacteriana. "Morte dependente com o tempo" significa que concentrações mais elevadas de fármaco não matam bactérias mais rapidamente ou numa extensão superior. "Morte dependente da concentração" significa que quanto 18 ΡΕ1750667 mais elevada a concentração do fármaco, mais elevada será a velocidade e a extensão da morte bacteriana. "Bacteriostático" significa que o antibiótico actua através da inibição do crescimento bacteriano. "Bactericida" significa que o antibiótico actua matando as bactérias. "Sinergia" significa que o efeito combinado dos antibióticos em exame é significativamente superior àquele de qualquer um dos fármacos isolados.

Descrição Detalhada da Presente Implementação A presente invenção refere-se a uma formulação avançada de fosfomicina e tobramicina adequada para a administração eficaz por aerossolização no espaço endobronquial ou nasal. A invenção é preferentemente adequada para formulação de fosfomicina e tobramicina concentrada para aerossolização por nebulizadores por jacto, ultrassónicos ou equivalentes para produzir partículas de aerossol entre 1 e 5 μ necessárias para a administração eficaz da fosfomicina e tobramicina para o espaço endobronquial e nasal para tratar infecções bacterianas, particularmente aquelas casadas por Pseudomonas aeruginosa multir-resistente. A formulação contém uma quantidade mínima mas eficaz de fosfomicina e tobramicina formulada no volume mais pequeno possível de solução fisiologicamente aceitável com uma salinidade ajustada para permitir a geração de um aerossol de fosfomicina e tobramicina bem tolerado por 19 ΡΕ1750667 pacientes mas minimizando o desenvolvimento de efeitos secundários indesejáveis tais como broncoespasmos e tosse.

Os requisitos principais para qualquer formulação aerossolizada são a sua segurança e eficácia. As vantagens adicionais são o seu baixo custo, a facilidade de utilização, um prolongado prazo de validade, armazenamento e manipulação de nebulizador. A fosfomicina mais tobramicina aerossolizada é formulada para a administração eficaz de fosfomicina e tobramicina para o espaço endobronquial do pulmão ou nasal. Selecciona-se um nebulizador para permitir a formação de um aerossol de fosfomicina e tobramicina com um diâmetro médio de massa predominantemente entre 1 a 5 μ. A quantidade formulada e administrada de fosfomicina e tobramicina é eficaz para o tratamento de infecções pulmonares bacteriana, particularmente aquelas causadas por Pseudomonas aeruginosa multirresistente. A formulação tem uma salinidade, uma força osmótica, e um pH ajustado de modo a permitir a geração de um aerossol de fosfomicina e tobramicina que é bem tolerante por pacientes. A formulação tem o volume mais pequeno possível aerossolizável capaz de administrar uma dose eficaz de fosfomicina e tobramicina ao local da infecção. Adicionalmente, a formulação aerossolizada não limita a funcionalidade das vias aéreas ou passagens nasais e minimiza efeitos secundários indesejáveis. 20 ΡΕ1750667

I. AVALIAÇÃO DAS COMBINAÇÕES ANTIBIÓTICAS

Combinações de fosfomicina:aminoglicósidos foram formuladas tal como descrito no Exemplo 1. A fosfomicina compreendeu o componente principal da combinação devido à sua segurança inerente e a necessidade de reduzir a toxicidade do aminoglicósido. As combinações de fosfomicina :aminoglicósido, em particular fosfomicina:tobramicina foram avaliadas para (a.) potência in vitro, (b.) velocidades de morte, (c.) frequência de resistência, e (d.) eficácia animal. a. Potência in vitro A potência in vitro da fosfomicina e tobramicina isoladamente e em combinação contra um painel de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas representativas de espécies que causam infecções do tracto respiratório em fibrose quistica, bronquiectasia, sinusite e pneumonia associada à ventilação mecânica é apresentada nas Tabelas 1 e 2. Os dados mostram que as combinações fosfomicina:tobramicina têm actividade antibacteriana contra um largo espectro de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As MICs das combinações fosfomicina:tobramicina não melhoraram em relação à fosfomicina ou tobramicina isoladamente. 21 ΡΕ1750667

Tabela 1. Valores de MIC de fosfomicina e tobramicina isoladamente e em combinação contra bactérias Gram-negativas. MIC (yg/mL)

Bactéria Fosfomicina Tobramicina F9:T1 F7:T3 F5:T5 P. aeruginosa COR-003 16 0,5 8 4 1 COR-O09 1024 2048 1024 512 2048 COR-021 8 64 8 8 8 COR-O27 128 0,5 8 2 1 E. coli COR-032 1 0,5 1 1 1 COR-O39 64 0,25 2 0,5 0,5 C03-040 1 32 1 1 2 H. influenzae COR-042 8 0,5 4 2 1 COR-O49 128 0,5 4 1 1 B. cepacia C03-090 > 2048 128 1024 ND ND COR-O 98 > 2048 64 1024 ND ND S. maltophilia COR-O82 128 4 4 4 8 COR-083 64 512 256 128 128 COR-O87 > 512 128 128 128 128 K. pneumoniae COR-042 8 0,5 4 2 1 COR-O49 128 0,5 4 1 1 M. catarrhalis COR-109 4 8 4 ND ND COR-113 4 8 4 ND ND ND = Não determinado. 22 ΡΕ1750667

Tabela 2. Valores de MIC de fosfomicina e tobramicina iso- ladamente e em combinação contra bactérias Gram-positivas. MIC (pg/mL) Bactéria Fosfomicina Tobramicina F9: TI F7:T3 F5:T5 S. aureus COR-051 (MSSA) 1 0,25 2 1 0,5 COR-055 (MSSA) 4 0,25 4 1 0,5 COR-059 2 128 2 4 4 COR-O60 (GISA) 2 64 1 4 8 S. pneumoniae COR-O61 32 64 16 32 32 COR-O68 8 16 16 16 16 S. pyogenes COR-104 64 32 ND ND ND COR-105 16 64 ND ND ND E. faecalis COR-099 32 512 ND ND ND COR-103 32 8 ND ND ND ND = Não determinado. A Tabela 3 mostra os valores de MIC50 e MIC90 de fosfomicina e tobramicina isoladamente e em combinação para 100 estirpes de P. aeruginosa isoladas de amostras de esputo pulmonar de pacientes com fibrose quistica. Este estudo demonstra que na ausência de mucina, a tobramicina era o antibiótico mais activo. A combinação da fosfomicina 23 ΡΕ1750667 e da tobramicina resultou numa melhoria significativa nos valores de MIC5o e MIC90 em comparação com a fosfomicina isoladamente. No modelo de ligação com mucina de fibrose quistica (+mucina), as combinações fosfomicina:tobramicina tinham valores MIC50 e MIC90 comparáveis à tobramicina isoladamente.

Tabela 3. Valores de MIC de fosfomicina e tobramicina isoladamente e em combinação para 100 estirpes de P. aeru-ginosa.

Antibiótico mic50 (yg/mL) MIC90 (yg/mL) Mucina (-) Mucina (+) Mucina (-) Mucina (+) Fosfomicina 64 64 > 512 128 Tobramicina 2 16 16 64 F9:T1 16 32 64 128 F8:T2 8 32 64 128 F7:T3 8 16 64 64 A Tabela 4 apresenta os resultados de estudos de sinergia entre a fosfomicina e nove aminoglicósidos. As interacções entre as nove diferentes combinações fosfomicina:aminoglicósido foram todas classificadas como indiferentes. Nenhuma das combinações apresentou uma actividade sinergética contra P. aeruginosa ATCC 27853. Estes dados demonstram que não é óbvio que uma melhoria na eficácia seria conseguida através da combinação de fosfomicina e aminoglicósidos. 24 ΡΕ1750667

Tabela 4. Estudos de sinergia entre a fosfomicina e vários aminoglicósidos para P. aeruginosa ATCC 27853.

Combinação de Antibióticos Interacção Fosfomicina:Tobramicina Indiferente Fosfomicina:Gentamicina Indiferente Fosfomicina:Arbecacina Indiferente Fosfomicina:Dibecacina Indiferente Fosfomicina:Canamicina B Indiferente Fosfomicina:Estreptomicina Indiferente Fosfomicina:Amicacina Indiferente Fosfomicina:Neomicina Indiferente Fosfomicina:Netilimicina Indiferente A Tabela 5 apresenta os resultados de estudos de sinergia entre fosfomicina e tobramicina contra estirpes clínicas de P. aeruginosa, E. coli, H. influenzae, e S. aureus. As interacções entre a fosfomicina e a tobramicina foram classificadas como indiferentes para a grande maioria dos isolados examinados. A interacção entre a fosfomicina e a tobramicina foi apenas sinérgica contra uma estirpe de P. aeruginosa e uma estirpe de E. coli. Estes dados sugerem ainda que não era óbvio que uma melhoria na eficácia seria conseguida através da combinação de fosfomicina e tobramicina. 25 ΡΕ1750667

Tabela 5. Estudos de sinergia entre fosfomicina e tobra-micina para estripes de P. aeruginosa, E. coli, H. influ-enzae, e S. aureus.

Estirpes Bacterianas N = Interacção Entre os Antibióticos Sinergia Adição Indiferença Antagonismo P. aeruginosa 17 1 0 16 0 E. coli 5 1 0 4 0 H. influenzae 1 0 0 1 0 S. aureus 4 0 0 4 0 A Tabela 6 apresenta os valores MBC/MIC da fosfomicina e da tobramicina isoladamente e combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3 para P. aeruginosa ATCC 27853. São preferíveis antibióticos com valores MBC/MIC d 1 uma vez que inibem as bactérias matando-as em vez de retardando o seu crescimento. Este estudo demonstrou inesperadamente que os valores MBC/MIC das combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3eram idênticos aos da tobramicina isoladamente. Esta descoberta foi inesperada uma vez que a razão MBC/MIC para a fosfomicina isoladamente era ^ 8. 0 estudo também mostrou que não se observou uma descoberta similar com qualquer uma das outras combinações fosfomicina:aminoglicósido. 26 ΡΕ1750667

Tabela 6. Valores MBC/MIC de aminoglicósidos isoladamente e combinações de fosfomicina e aminoglicósido a 9:1, 8:2 e 7:3 para P. aeruginosa ATCC 27853.

Combinação de MBC/MIC

Antibióticos Aminoglicósido F9:T1 TI co h-3 t\D F7 :T3 Fosfomicina: 1 1 1 1 Tobramicina Fosfomicina: 2 4 2 8 Gentamicina Fosfomicina: 2 4 4 2 Amicacina Fosfomicina: 1 2 4 2 Netilimicina Fosfomicina: 1 4 4 2 Arbecacina Fosfomicina: 4 2 2 2 Estreptomicina Fosfomicina: 2 2 2 4 Neomicina Fosfomicina: ND 4 2 4 Canamicina B Fosfomicina: 1 4 2 1

Dibecacina ND = Não determinado. A Tabela 7 mostra os valores de MBC/MIC da fosfomicina e da tobramicina isoladamente e combinações 27 ΡΕ1750667 9:1, 8:2 e 7:3 para P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922, e S. aureus ATCC 29213. Para P. aeruginosa, os valores MBC/MIC das combinações foram idênticos à tobramicina isoladamente. Esta descoberta foi inesperada uma vez que não foi observada com E. coli ou S. aureus.

Tabela 7. Valores de MBC/MIC de fosfomicina e tobramicina isoladamente e combinações de fosfomicina e tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3.

Antibiótico MBC/MIC P. aeruginosa E. coli S. aureus Fosfomicina > 8 8 1 Tobramicina 1 1 8 F9:T1 1 1 2 F8 :T2 1 2 4 F7 :T3 1 2 4 b. velocidades de Morte A Tabela 8 apresenta os resultados de estudos de tempo de morte de combinações de fosfomicina:aminoglicósido a 9:1, 8:2 e 7:3 contra P. aeruginosa ATCC 27853. O exame da morte bacteriana ao longo do tempo mostrou sinergia entre combinações de fosfomicina:tobramicina, fosfomicina : gentamicina, e fosfomicina:arbecacina. As restantes combinações de fosfomicina:aminoglicósido não eram sinérgicas. Estes dados mostram que não era óbvia qual a 28 ΡΕ1750667 combinação de fosfomicina:aminoglicósido, nem qual a razão de fosfomicina:aminoglicósido seria sinérgica.

Tabela 8. Estudos de tempo de morte com combinações fosfomicina : aminoglicósido contra P. aeruginosa ATCC 27853. Os antibióticos foram avaliados a uma concentração de 32 yg/mL.

Sinergia

Combinação de Antibióticos F9:T1_F8 : T2_F7 : T3

Fosfomicina:Tobramicina Fosfomicina:Gentamicina Fosfomicina:Amicacina Fosfomicina:Netilimicina Fosfomicina:Arbecacina Fosfomicina:Estreptomicina Fosfomicina:Neomicina Fosfomicina:Canamicina B Fosfomicina:Dibecacina

Sim Não Não Sim Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Sim Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não A Tabela 9 mostra o tempo necessário para se atingir a morte bactericida de P. aeruginosa ATCC 27853 por várias combinações fosfomicina:aminoglicósido. Os antibióticos foram avaliados a uma concentração de 32 yg/mL. Este estudo demonstrou que as combinações de fosfomicina:tobramicina 9:1, 8:2, e 7:3 atingiram uma morte bactericida mais rapidamente do qualquer outra combinação fosfomicina:aminoglicósido. Os dados também mostram que 29 ΡΕ1750667 três das combinações fosfomicina:aminoglicósido não apresentaram morte bactericida. Estes resultados foram inesperados uma vez que a tobramicina isoladamente atingiu morte bactericida a 1 hora, e a fosfomicina isoladamente não era bactericida.

Tabela 9. Tempo para se conseguir morte bactericida de P. aeruginosa ATCC 27853 por combinações de fosfomicina:aminoglicósido a 9:1, 8:2 e 7:3.

Combinação de Antibióticos Tempo (h) F9 :T1 F8:T2 F7:T3 Fosfomicina:Tobramicina 2 1 1 Fosfomicina:Gentamicina 6 4 2 Fosfomicina:Amicacina 6 2 2 Fosfomicina:Netilimicina NC NC NC Fosfomicina:Arbecacina NC 4 2 Fosfomicina:Estreptomicina NC NC NC Fosfomicina:Neomicina NC NC NC Fosfomicina:Dibecacina NC 4 4

As Figuras 1 e 2 apresentam as curvas de morte para uma combinação fosfomicina:tobramicina a 9:1 e demonstram uma rápida morte bactericida de P. aeruginosa ATCC 27853 em comparação com a morte bacteriostática da fosfomicina e tobramicina isoladamente. Isto foi inesperado uma vez que a análise realizada não demonstrou sinergia entra a fosfomicina e a tobramicina. 30 ΡΕ1750667

As Figuras 3 e 4 apresentam as curvas de morte para uma combinação fosfomicina:tobramicina a 8:2 e demonstram uma rápida morte bactericida de P. aeruginosa ATCC 27853. A uma concentração de 32 pg/mL, a actividade de morte da combinação foi significativamente superior à da fosfomicina e ligeiramente superior à da tobramicina. A 16 pg/mL, a combinação foi superior à tobramicina e à fosfomicina isoladamente.

As Figuras 5, 6 e 7 apresentam as curvas de morte para uma combinação fosfomicina:tobramicina a 7:3 e demonstram uma rápida morte bactericida de P. aeruginosa ATCC 27853. A concentrações de 16 pg/mL e 32 pg/mL, a actividade de morte da combinação foi significativamente superior à da fosfomicina e ligeiramente superior à da tobramicina isoladamente. A 8 pg/mL, a combinação foi superior tanto à tobramicina como à fosfomicina isoladamente.

As Figuras 8 e 9 apresentam as curvas de morte para combinações fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3 e tobramicina isoladamente contra P. aeruginosa ATCC 27853. A uma concentração de 32 pg/mL, todos os antibióticos tinham velocidades e graus de morte comparáveis. A 16 pg/mL a tobramicina foi o antibiótico mais activo seguido de F7:T3, F8:T2 e F9:T1.

As Figuras 10, 11 e 12 demonstram a morte dependente da concentração das combinações de fosfomicina:tobra- 31 ΡΕ1750667 micina a 9:1, 8:2 e 7:3 contra P. aeruginosa ATCC 27853, Isto foi inesperado dado que o componente principal da combinação fosfomicina, apresenta morte dependente do tempo. A tobramicina isoladamente apresenta morte dependente da concentração. c. Frequência de Resistência A Tabela 10 apresenta a frequência do desenvolvimento de resistência de fosfomicina e tobramicina isoladamente, e uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1 para cinco estirpes de P. aeruginosa. Este estudo demonstrou a frequência do desenvolvimento de resistência à combinação de fosfomicina: tobramcina a 9:1 era de 1000-100000 vezes menos do que a fosfomicina isoladamente e 10-1000 vezes menos que a tobramicina isoladamente.

Tabela 10. Frequência de desenvolvimento de resistência à fosfomicina, tobramicina e a uma combinação de fosfomicina : tobramicina 9:1.

Frequência de Resistência

Estirpes de P. aeruginosa Fosfomicina Tobramicina Fos + Tob COR-002 1, 4 X co 1 o \—1 6, 7 X 10' -6 < 2, . 9 X 10'1 COR-003 5, 5 X o T-1 3, 2 X 10' -6 < 1, . 2 X 10': COR-013 6, 4 X 10‘3 2, 6 X 10' -6 2, .0 X 1C f7 COR-O14 1, 5 X IO'5 5, 0 X 10' -6 < 1, . 4 X 10‘: ATCC 27853 4, 1 X 10'5 3, 4 X 10' -6 < 2, .5 X 10': 32 ΡΕ1750667 A Tabela 11 apresenta o número de vezes que a MIC de mutantes de P. aeruginosa isolados após uma única exposição a fosfomicina, tobramicina, ou uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1. Este estudo demonstrou que mutantes 9:1 não têm um aumento significativo na MIC (1-2 vezes), em comparação com a fosfomicina (128-> 512 vezes) ou tobramicina (2-16 vezes) mutantes.

Tabela 11. Número de vezes que a MIC aumenta após uma única exposição a antibiótico.

Estirpes de P. Número de vezes de aumento da MIC aeruginosa F9:T1 Fos Tob COR-O02 1 > 256 1 COR-O03 2 > 256 2 COR-O13 1 > 64 8 COR-O14 1 > 512 16 ATCC 27853 2 128 1 A Tabela 12 mostra o desenvolvimento de resistência numa estirpe clinica de P. aeruginosa após 28 dias de exposição continua a fosfomicina, tobramicina ou a uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1. Exposição da combinação a 9:1 causada por um aumento de 8 vezes na MIC ao dia 14, mas a MIC não excedeu o limite de resistência da fosfomicina de 256 yg/mL. A exposição à tobramicina aumentou a MIC 128 vezes, o que excedeu o 33 ΡΕ1750667 limite de resistência à tobramicina de 16 pg/mL. Observou-se um desenvolvimento rápido e impressionante da resistência com P. aeruginosa exposta apenas à fosfomicina.

Tabela 12. Desenvolvimento de resistência após exposição continua ao antibiótico. MIC (pg/mL)

Antibiótico Od 7d 14d 21d 28d F9:T1 8 16 64 64 64 Tobramicina 0, 5 0,5 0,5 32 64 Fosfomicina 16 > 512 > 512 > 512 > 512 d. Eficácia em Animais

As Figuras 13, 14 e 15 apresentam a morte de E. coli no pulmão de ratos após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de, respectivamente, combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3. Este estudo demonstrou a erradicação completa (5-6 LoglO ufc) da infecção no pulmão com E. coli após 45-60 minutos de tratamento.

As Figuras 16 e 17 demonstram que a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1 resultou numa morte > 5 log 10 de E. coli no pulmão de rato, comparado com uma morte de menos de 1 log 10 com administração isolada de fosfomicina e tobramicina. 34 ΡΕ1750667 A Figura 20 demonstra que a administração de aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2 resultou numa morte > 5 log 10 de E. coli no pulmão de rato, comparado com uma morte de 2 log 10 de através de tobramicina isoladamente. Isto foi inesperado uma vez que os dados de potência in vivo não demonstraram que a combinação era superior à tobramicina isoladamente.

II. FORMULAÇÃO DE FOSFOMICINA/TOBRAMICINA EM AEROSSOL

Os aminoglicósidos úteis na invenção são antibióticos, tais como a tobramicina, a gentamicina, a canamicina B, a amicacina, a arbecacina, a dibecacina, a estreptomicina, a neomicina, e a netilimicina. Compostos de fosfomicina particularmente úteis na invenção são 35 ΡΕ1750667 antibióticos, tais como trometamol de fosfomicina, sal dissódico de fosfomicina, e fosfomicina de cálcio. A formulação preferida de fosfomicina com tobra-micina de acordo com a invenção contém 10-500 mg de fosfomicina mais tobramicina por 0,5-7 mL de água com uma concentração de cloretos >30 mM. Isto corresponde a doses que seriam necessárias para evitar a colonização ou para tratar infecções graves do tracto respiratório superior e inferior causadas por uma gama de organismos susceptiveis.

Os pacientes podem ser sensíveis ao pH, à osmola-lidade e ao conteúdo iónico de uma solução nebulizada. Deste modo, estes parâmetros deverão ser ajustados para serem compatíveis com as fosfomicina mais tobramicina e tolerados pelos pacientes. A solução ou suspensão mais preferida de fosfomicina e tobramicina conterá uma concentração de cloreto >30 mM a pH 4,5-8,0. A formulação da invenção é nebulizada predominantemente em tamanhos de partícula que permitem a administração do fármaco nos bronquíolos terminais e respiratórios ou nas passagens nasais onde as bactérias residem durante a infecção e a colonização. Para a administração eficaz de fosfomicina mais tobramicina ao espaço endobronquial das vias aéreas num aerossol, é necessária a formação de um aerossol com um diâmetro médio de massa predominantemente entre 1 a 5 μ. A quantidade formulada e administrada de fosfomicina mais tobramicina 36 ΡΕ1750667 para o tratamento e a profilaxia de infecções endobronquiais, particularmente aquelas causadas por P. aeruginosa devem de forma eficaz ter como alvo a superfície pulmonar. A formulação deve ter o mais pequeno volume aerossolizável possível capaz de administrar uma dose eficaz de fosfomicina mais tobramicina ao local da infecção. A formulação deve adicionalmente proporcionar condições que não afectem de forma adversa a funcionalidade das vias respiratórias e as passagens nasais. Consequentemente, a formulação deve conter uma quantidade suficiente do fármaco formulado sob as condições de modo a permitir a sua administração eficaz, evitando simultaneamente reacções indesejadas. A nova formulação de acordo com a invenção cumpre com todos estes requisitos.

De acordo com a invenção, a fosfomicina mais a tobramicina é formulada numa forma de dosagem líquida destinada a terapia por inalação por pacientes com, ou em risco de adquirir, infecção bacteriana das vias respiratórias superiores ou inferiores. Uma vez que os pacientes residem através do mundo, é imperativo que a formulação de dosagem líquida tenha um prazo de validade razoável. As condições de armazenamento e de embalamento tornam-se assim importantes. A formulação de fosfomicina mais tobramicina pode ser preparada assepticamente na forma de uma solução aquosa numa ampola dupla de modo que cada antibiótico seja formulado em água e o seu pH ajustado de forma independente. A tobramicina é formulada a um pH ácido (1-6) 37 ΡΕ1750667 enquanto que a fosfomicina é formulada a um pH básico (8-13). A formulação a valores baixos de pH para a tobramicina assegura que todos os seus átomos de azoto básicos sejam protonados, protegendo assim a molécula da oxidação de aminas e de degradação (as soluções de tobramicina tornam-se amarelas à temperatura ambiente). Assim, as soluções de tobramicina com baixo pH são estáveis à temperatura ambiente durante períodos de tempo indefinidos. A fosfomicina é particularmente estável a valores elevados de pH uma vez que o anel epoxídico reactivo é susceptível de hidrólise (abertura do anel) a pH acídico ou baixo. As soluções de fosfomicina com elevado pH são igualmente estáveis à temperatura ambiente. Deste modo, o recipiente em ampola dupla permite a formulação estável separada e à temperatura ambiente de cada antibiótico a um pH elevado e baixo de tal modo que o produto de combinação de fármacos e o pH final seja obtido através da mistura de ambas as soluções no nebulizador imediatamente antes da utilização. A adequação do armazenamento da formulação permite a utilização fiável da fosfomicina mais tobramicina formulada adequada para aerossolização.

III. NEBULIZADORES PARA ADMINISTRAÇÃO PULMONAR DA COMBINAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS

Utiliza-se um dispositivo capaz de nebulizar a formulação da invenção em partículas de aerossol predominantemente na gama de tamanhos de 1 a 5 μ para administrar as formulações da presente invenção. Predominantemente, 38 ΡΕ1750667 nesta aplicação significa que pelo menos 70% mas preferentemente mais de 90% das partículas de aerossol geradas situam-se na gama de 1 a 5 μ. Dispositivos típicos incluem nebulizadores de jacto, nebulizadores ultrassónicos, nebulizadores geradores de aerossol pressurizado, e nebulizadores de placa porosa vibratória. Nebulizadores adequados representativos incluem o nebulizador eFlow® disponível da Pari Inovative Manufactures, Midlothian, VA; o nebulizador iNeb® disponível da Profile Drug Delivery de West Sussex, Reino Unido; o nebulizador Omeron MicroAir® disponível da Omeron, Inc. de Chicago, IL e o nebulizador AeroNebGo® disponível da Aerogen Inc. de Mountain View, CA.

Um nebulizador de jacto utiliza pressão de ar para quebrar uma solução líquida em gotículas de aerossol. Um nebulizador ultrassónico funciona através de um cristal piezoeléctrico que divide o líquido em pequenas gotículas de aerossol. Os sistemas pressurizados geralmente forçam soluções através de pequenos poros de modo a gerar pequenas partículas. Um dispositivo de placa vibratória porosa utiliza uma vibração rápida para quebrar uma corrente de líquido nem tamanhos de gotícula apropriados. No entanto, apenas algumas formulações de fosfomicina mais tobramicina podem ser eficientemente nebulizadas uma vez que os dispositivos são sensíveis às propriedades físicas e químicas da formulação. A invenção é uma formulação de baixo volume, elevada concentração de fosfomicina e tobramicina que pode 39 ΡΕ1750667 ser administrada na forma de um aerossol a concentrações eficazes do fármaco para o tracto respiratório em pessoas em risco de, ou sofrendo de, uma infecção causada por uma bactéria susceptivel. A formulação é segura, bem tolerada, e económica. Além disso, a formulação proporciona um prazo de validade adequado para distribuição comercial.

Exemplo 1

Preparação de Soluções de Fosfomicina/Tobramicina para Aerossolização

Solução de Fosfomicina/Tobramicina a 9:1

Dissolveu-se fosfomicina dissódica (18,057 g, 13,99 g de ácido livre) em 250 mL de água e o pH foi ajustado a 7,41 por adição gota a gota de 1,53 mL de HC1 a 4,5 N. À solução resultante, adicionou-se 1,56 g da base tobramicina a 97,5%. O pH da solução foi ajustado a 7,60 pela adição de 2,45 mL de HCl a 4,5 N. A solução foi diluída a 500 mL com água e filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 ym Nalge Nunc 167-0020. O pH final foi de 7,76, a osmolalidade foi de 537 mOsmol/kg, calculou-se que a razão fosfomicina/tobramicina era de 9:1, e a concentração de cloreto foi de 35,8 mM.

Solução de Fosfomicina/Tobramicina a 8:2

Preparou-se uma solução de fosfomicina/tobramicina com uma razão de 8:2. Dissolveu-se 3,1680 g de fosfomicina dissódica (2,4013 g de ácido livre) em 50 mL de água. Dissolveu-se 0,6154 g da base tobramicina a 97,5% (0,6000 g 40 ΡΕ1750667 de base tobramicina pura) na solução de fosfomicina. O pH da solução foi ajustado pela adição de 0,910 mL de HC1 a 6 N. A solução foi diluída a 100 mL com água. O pH final da solução foi de 7,65, a osmolalidade foi de 477 mOsmol/kg e a concentração de cloreto foi de 54,6 mM. Calculou-se que a razão final de fosfomicina/tobramicina era 8:2.

Solução de Fosfomicina/Tobramicina a 7:3 Utilizando o procedimento acima descrito para a solução de 9:1, preparou-se uma solução de fosfomicina/tobramicina com uma razão de 7:3; dissolveu-se 17,466 g de fosfomicina dissódica (13,239 g de ácido livre) em água; o pH foi ajustado a 7,43 através da adição de 1,46 mL de HC1 a 4,5 N, 5,819 g de base tobramicina a 97,5% (5, 674 g de base tobramicina pura) e o pH da solução combinada foi ajustado pela adição de 9,20 mL de HC1 a 4,5 N. O pH final da solução foi 7,68, a osmolalidade foi de 560 mOsmol/kg, a razão fosfomicina/tobramicina foi 7:3, e a concentração de cloreto foi de 95,9 mM.

Exemplo 2

Preparação de uma Solução Hiperosomolar de Fosfomicina e Tobramicina a 8:2

Dissolveu-se 7,9165 g de fosfomicina dissódica (6,0007 g de ácido livre de fosfomicina) e 1,5382 g de base tobramicina a 97,5% (1,4997 g de base tobramicina pura) em 50 mL de água. o pH foi ajustado a 7,62 através da adição 41 ΡΕ1750667 de 2,3 mL de HCl a 6 Μ. A solução combinada foi diluída até 100 mL. O pH final foi de 7,64, a osmolalidade foi de 1215 mOsmol/kg, a concentração final de cloreto foi de 138 mM e a razão de fosfomicina/tobramicina foi de 8:2.

Exemplo 3

Preparação de Soluções Individuais de Fosfomicina com Elevado pH e Tobramicina com Baixo pH para Reconstituição

Preparou-se uma solução de fosfomicina através da dissolução de 5,891 g de fosfomicina dissódica (4,465 g de ácido livre de fosfomicina) em água e diluindo para 100 mL. O pH foi de 9,42, e a osmolalidade foi de 795 mOsmol/kg.

Preparou-se uma solução de tobramicina através da dissolução de 1,869 g de base tobramicina a 97,5% (1,822 g de base tobramicina pura) em 60 mL de água, ajustando o pH a 4,90 através da adição de 18,8 mL de HCl a 1 M, e diluindo a 100 mL com água. O pH foi de 4,89, e a osmolalidade foi de 148 mOsmol/kg.

Combinaram-se 1 mL da solução de fosfomicina e 1 mL da solução de tobramicina. Para a solução de produto de fármacos combinados, o pH foi de 7,30, a osmolalidade foi de 477 mOsmol/kg, a concentração de cloretos foi de 94,0 mM, e a razão de fosfomicina/tobramicina foi de 7:3. 42 ΡΕ1750667

Exemplo 4

Preparação de uma solução de fosfomicina/tobramicina a 8:2 a partir de Solução para Inalação de Tobramicina comercial (TOBI) e Fosfomicina Dissódica Liofilizada (anidra) (FOSFO)

Dissolveu-se 3,1665 g de fosfomicina dissódica (FOSFO, 2,4002 g de ácido livre de fosfomicina) em duas ampolas de 5 mL (60 mg/mL) de Solução de Tobramicina para Inalação (TOBI, 600 mg da base tobramicina) mais 40 mL de água. O pH inicial da solução foi de 7,50. à solução adicionou-se 667 pL de 4,5 M de NaCl. A solução combinada foi diluída a 100 mL com água. A formulação final tinha as seguintes propriedades; pH 7,49, osmolalidade 502 mOsmol/kg, concentração de cloretos 33,8 mM, e a razão de fosfomicina/tobramicina 8:2, e concentração de fármaco de 24 mg/mL de fosfomicina e 6 mg/mL de tobramicina.

Os Exemplos 5-10 apresentam os procedimentos que foram utilizados para gerar os dados apresentados nas Tabelas e figuras deste pedido de patente.

Exemplo 5

Determinação das concentrações inibitórias mínimas (MIC) A eficácia de antibióticos e de combinações de antibióticos contra bactérias Gram-positivas e Gram- 43 ΡΕ1750667 negativas representativas de espécies que causam infecções respiratórias em pacientes com fibrose quistica, bronquiectasia, sinusite, e pneumonia associada a ventilação mecânica foi avaliada em testes de determinação das MIC. Isolaram-se estirpes de P. aeruginosa a partir de amostras de esputo do pulmão recolhidas de pacientes com fibrose quistica, culturas do sangue, infecções do tracto respiratório, e infecções da pele ou de tecidos moles.

Isolaram-se E. coli, H. influenzae, B. cepacia, S. maltophilia, K. pneumoniae, M. catarrhalis, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, e E. faecalis de infecções do tracto respiratório. Utilizaram-se como estirpes de controlo E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, e s. aureus ATCC 29213. Método A: Foram determinadas as MICs de

fosfomicina isoladamente, de tobramicina isoladamente, ou combinações de fosfomicina mais tobramicina pelo método de diluição em placas de agar de acordo com as directrizes NCCLS (NCCLS, 2003). As estirpes bacterianas foram inoculadas riscando placas de Tryptic Soy Agar (PML Microbiologicals, Wilsonville, Or.) contendo sangue de carneiro desfibrinado (de seguida referidas como placas de agar de sangue) e incubadas durante a noite a 35°C. Inocularam-se duas a três colónias bacterianas das culturas crescidas durante a noite em 3 mL de solução salina normal, submeteu-se a um breve período de agitação em vórtex, e ajustou-se a um padrão McFarland 0,5 (NCCLS, 2003). A 44 ΡΕ1750667 suspensão bacteriana foi diluída 1:40 em solução salina normal e serviu de inoculo. Prepararam-se placas de agar Mueller-Hinton (aqui de seguida referidas como MHA) através da combinação de 16 g de agarose (Beckton-Dickinson, Sparks, MD), 22 g de meio Mueller-Hinton em pó (Beckton-Dickinson, Sparks, MD), e ajustou-se a 1 L com água destilada. 0 agar foi esterilizado por autoclavagem, arrefecido a 55°C, e suplementado com 25 yg/mL de glucose-6-fosfato (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.). Prepararam-se alíquotas de vinte e cinco mL de agar arrefecido em tubos cónicos de 50 mL e suplementou-se com concentrações apropriadas de antibiótico para conseguir concentrações na gama de 0,06 yg/mL a 512 yg/mL. Após se misturar suavemente o agar e o antibiótico, a suspensão foi vertido em placas de Petri de 100 mm estéreis e deixa-se solidificar à temperatura ambiente. As placas de agar com antibiótico foram inoculadas com aproximadamente 2xl04 ufc/ponto com um inoculador de 48 pontos (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.). A MIC foi definida como a concentração mais baixa de antibiótico8s) que preveniu um crescimento visível após incubação durante 18-20 horas a 35°C. A eficácia de um antibiótico ou de uma combinação de antibióticos particular em grandes populações de P. aeruginosa foi determinada através do cálculo dos valores MIC50 e MlCgo- O valor MIC5o foi definido com a concentração de antibiótico (s) que inibia 50% das estirpes de P. aeruginosa. O valor MIC90 foi definido com a concentração de antibiótico(s) que inibia 45 ΡΕ1750667 90% das estirpes de P. aeruginosa (Wiedemann e Grimm, 1996). Método B: As MICs da fosfomicina isoladamente, tobramicina isoladamente, ou combinações de fosfomicina mais tobramicina foram determinadas para estirpes de P. aeruginosa na presença de mucina gástrica suína para avaliar o efeito da mucina e da ligação de proteína na actividade de antibiótico. As metodologias foram idênticas àquelas descritas no Exemplo 5, Método A, com a excepção que se adicionou 2% (peso/volume) de mucina gástrica suína (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) à MHA antes de se autoclavar. Método C: As MICs da amicacina, arbecacina, dibecacina, gentamicina, canamicina, netilimicina, neomi-cina, estreptomicina e tobramicina isoladamente foram determinadas para P. aeruginosa ATCC 27853 pelo método de microdiluição do meio de cultura de acordo com os padrões NCCLS (NCCLS, 2003). A suspensão bacteriana foi diluída 1:100 em meio Mueller-Hinton com ajuste dos catiões (aqui de seguida referido como CAMHB). Pipetou-se cinquenta microlitros de inoculo bacteriano (aproximadamente 2xl05 UFC/mL) em poços individuais de placas de 96 poços contendo 50 pL de CAMHB (Remei, Lenexa, Kansas) suplementado com diluições de duas vezes de antibióticos numa gama de concentração de 0,125 pg/mL a 128 pg/mL. A MIC foi definida como a concentração mais baixa de antibiótico (s) que 46 ΡΕ1750667 prevenia o crescimento visível após incubação a 35°C durante 18-24 horas.

Exemplo 6

Tabuleiro de Sinergia

As potenciais interacções entre fosfomicina e amicacina, arbecacina, dibecacina, gentamicina, canamicina B, neomicina, netilimicina, estreptomicina, ou tobramicina foram determinadas pelo método do tabuleiro (Eliopoulos e Moellering, 1996). Avaliaram-se diluições em série de duas vezes de fosfomicina e aminoglicósidos, que abrangem o valor esperado da MIC para ambos os compostos. As estirpes bacterianas foram inoculadas riscando em agar de sangue e incubadas a 35°C durante 18-24 horas. Duas ou três colónias bacterianas de culturas crescidas durante a noite foram inoculadas em 3 mL de solução salina normal, brevemente agitadas em vértex, e ajustadas a um padrão de McFarland de 0,5 (NCCLS, 2003). Pipetaram-se cinquenta microlitros de inoculo bacteriano (aproximadamente 2xl0s UFC/mL) em poços individuais de placas de 96 poços contendo 50 yL de CAMHB suplementado com os dois antibióticos de interesse diluídos duas vezes. A concentração inibitória fraccional (FIC) foi calculada como a MIC do composto #1 em combinação com um segundo composto, dividida pela MIC do composto #1 isoladamente. Calculou-se uma soma de FIC (SFIC) para cada combinação de fármaco como a soma dos FICs individuais do 47 ΡΕ1750667 composto #1 e #2. O FIC foi calculado como a concentração mais baixa de antibióticos que preveniu um crescimento visível após incubação a 18-20 horas a 35°C. A sinergia foi definida como uma SFIC de ^0,5, a indiferença como um SFIC > 0,5 e < 4, e um antagonismo como uma SFIC >4.0 SFIC mais baixo foi utilizado para uma interpretação final de interacções de fármacos.

Exemplo 7

Determinação de cinética de morte

Realizaram-se várias experiências de curvas de morte na presença de 2% de mucina gástrica suína para avaliar o efeito de mucina e ligação de proteína na actividade do antibiótico. Duas ou três colónias bacterianas foram inoculadas em 10 mL de CAMHB e incuba-se a 35°C num banho de água com agitação (250 rpm) durante 18- 24 horas. Procede-se a uma diluição 1:40 da cultura incubada durante a noite em 10 mL de CAMHB fresco e incubou-se a 35°C num banho de água agitado (250 rpm) durante 1-2 horas. A cultura resultante foi ajustada a um padrão McFarland 0,5 (NCCLS, 2003). Para reduzir a variabilidade na força do inoculo bacteriano quando se comparam múltiplos antibióticos, inoculou-se um tubo principal de CAMHB contendo 2% (peso/volume) de mucina gástrica suína com um inoculo bacteriano com uma diluição de 1:200 (aproximadamente 5xl05 UFC/mL), suplementado com 25 yg/mL de glucose-6-fosfato, e brevemente agitado com um 48 ΡΕ1750667 vórtex. Seguidamente pipetaram-se alíquotas de dez mililitros em tubos cónicos de 50 mL. Adicionaram-se fosfomicina isoladamente, tobramicina isoladamente, e combinações de fosfomicina e amicacina, arbecacina, dibicacina, gentamicina, canamicina, netilimicina, neomicina, estreptomicina, ou tobramicina ao meio de cultura a concentrações iguais a múltiplos de 1, 2, 4, e 8 vezes da MIC da fosfomicina (4 yg/mL) para P. aeruginosa ATCC 27853. A actividade letal da fosfomicina mais amicacina, arbecacina, dibicacina, gentamicina, canamicina, netilimicina, neomicina, estreptomicina, ou tobramicina foi também comparada com a letalidade dos componentes individuais isoladamente. Por exemplo, 32 yg/mL de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1 foi comparada com a letalidade de 28,8 yg/mL de fosfomicina isoladamente e 3,2 yg/mL de tobramicina isoladamente. Em cada experiência correu-se um controlo sem fármaco. As culturas foram incubadas com antibiótico a 35°C num banho de água com agitação (250 rpm) durante 24 horas. A letalidade nas bactérias foi determinada a 0, 1, 2, 4, 6, e 24 horas fazendo diluições em série de 10 vezes das culturas em solução salina normal estéril, e espalhando aliquotas de 100 yL em placas de agar de sangue. As placas de cultura foram incubadas a 35°C durante 18-24 horas e o número de colónias foi enumerado manualmente. O limite de detecção para o método de contagem de colónias foi 1 Logio. Construíram-se curvas de morte através da representação do valor Logio das UFC/mL da cultura em função do tempo. As concentrações de antibiótico que reduziram o inoculo original em >3 Logio UFC/mL foram consideradas 49 ΡΕ1750667 bactericidas, e as concentrações que reduziram o inoculo original em ^2 Logio UFC/mL foram definidas como bacteriostáticas (NCCLS, 1999) . Definiu-se sinergismo por uma redução das contagens das colónias bacterianas de h2 Logio UFC/mL com as combinações de antibióticos em comparação com o antibiótico isolado mais activo (NCCLS, 1999) .

Exemplo 8

Determinação da concentração bactericida mínima (MBC)

As MBCs de fosfomicina, amicacina, arbecacina, dibicacina, gentamicina, canamicina B, netilimicina, neomi-cina, estreptomicina, ou tobramicina isoladamente para P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922, e S. aureus ATCC 29213 foram determinadas pelo método de microdiluição do meio de cultura de acordo com os padrões NCCLS (NCCLS, 1999). As estirpes bacterianas foram inoculadas riscando placas de agar de sangue e foram incubadas a 25°C durante 18-24 horas. Duas a três colónias bacterianas das culturas incubadas durante a noite foram inoculadas em 3 mL de solução salina normal, brevemente agitadas em vórtex, e ajustadas a um padrão McFarland 0,5 (NCCLS, 2003). Pipetaram-se cinquenta microlitros de inoculo bacteriano (aproximadamente 2xl05 UFC/mL) em poços individuais de placas de 96 poços contendo 50 pL de CAMHB (Remei, Lenexa, Kansas) suplementado com diluições de duas vezes de antibióticos na gama de concentração de 0,125 pg/mL a 128 pg/mL. As placas foram incubadas a 35°C durante 18-24 horas 50 ΡΕ1750667 e as MIC determinadas como descrito no Exemplo 5, Método C. O conteúdo dos poços que não apresentavam crescimento (MIC e acima) foram misturados com um pipetador e amostras de 10 pL em duplicado foram espalhadas em placas de agar de sangue. As placas de cultura foram incubadas a 35°C durante 18-24 horas e o número de colónias bacterianas em cada placa foi enumerado manualmente. Os valores de rejeição foram determinados pelos métodos NCCLS que consideram a força final do inoculo, a amostragem simples ou dupla, o erro de pipetagem, e a distribuição de Poisson das respostas das amostras (NCCLS, 1999). Por exemplo, se o inoculo final era de 5xl05 CFU/mL e se tiverem sido avaliadas amostras em duplicado, a diluição mais baixa contendo menos do que um total de 25 colónias foi considerada a MBC. A MBC foi definida como a diminuição ^3 Logio em UFC/mL do inoculo original tal como descrito pelas normas NCCLS (NCCLS, 1999). As razões MBC/MIC foram calculadas dividindo a MBC pela MIC.

Exemplo 9

Determinação da frequência de resistência num só passo A frequência de mutação de resistência espontânea num só passo foi determinada para 5 estirpes de P. aeruginosa susceptiveis. O inoculo bacteriano foi preparado através da inoculação de 5 mL de CAMHB com 2-3 colónias bacterianas e incubação a 35 °C num banho de água com agitação (250 rpm) durante 18 h. Preparou-se uma diluição 51 ΡΕ1750667 1:20 da cultura incubada durante a noite em 50 mL de CAMHB fresco num balão erlenmeyer de 125 mL e incubou-se a 35°C num banho de água agitado (250 rpm) durante 8 horas. As culturas foram centrifugadas a 2500 rpm, temperatura ambiente, durante 20 min. O sobrenadante foi removido por decantação e o sedimento de 50 mL de cultura foi ressuspendido em 500 pL-1000 pL CAMHB. As UFC/mL na suspensão bacteriana foram determinadas preparando diluições em série de 10 vezes em solução salina normal, e espalharam-se alíquotas de 100 pL em placas de agar de sangue. As placas de cultura foram incubadas a 35°C durante 18-24 horas e o número de colónias foi enumerado manualmente. Espalharam-se cem microlitros de suspensão de células bacterianas (aproximadamente 109 UFC) em placas MHA contendo 128 pg/mL de fosfomicina, 8 pg/mL de tobramicina, ou 128 pg/mL de fosfomicina mais 8 pg/mL de tobramicina. As placas de cultura foram incubadas a 35°C durante 48-72 horas e o número de colónias em cada placa foi enumerado manualmente. A frequência de resistência foi calculada através da divisão do número de bactérias que crescem à concentração de antibiótico definida pelo número de bactérias no inoculo original. Avaliaram-se mutantes representativos relativamente a alterações na MIC para fosfomicina isoladamente, tobramicina isoladamente, e combinações de fosfomicina mais tobramicina tal como descrito no Exemplo 5, Método A. 52 ΡΕ1750667

Exemplo 10

Análise de resistência em vários passos O desenvolvimento de resistência durante passagem em série continua foi avaliada com uma estirpe clinica de P. aeruginosa susceptivel à fosfomicina (MIC=8 yg/mL)e tobramicina (MIC=0,5 yg/mL). Inoculou-se uma única colónia de P. aeruginosa COR-014 em 5 mL de MHCAB e agitou-se brevemente em vórtex. Preparam-se em CAMHB diluições de duas vezes em série de fosfomicina isoladamente cobrindo a gama de 1 yg/mL - 512 yg/mL, tobramicina isoladamente cobrindo 0,0625 yg/mL - 512 yg/mL, e uma combinação fosfomicina:tobramicina a 9:1 cobrindo 0,0625 yg/mL - 512 yg/mL. Pipetaram-se dez microlitros de suspensão bacteriana em 3 mL de cada uma das diluições de antibiótico e incubou-se sem agitação a 35°C durante 18-24 horas. Os tubos com a concentração mais elevada de antibiótico com crescimento bacteriano visivel foram seleccionadas de cada série de diluição de antibiótico e pipetou-se 100 yL da cultura numa série de diluição de antibiótico fresca. Os tubos foram incubados sem agitação a 35°C durante 18-24 horas. Este processo foi repetido durante um total de 28 vezes. Determinaram-se as MICs da fosfomicina isoladamente, da tobramicina isoladamente, e da fosfomicina mais tobramicina para a estripe parental e para os isolados resistentes recolhidos após cada passagem como descrito no Exemplo 5, Método C. 53 ΡΕ1750667

Exemplo 11

Determinação da eficácia em modelo animal A eficácia in vivo da fosfomicina isolada, da tobramicina isolada e de combinações de fosfomicina mais tobramicina aerossolizados foi avaliada contra E. coli ATCC 25922 e P. aeruginosa ATCC 27853 em pulmões de rato. O inoculo bacteriano utilizado para estabelecer as infecções no pulmão de rato consistiu numa mistura de bactérias e esferas de agarose. Riscaram-se E. coli ATCC 25922 ou P. aeruginosa ATCC 27853 em placas de agar de sangue e incubou-se durante 18-24 horas a 35°C. Duas a três colónias foram inoculadas em 10 mL de Tryptic Soy Broth (aqui de seguida referido como TSB) e incubou-se sem agitação a 35°C durante 1,5 a 2 horas. A cultura foi ajustada a uma densidade óptica de 0,1 (625 nm) em TSB fresco e depois diluida 1:5 em TSB. Adicionou-se um mililitro de suspensão bacteriana (aproximadamente 107 UFC/mL) a 10 mL de uma solução de agar purificado a 2% e misturou-se brevemente por inversão. A mistura foi adicionada a 150 mL de fracção pesada de óleo mineral branco, equilibrada a 55°C e agitada em gelo durante 5 minutos. A suspensão arrefecida foi vertida para um tubo de centrífuga de 250 mL e centrifugada a 3000 rpm, 4°C durante 10 minutos. O sobrenadante foi separado por decantação, o sedimento foi ressuspendido em 25 mL de solução salina normal estéril, e transferida para 54 ΡΕ1750667 um tubo de centrífuga cónico. Após a centrifugação a 3000 rpm, 4°C, durante 10 minutos, o sobrenadante foi separado por decantação. o sedimento foi ressuspendido em aproximadamente 10 mL de solução salina estéril normal e depois diluído 1:30 numa solução de esferas de agarose a 2% estéril para originar aproximadamente 10-1000 UFC/mL.

Antes da instalação intratraqueal do inoculo bacteriano, anestesiaram-se ratos Sprague-Dawly (200-250 g) por exposição a isoflurano durante 5 minutos. Inseriu-se uma agulha intratraqueal na traqueia e instilou-se 80 pL de esferas de agarose contendo aproximadamente 10-100 UFC de E. coli ATCC 25922 ou P. aeruginosa ATCC 27853 nos pulmões com uma seringa de 1 mL. Colocaram-se os ratos em gaiolas individuais e deixaram-se recuperar durante aproximadamente 18 horas.

Administraram-se aos ratos fosfomicina isoladamente, tobramicina isoladamente, e combinações de fosfomicina : tobramicina utilizando um dispositivo de exposição a aerossol (In Tox Products, Novo México). O sistema consistiu numa câmara central com vias de fornecimento e exaustão de aerossol separadas. A câmara central tem 24 portas que foram ligadas directamente ao sistema de fornecimento de aerossol. Os ratos foram colocados em tubos de exposição ao aerossol individuais e presos com uma placa ajustável e um conjunto de tampa de modo que não pudessem voltar-se ou recuar da extremidade do tubo. Os tubos de 55 ΡΕ1750667 contenção contendo os ratos foram carregados nas portas na câmara central e o fluxo de ar foi ajustado a 1 litro/min. O fluxo de ar (ar de qualidade respirável) para o nebulizador PARI LC Star foi mantido constante a 6,9 litros por minuto. Nebulizaram-se fosfomicina isoladamente, tobramicina isoladamente ou combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 ou 7:3 a 0,2 mL/min e administrou-se aos ratos através da via de fornecimento de aerossol. Administrou-se ar adicional (aqui de seguida referido como ar de diluição) ao nebulizador para equilibrar a sobrepressão do ar utilizado para administrar os fármacos aerossolizados aos ratos. Os roedores foram expostos a antibióticos aerossolizados durante 2 horas, duas vezes por dia, durante 3 dias consecutivos. Cada grupo de tratamento consistiu em 5-8 animais por grupo. Foi incluído em cada experiência um controlo sem tratamento. A letalidade nas bactérias foi avaliada 18 horas após a última exposição. Os ratos foram anestesiados com isoflurano e submetidos a eutanásia por administração intraperitoneal de 500 pL de fenobarbitol. Os pulmões foram removidos assepticamente, removeu-se o excesso de tecido e determinou-se o peso dos pulmões. Os pulmões foram colocados em frascos de vidro de 10 mL, e adicionou-se 3 mL de solução salina estéril normal por grama de tecido. As amostras foram homogeneizadas com um homogeneizador portátil durante 30 segundos. Determinou-se a letalidade nas bactérias fazendo diluições de 10 vezes em série do 56 ΡΕ1750667 homogeneizado de pulmão em solução salina normal estéril, e espalhou-se aliquotas de 100 pL em placas de agar de sangue. As placas de cultura foram incubadas a 35°C durante 18-24 horas e o número de colónias bacterianas foi enumerado manualmente. A eficácia do antibiótico foi determinada comparando as UFC/pulmão do grupo de controlo sem tratamento com os grupos tratados.

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Lisboa, 3 de Março de 2011

Claims

1 ΡΕ1750667 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação em pó seco sob forma de aerossol para a prevenção e o tratamento de infecção causada por bactérias susceptíveis no tracto respiratório de um paciente, compreendendo a referida formulação de 1 mg a 300 mg de fosfomicina, 1 mg a 300 mg de tobramicina, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tendo a referida formulação um tamanho de partícula entre 1-5 pm; e sendo a referida formulação adaptada à administração para a via pulmonar por um inalador de um pó seco; em que a razão ponderai de fosfomicina em relação à tobramicina é de 5 a 9 partes de fosfomicina para de 1 a 5 partes de tobramicina.

2/21 ΡΕ1750667 Figura 2. Curvas de tempo de morte para uma combinação de fosfomicina:tobramicina 9:1 contra P. aeruginosa ATCC 27853. Símbolos: Δ controlo sem fármaco, A fosfomicina (14,4 yg/mL), · tobramicina (1,6 yg/mL), fosfomicina (14,4 yg/mL) + tobramicina (1,6 yg/mL), e linha bactericida.

2. Uma formulação em aerossol para a prevenção e o tratamento de infecção causada por bactérias susceptíveis no tracto respiratório de um paciente, compreendendo a referida formulação de 1 mg a 300 mg de fosfomicina, 1 mg a 300 mg de tobramicina, e 0,5-7 mL de uma solução contendo uma concentração de cloreto >30 mM; sendo a referida formulação adaptada à administração para a via pulmonar por aerossolização utilizando um nebulizador capaz de produzir um aerossol com uma distribuição de tamanho de partícula predominante entre 1-5 pm; e em que a razão ponderai de fosfomicina em relação à tobra- 2 ΡΕ1750667 micina é de 5 a 9 partes de fosfomicina para de 1 a 5 partes de tobramicina.

3/21 ΡΕ1750667 Figura 3. Curvas de tempo de morte para uma combinação de fosfomicina:tobramicina 8:2 contra P. aeruginosa ATCC 27853. Símbolos: Δ controlo sem fármaco, A fosfomicina (25,6 yg/mL), · tobramicina (6,4 yg/mL), fosfomicina (25,6 yg/mL) + tobramicina (6,4 yg/mL), e --- linha bactericida.

3. A formulação das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pela razão ponderai de fosfomicina em relação à tobramicina ser de 7 a 9 partes de fosfomicina para de 1 parte a 3 partes de tobramicina.

4/21 ΡΕ1750667 Figura 4. Curvas de tempo de fosfomicina:tobramicina 8:2 27853. Símbolos: Δ controlo (12,8 pg/mL), · tobramicina (12,8 pg/mL) + tobramicina bactericida. morte para uma combinação de contra P. aeruginosa ATCC sem fármaco, A fosfomicina (3,2 pg/mL), fosfomicina (3,2 pg/mL), e --- linha

4. A formulação das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pela razão ponderai de fosfomicina em relação à tobramicina ser de 8 partes de fosfomicina para 2 partes de tobramicina.

5/21 ΡΕ1750667 Figura 5. Curvas de tempo de fosfomicina:tobramicina 7:3 27853. Símbolos: Δ controlo (22,4 pg/mL), · tobramicina (22,4 pg/mL) + tobramicina bactericida. morte para uma combinação de contra P. aeruginosa ATCC sem fármaco, A fosfomicina (9,6 pg/mL), fosfomicina (9,6 pg/mL), e --- linha

5. A formulação de aerossol de qualquer uma das reivindicações 2-4 em que a referida formulação é embalada numa ampola dupla de tal modo que cada antibiótico é formulado individualmente em água e o pH é ajustado de tal forma que a solução de fosfomicina tenha um pH entre 8-13 e a solução de tobramicina tenha um pH entre 1-6 e, quando a ampola dupla é aberta e o conteúdo reconstituído, a solução resultante tem um pH entre 4,5 e 8,0.

6/21 ΡΕ1750667 Figura 6. Curvas de tempo de fosfomicina:tobramicina 7:3 27853. Símbolos: Δ controlo (11,2 pg/mL), · tobramicina (11,2 pg/mL) + tobramicina bactericida. morte para uma combinação de contra P. aeruginosa ATCC sem fármaco, A fosfomicina (4,8 pg/mL), fosfomicina (4,8 pg/mL), e --- linha

6. A formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-4 na forma de uma solução reconstituída de 1 a 300 mg de fosfomicina ela 300 mg de tobramicina suspendida em 0,5-7 mL de uma solução fisiologicamente adequada. 3 ΡΕ1750667

7/21 ΡΕ1750667 Figura 7. Curvas de tempo de morte para uma combinação de fosfomicina:tobramicina 7:3 contra P. aeruginosa ATCC 27853. Símbolos: Δ controlo sem fármaco, A fosfomicina (5,6 pg/mL), · tobramicina (2,4 pg/mL), fosfomicina (5,6 pg/mL) + tobramicina (2,4 pg/mL), e --- linha bactericida.

7. A utilização de uma formulação de aerossol compreendendo 1 a 300 mg de fosfomicina mais 1 a 300 mg de tobramicina suspendida em 0,5-7 mL de uma solução fisiolo-gicamente adequada, para o fabrico de um medicamento para a prevenção e o tratamento de infecções do tracto respiratório causadas por bactérias e adequada para administração a um paciente que necessite de tal tratamento em que a razão ponderai de fosfomicina para tobramicina é de 5 a 9 partes de fosfomicina para de 1 parte a 5 partes de tobramicina.

8/21 ΡΕ1750667 Figura 8. Curvas de tempo de morte para tobramicina isoladamente e combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3 contra P. aeruginosa ATCC 27853. Os antibióticos foram avaliados a 32 pg/mL. Simbolos: Δ 9:1, A 8:2, · 7:3, O tobramicina, e --- linha bactericida.

8. A utilização da reivindicação 7, em que a razão ponderai de fosfomicina para tobramicina é de 7 a 9 partes de fosfomicina para de 1 parte até 3 partes de tobramicina.

9/21 ΡΕ1750667 Figura 9. Curvas de tempo de morte para tobramicina isoladamente e combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2 e 7:3 contra P. aeruginosa ATCC 27853. Os antibióticos foram avaliados a 16 pg/mL. Simbolos: Δ 9:1, A 8:2, · 7:3, O tobramicina, e --- linha bactericida.

9. A utilização da reivindicação 7, em que a razão ponderai de fosfomicina para tobramicina é de 8 partes de fosfomicina para 2 partes de tobramicina.

10/21 ΡΕ1750667 Figura 10. Curvas de tempo de morte para uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1, contra P. aeruginosa ATCC 27853. Símbolos: Δ controlo sem fármaco, □ 4,0 yg/mL, 8,0 yg/mL, O 16 yg/mL, · 32 yg/mL, e --- linha bactericida.

10. A utilização de qualquer uma das reivindicações 7-9, em que a referida formulação tem um pH entre 4,5 e 8,0 em água com uma concentração de cloreto >30 mM.

11/21 ΡΕ1750667 Figura 11. Curvas de tempo de morte para uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2, contra P. aeruginosa ATCC 27853. Símbolos: Δ controlo sem fármaco, □ 4,0 yg/mL, 8,0 yg/mL, O 16 yg/mL, · 32 yg/mL, e --- linha bactericida.

11. A utilização de qualquer uma das reivindicações 7-9, em que a referida formulação é para administração por aerossolização utilizando um nebulizador de jacto, ultrassónico, pressurizado ou poroso vibratório e 4 ΡΕ1750667 o aerossol compreende uma distribuição de tamanho de partícula predominantemente entre 1 e 5 pm,

12/21 ΡΕ1750667 Figura 12. Curvas de tempo de morte para uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 7:3, contra P. aeruginosa ATCC 27853. Símbolos: Δ controlo sem fármaco, □ 4,0 yg/mL, 8,0 yg/mL, O 16 yg/mL, · 32 yg/mL, e --- linha bactericida.

12. A utilização de qualquer uma das reivindicações 7-9, em que as infecções são causadas pela bactéria P. aeruginosa ou S. aureus.

13. A utilização de qualquer uma das reivindicações 7-9, em que o tratamento de infecções do tracto respiratório são seleccionadas do grupo que consiste em sinusite bacteriana, fibrose quística, Pseudomonas pulmonar crónica, bronquiectasia, pneumonia associada ao hospital ou à comunidade e pneumonia associada à ventilação mecânica. Lisboa, 3 de Março de 2011 1/21 ΡΕ1750667 Figura 1. Curvas de tempo de fosfomicina:tobramicina 9:1 27853. Símbolos: Δ controlo (28,8 pg/mL), · tobramicina (28,8 pg/mL) + tobramicina bactericida. morte para uma combinação de contra P. aeruginosa ATCC sem fármaco, A fosfomicina (3,2 pg/mL), I fosfomicina (3,2 pg/mL), e --- linha

13/21 ΡΕ1750667 Figura 13. Morte de E. coli no pulmão de rato após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma solução de combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1.

Duração do Tratamento (min) 14/21 ΡΕ1750667 Figura

14. Morte de E. colí no pulmão de rato após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma solução de combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2. o «te E υ IL D 1.0E+071.0E+061.0E+05 1.0E+Q2

Cont,o|° 15 30 45 Duração do Tratamento (min) ΡΕ1750667 15/21 Figura

15. Morte de E. coli no pulmão de rato após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma solução de combinação de fosfomicina:tobramicina a 7:3. 1.1 1.0E+Q6 1 o >ÍS JE 1.a. u 1.0E+031.0B02 1.0E+01

•pçf ή ,Ί , "J J · V κ '5 I \ ut ) , ' c I í «v Λι®\·| S * S siSlfc J í .·.· o.í I Controlo 15 30 45 60 Duração do Tratamento fmin) í.............

16/21 ΡΕ1750667 Figura 16. Morte de E. coli no pulmão de rato após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma solução de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1 e uma solução de 28 mg/mL de fosfomicina isoladamente. Os ratos froam expostos ao antibiótico aerossolizado durante 1 hora, duas vezes por dia, durante 3 dias. $ j j 1.0E+Q7 1,ΟΕ+ϋδ O £ 3a. o IL D 1.0E+G3 1.GE+021.0E+01

Controlo F9:T1 F9 Duração do Tratamento (min) 17/21 ΡΕ1750667 Figura

17. Morte de E. coli no pulmão de rato após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma solução de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2 e uma solução de 3,1 mg/mL de tobramicina isoladamente. Os ratos foram expostos ao antibiótico aerossolizado durante 1 hora, duas vezes por dia, durante 3 dias. 10E+07 | o E 3Ú.υ IL D 1.0E+Q31.0E+02

Duração do Tratamento (min) 18/21 ΡΕ1750667 Figura

18. Morte de E. coli no pulmão de rato após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma solução de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2 ou uma solução de 40 mg/mL de tobramicina isoladamente. Os ratos foram expostos ao antibiótico aerossolizado durante 1 hora, duas vezes por dia, durante 3 dias.

Controlo Tobramicina F8:T2 1.GE+06 -I o E t.GE+04 -i 3 fL <3 1.0E+03 D 1 ,OE+02 1.QE+G1 Tratamento 19/21 ΡΕ1750667 Figura

19. Morte de P. aeruginosa no pulmão de rato após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma solução de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2 ou uma solução de 24,9 mg/mL de fosfomicina isoladamente. Os ratos foram expostos ao antibiótico aerossolizado durante 1 hora, duas vezes por dia, durante 3 dias. 1.0E+061.QE+051.0E+04o >«E 3ο 1.0E+03 IL D 1.QE+021.0E+01

Controlo B:T2 F8Duração do Tratamento (min) ΡΕ1750667 20/21 Figura

20. Morte de P. aeruginosa no pulmão de rato após a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma solução de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2 e uma solução de 6,2 mg/mL de tobramicina isoladamente. Os ratos foram expostos ao antibiótico aerossolizado durante 1 hora, duas vezes por dia, durante 3 dias. 10E+Q4 Q t(QE 3 CL υ IL 3 1.0E+01

Duração do Tratamento (min) 21/21 ΡΕ1750667 Figura

21. Morte de P. aeruginosa no pulmão de rato após a administração de um aerossol de soluções a 60 mg/mL e 90 mg/mL de uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 8:2. Os ratos foram expostos ao antibiótico aerossolizado durante 1 hora, duas vezes por dia, durante 3 dias.

I 1.0E+07 j 1.DE+06 1.0E+05 1 1.0E+04 3 CL □ 1.0E+03 1.0E+02 1.0Ê+01Controlo $Q 90 Hig/mlDuração do Tratamento (min) 1 ΡΕ1750667 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição m 2353131:051 AI ♦ WG 03035030 Â. Literatura que não é de patentes citada na Descrição « OKAZAKi *1 ei ai. EffscfJwessoftosSbmyap osm- Sbáfssá Mts stf bsr afstacre&Mil sgsr-ís aga-tess. muiiifd -ttíg-assístarÈ Pseaâsmanae «efeprass® ísoMss us-§*S tra® fexte* assoj· 5 MFSCT ChEMDTHER. SSCS.wsí. 8,:37-42 « T£SSi5RF>eía!. 5a tfKro âSíi.v;S.yof fcsidrayvífí cústv ibírse#^ oeiteskSme. irragsaftrm sf&.sc&í atas as-'jssSSBsacJn sgawsl Psaudaraems se^girasa. EUR J. GM M1CROBÍQL £KS. W, «foi 10.159-1 €2 - TAKÂRASÍ15, K. si ai. Açíwjfew »1 sosrs- h«s&jas ai Bela iadísim*. fosisaiycm and fcbrsssy-an agaiTiSt FseuaDfwrias wm^tfxsa.A^TikSCRC^ SÍAL AGENTE Am CHEMQTHERAPV íiov&re&sr 1384. vá 28(5,),.703-731 * TOiiW. D J. ftí ai. snnaistien ot AtifcbssBis ia íassc : fiSrasis EUfiOfSm RESP-RA TORY JGuRmp 1335. vri. 5. 1554-1504 * DÒRiWS, β. et si -ÀmsiKát «waoy sgs^iPssíí-smosss asrogiRsss is cvs.%5 fibfo&fe.·. .s Euaspsasi fíifKSfisu?. EtmpEW RESPiRATORV MM- : awl. 2008. «a. fAShW: «:· Af-Ata-sã. M.; Fi SSÉen S, ftiapa»·': P,A. Stockton; M.i. istísoH; M.XWstsh-sw. Rsnai t:~;- psawssnt ia «^soc *»«5k sstwnts «isto rapgsieè IstoeRavis satftagiycastig .as®.· Peã FéMm.< m&vai ÔO. S5T28 * Anserg, K,; K.-D. SSaíter · W, Wfóps. CscRpensc® s? «stMorj asa -«f· *ηφ§®«κ ás)mnalasfscs)cssg^slPsssicis^0(íss&m5gtes333 isoiàtes fro<R c>sk j&stesis 'mfàzét. 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