PT2266534E - Combinação fosfomicina/aminoglicósido num aerossol para o tratamento de infecções respiratórias devidas a bactérias - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMBINAÇÃO FOSFOMICINA/AMINOGLICÓSIDO NUM AEROSSOL PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS DEVIDAS A BACTÉRIAS"

Domínio da Invenção A invenção corrente diz respeito a uma formulação nova, segura, não irritante e fisiologicamente compatível, inalável, de uma combinação de fosfomicina e um amino-glicósido, adequada para o tratamento de fibrose quistica, provocada por bactérias Gram-negativas, tais como a

Burkholderia cepacia, a espécie Citrobacter, a Escherichia coli, a espécie Enterobacter, a espécie Fusobacterium, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneunoniae, Klebsiella oxytoca, Moraxella catarrhalis, Proteus mirabilis, a espécie Prevotella, Pseudomonas aeruginosa, Serratia mar-cescens, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xyloso-xidans, e bactérias Gram-positivas, tais como Staphylo-coccus aureus resistente à meticilina, Staphylococcus aureus sensivel à meticilina, Streptococcus pneumoniae, e espécie Streptococcus β-hemolitica.

Antecedentes da Invenção A terapia mais habitualmente reconhecida para tratar infecções respiratórias provocadas por bactérias 2 ΡΕ2266534

Gram-negativas em pacientes com fibrose quística envolve a administração endovenosa de um único antibiótico ou de combinações de antibióticos (Gibson et al., 2003; Ramsey, 1996). Eeste método de tratamento apresenta diversas limitações significativas, incluindo: (1) um espectro estreito de actividade dos antibióticos existentes, (2) concentrações insuficientes de antibiótico que alcançam o tracto respiratório, para assegurar um inicio rápido e taxas elevadas de mortalidade das bactérias, e (3) o desenvolvimento de efeitos colaterais adversos devido às concentrações sistémicas elevadas do fármaco. A administração de aerossóis de antibióticos (Conway, 2005; 0'Riordan, 2000) ataca diversas das limitações na administração parenteral (Flume e Klepser, 2002; Kuhn, 2001) . Ela permite uma entrega tópica de concentrações elevadas do fármaco nos espaços endobrônquicos e diminui os efeitos colaterais por diminuir a exposição sistémica ao antibiótico. No entanto, os pacientes com fibrose quistica recebem tipicamente terapias prolongadas e repetidas com antibióticos ao longo da totalidade da duração das suas vidas como adultos (Gibson et al., 2003;

Ramsey, 1996). Portanto, a toxicidade acumulada de amino-glicósidos e o desenvolvimento de resistência permanecem como problemas significativos.

Fosfomicina A fosfomicina é um antibiótico de ácido fosfónico com um largo espectro (Kahan et al., 1974; Woodruff et al., 3 ΡΕ2266534 1977) com actividade bactericida contra bactérias Gram-negativas, incluindo Citrobacter spp., E. coli, Entero-bacter spp., K. pneumoniae, P. aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., e S. marcescens (Greenwood et al., 1992; Grimm, 1979; Marchese et ai., 2003; Schulin, 2002), bem como contra bactérias Gram-positivas, incluindo enterococos resistentes à vancomicina, S. aureus resistentes à meticilina (MRSA), S. aureus sensiveis à meticilina (MSSA), e S. pneumonia (Greenwood et ai., 1992; Grimm, 1979; Perri et al., 2002) . A fosfomicina apresenta a maior actividade contra E. coli, Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp., e S. marcescens, que em geral são inibidos a concentrações em fosfomicina ^ 64 yg/mL (Forsgren e Walder, 1983) . A fosfomicina é moderadamente active contra P. aeruginosa (Forsgren e Walder, 1983) , em especial quando se compara com a tobramicina (Schulin, 2002) . A fosfomicina é bactericida mas exibe dependência do tempo na aniquilação de E. coli e de S. aureus (Grif et al., 2001). A taxa e o grau de aniquilação dependem da extensão do período durante o qual a fosfomicina estiver em contacto com o organismo alvo (Craig, 1998; Mueller et al., 2004). Um aumento da concentração em fosfomicina não origina um aumento correspondente na taxa ou no grau de actividade aniquilante. Esta característica é significativa porque é preferível tratar infecções por P. aeruginosa com antibióticos que exibam uma actividade bactericida, aniquilante, dependente da concentração (Craig, 1998; Mueller et al., 2004). 4 ΡΕ2266534 A monoterapia com fosfomicina é habitualmente utilizada no tratamento de infecções não complicadas do tracto urinário provocadas por E. coli, e menos frequentemente no tratamento de infecções respiratórias bacterianas, incluindo nos pacientes com fibrose quística (Kamijyo et al., 2001; Katznelson et al., 1984; Kondo et al., 1996; Reeves, 1994; Bacardi et al., 1977; Bonora et al., 1977; Honorato et al., 1977; Menendez et al., 1977). No entanto, a fosfomicina por si só não tem sido largamente utilizada para tratar infecções provocadas por P. aeruginosa. A fosfomicina tem sido administrada por via parenteral em combinação com antibióticos de diferentes classes para tratar a endocardite (Moreno, et al., 1986) e a fibrose quística (Mirakhur et al., 2003) mas não tem sido veiculada directamente ao ambiente pulmonar por administração em aerossol. A fosfomicina encontra-se disponível tanto sob forma de formulação oral (fosfomicina cálcica e fosfomicina trometamol) como endovenosa (fosfomicina dissódica) (Woodruff et al., 1977). A fosfomicina trometamol é a formulação preferida para administração por via oral porque é mais facilmente absorvida para o sangue em comparação com a fosfomicina cálcio. Após uma única dose endovenosa ou intramuscular de 2 g de fosfomicina, os picos das concentrações no soro variam entre 25-95 yg/mL adentro de 1-2 horas (Woodruff et al., 1977). Em comparação, as concentrações atingem os 1-13 yg/mL num pulmão normal após uma 5 ΡΕ2266534 administração parenteral de uma dose comparável de fosfomicina (Bonora et al., 1977), o que é insuficiente para matar a maior parte dos patogénicos bacterianos, e em especial P. aeruginosa (Forsgren e Walder, 1983; Schulin, 2002). Os pacientes com fibrose quistica denotam farmaco-cinéticas alteradas caracterizadas por um maior volume de distribuição e uma maior velocidade de eliminação (Tan et al., 2003), e isto presumivelmente diminuiria ainda mais a eficácia de fosfomicina que se lhes administrasse por via parenteral. A fosfomicina distribui-se largamente por diversos tecidos corporais, mas não se liga significativamente às proteínas do plasma (Mirakhur et al., 2003). Em consequência, a fosfomicina encontra-se disponível para exercer efeitos antibacterianos quando atinge concentrações suficientes no local da infecção. O aparelho respiratório dos pacientes com fibrose quistica está obstruído com secreções viscosas denominadas expectoração (Ramsey, 1996) . A eficácia de diversos antibióticos tais como os aminoglicósidos e as β-lactamas é diminuída devido à sua dificuldade de penetração na expectoração. Além disto, a actividade destes antibióticos é ainda mais diminuída por se ligarem a componentes da expectoração (Hunt et al., 1995; Kuhn, 2001; Ramphal et al., 1988; Mendelman et al., 1985). O desenvolvimento de resistência nas bactérias isoladas dos pacientes tratados com fosfomicina devido a 6 ΡΕ2266534 infecções do tracto urinário ocorre muito raramente (Marchese et ai., 2003). Não ocorre resistência cruzada com outras classes de antibióticos inibidores das paredes celulares porque a fosfomicina actua sobre o enzima fosfoenol-piruvato (UDP-N-acetilglucosamina enolpiruvato-transferase) que não é alvejado por outros antibióticos (Kahan et ai., 1974; Woodruff et ai., 1977). A fosfomicina é activamente importada pelas células bacterianas por dois sistemas de transporte; um transporte funcional constitutivo de L-a-glicerofosfato e o sistema de captação de hexose-fosfato (Kahan et ai., 1974). Quando ocorre a resistência à fosfomicina, ela é tipicamente devida a uma mutação genética num ou em ambos os sistemas de transporte codificados nos cromossomas, e menos habitualmente devida a enzimas modificantes (Area et al., 1997; Nilsson et al., 2003).

Tobramicina A tobramicina é uma aminoglicósido antibiótico que é activo contra bacilos aeróbicos Gram-negativos incluindo P. aeruginosa, E. coli, Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., K. pneumoniae, Proteus spp., Salmonella spp., S. marcescens, e Shigella spp. (Vakulenko e Mobasheiy, 2003). Em especial, a tobramicina é fortemente activa contra P. aeruginosa. Os MIC face à tobramicina, de P. aeruginosa susceptiveis, são tipicamente inferiores a 2 yg/mL (Shawar et al., 1999; Spencker et al., 2002; Van Eldere, 2003). A maior parte das bactérias Gram-positivas são resistentes à tobramicina, com excepção de S. aureus e de S. epidermidis (Vakulenko e Mobashery, 2003). 7 ΡΕ2266534 A tobramicina é rapidamente bactericida e exibe uma potência aniquilantes dependente da concentração (Vakulenko e Mobashery, 2003) . Aumentando a concentração de tobramicina, aumenta tanto a velocidade como a extensão da aniquilação de bactérias. Portanto, para se atinqir um sucesso terapêutico, é necessário administrar uma dose suficientemente grande para produzir um teor de pico de tobramicina 5-10 vezes maior do que o MIC do organismo alvo, no local da infecção. É preferível tratar infecções por P. aeruginosa com antibióticos que exibam uma actividade bactericida aniquilante, dependente da concentração, (Ansoxg et al, 1990).

Administra-se em geral a tobramicina para se tratarem infecções menos graves com bactérias Gram-negativas (Vakulenko e Mobashery, 2003). No entanto, ela pode ser combinada com outras classes de antibióticos para tratar infecções severas do tracto urinário e do abdómen, bem como na endocardite e na bacteriemia (Vakulenko e Mobashery, 2003). A administração parenteral de tobramicina em combinação com antibióticos inibidores das paredes celulares tem disso utilizada para tratar infecções respiratórias, em especial as provocadas por P. aeruginosa em pacientes com FQ (Gibson et al., 2003; Lang et al., 2000; Ramsey et al., 1999; Ramsey et al., 1993; Smith et al., 1999; Spencker et al., 2003). A tobramicina é pouco absorvida quando adminis- ΡΕ2266534 trada por via oral, e tem que se administrada por via parenteral (Hammett-Stabler e Johns, 1998). A tobramicina encontra-se disponível tanto em formulações endovenosas como de aerossol. Após uma administração parenteral, a tobramicina encontra-se distribuída sobretudo no fluido extracelular. A tobramicina é rapidamente excretada por filtração glomerular, resultando numa vida média no plasma de 1-2 horas (Tan et al., 2003). A penetração da tobramicina através das secreções respiratórias é muito fraca e a sua actividade ainda é mais diminuída por ligação à expectoração (Kuhn, 2001). A administração de tobramicina em aerossol resulta em teores significativamente maiores na expectoração, ^ 1.000 yg/mL (Geller et al., 2002) em comparação com a administração parenteral, mas a ligação à expectoração continua a ser um problema significativo (Hunt et al., 1995; Mendelman et al., 1985; Ramphal et al., 1988) . A nefrotoxicidade e a ototoxicidade são reacções adversas associadas à terapia com tobramicina (Al-Aloui et al., 2005; Hammett-Stabler e Johns, 1998). A nefrotoxi-cidade provém da acumulação de tobramicina nos lisossomas das células epiteliais que recobrem os túbulos proximais. Isto provoca uma alteração das funções da célula e em última análise uma necrosa de célula (Mingeot-Leclercq e Tulkens, 1999). Clinicamente, isto apresenta uma falha renal nonoligúrica. A prevalência da nefrotoxicidade em pacientes com fibrose quistica é estimada como sendo 31-42 % (Al-Aloui et al., 2005) . Estima-se que a incidência da 9 ΡΕ2266534 ototoxicidade, que se caracteriza por uma perda da audição e por tonturas, atinja até 25 % dos pacientes tratados com aminoglicósidos (Hammett-Stabler e Johns, 1998). Ao contrário da nefrotoxicidade, a ototoxicidade é irreversível. 0 maior factor de risco no desenvolvimento da toxicidade é a exposição acumulada a doses grandes de tobra-micina (Hammett-Stabler e Johns, 1998; Mingeot-Leclereq e Tulkens, 1999). Os pacientes com fibrose quistica são tratados com doses elevadas de tobramicina, prolongada e repetidamente, todo ao longo da sua vida (Tan et al., 2003), encontrando-se sob risco aumentado de desenvolver falha renal cumulativa (Al-Aloui et al., 2005). A resistência bacteriana à tobramicina tem-se tornado cada vez mais prevalente e é devida à utilização repetida e prolongada de monoterapias com antibiótico (Conway et al., 2003; Van Eldere, 2003; Mirakhur et al., 2003; Pitt et al., 2005; Schulin, 2002). Por exemplo, os pacientes com fibrose quistica estão colonizados com estirpes de P. aeruginosa que são largamente resistentes a tobramicina, gentamicina, ceftazidina, piperacilina, e ciprof loxacina (Eldere, 2003; Pitt et al., 2005; Pitt et al., 2003; Weiss e Lapointe, 1995). Por esta razão, as terapias com antibióticos já existentes estão a tornar-se cada vez menos eficazes para tratar infecções com P. aeruginosa, por causa da resistência aos fármacos. OKAZAKI, M. et al.: "Effectiveness of fosfomycin combined with other antimicrobial agents agaisnt mutidrug- 10 ΡΕ2266534 resistante Pseudomonas aeruginosa isolates using time index assay", J. Infect. Chemother., 8, 2002, páginas 37-42; TESSIER, F. et ai.: "In vitro activity of fosfomycin combined with ceftazidine, imipenem, amikacin and ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa", Eur. J. Clin. Microbiol. Dis. 16, 1997, páginas 159, 162; TAKAHASHI, K. et al"Synergistic Activities of combinations of Beta lactams, fosfomycin and tobramycin against Pseudomonas aeruginosa", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 26(5), Novembro de 1994 (1984/11), páginas 798-791, WO 03/035030; US 2003/191051; TOUW, D. J., et al.: "Inhalation of Antibiotics in Cystic Fibrosis", European Respiratory Journal, 8, 1995, páginas 1594-1604; DÒRING, G. et al.: "Antibiotic therapy against Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: a European consensus", European Respiratory Journal, 16, 2000, páginas 749-767. É claro que existe uma necessidade constante de um método melhorado de tratamento para infecções respiratórias agudas e crónicas provocadas por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, em especial P. aeruginosa resistente a diversos fármacos. Isto é especialmente evidente nos pacientes com fibrose quistica nos quais as terapias actuais estão limitadas por problemas com o desenvolvimento de resistência e com a toxicidade. Um tal método de tratamento deveria preferivelmente incluir a inalação de uma combinação de antibióticos num aerossol, contendo fosfomicina e um aminoglicósido tal como a tobramicina, que transporta uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico dos fármacos directamente até ao 11 ΡΕ2266534 espaço endobrônquico das vias respiratórias ou até às passagens nasais. Um tal tratamento será eficaz, diminuirá a frequência da resistência a fármacos, e melhorará a segurança.

Seria muito vantajoso proporcionar-se uma formulação e um sistema para transporte de uma dose suficiente de fosfomicina mais um aminoglicósido tal como a tobra-micina, sob uma forma concentrada, contendo o volume mais pequeno possivel de solução ou peso de pó seco que possa ser incluida num aerossol e transportada predominantemente ao espaço endobrônquico.

Deste modo, é um objectivo desta invenção proporcionar uma formulação de fosfomicina com um aminoglicósido num liquido concentrado ou num pó seco, que contenha quantidades suficientes mas não excessivas de fosfomicina e de aminoglicósido, que possa ser eficientemente transportada sob a forma de um aerossol por nebulização, a partículas cujas dimensões sejam predominantemente de entre 1 e 5 μιη, com uma salinidade que seja ajustada para permitir gerar um aerossol de fosfomicina mais aminoglicósido que seja bem tolerado pelos pacientes, e que possua uma vida útil adequada.

Sumário da Invenção

Um aspecto desta invenção é um método para o tratamento de infecções da parte inferior do tracto 12 ΡΕ2266534 respiratório (pulmonares) tal como a fibrose quistica, infecções crónica pulmonares com Pseudomonas nos pacientes com fibrose quistica, provocadas por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, incluindo o passo de se administrar uma quantidade eficaz de uma formulação em aerossol incluindo fosfomicina e tobramicina no espaço endobrônquico ou nasal dos pacientes que necessitem deste tipo de tratamento.

Um aspecto da invenção corrente é uma formulação concentrada, quer liquida, quer um pó seco, adequada para o transporte de uma combinação de fosfomicina e tobramicina até o espaço endobrônquico ou nasal dos pacientes para tratar a fibrose quistica.

Ainda outro aspecto da invenção corrente é uma formulação, quer liquida, quer num pó seco, adequado para transportar aminoglicósido e fosfomicina até ao espaço endobrônquico e nasal, que diminua o desenvolvimento de resistência a antibióticos, em comparação com a utilização de qualquer um destes fármacos por si sós.

Ainda outro aspecto da invenção corrente é uma formulação, quer liquida, quer num pó seco, adequado para transportar aminoglicósido e fosfomicina até ao espaço endobrônquico e nasal, que aumente o efeito pós-antibiótico (PAE) , em comparação com o PAE de qualquer um destes fármacos por si sós. 13 ΡΕ2266534

Ainda outro aspecto da invenção corrente é uma formulação contendo entre 1-300 mg de fosfomicina e entre 1 e 300 mg de aminoglicósido em 0,5 a 7 mL de água, com uma concentração > 30 mM em cloreto, em que a formulação referida apresente um pH de entre 4,5 e 8,0 e seja administrada sob a forma de um aerossol. O aerossol contém partículas que apresentam um diâmetro aerodinâmico médio em massa (MMAD) predominantemente de entre 1 e 5 μ, e é administrado utilizando um nebulizador capaz de atomizar as partículas com as dimensões pretendidas.

Ainda outro aspecto da invenção corrente é uma formulação de um pó seco contendo entre cerca de 1 e cerca de 300 mg de fosfomicina, entre cerca de 1 e cerca de 300 mg de aminoglicósido, e pelo menos um excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico sob uma forma de pó seco micronizado que permite entregar partículas com um diâmetro aerodinâmico médio em massa, MMAD, de 1 a 5 μ, quando sob a forma de um aerossol. A especificação diz respeito a uma formulação inalável incluindo fosfomicina e um aminoglicósido, adequada para o tratamento de infecções bacterianas pulmonares crónicas e agudas, em particular as provocadas pelas bactérias resistentes a múltiplos fármacos, Gram-negativas, P. aeruginosa, que são resistentes a tratamento com β-lactamas e aminoglicósidos. A formulação em aerossol apresenta um pequeno volume, mas no entanto entrega uma dose eficaz do ponto de vista terapêutico de fosfomicina e 14 ΡΕ2266534 aminoglicósido no local da infecção, em quantidades suficientes para tratar as infecções respiratórias com bactérias. As formulações em pós seco e as reconstituídas de aminoglicósido e fosfomicina apresentam uma longa vida de prateleira e estabilidade durante a armazenagem.

As formulações da invenção presente contêm preferivelmente 8 partes em peso de fosfomicina e 2 partes em peso de tobramicina.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1 e 2 mostram as curvas de morte ao longo do tempo para uma combinação a 9:1 de fosfomicina:tobramicina, e demonstram a morte bactericida rápida de P. aeruginosa ATCC 27853, em comparação com a morte bacteriostática proveniente de fosfomicina e de tobramicina por si sós.

As Figuras 3 e 4 mostram curvas de morte ao longo do tempo para combinações a 8:2 de fosfomicina:tobramicina e demonstram uma morte bactericida rápida da P. aeruginosa ATCC 27853.

As Figuras 5, 6 e 7 mostram curvas de morte ao longo do tempo para combinações a 7:3 de fosf omicina: tobramicina e demonstram uma morte bactericida rápida da P. aeruginosa ATCC 27853. 15 ΡΕ2266534

As Figuras 8 e 9 comparam as curvas de morte para as combinações a 9:1, 8:2, e 7:3 de combinações de fosfomi-cina:tobramicina com as obtidas por tobramicina por si só, para P. aeruginosa ATCC 27853.

As Figuras 10, 11 e 12 demonstram morte dependente da concentração por parte das combinações a 9:1, 8:2, e 7:3 de fosfomicina:tobramicina, em relação à P. aeruginosa ATCC 27853.

As Figuras 13, 14, e 15 mostram a morte de E. coli no pulmão de rato, após uma administração, de uma solução a 31,1 mg/mL de, respectivamente, combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2, e 7:3.

As Figuras 16 e 17 demonstram que a administração do aerossol proveniente de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação a 9:1 de fosfomicina:tobramicina proporcionava > 5 logio mortes de E. coli no pulmão de rato, em comparação com menos do que 1 logio de morte provocadas por fosfomicina e por tobramicina por si sós. A Figura 18 demonstra que a administração de um aerossol contendo uma solução a 31,1 mg/mL de uma mistura a 8:2 de fosfomicina:tobramicina proporcionava > 5 logio mortes de E. coli no pulmão de rato, em comparação com 2 logio de mortes pela administração de um aerossol contendo uma solução a 40 mg/mL de tobramicina por si só. 16 ΡΕ2266534

As Figuras 19 e 20 demonstram que a administração de um aerossol contendo uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação a 8:2 de fosfomicina:tobramicina proporcionava mais morte de P. aeruginosa no pulmão de rato, quando comparada com a obtida de fosfomicina e de tobramicina por si sós. A Figura 21 demonstra que a administração de um aerossol contendo soluções a 60 e a 90 mg/mL de uma combinação a 8:2 de fosfomicina:tobramicina resultava numa mortalidade significativa de P. aeruginosa no pulmão de rato.

Definição de Termos

Tal como se utiliza neste documento: "Soro salino H normal" ou "SS V significa soro salino normal diluído a um quarto da força, contendo 0,225 % (peso/volume) de NaCl. "Fosfomicina:tobramicina a 9:1" significa uma solução aquosa ou uma formulação em pó seco que contenham uma razão 9:1 em peso de ácido fosfomicina para base tobramicina. "Fosfomicina:tobramicina a 8:2" significa uma solução aquosa ou uma formulação em pó seco que contenham uma razão 8:2 em peso de ácido fosfomicina para base 17 ΡΕ2266534 tobramicina, de tal modo que a quantidade de fosfomicina seja oito vezes a quantidade de tobramicina. "Fosfomicina:tobramicina a 7:3" significa uma solução aquosa ou uma formulação em pó seco que contenham uma razão 7:3 em peso de ácido fosfomicina para base tobramicina. "fosfomicina:tobramicina a 5:5" significa uma solução aquosa ou uma formulação em pó seco que contenham uma razão 5:5 em peso de ácido fosfomicina para base tobramicina. "Concentração mínima inibitória (MIC)" significa a menor concentração de antibiótico(s) que impede o crescimento visível após incubação durante 18-20 horas a 35 °C. "Concentração mínima bactericida (MBC)" significa a concentração mais baixa de antibiótico que proporciona ^ 3 Logio de morte bacteriana. "Mortalidade dependente do tempo" significa que maiores concentrações de fármaco não matam bactérias nem mais rapidamente nem em maior quantidade. "Mortalidade dependente da concentração" significa que quanto maior a concentração de fármaco, maior é a velocidade e a extensão da morte bacteriana. 18 ΡΕ2266534 "Bacteriostático" significa que o antibiótico actua inibindo o crescimento bacteriano. "Bactericida" significa que os antibióticos actuam matando bactérias. "Sinergia" significa que o efeito combinado dos antibióticos que se estão a examinar é significativamente maior do que o de qualquer um dos fármacos por si só.

Descrição Pormenorizada da Concretização Preferida A invenção corrente diz respeito a uma formulação concentrada de fosfomicina e tobramicina adequada para uma entrega eficaz sob a forma de aerossol, no espaço endobrônquico ou nasal. A invenção é preferivelmente adequada para formulação de fosfomicina mais tobramicina concentradas, para se obter um aerossol por jacto, ultra-sónico, ou com nebulizadores equivalentes originando partículas de aerossol com entre 1 e 5 μ necessárias para a entrega eficaz de fosfomicina mais tobramicina no espaço endobrônquico ou nasal, para tratar infecções bacterianas, em especial as provocadas por Pseudomonas aeruginosa resistente a muitos fármacos. A formulação contém uma quantidade mínima mas no entanto eficaz de fosfomicina e de tobramicina, formuladas no menor volume possível de uma solução fisiologicamente aceitável exibindo uma salinidade ajustada para permitir gerar um aerossol contendo fosfomicina e tobramicina bem tolerado pelos pacientes mas minimizando o desenvolvimento de efeitos colaterais secundários indesejáveis tais como o broncospasmo e a tosse. 19 ΡΕ2266534

As condições principais para uma formulação funcionar em aerossol são a sua segurança e a sua eficácia. São vantagens adicionais o seu menor custo, ser prática de utilizar, possuir uma longa vida de prateleira, de armazenagem, bem como uma fácil manipulação do nebulizador.

Formula-se para aerossol fosfomicina mais tobra-micina de modo a assegurar a entrega eficaz da fosfomicina mais tobramicina ao espaço pulmonar, endobrônquico ou nasal. Selecciona-se um nebulizador de modo a permitir a formação de um aerossol de fosfomicina mais tobramicina que apresente um diâmetro aerodinâmico mediano predominantemente de 1 a 5 μ. A quantidade formulada de fosfomicina mais tobramicina e a quantidade entregue é eficaz para o tratamento de fibrose quística, em especial quando provocada por Pseudomonas aeruginosa resistente a diversos fármacos. A formulação apresenta uma salinidade, uma tensão osmótica, e um pH ajustados para permitir que seja gerado um aerossol de fosfomicina mais tobramicina que seja bem tolerado pelos pacientes. A formulação terá o menor volume possível para transformação em aerossol que seja capaz de entregar uma dose eficaz de fosfomicina mais tobramicina no local da infecção. Além disto, a formulação em aerossol não compromete a funcionalidade das vias respiratórias nem das passagens nasais, e minimiza os efeitos colaterais indesej áveis. 20 ΡΕ2266534

AVALIAÇÃO DAS COMBINAÇÕES DE ANTIBIÓTICOS

Formularam-se combinações de fosfomicina:amino-glicósidos tais como as que se descrevem no Exemplo 1. A fosfomicina era a principal componente d combinação por causa da sua segurança inerente e da necessidade de diminuir a toxicidade do aminoglicósido. Avaliaram-se as combinações fosfomicina:aminoglicósido, em especial fosfomicina:tobramicina quanto à (a.) potência in vitro, (b.) velocidade de morte, (c.) frequência da resistência, e (d.) eficácia em animal. a. Potência in vitro

Mostra-se nas Tabelas 1 e 2 a potência in vitro da fosfomicina e da tobramicina por si sós e em combinação, contra um painel de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas representativas de espécies que provocam infecções no tracto respiratório em pacientes com fibrose quistica, bronquiectasia, sinusite e pneumonia associada a ventilador. Os dados mostram que as combinações de fosfomicina:tobramicina têm actividade antibacteriana contra um largo espectro de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. os valores de MIC para as combinações fosfomicina:tobramicina não melhoraram face aos da fosfomicina ou da tobramicina por si sós. 21 ΡΕ2266534

Tabela 1. Valores de MIC de fosfomicina e de tobramicina, por si sós e em combinação, contra bactérias Gram-negativas. MIC (Mg/ML) Bactérias Fosfomicina Tobramicina F9:T1 F7:T3 F5:T5 P. aeruqinosa COR-O03 16 0,5 8 4 1 COR-O09 1024 2048 1024 512 2048 COR-021 8 64 8 8 8 COR-027 128 0,5 8 2 1 E. coli COR-032 1 0,5 1 1 1 COR-039 64 0,25 2 0,5 0,5 COR-040 1 32 1 1 2 H. influenzae COR-042 8 0,5 4 2 1 COR-049 128 0,5 4 1 1 B. cepacia COR-O90 > 2048 128 1024 ND ND COR-O98 > 2048 64 1024 ND ND S. maltophilia COR-082 128 4 4 4 8 COR-O83 64 512 256 128 128 COR-O87 > 512 128 128 128 128 K. pneumoniae COR-042 8 0,5 4 2 1 COR-049 128 0,5 4 1 1 M. catarrhalis COR-109 4 8 4 ND ND ND = Não determinado. 22 ΡΕ2266534

Tabela 2. Valores de MIC de fosfomicina e de tobramicina, por si sós e em combinação, contra bactérias Gram-positivas. MIC (pg/ml·)

Bactérias Fosfomicina Tobramicina F9:T1 F7:T3 F5:T5 S. aureus COR-051 (MSSA) 1 0,25 2 1 0,5 COR-055 (MRSA) 4 0,25 4 1 0,5 COR-059 2 128 2 4 4 COR-060 (GISA) 2 64 1 4 8 S. pneumoniae COR-O61 32 64 16 32 32 COR-068 8 16 16 16 16 S. pyoqenes COR-104 64 32 ND ND ND COR-105 E. faecalis COR-099 16 64 ND ND ND COR-103 32 8 ND ND ND ND = Não determinado. A Tabela 3 mostra os valores de MIC5o e de MICgo para fosfomicina e para tobramicina, por si sós e em combinação, para 100 estirpes de P. aeruginosa isoladas de amostras de expectoração de pacientes com fibrose quistica. Este estudo demonstrou que na ausência de mucina, a 23 ΡΕ2266534 tobramicina era o antibiótico mais activo. Combinando fosfomicina com a tobramicina resultava uma melhoria significativa dos valores de MIC50 e de MIC90 em comparação com os da fosfomicina por si só. No modelo CF de ligação a mucina (+ mucina), as combinações de fosfomicina:tobramicina apresentavam valores de MIC50 e de MIC90 comparáveis aos da tobramicina por si só.

Tabela 3. Valores de MIC para fosfomicina e para tobramicina por si sós e em combinação, contra 100 estirpes de P. aeruginosa. MIC50 (μς/πιΑ) MICgo (pg/mL) Antibiótico Mucina (-) Mucina (+) Mucina (-) Mucina (+) Fosfomicina 64 64 > 512 128 Tobramicina 2 16 16 64 F9:T1 16 32 64 128 F8:T2 8 32 64 128 F7:T3 8 16 64 64 A Tabela 4 mostra os resultados de estudos de sinergia em tabuleiro de xadrez entre a fosfomicina e nove aminoglicósidos. As interacções entre as nove combinações diferentes de fosfomicina:aminoglicósido foram todas classificadas como indiferentes. Nenhuma das combinações apresentava actividade sinergística contra P. aeruginosa ATCC 27853. Estes dados demonstram que não é óbvio que uma melhoria da eficácia seja conseguida combinado a fosfomicina com aminoglicósidos. 24 ΡΕ2266534

Tabela 4. Estudos em tabuleiro de xadrez entre a fosfo-micina e diversos aminoglicósidos, contra a P. aeruginosa ATCC 27853.

Interacção Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente Indiferente

Combinação de antibióticos Fosfomicina:Tobramicina Fosfomicina:Gentamicina Fosfomicina:Arbecacina Fosfomicina:Dibecacina Fosfomicina:Canamicina B Fosfomicina:Estreptomicina Fosfomicina:Amicacina Fosfomicina:Neomicina Fosfomicina:Netilmicina A Tabela 5 mostra os resultados de estudos de sinergia em tabuleiro de xadrez entre a fosfomicina e a tobramicina, contra estirpes clinicas de P. aeruginosa, E. coli, H. influenzae, e S. aureus. As interacções entre a fosfomicina e a tobramicina foram classificadas como indiferentes para a grande maioria dos isolados examinados. A interacção entre a fosfomicina e a tobramicina combinadas era sinergistica apenas contra uma estirpe de P. aeruginosa e uma estirpe de E. coli. Estes dados sugerem além disto que não era óbvio que se conseguisse uma melhoria da eficácia por combinar a fosfomicina com a tobramicina. 25 ΡΕ2266534

Tabela 5. Estudos em tabuleiro de xadrez entre fosfomicina e tobramicina, H. influenzae, t contra estirpes 2 S. aureus. de P. , aeruginosa, E. coli, Estirpes Bacterianas Interacção entre Antibióticos N= Sinergia Adição Indiferença Antagonismo P. aeruginosa 17 1 0 16 0 E. coli 5 1 0 4 0 H. influenzae 1 0 0 1 0 S. aureus 4 0 0 4 0 A Tabela 6 mostra os valores de MBC/MIC para fosfomicina e para tobramicina por si sós e para as combinações de fosf omicina: tobramicina a 9:1, 8:2, e 7:3 contra a P. aeruginosa ATCC 27853. São preferíveis antibióticos com valores de MBC/MIC < 1 porque inibem bactérias matando mais do que por tornarem o crescimento mais lento. Este estudo revelou inesperadamente que os valores de MBC/MIC para as combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2, e 7:3 eram idênticos aos observados para a tobramicina por si só. Este facto era inesperado uma vez que os valores da razão MBC/MIC para a fosfomicina por si só eram >8. 0 estudo também mostrou que não se observava algo de semelhante para nenhuma das outras combinações fosfomicina:aminoglicósido.

Tabela 6. Valores de MBC/MIC para os aminoglicósidos por si sós e das combinações a 9:1, 8:2, e 7:3 combinations de fosfomicina com aminoglicósido, contra P. aeruginosa ATCC 27853. 26 ΡΕ2266534

Combinação de Antibióticos Aminoglicós ido MBC/MIC F9:T1 F8:T2 F7:T3 Fosfomicina:Tobramicina 1 1 1 1 Fosfomicina:Gentamicina 2 4 2 8 Fosfomicina:Amicacina 2 4 4 2 Fo s f omi cina:Netilimicina 1 2 4 2 Fosfomicina:Arbecacina 1 4 4 2 Fosfomicina:Estreptomicina 4 2 2 2 Fosfomicina:Neomicina 2 2 2 4 Fosfomicina:Canamicina B ND 4 2 4 Fosfomicina:Dibecacina 1 4 2 1 ND = Não determinado. A Tabela 7 mostra os valores de MBC/MIC para fosfomicina e para tobramicina por si sós, e para as sus combinações a 9:1, 8:2, e 7 : 3 contra P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922, e S. aureus ATCC 29213. Contra a P. aeruginosa, os valores de MBC/MIC para as combinações 9:1, 8:2, e 7:3 foram idênticos ao determinados para tobramicina por si só. Este facto era inesperado uma vez que não havia sido observado nem contra E. coli, em contra S. aureus.

Tabela 7. Valores de MBC/MIC para fosfomicina e para tobramicina por si sós, bem como para as combinações a 9:1, 8:2, e 7:3 de fosfomicina com tobramicina. ΡΕ2266534 27

MBC/MIC

Antibiótico P. aeruginosa E. coli S. au Fosfomicina > 8 8 1 Tobramicina 1 1 8 F9:T1 1 1 2 F8 :T2 1 2 4 F7 :T3 1 2 4 b. Velocidades de Aniquilação A Tabela 8 mostra os resultados de morte ao longo do tempo para as combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2, e 7:3 contra a P. aeruginosa ATCC 27853. A inspecção da mortalidade bacteriana ao longo do tempo revelou sinergia para as combinações de fosfomicina:tobramicina, de fosfomicina:gentamicina, e de fosfomicina:arbecacina. As restantes combinações de fosfomicina:aminoglicósido não eram sinergísticas. Estes dados mostram que não era óbvio qual a combinação de fosfomicina:aminoglicósido, nem qual a razão entre fosfomicina:aminoglicósido que seria sinergistica.

Tabela 8. Estudos de mortalidade ao longo do tempo com combinações de fosfomicina:aminoglicósido a 9:1, 8:2, e 7:3, contra P. aeruginosa ATCC 27853. Avaliaram-se os antibióticos a uma concentração de 32 yg/mL. 28 ΡΕ2266534

Combinação de Antibióticos F9:T1 Sinergia F8 :T2 F7 :T3 Fosfomicina:Tobramicina Sim Não Não Fosfomicina:Gentamicina Sim Não Não Fosfomicina:Amicacina Não Não Não Fosfomicina:Netilimicina Não Não Não Fosfomicina:Arbecacina Não Não Sim Fosfomicina:Estreptomicina Não Não Não Fosfomicina:Neomicina Não Não Não Fosfomicina:Canamicina B Não Não Não Fosfomicina:Dibecacina Não Não Não A Tabela 9 mostra o período de tempo necessário para se conseguir a morte das bactérias P. aeruginosa ATCC 27853 utilizando diversas combinações fosfomicina:amino- glicósido. Avaliaram-se os antibióticos a uma concentração de 32 pg/mL. Este estudo demonstrou que as combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2, e 7:3 asseguravam morte bactericida mais depressa do que qualquer outra combinação fosfomicina:aminoglicósido. Os dados também mostram que três das combinações fosfomicina:aminoglicósido não exibem morte bactericida. Estes resultados eram inesperados porque a tobramicina por si só atingia a morte bactericida à 1 hora, e a fosfomicina por si só não era bactericida.

Tabela 9. Período até se atingir a morte bactericida da P. aeruginosa ATCC 27853, utilizando combinações de fosfomicina:aminoglicósido a 9:1, 8:2, e 7:3. 29 ΡΕ2266534

Tempo (h) Combinação de antibióticos F9:T1 F8 :T2 F7 :T3 Fosfomicina:Tobramicina 2 1 1 Fosfomicina:Gentamicina 6 4 2 Fosfomicina:Amicacina 6 2 2 Fosfomicina:Netilimicina NC NC NC Fosfomicina:Arbecacina NC 4 2 Fosfomicina:Estreptomicina NC NC NC Fosfomicina:Neomicina NC NC NC Fosfomicina:Dibecacina NC 4 4

As Figuras 1 e 2 mostram as curvas de morte ao longo do tempo para uma combinação a 9:1 de fosfomicina:to-bramicina e demonstram uma aniquilação bactericida rápida da P. aeruginosa ATCC 27 853 em comparação com a morte bacteriostática conseguida com a fosfomicina e com a tobramicina por si sós. Isto era inesperado uma vez que a análise em tabuleiros de xadrez não havia demonstrado sinergia entre a fosfomicina e a tobramicina.

As Figuras 3 e 4 mostram as curvas de morte ao longo do tempo para combinações de fosfomicina:tobramicina a 8:2 e demonstram uma aniquilação bactericida rápida da P. aeruginosa ATCC 27853. A uma concentração de 32 yg/mL, a actividade de morte da combinação era significativamente superior à da fosfomicina e ligeiramente superior à da tobramicina. A 16 yg/mL, a combinação era superior à da tobramicina e à fosfomicina por si sós. 30 ΡΕ2266534

As Figuras 5, 6 e 7 mostram as curvas de morte ao longo do tempo para combinações de fosfomicina:tobramicina a 7:3 e demonstram uma aniquilação bactericida rápida da P. aeruginosa ATCC 27853. A concentrações de 16 pg/mL e de 32 pg/mL, a actividade de morte da combinação era significativamente superior à da fosfomicina e ligeiramente superior à da tobramicina. A 8 pg/mL, combinação era superior à da tobramicina e à fosfomicina por si sós.

As Figuras 8 and 9 comparam as curvas de morte para combinações de fosfomicina:tobramicina a 9:1, 8:2, e a 7:3 com tobramicina por si só, contra P. aeruginosa ATCC 27853. A uma concentração de 32 pg/mL, todos os antibióticos exibiam taxas de aniquilação e graus de morte comparáveis. A 16 pg/mL, a tobramicina era o antibiótico mais activo, seguida por F7:T3, F8:T2, e F9:T1.

As Figuras 10, 11 e 12 demonstram uma morte dependente da concentração para as combinações de fosfomicina : tobramicina a 9:1, 8:2, e 7:3, contra P. aeruginosa ATCC 27853. Isto era inesperado porque a principal componente da combinação, a fosfomicina, exibira uma morte dependente do tempo. A tobramicina por si só exibe morte dependente da concentração. c. Frequência da Resistência A Tabela 10 mostra a frequência do desenvolvimento de resistência à fosfomicina e à tobramicina por si 31 ΡΕ2266534 sós, e a uma combinação a 9:1 de f osf omicina: tobramicina, por parte de cinco estirpes de P. aeruginosa. Este estudo demonstrou que a frequência do desenvolvimento de resistência à combinação a 9:1 de fosfomicina:tobramicina era 1.000-100.000 vezes menor do que para a fosfomicina por si só, e 10-1.000 vezes menor do que para a tobramicina por si só.

Tabela 10. Frequência do desenvolvimento de resistência à fosfomicina, à tobramicina e a uma combinação de fosfomicina:tobramicina a 9:1.

Estirpes de _Frequência da Resistência P. aeruginosa Fosfomicina_Tobramicina_Fos + Tob COR-002 1,4 X 10“3 6,7 X 10'6 < 2, 9 x 10'8 COR-O03 5, 5 X IO-4 3,2 X IO"6 < 1,2 x IO-9 COR-O13 6,4 X 10-3 2, 6 X IO-6 2,0 x 10'7 COR-O14 1,5 X 10-5 5, 0 X 10'6 <y\ 1 O \—1 X \—1 V ATCC 27853 4,1 X 10-5 3,4 X IO-6 < 2,5 X 10~9 A Tabela 11 mostra o número de vezes que aumentou o MIC dos mutantes de P. aeruginosa isolados após uma única exposição à fosfomicina, à tobramicina, ou a uma combinação a 9:1 de fosfomicina:tobramicina. Este estudo demonstrou que os mutantes da 9:1 não exibiam um aumento significativo de MIC (1-2 vezes), em comparação com os aumentos dos mutantes após fosfomicina (12 8—> 512 vezes) ou após tobramicina (2-16 vezes). 32 ΡΕ2266534

Tabela 11. Número de vezes do aumento do MIC após uma única exposição a um antibiótico

Estirpe de P. aeruginosa Número de vezes do aumento do MIC F9:T1 Fos Tob COR-002 1 > 256 1 COR-O03 2 >256 2 COR-O13 1 > 64 8 COR-O 14 1 > 512 16 ATCC 27853 2 128 1 A Tabela 12 mostra o desenvolvimento da resistência de uma amostra clínica de uma estirpe de P. aeruginosa após 28 dias de exposição contínua a fosfomicina, tobramicina ou a uma combinação a 9:1 de fosfomicina:tobramicina. A exposição à combinação a 9:1 originou um aumento de 8 vezes do MIC no dia 14, mas o MIC não excedia o ponto de quebra da resistência à fosfomicina de 256 yg/mL. A exposição à tobramicina aumentava o MIC 128 vezes o que excedia o ponto de quebra da resistência à tobramicina, de 16 yg/mL. Observou-se um aumento rápido e brutal da resistência na P. aeruginosa exposta a fosfomicina por si só.

Tabela 12. Desenvolvimento de resistência após exposição contínua a antibiótico 33 ΡΕ2266534

Antibiótico MIC (pg/mL) Od 7d 14d 21d 28d F9:T1 8 16 64 64 64 Tobramicina 0,5 0,5 0,5 32 64 Fosfomicina 16 >512 >512 >512 >512 d. Eficácia em Animais

As Figuras 13, 14, e 15 mostram a morte de E. coli no pulmão de rato após uma administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de combinações de fosfomicina/tobramicina respectivamente a 9:1, 8:2, e 7:3 fosfomicina:tobramicina. Este estudo demonstrou a aniquilação completa (5-6 Logio CFU) da infecção pulmonar com E. coli ao fim de 45-60 minutos de tratamento.

As Figuras 16 e 17 demonstram que a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação a 9:1 de fosfomicina:tobramicina originava uma morte > 5 logio de E. coli no pulmão de rato, em comparação com menos do que uma morte de 1 logio para a fosfomicina e para a tobramicina por si sós. A Figura 20 demonstra que a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação a 8:2 de fosfomicina:tobramicina originava uma morte de > 5 logio de E. coli no pulmão de rato, em comparação com uma morte de 2 logio pela tobramicina por si só. Isto era inesperado porque os dados acerca da potência in vitro não 34 ΡΕ2266534 demonstravam que a combinação fosse superior à tobramicina por si só.

As Figuras 19 e 20 demonstram que a administração de um aerossol de uma solução a 31,1 mg/mL de uma combinação a 8:2 de fosfomicina:tobramicina originava mais morte de P. aeruginosa no pulmão do rato, em comparação com fosfomicina e com tobramicina por si sós. A Figura 21 demonstra que a administração de um aerossol contendo uma solução a 60 ou a 90 mg/mL de uma combinação a 8:2 de fosfomicina:tobramicina originava uma morte significativa de P. aeruginosa no pulmão do rato.

FORMULAÇÃO DE FOSFOMICINA/TOBRAMICINA EM AEROSSOL O aminoglicósido útil na invenção é a tobramicina .

Os compostos de fosfomicina especialmente úteis na invenção são antibióticos, tais como fosfomicina trome-tamol, sal disódico de fosfomicina, e fosfomicina cálcica. A formulação preferida de fosfomicina com tobramicina consoante a invenção contém 1 a 300 mg de fosfomicina mais 1 a 300 mg de tobramicina por 0,5 a 7 mL de água, preferivelmente com uma concentração em cloreto > 30 mM.

Isto corresponde às doses que seriam necessárias 35 ΡΕ2266534 para evitar a colonização ou tratar infecções severas do tracto respiratório superior ou inferior, provocadas por diversos organismos susceptiveis.

Os pacientes podem ser sensiveis ao pH, à osmola-ridade, e ao conteúdo iónico de uma solução nebulizada. Portanto estes parâmetros devem ser ajustados de modo a serem compatíveis com a fosfomicina mais tobramicina, e a serem toleráveis por parte dos pacientes. A solução ou suspensão mais preferida de fosfomicina mais tobramicina conterá uma concentração em cloreto >30 mM a um pH de 4,5-8,0.

A formulação da invenção é predominantemente nebulizada a partículas com dimensões que permitam a entrega do fármaco aos terminais dos bronquíolos respiratórios ou às passagens nasais, em que aa bactérias residem durante a infecção e a colonização. Para uma entrega eficaz de fosfomicina mais tobramicina ao espaço endobrônquico do pulmão das vias respiratórias num aerossol, é necessário que se forme um aerossol que contenha partículas com um diâmetro aerodinâmico mediano em massa que seja predominantemente de entre 1 e 5 μ. As quantidades formuladas e entregues de fosfomicina mais tobramicina para o tratamento e para a profilaxia das infecções endobrônquicas, em especial as provocadas por P. aeruginosa, têm que alvejar de forma eficaz a superfície pulmonar. A formulação tem que apresentar o menor volume possivel a que se possa conferir a forma de um aerossol, capaz de entregar uma dose eficaz de fosfomicina mais tobramicina no local da infecção. A 36 ΡΕ2266534 formulação tem que proporcionar adicionalmente condições que não afectem de forma adversa a funcionalidade das vias aéreas e das passagens nasais. Em consequência, a formulação tem que conter uma quantidade suficiente do fármaco formulado nas condições que permitem a sua entrega eficaz, enquanto evita reacções indesejáveis. A nova formulação consoante a invenção cumpre todos estes requisitos.

De acordo com a invenção, formula-se a fosfomici-na mais tobramicina numa forma de dosagem líquida destinada a uma terapia por inalação por parte de pacientes sofrendo de, ou em risco de vir a sofrer de, fibrose quística. Uma vez que estes pacientes residem em todo o mundo, é imperativo que a formulação da forma de dosagem líquida apresente uma vida de prateleira razoavelmente longa. As condições de armazenagem e de embalagem tornam-se assim importantes.

A formulação de fosfomicina mais tobramicina pode ser preparada de um modo asséptico sob a forma de uma solução aquosa numa ampola dual de sopragem e enchimento, de tal modo que cada um dos antibióticos seja formulado independentemente em água, e o seu pH seja ajustado. A tobramicina é formulada a um pH ácido (1-6), enquanto a fosfomicina é formulada a um pH básico (8-13). A formulação a pH baixo para a tobramicina assegura que todos os seus átomos de azoto básicos estão protonados, protegendo deste modo a molécula da oxidação de aminas e consequente degradação (as soluções de tobramicina amarelecem à temperatura ambiente). Deste modo, as soluções a baixo pH 37 ΡΕ2266534 da tobramicina são estáveis à temperatura ambiente durante periodos de tempo indefinidos. A fosfomicina tem uma estabilidade máxima a pH alto, uma vez que o anel epoxidico reactivo tende a sofrer hidrólise (abertura do anel) a pH ácido ou baixo. As soluções de fosfomicina com pH baixo também são estáveis à temperatura ambiente. Portanto, o contentor em ampola dual de sopragem e enchimento permite a formulação estável, em separado e à temperatura ambiente, de cada um destes antibióticos a valores de pH alto e baixo, de tal modo que a combinação dos fármacos constituindo o produto, e o seu pH final, sejam criados misturando ambas as soluções no nebulizador, imediatamente antes da sua utilização. A adequação da formulação para armazenagem permite uma utilização segura da fosfomicina mais tobramicina formuladas, adequada para ser proporcionada como aerossol.

III. NEBULIZADORES PARA ENTREGA DA COMBINAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS AO PULMÃO

Utiliza-se um dispositivo capaz de nebulizar a formulação da invenção em partículas de aerossol predominantemente com dimensões de entre 1 e 5 μ para se administrarem as formulações da invenção presente. Predominantemente significa, nesta aplicação que pelo menos 70 % mas preferivelmente mais do que 90 % de todas as partículas de aerossol que se geram se encontram adentro da gama de dimensões de 1 a 5 μ. Incluem-se nos dispositivos típicos os nebulizadores de jacto, os nebulizadores ultra-sónicos, 38 ΡΕ2266534 os nebulizadores pressurizados que gerem aerossóis, e os nebulizadores de placas porosas vibratórias. Incluem-se nos nebulizadores adequados representativos os nebulizadores eFlow® disponíveis junto da Pari Inovative Manufactures, Midlothian, VA; os nebulizadores iNeb® disponíveis junto da Profile Drug Delivery de West Sussex, Reino Unido; o nebulizador Omeron MicroAir® disponível junto da Omeron, Inc. de Chicago, IL e o nebulizador AeroNebGo® disponível junto da Aerogen Inc. de Mountain View, CA.

Um nebulizador de jacto utiliza a pressão do ar para quebrar uma solução líquida em gotículas de aerossol. Um nebulizador ultra-sónico funciona graças a um cristal piezoeléctrico que gera uma tensão de corte que transforma um líquido em pequenas gotículas de aerossol. Os sistemas sob pressão forçam em geral as soluções a passar através de pequenos poros para que se gerem pequenas partículas. Um dispositivo com placas porosas vibratórias utiliza uma vibração rápida para gerar tensão de corte numa corrente de líquido transformando-a em gotículas com dimensões apropriadas. No entanto, só algumas formulações de fosfomicina mais tobramicina conseguem ser eficientemente nebulizadas, uma vez que os dispositivos são sensíveis às propriedades físicas e químicas da formulação. A invenção é uma formulação com um pequeno volume e uma concentração elevada, de fosfomicina mais tobramicina, que pode ser entregue sob a forma de um aerossol, a concentrações eficazes do fármaco, no tracto respiratório 39 ΡΕ2266534 de pessoas em risco de contrair, ou já sofrendo de uma infecção com fibrose quística provocada por bactéria susceptiveis. A formulação é segura, bem tolerada e muito eficaz face ao seu custo.

Além disto, a formulação proporciona uma vida de prateleira adequada para a sua distribuição comercial.

Exemplo 1

Preparação de Soluções de Fosfomicina/Tobramicina para Transformação em Aerossóis

Solução de Fosf omicina/Tobramicina a 9:1 para

Comparação

Dissolveu-se fosfomicina disódica (18,057 g, 13,99 g de ácido livre) em 250 mL de água e ajustou-se o pH a 7,41 por adição gota a gota de 1,53 mL de HC1 4,5 N. Adicionou-se à solução resultante 1,56 g de tobramicina base a 97,5 %. Ajustou-se o pH da solução a 7,60 por adição de 2,45 mL de HC1 4,5 N. Diluiu-se a solução a 500 mL com água e filtrou-se através de uma membrana filtrante de 0,2 ym Nalge Nunc 167-0020. O pH final era de 7,76, a osmolalidade era de 537 mOsmol/kg, a razão fosfomicina/to-bramicina foi calculada como sendo de 9:1, e a concentração em cloreto era de 35,8 mM. 40 ΡΕ2266534

Solução de fosfomicina/Tobramicina a 8:2 da invenção

Preparou-se uma solução de fosfomicina/tobra-micina numa razão 8:2 ratio. Dissolveram-se 3,1680 g de fosfomicina dissódica (2,4013 g de ácido livre) em 50 mL de água. Dissolveram-se 0,6154 g de tobramicina base a 97,5 % (0,6000 g de tobramicina base pura) na solução de fosfomicina. Ajustou-se o pH adicionando 0,910 mL de HC1 6 M. Diluiu-se a solução a 100 mL com água. O pH final da solução era de 7,65, a osmolalidade era de 477 mOsmol/kg, e a concentração em cloreto era de 54,6 mM. Calculou-se a razão final de fosfomicina/tobramicina como sendo 8:2

Solução de Fosfomicina/Tobramicina a 7:3 para comparação

Utilizando o processo descrito para a solução a 9:1, acima, preparou-se uma solução de fosfomicina/tobramicina numa razão de 7:3; dissolveram-se 17,466 g de fosfomicina dissódica (13,239 g de ácido livre) em água; ajustou-se o pH a 7,43 adicionando 1,46 mL de HC1 4,5 N, 5,819 g de tobramicina base a 97,5 % (5, 674 g de tobrami cina base pura), e ajustou-se o pH da solução combinada adicionando 9,20 mL de HC1 4,5 N. O pH final da solução era de 7,68, a osmolalidade era de 560 mOsmol/kg, a razão fosfomicina/tobramicina era de 7:3, e a concentração em cloreto era de 95,9 mM. ΡΕ2266534 41

Exemplo 2

Preparação de uma Solução Hiperosmolar de fosfomicina e tobramicina a 8:2

Dissolveram-se 7,9165 g de fosfomicina disódica (6,0007 g de ácido livre fosfomicina) e 1,5382 g de tobramicina base a 97,5 % (1,4997 g de tobramicina base pura) em 50 mL de água. Ajustou-se o pH a 7,62 por adição de 2,3 mL de HC1 6 M. Diluiu-se a solução combinada até 100 mL. O pH final era de 7,64, a osmolalidade era de 1215 mOsmol/kg, a concentração final em cloreto era de 138 mM, e a razão de fosfomicina/tobramicina era de 8:2.

Exemplo 3

Preparação de Soluções Individuais de pH elevado de Fosfomicina e de pH baixo de Tobramicina para

Reconstituição

Preparou-se uma solução de fosfomicina dissolvendo 5,891 g de fosfomicina dissódica (4,465 g de ácido livre de fosfomicina) em água e diluindo a 100 mL. O pH era de 9,42, e a osmolalidade era de 795 mOsmol/kg.

Preparou-se uma solução de tobramicina dissolvendo 1,869 g de tobramicina base a 97,5 % (1,822 g de tobramicina base pura) em 60 mL de água, ajustando o pH a 4,90 por adição de 18,8 mL de HC1 1 M, e diluindo a 100 mL 42 ΡΕ2266534 com água. O pH era de 4,89, e a osmolalidade era de 148 mOsmol/kg.

Misturaram-se 1 mL da solução de fosfomicina e 1 mL da solução de tobramicina. Para a solução da combinação dos produtos farmacêuticos, o pH era de 7,30, a osmolalidade era de 477 mOsmol/kg, a concentração em cloreto era de 94,0 mM, e a razão fosfomicina/tobramicina era de 7:3.

Exemplo 4

Preparação de uma solução de Fosfomicina/Tobrami-cina a partir de Solução comercial de Tobramicina para Inalação (TOBI) e de Fosfomicina Dissódica Liofilizada (seca) (FOSFO)

Dissolveram-se 3,1665 g de fosfomicina disódica (FOSFO, 2,4002 g de ácido livre fosfomicina) em duas ampolas de 5 mL (a 60 mg/mL) de Solução de Tobramicina para Inalação (TOBI, 600 mg de tobramicina base) mais 40 mL de água. O pH inicial da solução era de 7,50. Adicionou-se à solução 667 yL de NaCl 4,5 M. Diluiu-se a solução combinada a 100 mL com água. A formulação final tinha as seguintes propriedades; pH 7,49, osmolalidade 502 mOsmol/kg, concentração em cloreto 33,8 mM, e a razão de fosf omicina/tobramicina era de 8:2, sendo a concentração dos fármacos de 24 mg/mL para a fosfomicina e de 6 mg/mL para a tobramicina.

Os Exemplos 5-10 descrevem os processos que foram 43 ΡΕ2266534 utilizados para gerar os dados apresentados nas Tabelas e nas Figuras desta especificação.

Exemplo 5

Determinação das concentrações inibitórias mínimas (MIC) A eficácia dos antibióticos e das combinações de antibióticos contra bactérias Gram-positivas e Gram-nega-tivas representativas das espécies que provocam infecções respiratórias nos pacientes com fibrose quística, bronqui-ectasia, sinusite, e pneumonia associada ao ventilador foram avaliadas em ensaios de MIC. Isolaram-se estirpes de P. aeruginosa a partir de amostras de expectoração pulmonar obtidas de pacientes com fibrose quística, de culturas de sangue, de infecções do tracto respiratório, e de infecções da pele ou dos tecidos moles. Isolaram-se E. coli, H. influenzae, B. cepacia, S. maltophilia, K. pneumoniae, M. catarrhalis, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, e E. faecalis a partir de infecções do tracto respiratório. Utilizaram-se a título de contrastes para controlo de qualidade E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, e S. aureus ATCC 29213. Método A: Determinaram-se os valores de MIC para fosfomicina por si só, tobramicina por si só, ou de combinações de fosfomicina com tobramicina, pelo método de diluição de placas em agar, consoante as linhas de orientação da NCCLS (NCCLS, 2003). Plaquearam-se estirpes 44 ΡΕ2266534 de bactérias sobre placas de Agar de Soja Trípico (PML Microbiologicals, Wilsonville, Or.) contendo 5 % de sangue de ovelha desfibrinado (referidas doravante neste documento como placas de agar de sangue) e incubaram-se de um dia para o outro a 35°C. Inocularam-se duas a três colónias bacterianas das culturas de um dia para o outro em 3 mL de soro salino normal estéril, agitaram-se brevemente com um vórtex, e ajustaram-se a um padrão de McFarland 0,5 (NCCLS, 2003). Diluiu-se a suspensão bacteriana a 1:40 em soro salino estéril normal e utilizou-se como inoculo. Prepararam-se placas em agar Mueller-Hinton (referidas doravante neste documento como MHA) combinando 16 g de agarose (Becton-Dickinson, Sparks, MD), 22 g de pó de caldo de Mueller-Hinton (Becton-Dickinson, Sparks, MD) , e ajustou-se a 1 L com água destilada. Esterilizou-se o agar por aquecimento num autoclave, arrefeceu-se a 55°C, e suplementou-se com 25 yg/mL de glucose-6-fosfato (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.). Distribuíram-se alíquotas de 25 mL do agar arrefecido por tubos cónicos de 50 mL e suplementou-se com concentrações adequadas de antibiótico para se conseguirem concentrações na gama de entre 0,06 yg/mL e 512 yg/mL. Depois de se misturarem suavemente o agar e o antibiótico, verteu-se a suspensão sobre placas de Petri estéreis de 100 mm, deixando-se solidificar à temperatura ambiente. Inocularam-se as placas de agar com antibiótico com cerca de 2 x 104 CFU/ponto recorrendo a um inoculador de 48 pontos (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.). Definiu-se a MIC como a menor concentração de antibiótico (s) que evitava o crescimento visível após incubação, 45 ΡΕ2266534 durante 18-20 horas a 35°C. Determinou-se a eficácia de um determinado antibiótico ou de uma combinação de antibióticos, sobre populações grandes de P. aeruginosa, calculando os valores de MIC50 e de MIC90· Definiu-se o valor de MIC50 como sendo a concentração de antibiótico (s) que inibia 50 % das estirpes de P. aeruginosa. Definiu-se o valor de MIC90 como sendo a concentração de antibiótico (s) que inibia 90 % das estirpes de P. aeruginosa (Wiedemann and Grimm, 1996) . Método B: Determinaram-se os valores de MIC para a fosfomicina por si só, a tobramicina por si só, ou para combinações de fosfomicina e tobramicina, contra estirpes de P. aeruginosa, na presença de mucina gástrica porcina para se avaliar o efeito da mucina e da ligação a proteína sobre a actividade antibiótica. As metodologias foram idênticas às descritas no Método A do Exemplo 5, coma excepção de que se adicionou mucina gástrica porcina a 2 % (peso/volume) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) às MHA antes de se aquecerem no autoclave. Método C: Determinaram-se os valores de MIC da amicacina, da arbecacina, da dibecacina, da gentamicina, da canamicina, da netilimicina, da neomicina, da estrepto-micina, e da tobramicina por si sós contra a P. aeruginosa ATCC 27853 pelo método de caldo-microdiluição consoante os padrões da NCCLS (NCCLS, 2003) . Utilizaram-se E. coli ATCC 25922 e S. aureus ATCC 29213 na qualidade de contrastações para controlo de qualidade. Plaquearam-se estirpes bacteri- 46 ΡΕ2266534 anas sobre placas com agar de sangue e incubaram-se a 35°C durante 18 horas. Inocularam-se duas a três colónias bacterianas das culturas de um dia para o outro em 3 mL de soro salino normal estéril, agitou-se brevemente num vórtex, e ajustou-se a um padrão de McFarland 0,5 (NCCLS, 2003). Diluiu-se a suspensão bacteriana a 1:100 em caldo de Mueller-Hinton com catiões ajustados (referido doravante neste documento como CAMHB) . Pipetaram-se 50 yL de inoculo bacteriano (com cerca de 2 x 105 CFU/mL) em poços individuais de placas de 96 poços contendo 50 yL de CAMHB (Remei,

Lenexa, Kansas) suplementado com diluições a ½ de antibió ticos com uma gama de concentrações variando entre 0,125 yg/mL e 128 yg/mL. Definiu-se a MIC como sendo a menor concentração de antibiótico(s) que evitava o crescimento visível após uma incubação a 35°C durante 18-24 horas.

Exemplo 6

Sinergia em Tabuleiro de Xadrez

Determinaram-se as interacções potenciais entre a fosfomicina e a amicacina, a arbecacina, e dibecacina, a gentamicina, a canamicina B, a neomicina, a netilimicina, a estreptomicina, ou a tobramicina pelo método do tabuleiro de xadrez (Eliopoulos e Moellering, 1996). Avaliaram-se séries de diluições a h de fosfomicina e dos aminogli-cósidos, maiores e menores do que o valor de MIC esperado para ambos os compostos. Inocularam-se as estirpes bacterianas em placas de agar de sangue e incubaram-se a 35°C 47 ΡΕ2266534 durante 18-24 horas. Inocularam-se duas a três colónias bacterianas das culturas de um dia para o outro em 3 mL de soro salino normal estéril, agitaram-se brevemente num vórtex, e ajustaram-se a um padrão de McFarland 0,5 (NCCLS, 2003) . Pipetaram-se 50 μ]1 de inoculo bacteriano (a cerca de 2 x 105 CFU/mL) em poços individuais de placas com 96 poços contendo 50 μΐ de CAMHB suplementados com as diluições a ½ em série de ambos os antibióticos de interesse, calculou-se a concentração inibitória fraccional (FIC) como sendo o valor de MIC do composto N° 1 em combinação com um segundo composto, dividida pelo valor de MIC com composto N° 1 por si só. Calculou-se o somatório dos FIC (SFIC) para cada combinação de fármacos como sendo a soma dos valores de FIC individuais dos N° 1 e N° #2. Calculou-se o valor de FIC como sendo a menor concentração de antibióticos que evitava o crescimento visivel após incubação durante 18-20 horas a 35°C. Definiu-se sinergia para um SFIC ^ 0.5, indiferença para um SFIC > 0,5 e < 4, e antagonismo para um SFIC > 4. Utilizou-se o menor SFIC para a interpretação final das interacções entre fármacos.

Exemplo 7

Determinação da cinéticas de períodos de morte

Levaram-se a cabo experiências de evolução da morte ao longo do tempo na presença de uma solução a 2 % de mucina gástrica porcina para se avaliar o efeito da mucina e da ligação proteica sobre a actividade dos antibióticos. 48 ΡΕ2266534

Inocularam-se duas a três colónias bacterianas em 10 mL de CAMHB e incubaram-se a 35°C num banho de água agitado (a 250 rpm) durante 18-24 horas. Preparou-se uma diluição a 1:40 da cultura de um dia para o outro em 10 mL de CAMHB fresco e incubou-se a 35°C num banho de água agitado (a 250 rpm) durante 1-2 horas. Ajustou-se a cultura resultante a um padrão de McFarland 0,5 (NCCLS, 2003) . Para diminuir a variabilidade na dimensão do inoculo bacteriano quando se comparavam múltiplos antibióticos, inoculou-se um tubo mestre de CAMHB contendo 2 % (peso/volume) de mucina gástrica porcina com uma diluição a 1:200 de inoculo bacteriano (a cerca de 5 x 105 CFU/mL), suplementado com 25 pg/mL de glucose-6-fosfato, e agitou-se brevemente num vórtex. Pipetaram-se então aliquotas de 10 mL para tubos cónicos de 50 mL. Adicionaram-se ao meio de cultura fosfomicina por si só, tobramicina por si só, e combinações de fosfomicina com amicacina, arbecacina, dibecacina, gentamicina, canamicina, netilimicina, neomicina, estrepto-micina, ou tobramicina, a concentrações iguais a múltiplos de 1, 2, 4, e 8 vezes o valor da MIC para a fosfomicina (4 pg/mL) contra P. aeruginosa ATCC 27853. Comparou-se também a actividade de morte da fosfomicina mais amicacina, arbecacina, dibecacina, gentamicina, canamicina, netilimicina, neomicina, estreptomicina, ou tobramicina com a actividade de morte das suas componentes individuais por si sós. Por exemplo, comparou-se 32 pg/mL de uma combinação a 9:1 de fosfomicina:tobramicina com a actividade de morte de 28,8 pg/mL de fosfomicina por si só e com 3,2 pg/mL de tobramicina por si só. Correu-se uma experiência de 49 ΡΕ2266534 controlo sem quaisquer fármacos de cada vez. Incubaram-se as culturas com antibiótico a 35°C num banho de água agitado (a 250 rpm) durante 24 horas. Determinou-se a morte bacteriana às 0, 1, 2, 4, 6, e 24 preparando diluições das culturas em série, a um décimo, em soro salino normal estéril, e plaqueando aliquotas de 100 yL sobre placas de agar de sangue. Inocularam-se as placas de cultura a 35°C durante 18-24 horas e contaram-se visualmente as colónias. O limite de detecção para o método de contagem de colónias era de 1 Logio. Construiram-se curvas de morte ao longo do tempo representando o número em Logio de CFU/mL em função do tempo. As concentrações em antibiótico que diminuíam o inoculo original em >3 Logio CFU/mL fora, consideradas bactericidas, e as concentrações que diminuíam o inoculo original a ã2 Logio CFU/mL foram definidas como bacterios-táticas (NCCLS, 1999). Definiu-se sinergia como uma diminuição das contagens de colónias bacterianas ^2 Logio CFU/mL para as combinações de antibióticos, em comparação com a mais activa dos antibióticos por si sós (NCCLS, 1999).

Exemplo 8

Determinação da concentração bactericida mínima (MBC)

Determinaram-se as MBC para fosfomicina, amica-cina, arbecacina, dibecacina, gentamicina, canamicina B, netilimicina, neomicina, estreptomicina, ou tobramicina por si sós contra P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922, 50 ΡΕ2266534 e S. aureus ATCC 29213 pelo método de microdiluição do caldo consoante os padrões NCCLS (NCCLS, 1999). Plaquearam-se as estirpes bacterianas sobre placas de agar de sangue e incubaram-se a 35°C durante 18-24 horas. Inocularam-se duas a três colónias bacterianas das culturas de um dia para o outro em 3 mL de soro salino normal estéril, agitaram-se brevemente num vórtex, e ajustaram-se ao padrão McFarland 0,5 (NCCLS, 2003). Pipetaram-se 50 pL de inoculo bacte-riano (a cerca de 2 x 105 CFU/mL) para poços individuais de placas de 96 poços contendo 50 pL de CAMHB (Remei, Lenexa, Kansas) suplementado com diluições a ^ dos antibióticos a concentrações de entre 0,125 pg/mL e 128 pg/mL. Incubaram-se as placas a 35°C durante 18-24 horas e determinaram-se os valores de MIC tal como se descreveu no Método C do Exemplo 5. Misturaram-se os conteúdos dos poços que não exibiam crescimento (MIC e acima) com um pipetador e plaquearam-se amostras de 10 pL em duplicado sobre placas de agar de sangue. Incubaram-se as placas de cultura a 35°C durante 18-24 horas e contaram-se as colónias bacterianas em cada uma visualmente. Determinaram-se os valores de rejeição pelos métodos do NCCLS que consideram a dimensão do inoculo final, amostragem singela ou duplas, erros de pipetagem, e a distribuição de Poisson das respostas das amostras (NCCLS, 1999) . Por exemplo, quando o inoculo final era de 5 x 105 CFU/mL e se avaliavam amostras em duplicado, considerou-se a menor diluição conduzindo a menos do que um total de 25 colónias como sendo o MBC. Definiu-se o MBC como a diminuição de Ú3 Logio em CFU/mL do inoculo original tal como se descreve nos padrões NCCLS (NCCLS, 1999) . Calcularam-se as razões MBC/MIC dividindo o MBC pelo MIC. ΡΕ2266534 51

Exemplo 9

Determinação da frequência da resistência em passo único

Determinou-se a frequência da mutação em passo único determinando resistência espontânea para 5 estirpes susceptiveis de P. aeruginosa. Preparou-se o inoculo bacte-riano inoculando 5 mL de CAMHB com 2-3 colónias bacterianas e incubando a 35°C num banho de água com agitação (a 250 rpm) durante 18 h. A Diluiu-se a cultura de um dia para o outro a 1:20 em 50 mL de CAMHB fresco, num balão de Erlenmeyer de 125 mL e incubou-se a 35°C num banho de água agitado (a 250 rpm) durante 8 horas. Centrifugaram-se as culturas a 2.500 rpm, à temperatura ambiente, durante 20 minutos. Separou-se o sobrenadante por decantação e voltou a suspender-se a pastilha de células em 500 pL-1.000 pL de CAMHB. Determinou-se o valor de CFU/mL da suspensão bacteriana através de uma série de diluições a um décimo em soro salino normal estéril, e plaqueando aliquotas de 100 pL sobre placas em agar de sangue. Incubaram-se as placas de cultura a 35°C durante 18-24 e contou-se visualmente o número de colónias. Plaquearam-se 100 pL de suspensão de células bacterianas (cerca de 109 CFU) sobre placas MHA contendo 128 pg/mL de fosfomicina, 8 pg/mL de tobramicina, ou 128 pg/mL de fosfomicina mais 8 pg/mL de tobramicina. Incubaram-se as placas de cultura a 35°C durante 48-72 horas e contaram-se visualmente os números de colónias em cada placa. Calculou-se a frequência da resistência 52 ΡΕ2266534 dividindo o número de bactérias que cresciam à concentração de antibiótico definida pelo número de bactérias presentes no inoculo inicial. Avaliaram-se mutantes representativos quanto à alteração dos seus valores de MIC com fosfomicina por si só, tobramicina por si só, e combinações de fosfomicina mais tobramicina, tal como se descreveu no Método A do Exemplo 5.

Exemplo 10

Análise da resistência múltipla

Avaliou-se o desenvolvimento de resistência durante uma passagem continua em série, com uma estirpe clinica de P. aeruginosa susceptivel à fosfomicina (MIC=8 yg/mL) e à tobramicina (MIC=0,5 yg/mL). Inoculou-se uma única colónia de P. aeruginosa COR-014 em 5 mL de MHCAB e agitou-se brevemente num vórtex. Prepararam-se séries de diluições a ^ de fosfomicina por si só, na gama de entre 1 yg/mL - 512 yg/mL, tobramicina por si só a entre 0,0625 yg/mL - 512 yg/mL, e uma mistura de 9:1 fosfomicina:tobramicina a entre 0,0625 yg/mL - 512 yg/mL, em CAMHB. Pipetaram-se 10 yL de suspensão bacteriana para 3 mL de cada diluição de antibiótico, e incubou-se estaticamente a 35°C durante 18-24 horas. Seleccionaram-se os tubos com as maiores concentrações de cada antibiótico que ainda denotavam crescimento bacteriano visualmente, de entre cada série de diluições de antibióticos, e pipetaram-se 100 yL de cultura para se preparar uma nova série de diluição de 53 ΡΕ2266534 antibióticos. Incubaram-se os tubos estaticamente a 35°C durante 18-24 horas. Repetiu-se este processo um total de 28 vezes. Determinaram-se os valores de MIC para a fosfo-micina por si só, tobramicina por si só, e fosfomicina mais tobramicina, para a estirpe de origem e para os isolados resistentes recolhidos em cada passagem, consoante de descreveu no Método C do Exemplo 5.

Exemplo 11

Determinação da eficácia em animais

Avaliaram-se as eficácias in vivo da fosfomicina em aerossol por si só, da tobramicina por si só, e das combinações de fosfomicina com tobramicina, contra E. coli ATCC 25922 e contra P. aeruginosa ATCC 27853, em pulmões de rato. 0 inoculo bacteriano utilizado para estabelecer as infecções nos pulmões de rato era constituído por uma mistura de bactérias e pérolas de agarose. Plaqueou-se E. coli ATCC 25922 ou P. aeruginosa ATCC 27853 sobre placas de agar de sangue e incubou-se durante 18-24 horas a 35°C. Inocularam-se duas a três colónias em 10 mL de Caldo de Soja Triptico (doravante referido neste documento como TSB) e incubou-se estaticamente a 35°C durante 1,5 a 2 horas. Ajustou-se a cultura a uma densidade óptica de 0,1 (a 625 nm) em TSB fresco, e depois diluiu-se a 1:5 em TSB. Adicionou-se um mililitro de suspensão bacteriana (a cerca de 107 CFU/mL) a 10 mL de uma solução a 2 % de agar nobre e misturou-se brevemente por inversão. Adicionou-se a mistura 54 ΡΕ2266534 a 150 mL de óleo mineral branco pesado equilibrado a 55°C e agitou-se sobre gelo durante 5 minutos. Verteu-se a suspensão fria para um tubo de centrífuga de 250 mL e centrifugou-se a 3.000 rpm, 4°C, durante 10 minutos. Separou-se o sobrenadante por decantação, voltou a suspender-se a pastilha em 25 mL de soro salino normal estéril, e transferiu-se para um tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Depois de se centrifugar a 3.000 rpm, 4°C, durante 10 minutos, separou-se o sobrenadante por decantação e voltou a suspender-se a pastilha em 10 mL de soro salino. Centrifugou-se a suspensão a 3.000 rpm, 4°C, durante 10 minutos e separou-se o sobrenadante por decantação. Suspendeu-se de novo a pastilha em cerca de 10 mL de soro salino normal estéril e depois diluiu-se a 1:30 numa solução estéril de pérolas de agarose a 2 %, para se obterem cerca de 10-1.000 CFU/mL.

Antes da instalação intratraqueal do inoculo bacteriano, anestesiaram-se ratos macho Sprague-Dawley (200-250 g) por exposição a isoflurano durante 5 minutos. Inseriu-se uma agulha intratraqueal na traqueia e instilaram-se 80 yL de pérolas de agarose contendo cerca de 10-100 CFU de E. coli ATCC 25922 ou de P. aeruginosa ATCC 27853 aos pulmões, com uma seringa de 1 mL. Colocaram-se os ratos em jaulas individuais e deixaram-se recuperar durante cerca de 18 horas.

Administrou-se fosfomicina por si só, tobramicina por si só, e as combinações de fosfomicina: tobramicina aos 55 ΡΕ2266534 ratos utilizando um dispositivo de exposição a aerossol (In Tox Products, New México). 0 sistema era constituído por uma câmara central com caminhos separados para fornecer o aerossol e para o retirar. A câmara central tinha 24 aberturas que se ligavam directamente ao sistema de fornecimento do aerossol. Colocaram-se os ratos em tubos individuais de exposição ao aerossol e restringiram-se os seus movimentos usando uma montagem de uma placa de empurrar ajustável e uma oclusão terminal, de tal modo que eles não conseguiam virar-se nem fugir da parte final do tubo. Os tubos restritores contendo os ratos foram ligados às aberturas da câmara central e ajustou-se o caudal de ar a 1 litro/minuto. Manteve-se constante o caudal de ar(ar com qualidade respirável) fornecido ao nebulizador PARI LC Star, a 6,9 litros por minuto. Nebulizaram-se fosfomicina por si só, tobramicina por si só, ou combinações a 9:1, 8:2, ou 7:3 de fosfomicina:tobramicina, a 0,2 mL/minuto, e entregaram-se aos ratos através do circuito de alimentação do aerossol. Forneceu-se ar adicional (doravante referido neste documento como ar de diluição) ao nebulizador (aonde) para equilibrar a sobrepressão do ar utilizado para a entrega do aerossol contendo os fármacos, aos ratos. Os roedores forma expostos ao aerossol contendo os antibióticos durante até 2 horas, duas vezes ao dia ao longo de 3 dias consecutivos. Os grupos de tratamento eram constituído por 5-8 animais por grupo. Incluiu-se em cada experiência um grupo sem tratamento para controlo.

Avaliou-se a morte bacteriana 18 horas depois da 56 ΡΕ2266534 última exposição. Anestesiaram-se os ratos com isoflurano e eutanizaram-se por administração intraperitoneal de 500 pL de fenobarbitol. Removeram-se os pulmões assepticamente, limpou-se o excesso de tecido e determinou-se o peso de cada pulmão. Colocaram-se os pulmões em frascos de vidro de 10 mL, adicionando-se 3 mL de soro salino normal estéril por grama de tecido. Homogeneizaram-se as amostras com um homogeneizador portátil durante 30 segundos. Determinou-se a morte bacteriana preparando diluições em série a um décimo, do homogenado de pulmão em soro salino normal estéril, e plaqueando alíquotas de 100 pL sobre placas de agar de sangue. Incubaram-se as placas de cultura a 35°C durante 18-24 horas e contaram-se as colónias bacterianas visualmente. Determinou-se a eficácia dos antibióticos comparando as CFU/pulmão provenientes do grupo de controlo sem tratamento com as provenientes de cada grupo em tratamento.

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Lisboa, 1 de Outubro de 2012

Claims (4)

1. ΡΕ2266534 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação em aerossol, incluindo 1 a 300 mg de fos fomicina mai; s I a 300 mg de tobramrc ina, suspensas em 0,5-7 mL de uma s olução fisioiogícamente aceitável, em que a ra; ^ a o p o n O- e r a-1 entre a fosfomicina e a tobramicína S G "j 3. de 8 partes de fosfomicina para 2 partes de t obrt imici na, para uti .lização na prevenção e no tratamento ,·-' σ.·. q < .te de um tal da fibrose quística num paciente tratamento.
2. 2. A formulação em aerossol da reivindicação 1, em que a formulação referida apresente um pH de entre 4,5 e 8,0 em água com uma concentração de cloreto >30 mM. em que sob a jacto,
3. 3. A formulação a formulação referid forma de um aerosso.’ ultra-sónico, sob em aerossol utilizando pressão ou da rervindicação 1, a ser administrada um nebul izador: de de pa c a o o r o s a .1 3 .
4. 4. Uma formulação em aerossol de pó seco i n c i u indo 1 a 30 0 mg de fos fomicina, inc’ Lu: Lndo 1 a 30 0 mg- de fo sfornic ina mí lis 1 a 300 mg de tobramic :ír: >a, í suspensas em 0, 5-7 mL de uma solução f is: Loiogicamente ac eitá .vel, em que a r cL li ão por idexal entre a f o sfomicina e a t obra .micina seja de O O partes de f osfomic: -na j: :>ara 2 partes de tor jramicina, e Ό G lo menos um excipie nte 3 3 Θ G '3 3 d O d O ;ontc ) de vrsua 2 ΡΕ2266534 farmacêutico sob a fornia de um pó seco mic/ronizado, que entregue um MMAD de 1 a 5 μ aquando da nebulização, destinada a uma. utilrzaçâo para evitar e para. tratar a fibrose qu.ist.ica num paciente que necessite de um tal tratamento. Lisboa, 1 de Outubro de 2012