TWI409074B - 供細菌性呼吸感染之治療用之噴霧式磷黴素／胺基糖苷組合 - Google Patents

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Description

供細菌性呼吸感染之治療用之噴霧式磷黴素/胺基糖苷組合
本發明係關於一種新穎、安全、無刺激性且生理上相容之可吸入磷黴素加胺基糖苷組合調配物，其適於治療藉由革蘭氏陰性菌(諸如洋蔥假單胞菌(Burkholderia cepacia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter species)、大腸桿菌(Escherichia coli)、腸桿菌屬(Enterobacter species)、梭桿菌屬(Fusobacterium species)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、蛋白分解菌屬(Prevotella species)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黏質沙雷氏桿菌(Serratia marcescens)、嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、木糖氧化產鹼菌(Alcaligenes xylosoxidans))及革蘭氏陽性菌(諸如甲氧苯青黴素抵抗性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、對甲氧苯青黴素敏感之金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)及β溶血性鏈球菌屬(β-hemolytic Streptococcus species))引起之細菌性呼吸感染。
在纖維囊腫患者中對治療由革蘭氏陰性菌引起的呼吸感染最廣為接受的治療方案涉及靜脈施用單種抗生素或多種抗生素之組合(Gibson等人，2003；Ramsey,1996)。該治療 方法有幾個重大缺陷，包括：(1)現有抗生素之活性範圍較窄；(2)達至呼吸道之抗生素濃度不夠，不能保證快速起作用及高殺菌率；及(3)由於全身藥物濃度很高而出現副作用。
噴霧施用抗生素(Conway,2005；O'Riordan,2000)可解決非經腸施用之若干限制(Flume及Klepser,2002；Kuhn,2001)。它使高濃度藥物可以局部輸送至支氣管內腔，且藉由降低全身與抗生素之接觸來減少副作用。然而，纖維囊腫患者通常在他們整個成年期受到長時間及重複之抗生素治療(Gibson等人，2003；Ramsey,1996)。因此，累積之胺基糖苷毒性及抵抗性之出現仍係一重要問題。
磷黴素
磷黴素係一廣範圍磷酸抗生素(Kahan等人，1974；Woodruff等人，1977)，其對包括檸檬酸桿菌屬、大腸桿菌、腸桿菌屬、肺炎克雷伯氏菌、綠膿桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬及黏質沙雷氏桿菌在內之革蘭氏陰性菌(Greenwood等人，1992；Grimm,1979；Marchese等人，2003；Schulin,2002)及包括抗萬古黴素之腸球菌(entericocci)、抗甲氧苯青黴素之金黃色葡萄球菌(MRSA)、對甲氧苯青黴素敏感之金黃色葡萄球菌(MSSA)及肺炎鏈球菌在內之革蘭氏陽性菌(Greenwood等人，1992；Grimm,1979；Perri等人，2002)具殺菌活性。磷黴素對大腸桿菌、變形桿菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬及黏質沙雷氏桿菌具最大活性，彼等菌屬通常在磷黴素濃度64微克/毫升時受抑制(Forsgren及Walder，1983)。磷黴素對綠膿桿菌具溫和活性(Forsgren及 Walder，1983)，尤其當與妥布黴素比較時(Schulin，2002)。
磷黴素具殺菌性，但對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌表現出時間依賴殺菌性(Grif等人，2001)。殺菌率及程度皆依賴磷黴素與目標生物體接觸之時間長度(Craig，1998；Mueller等人，2004)。增加磷黴素濃度將不會引起殺菌活性率或程度之相應增加。此特點值得注意，乃因用表現出濃度依賴殺菌活性之抗生素治療綠膿桿菌感染更為可取(Craig，1998；Mueller等人，2004)。
磷黴素單一治療通常用於治療由大腸桿菌引起之簡單尿道感染，而較少用於治療包括纖維囊腫患者之細菌性呼吸感染(Kamijyo等人，2001；Katznelson等人，1984；Kondo等人，1996；Reeves,1994；Bacardi等人，1977；Bonora等人，1977；Honorato等人，1977；Menendez等人，1977)。然而，磷黴素單獨尚未廣泛地用於治療由綠膿桿菌引起的感染。磷黴素與不同種類抗生素聯合以非經腸方式施用來治療心內膜炎(Moreno等人，1986)及纖維囊腫(Mirakhur等人，2003)，但尚未能藉由噴霧施用直接輸送至肺部。
磷黴素既有口服(磷黴素鈣及磷黴素胺丁三醇)調配物形式亦有靜脈(磷黴素二鈉)調配物形式(Woodruff等人，1977)。磷黴素胺丁三醇係較佳之口服施用調配物，乃因為其較磷黴素鈣可更快地吸收入血液中。於單次靜脈或肌肉內2克磷黴素劑量後，1至2小時內血清濃度峰值範圍在25至95微克/毫升之間(Woodruff等人，1977)。比較起來，在非經腸施用相當劑量之磷黴素劑量後，在正常肺中達成之 濃度係1至13微克/毫升(Bonora等人，1977)，該濃度不足以殺死大部分細菌性病原體，尤其是綠膿桿菌(Forsgren及Walder，1983；Schulin,2002)。纖維囊腫患者具有特徵係分佈體積及清除率增大之經改變藥代動力學(Tan等人，2003)，其很可能進一步降低非經腸施用磷黴素之功效。
磷黴素廣泛分佈於各種體組織及體液中，但並不顯著與血漿蛋白質結合(Mirakhur等人，2003)。因此，若磷黴素在感染位點達至足夠濃度，則可充分發揮抗細菌效果。纖維囊腫患者之呼吸道由稱為痰液之黏性分泌物所阻塞(Ramsey，1996)。由於數種抗生素(諸如胺基糖苷及β-內醯胺)很難穿透痰液，故其功效降低。另外，此等抗生素之活性進一步藉由與痰液組份結合而降低(Hunt等人，1995；Kuhn,2001；Ramphal等人，1988；Mendelman等人，1985)。
經常發現自用磷黴素治療尿道感染之患者分離的細菌中出現抵抗性(Marchese等人，2003)。不會發生與其他種類的抑制細胞壁之抗生素之交叉抵抗性，因為磷黴素係作用於磷酸烯醇丙酮酸酶(UDP-N-乙醯葡胺糖烯醇丙酮基-轉移酶)，而其他抗生素並不以該酶為靶(Kahan等人，1974；Woodruff等人，1977)。磷黴素藉由兩種運輸系統主動吸收進細菌細胞內：一構成功能型L-α-甘油磷酸鹽轉運系統及己糖磷酸鹽吸收系統(Kahan等人，1974)。當發生磷黴素抵抗性時，其通常係由於染色體編碼運輸系統之一或兩個中之基因突變所致，且很少係由修飾酶類所致(Arca等人， 1997；Nilsson等人，2003)。
妥布黴素
妥布黴素係一種可有效對抗包括綠膿桿菌、大腸桿菌、不動桿菌屬(Acinetobacter spp.)、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌屬、沙門氏菌屬、黏質沙雷氏桿菌及志賀氏菌屬在內的革蘭氏陰性需氧桿菌之胺基糖苷類抗生素(Vakulenko及Mobashery,2003)。特定而言，妥布黴素對綠膿桿菌具高活性。妥布黴素對敏感菌綠膿桿菌之MIC通常低於2微克/毫升(Shawar等人，1999；Spencker等人，2002；Van Eldere,2003)。大部分革蘭氏陽性菌對妥布黴素有抵抗性，金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌(S.epidermidis)係例外(Vakulenko及Mobashery，2003)。
妥布黴素能快速殺菌，且表現出濃度依賴殺菌性(Vakulenko及Mobashery，2003)。增加妥布黴素濃度既可增加殺菌率亦可增加殺菌程度。因此，為達成治療成功，施用大劑量以使在感染位點妥布黴素峰值水平達至目標生物體之MIC 5至10倍係很有必要。用表現出濃度依賴殺菌活性之抗生素治療綠膿桿菌感染較佳(Ansorg等人，1990)。
通常施用妥布黴素治療較不嚴重之革蘭氏陰性菌感染(Vakulenko及Mobashery，2003)。然而，它可與其他種類抗生素聯合來治療嚴重之尿道及腹部感染以及心內膜炎及菌血症(Vakulenko及Mobashery，2003)。妥布黴素與抑制細胞壁之抗生素聯合非經腸施用業已用於治療呼吸感染，尤其係彼等在CF(纖維囊腫)患者中由綠膿桿菌引起之感染 (Gibson等人，2003；Lang等人，2000；Ramsey等人，1999；Ramsey等人，1993；Smith等人，1999；Spencker等人，2003)。
妥布黴素口服吸收很差，必須以非經腸方式施用(Hammett-Stabler及Johns，1998)。妥布黴素既有靜脈調配物形式亦有噴霧調配物形式。於非經腸施用後，妥布黴素主要分佈在細胞外液內。妥布黴素藉由腎小球濾過而快速排泄，血漿半衰期為1至2小時(Tan等人，2003)。妥布黴素對呼吸分泌物之穿透性很差，且其活性藉由結合至痰液而進一步降低(Kuhn，2001)。與非經腸施用相比，噴霧施用妥布黴素產生明顯更高的1000微克/毫升之痰液水平(Geller等人，2002)，但痰液結合仍是一重要問題(Hunt等人，1995；Mendelman等人，1985；Ramphal等人，1988)。
腎中毒及耳中毒皆係伴隨妥布黴素治療之副作用(Al-Aloui等人，2005；Hammett-Stabler及Johns，1998)。腎中毒源自妥布黴素於覆蓋近端小管內側的上皮細胞之溶酶體中之累積。此引起細胞功能改變，且最終引起細胞壞死(Mingeot-Leclercq及Tulkens，1999)。臨床上，此表現為非少尿型腎衰竭。腎中毒在纖維囊腫患者中之發病率估計係31至42%(Al-Aloui等人，2005)。耳中毒之特徵係聽力損失及暈眩，其發病率估計高至係佔用胺基糖苷治療患者之25%(Hammett-Stabler及Johns，1998)。不同於腎中毒，耳中毒係不可逆的。毒性出現之最大風險因素係與大劑量妥布黴素之累積接觸(Hammett-Stabler及Johns，1998； Mingeot-Leclercq及Tulkens，1999)。纖維囊腫患者在整個生命期用長期及重複高劑量妥布黴素治療(Tan等人，2003)，增加了出現累積性腎衰竭之風險(Al-Aloui等人，2005)。
細菌對妥布黴素之抵抗性日益普遍，其起因於重複及長期之抗生素單一治療(Conway等人，2003；Van Eldere，2003；Mirakhur等人，2003；Pitt等人，2005；Schulin，2002)。舉例而言，纖維囊腫患者體內定居有主要對妥布黴素、慶大黴素(gentamicin)、頭孢噻甲羧肟(ceftazidinme)、哌拉西林(piperacillin)及環丙沙星(ciprofloxacin)有抵抗性之綠膿桿菌菌株(Eldere,2002；Pitt等人，2005；Pitt等人，2003；Weiss及Lapointe，1995)。因此，現有抗生素治療因藥物抵抗性而正變得對於治療綠膿桿菌感染無效。
顯然需要繼續改進治療由革蘭氏陰性及革蘭氏陽性菌(尤其係具多種藥物抵抗性之綠膿桿菌)引起之急性及慢性呼吸感染之方法。此點在纖維囊腫患者中尤其明顯，在纖維囊腫患者中目前治療方法受限於出現抵抗性及中毒等問題。此治療方法將較佳包含磷黴素與一胺基糖苷(例如妥布黴素)之噴霧式抗生素組合之吸入，將治療有效量之藥物直接輸送至呼吸道之支氣管內腔或鼻道。此治療方法將會有效，降低藥物抵抗性頻率及改進安全性。
提供一種供輸送足量呈濃縮形式之磷黴素加胺基糖苷(例如妥布黴素)用的調配物及系統(含有最小可能體積之溶液或最小可能重量之乾粉，溶液或乾粉能噴霧化且基本上 輸送至支氣管內腔)將極為有益。
因此，本發明一個目的係提供一種磷黴素加胺基糖苷之濃縮液體或乾粉調配物，其含有足量但非過量之磷黴素及胺基糖苷，磷黴素及胺基糖苷可藉由噴霧作用有效噴霧化成粒徑主要在1至5微米範圍內且鹽度可調整為允許產生為患者良好耐受之磷黴素加胺基糖苷之噴霧，且該調配物具有合適之儲存壽命。
本發明一態樣係關於一種治療諸如以下疾病之方法：由革蘭氏陰性及革蘭氏陽性菌引起的上呼吸道感染(例如細菌性竇炎)及下呼吸道(肺部)感染(例如纖維囊腫中之感染、纖維囊腫患者中之慢性肺部假單胞菌感染、第一次感染後之假單胞菌感染、支氣管擴張、醫院及社區獲得性肺炎、呼吸器相關性肺炎(VAP))，其包括將一有效量的包含磷黴素及妥布黴素之噴霧調配物施用至有此治療需要的患者之支氣管內腔或鼻腔之步驟。
本發明另一態樣係關於一種或為液體或為乾粉之濃縮調配物，其適於將磷黴素妥布黴素組合輸送至患者之支氣管內腔或鼻腔以治療細菌性下呼吸道及上呼吸細菌感染。
本發明再一態樣係關於一種或為液體或為乾粉之調配物，其適於將胺基糖苷及磷黴素輸送至患者之支氣管內腔或鼻腔，與單獨使用任一種藥物相比降低抗生素抵抗性之出現。
本發明另一態樣係關於一種或為液體或為乾粉之調配 物，其適於將胺基糖苷及磷黴素輸送至患者之支氣管內腔或鼻腔，與單獨使用任一種藥物之PAE相比增加後抗生素效應(PAE)。
本發明再一態樣係關於一種調配物，其包含溶於0.5至7毫升具>30 mM之氯化物濃度之水中的1至300毫克磷黴素及1至300毫克胺基糖苷，其中該調配物pH介於4.5與8.0之間，且藉由霧化輸送。該噴霧含有質量平均空氣動力直徑(MMAD)主要介於1至5微米之間之顆粒，且使用一能霧化成所需大小顆粒之噴霧器施用。
本發明再一態樣係關於一乾粉調配物，其包含呈一微粉化乾粉形式之從約1至約300毫克之磷黴素、從約1至約300毫克之胺基糖苷及至少一種醫藥上可接受賦形劑，其輸送噴霧化後具1及5微米之質量平均空氣動力直徑MMAD之顆粒。
本發明係關於一種包含磷黴素加胺基糖苷之可吸入調配物，其適於治療急性及慢性細菌性肺部細菌感染，尤其係彼等由對於用β-內醯胺及胺基糖苷治療有抵抗性之多種藥物抵抗性革蘭氏陰性菌綠膿桿菌引起之感染。該噴霧調配物體積很小，但仍能以足夠量輸送治療有效量之磷黴素加胺基糖苷至感染位點以治療細菌性呼吸感染。該乾粉及重配之胺基糖苷加磷黴素調配物具有很長之儲存壽命及儲存穩定性。
本發明之調配物較佳包含從5至9重量份數之磷黴素及1至5重量份數之胺基糖苷，較佳地從約7至9重量份數之磷黴 素及1至3重量份數之胺基糖苷，更佳地係約8重量份數之磷黴素及約2重量份數之胺基糖苷。最佳胺基糖苷係妥布黴素。
術語定義
如本文所用：
「四分之一生理鹽水」或「1/4NS」意指稀釋至其四分之一濃度且含有0.225%(w/v)NaCl之生理鹽水。
「9：1之磷黴素：妥布黴素」意指一含有重量比係9：1之磷黴素酸：妥布黴素鹼之水溶液或乾粉調配物。
「8：2之磷黴素：妥布黴素」意指一含有重量比係8：2之磷黴素酸：妥布黴素鹼之水溶液或乾粉調配物，以使磷黴素之量係四倍於妥布黴素之量。
「7：3之磷黴素：妥布黴素」意指一含有重量比係7：3之磷黴素酸：妥布黴素鹼之水溶液或乾粉調配物。
「5：5之磷黴素：妥布黴素」意指一含有重量比係5：5之磷黴素酸：妥布黴素鹼之水溶液或乾粉調配物。
「最小抑制濃度(MIC)」意指在35℃培養18至20小時後阻止可見生長之最低抗生素濃度。
「最小殺菌濃度(MBC)」意指產生3 Log10殺菌之最低抗生素濃度。
「時間依賴殺菌」意指更高藥物濃度殺菌速率並不更快或殺菌程度並不更高。
「濃度依賴殺菌」意指藥物濃度愈高，殺菌速率愈快且及殺菌程度愈高。
「抑菌性」意指抗生素藉由抑制細菌生長起作用。
「殺菌性」意指抗生素藉由殺滅細菌起作用。
「協同作用」意指所檢驗抗生素之組合效果顯著大於任一種單獨藥物。
本發明係關於一種適於藉由噴霧化有效輸送至支氣管內腔或鼻腔之濃縮磷黴素加妥布黴素調配物。本發明較佳適於調配濃縮磷黴素加妥布黴素以藉由噴氣式噴霧器、超音噴霧器或等效噴霧器噴霧化產生介於1與5微米之間之噴霧顆粒，該粒徑對於有效輸送磷黴素加妥布黴素至支氣管內腔或鼻腔中以治療細菌性感染(尤其係彼等由甲氧苯青黴素抵抗性綠膿桿菌引起之感染)很有必要。該調配物含有最少然而係有效量的調配入最小可能體積的生理上可接受溶液中之磷黴素加妥布黴素，該溶液之鹽度被調整至允許產生一患者可耐受良好但將伴隨的非期望副作用(諸如支氣管痙攣及咳嗽)之出現減至最小的磷黴素及妥布黴素噴霧。
對任何噴霧式調配物主要要求係其安全性及有效性。另外優點係低成本、使用之使用性、長儲存壽命、噴霧器儲存及操作。
噴霧式磷黴素加妥布黴素調配成用於有效輸送磷黴素加妥布黴素至呼吸道支氣管內腔或鼻腔。選擇一噴霧器以形成主要質量平均空氣動力直徑在1至5微米之間之磷黴素加妥布黴素噴霧。磷黴素加妥布黴素之調配及輸送量可有效治療細菌性肺部感染，尤其係彼等由多種藥物抵抗性綠膿 桿菌引起之感染。該調配物具有調整至允許產生患者耐受良好之磷黴素加妥布黴素噴霧之鹽度、滲透壓及pH。該調配物具有能夠輸送有效劑量之磷黴素加妥布黴素至感染位點之最小可能可霧化體積。另外，該噴霧式調配物無損害呼吸道或鼻腔之功能，且將非期望之副作用減至最小。
I.抗生素組合之評估
磷黴素：胺基糖苷組合係如實例1所述進行調配。因為磷黴素固有的安全性及降低胺基糖苷毒性之需要，磷黴素構成該組合之主要組份。磷黴素：胺基糖苷組合(特定言之係磷黴素：妥布黴素)係在以下幾方面得到評估：(a.)體外藥效；(b.)殺菌率；(c.)抵抗性頻率及(d.)動物效能。
a.體外藥效
磷黴素及妥布黴素單獨及組合用於抵抗一組在纖維囊腫、支氣管擴張、竇炎及呼吸器相關性肺炎中引起呼吸道感染之代表性革蘭氏陰性及革蘭氏陽性菌種之體外藥效係示於表1及2。數據表明磷黴素：妥布黴素組合對革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌具有廣範圍之殺菌活性。磷黴素：妥布黴素組合之MIC無優於單獨的磷黴素或妥布黴素之改善。
ND=未測定
ND=未測定
表3所示係磷黴素及妥布黴素單獨及組合對分離自纖維囊腫患者呼吸痰液試樣的100株綠膿桿菌菌株之MIC50及MIC90值。該研究證明在不存在黏蛋白時妥布黴素係活性最強之抗生素。聯合磷黴素及妥布黴素與單獨磷黴素相比可使MIC50及MIC90值得到顯著改進。在CF黏蛋白結合模型(+黏蛋白)中，磷黴素：妥布黴素組合具有與單獨的妥布黴素相當之MIC50及MIC90值。
表4所示係磷黴素及九種胺基糖苷之間的棋盤格協同殺菌作用研究結果。九種不同磷黴素：胺基糖苷之間之相互作用皆歸為無效類。沒有一種組合具有抗綠膿桿菌ATCC 27853之協同活性。該數據證明藉由聯合磷黴素及胺基糖苷未能達成明顯的效能改進。
表5所示係磷黴素與妥布黴素之間抗臨床綠膿桿菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌及金黃色葡萄球菌菌株之棋盤格協同殺菌作用研究結果。磷黴素與妥布黴素之間之相互作用對於絕大部分所檢查分離菌株皆歸為無效類。磷黴素與妥布黴素組合之間的相互作用僅對一株綠膿桿菌及一株大腸桿菌有協同作用。該數據進一步表明藉由聯合磷黴素及妥布黴素未能達成顯著的功效改進。
表6所示係磷黴素及妥布黴素單獨及9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素組合對綠膿桿菌ATCC 27853之MBC/MIC值。MBC/MIC之值1之抗生素係較佳，因為其係藉由殺滅而非減緩生長來抑制細菌。該研究意料之外地證明9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素組合之MBC/MIC值等同於單獨的妥布黴素。此發現係出人意料，因為單獨磷黴素之MBC/MIC比率8。該研究亦顯示對任何其他磷黴素：胺基糖苷組合沒有觀察到類似發現。
表6. 單獨胺基糖苷及9：1、8：2及7：3之磷黴素及胺基 糖苷組合對綠膿桿菌ATCC 27853之MBC/MIC值 ND=未測定
表7所示係磷黴素及妥布黴素單獨及9：1、8：2及7：3組合對綠膿桿菌ATCC 27853、大腸桿菌ATCC 25922及金黃色葡萄球菌ATCC 29213之MBC/MIC值。對綠膿桿菌，9：1、8：2及7：3組合之MBC/MIC值等同於單獨的妥布黴素。此發現係出乎意料，因為對大腸桿菌或金黃色葡萄球菌未觀察到此結果。
b.殺菌率
表8所示係9：1、8：2及7：3磷黴素：胺基糖苷組合對綠膿桿菌ATCC 27853之時間-殺菌研究結果。殺菌效果對時間之檢查顯示磷黴素：妥布黴素、磷黴素：慶大黴素及磷黴素：阿貝卡星(arbekacin)組合具協同作用。其餘磷黴素：胺基糖苷組合沒有協同作用。此數據表明，哪一磷黴素：胺基糖苷組合或何種磷黴素：胺基糖苷比率具協同作用並不明顯。
表9所示係藉由各種磷黴素：胺基糖苷組合達成殺滅綠膿桿菌ATCC 27853之時間。抗生素以32微克/毫升之濃度進行評估。該研究證明9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素 組合較其他任何磷黴素：胺基糖苷組合更快達成細菌之殺滅。此數據亦表明該等磷黴素：胺基糖苷組合中有三種未表現出殺細菌性。此等結果係出乎意料，因為單獨的妥布黴素在1小時達成殺菌效果，而單獨的磷黴素不能殺菌。
圖1及2所示係9：1之磷黴素：妥布黴素組合之時間-殺菌曲線，且證明與單獨用磷黴素及妥布黴素之抑菌性殺菌相比該組合可快速殺滅綠膿桿菌ATCC 27853。此係出乎意料，因為棋盤格殺菌分析並沒有證明磷黴素與妥布黴素之間有協同作用。
圖3及4所示係8：2之磷黴素：妥布黴素組合之時間-殺菌曲線，且證明該組合可快速殺滅綠膿桿菌ATCC 27853。在濃度為32微克/毫升時，該組合之殺菌活性顯著高於磷黴素，稍微高於妥布黴素。在16微克/毫升時該組合高於單獨 的妥布黴素及磷黴素。
圖5、6及7所示係7：3之磷黴素：妥布黴素組合之時間-殺菌曲線，且證明該組合可快速殺滅綠膿桿菌ATCC 27853。在濃度為16及32微克/毫升時，該組合之殺菌活性顯著高於單獨的磷黴素，且稍微高於單獨的用妥布黴素。在8微克/毫升時該組合既高於單獨的妥布黴素亦高於單獨的磷黴素。
圖8及9比較9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素組合及單獨用妥布黴素對綠膿桿菌ATCC 27853之殺菌曲線。在濃度為32微克/毫升時，所有抗生素之殺菌率及殺菌程度皆相當。16微克/毫升時妥布黴素係活性最強之抗生素，隨後為F7：T3、F8：T2及F9：T1。
圖10、11及12證明9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素組合對綠膿桿菌ATCC 27853之濃度依賴殺菌性。此係出乎意料，因為該組合之主要組份磷黴素表現出時間依賴殺菌性。單獨的妥布黴素表現出濃度依賴殺菌性。
c.扺抗性頻率
表10所示係五株綠膿桿菌菌株對單獨用磷黴素及妥布黴素及9：1之磷黴素：妥布黴素組合之抵抗性出現頻率。該研究證明對9：1之磷黴素：妥布黴素之抵抗性出現頻率係單獨的磷黴素的1/1000至1/100,000，且係單獨的妥布黴素的1/10至1/1000。
表11所示係單次與磷黴素、妥布黴素或9：1之磷黴素：妥布黴素組合接觸後分離之綠膿桿菌突變株之MIC倍數增加。該研究證明與磷黴素(128至>512倍)或妥布黴素(1至16倍)突變體相比，9：1突變體之MIC(1至2倍)並沒有顯著增加。
表12所示係一臨床綠膿桿菌菌株在與磷黴素、妥布黴素或9：1之磷黴素：妥布黴素組合連續接觸28天后抵抗性之出現。在與9：1組合接觸14天時可引起MIC之8倍增加，但該MIC並沒有超過256微克/毫升之磷黴素抵抗性臨界點。與 妥布黴素接觸使MIC增加128倍，此超過了16微克/毫升之妥布黴素抵抗性臨界點。當綠膿桿菌與單獨的磷黴素接觸時觀察到抵抗性快速且猛烈地出現。
d.動物效能
圖13、14及15所示係分別在大鼠肺部噴霧施用31.1毫克/毫升9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素組合溶液後殺滅大腸桿菌之效果。該研究證明在45至60分鐘治療後能完全根除(5至6 log10CFU)肺部大腸桿菌感染。
圖16及17證明在大鼠肺部噴霧施用31.1毫克/毫升9：1之磷黴素：妥布黴素組合溶液後可得到>5 log10殺大腸桿菌效果，相比之下單獨用磷黴素及妥布黴素獲得小於1 log10殺菌效果。
圖18證明在大鼠肺部噴霧施用31.1毫克/毫升8：2之磷黴素：妥布黴素組合溶液後可得到>5 log10殺大腸桿菌之效果，相比之下單獨用妥布黴素獲得2 log10殺菌效果。此係出乎意料，因為體外藥效數據並沒有證明該組合優於單獨用妥布黴素。
圖19及20證明在大鼠肺部噴霧施用31.1毫克/毫升8：2之 磷黴素：妥布黴素組合溶液比單獨用磷黴素及妥布黴素可產生更強之殺綠膿桿菌效果。
圖21證明在大鼠肺部噴霧施用60及90毫克/毫升之8：2磷黴素：妥布黴素組合溶液可產生顯著之殺綠膿桿菌效果。
II. 磷黴素/妥布黴素噴霧調配物
本發明中有用之胺基糖苷係諸如妥布黴素、慶大黴素、卡那黴素B、阿米卡星、阿貝卡星、地貝卡星、鏈黴素、新黴素及奈替米星等抗生素。本發明中尤其有用之磷黴素化合物係諸如磷黴素胺丁三醇、磷黴素二鈉鹽及磷黴素鈣等抗生素。
本發明較佳之磷黴素加妥布黴素調配物每0.5至7毫升具有濃度>30 mM之氯化物之水含有10至500毫克磷黴素加妥布黴素。此相當於防止多種敏感生物體定居或治療由多種敏感生物體引起的嚴重上及下呼吸道感染所需之劑量。
患者可能對霧化溶液之pH、體積滲莫耳濃度及離子濃度敏感。因此，此等參數應調整為與磷黴素加妥布黴素相容且為患者所耐受。最佳磷黴素加妥布黴素之溶液或懸浮液將含有>30 mM之氯化物濃度，pH 4.5至8.0。
本發明之調配物係主要噴霧成允許輸送藥物至在感染及聚落期間細菌所定居之終末及呼吸性細支氣管或鼻道的粒徑。為將磷黴素加妥布黴素以噴霧形式有效輸送至呼吸道之肺支氣管內腔，形成質量平均空氣動力直徑主要介於1至5微米之間的噴霧係很有必要。用於治療及預防支氣管內感染(尤其係彼等由綠膿桿菌引起之感染)之調配及輸送量之磷黴素加妥布黴 素必須有效對準肺表面。該調配物應該具有可輸送有效磷黴素加妥布黴素劑量至感染位點之最小可能可噴霧化體積。另外，該調配物必須提供不會對呼吸道及鼻腔功能產生不良影響之條件。因此，該調配物必須含有於允許藥物有效輸送之條件下調配足量藥物，同時可避免不期望之反應。本發明之新穎調配物滿足所有此等要求。
本發明之磷黴素加妥布黴素係以液態劑型調配，意欲供患有細菌性上或下呼吸感染之患者或具有得此等疾病風險之患者吸入治療用。因為該等患者遍佈世界各地，該液態劑量調配物具有相當長的儲存壽命係很有必要。因此儲存條件及包裝變得很重要。
將磷黴素加妥布黴素調配物可無菌製備為水溶液置於雙吹製灌裝安瓿中，以便每一種抗生素可獨立用水調配並調整pH。妥布黴素係在酸性pH(1至6)下調配，而磷黴素係在鹼性pH(8至13)下調配。妥布黴素之低pH調配物確保其所有鹼性氮原子皆質子化，由此防止分子發生胺氧化及降解(妥布黴素溶液在室溫下變成黃色)。因此，妥布黴素之低pH溶液在室溫下長期保持穩定。磷黴素在高pH下最穩定，因為反應性活性環氧化物環在酸性或低pH下易於水解(環打開)。磷黴素之高pH溶液在室溫下亦很穩定。因此，該雙安瓿吹製灌裝容器允許每一種抗生素之單獨且室溫穩定的調配物處於高及低pH下，以便在臨用前藉由在噴霧器中混合兩種溶液而得到藥物產品組合及最終pH。該調配物之儲存適宜性使得能可靠使用經調配適於噴霧化之磷黴素加妥布黴素。
III. 用於向肺部輸送抗生互素組合之噴物器
使用能將本發明之調配物霧化成主要在1至5微米大小範圍內之噴霧顆粒之裝置施用本發明之調配物。在本申請案中「主要」意指所有所產生噴霧顆粒之至少70%(但較佳90%以上)在1至5微米範圍內。典型裝置包括噴氣式噴霧器、超音噴霧器、加壓噴霧產生噴霧器及振盪多孔盤噴霧器。合適噴霧器之代表包括可自Pari Inovative Manufactures，Midlothian,VA得到之eFlow®噴霧器、可自Profile Drug Delivery of West Sussex,United Kingdom得到之iNeb®噴霧器、可自Omeron,Inc.of Chicago,IL得到之Omeron MicroAir®噴霧器及可自Aerogen Inc.of Mountain View,CA得到之AeroNebGo®噴霧器。
噴氣式噴霧器使用空氣壓力使液態溶液破碎為噴霧小滴。超音噴霧器藉由一將液體剪切成小噴霧小滴之壓電晶體起作用。加壓系統一般迫使溶液通過小孔產生小顆粒。振盪多孔盤裝置利用快速振盪將液體流剪切成合適大小的小滴。然而，僅某些磷黴素加妥布黴素調配物能有效噴霧，因為該等裝置對調配物之物理及化學性質很敏感。
本發明係體積小但濃度高之磷黴素加妥布黴素調配物，其可作為噴霧以有效藥物濃度輸送至具患由敏感細菌引起的感染風險或已患有此感染之人之呼吸道。該調配物安全、耐受良好且成本有效性極高。另外，該調配物可提供合適儲存壽命供商業銷售。由下列實例可更好地理解上述內容，給出該等實例係用於舉例說明目的而並非意欲限制 本發明概念之範圍。
實例1
供噴霧化之磷黴素/妥布黴素溶液之製備
9：1之磷黴素/妥布黴素溶液：將磷黴素二鈉(18.057克、13.99克遊離酸)溶於250毫升水中，且藉由滴加1.53毫升4.5 N HCl將pH調至7.41。向該得到之溶液中加入1.56克97.5%妥布黴素鹼。藉由加入2.45毫升4.5 N HCl將該溶液pH調至7.60。用水稀釋該溶液至500毫升，且藉由0.2微米Nalge Nunc 167-0020膜濾器過濾。最終pH係7.76，體積滲莫耳濃度係537 mOsmol/公斤，磷黴素/妥布黴素比率經計算係9：1，且氯化物濃度係35.8 mM。
8：2之磷黴素/妥布黴素溶液：製備8：2比率之磷黴素/妥布黴素溶液。將3.1680克磷黴素二鈉(2.4013克遊離酸)溶於50毫升水中。將0.6154克97.5%妥布黴素鹼(0.6000克純妥布黴素鹼)溶於該磷黴素溶液中。藉由加入0.910毫升6 M HCl調整pH。該溶液用水稀釋至100毫升。該溶液最終pH係7.65，體積滲莫耳濃度係477 mOsmol/公斤，且氯化物濃度係54.6 mM。最終磷黴素/妥布黴素比率經計算係8：2。
7：3之磷黴素/妥布黴素溶液：使用上述9：1溶液之方法製備7：3比率之磷黴素/妥布黴素溶液。將17.466克磷黴素二鈉(13.239克遊離酸)溶於水中，藉由加入1.46毫升4.5 N HCl、5.819克97.5%妥布黴素鹼(5.674克純妥布黴素鹼)將pH調至7.43，且藉由加入9.20毫升4.5 N HCl調節該組合溶液之pH。該溶液之最終pH係7.68，體積滲莫耳濃度係560 mOsmol/公斤，磷黴素/妥布黴素比率係7：3，且氯化物濃度係95.9 mM。
實例2
8：2之高滲性磷黴素與妥布黴素溶液之製備
將7.9165克磷黴素二鈉(6.0007克磷黴素遊離酸)及1.5382克97.5%妥布黴素鹼(1.4997克純妥布黴素鹼)溶於50毫升水中。藉由加入2.3毫升6 M HCl將pH調至7.62。將該組合溶液稀釋至100毫升。最終pH係7.64，體積滲莫耳濃度係1215 mOsmol/公斤，最終氯化物濃度係138 mM，且磷黴素/妥布黴素比率係8：2。
實例3
供重配用之高pH磷黴素與低pH妥布黴素之單獨溶液之製備
藉由將5.891克磷黴素二鈉(4.465克磷黴素遊離酸)溶於水中且稀釋至100毫升來製備磷黴素溶液。pH係9.42，且體積滲莫耳濃度係795 mOsmol/公斤。
藉由將1.869克97.5%妥布黴素鹼(1.822克純妥布黴素鹼)溶於60毫升水且藉由加入18.8毫升1 M HCl調pH至4.90並用水稀釋至100毫升來製備磷黴素溶液。pH係4.89，且體積滲莫耳濃度係148 mOsmol/公斤。
將1毫升磷黴素溶液及1毫升妥布黴素溶液組合。對該組合藥物產品溶液，pH係7.30，體積滲莫耳濃度係477 mOsmol/公斤，氯化物濃度係94.0 mM，且磷黴素/妥布黴素比率係7：3。
實例4
從市售供吸入用妥布黴素溶液(TOBI)及凍乾(乾)磷黴素二鈉(FOSFO)製備8：2之磷黴素/妥布黴素溶液
將3.1665克磷黴素二鈉(FOSFO,2.4002克磷黴素遊離酸)溶於兩支5毫升(60毫克/毫升)安瓿的供吸入用妥布黴素溶液(TOBI，600毫克妥布黴素鹼)加40毫升水中。該溶液之起始pH係7.50。向該溶液中加入667微升4.5 M NaCl。將該組合溶液用水稀釋至100毫升。最終調配物具有下列性質：pH 7.49；體積滲莫耳濃度502 mOsmol/公斤；氯化物濃度33.8 mM且磷黴素/妥布黴素比率係8：2；且藥物濃度係24毫克/毫升磷黴素及6毫克/毫升妥布黴素。
實例5至10闡述已用於產生於本申請案之表格及圖中所示數據的方法。
實例5
最小抑制濃度(MIC)之測定
抗生素及抗生素組合對在纖維囊腫、支氣管擴張、竇炎及呼吸器相關性肺炎患者中引起呼吸感染之革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌代表菌種之效能用MIC測試來評估。綠膿桿菌菌株分離自采自纖維囊腫患者之肺痰液樣本、血液培養物、呼吸道感染及皮膚或軟組織感染。大腸桿菌、流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌、嗜麥芽寡養單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌(S.pyogenes)及糞腸球菌(E.faecalis)分離自呼吸道感染。大腸桿菌ATCC 25922、綠膿桿菌ATCC 27853及金黃 色葡萄球菌ATCC 29213用作品質對照菌株。
方法A：單獨的磷黴素、單獨的妥布黴素或磷黴素加妥布黴素組合之MIC按照NCCLS準則(NCCLS,2003)藉由瓊脂平板稀釋法測定。細菌菌株劃線接種於含有5%去纖維蛋白羊血之Trypic Soy瓊脂平板上(PML，Microbiologicals,Wilsonville,Or.)(此後稱為血瓊脂平板)，並於35℃過夜培養。從過夜培養物中取兩至三個菌落接種於3毫升無菌生理鹽水中，簡短旋渦振盪，且調整菌液濃度至0.5 McFarland標準濃度(NCCLS,2003)。將該細菌懸浮液用無菌生理鹽水1：40稀釋，用作接種物。藉由組合16克瓊脂糖(Becton-Dickinson，Sparks，MD)、22克Mueller-Hinton肉湯粉(Becton-Dickinson,Sparks,MD)並用蒸餾水調節至1公升來製備Mueller-Hinton瓊脂平板(此後稱為MHA)。該瓊脂用高壓鍋滅菌，冷卻至55℃，且補充25微克/毫升葡萄糖-6-磷酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)。將二十五毫升冷卻瓊脂等分於50毫升尖底管，且用合適濃度之抗生素補充以達成0.06微克/毫升至512微克/毫升之濃度。輕輕混合瓊脂及抗生素後，將該懸浮液倒入100毫米之無菌皮氏培養皿(petri dishes)中，且在室溫下讓其凝固。該抗生素瓊脂平板用48點接種器(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)每點大約接種2 x 104 CFU。MIC定義為在35℃培養18至20小時後阻止可見生長之最低抗生素濃度。一具體抗生素或抗生素組合對大量綠膿桿菌之效能藉由計算MIC50及MIC90值來測定。MIC50值定義為抑制50%綠膿桿菌菌株之抗生素濃度。 MIC90值定義為抑制90%綠膿桿菌菌株之抗生素濃度(Wiedemann及Grimm,1996)。
方法B：測定在豬胃黏蛋白存在時單獨的磷黴素、單獨的妥布黴素或磷黴素加妥布黴素組合對綠膿桿菌菌株之MIC，以評估黏蛋白與蛋白質結合對抗生素活性之影響。除在高壓滅菌之前加入2%(重量/體積)豬胃黏蛋白(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo)至MHA中外，方法與實例5方法A所述相同。
方法C：藉由按照NCCLS標準(NCCLS,2003)之肉湯微量稀釋法測定單獨的阿米卡星、阿貝卡星、地貝卡星、慶大黴素、卡那黴素、奈替米星、新黴素、鏈黴素及妥布黴素對綠膿桿菌ATCC 27853之MIC。大腸桿菌ATCC 25922及金黃色葡萄球菌ATCC 29213用作品質對照菌株。將細菌菌株劃線接種到血瓊脂平板，並在35℃培養18小時。從過夜培養物中取兩至三個菌落接種於3毫升無菌生理鹽水中，簡短旋渦振盪，且將菌液濃度調整至0.5 McFarland標準濃度(NCCLS,2003)。將該細菌懸浮液用經陽離子調整過之Mueller-Hinton肉湯(此後稱為CAMHB)1：100稀釋。將50微升細菌接種物(大約2 x 105 CFU/毫升)用移液到96孔培養板各孔中，每一孔中含有50微升CAMHB(Remel,Lenexa,Kanas)且補充有濃度範圍從0.125微克/毫升至128微克/毫升的經2倍稀釋的抗生素。MIC定義為在35℃培養18至24小時後阻止可見生長之最低抗生素濃度。
實例6
棋盤格協同殺菌試驗
藉由棋盤格殺菌方法(Eliopoulos及Moellering,1996)測定磷黴素與阿米卡星、阿貝卡星、地貝卡星、慶大黴素、卡那黴素B、新黴素、奈替米星、鏈黴素或妥布黴素之間之潛在相互作用。評估經兩倍系列稀釋的磷黴素及胺基糖苷，其涵蓋兩種化合物之預期MIC值。將細菌菌株劃線接種於血瓊脂平板並在35℃培養18至24小時。從過夜培養物中取兩至三個菌落接種於3毫升無菌生理鹽水中，簡短旋渦振盪，且將菌液濃度調整至0.5 McFarland標準濃度(NCCLS,2003)。將50微升細菌接種物(大約2 x 105 CFU/毫升)移液到96孔培養板各孔中，每一孔中含有50微升CAMHB(Remel,Lenexa,Kanas)且補充有經兩倍稀釋的兩種所述抗生素。微量抑制濃度(FIC)藉由用與第二種化合物組合之化合物1之MIC除以單獨化合物1之MIC來計算。每一種藥物組合之FIC總和(SFIC)藉由將化合物1及2之單個FIC相加來計算。FIC計算為於35℃培養18至20小時後阻止可見生長之最低抗生素濃度。協同作用定義為SFIC0.5，無效作用為>0.5及<4，而拮抗作用為SFIC>4。最低SFIC用於藥物相互作用之最終判定。
實例7
時間-殺菌動力學之測定
在存在2%豬胃黏蛋白條件下實施時間-殺菌試驗以評估黏蛋白與蛋白質結合對抗生素活性之影響。將兩至三個菌落接種於10毫升CAMHB中，並於35℃在振盪水浴(250 rpm) 中培養18至24小時。過夜培養物用10毫升新鮮CAMHB作1：40稀釋，並在35℃於振盪水浴(250 rpm)中培養1至2小時。將得到之培養物菌液濃度調節至0.5 McFarland標準濃度(NCCLS,2003)。當比較多種抗生素時為減少細菌接種量之變化，一含有2%(重量/體積)豬胃黏蛋白之主要CAMHB試管用細菌接種物的1：200稀釋物(大約5 x 105 CFU/毫升)接種，補充25微克/毫升葡萄糖-6-磷酸，簡短旋渦振盪。然後將十毫升等分試樣用吸管移至50毫升尖底試管中。將單獨的磷黴素、單獨的妥布黴素及磷黴素加阿米卡星、阿貝卡星、地貝卡星、慶大黴素、卡那黴素、奈替米星、新黴素、鏈黴素或妥布黴素組合以等同於1、2、4及8倍於磷黴素抗綠膿桿菌ATCC 27853之MIC(4微克/毫升)之濃度加至培養物培養基中。磷黴素加阿米卡星、阿貝卡星、地貝卡星、慶大黴素、卡那黴素、奈替米星、新黴素、鏈黴素或妥布黴素之殺菌活性亦與其單個組份單獨使用之殺菌活性比較。舉例而言，對32微克/毫升之9：1之磷黴素：妥布黴素組合與單獨28.8微克/毫升之磷黴素及單獨3.2微克/毫升之妥布黴素之殺菌活性予以比較。在每一試驗中皆進行無藥物對照。培養物於35℃用抗生素在振盪(250 rpm)水浴中培養24小時。藉由用無菌生理鹽水10倍系列稀釋培養物並將100微升等分試樣塗佈於血瓊脂平板上來測定0、1、2、4、6及24小時之殺菌性。培養物平板在35℃培養18至24小時，人工計數菌落數量。該菌落計數方法之檢測限度係1 Log10。藉由用CFU/毫升培養物之Log10數量對時間作圖繪 製時間-殺菌曲線。將原始接種物減少3 Log10CFU/毫升之抗生素濃度視為具殺菌性，將原始接種物減少2 Log10CFU/毫升之抗生素濃度定義為具抑菌性(NCCLS,1999)。協同作用定義為抗生素組合與活性最大之單個抗生素比較細菌菌落計數之降低2 Log10 CFU/毫升(NCCLS,1999)。
實例8
最小殺菌濃度(MBC)之測定
磷黴素、阿米卡星、阿貝卡星、地貝卡星、慶大黴素、卡那黴素B、奈替米星、新黴素、鏈黴素或妥布黴素單獨對綠膿桿菌ATCC 27853、大腸桿菌ATCC 25922及金黃色葡萄球菌ATCC 29213之MBC藉由肉湯微量稀釋法按照NCCLS標準(NCCLS,1999)測定。將細菌菌株劃線接種於血瓊脂平板且在35℃培養18至24小時。從過夜培養物中取兩至三個菌落接種於3毫升無菌生理鹽水中，簡短旋渦振盪，且將菌液濃度調整至0.5 McFarland標準濃度(NCCLS,2003)。將五十微升細菌接種物(大約2 x 105 CFU/毫升)用吸管移到含有50微升補充有濃度範圍從0.125微克/毫升至128微克/毫升抗生素的2倍稀釋物之CAMHB(Remel,Lenexa,Kanas)之96孔培養板各孔中。平板在35℃培養18至24小時，且如實例5方法C所述測定MIC。將顯示無生長(MIC及以上)之孔之內容物用微量移液管混合，且將兩份相同的10微升樣本塗佈到血瓊脂平板上。使培養物平板在35℃培養18至24小時，人工計數每一平板菌落數量。藉由NCCLS方法測定拒絕 值，該方法慮及最終接種量、單或雙取樣、移液器量取誤差及樣本反應之泊松分佈(Poisson distribution)。舉例而言，若最終接種物係5 x 105 CFU/毫升且評估兩份樣本，則將具有小於25個菌落總數之最低稀釋度視為MBC。該MBC定義為3 Log10原始接種物之CFU/毫升減少量，如NCCLS標準(NCCLS,1999)所述。MBC/MIC比率藉由MBC除以MIC來計算。
實例9
單步抵抗性頻率之測定
測定5株敏感綠膿桿菌菌株之單步自發抵抗性突變頻率。細菌接種物藉由用2至3個細菌菌落接種5毫升CAMHB且在35℃於振盪水浴(250 rpm)培養18小時來製備。於125毫升三角錐瓶中用50毫升新鮮CAMHB1：20稀釋過夜培養物，且在35℃於振盪水浴(250 rpm)中培養8小時。培養物在室溫下以2,500 rpm離心20分鐘。棄掉上清液，將來自50毫升培養物之細胞沉澱用500微升至1000微升之CAMHB重新懸浮。該細菌懸浮液之CFU/毫升藉由以下測定用無菌生理鹽水10倍系列稀釋且將100微升等分試樣塗佈於血瓊脂平板上來測定。將培養物平板在35℃培養18至24小時，且人工計數菌落數目。將100微升細菌細胞懸浮液(大約109 CFU)塗佈於含有128微克/毫升磷黴素、8微克/毫升妥布黴素或128微克/毫升磷黴素加8微克/毫升妥布黴素之MHA平板上。將培養物平板在35℃培養48至72小時，且人工計數每一平板之菌落數目。抵抗性頻率藉由在規定抗生素濃度下 細菌生長之數目除以原始接種物細菌數目來計算。如實例5方法A所述以單磷黴素、單妥布黴素及磷黴素加妥布黴素組合之MIC變化來評估代表性突變株。
實例10
多步抵抗性分析
用臨床對磷黴素(MIC=8微克/毫升)及妥布黴素(MIC=0.5微克/毫升)敏感之綠膿桿菌菌株評估連續系列傳代期間抵抗性之出現。將綠膿桿菌COR-014之單菌落接種於5毫升MHCAB中並短暫旋渦振盪。介於1微克/毫升至512微克/毫升間之單獨磷黴素、介於0.0625微克/毫升至512微克/毫升間之單獨妥布黴素及介於0.0625微克/毫升至512微克/毫升間之9：1之磷黴素：妥布黴素組合用CAMHB進行2倍系列稀釋。將十微升細菌懸浮液用吸管移至每一抗生素之3毫升稀釋液內且在35℃靜態培養18至24小時。從每一種抗生素系列稀釋物中選擇具可見細菌生長之最高抗生素濃度試管，且將100微升培養物用吸管移至一新鮮抗生素系列稀釋物中。將試管在靜態於35℃培養18至24小時。該過程共重複28次。如實例5方法C所述來測定單獨的磷黴素、單獨妥布黴素及磷黴素加妥布黴素組合對親代菌株及采自每一傳代後之抵抗性分離菌株之MIC。
實例11
動物效能之測定
評估單獨用噴霧式磷黴素、單獨用噴霧式妥布黴素及噴霧式磷黴素加妥布黴素組合對抗大鼠肺中大腸桿菌ATCC 25922及綠膿桿菌ATCC 27853之體內效能。用於建立大鼠肺感染之細菌接種物由細菌與瓊脂糖珠混合物構成。將大腸桿菌ATCC 2S922或綠膿桿菌ATCC 27853劃線接種於血瓊脂平板上，並在35℃培養18至24小時。將兩至三個菌落接種於10毫升Tryptic Soy肉湯(此後稱為TSB)中，並在35℃靜態培養1.5至2小時。用新鮮TSB將培養物調整至光密度為0.1(625奈米)，然後用TSB進行1：5稀釋。將一毫升細菌懸浮液(大約107 CFU/毫升)加至10毫升2%純淨瓊脂溶液並藉由顛倒短暫混合。將該混合物加至150毫升平衡至55℃之重石蠟油中，且在冰上攪拌5分鐘。將冷卻後之懸浮液倒入250毫升離心管中，並在4℃ 3,000 rpm離心10分鐘。倒掉上清液，用25毫升無菌生理鹽水重新懸浮沉澱小塊，且轉移至50毫升尖底離心管中。在4℃以3,000 rpm離心10分鐘後，棄掉上清液，用10毫升鹽水重懸沉澱。將該懸浮液在4℃以3,000 rpm離心10分鐘且棄掉上清液。用大約10毫升無菌生理鹽水重懸該沉澱，然後用2%無菌瓊脂珠溶液以1：30稀釋得到大約10至1000 CFU/毫升。
在向氣管內接種細菌接種物之前，藉由與異氟烷接觸5分鐘來麻醉Sprague-Dawly雄鼠(200至250克)。將一氣管內針插入氣管，且用1毫升注射器將80微升含有大約10至100 CPU之大腸桿菌ATCC 25922或綠膿桿菌ATCC 27853之瓊脂珠滴注入肺部。將大鼠置於單個籠中，使其大約恢復18小時。
用一噴霧施放裝置(In Tox Products,New Mexico)將單獨 的磷黴素、單獨的妥布黴素及磷黴素：妥布黴素組合施用至大鼠。該系統由具隔開的噴霧供應及排氣通道之中央室構成。中央室具有24個直接連接到噴霧供應系統之開孔。將大鼠置於單個噴霧施放管，用一可調節推盤及端帽組件來固定，以便大鼠不能轉動或自施放管末端逐漸後退。將該含有大鼠之固定管置於中央室之開孔上，並將氣流調整至1公升/分鐘。使流至PARI LC Star噴霧器之空氣(可呼吸性空氣)流恒定在每分鐘6.9公升。單獨的磷黴素、單獨的妥布黴素或9：1、8：2或7：3之磷黴素：妥布黴素組合以0.2毫升/分鐘噴霧，並藉由噴霧供應通道輸送至大鼠。將另外的空氣(下文稱為稀釋氣體)輸送至噴霧器(噴霧器位置？)以平衡用於輸送噴霧式藥物至大鼠之空氣之超壓。使齧齒動物與噴霧式抗生素接觸長達2小時，連續3天每天兩次。每一治療小組每組由5至8只動物組成。每一試驗中皆包括一無治療對照組。
在最後一次接觸後18小時評估殺細菌性。用異氟烷麻醉大鼠，藉由腹膜內施用500微升苯巴比妥實施無痛致死術。以無菌方式移出肺，去除多餘組織，測定肺重量。將肺置於10毫升玻璃小瓶中，每克組織添加3毫升無菌生理鹽水。樣本用手動勻漿機勻漿30秒。藉由用無菌生理鹽水10倍系列稀釋肺勻漿且塗佈100微升等分試樣於血瓊脂平板來測定殺細菌性。培養物平板在35℃培養18至24小時，手動計數細菌菌落數目。藉由比較無治療對照組與治療組之CFU's/肺測定抗生素效能。
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圖1及2所示係9：1之磷黴素：妥布黴素組合之時間-殺菌曲線，且表明與單獨用磷黴素及妥布黴素之抑菌性殺菌相比，該組合可快速殺滅綠膿桿菌ATCC 27853。圖1之符號：△無藥物對照，▲磷黴素(28.8微克/毫升)，●妥布黴素(3.2微克/毫升)，■磷黴素(28.8微克/毫升)+妥布黴素(3.2微克/毫升)，及---係指殺菌線。圖2之符號：△無藥物對照，▲磷黴素(14.4微 克/毫升)，●妥布黴素(1.6微克/毫升)，■磷黴素(14.4微克/毫升)+妥布黴素(1.6微克/毫升)，及---係指殺菌線。
圖3及4所示係8：2之磷黴素：妥布黴素組合之時間-殺菌曲線，且表明該組合可快速殺滅綠膿桿菌ATCC 27853。圖3之符號：△無藥物對照，▲磷黴素(25.6微克/毫升)，●妥布黴素(6.4微克/毫升)，■磷黴素(25.6微克/毫升)+妥布黴素(6.4微克/毫升)，及---係指殺菌線。圖4之符號：無藥物對照，▲磷黴素(12.8微克/毫升)，●妥布黴素(3.2微克/毫升)，■磷黴素(12.8微克/毫升)+妥布黴素(3.2微克/毫升)，及---係指殺菌線。
圖5、6及7所示係7：3之磷黴素：妥布黴素組合之時間-殺菌曲線，且表明該組合可快速殺滅綠膿桿菌ATCC 27853。圖5之符號：△無藥物對照，▲磷黴素(22.4微克/毫升)，●妥布黴素(9.6微克/毫升)，■磷黴素(22.4微克/毫升)+妥布黴素(9.6微克/毫升)，及---係指殺菌線。圖6之符號：△無藥物對照，▲磷黴素(11.2微克/毫升)，●妥布黴素(4.8微克/毫升)，■磷黴素(11.2微克/毫升)+妥布黴素(4.8微克/毫升)，及---係指殺菌線。圖7之符號：△無藥物對照，▲磷黴素(5.6微克/毫升)，●妥布黴素(2.4微克/毫升)，■磷黴素(5.6微克/毫升)+妥布黴素(2.4微克/毫升)，及---係指殺菌線。
圖8及9比較9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素組合及單獨用妥布黴素對綠膿桿菌ATCC 27853之殺菌曲線。圖8中，抗生素以32微克/毫升來評價。符號：△9：1，▲8：2，●7：3，○妥布黴素，及---係指殺菌線。圖9中，抗生素以16微克/毫升來評價。符號：△9：1，▲8：2，●7：3，○妥布黴素，及---係指殺 菌線。
圖10、11及12分別表明9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素組合對綠膿桿菌ATCC27853之濃度依賴殺菌性。圖10之符號：△無藥物對照，□4.0微克/毫升，■8.0微克/毫升，○16微克/毫升，●32微克/毫升，及---係指殺菌線。圖11之符號：△無藥物對照，□4.0微克/毫升，■8.0微克/毫升，○16微克/毫升，●32微克/毫升，及---係指殺菌線。圖12之符號：△無藥物對照，□4.0微克/毫升，■8.0微克/毫升，○16微克/毫升，●32微克/毫升，及---係指殺菌線。
圖13、14及15所示係在大鼠肺部分別噴霧施用31.1毫克/毫升9：1、8：2及7：3之磷黴素：妥布黴素組合之溶液後殺滅大腸桿菌之效果。
圖16及17表明31.1毫克/毫升9：1之磷黴素：妥布黴素組合溶液、28毫克/毫升單獨的磷黴素溶液或3.1毫克/毫升單獨的妥布黴素於噴霧施用至大鼠肺部後殺大腸桿菌效果。大鼠與噴霧式抗生素連續3天每天2次接觸1小時。圖16及17顯示，在大鼠肺部噴霧施用31.1毫克/毫升9：1之磷黴素：妥布黴素組合溶液後可產生>5 log10殺大腸桿菌效果，相比之下單獨用磷黴素及妥布黴素之殺菌效果小於1 log10。
圖18表明31.1毫克/毫升8：2之磷黴素：妥布黴素組合溶液或40毫克/毫升單獨的妥布黴素溶液於噴霧施用至大鼠肺部後殺大腸桿菌效果。大鼠與噴霧式抗生素連續3天每天2次接觸1小時。圖18顯示，在大鼠肺部噴霧施用31.1毫克/毫升8：2之磷黴素：妥 布黴素組合溶液後可產生>5 log10殺大腸桿菌效果，相比之下藉由噴霧施用40毫克/毫升單獨妥布黴素溶液得到2 log10殺菌效果。
圖19及20表明31.1毫克/毫升8：2之磷黴素：妥布黴素組合溶液、24.9毫克/毫升單獨的磷黴素溶液或6.2毫克/毫升單獨的妥布黴素溶液於噴霧施用至大鼠肺部後殺綠膿桿菌效果。大鼠與噴霧式抗生素連續3天每天2次接觸1小時。圖19及20顯示，在大鼠肺部噴霧施用31.1毫克/毫升8：2之磷黴素：妥布黴素組合溶液較單獨用磷黴素及妥布黴素可產生更大之殺綠膿桿菌效果。
圖21表明60毫克/毫升及90毫克/毫升8：2之磷黴素：妥布黴素組合溶液於噴霧施用至大鼠肺部後殺綠膿桿菌效果。大鼠與噴霧式抗生素連續3天每天2次接觸1小時。圖21顯示，在大鼠肺部噴霧施用60及90毫克/毫升8：2之磷黴素：妥布黴素組合溶液可產生顯著之殺綠膿桿菌效果。

Claims (5)

  1. 一種噴霧調配物，其係由約1毫克至約300毫克之磷黴素及約1毫克至約300毫克之妥布黴素所組成，其中磷黴素及妥布黴素存在於生理上可接受溶液中，其中磷黴素與妥布黴素之重量比係約7至約9份磷黴素比約1至約3份妥布黴素，其中該調配物適於以噴霧器施用。
  2. 如請求項1之噴霧調配物，其中該生理上可接受溶液包含約0.5至約7毫升含有濃度>30 mM之氯化物之溶液。
  3. 一種噴霧調配物，其由存在於生理上可接受溶液中之磷黴素及妥布黴素組成，其中磷黴素與妥布黴素之重量比係約8份重量比之磷黴素比約2份重量比之妥布黴素，其中該調配物適於以噴霧器施用。
  4. 如請求項3之噴霧調配物，其中該生理上可接受溶液包含約0.5至約7毫升含有濃度>30 mM之氯化物之溶液。
  5. 一種乾粉調配物，其係由約1毫克至約300毫克之磷黴素及約1毫克至約300毫克之妥布黴素及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑所組成，其中磷黴素與妥布黴素之重量比係約7至約9份磷黴素比約1至約3份妥布黴素，其中該調配物係以乾粉吸入器施用。
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