PT1663233E - Utilização de tigeciclina isolada ou em combinação com rifampina para o tratamento de osteomielite e/ou artrite séptica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE TIGECICLINA ISOLADA OU EM COMBINAÇÃO COM RIFAMPINA PARA O TRATAMENTO DE OSTEOMIELITE E/OU ARTRITE SÉPTICA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um novo método de tratamento da osteomielite e artrite séptica provocada por ou como um resultado de infecções bacterianas. A presente invenção refere-se também ao tratamento de infecções bacterianas do osso, medula óssea, articulação e fluido sinovial. A presente invenção refere-se também ao tratamento de infecções bacterianas resistentes a antibióticos nestas doenças e tecidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A última metade do século 20 assistiu a um progresso significativo no desenvolvimento de agentes antibacterianos. Este sucesso criou a percepção de que as doenças bacterianas eram mais rapidamente curadas que qualquer outro importante distúrbio, mas a emergência de organismos multi-resistentes a fármacos nos anos 90 resultou em implicações sérias para a saúde pública. A resistência estendeu-se a organismos previamente susceptiveis e alguns organismos são essencialmente resistentes a todos os agentes antibacterianos aprovados. 1 A tigeciclina que pertence à classe de antibióticos das glicilciclinas, contorna os mecanismos existentes de resistência microbiana. Demonstra um espectro amplo de actividade antibacteriana, inibindo as bactérias gram-positiva, gram-negativa e anaeróbias multi-resistentes. A tigeciclina é activa contra a maioria dos patogéneos comuns. A tigeciclina é activa contra patogéneos, tais como Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), enterococos resistente à vancomicina (incluindo Enterococcus faecalis), pneumococos resistentes à penicilina/resistentes ao macrólido, Prevotella spp., peptoestreptococos, micobactéria e organismos resistentes a minociclina (Boucher et al., Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44(8): 2225-2229, Gales et al., Antimicrob Agents Chemother. 2000; 46: 19-36, Goldstein et al., Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44(10): 2747-2751). A tigeciclina é útil no tratamento de patogéneos respiratórios, tais como Streptococcus pneumoniae (sensíveis à penicilina e resistentes à penicilina), Haemophilus influenzae, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Staphylococcus aureus (susceptiveis à meticilina e resistentes à meticilina) , bastonetes gram-negativos aeróbios e enterococcus (enterococos susceptiveis à vancomicina e resistentes a vancomicina). Os resultados in vivo foram muito encorajadores e melhores do que seria esperado, com base no tempo acima da concentração mínima inibitória (MIC) no soro. A tigeciclina é considerada como sendo um agente antibacteriano seguro.

Os estafilococos resistentes à meticilina são os organismos mais comuns em infecções no osso e articulações (Waldvogel, Infectious Diseases 1988: 1339-1344). As opções para o tratamento de infecções provocadas por estes microorganismos são limitadas: a sensibilidade das estirpes clínicas às quinolonas, 2 clindamicina, cotrimoxazole e rifampina é variável e a sensibilidade está, muitas vezes, limitada a glicopéptidos, que deverão ser administrados através da via parentérica. A resistência dos estafilococos aos glicopéptidos já foi descrita e representa uma preocupação principal, uma vez que esses fármacos são considerados padrão de ouro para o tratamento de infecções graves provocadas por estafilococos resistentes a meticilina (Smith, et al., N Engl J Med 1999; 340: 493-501).

Foram recentemente introduzidos na prática clinica novos fármacos para o tratamento de infecções provocadas por estafilococos resistentes a meticilina, tais como quinupristina-dalfopristina e linezolide (Johnson, et al., Lancet 1999; 354: 2012-2013, Livermore, J Antimicrob Chemother 2000; 46: 347-350). No entanto, nenhum foi totalmente investigado em ensaios clínicos no tratamento da osteomielite. O tratamento de infecções ortopédicas crónicas e agudas é difícil, devido, em parte, ao facto de muitas das infecções resultarem de patogéneos resistentes aos antibióticos, mas também, em parte, devido à localização da infecção. Muitas vezes a terapia requer uma terapia prolongada com antibiótico e tratamento cirúrgico (Lazzarini et al., Curr Infect Dis Rep 2002: 4: 439-445). Foram efectuados vários estudos utilizando vários modelos animais de osteomielite (Rissing, Infect Dis Clin North Am 1990; 4: 377-390). Apesar de um tratamento prolongado com antibiótico, podem ainda ser observadas bactérias viáveis no osso. A erradicação de mais bactérias do osso tem sido associada com uma duração prolongada do tratamento com antibiótico (Norden, Rev Infect Dis 1988; 10: 103-110). Após quatro semanas de tratamento com antibiótico, a maioria dos regimes de 3 antibiótico foram incapazes de erradicar os estafilococos do osso. 0 tratamento com antibiótico para a osteomielite é tradicionalmente administrado pela via intravenosa. No entanto, têm sido testados os regimes orais para a osteomielite, com sucesso, em ensaios com humanos (Bell, Lancet 1968; 10: 295-297, Feigin et al., Pediatr 1975; 55: 213-223, Slama et ai., Am J Med 1987; 82 (Supl 4A): 259-261). Infelizmente, a escolha dos antimicrobianos orais está limitada quando se lida com organismos multi-resistentes a fármacos e o tratamento destes organismos multi-resistentes a fármacos pode necessitar da utilização de fármacos parentéricos (Tice, Infect Dis Clin North

Am 1998; 12 : 903- -919) .34 Norden et al. referiram também num artigo recente, o tratamento da osteomielite crónica por estafilococos com rifampina como um componente da terapia com antibiótico ("Chronic staphylococcal osteomyelitis: treatment with regiments containing rifampin", Reviews of infectious diseases, 1983, Vol. 5, Supl. 3, páginas S495-S501). O documento WO 03/00597 A (Paratek Pharmaceuticals, Inc., 2003) descreve vários compostos tetraciclina para o tratamento de uma longa lista de doenças, por exemplo, estados associados com o processo inflamatório, distúrbios neurológicos e neuroprotecção, bem como cancro e distúrbios relacionados.

Mercier et al. analisaram no seu artigo de investigação "Antimicrobial activity of tigecycline (GAR-936) against Enterococus faecium and Staphylococcus aureus used alone and in combination" (Pharmacotherapy, Vol. 22(12), 2002, páginas 1517-1523), a actividade da tigeciclina e rifampina como agentes 4 antibacterianos e concluíram que a rifampina não potência a actividade antimicrobiana da tigeciclina contra a estirpe de S. aureus testada. 0 pedido de patente internacional WO 02/102384 A, 27 (Dezembro de 2002) revela a função principal das bactérias para a invocação da osteoartrite e sugere a utilização de antibióticos, em particular utilização de doxiciclina, como um tratamento adequado.

Patel et al. descrevem o GAR-936 como um agente activo promissor, contra estirpes de S. aureus resistentes a meticilina ("In vitro activity of GAR-936 against vancomycin-resistant Enterococci, methicillin-resistant Staphylococcus aureus and penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae", Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, Vol. 38(3), 2000, páginas 177-179) .

Zimmerli et al. revelaram o tratamento da osteomielite provocada por infecções por S. aureus, subsequentes ao implante de dispositivos ortopédicos, com um tratamento com flucoxacilina/rifampina ou vancomicina/rifampina, seguido por terapia de longo termo com ciprofloxacina/rifampina ("Role of rifampin for treatment of orthopaedic implant-related staphylococcal infections: a randomized controlled trial. Foreign-Body-Infection (FBI) Study Group" (JAMA, Vol. 279(19), 1998, páginas 1537-1541).

Lew et al. verificaram que o S. aureus era o microorganismo mais frequente em qualquer tipo de osteomielite (tabela 1) no seu artigo "Osteomyelitis" (The New England Journal of Medicine, 3 de Abril de 1997, Vol. 336(14), páginas 999-1007) e 5 recomendaram a utilização de antibióticos do grupo dos glicopéptidos (vancomicina ou teicoplanina) para o tratamento de estirpes de S. aureus resistentes à meticilina (tabela 2). Alternativamente, podem ser utilizadas as quinolonas orais em combinação com a rifampina (página 1005, segundo parágrafo). É também proporcionada por "The Merck Index, 7a Ed.", 1999, Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, NJ, EUA, uma lista de bactérias que, mais frequentemente, provocam artrite infecciosa e osteomielite.

Permanece assim uma necessidade de um método de tratamento da osteomielite e/ou artrite séptica provocada por infecções bacterianas, especialmente aquelas provocadas por estirpes bacterianas resistentes a antibióticos. A presente invenção, preenche esta necessidade de longa data.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de tratamento de infecções do osso e medula óssea (muitas vezes referidas como osteomielite) e/ou infecções nas articulações e infecção dos tecidos circundantes (muitas vezes referidas como artrite séptica) num mamífero, de um modo preferido, um humano. O método compreende administrar a um mamífero, uma quantidade farmacologicamente activa de tigeciclina e, opcionalmente, um segundo agente antimicrobiano seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina, para tratar a infecção. De um modo preferido, o segundo antimicrobiano é a rifampina. 6 A infecção pode ser provocada por um patogéneo seleccionado do grupo consistindo de bactérias gram negativas, gram positivas e bactérias anaeróbias e aeróbias. Exemplos de bactérias incluem Staphylococcus, Acinetobacter Mycobacterium, Haemophilus, Salmonella, Streptococcus, Enterobacteriaceae, Enterococcus, Escherichia, Pseudomonas, Neisseria, Rickettsia, Pneumococci, Prevotella, Peptostreptococci, Bacteroides Legionella, estreptococos beta-hemolíticos, estreptococos do grupo B e Spirochetes. De um modo preferido, a infecção é compreendida por Neisseria, Mycobacterium, Staphylococcus e Haemophilus e, de um modo mais preferido, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosís, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae ou Mycobacterium leprae.

Em formas de realização preferidas, a infecção é compreendida por um patogéneo exibindo resistência a antibióticos. Exemplos de resistência a antibióticos incluem resistência à meticilina, resistência ao glicopéptido, resistência à tetraciclina, resistência à oxitetraciclina, resistência à doxiciclina; resistência à clortetraciclina, resistência à minociclina, resistência à glicilciclina, resistência à cefalosporina, resistência à ciprofloxacina, resistência à nitrofurantoina, resistência à trimetoprim-sulfa, resistência à piperacilina/tazobactam, resistência à moxifloxacina, resistência à vancomicina, resistência à teicoplanina, resistência à penicilina e resistência aos macrólidos.

Uma resistência a glicopéptido preferida é a resistência à vancomicina. Noutra forma de realização preferida, a infecção é compreendida por S. aureus, exibindo uma resistência 7 seleccionada do grupo consistindo de resistência ao glicopéptido, resistência à tetraciclina, resistência à minociclina, resistência à meticilina, resistência à vancomicina e resistência a outros antibióticos de glicilciclina que não a tigeciclina.

Noutra forma de realização, a infecção é compreendida por Acinetobacter baumannii que pode ou não exibir resistência a antibióticos, seleccionada do grupo consistindo de resistência à cefalosporina, resistência à ciprofloxacina, resistência à nitrofurantoina, resistência à trimetoprima-sulfa e resistência à piperacilina/tazobactam.

Noutra forma de realização, a infecção é compreendida por Mycobacterium abscessus que pode ou não exibir resistência à moxifloxacina. Noutras formas de realização, a infecção é compreendida por Haemophilus influenzae, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi ou Rickettsia rickettsii. A presente invenção refere-se à utilização de uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina para o tratamento de osteomielite e/ou artrite séptica num mamífero. Noutra forma de realização, a presente invenção refere-se à utilização de uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina e, opcionalmente, um segundo agente antimicrobiano seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina, para o tratamento de osteomielite e/ou artrite séptica. Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma utilização de uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina para a preparação de um medicamento para o tratamento de osteomielite 8 e/ou artrite séptica num mamífero. Noutra forma de realização é proporcionada uma utilização de uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina e, opcionalmente, um segundo agente antimicrobiano seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina, para a preparação de um medicamento para o tratamento de osteomielite e/ou artrite séptica num mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra as farmacocinéticas da tigeciclina em coelhos brancos da Nova Zelândia que estabelece os níveis serológicos acima da concentração mínima de inibição durante doze horas após tratamento com 14 mg/kg de tigeciclina. A Figura 2 mostra a classificação dos investigadores para a extensão da infecção do osso, como observado em imagens de raio-X. Os dados demonstram que o tratamento eficaz da osteomielite com tigeciclina e tigeciclina em combinação com rifampina relativamente aos controlos. A Figura 3 mostra as unidades formadoras de colónia por grama de medula e osso em cada um dos tratamentos, o que demonstra que a tigeciclina e tigeciclina, em combinação com a rifampina foram um tratamento eficaz para a infecção do osso e infecção da medula óssea relativamente aos controlos. A Figura 4A proporciona uma representação gráfica dos pesos dos coelhos ao longo do tempo de administração dos vários antibacterianos. 9 A Figure 4B proporciona uma representação gráfica das variações dos pesos dos coelhos ao longo do tempo de administração dos vários antibacterianos.

As Figuras 5A e 5B mostram os picos e depressões da tigeciclina (14 mg/kg, duas vezes por dia) e vancomicina (30 mg/kg, duas vezes por dia) no soro de coelhos infectados após administração dos fármacos respectivos. Os dados demonstraram gue os niveis serológicos de antibiótico foram acima das concentrações minimas inibitórias ao longo do tratamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de infecções do osso e medula óssea num mamífero. De um modo preferido, o mamífero é humano. Numa forma de realização preferida, a infecção do osso ou medula óssea provoca osteomielite. A osteomielite é uma infecção aguda ou crónica do osso e/ou medula óssea e inclui o processo inflamatório relacionado do osso e sua estrutura devida a infecção com organismos pirogénicos. A infecção associada com a osteomielite pode ficar localizada ou pode propagar-se para o periósteo, córtex, medula óssea e tecido esponjoso. Os patogéneos bacterianos comuns que provocam a osteomielite variam com base na idade do doente e o mecanismo de infecção. A osteomielite aguda inclui duas categorias primárias: osteomielite hematogénea e osteomielite por inoculação directa ou contínua. A osteomielite hematogénea é uma infecção provocada por propagação de bactérias a partir do sangue. A osteomielite 10 hematogénea aguda é caracterizada por uma infecção aguda do osso provocada pela propagação das bactérias no interior do osso a partir de uma fonte remota. A osteomielite hematogénea ocorre principalmente, em crianças. 0 local mais comum é a metáfise de rápido crescimento e altamente vascular dos ossos em crescimento. 0 abrandamento ou lentidão evidentes do fluxo de sangue à medida que os vasos formam ângulos apertados na metáfise distai, predispõe os vasos a tromboses e o próprio osso a necrose localizada e propagação de bactérias. Estas alterações na estrutura do osso podem ser observadas em imagens de raio-X. A osteomielite haematogénea aguda, apesar do seu nome, pode apresentar um desenvolvimento clinico lento e inicio insidioso. A osteomielite por inoculação directa ou contínua é provocada por contacto directo do tecido e bactéria durante o trauma ou cirurgia. A osteomielite por inoculação directa (foco contínuo) é uma infecção no osso secundário à inoculação dos organismos a partir do traumatismo directo, propagação a partir de um foco contínuo de infecção ou sepsia após um processo cirúrgico. As manifestações clínicas da osteomielite por inoculação directa são mais localizadas que as da osteomielite haematogénea e tendem a envolver múltiplos organismos/patogéneos.

As categorias adicionais incluem a osteomielite crónica e osteomielite secundária à doença vascular periférica. A osteomielite crónica persiste ou repete-se, independentemente da sua causa inicial e/ou mecanismo e apesar de intervenção agressiva. Embora indicada como uma etiologia, a doença vascular periférica é, actualmente, um factor de predisposição e não de uma verdadeira causa de infecção. 11

Os sintomas de osteomielite incluem muitas vezes febre elevada, fadiga, irritabilidade e indisposição. Muitas vezes, o movimento pode ser limitado num membro ou articulação afectado. 0 edema local, eritema e fragilidade, acompanham geralmente a infecção e calor em redor da área afectada. Pode também, estar presente no tracto sinusal em fases posteriores de infecção. A osteomielite hematogénea apresenta-se normalmente com uma progressão insidiosa lenta de sintomas, enquanto a osteomielite crónica pode incluir uma úlcera não lesionada, drenagem no tracto sinusal, fadiga crónica e indisposição. A osteomielite directa apresenta-se geralmente com sinais proeminentes e sintomas numa área mais localizada.

Determinadas patologias da doença são conhecidas por predispor os doentes a osteomielite. Estas incluem diabetes mellitus, doença das células falciformes, sindrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), abuso de fármacos IV, alcoolismo, utilização crónica de esteróides, imunossupressão e doença crónica das articulações. Além disso, a presença de um dispositivo ortopédico prostético é um factor de risco independente, tais como qualquer cirurgia ortopédica ou fractura exposta recente. Vários patogéneos bacterianos são normalmente conhecidos por provocarem osteomielite aguda e directa. Por exemplo, a osteomielite haematogénea aguda em recém-nascidos (com menos de 4 meses) é normalmente provocada por S. aureus, espécies de Enterobacter e espécies de Streptococcus do grupo A e B. Em crianças com 4 meses a 4 anos, a osteomielite haematogénea aguda é normalmente provocada por S. aureus, espécies de Streptococcus do grupo A, Haemophilus influenzae e espécies de Enterobacter. Em crianças e adolescentes com 4 anos a adultos, a osteomielite 12 haematogénea aguda é normalmente provocada por S. aureus (80%), espécies de Streptococcus do grupo A, Haemophilus influenzae e espécies de Enterobacter. Em adultos, a osteomielite haematogénea aguda é normalmente provocada por S. aureus e, ocasionalmente, por espécies de Enterobacter ou Streptococcus. O tratamento primário, como no passado, inclui uma combinação de penicilina sintética resistente a penicilinase e uma cefalosporina de terceira geração. A terapia alternativa inclui a vancomicina ou clindamicina e uma cefalosporina de terceira geração. Além destes antibacterianos mencionados anteriormente, a ciprofloxacina e rifampina têm sido utilizados numa terapia de combinação para doentes adultos. Em casos onde existe a evidência de infecção com bacilos gram-negativos, é muitas vezes administrada uma cefalosporina de terceira geração. A osteomielite directa é normalmente provocada por S. aureus, espécies de Enterobacter e espécies de Pseudomonas. Muitas vezes, a osteomielite directa é provocada por uma lesão por punção através de um sapato atlético. Nestes casos, a osteomielite directa é normalmente provocada por S. aureus e espécies de Pseudomonas. Os antibióticos primários neste cenário incluem ceftazidima ou cefepima. A ciprofloxacina é muitas vezes utilizada como um tratamento alternativo. Em doentes com doença das células falciformes, a osteomielite directa é normalmente provocada por S. aureus e espécies de Salmonella e a escolha primária para o tratamento é um antibiótico de fluoroquinolona (não em crianças). Uma cefalosporina de terceira geração (e. g., ceftriaxona) é uma escolha alternativa.

Para doentes com osteomielite devida a traumatismo, os agentes infecciosos incluem, normalmente, S. aureus, coliform bacilli e Pseudomonas aeruginosa. Os antibióticos primários são 13 nafcilina e ciprofloxacina. As alternativas incluem vancomicina e uma cefalosporina de terceira geração com actividade antipseudomonal.

Consequentemente, com aqui utilizado e nas reivindicações, o termo "osteomielite" inclui osteomielite haematogénea, osteomielite por inoculação directa ou continua, osteomielite crónica e osteomielite secundária a doença vascular periférica. A osteomielite pode ser o resultado de infecções provocadas por qualquer dos patogéneos descritos anteriormente, mas também inclui outros patogéneos com a capacidade de infectar o osso, medula óssea, articulação ou tecidos circundantes. 0 termo "tratar a osteomielite", inclui a erradicação dos patogéneos/bactérias que provocam a infecção subjacente associada com a osteomielite, inibição do crescimento bacteriano, redução na concentração bacteriana, redução no tempo de recuperação da infecção, melhoria, eliminação ou redução dos sintomas de infecção, tais como inchaço, necrose, febre, dor, fraqueza e ou outros indicadores como os seleccionados como medidas apropriadas pelos especialistas na técnica.

Outra forma de realização da presente invenção refere-se a métodos de tratamento de infecções das articulações e/ou infecções do tecido circundante num mamifero. De um modo preferido, o mamifero é humano. Numa forma de realização preferida, a infecção da articulação e/ou infecção do tecido circundante provoca artrite séptica.

A artrite séptica é uma infecção da articulação e tecidos circundantes e resulta na inflamação da articulação provocada pela presença de microorganismos intra-articulares vivos. A 14 artrite séptica acontece normalmente depois da osteomielite, especialmente na infância e surge como um resultado de infecção bacteriana. A infecção da articulação pode ocorrer por várias vias. De um modo mais comum, a propagação do patogéneo infeccioso é a haematogénea. Frequentemente, a artrite séptica surge de infecções ou abcessos na pele. A sepsia na boca e dentes ou após intervenções dentárias ou em associação com infecção do tracto respiratório ou urogenital podem também conduzir a artrite séptica. O traumatismo provocado por penetração directa de objectos afiados na articulação ou resultante de lesão traumática principal pode também conduzir a infecção da articulação. A aspiração ou injecção da articulação e processos cirúrgicos, tal como substituição da articulação podem, também, resultar em infecção da articulação. Adicionalmente, a osteomielite por vezes propaga-se para envolver a articulação, isto é especialmente comum em crianças jovens. Finalmente, a infecção dos tecidos moles adjacentes à articulação, tais como bolsa sinovial ou bainha do tendão inflamada, pode propagar-se de modo a envolver o espaço da articulação. A propagação da infecção pela via haematogénea é ainda a causa mais frequente de sepsia da articulação.

Os sintomas de artrite séptica incluem indisposição e febre, articulação ou articulações quentes agudas em conjunto com inflamação aguda: inchaço e efusão da articulação, vermelhidão, dor e perda de função. 0 organismo mais comum que provoca a artrite séptica é o Staphylococcus aureus. Na artrite séptica neonatal, a Escherichia coli e Haemophilus influenzae são também patogéneos 15 comuns. Em crianças até aos 5 anos de idade, o Haemophilus influenzae é a causa mais comum de sepsia da articulação haematogénea. As bactérias intestinais gram-negativas são também patogéneos comuns em idosos e aqueles com diabetes mellitus ou articulações prostéticas. Em casos de lesão por penetração e em pessoas que abusam de fármacos intravenosos, são muitas vezes verificadas infecções por Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus epidermidis. Em adultos jovens saudáveis a infecção por Neisseria gonorrhoeae ou meningocócica é, por vezes, a causa de artrite séptica. A artrite séptica crónica de baixo grau, especialmente na espinal-medula, pode ser o resultado de infecção com microorganismos, tais como Micobactéria ou Brucella abortus. Além disso, dentro do grupo das pessoas que sofrem de síndrome de imunodeficiência adquirida, a gama de patogéneos da articulação é variada.

Alguns dos patogéneos da artrite séptica mais comuns incluem, mas não estão limitados a, (1) Gram positivos: Staphylococcus aureus (80% dos casos), Streptococcus pyogenes/pneumoniae; (2) Gram negativos: Haemophilus Influenzae, Neisseria gonorrhoeae/meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, espécies de Brucella, espécies de Salmonella, bactérias fusiformes; (3) bacilos ácido-resistentes: Mycobacterium tuberculosis, micobactéria atípica; e (4) Espiroquetas: Leptospira icterohaemorrhagica.

Consequentemente, o termo "artrite séptica", como aqui utilizado e nas reivindicações, inclui infecções da articulação e tecidos circundantes provocadas pelos patogéneos apresentados acima, bem como quaisquer outros patogéneos com a capacidade para infectar a articulação e tecidos circundantes. Os tecidos circundantes incluem, mas não estão limitados a, músculo 16 circundante, tendões relacionados, ossos de ligação, bolsa sinovial, bainha do tendão, sinóvio, fluído sinovial e cartilagem relacionada. 0 termo "tratar a artrite séptica" inclui a erradicação dos patogéneos/bactérias que provocam a infecção subjacente associada com a artrite séptica, inibição do crescimento bacteriano, redução na concentração bacteriana, redução do tempo de recuperação da infecção, melhoria, eliminação ou redução dos sintomas de infecção, tais como inchaço, necrose, febre, dor, fraqueza e ou outros indicadores como os seleccionados como medidas apropriadas pelos especialistas na técnica. A tigeciclina (anteriormente e ainda muitas vezes referida como "GAR-936") é um derivado sintético de 9-t-butilglicilamida de uma nova classe de antibióticos denominada glicilciclinas. Esta nova classe de derivados de tetraciclina tem demonstrado excelente actividade in vitro contra um grande número de organismos gram positivos e gram negativos, aeróbios e anaeróbios, incluindo Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), enterococos resistentes a vancomicina (incluindo Enterococcus faecalis), pneumococos resistentes a penicilina/resistentes a macrólidos, Prevotella spp., peptoestreptococos e Mycobacterium spp. (Boucher et al., Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44(8): 2225-2229, Gales et al., Antimicrob Agents Chemother. 2000; 46: 19-36, Goldstein et al., Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44(10): 2747-2751). As tetraciclinas são agentes bacterioestáticos que actuam por inibição da síntese de proteínas bacterianas. As glicilciclinas têm sido desenvolvidas de modo a ultrapassar os mecanismos bacterianos de resistência às tetraciclinas, embora o seu mecanismo de acção exacto ainda não tenha sido determinado 17 (Rasmussen et al., Antimicrob Agents Chemother 1995; 38: 1658-1660) . A tigeciclina concentra-se no osso, medula óssea, articulação e fluido sinovial, bem como em muitos outros órgãos e tecidos de interesse. Além disso, verificou-se que a tigeciclina se concentra em porções infectadas dos tecidos descritos acima. Os estudos de farmacocinética da tigeciclina intravenosa em humanos, demonstraram que existe uma fase de distribuição rápida, com um tempo de meia vida prolongado (40 a 60 horas) e um elevado volume de distribuição no estado de equilíbrio (7 a 14 L/kg). Estudos em animais com tigeciclina marcada radioactivamente sugerem que esta fase de distribuição rápida no estado de equilíbrio representa a penetração da tigeciclina nos tecidos, incluindo pulmão e osso.

Por exemplo, a distribuição da tigeciclina nos tecidos de ratos, tem sido apresentada em ratos Sprague-Dawley, quando administrada tigeciclina[14C] a uma dose de 3 mg/kg em 30 minutos de infusão IV. No geral, a radioactividade estava bem distribuída pela maioria dos tecidos, com a exposição global mais elevada observada no osso. A exposição nos tecidos que apresentaram as concentrações mais elevadas foi como se segue: osso>medula óssea>glândula salivar, tiróide, baço e rim. Em cada destes tecidos, a razão da área sob a curva de concentração-tempo (AUC) no tecido para AUC no plasma foi superior a 10. Neste estudo, a razão de AUC no pulmão do rato para AUC no plasma foi de 4,4. Adicionalmente, foi demonstrado que a tigeciclina administrada intravenosamente, penetra no tecido ósseo em humanos e a administração intravenosa prolonga a concentração de tigeciclina no fluido sinovial em humanos ao longo do tempo. 18

As requerentes verificaram que a tigeciclina é um tratamento útil para a osteomielite e artrite séptica. 0 espectro antimicrobiano é amplo, incluindo todos os patogéneos encontrados nas infecções do osso e articulação nosocomiais. As propriedades farmacocinéticas são favoráveis, uma vez que o fármaco pode ser administrado duas vezes por dia. Além disso, a penetração do osso e niveis de fármaco acima da concentração minima inibitória (MIC), verificaram-se em quase todas as amostras recolhidas. A concentração minima inibitória é um método de determinação da eficácia de um composto na inibição do crescimento bacteriano. É a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que inibe o crescimento de um microorganismo e deverá corresponder às concentrações necessárias no soro do mamífero para o tratamento mínimo. Além disso, a tigeciclina proporciona um bom perfil de segurança em humanos, demonstrando que o antimicrobiano deverá ser adequado para estudos clínicos em infecções ortopédicas.

Consequentemente, um aspecto da invenção proporciona um método para o tratamento de infecções do osso, medula óssea, articulação e tecido circundante e um método para o tratamento de osteomielite e/ou artrite séptica num mamífero por administração, a um mamífero, de uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina. As infecções do osso, medula óssea, articulação e tecido circundante e osteomielite e/ou artrite séptica e, talvez, provocadas, normalmente, por qualquer dos patogéneos encontrados, tal como os patogéneos discutidos acima que incluem bactérias gram negativas, gram positivas, bactérias anaeróbicas e bactérias aeróbias. Por exemplo, a infecção pode ser compreendida por, mas não limitada a, Staphylococcus, Acinetobacter, Mycobacterium, Haemophilus, Salmonella, Streptococcus, Enterobacteriaceae, Enterococcus, 19

Escherichia, Pseudomonas, Neisseria, Rickettsia, Pneumococci, Prevotella, Peptostreptococci, Bacteroides Legionella, estreptococos beta-hemolíticos e estreptococos do grupo B. Em formas de realização preferidas, a infecção é compreendida por Neisseria, Mycobacterium, Staphylococcus e Haemophilus. Em formas de realização mais preferidas, a infecção é constituída por Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Enterococcus faecium, Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia rickettsii, Mycobacterium leprae, Mcyobacterium abscessus ou Mycoplasma pneumoniae.

Numa forma de realização da presente invenção, é proporcionado um método de tratamento de infecções do osso, medula óssea, articulação e tecido circundante e um método para o tratamento de osteomielite e/ou artrite séptica provocada por estirpes bacterianas (tal como as descritas acima) que demonstram resistência a antibiótico por administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de tigeciclina. Por exemplo, a resistência exibida pode ser, mas não está limitada a resistência à meticilina, resistência ao glicopéptido, resistência à tetraciclina, resistência à oxitetraciclina, resistência à doxiciclina; resistência à clortetraciclina, resistência à minociclina, resistência à glicilciclina, resistência à cefalosporina, resistência à ciprofloxacina, resistência à nitrofurantoina, resistência à trimetoprim-sulfa, resistência à piperacilina/tazobactam, resistência à moxifloxacina, resistência à vancomicina, resistência à teicoplanina, resistência à penicilina e resistência a macrólidos. 20

Numa forma de realização preferida, a resistência ao glicopéptido é a resistência à vancomicina. Noutra forma de realização preferida, a infecção é constituída por S. aureus exibindo qualquer resistência de, resistência a glicopéptido, resistência à tetraciclina, resistência à minociclina, resistência à meticilina, resistência à vancomicina ou resistência a um antibiótico de glicilciclina que não a tigeciclina.

Noutra forma de realização preferida, a infecção compreende Acinetobacter baumannii que pode ou não exibir resistência a antibiótico, tais como resistência a cefaloesporina, resistência a ciprofloxacina, resistência a nitrofurantoina, resistência a trimetoprima-sulfa e resistência a piperacilina/tazobactam. Noutra forma de realização, a infecção é compreendida por Mycobacterium abscessus que pode ou não exibir resistência a moxifloxacina.

No tratamento de humanos e outros mamíferos, a tigeciclina é, de um modo mais comum, administrada intravenosamente, embora estejam disponíveis outras vias de administração para os especialistas na técnica. Em indivíduos humanos, podem ser toleradas doses até 100 mg administradas durante uma infusão de uma hora. As administrações de 75 mg ou mais, duas vezes por dia, durante nove dias, em infusões de 200 mL, durante mais de uma hora a indivíduos que foram alimentados 30 minutos antes da infusão, resultaram em intolerância gastrointestinal em todos os indivíduos, incluindo náusea e vómitos. Foi tolerada a administração de 25-50 mg em infusões de 200 mL, duas vezes por dia, durante uma hora. Uma infusão simples de 100 mg foi também tolerada, resultando em concentrações serológicas máximas médias de 0,9 a 1,1 microgramas/mL. 21 A administração de 14 mg/kg, duas vezes por dia, a Coelhos Brancos da Nova Zelândia resultou em níveis estáveis superiores à concentração mínimas inibitórias. Ver Figura 1. As concentrações mínimas inibitórias (MIC) e concentrações bactericidas mínimas (MBC) para a tigeciclina, para a estirpe de MRSA utilizada neste estudo, foram inferiores a 0,2 pg/mL e 0,2 pg/mL, respectivamente. A determinação da MBC proporciona um método de determinação da eficácia de um composto na morte de bactérias. A técnica de MBC estabelece o nível mais baixo de um agente bactericida que irá matar, pelo menos, 99,9% dos organismos num inoculo padrão. Foi determinada a MIC e a MBC por Mercier et al. para a tigeciclina contra E. faecium resistentes à vancomicina, como sendo 0,125 pg/mL e entre 16 a 32 pg/mL, respectivamente. Para S. aureus, as concentrações mínimas inibitórias e concentrações bactericidas mínimas foram de entre 0,25 e 1 pg/mL e 16 e 64 pg/mL, respectivamente. Num estudo de utilização compassiva, os requerentes verificaram que a concentração mínima inibitória da tigeciclina contra M. abcessus num doente humano é de 0,25 pg/mL.

Em mamíferos, o S. aureus resistente à meticilina pode ser tratado com tigeciclina na gama de 5 mg/kg a 60 mg/kg, duas vezes ao dia, de um modo mais preferido, 10 mg/kg a 40 mg/kg, de um modo mais preferido, 12 mg/kg a 20 mg/kg. As dosagens apropriadas para o tratamento de outros patogéneos serão evidentes para o especialista na técnica.

Num estudo de utilização compassiva, um doente humano que sofreu de espinha bífida com paralisia resultante. O doente foi gravemente alérgico a fármacos sulfa e apresentou bacterimia resistente a meticilina por decúbito do calcanhar infectado. O doente apresentou também colapso da pele sob o ísquio direito. A 22 úlcera foi desbridada, mas não cicatrizou. Um MRI revelou osteomielite e uma secção do osso foi positiva para infecção por Acinetobacter baumanníi. 0 A. baumanii foi resistente à cefaloesporina, ciprofloxacina, nitrofurantoina e demonstrou resistência intermediária à trimetoprima-sulfa e piperacilina/tazobactam. 0 organismo foi susceptivel a imipenema, gentamicina e tobramicina. 0 doente foi tratado com meropenema e tobramicina. 0 meropenema foi depois substituído com aztreonam devido aos eosinofilia. 0 aztreonam foi depois descontinuado devido à persistência dos eosinofilia. A tobramicina foi também descontinuada devido à creatinina aumentada. 0 doente foi depois tratado com tigeciclina durante dois meses com 50 mg a cada 12 horas ou 50 mg a cada 24 horas. No período de um mês a receber tratamento com tigeciclina, um MRI mostrou resolução da osteomielite e foi observada uma melhoria acentuada no fluido recolhido da área ísquial direita. O doente mostrou estar bem de saúde dez semanas após tratamento com tigeciclina.

Noutro estudo de utilização compassiva, um doente com displasia ectodérmica anidrótica com imunodeficiência, apresentou um historial de três anos e meio de osteomielite vertebral com uma infecção por Mycobacterium abscessus. O desbridamento foi bem efectuado após um ano de infecção com colocação de hardware. O doente apresentou algumas melhorias com o cefoxitano, claritromicina e amicacina. A amicacina foi depois interrompida devido a lesões renais. O linezolide e azitromicina foram depois adicionados ao regime de tratamento. O organismo demonstrou ser resistente à moxifloxacina. 23 0 doente apresentou depois uma nova osteomielite vertebral mesmo acima do local da infecção anterior. Foi efectuada uma biopsia e foi determinado que não era necessário desbridamento adicional. Verificou-se que o organismo era apenas sensível à cefoxitina. Determinou-se que um agente antimicrobiano adicional seria útil e verificou-se que o organismo era susceptível à tigeciclina. A tigeciclina foi administrada até MIC de 0,25 microgramas/mL. A contagem dos glóbulos brancos do doente estava normal embora estivesse presente hipogamaglobulinemia e função linfocítica diminuída. O doente esteve também sob tratamento com IL-12, mas a IL-12 foi mantida durante o tratamento com antibiótico. O doente mostrou estar bem de saúde um ano após o tratamento.

Outra forma de realização da presente invenção proporciona um método de tratar infecções do osso, medula óssea, articulação e tecido circundante e um método para tratar osteomielite e/ou artrite séptica num mamífero, de um modo preferido, um humano, compreendendo administrar ao mamífero, uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina e um agente antimicrobiano da família da ansamicina que inclui os grupos de antibióticos da rifamicina e da estreptovaricina. A família da rifamicina inclui a rifampina, rifapentina, rifaximina e, de um modo preferido, rifampina. Estes antibióticos macrocíclicos apresentam actividade bactericida devido à sua propensão para se ligarem à ARN polimerase. Estes antibióticos são úteis em combinação com a tigeciclina porque afectam diferentes passos na síntese de proteínas bacterianas. Enquanto a rifamicina afecta a actividade da ARN polimerase e limita a produção de ARN mensageiro, a tigeciclina afecta a actividade dos ribossomas e a produção de proteínas a partir do ARN mensageiro. O modo de acção da tigeciclina parece estar relacionado com a inactivação 24 dos ribossomas 70S através da ligação a um local de ligação da tetraciclina na subunidade ribossomal 30S com uma orientação ligeiramente diferente à da tetraciclina. (Bauers et al., J. Antimicrob Chemother. 2004; 53(4): 592-599).

As presentes requerentes verificaram que a tigeciclina, em combinação com um antibiótico da classe de antimicrobianos da rifamicina, proporciona um efeito antimicrobiano adicional no tecido infectado. Numa investigação com coelhos inoculados na tibia com S. aureus resistente à meticilina, o tratamento da osteomielite com tigeciclina em combinação com a rifampina, não demonstrou infecção no osso em 10 coelhos, enquanto os controlos apresentaram infecção em 11 dos 15 coelhos. O tratamento da medula óssea também não demonstrou infecção em 10 coelhos, enquanto os controlos apresentaram 5 infectados em 15 coelhos testados. Além disso, o tratamento da osteomielite em coelhos com tigeciclina isolada, demonstrou infecção no osso de 1 coelho em 10 e nenhuma infecção na medula óssea.

Em mamíferos, o tratamento com rifampina pode estar na gama de 10 mg/kg a 100 mg/kg duas vezes por dia, de um modo mais preferido, pode estar na gama de 20 mg/kg a 70 mg/kg duas vezes por dia, de um modo mais preferido, pode estar na gama de 30 mg/kg a 50 mg/kg duas vezes por dia. Em coelhos brancos da Nova Zelândia infectados com MRSA, o tratamento com 40 mg/kg resultou em actividade bactericida. Os níveis de concentração mínima inibitória e a concentração bactericida mínima para a rifampina contra a estirpe de MRSA foram de 0,78 pg/mL e 1,56 pg/mL, respectivamente, proporcionando uma razão de 0,5. A administração oral de rifampina a humanos está disponível em cápsulas de 150 e 300 mg. Após uma dose individual de 600 mg 25 em humanos adultos saudáveis, as concentrações serológicas máximas médias foram de 7 microgramas/mL, mas com uma variação ampla de 4 a 32 microgramas/mL. A administração de 600 mg intravenosamente a humanos adultos saudáveis durante 30 minutos resultou em concentrações serológicas máximas médias de cerca de 17 microgramas/mL. A administração da tigeciclina é, de um modo preferido, administrada intravenosamente ou intramuscularmente, enquanto a rifampina pode ser administrada intravenosamente,

intramuscularmente, oralmente ou por outros meios de administração conhecidos na técnica, tais como sistemas de distribuição transbocal, intrapulmonar ou transdérmico. A co-administração pode incluir uma combinação de qualquer destes métodos. Por exemplo, a tigeciclina pode ser administrada intravenosamente, enquanto a rifampina pode ser administrada oralmente. A co-administração inclui a administração simultânea ou sequencial, em qualquer ordem e não implica necessariamente a administração ao mesmo tempo ou no mesmo dia ou o mesmo calendário de tempo. De um modo preferido, as concentrações da tigeciclina e rifampina são mantidas, simultaneamente, bem acima da concentração mínima de inibição.

Num ensaio realizado pelas requerentes, um grupo de coelhos infectados com S. aureus resistente à meticilina e tratado com tigeciclina mostrou menos unidades formadoras de colónias no osso e medula óssea relativamente ao grupo de controlo infectado não tratado ou ao grupo tratado com vancomicina no final do período de tratamento. As MIC e MBC para a tigeciclina (0,2 pg/mL) foram inferiores às da vancomicina (0,39 pg/mL e 0,78 pg/mL), que são mais propícias à resolução de infecções osteomielíticas. A associação da tigeciclina e rifampina 26 permitiu a erradicação completa das bactérias do osso e da medula óssea, enquanto no grupo da vancomicina mais rifampina, uma amostra continuou a dar positiva. Ver Figura 3. 0 tratamento foi bem sucedido com administração subcutânea de 14 mg/kg de tigeciclina duas vezes por dia e administração oral de 40 mg/kg de rifampina duas vezes por dia. Estes dados demonstram que a osteomielite em coelhos com infecção por S. aureus resistente à meticilina, são tratados com eficácia com uma combinação de tigeciclina e rifampina.

Consequentemente, considerando a descrição aqui apresentada, tal como a dose e regimes de tratamento (i. e., extensão e modo de administração e periodo de tempo da terapia) utilizados nos estudos de utilização compassiva descritos acima, a dose e regimes de tratamento tipicos dos antibióticos comuns administrados aos doentes para tratar infecções com os patogéneos apresentados e a dose e regimes de tratamento utilizados no estudo com coelhos, um especialista na técnica irá apreciar que a dose e regime de tratamento apropriados para administrar a um mamifero, atinjam uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina e/ou antimicrobianos adicionais, tais como rifampina, para tratar a osteomielite e/ou artrite séptica. Um especialista na técnica, irá apreciar que factores, tal como a extensão da infecção, estado de saúde global, peso e idade do doente irão afectar a dose e regime de tratamento desejados. O termo "quantidade farmacologicamente eficaz" significa, consistente com considerações conhecidas na técnica, a quantidade de agente antimicrobiano eficaz para alcançar um efeito farmacológico ou melhoria terapêutica sem provocar efeitos secundários adversos, incluindo, mas não limitados a 27 inibição do crescimento bacteriano, redução na concentração bacteriana, redução no tempo de recuperação da infecção, melhoria, eliminação ou redução dos sintomas de infecção ou outra doença, tais como inchaço, necrose, febre, dor, fraqueza e ou outros indicadores como os seleccionados como medidas apropriadas pelos especialistas na técnica.

Outra forma de realização da presente invenção proporciona a utilização de tigeciclina com ou sem um agente antimicrobiano seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina (de um modo preferido, rifampina), para a preparação de um medicamento para o tratamento de infecções do osso, medula óssea, articulação e tecido circundante e osteomielite e/ou artrite séptica, num mamifero, de um modo preferido, um humano.

Outra forma de realização proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de infecções do osso, medula óssea, articulação e tecido circundante e osteomielite e/ou artrite séptica num mamifero, de um modo preferido, um humano, compreendendo tigeciclina, com ou sem um agente antimicrobiano seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina (de um modo preferido, rifampina) e diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou veiculos farmaceuticamente aceitáveis, utilizados convencionalmente em formulações farmacêuticas e veterinárias. As presentes formulações farmacêuticas podem ser adaptadas para administração a humanos e/ou animais.

Outra forma de realização da presente invenção proporciona a utilização de tigeciclina com ou sem um agente antimicrobiano 28 seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina (de um modo preferido, rifampina), para a preparação de um medicamento para o tratamento de infecções do osso, medula óssea, articulação e tecido circundante e osteomielite e/ou artrite séptica num mamífero, de um modo preferido, um humano. É para ser entendido que nas várias formas de realização da presente invenção, a tigeciclina e/ou rifampina ou outros antimicrobianos, podem estar presentes como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, tais sais podem incluir, mas não estão limitados a sais cloridrato, sulfato ou fosfato. Podem também incluir, por exemplo, os sais acetato, citrato ou lactato. 0 medicamento ou composição farmacêutica é administrado a uma dose de modo a alcançar uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina e uma quantidade farmacologicamente eficaz de um agente antimicrobiano seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina (de um modo preferido, rifampina). A composição farmacêutica e/ou medicamento compreende também diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem incluir, mas não estão limitados a, sacarose, manitol, sorbitol, lecitinas, polivinilpirrolidonas, celuloses microcristalinas, metilceluloses, carboximetilceluloses, hidroxietilceluloses, hidroxipropilceluloses; amidos, poliacrilatos, etilceluloses, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose e suas derivações, triacetina, dibutilftalato, dibutilsebacato, ésteres de ácido cítrico, polietilenoglicóis, polipropilenoglicóis, 29 polivinilpirrolidona, lactose, sacarose, estearato de magnésio, talco ou óleo de silicone.

Para administração oral, as formulações farmacêuticas podem ser utilizadas como, por exemplo, comprimidos, cápsulas, emulsões, soluções, xaropes ou suspensões. Para administração parentérica, as formulações podem ser utilizadas como ampolas, ou, de outro modo, suspensões, soluções ou emulsões em transportadores aquosos ou oleosos. A necessidade de agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão irá, com certeza, ter em consideração a solubilidade dos compostos activos nos transportadores que são utilizados nas formas de realização particulares. As formulações podem conter, adicionalmente, conservantes e antioxidantes fisiologicamente compatíveis.

As formulações farmacêuticas podem também ser utilizadas como supositórios com bases para supositório convencionais, tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos. Alternativamente, as formulações podem ser disponibilizadas numa forma de depósito que irá libertar lentamente a composição activa no corpo, durante um período de tempo pré-seleccionado.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Tratamento da osteomielite em coelhos com tigeciclina

Este exemplo mostra o tratamento da osteomielite em coelhos com tigeciclina e tigeciclina em combinação com rifampina. Foram também efectuados estudos de comparação com vancomicina e a combinação de vancomicina com rifampina. Os dados demonstram uma 30 eficácia antimicrobiana melhorada com tigeciclina relativamente à vancomicina e com tigeciclina em combinação com rifampina relativamente à vancomicina em combinação com rifampina. Adicionalmente, a tigeciclina em combinação com a rifampina proporciona uma protecção completa contra o S. aureus resistente à meticilina, no seu grupo de teste.

Obtenção de Curvas Padrão para Bioensaios de Difusão

Foi utilizando soro de coelho NZW normal (Fisher Scientific) e osso da tibia de coelho normal não infectado para obter as curvas padrão para a tigeciclina (Wyeth-Ayerst Research, Pearl River, Nova Iorque), vancomicina (Abbott Laboratories, Chicago, Illinois) e rifampina (Merrell Pharmaceuticals Inc. Kansas, Missouri). Os bioensaios foram efectuados com cada fármaco para obter as curvas padrão para a concentração de antibiótico no soro e/ou osso da tíbia. 0 organismo utilizado para o bioensaio foi o Bacíllus cereus ATCC11778. Os padrões de soro foram preparados utilizando diluições em série de duas vezes com cada antibiótico, para proporcionar concentrações de fármaco de 25 pg/mL a 0,20 pg/mL em soro de coelho da NZW Normal. Os padrões de eluído de osso foram preparados para a tigeciclina através da lavagem exaustiva de tíbias de coelho não infectado, limpas com etanol a 70% numa campânula de extracção de fumos esterilizada. Cada uma das tíbias foi partida em pequenos pedaços de, aproximadamente, 0,5 cm2, utilizando um triturador. Os pedaços foram colocados num tubo de centrífuga estéril cónico de 50 mL e pesados. Foi adicionado um mililitro de solução salina normal estéril a 0,9% por cada grama de pedaços de osso. A solução foi exaustivamente 31 vortexada durante dois minutos. 0 eluido de osso resultante foi deixado em agitação a 180 rpm numa sala fria a 4 °C, durante 12 horas. As amostras foram centrifugadas a 4000 rpm durante 3 minutos antes do ensaio, para fazer sedimentar os pedaços. O diâmetro da zona de inibição de crescimento à volta de cada poço foi medido, em milímetros. Foi obtida uma curva padrão para a concentração de tigeciclina no soro e eluido de osso e para a vancomicina no soro por representação gráfica da concentração de antibiótica conhecida, em função da medição da sua zona de inibição de crescimento resultantes relativamente à sua zona de determinação de inibição resultante.

Farmacocinética da tigeciclina

Foram administradas subcutaneamente 14 mg/kg de tigeciclina, reconstituída em água estéril, a cada 12 horas, durante um período de 8 dias, a um grupo de linha de base de 6 coelhos não infectados. Foram recolhidas amostras de sangue, aproximadamente, nos seguintes intervalos, após tratamento inicial com antibiótico: 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 171 horas e 180 horas (tempo do sacrifício). Foi recolhido meio mililitro de sangue com técnicas convencionais. As amostras foram imediatamente colocadas em tubos de centrífuga de 1,5 mL estéreis. Após eutanásia, ambas as tíbias foram exaustivamente lavadas com etanol a 70% e depois recolhidas, após remoção de todo o tecido mole. As tíbias foram colocadas em diferentes tubos de centrífuga de 50 mL estéreis e armazenadas a -70 °C.

As amostras de soro foram armazenadas a -70 °C até ser efectuado o bioensaio. As amostras de osso foram preparadas como 32 anteriormente descrito. Foram preparadas placas de agár inoculadas e as amostras foram colocadas, em triplicado, nas placas inoculadas e incubadas, a 30 °C, durante 18 horas. O diâmetro da zona de inibição do crescimento à volta de cada poço foi medido e as concentrações de tigeciclina foram extrapoladas a partir da curva padrão.

Determinações da Concentração Mínima de Inibição e Concentração Bactericida Mínima

As concentrações mínimas inibitórias (MIC) da tigeciclina, vancomicina e rifampina, foram determinadas utilizando um método duplo de diluição 2 vezes em tubo do antibiótico. Foram também determinadas as concentrações bactericidas mínimas. Os limites da sensibilidade deste método foram de 25 pg/mL a 0,20 pg/mL.

Indução da Osteomielite Tibial

Foi induzida percutaneamente uma osteomielite localizada por S. aureus na metáfise tibial lateral esquerda de todos os coelhos de todos os seis grupos de estudo. A estripe de S. aureus resistente à meticilina foi obtida a partir de um doente com osteomielite sob tratamento.

Preparação do Meio de Infecção: A S. aureus foi incubada de um dia para o outro em meio Mueller Hinton Broth (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) misturado com 40 pg/mL de oxacilina a 37 °C. A concentração bacteriana da cultura foi ajustada para 107 CFU/mL. 33

Processo de Infecção de Coelhos: Foram utilizados para o estudo coelhos brancos da Nova Zelândia (Ray Nicholl's Rabbitry, Lumberton, Texas), com oito a 12 semanas de idade e pesando 2,0 a 3,5 kg. Após ter sido administrada a anestesia, foi inserida, percutaneamente, uma agulha de calibre 18 através do aspecto esquerdo da metáfise tibial esquerda até à cavidade intramedular. Em seguida, foram injectados sequencialmente 0,15 mL de morruato de sódio a 5% (American Regent Laboratories, Inc., Shirley, Nova Iorque), 0,1 mL de S. aureus (107 CFU/mL) e 0,2 mL de solução salina normal estéril a 0,9%. A infecção foi deixada prosseguir durante 2 semanas, após as quais foi determinada radiograficamente a gravidade da osteomielite (Tabela 1) .

Grupos de Tratamento: No final das duas semanas, após infecção, os coelhos com osteomielite tibial proximal localizada (confirmada radiograficamente como de Grau 2-4) foram separados em seis grupos de estudo. Grupo 1 (grupo de controlo): infectado mas não tratado durante a duração do estudo. Grupo 2: os coelhos foram tratados durante 4 semanas com vancomicina subcutânea a 30 mg/kg, duas vezes por dia. Grupo 3: os coelhos foram tratados durante 4 semanas com vancomicina subcutânea a 30 mg/kg, duas vezes por dia, mais rifampina oral a 40 mg/kg duas vezes por dia em metilcelulose a 0,5%. Grupo 4: os coelhos foram tratados durante 4 semanas com tigeciclina subcutânea a 14 mg/kg duas vezes por dia. Grupo 5: os coelhos foram tratados durante 4 semanas com tigeciclina subcutânea, à mesma dose que os coelhos do Grupo 4, mais rifampina oral a 40 mg/kg duas vezes por dia em metilcelulose a 0,5%. Aos coelhos que receberam a rifampina oral (Grupos 3 e 5) foi administrado, diariamente, um suplemento nutricional oral (Ensure Plus®, Abbott Laboratories, Columbus, Ohio) e uma preparação de Lactobacillus spp. (Kvvet 34

Supply, 3190 NRoad, David City, Nebraska). Grupo 6: os coelhos foram tratados durante 1 semana com tigeciclina subcutânea à mesma dose que no Grupo 4, mas foram sacrificados 3 horas após administração da última dose. Ao mesmo tempo, foram recolhidas amostras de sangue e osso infectado e foi determinada a concentração de tigeciclina. Os grupos 1 a 5 foram deixados sem tratamento, durante 2 semanas após a fase de tratamento da experiência e sacrificados 8 semanas após infecção.

Avaliação Radiográfica

Foram efectuadas radiografias das tíbias bilaterais no início da terapia (2 semanas após infecção), no final da terapia com antibiótico (6 semanas após infecção) e no momento do sacrifício (8 semanas após a infecção). As radiografias foram pontuadas de acordo com uma escala visual (Tabela 1) por três investigadores, cada um desconhecendo o grupo de tratamento, e foi calculada a média das pontuações. 35 TABELA 1

Critérios para a Avaliação Radiográfica da Gravidade da Osteomielite em Coelhos Pontuação* Descrição das Alterações 0 Normal, sem alteração quando comparada com a tíbia direita 1 + Elevação da ruptura do periósteo, ou ambos; inchaço do tecido mole 2 + < 10% de ruptura da arquitectura normal do osso 3 + 10 - 40% de ruptura da arquitectura normal do osso 4 + > 40% ruptura da arquitectura normal do osso * Percentagem estimada visualmente da ruptura do osso

Determinação dos Níveis Serológicos de Antibiótico

Foram determinados os níveis máximos e mínimos de antibiótico para os Grupos 2 e 4, 1 hora (máximo) e 12 horas (mínimo) após a administração inicial de antibiótico. Ver as Figuras 5A e 5B. As concentrações de antibiótico foram determinadas através de um bioensaio. 0 ensaio de difusão de antibiótico foi efectuado como descrito acima. As concentrações de antibiótico foram extrapoladas a partir das curvas padrão respectivas. 36

Determinação da Concentração Bacteriana por Grama de Osso e Medula Óssea

Após o sacrifício, foram efectuadas culturas em bruto para as tíbias, direita e esquerda. Para todos os grupos do estudo foram determinadas contagens quantitativas de S. aureus, em CFU por grama, do osso tibial esquerdo e medula óssea.

Preparação da Cultura: A medula óssea e o canal intramedular das tíbias bilaterais foram esfregados com aplicadores com ponta de algodão estéril, para análise das culturas em bruto das tíbias esquerdas e verificações da garantia de qualidade das tíbias direitas. 0 aplicador inoculado foi riscado nas placas de sangue e, depois, colocado em 5 mL de TSB estéril. As placas e os tubos foram depois incubados a 37 °C durante 24 horas e foi registado o crescimento e/ou turbidez. A medula óssea foi colocada num tubo de centrífuga estéril de 50 mL e pesada. Os fragmentos do osso foram partidos em pedaços de 0,5 cm2, colocados num tubo de centrífuga estéril de 50 mL e o produto final pesado. Foi adicionada solução salina estéril normal a 0,9%, numa proporção de 3 para 1 (3 mL de solução salina/grama de osso ou medula óssea) e as suspensões foram submetidas a vórtex durante 2 minutos. Foram preparadas seis diluições de dez vezes de cada suspensão com solução salina normal estéril a 0,9%. Foram plaqueadas amostras de vinte microlitros de cada diluição, incluindo a suspensão inicial, em triplicado, em placas de agár de sangue e incubadas a 37 °C durante 24 horas. Foram contadas as CFU na diluição mais elevada para cada amostra de tíbia. A concentração de S. aureus foi calculada em CFU por grama de osso ou medula óssea. O resultante calculado foi multiplicado por 3 para as amostras de osso e por 37 4 para a medula óssea, de modo a ter em conta as suas diluições inicias em solução salina e para a adsorção da medula óssea na solução salina. Foi calculado o log médio da concentração de S. aureus para cada um.

Análise Estatística dos Dados Experimentais

Foram calculados o desvio padrão e o erro padrão da média para todos os dados em bruto, incluindo determinações de difusão do disco, variações de peso, classificações das radiografias e contagens bacterianas. Foi efectuada a análise por regressão linear, método dos quadrados mínimos, para as curvas padrão de difusão do antibiótico, utilizando o log de base dez das concentrações de antibiótico para representar graficamente a concentração (em pg/mL) versus a zona de inibição determinada (em milímetros). Todas as determinações de difusão subsequentes foram extrapoladas para microgramas/mililitro de concentração de antibiótico a partir da curva padrão, utilizando os valores do declive e intercepção no eixo dos yy, derivados dos últimos cálculos dos quadrados menores.

Concentrações Mínimas Inibitórias e Concentrações Bactericidas Mínimas

Para a estirpe de S. aureus resistente à meticilina (inoculo de 106 CFU/mL) utilizada no estudo, as concentrações mínimas inibitórias e concentrações bactericidas mínimas para a tigeciclina foram inferiores a 0,2 pg/mL e 0,2 pg/mL, respectivamente. Os níveis de concentração mínima inibitória e concentração bactericida mínima para a vancomicina foram de 38 0,39 pg/mL, e 0,78 pg/mL, respectivamente, proporcionando uma razão MIC/MBC de 0,5. Os níveis de concentração mínima inibitória e concentração bactericida mínima para a rifampina foram de 0,78 pg/mL, e 1,56 pg/mL, respectivamente, proporcionando uma razão de 0,5. Níveis Cinéticos de Fármaco no Osso e Soro

Todas as concentrações de antibiótico foram derivadas das curvas padrão respectivas. As inclinações logarítmicas das concentrações de tigeciclina (14 mg/kg, duas vezes por dia) no soro do grupo de animais não infectados são apresentadas na Figura 1. A tigeciclina, como apresentado na Figura 1, eliminada lentamente, mantendo um nível estável superior à MIC (0,2 pg/mL) em 12 horas (mínimo) . Nas Figuras 5a a 5b são apresentados os máximos e mínimos da tigeciclina (14 mg/kg, duas vezes ao dia) e vancomicina (30 mg/kg, duas vezes por dia) no soro dos coelhos infectados após administração dos fármacos respectivos. Foram determinadas, separadamente, as concentrações de tigeciclina no osso (14 mg/kg, Bid) no grupo dos coelhos infectados, na tíbia infectada e no final do tratamento, na qual apresentavam em média 0,78 pg/mL +/- 0,01 pg/mL, e na tíbia não infectada, na qual apresentavam em média 0,49 pg/mL +/- 0,01 pg/mL. A diferença foi estatisticamente significativa (p < 0,05).

Verificações Radioqráficas

De acordo com a Tabela 1, foi induzido uma pontuação de 2 a 4 de osteomielite em todos os animais infectados. As pontuações radiográficas iniciais foram semelhantes entre os grupos. As 39 classificações médios para os grupos da tigeciclina, tigeciclina + rifampina e vancomicina + rifampina a t=14 dias, foram significativamente superiores às pontuações médias para os dias t=56 (p<0,05). 0 grupo controlo apresentou a menor quantidade radiográfica (0,2 +/- 0,2 ou 9,1%), quando comparado com os grupos da vancomicina (0,5 +/- 0,2 ou 25%), tigeciclina (0,9 + /- 0,1 ou 40,9%), vancomicina + rifampina (0,9 +/- 0,1 ou 40,9%) ou tigeciclina + rifampina (0,8 +/- 0,1 ou 40,0%). A Figura 2 representa a gravidade radiográfica média para cada grupo em t=14 e t=56 dias. No final do estudo (t=56 dias), as pontuações radiográficas médias foram comparadas entre os diferentes grupos. As pontuações médias para o grupo da tigeciclina, grupo da tigeciclina + rifampina e grupo da vancomicina + rifampina, em t=56 dias, foram significativamente inferiores às pontuações médias para o grupo controlo em t=5 6 dias (p < 0,05) . A chave para a figura 2 é como se segue: Controlo = grupo de controlo, sem tratamento; Vancomicina = grupo tratado com vancomicina subcutânea; Van + Rifam = grupo tratado com vancomicina subcutânea e com rifampina oral; Gar-936 = grupo tratado com Gar-936 subcutânea; Gar + Rifam = grupo tratado com Gar-936 subcutânea e com rifampina oral.

Culturas de Osso

Uma percentagem elevada de tíbias dos controlos infectados não tratados (n=15) revelou culturas positivas (80%) para Staphylococcus aureus resistente à meticilina a uma concentração média de 9,21 x 104 CFU/g osso. Quando comparado com controlos não tratados, o grupo da vancomicina (n=ll), grupo da 40 tigeciclina e grupo da tigeciclina + rifampina, demonstraram todos uma percentagem significativamente inferior de infecção positiva por Staphylococcus aureus resistente à meticilina. No grupo da vancomicina, 2 das 11 amostras (18,2%) foram positivas para MRSA e a concentração bacteriana média do grupo foi de 1,4 x 102 CFU/grama de osso (p < 0,05). No grupo da tigeciclina, 1 das 10 amostras foi positiva para Staphylococcus aureus resistente à meticilina e a concentração bacteriana média no grupo foi de 20 CFU/grama de osso que é inferior aos controlos e ao grupo da vancomicina (p < 0,05). Um coelho no grupo da vancomicina + rifampina apresentou uma concentração bacteriana superior ao controlo. Os coelhos do grupo de tratamento que receberam tigeciclina + rifampina, demonstraram uma erradicação completa das bactérias da tíbia (0,0 CFU/grama de osso em todas as amostras). A Figura 3 compara as CFU/grama de medula óssea e osso entre todos os grupos. A Figura 3 demonstra que a tigeciclina e a tigeciclina em combinação com a rifampina foram um tratamento eficaz para a infecção do osso e infecção da medula óssea em relação aos controlos. se segue: tratamento; subcutânea; subcutânea; vancomicina oral; A chave para a figura 3 é como

Controlo = Controlo = grupo de controlo, sem Vancomicina = grupo tratado com vancomicina Gar-936 = grupo tratado com Gar-936 Vancomicina + Rifampina = grupo tratado com subcutânea e com rifampina

Gar-936 + Rifampina = grupo tratado com Gar-936 subcutânea e com rifampina oral. 41

Efeitos Secundários

Dos 66 coelhos infectados, um total de 6 morreram antes de ter terminado o tratamento. Dos 5 coelhos que morreram no grupo de tratamento com tigeciclina, um deles foi eutanasiado ao dia 19 devido à grave insuficiência do estado nutricional. Outro coelho morreu ao dia 17 devido ao tratamento com tigeciclina devido a gastroenterocolite. Três dos coelhos neste grupo morreram ao dia 28 devido a gastroenterocolite e intolerância à anestesia. Um coelho do grupo da tigeciclina + rifampina morreu durante o tratamento ao dia 15, devido a gastroenterocolite. A gastroenterocolite foi, muito provavelmente, provocada por alteração da flora normal do intestino grosso. Todos os coelhos foram monitorizados semanalmente para a variação de peso. 0 grupo controlo apresentou o maior ganho médio (0,58 kg + /- 0,27), a vancomicina o segundo maior (0,39 kg +/-0,26), o grupo da vancomicina + rifampina, o terceiro (0,21 kg +/- 0,32). No grupo da tigeciclina (-0,05 kg +/-0,32) e no grupo da tigeciclina + rifampina (-0,39 +/- 0,31) verificou-se perda de peso após o tratamento com antibiótico. Quase todos os coelhos no grupo da tigeciclina e grupo da tigeciclina + rifampina apresentaram sintomas moderados a graves, de disfunção gástrica, aproximadamente, 1,0-1,5 semanas após inicio do antibiótico, incluindo diminuição do apetite, desidratação, diarreia e/ou perda de peso. A Figura 4A e B mostram as variações de peso entre todos os grupos. A chave para as figuras 4A e B é como se segue: Controlo = grupo de controlo, sem tratamento; Vancomicina = grupo tratado com vancomicina subcutânea; Vanco + Rifampina = grupo tratado com vancomicina subcutânea e com rifampina oral; Gar-936 = grupo tratado com Gar-936 subcutânea; Gar-936 + Rifampina = grupo tratado com Gar-936 subcutânea com Rifampina oral. 42

Em relação à segurança, foi observado um número superior de mortes e efeitos secundários nos grupos de coelhos tratados com tigeciclina. A enterocolite devida à tigeciclina pode ser provocada por uma destruição extensiva da flora microbiana normal do intestino. Os sintomas foram atenuados pela administração de probióticos orais. 0 espectro antimicrobiano amplo da tigeciclina, em contraste com o espectro mais estreito da vancomicina, pode ajudar a explicar a diferença observada entre os grupos de tratamento.

Resultados

Os dados de contagem para cada animal em cada tecido são apresentados na Tabela 2. As contagens na tabela são médias das determinações efectuadas, em triplicado, em cada tecido. A inspecção dos dados na Tabela 2 revela que nos grupos tratados com os artigos de teste, as contagens na maioria ou em todos os animais foram 0. No grupo de controlo, as contagens que não zero, foram determinadas na medula óssea de 5 dos 15 animais e no osso de 11 dos 15 animais. Existiu uma variação considerável na magnitude das contagens que não zero nos grupos de controlo, especialmente, para o osso O número de culturas positivas e negativas em cada grupo de tratamento e os valores de p resultantes das comparações com o controlo, foram como se segue: 43 TABELA 2

Contagem das Unidades Formadoras de Colónias Por Grama de Osso e Medula Óssea do Estudo da Osteomielite em Coelhos Grupo de Contagens (CFU/gm) da Contagens Tratamento Medula Óssea (CFU/gm) do Osso Controlo 1 0 238 2 0 0 3 83000000 97 4 0 0 5 0 5000 6 0 2380 7 610000 100000 8 22000 1000 9 0 0 10 0 50 11 1700 1100000 12 0 0 13 4400 108000 14 0 72,9 15 0 106,3 Tigeciclina 1 0 178,6 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 44 (continuação)

Contagem das Unidades Formadoras de Colónias Por Grama de Osso e Medula Óssea do Estudo da Osteomielite em Coelhos Grupo de Contagens (CFU/gm) da Contagens Tratamento Medula Óssea (CFU/gm) do Osso 10 0 0 Tigeciclina + 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 10 0 0 Vancomicina 1 1250 270,3 2 0 1315,8 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 10 0 0 45 (continuação)

Contagem das Unidades Formadoras de Colónias Por Grama de Osso e Medula Óssea do Estudo da Osteomielite em Coelhos Grupo de Contagens (CFU/gm) da Contagens Tratamento Medula Óssea (CFU/gm) do Osso 11 0 0 Vancomicina + 0 0 2 530000000 1040000 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 10 0 0

Dados da comparação da osteomielite em Coelho com tigeciclina, vancomicina e rifampina

Na medula óssea, a proporção de culturas positivas nos grupos de tratamento com tigeciclina e tigeciclina + rifampina foi 0, que em comparação com a proporção de 0,33 (5/15) no grupo de controlo, foi quase estatisticamente significativa (p=0,06) ao nivel convencional p=0,05. As proporções nos grupos da vancomicina e vancomicina + rifampina não foram, de um modo significativo, estatisticamente diferentes do grupo de controlo. No osso, a proporção das culturas positivas em cada dos grupos tratados com os artigos de teste foi, de um modo significativo, estatisticamente inferior à proporção no grupo de controlo. 46

Num modelo animal de endocardite por Staphylococcus aureus resistente à meticilina, 14 mg\kg bid de tigeciclina demonstrou ser mais eficaz que 40 mg\kg de vancomicina (Murphy, Antimicrob Agents Chemother 2000; 44(11): 3022-3027). Num modelo em rato, foram administradas dosagens tão elevadas quanto 80 mg\kg\dia. No entanto, no modelo em coelho aqui utilizado, a administração de dosagens superiores a 14 mg/kg por dia provocaram uma morbidade e mortalidade relevante nos animais (dados não apresentados). Deste modo, foi utilizada neste estudo a dosagem citada anteriormente. Embora o objectivo não seja estudar as farmacocinéticas da tigeciclina em coelhos, foram efectuados algumas determinações dos niveis de fármaco de modo a garantir que está a ser utilizada uma dosagem adequada no modelo animal. Os dados confirmam que os niveis de fármaco no soro estavam ainda acima da MIC da estirpe de estafilococos utilizada, 12 horas após a última administração. Além disso, o fármaco apresentou uma penetração relevante no osso e verificaram-se niveis terapêuticos da tigeciclina no osso infectado e não infectado. A concentração mais elevada de fármaco, encontrada no osso infectado é outra observação relevante que necessita de estudos posteriores. EXEMPLO 2: Distribuição de Tigeciclina no Tecido Humano após Uma Administração Intravenosa de 100 mg.

Este exemplo mostra a penetração nos tecidos seleccionados em indivíduos humanos após uma administração intravenosa única de tigeciclina. Os dados demonstram uma fase de distribuição rápida, com um tempo de meia vida prolongado e um volume elevado de distribuição no estado estável. Estabelecem também a penetração no osso, fluido sinovial, pulmão, vesícula biliar e 47 cólon em indivíduos humanos. A penetração melhora o tratamento de infecções do osso e da articulação.

Estudos das farmacocinéticas da tigeciclina intravenosa em humanos, demonstraram que existe uma fase de distribuição rápida, com um tempo de meia vida prolongado (40 a 60 horas) e um volume elevado de distribuição no estado estável. Estudos em animais com tigeciclina marcada radioactivamente sugerem que esta fase de distribuição rápida e volume elevado de distribuição no estado estável representam a penetração da tigeciclina nos tecidos, incluindo pulmão e osso. Foi administrada tigeciclina marcada com carbono-14 a ratos Sprague-Dawley (18 machos) a uma dosagem de 3 mg/kg por infusão de 30 minutos. As concentrações ou radioactividade foram determinadas em tecidos de 3 ratos/ponto de tempo no final da infusão e 1, 8, 24, 72, e 168 horas após o final da infusão. Para todos os tecidos, foi observada a concentração da radioactividade máxima no final da infusão. Em geral, a radioactividade estava bem distribuída pela maioria dos tecidos, com as concentrações mais elevadas como se segue: osso>medula óssea>glândula salivar, tiróide, baço e rim. Em cada dos tecidos, a razão da área sobre a curva de concentração-tempo no tecido em relação à área sob a curva de concentração-tempo no plasma foi >10. O objectivo deste estudo foi determinar a concentração de tigeciclina no tecido e a concentração serológica de tigeciclina correspondente, em pontos de tempo seleccionados no pulmão, cólon, vesícula biliar, osso e fluido sinovial. Foram recolhidas amostras de indivíduos com cirurgias marcadas ao pulmão, cólon, vesícula biliar ou osso ou uma punção lombar a quem foi administrada intravenosamente uma dose única de tigeciclina. 48 A recolha de amostras de tecido/fluido pré-específiçada de pulmão, cólon, vesicular biliar e fluido sinovial foi efectuada em cada indivíduo durante a cirurgia, 4 horas, 8 horas, 12 horas ou 24 horas após o inicio de uma dose única de 100 mg de tigeciclina, administrada durante 30 minutos. O soro foi recolhido de todos os indivíduos à hora 0 (antes da primeira dose), aproximadamente, 30 minutos (final da infusão) e ao tempo correspondendo às recolhas de tecido/fluido. Foi determinada a concentração no tecido e no soro, de acordo com o método apresentado abaixo.

Parâmetros de Investigação para Amostras de Soro

As amostras de soro e tecido humano dos indivíduos do estudo que receberam tigeciclina foram analisadas de acordo com os métodos que foram previamente validados. As amostras de soro e fluido sinovial (0,2 mL) foram misturadas com 0,6 mL de padrão interno em acetonitrilo, o sobrenadante foi evaporado até à secura e o resíduo reconstituído em 200 microlitros de fase móvel. Foram injectadas aliquotas (10 microlitros) das amostras reconstituídas num LC/MS/MS.

Os dados foram recolhidos por e analisados num software PE SCIEX "Analyst" versão 1.3. Foi utilizada a regressão linear, com 1/x2 ponderação, para obter o melhor ajuste dos dados para as curvas de calibração. O limite inferior de quantificação foi de 10 ng/mL para amostras de soro e de fluido sinovial, 10 ng/g para as amostras de cólon e vesícula biliar e 30 ng/g para as amostras de osso. 49

As amostras de controlo de qualidade (2 conjuntos) a baixo (25 ng/mL), médio (500 ng/mL) e elevado (1500 ng/mL), preparadas em soro humano, foram analisadas com cada conjunto de amostras de soro. Para as amostras de cólon, vesicular biliar e pulmão, foram analisados dois conjuntos de amostras de controlo de qualidade a 25, 500 e 1500 ng/g com cada conjunto de amostras de tecido. Para o osso, foram analisados dois conjuntos de amostras de controlo de qualidade a 100, 500 e 1500 ng/g, com cada conjunto de amostras de tecido.

As curvas foram lineares na gama de 10 a 2000 ng/mL para o soro e fluido sinovial e do limite inferior de quantificação até 2000 ng/g para os tecidos. Um ensaio foi considerado bem sucedido, se não mais do que duas amostras de controlo de qualidade, estivessem fora da gama de 85-115% do alvo e duas amostras de controlo de qualidade à mesma concentração não estivessem fora da gama. Se duas amostras de controlo de qualidade, à mesma concentração, estavam fora da gama, apenas foram referidas as concentrações entre as restantes amostras de controlo de qualidade.

Materiais e Métodos para as Amostras de Soro A tigeciclina foi determinada em soro humano utilizando um método LC/MS/MS. A solução stock primária de tigeciclina foi preparada a 1 mg/mL por dissolução em metanol. Foi preparada uma solução stock secundária a partir da solução stock primária por diluição para uma concentração de, aproximadamente, 40000 ng/mL com acetonitrilo. As soluções stock foram armazenadas a -20 °C quando não estavam a ser utilizadas. Foi preparada uma solução de padrão interno de terc-butil-d9-tigeciclina a uma 50 concentração de 1 mg/mL em metanol. Foi preparada uma solução stock de padrão interno secundária por diluição da solução stock primária para uma concentração de 100 microgramas/mL em acetonitrilo com adição de trifluoroacetato a 0,1%. As soluções stock primária e secundária foram armazenadas a -20 °C. O padrão interno de trabalho foi preparado por diluição para volume com acetonitrilo/trifluoroacetato a 0,1%. O padrão interno de trabalho foi armazenado a 4 °C quando não estava a ser utilizado. No dia da análise, a solução stock secundária foi colocada à temperatura ambiente antes da utilização para preparar as soluções de trabalho para a curva padrão. A curva padrão foi preparada a, aproximadamente, 2000, 1600, 1000, 500, 250, 100, 50, 20 e 10 ng/mL por diluição em série em soro humano branco. 0 processo de extracção foi como se segue: a 200 microlitros de calibrador, controlo de qualidade ou amostra, foram adicionados 600 microlitros de solução de trabalho de padrão de interno e misturados por vortex. As amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 13000 rpm para separar as camadas e o sobrenadante foi transferido para um tubo de cultura. As amostras foram evaporadas até à secura num Speed Vac. Os residuos foram reconstituídos por sonicação em 200 microlitros de fase móvel e foram injectados 10 microlitros no LC/MS/MS. O LC/MS/MS foi composto por HPLC (Agilent 1100), Espectrómetro de Massa (Applied Biosystems API3000), Coluna (Aquasil C18, 50 x 2,1 mm i.s., 5 micrones (ThermoKeystone) com fase móvel de 16% de acetonitrilo, 6% de metanol, 78% de água e 0,1% de tetrafluoroacetato, fluxo de, aproximadamente, 0,35 mL/min, volume de injecção de 10 microlitros, Condições do 51

Detector: 119 varrimentos no período, tipo de varrimento MRM, polaridade positiva, fonte de vaporização por iões turbo a resolução baixa, utilizando azoto a 6 psi como um gás de nebulização, um gás de cortina e um gás de colisão, com energia iónica a 4500 mv e temperatura de vaporização de iões a 450 °C. O detector monitorizou a tigeciclina e o padrão interno.

As amostras foram analisadas ao longo de três ensaios analíticos. Em cada dia de análise de amostras, foi ensaiada uma curva padrão completa em simultâneo com as amostras de controlo de qualidade e amostras dos indivíduos do estudo. As amostras que apresentaram uma concentração determinada superior ao calibrador mais elevado foram diluídas por mistura de 100 microlitros de amostra com 900 microlitros de soro humano branco e analisados 200 microlitros da mistura como descrito previamente. A quantificação da tigeciclina no soro foi alcançada por comparação com uma curva padrão preparada na matriz apropriada e calculada utilizando um factor de ponderação (1/concentração)2. O limite da quantificação para a tigeciclina foi de 10 ng/mL. Não foram detectados picos interferindo com a determinação de qualquer um dos isómeros da tigeciclina e, qualquer das amostras de pré-dose. Todos os calibradores e amostras de controlo de qualidade estavam dentro da gama (85-115% do alvo).Os resultados das amostras são apresentados na Tabela 1. Os resultados das curvas padrão e calibradores são apresentados na Tabela 4. 52

Parâmetro de Investigação para as Amostras de Tecido A solução stock e a solução de padrão interno foram preparadas do mesmo modo que para os parâmetros de investigação para as amostras de soro acima. As soluções de trabalho para a curva padrão foram preparadas a, aproximadamente, 10000, 8000, 5000, 2500, 500, 250, 100 e 50 mg/mL. No dia da análise, foram adicionados 40 microlitros das soluções de trabalho a 200 mg de tecido para produzir calibradores a 2000, 1600, 1000, 500, 250, 100, 50, 20 e 10 ng/mL. O tecido canino foi substituído por tecido humano para preparar os calibradores e as amostras de controlo de qualidade. Devido a disponibilidade limitada de vesícula biliar canina, foi utilizado cólon canino para preparar a curva padrão para a análise de vesícula biliar humana. O cólon demonstrou ser uma matriz de substituição apropriada para a análise das amostras de vesícula biliar. 0 processo de extracção foi como se segue: a 200 mg de calibrador, controlo de qualidade ou amostra foram adicionados 3 mL de solução de trabalho de padrão interno e as amostras foram homogeneizadas utilizando um homogeneizador de mão. As amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 14000 rpm para separar as camadas e o sobrenadante foi transferido para um tubo de centrífuga. As amostras foram evaporadas até à secura num Speed Vac. Os resíduos foram reconstituídos por sonicação em 200 microlitros de fase móvel e 10 microlitros foram injectados no LC/MS/MS. As condições do LC/MS/MS foram as mesmas que as utilizadas para analisar as amostras de soro. As amostras de fluido sinovial foram extraídas do mesmo modo que as amostras de soro. 53

As amostras foram analisadas ao longo dos vários ensaios analíticos. Em cada dia de análise de amostras, foi ensaiada uma curva padrão completa em simultâneo com as amostras de controlo de qualidade e tecidos. A curva padrão foi preparada na matriz de substituição apropriada para as amostras de tecido a serem analisadas. As amostras que apresentaram uma concentração determinada superior ao calibrador mais elevado (200 ng/g) foram homogeneizadas com padrão interno a 10 ou 20 vezes a concentração utilizada para a curva padrão. Uma aliquota (300 microlitros) (10 vezes diluída) foi evaporada até à secura e as amostras foram reconstituídas de modo a que as razões da área do pico e áreas do pico estejam dentro da gama da curva padrão. A quantificação da tigeciclina nos tecidos foi alcançada por comparação com uma curva padrão preparada na matriz apropriada e calculada utilizando um factor de ponderação (1/concentração)2. Para o fluido sinovial, os calibradores foram preparados em solução salina tamponada com fosfato. Foi preparado um segundo conjunto de calibradores num fluido sinovial artificial composto pelos seguintes componentes: 100 mmol/L de glucose, 2,03-2,26 g/L de hialuronato e, aproximadamente, 8 g/L de albumina com pH ajustado para pH 7,4. A curva de calibração preparada em PBS e a recuperação, foi calculado um factor de correcção ao efectuar a regressão linear das concentrações determinadas de amostras de fluido sinovial artificial a partir da curva de PBS versus a concentração teórica dessas amostras utilizando uma equação de potência (y=y0 +axb) . Uma vez que a concentração determinada das amostras dos indivíduos do estudo estava na gama mais baixa da curva de calibração, foram apenas utilizados os calibradores de 20 a 500 ng/mL para calcular esta regressão. Os resultados desta 54 regressão mostraram uma forte correlação (r2 = 0,9996) e as concentrações calculadas para os calibradores ASF estavam entre 94 e 122% dos seus valores alvo ao longo da gama completa da curva padrão (20-2000 ng/mL). A equação de regressão foi depois aplicada às concentrações das amostras dos indivíduos do estudo a partir da curva padrão de pbs e foi determinada a concentração correcta da tigeciclina nas amostras de fluido sinovial. O limite da quantificação para a tigeciclina foi de 10 ng/mL. Foram observadas concentrações passíveis de determinação em todas as matrizes analisadas. Todos os calibradores e amostras de controlo de qualidade a concentrações semelhantes às das amostras estavam dentro da gama (85-115% do alvo). Os resultados das amostras são apresentados na Tabela 4 (tecidos) e Tabela 5 (fluido sinovial).

Resultados

Os dados demonstram uma fase de distribuição rápida, com um tempo de meia vida prolongado e um volume de distribuição elevado no estado estável. Estabeleceram também a penetração no osso, fluido sinovial, pulmão, vesícula biliar e cólon em indivíduos humanos. Adicionalmente, as concentrações no fluido sinovial mostram uma rápida distribuição e retenção prolongada da tigeciclina quando comparado com dados de soro a tempos semelhantes. 55 TABELA 3

Resultados das Análises de Soro Calculado Calculado Calculado Amostra Concentração Tempo Amostra Concentração Tempo Amostra Concentração Tempo ID. fn e mL} Hora I.D. fnpJmlZ Hora I.D fnpJmli Hora IA BQL ' 0 22A BQL 0 40A BQL 0 1B 5450 0,5 22B 1810 0,5 40B 1950 0,5 1C 81,6 24 22C 251 4 40C 80,6 24 2A BQL 0 23A BQL 0 41A BQL 0 2B 1080 0,5 23B 1530 0,5 41 B 2580 0,5 2C 151 4 23C 74, 4 24 41C 191 12 4A BQL 0 2 4A BQL 0 42A BQL 0 4B 1490 0,5 2 4B 1650 0,5 42B 789 0,5 4C 175 4 24C 85,6 12 42C 198 8 5A BQL 0 25A BQL 0 43A BQL 0 5B 1100 0,5 25B 3550 0,5 43B 1150 0,5 5C 116 12 25C 136 4 43C 77.4 24 6A BQL 0 26A BQL 0 44A BQL 0 6B 1170 0,5 26B 878 0,5 44B 954 0,5 6C 113 12 26C 120 12 44C 144 4 7A BQL 0 2 7A BQL 0 45A BQL 0 7B 1640 0,5 2 7B 847 0,5 45B 894 0,5 7C 97, 2 12 2 7C 78,9 12 45C 299 4 8A BQL 0 2 8A BQL 0 46A BQL 0 8B 1710 0.5 28B 922 0,5 46B 1420 0,5 8C 186 4 28C 120 12 46C 66,6 24 9A BQL 0 2 9A BQL 0 47A BQL 0 9B 1860 0,5 29B 5190 0,5 47B 447 0,5 9C 221 4 29C 147 4 47C 252 4 10A BQL 0 3 0A BQL 0 48A BQL 0 10B 27400 0,5 3 0B 1190 0,5 48B 976 0,5 10C 244 4 3 0C 50,8 24 48C 86,9 24 11A BQL 0 3 IA BQL 0 49A BQL 0 11B 1320 0,5 31B 2320 0,5 49B 1200 0,5 11C 47, 2 12 31C 166 4 49C 102 12 12A BQL 0 32A BQL 0 5 0A BQL 0 12B 6950 0,5 32B 3550 0,5 5 0B 1430 0,5 12C 54, 4 24 32C 42,1 24 5 0C 186 8 56 (Continuação)

Resultados das Análises de Soro

Calculado Calculado Calculado

Amostra Concentração Tempo Amostra Concentração Tempo Amostra Concentração Tempo ID. {n e mL} Hora I.D. fnpJmlZ Hora I.D fnpJmli Hora 15A BQL 0 33A BQL 0 5 IA BQL 0 15B 1960 0,5 33B 620 0,5 51B 726 0,5 15C 250 4 33C 43,7 24 51C 44, 7 24 16A BQL 0 3 4A BQL 0 52A BQL 0 16B 741 0,5 3 4B 4080 0,5 52B 821 0,5 16C 107 12 34C 92,7 12 52C 125 4 17A BQL 0 35A BQL 0 53A BQL 0 17B 1110 0,5 35B 2430 0,5 53B 1060 0,5 17C 51 24 35C 53,6 24 53C 209 4 18A BQL 0 36A BQL 0 5 4A BQL 0 18B 761 0,5 36B 2300 0,5 5 4B 1850 0,5 18C 133 8 36C 65,7 24 5 4C 206 8 19A BQL 0 3 7A BQL 0 55A BQL 0 19B 1240 0,5 3 7B 2415 0,5 55B 628 0,5 19C 162 4 37C 95,7 12 55C 431 4 2 0 A BQL 0 3 8A BQL 0 20B 903 0,5 38B 4600 0,5 2 0C 106 12 3 8C 106 12 2 IA BQL 0 3 9A BQL 0 21B 870 0,5 39B 5130 0,5 21C 778 4 39C 342 4 Aql = : abaixo dos limites quantitativos TABELA 4

Resultados da Calculada Análise de Tecido Amostra Concentração I.D. (n2/2) Tecido 001 8210 Vesícula Biliar 002 1560 Vesícula Biliar 004 41, 6 Osso 57 (continuação)

Resultados da Análise de Tecido Calculada

Amostra Concentração 005 20700 Vesícula Biliar 006 46,5 Osso 007 33,3 Osso 008 79,3 Osso 009 1890 Pulmão 010 141 Osso 011 7640 Vesícula Biliar 012 BQL Osso 015 8400 Vesícula Biliar 016 824 Vesícula Biliar 017 93,3 Osso 018 3750 Vesícula Biliar 019 18900 Vesícula Biliar 020 269 Osso 021 86,6 Cólon 022 50, 0 Osso 023 1180 Vesícula Biliar 024 BQL Osso 025 1550 Vesícula Biliar 026 91,2 Cólon 027 BQL Osso 028 598 Cólon 029 3240 Vesícula Biliar 030 BQL Osso 031 5960 Vesícula Biliar 032 938 Vesícula Biliar 033 BQL Osso 58 (continuação)

Resultados da Análise de Tecido Calculada

Amostra Concentração 034 3480 Vesícula Biliar 035 778 Vesícula Biliar 037 3850 Vesícula Biliar 038 BQL Osso 039 198 Cólon 040 1500 Vesícula Biliar 041 106 Colon 042 238 Vesícula Biliar 043 995 Cólon 044 725 Cólon 045 814 Cólon 046 BQL Osso 047 453 Cólon 048 BQL Osso 050 618 Cólon 051 653 Pulmão 052 35,5 Osso 053 BQL Osso 054 36,1 Osso 055 118 Cólon *BQL = abaixo dos limites quantitativos do ensaio (<33,2 ng/mL) 59 TABELA 5

Resultados da Análise do Fluido

Sinovial

Calculado

Amostra Concentração Tempo I.D. (ng/mL) (Hora) 4 39,9 4 6 62,8 12 8 159 4 10 130 4 12 46, 4 24 20 111 12 22 181 4 24 65, 0 12 30 37, 8 24 33 25, 9 24 38 65, 7 12 46 55, 4 24 48 45, 0 24 52 70, 6 4 54 70, 9 8 EXEMPLO 3: Distribuição no tecido em Ratos Tratados com Tigeciclina

Este estudo foi efectuado para quantificar a radioactividade derivada de [14C]-tigeciclina nos tecidos, através da autoradiografia ao corpo todo, utilizando imagiologia de fósforo, após uma infusão única intravenosa de 30 minutos com 60 3 mg/kg de [14C]-tigeciclina a ratos machos Sprague-Dawley e Long-Evans.

Materiais e Métodos A tigeciclina foi fornecida pelo Departamento Analítico, Wyeth-Ayerst Research, Montreal, Canada. A [14C]-tigeciclina foi fornecida por Amersham (Boston, MA) . A pureza radioquímica e actividade específica da [14C]-tigeciclina em bruto foi de 98% e 93,6 microCi/mg, respectivamente.

Foi utilizada água estéril para preparar a solução de dosagem intravenosa. 0 cocktail de cintilação líquida utilizado na contagem da radioactividade no plasma e urina foi Ultima Gold (Packard Instruments Co., Meriden, CT).

Foi utilizado um Tri-Carb Sample Oxidizer Modelo 3078 equipado com um Injector Automático Robótico Oximate-80 (Canberra-Packard Co., Downers Grove, IL) para a combustão das amostras de sangue. Foi utilizado um cocktail de cintilação líquida Permafluor E (Packard Instruments Co., Meridan, CT), absorvente de dióxido de carbono Carbo-Sorb-E (Packard Instruments Co., Meridan CT) e água desionizada para capturar o dióxido de carbono radioactivo gerado pela combustão no dispositivo de oxidação. As aliquotas de sangue foram transferidas para cones de combustão e almofadas de cobertura (Canberra-Packard Co., Downers Grove, IL) para a combustão.

Todas as determinações de radioactividade (dose, sangue e plasma) foram efectuadas utilizando um contador de cintilação líquida Tri-Carb Modelo 2700 TR (Canberra-Packard Co., Downers 61

Grove, IL) com uma curva padrão de Ultima Gold ou tolueno. As contagens por minuto (CPM) foram convertidas para desintegrações por minuto (DPM) pela utilização de padrões externos de radioactividade conhecida. A atenuação de cada padrão foi determinada pelo índice espectral transformado de um padrão radioactivo externo (TSIE). Os limites inferiores de detecção foram definidos como duas vezes o sinal de fundo.

Os ratos machos Sprague-Dawley e Long-Evans foram obtidos da Charles River Breeding Laboratories, Raleigh, NC e foram mantidos em quarentena até, pelo menos, uma semana antes do início do estudo. A solução de dosagem intravenosa (1,02 mg/mL) foi preparada por dissolução de 6,90 mg de tigeciclina não marcada e 5,30 mg de [14C]-tigeciclina em 12 mL de água estéril. A solução de dosagem foi diluída e avaliada para a radioactividade directamente num cocktail de contagem de cintilação Ultima Gold (Packard Inc.). Todas as determinações da radioactividade total foram efectuadas com um espectrómetro de cintilação líquida Packard 2700 TR (Canberra-Packard Co.).

Os pesos corporais dos ratos variaram de 0,206 a 0,301 kg. Todos os ratos receberam uma única dose de infusão intravenosa de [14C]-tigeciclina durante 30 minutos via uma canula na veia jugular, (3 mL/kg, 3 mg/kg como porção activa, 40 microCi/kg) utilizando uma bomba de infusão Harvard 22 (Harvard Apparatus, Southnatick, MA) . Todas as bombas foram calibradas antes da administração do composto. Os ratos foram anestesiados com isoflurano antes da exsanguinação por punção cardíaca a tempos pré-determinados após dosagem. Os ratos Sprague-Dawley e Long-Evans foram sacrificados, um por cada ponto de tempo a 0,5, 8,5, 24, 72, 168 e 336 h pós-dose. 62 0 sangue total de controlo foi recolhido de ratos machos Sprague-Dawley para tubos contendo heparina sódica. 0 sangue reunido foi utilizado para preparar os padrões de calibração e amostras de controlo de qualidade. Os padrões foram utilizados para construir a curva padrão para a quantificação da distribuição de fármaco marcado radioactivamente nos tecidos das criosecções de sangue total. Os controlos de qualidade, que foram inseridos no mesmo bloco CMC com cada rato, foram utilizados para avaliar a variação intra- e inter-secção na espessura das criossecções de todo o corpo do rato.

Uma solução stock de 200 microCi/mL de [14C]-glucose (New England Nuclear, Boston, MA) foi diluida em série com sangue total de ratos machos Sprague-Dawley para obter catorze padrões às seguintes concentrações: 832, 485, 250, 122, 48,6, 24,3, 12,0, 4,72, 2,36, 0,853, 0,638, 0,405, 0,327 e 0,221 nCi equiv./mL. As concentrações baixas, médias e elevadas de GC foram de 12,39, 25,9 e 508 nCi equiv./mL.

Imediatamente após eutanasia, cada rato foi totalmente imerso num banho de hexano e gelo seco (-75 °C) até congelar. Cada carcaça foi seca e armazenada a -30 °C até ser inserida. Cada animal foi inserido num molde (15 cm x 45 cm) por adição de carbosimetilcelulose a 10% (CMC) de viscosidade reduzida e congelado por colocação da fase numa mistura de hexano-gelo seco.

Os blocos congelados foram transferidos para Jung Cryomacrocut 3000 (Leica Instruments GmbH, Nussloch, Alemanha) e deixados a equilibrar, de um dia para o outro, para a temperatura interna do críotomo durante, pelo menos, 12 horas antes do seccionamento. 63

Cada rato congelado foi seccionado sagitalmente a -20 °C. Foi recolhido um número suficiente de secções de modo a garantir uma amostra de todos os tecidos de interesse. As secções foram desidratadas de um dia para o outro numa criocâmara e, depois, transferidas rapidamente para um dissecador contendo CaS04, para prevenir a condensação da humidade atmosférica enquanto se equilibra a temperatura ambiente. As secções foram colocadas em cartão e marcadas com tinta preta marcada com [14C] com um número de identificação único. A tinta radioactiva foi preparada com volumes iguais de Tinta da índia e [14C]-CL-284846 (100 microCi/mL) . Foi colocado um pequeno pedaço de fita adesiva sobre a tinta radioactiva seca para prevenir contaminação das telas de armazenamento de fósforo.

As placas de fósforo de imagiologia, BAS-SR 2025 (Fuji Photo Film Co., Japan) foram expostas a luz visível brilhante durante 20 minutos utilizando um removedor IP (Raytest, USA Inc., New Castle, DE) para remover a radiação de fundo. As secções e padrões de sangue de calibração foram colocados simultaneamente em contacto directo com Ips e expostos durante 7 dias. Todas as secções foram armazenadas à temperatura ambiente numa caixa forrada a chumbo para minimizar os níveis de fundo. As imagens de fósforo foram geradas utilizando um Analisador de Bio-Imagens Fujifilm BAS-5000 e quantificadas pelo Software MCID M2, versão 3.2 (Imaging Research Inc., St. Catherines, Ontario, Canada). Os STD e QC foram analisados utilizando uma ferramenta de amostragem circular no software MCID. As áreas de interesse nas secções do corpo total foram manualmente delineadas com a ferramenta de amostragem regional para gerar os dados de cortagem. 64

As concentrações radioactivas nos tecidos seleccionados foram determinadas por análise digital dos autorradiogramas resultantes, com base numa curva de calibração. Foi gerada uma curva de calibração das concentrações indicadas (nCi/g) versus resposta da MCID, luz foto-estimulada/mm2 (PSL/mm2 menos o fundo convertido em nCi/g) para cada um dos padrões, por análise de regressão linear ponderada (1/x2) . A curva de regressão linear foi depois utilizada para determinar a concentração da radioactividade não conhecida das amostras de estudo. As regiões de interesse (ROI) que exibiram visualmente níveis de radioactividade, foram delineadas ou auto-avaliadas individualmente com ferramentas de amostragem para obter as concentrações de radioactividade. Para determinar o limite da quantificação para QWBAR, foram determinados os coeficientes de variação dos padrões de sangue testados e o limite da quantificação foi definido como a concentração mais baixa, à qual os coeficientes de variação não excedem os 15%.

As aliquotas de plasma forma combinadas com 10 mL de cocktail de contagem de cintilação Ultima Gold™ (Packard Inc.) e contadas directamente. As amostras de sangue foram submetidas a combustão utilizando um dispositivo de oxidação de amostras Modelo 307 (Packard Instrument Company). O [ 14C]O2 resultante foi capturado no Carbo-Sorb®, foi adicionado um cocktail de cintilação (PermaFlour®E+) e as amostras foram quantificadas por LSC.

As amostras foram contadas num espectrómetro de cintilação líquida Packard 2700 tr (Canberra-Packard Co.) durante 10 minutos ou 0.2 sigma. As contagens por minuto foram convertidas em desintegrações por minuto por utilização de uma curva de atenuação gerada a partir de padrões externos de 65 radioactividade conhecida. A atenuação de cada padrão e amostra foi determinada por desvio espectral total. 0 limite de quantificação (LOQ) para LSC foi definido como duas vezes o fundo.

Os parâmetros de farmacocinética para a radioactividade derivada de [14C]-GAR-936 foram calculados utilizando infusão intravenosa (Modelo 202), o Módulo de Análise Não

Compartimentada da WinNonlin, ver. 1.1, (Scientific Consultants, Inc. Research Triangle Park, NC) que aplica uma abordagem independente do modelo e processos convencionais como descrito em Gibaldi e Perrier. Gibaldi, Pharmacokinetics, 1982. Na determinação da concentração média, o zero foi substituído por quaisquer valores que sejam inferiores ao limite de quantificação (5,10 ng equiv./g). Para a dosagem da infusão IV, C30 min foi a concentração aos 30 minutos, o primeiro ponto de tempo de amostragem. A concentração plasmática máxima (Cmax) e o tempo correspondente da concentração máxima após administração IV, foram obtidos directamente por inspecção numérica a partir dos dados individuais de concentração-tempo. O tempo de meia vida terminal foi calculado pela razão 1η2/λζ, onde λζ é derivado do declive terminal da curva de concentração-tempo. A área sobre a curva de concentração plasmática versus tempo, de zero ao infinito, foi calculada utilizando a regra do trapézio, onde Cúitima é a ultima concentração plasmática mensurável. As razões de concentração de tecido para plasma foram calculadas de acordo com a seguinte equação: Ctecido/CpiaSma, onde Ctecido é igual à concentração de fármaco no tecido (ng equiv./g) e Cpiasma é igual à concentração de fármaco no plasma (ng equiv./g). A actividade específica da [14C]-tigeciclina (base) foi determinada por ensaio gravimétrico como sendo 43,94 pCi/mg (Tabela 1). A concentração da solução de dosagem foi de 66 1,02 mg/mL. Os animais receberam uma dose média de 3,09 ± 0,11/kg, comparada com uma dose alvo de 3 mg/kg.

Resultados

As concentrações individuais (ng equiv./g) da radioactividade total nos tecidos de ratos Sprague-Dawley, após uma infusão IV de 3 mg/kg de [14C]-tigeciclina, estão representadas na Tabela 6. Os parâmetros farmacocinéticos nos tecidos são apresentados na Tabela 7. As razões tecido para plasma são apresentadas na Tabela 8.

As concentrações máximas individuais (CmáX) da radioactividade total foram observadas no final da infusão para virtualmente todos os tecidos. Os tecidos com as concentrações mais elevadas de radioactividade foram os rins (7601 ng equiv./g), figado (7300 ng equiv./g) e baço (6627 ng equiv./g) (Tabela 7) . Os tecidos com a concentração máxima mais baixa de radioactividade foram o cérebro (54 ng equiv./g) e os olhos (108 ng equiv./g) (Tabela 7). O Cmáx foi superior a 2000 ng equiv./g para a maioria dos tecidos (70%). A radioactividade derivada da tigeciclina para a Cmáx foi inferior no plasma relativamente a todos os outros tecidos, excepto no cérebro, olhos, gordura e testículos (Tabela 7). Às 24 h, todos os tecidos excepto os olhos apresentaram concentrações elevadas de radioactividade derivada de [14C] (Tabela 6) relativamente ao plasma.

As concentrações individuais de radioactividade nos tecidos às 168 horas, para a maioria dos tecidos, diminuiu para 1% ou menos, relativamente à sua Cmáx, com excepção para o osso, rim, 67 fígado, pele, baço e tiróide (Tabela 6). Às 336 horas, a maioria dos tecidos apresentava concentrações abaixo do limite de quantificação (5,10 ng. equiv./g) excpto o osso, rim, pele e tiróide. No entanto, as concentrações nestes tecidos (osso, tiróide, reim e pele) foram muito reduzidas em relação à Cmáx. No geral, as concentrações tecidulares de radioactividade derivada de [14C]-tigeciclina no osso, rim, pele e tiróide às 336 horas foram de 19%, 0,18%, 0/43% e 6% da Cmáix, respectivamente.

Utilizando a AUC como uma medida da carga tecidular, o osso e a tiróide apresentaram uma carga muito superior relativamente a qualquer outro tecido. Os valores de AUC mais elevados foram observados no osso (794704 ng eq-h/g), tiróide (330047 ng eq-h/g), glândula salivar (110979 ng eq-h/g), rim (70704 ng eq-h/g), tiróide (33047 ng eq-h/g), baço (70522 ng eq-h/g) e figado (53527 ng eq-h/g). Os tecidos com a carga mais baixa foram o cérebro (2865 ng eq-h/g), gordura (3500 ng eq-h/g) e testículos (10303 ng eq-h/g). A exposição à AUC no osso foi duas vezes superior à do tecido seguinte mais elevado (tiróide). Os valores da razão AUC no Tecidorplasma foram superiores a um, para a maioria dos tecidos (Tabela 7) . O tempo de meia vida terminal para a radioactividade derivada de [14C]-tigeciclina variou de um mínimo de 5 horas na gordura até mais de 200 horas no osso e tiróide, comparativamente ao osso e tiróide, comparativamente com um ti/2 no plasma de 24 horas (Tabela 7). Os tecidos com o tempo de meia vida de eliminação mais elevado foram a tiróide (804 horas), osso (217 horas), pele (182 horas) e rim (118 horas) (Tabela 7).

As razões de concentração tecidorplasma (Tabela 8) foram superiores a um para a maioria dos tecidos, com a excepção do 68 cérebro, olhos, testículos e gordura nos pontos de tempo de 0,5 e 8,5 horas. Às 24 horas, todas as razões foram superiores a um. As razões tecido para plasma mais elevadas, verificaram-se, para alguns tecidos, às 72 horas: osso (414), tiróide (56), pele (19,3), baço (16,7) e rim (11,1). As razões sanguerplasma foram superiores a um para todos os pontos de tempo, sugerindo que ocorre uma partição substancial da radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina para os glóbulos vermelhos.

Foi também avaliada a distribuição da radioactividade derivada da [ 14C] — tigeciclina para os tecidos contendo melanina (pele e tracto uveal) em ratos Long-Evans, até 336 horas pós-dose. As concentrações no sangue e plasma de radioactividade derivada de [14C]-tigeciclina em ratos Long-Evans, foram semelhantes para os ratos Sprague-Dawley (Tabelas 2 e 5) . As concentrações de radioactividade máxima (Cmáx) foram observadas no final da infusão (0,5 hora) para a pele, tracto uveal, plasma e sangue (Tabela 9). A Cmax da radioactividade derivada a [14C]-tigeciclina na pele e tracto uveal foi de 1997 e 2502 ng equiv./g, respectivamente. O AUC [14C] da radioactividade derivada da [14C] -tigeciclina na pele e tracto uveal foi de 109296 e 233288 ng equiv-h/g, respectivamente. Os tempos de meia vida terminal para a pele e tracto uveal foram de 473 e 20 horas, respectivamente (Tabela 10) . Os valores para o tempo de meia vida são de significado questionável uma vez que as fases de eliminação no perfil concentração-tempo poderão não ser identificadas com certeza. Isto reflecte-se também na extrapolação dos dados de AUC para o tracto uveal e pele.

As razões de concentração tecido:plasma foram superiores a um para a pele e tracto uveal para todos os pontos de tempo (Tabela 7) . As razões tecido para plasma globais mais elevadas, 69 foram observadas às 72 horas na pele (179) e tracto uveal (393). As razões de AUC tecido:plasma foram de 8,45 e 18,0 para a pele e tracto uveal, respectivamente e indicam que estes tecidos retêm selectivamente concentrações significativas de radioactividade derivada de [14C]-tigeciclina. Os dados sugerem que a radioactividade é selectivamente particionada na região contendo melanina do olho do rato. As concentrações médias de radioactividade nos tecidos às 336 horas, para a pele e tracto uveal, diminuíram para 8 e 1% da Cmáx, respectivamente.

Tabela 6

Concentrações Médias da Radioactividade Total nos Tecidos Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Sprague-Dawley Tipo de Tecido 0,5 h 8,5 h 24 h 72 h 168 h 336 h Sangue 1277 624 44, 5 11, 8 1, 87 <1, 03 Plasma 895 504 14, 8 4,31 <1,03 <1,03 Glândula Adrenal 3580 941 68, 9 19, 3 <5,10 <5, 10 Osso 3312 3794 2711 1787 1526 720 Medula Óssea 4376 1562 291 22, 5 <5, 10 <5, 10 Cérebro 35, 8 54,3 35, 8 13, 3 <5, 10 <5, 10 Olhos 106 108 36, 6 6,76 <5, 10 <5, 10 Gordura 450 144 <5, 1 <5, 10 <5,10 <5, 10 Coração 5657 1138 69, 9 6,98 <5,10 <5, 10 Rim 7601 1725 140 47, 9 41,3 13,9 Fígado 7300 1192 160 22, 7 13,3 <5, 10 Pulmão 2981 496 73, 1 13, 5 <5,10 <5, 10 Nódulo Linfático 3473 1276 180 29, 1 <5,10 <5, 10 Músculo 2260 1863 85, 8 6,24 <5,10 <5, 10 Pancreas 4437 971 70, 0 7,41 <5,10 <5, 10 Pituitária 3693 2014 144 18, 8 <5,10 <5, 10 Glândula Salivar 5771 6313 300 31, 6 <5,10 <5, 10 70 (continuação)

Concentrações Médias da Radioactividade Total nos Tecidos Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Sprague-Dawley Pele 1929 577 249 83, 1 7, 32 8,34 Baço 6627 1691 476 72, 0 18,8 <5,10 Testículos 347 361 119 16, 4 <5,10 <5,10 Timo 2528 1590 158 15, 3 <5,10 <5,10 Tiróide 2992 1762 354 242 218 187

Tabela 7

Parâmetros Farmacocinéticos da Radioactividade Total nos Tecidos Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Sprague-Dawley Tipo de Tecido Cmáx Ng equiv/g Tl/2 AUC Ng eq h/g AUC Ng eq h/g AUC Tecido:Plasma Sangue 1277 105 12063 1261 1,15 Plasma 895 24 10643 10652 1, 00 Glândula Adrenal 3580 13 29153 29515 2, 77 Osso 3794 217 569498 794704 74,6 Medula Óssea 4376 11 47116 47468 4, 46 Cérebro 54 32 2256 2865 0, 269 Olhos 108 17 3060 3221 0,302 Gordura 450 5 2489 3500 0,329 Coração 5657 9 40083 40179 3, 77 Rim 7601 118 68333 70704 6, 64 Fígado 7300 44 ^ 52676 53527 5, 03 Pulmão 2981 1 13 21263 21523 2, 02 Nódulo 3473 13 36478 37010 3, 47 71 (continuação)

Parâmetros Farmacocinéticos da Radioactividade Total nos Tecidos Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [ 14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Sprague-Dawley Tipo de Tecido Cmáx Ng equiv/g Tl/2 AUC Ng eq h/g AUC Ng eq h/g AUC Tecido:Plasma Linfático Músculo 2260 8 34833 34910 3,28 Pancreas 4437 10 32908 33014 3,10 Pituitária 3693 10 44882 45164 4, 24 Glândula Salivar 6313 9 110558 110979 10,4 Pele 1929 182 31819 36471 3, 42 Baço 6627 33 69638 70522 6,62 Testículos 361 15 9975 10323 0, 97 Timo 2528 10 35204 35430 3,33 Tiróide 2992 804 113022 330047 31,0

Tabela 8

Razão Tecido:Plasma Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Sprague-Dawley Sangue 0,5 h 8,5 h 24 h 72 h 168 336 h h Plasma 1, 43 1, 24 3,01 2,74 ND ND Glândula 1,00 1, 00 1,00 1,00 ND ND Adrenal Osso 4,00 1, 87 4, 67 4,47 ND ND Medula Óssea 3, 70 7, 53 184 414 ND ND 72 (continuação)

Razão Tecido:Plasma Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Sprague-Dawley Cérebro 4, 89 3, 10 19, 7 5,21 ND ND Olhos 0, 040 0,108 2, 42 3,10 ND ND Gordura 0,118 0, 215 2, 46 1,57 ND ND Coração 0,50 0, 287 NA NA ND ND Rim 6,32 2, 26 4, 74 1,62 ND ND Figado 8, 49 3, 42 9, 49 11,1 ND ND Pulmão 8,16 2, 37 10, 8 5,26 ND ND Nódulo Linfático 3,33 0, 984 4,96 3,13 ND ND Músculo 3, 88 2, 53 12,2 6,75 ND ND Pancreas 2,52 3, 70 5, 801 1,45 ND ND Pituitária 4, 96 1, 93 4, 75 1,72 ND ND Glândula Salivar 4,13 4, 00 9, 79 4,36 ND ND Pele 6,45 12,53 20,3 7,32 ND ND Baço 2,15 1, 14 16,9 19,3 ND ND Testículos 7, 40 3, 36 32,3 16,7 ND ND Timo 0,388 0, 716 CG O co 3,80 ND ND Tiróide 2, 82 3, 16 10, 7 3,55 ND ND Sangue 3,34 3, 50 24, 0 56,0 ND ND 73

Tabela 9

Concentração Média (ng equiv./g) da Radioactividade Total nos Tecidos Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Long-Evans Tipo de Tecido 0,5 h 8,5 h 24 h 72 h 168 h Sangue 1296 340 11, 8 2, 72 1,24 Plasma 975 70.5 4,31 <1, 03 <1, 03 Tracto Uveal 1997 124 96,5 74, 8 19,3 Pele 2502 2363 1787 351 211

Tabela 10

Parâmetros Farmacocinéticos da Radioactividade Total nos Tecidos Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Long-Evans Tipo de Tecido Cmax Ng equiv/g Tl/2 AUC Ng eq hr/g AUC Ng eq hr/g AUC Tecido:Plasma Sangue 1296 62 21843 21954 1,70 Plasma 975 19 12923 12938 1,00 Pele 1997 473 58287 109296 8,45 Tracto Uveal 2502 201 131346 233288 18,0 74

Tabela 11

Razão Tecido:Plasma Após uma Infusão Única de 30 Minutos de [14C]-Tigeciclina em Ratos Machos Long-Evans Sangue 0,5 h 24 h 72 h 168 h 336 h Plasma 1, 33 4, 81 5, 05 5, 05 ND Pele 1, 00 O 0 1 1 1, 00 1,00 ND Tracto Uveal 2, 05 8, 76 179 179 ND Sangue 2, 57 25,7 393 393 ND

Discussão A distribuição da radioactividade nos tecidos foi avaliada após uma infusão intravenosa única de 30 minutos de [14C]-tigeciclina em ratos Sprague-Dawley e Long-Evans. A radioactividade distribuiu-se rapidamente para os tecidos, com Cmáx, observada no final da infusão (0,5 h) para a maioria dos tecidos. As concentrações nos tecidos foram semelhantes a um estudo efectuado previamente pelo método de dissecação de tecidos. A extensa distribuição da tigeciclina nos vários tecidos sugere um elevado volume de distribuição. Estas verificações confirmam a observação anterior de um elevado volume de distribuição em ratos e cães. Em geral, a eliminação da radioactividade da maioria dos tecidos foi mais lenta do que a velocidade a partir do plasma.

As concentrações de radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina nos tecidos de ratos Sprague-Dawley foram superiores às do plasma na maioria dos pontos de tempo. As concentrações de radioactividade nos tecidos às 168 horas, para 75 a maioria dos tecidos, diminuíram para 1% ou menos, relativamente aos seus valores no final da infusão. Às 336 horas, as concentrações no osso, tiróide, rim e pele diminuíram para 19%, 6,25%, 0,18% e 0,43% dos valores de Cmáx, respectivamente.

Os tecidos com os valores mais elevados de exposição em ratos Sprague-Dawley, como indicado pelos valores médios de AUC, foram o osso, tiróide, glândulas salivares, rim e baço. Os tempos de meia vida de eliminação foram muito longos (5 a 217 horas), com o osso, pele e tiróide apresentando os tempos de meia vida de eliminação mais elevados. O valor de tempo de meia vida para o tecido da tiróide é questionável uma vez que as fases de eliminação no perfil concentração-tempo poderão não ser identificados com certeza. Isto reflecte-se também na extrapolação dos dados de AUC para AUC.

As razões tecido-plasma e sangue-plasma foram superiores a um para todos os pontos de tempo, sugerindo que existiu um particionamento substancial da radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina para os tecidos e glóbulos vermelhos. Os resultados da razão tecido-plasma deste estudo são semelhantes aos resultados da razão tecido-plasma do rato após dosagem IV de minociclina.

Embora não ligado pela teoria, as concentrações de radioactividade elevadas no osso podem ser devidas à quelação da tigeciclina pelo cálcio. A capacidade das tetraciclinas (minociclina, coloretetraciclinas) para formarem complexos quelantes com o cálcio ou outros iões metálicos e, deste modo, aderirem ao osso, foi descrita na literatura. No estudo actual, a radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina foi 76 significativamente retida no osso, com uma AUC de 794704 ng equiv-h/g. Este valor é, aproximadamente, 75 vezes superior ao do plasma. Foi também observado no osso, um tempo de meia vida de eliminação aparente de 217 horas. A retenção da radioactividade no osso pode contribuir para a recuperação um tanto incompleta (89,4 ± 2,50%) da [14C]-tigeciclina num estudo de equilíbrio de massa em ratos machos Sprague-Dawley, observada após uma dose intravenosa de 5 mg/kg. A exposição (AUC) no osso foi 2,5 vezes superior à do tecido seguinte mais elevado (tiróide). A radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina demonstrou também uma forte afinidade e tempo de meia vida longo para os tecidos ósseos e da tiróide, que é também semelhante para outras tetraciclinas conhecidas.

As concentrações de radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina foram detectáveis até às 336 horas no rim e foram superiores às dos outros tecidos excepto para o osso e tiróide. No entanto, no estudo de equilíbrio de massa, bem como no estudo da excreção biliar e urinária, a maioria da radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina foi excretada nas primeiras 48 horas, sugerindo que alguma radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina pode estar ligada, com uma afinidade elevada, ao tecido do rim. A ligação ao tecido do rim é também conhecida com as tetraciclinas.

Como determinado por QWBAR, a radioactividade presente nos tecidos oculares do rato foi selectivamente particionada apenas nos tecidos contendo melanina do tracto uveal, além da pele nos ratos Long-Evans. O tracto uveal apresentou concentrações relativamente elevadas de radioactividade para todos os pontos de tempo após as 0,5 horas, sugerindo um nível significante de exposição e um tempo de meia vida longo. Num estudo previamente 77 efectuado utilizando um método de dissecação dos tecidos, a avaliação do glóbulo ocular intacto revelou radioactividade presente neste órgão; no entanto, não foi possivel associar a localização desta radioactividade com qualquer tecido ocular especifico.

As concentrações dos 14 padrões e 28 QCS, determinadas por contagem de cintilação liquida convencional (LSC), foram semelhantes às das avaliações por QWBAR, para estes mesmos padrões. A exposição destes padrões a 14 telas de fósforo de armazenamento diferentes, resultou numa resposta de MCID fiável que está correlacionada com as actividades especificas determinadas por LSC, sugerindo que a variabilidade intra-dia e inter-dia foi muito baixa. 0 CV e precisão do método QWBAR estavam dentro de limites aceitáveis 20%). A reprodutibilidade da resposta de MCID e boa correlação das actividades especificas entre o LSC convencional e QWBAR, demonstraram que os padrões RBC eram de concentração de radioactividade uniforme. A variabilidade observada neste estudo foi considerada como estando relacionada com vários aspectos do criosseccionamento, técnica de QWBAR e análise por imagiologia. O QWBAR demonstrou ser reprodutível com uma sensibilidade de 0,221 nCi/g (limite inferior de quantificação). A gama dinâmica foi linear ao longo de quarto ordens de magnitude, de 0,221 a 832 nCi/g.

Em conclusão, as concentrações de radioactividade derivada da [14C] -tigeciclina nos tecidos, foram superiores para a maioria dos tecidos comparativamente às concentrações no plasma. Em geral, a eliminação da radioactividade da maioria dos tecidos foi inferior à velocidade a partir do plasma. A AUC foi superior para a maioria dos tecidos relativamente ao plasma, sugerindo 78 que a maioria dos tecidos foram lentos na eliminação da radioactividade derivada da [14C]-tigeciclina.

Lisboa, 2 de Outubro de 2008 79

Claims (44)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção no osso ou medula óssea num mamífero.
2. 2. Utilização da reivindicação 1, em que o tratamento compreende também a administração de um agente antimicrobiano seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina.
3. 3. Utilização da reivindicação 2, em que o antimicrobiano é rifampina.
4. 4. Utilização da reivindicação 1, 2 ou 3, em que a infecção é compreendida por um patogéneo seleccionado do grupo que consistindo de bactérias gram negativas, bactérias gram positivas, bactérias anaeróbias e bactérias aeróbias.
5. 5. Utilização da reivindicação 4, em que o patogéneo é seleccionado do grupo consistindo de Staphylococcus, Acinetobacter, Mycobacterium, Haemophilus, Salmonella, Streptococcus, Enterobacteriaceae, Enterococcus, Escherichia, Pseudomonas, Neissería, Rickettsia, Pneumococci, Prevotella, Peptostreptococci, Bacteroides Legionella, estreptococos beta-haemolíticos, estreptococos do grupo B e spirochaetes.
6. 6. Utilização da reivindicação 5, em que a infecção é compreendida por Neisseria, Mycobacterium, Staphylococcus e Haemophilus.
7. 7. Utilização da reivindicação 6, em que a infecção é compreendida por Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ou Haemophilus influenzae.
8. 8. Utilização da reivindicação 4, onde o patogéneo exibe resistência a antibiótico.
9. 9. Utilização da reivindicação 8, onde a resistência a antibiótico é seleccionada do grupo consistindo de resistência à meticilina, resistência ao glicopéptido, resistência à tetraciclina, resistência à oxitetraciclina, resistência à doxiciclina; resistência à clortetraciclina, resistência à minociclina, resistência à glicilciclina, resistência à cefalosporina, resistência à ciprofloxacina, resistência à nitrofurantoina, resistência à trimetoprim-sulfa, resistência à piperacilina/tazobactam, resistência à moxifloxacina, resistência à vancomicina, resistência à teicoplanina, resistência à penicilina e resistência aos macrólidos.
10. 10. Utilização da reivindicação 9, onde a resistência ao glicopéptido é a resistência à vancomicina.
11. 11. Utilização da reivindicação 5, onde o patogéneo é seleccionado do grupo consistindo de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae ou Streptococcus pyogenes. 2
12. 12. Utilização da reivindicação 11, onde a infecção é compreendida por Staphylococcus aureus.
13. 13. Utilização da reivindicação 12, onde o Staphylococcus aureus exibe uma resistência a antibiótico seleccionada do grupo consistindo de resistência ao glicopéptido, resistência à tetraciclina, resistência à minociclina, resistência à meticilina, resistência à vancomicina e resistência a um outro antibiótico de glicilciclina que não a tigeciclina.
14. 14. Utilização da reivindicação 5, onde a infecção é compreendida por Acinetobacter baumannii.
15. 15. Utilização da reivindicação 14, onde o Acinetobacter baumanii exibe uma resistência a um antibiótico seleccionado do grupo consistindo de resistência à cefaloesporina, resistência à ciprofloxacina, resistência à nitrofurantoina, resistência à trimetoprima-sulfa e resistência à piperacilina/tazobactam.
16. 16. Utilização da reivindicação 5, onde a infecção é compreendida por Mycobacterium abscessus.
17. 17. Utilização da reivindicação 16, onde o Mycobacterium abscessus exibe resistência à moxifloxacina.
18. 18. Utilização da reivindicação 5, onde a infecção é compreendida por Haemophilus influenzae.
19. 19. Utilização da reivindicação 5, onde a infecção é compreendida por Enterococcus faecium. 3
20. 20. Utilização da reivindicação 5, onde a infecção é compreendida por Escherichia coli.
21. 21. Utilização da reivindicação 5, onde a infecção é compreendida por Neisseria gonorrhoeae.
22. 22. Utilização da reivindicação 5, onde a infecção é compreendida por Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi ou Rickettsia rickettsii.
23. 23. Utilização da reivindicação 4, em que a infecção provoca osteomielite.
24. 24. utilização de uma quantidade farmacologicamente eficaz de tigeciclina, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção da articulação ou uma infecção dos tecidos circundantes à articulação num mamífero.
25. 25. Utilização da reivindicação 24, em que o tratamento compreende também administrar um agente antimicrobiano seleccionado do grupo consistindo de rifamicina, rifampina, rifapentina, rifaximina ou estreptovaricina.
26. 26. Utilização da reivindicação 25, onde o antimicrobiano é rifampina.
27. 27. Utilização da reivindicação 24, 25 ou 26, onde a infecção é constituída por um patogéneo seleccionado do grupo consistindo de bactérias gram negativas, bactérias gram positivas, bactérias anaeróbias e bactérias aeróbias. 4
28. 28. Utilização da reivindicação 27, onde o patogéneo é seleccionado do grupo consistindo de Staphylococcus, Acinetobacter, Mycobacterium, Haemophilus, Salmonella, Streptococcus, Enterobacteriaceae, Enterococcus, Escherichia, Pseudomonas, Neisseria, Rickettsia, Pneumococci, Prevotella, Peptostreptococci, Bacteroides Legionella, estreptococos beta-haemoliticos, estreptococos do grupo B e spirochaetes.
29. 29. Utilização da reivindicação 28, em que a infecção é compreendida por Neisseria, Mycobacterium, Staphylococcus e Haemophilus.
30. 30. Utilização da reivindicação 29, em que a infecção é compreendida por Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ou Haemophilus influenzae.
31. 31. Utilização da reivindicação 27, onde o patogéneo exibe resistência a antibióticos.
32. 32. Utilização da reivindicação 31, onde a resitência a antibióticos é seleccionada do grupo consistindo de resistência à meticilina, resistência ao glicopéptido, resistência à tetraciclina, resistência à oxitetraciclina, resistência à doxiciclina; resistência à clortetraciclina, resistência à minociclina, resistência à glicilciclina, resistência à cefalosporina, resistência à ciprofloxacina, resistência à nitrofurantoina, resistência a trimetoprim-sulfa, resistência à piperacilina/tazobactam, resistência à moxifloxacina, resistência à vancomicina, 5 resistência à teicoplanina, resistência à penicilina e resistência aos macrólidos.
33. 33. Utilização da reivindicação 32, onde a resistência ao glicopéptido é a resistência à vancomicina.
34. 34. Utilização da reivindicação 28, onde o patogéneo é seleccionado do grupo consistindo de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae ou Streptococcus pyogenes.
35. 35. Utilização da reivindicação 34, onde a infecção é compreendida por Staphylococcus aureus.
36. 36. Utilização da reivindicação 35, onde o Staphylococcus aureus exibe uma resistência a antibiótico seleccionada do grupo consistindo de resistência ao glicopéptido, resistência à tetraciclina, resistência à minociclina, resistência à meticilina, resistência à vancomicina e resistência a um outro antibiótico de glicilciclina que não a tigeciclina.
37. 37. Utilização da reivindicação 28, onde a infecção é compreendida por Acinetobacter baumannii.
38. 38. Utilização da reivindicação 37, onde o Acinetobacter baumanii exibe uma resistência a antibiótico seleccionada do grupo consistindo de resistência à cefaloesporina, resistência à ciprofloxacina, resistência à nitrofurantoina, resistência à trimetoprima-sulfa e resistência à piperacilina/tazobactam. 6
39. 39. Utilização da reivindicação 28, onde a infecção é compreendida por Mycobacterium abscessus.
40. 40. Utilização da reivindicação 39, onde o Mycobacterium abscessus exibe uma resistência à moxifloxacina.
41. 41. Utilização da reivindicação 28, onde a infecção é compreendida por um patogéneo seleccionado do grupo consistindo de Haemophilus influenzae, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Rickettsía prowazekii, Ríckettsía typhi ou Rickettsia rickettsii.
42. 42. Utilização da reivindicação 27, onde a infecção da articulação ou infecção dos tecidos circundantes da articulação provoca artrite séptica.
43. 43. Utilização da reivindicação 1 ou 2, em que a infecção do osso ou medula óssea provoca osteomielite.
44. 44. Utilização da reivindicação 24 ou 25, em que a infecção da articulação ou infecção dos tecidos circundantes da articulação provoca artrite séptica. Lisboa, 2 de Outubro de 2008 7 1/7 Farmacocinéticas - Gar-936, 14 mg/kg, BID (5 Coelhos Não Infectados Tratados durante 8 Dias) *<d υ* id u p μιc g «u U θ'c a θ' C O H ^1 (D Ο t Ό fdu c •Η O +J N U id & t 0 η U Φ 6 o •H i«j U» O -H id Ό id H O & u P a ω

    Erro Y da Estimativa da Extrapolação: Soro=l,0,62 ag/mL Tempo aproximado da Recolha de Amostras de Soro em Horas (Após a Primeira Dose de Gar-936) Fig 1. Farmacocinéticas em Coelhos Brancos Normais da Nova Zelândia 2/7 Pontuação radiográfica Média Por Grupo 2 semanas e 8 semanas após-infecção

    Grupos de Tratamento Fig. 2. São apresentadas as pontuações Médias Radiográficas ao dia 14 e dia 56 de cada grupo. Controlo = grupo de controlo, sem tratamento; Vancomicina = grupo tratado com vancomicina subcutânea; Van + Rifam = grupo tratado com vancomicina subcutânea e rifampina oral; GAr-936 = grupo tratado com Gar-936 subcutânea; Gar + Rifam = grupo tratado com Gar-936 subcutânea e rifampina oral. 3/7 FIGURA 3 Recuperação do MRSA do Estudo da Osteomielite em Coelhos 80 de culturas positivas

    Controlo Tigeciclina Tige + Vanco Vanco + Rifam Rifamp Tratamento *Indica diferença significativa em relação ao controlo p ^ 0,004 4/7

    Variações de Peso Por Grupo de Tratamento Linha de tempo experimental Fig 4a. É apresentado o peso médio do grupo durante a experiência Controlo = grupo de controlo, sem tratamento; Vancomicina = grupo tratado com vancomicina subcutânea; Vanco + Rifampina = grupo tratado com vancomicina subcutânea e rifampina oral; GAr-936 = grupo tratado com Gar-936 subcutânea; Gar + Rifampina = grupo tratado com Gar-936 subcutânea e rifampina oral. 5/7 Variações do Peso por Grupo de Tratamento b< 0 5.5 s 0) 0Q. P n o n 0o. u H O C H h 2.5· 1.5 0.5 1

    Q Controlo 0 Vancomicina g vanco + Rifampina 0 Gar-936 0 Gar-936 + Rifarrp

    mi Ponto Final Linha de tempo experimental Fig 4b. É apresentado o peso médio inicial e final em cada grupo de tratamento. Controlo = grupo de controlo, sem tratamento; Vancomicina = grupo tratado com vancomicina subcutânea; Vanco + Rifampina = grupo tratado com vancomicina subcutânea e rifampina oral; GAr-936 = grupo tratado com Gar-936 subcutânea; Gar + Rifampina = grupo tratado com Gar-936 subcutânea e rifampina oral. 6/7 Figura 5A Concentração Máxima e Mínima do Gar-936 no Soro de Coelho Gar-936, 14 mg/kg BID, SC. As amostras de soro foram recolhidas 1 hora e 12 horas após a primeira dosagem. Máximo (1 hora) Coelho Grupo Diâmetrol (mm) Diâmetro2 (mm) Diâmetro3 (mm) Média dos Diâmetros Desvio Padrão Erro Padrão da Média 117 2 16,5 16,5 16,5 16,50 0, 0 0, 00 119 2 18 18 18 18,00 0, 0 0, 00 120 2 16,5 16,5 16,5 16,50 0, 0 0, 00 125 2 17 17,2 17,5 17,23 0,2 0,12 126 2 16,5 16,5 16,5 16,50 0, 0 0, 00 128 2 16,5 16,5 16,5 16,50 0, 0 0, 00 16,87 , ‘ 0,21 -2,60196 -2,60438 - - í 1,62 ,· .......... .............................M&HUffo <12 horas·) ................. Coelho Grupo Diâmetrol (mm) Diâmetro2 (mm) Diâmetro3 (mm) Média dos Diâmetros Desvio Padrão Erro Padrão da Média 117 2 14 14 14 14,00 0, 0 0,00 119 2 14 14 14 14,00 0, 0 0,00 120 2 14 13,2 13,60 0, 4 0, 23 125 2 13,2 14 13,60 0, 4 0, 23 126 2 14 13 13,50 0, 5 0,29 128 2 14 13 13,50 0, 5 0,29 lliiBeBlieSiiil! 13r78 . • 0,32 , , COhí, j<> S3Ç: nq/aif. .........ΐ>,48......... ..........crm......... ..... Q'm......... 7/7 Figura 5B Concentração Máxima e Mínima da Vancomicina no Soro de Coelho Vancomicina: 30 mg/kg BID, SC. As amostras de soro foram recolhidas 1 hora e 12 horas após a primeira dosagem. Coelho Grupo Diâmetrol (mm) Diâmetro2 (mm) Diâmetro3 (mm) Maxim Média dos Diâmetros > (1 hora) Desvio Padrão Erro Padrão da Média 100 1 18,4 19 18,70 0, 3 0,17 102 1 17, 2 17, 2 16 16,80 0, 6 0, 33 107 1 18,8 18,8 18,8 18,80 0, 0 0,00 108 1 12,3 12,3 12,30 0, 0 0,00 109 1 16,3 16,30 0, 0 0,00 113 1 18,4 18,4 18,4 18,40 0, 0 0,00 16,88 , .........0,51......... ·.·. : - \.....' ·" : : : 3,26 WÊÈÊÈÊÈÊÈ Mínimo (12 horas) Coelho Grupo Diâmetrol (mm) Diâmetro2 (mm) Diâmetro3 (mm) Média dos Diâmetros Desvio Padrão Erro Padrão da Média 100 1 8 8 8 8,00 0, 0 0,00 102 1 8 8 8 8,00 0, 0 0,00 107 1 10,5 10,5 10,5 10,50 0, 0 0,00 108 1 8 8 8 8,00 0, 0 0,00 109 1 11,5 11,5 11,8 11,60 0, 1 0,08 113 1 13, 4 13, 4 13,4 13,40 0, 0 0,00 444444444:fSâÍ®f:^SS:4:|MiSSÍ£:a::f:44Í®444444444444 íssSaraess^ 8,92 8,35 0,44 , , · 1 ’ -, - 1 ’ 7