CN1889957A - 替加环素单独或与利福平联合治疗骨髓炎和/或脓毒性关节炎的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗骨或骨髓感染、关节感染或关节周边组织感染的方法，包括单独给予替加环素抗生素或联合利福霉素抗生素。在优选实施方案中，骨或骨髓感染引起骨髓炎。在另一个优选实施方案中，关节感染或关节周边组织感染引起脓毒性关节炎。本发明还涉及单独使用替加环素或联合利福平治疗骨和/或骨髓感染、或关节感染和/或关节周边组织感染的药物的制备。

Description

替加环素单独或与利福平联合治疗骨髓炎和/或 脓毒性关节炎的应用
本申请要求了美国临时申请60/500,474的优先权，该临时申请于2003年9月5日提交，其全部内容在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及治疗由细菌感染引起或导致的骨髓炎和脓毒性关节炎的新型方法。本发明还涉及治疗骨、骨髓、关节和滑液的细菌感染。本发明还涉及治疗这些疾病和组织中的抗生素耐药性细菌的感染。
发明背景
二十世纪后半叶在抗菌剂开发中出现了显著进步。这一成功培养这样的认识：细菌疾病较任何其它主要的紊乱更易于治疗，但在二十世纪九十年代出现的多药-耐药生物体导致了严重的公共健康问题。耐药性已蔓延到先前敏感的生物体，并且一些生物体基本上对于所有批准的抗菌药耐药。
替加环素，其属于甘氨酰环素类抗生素，绕过了现存的微生物耐药机制。证明了其广谱抗菌活性，抑制多药耐药性革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和厌氧菌。替加环素具有抵抗大多数常见病原体的活性。替加环素具有抵抗下列病原体的活性，比如：甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药性肠球菌(包括粪肠球菌)、青霉素耐药性/大环内酯耐药性肺炎双球菌、普雷沃菌(Prevotellaspp.)、peptostreptococci、分枝杆菌和米诺环素耐药性生物体(Boucher等，Antimicrob Agents Chemother.2000；44(8)：2225-2229，Gales等，Antimicrob Agents Chemother.2000；46：19-36，Goldstein等，Antimicrob Agents Chemother.2000；44(10)：2747-2751)。替加环素适用于治疗呼吸病原体比如肺炎链球菌(青霉素敏感性和青霉素耐药性)、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、金黄色酿脓葡萄球菌(甲氧西林敏感性和甲氧西林耐药性)、厌氧革兰氏阴性杆菌和肠球菌(万古霉素敏感性和万古霉素耐药性肠球菌)。体内结果非常令人振奋并较所预期的基于血清中最低抑制浓度(MIC)以上的时间更佳。观察到替加环素是安全的抗菌药。
甲氧西林-耐药性葡萄球菌是骨和关节感染中最常见的生物体(Waldvogel，Infectious Diseases 1988：1339-1344)。治疗因这些微生物引起感染的选择是有限的：临床菌株对于喹诺酮、克林霉素、磺胺甲基异唑和利福平的敏感性是变化的，且该敏感性通常限于糖肽，其必需通过胃肠外途径给药。葡萄球菌对于糖肽类的耐药性已有描述并代表了主要的忧虑，因为那些药物被认为是治疗由甲氧西林-耐药性葡萄球菌引起严重感染的杰出标准物(Smith，等，N Engl J Med 1999；340：493-501)。
近来已将治疗甲氧西林-耐药性葡萄球菌感染的新型药物如奎奴普丁-达福普汀(quinupristin-dalfopristin)和利奈唑胺引入临床实践(Johnson，等，Lancet 1999；354：2012-2013，Livermore，J AntimicrobChemother 2000；46：347-350)。但是，对于治疗骨髓炎尚未进行完整的临床研究。
治疗急性和慢性整形外科感染是困难的，部分原因是许多感染是由抗生素耐药病原体引起的，部分是缘于感染部位。通常该疗法需要长期抗生素疗法和外科治疗(Lazzarini等，Curr Infect Dis Rep 2002：4：439-445)。已使用多种骨髓炎动物模型进行了若干研究(Rissing，Infect Dis Clin North Am 1990；4：377-390)。尽管使用长期抗生素疗法，在骨中仍发现了活细菌。从骨中根除更多细菌已与抗生素疗法的延长期相关联(Norden，Rev Infect Dis 1988；10：103-110)。抗生素治疗四周后，大多数抗生素方案不能从骨中根除葡萄球菌。
抗生素治疗骨髓炎在常规上是通过静脉内途径给药。但是，已在人类临床试验中成功地测验了治疗骨髓炎的口服方案(Bell，Lancet1968；10：295-297，Feigin等，Pediatr 1975；55：213-223，Slama等，Am J Med 1987；82(增刊4A)：259-261)。不幸地，当处理多药耐药性生物体时口服抗菌剂的选择受到限制，而且治疗多药耐药性生物体可能需要使用肠胃外药物(Tice，Infect Dis Clin North Am 1998；12：903-919)。
因此仍需要治疗由细菌尤其是抗生素耐药性细菌菌株感染引起的骨髓炎和/或脓毒性关节炎的方法。本发明满足了这些长期存在的需要。
发明简述
本发明提供了治疗哺乳动物优选人体内骨或骨髓感染(通常是指骨髓炎)和/或关节感染以及周边组织感染(通常是指脓毒性关节炎)的方法。本方法包括给予哺乳动物药理学有效量的替加环素和/或选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素的抗菌剂治疗感染。优选的抗菌剂是利福平。
感染可以由选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌和需氧菌引起。示例性的细菌包括葡萄球菌、不动杆菌、分枝杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌、链球菌、肠杆菌科、肠球菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、奈瑟氏球菌、立克次氏体、肺炎球菌、普雷沃菌、peptostreptococci、军团拟杆菌、β-溶血的链球菌、B组链球菌和螺旋体。优选地、该感染包括奈瑟氏球菌、分枝杆菌、葡萄球菌和嗜血杆菌且更优选脑膜炎奈瑟氏球菌、结核分枝杆菌、金黄色酿脓葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌或麻风分枝杆菌。
在优选实施方案中，感染包括显示抗生素耐药性病原体。示例性的抗生素耐药性包括甲氧西林耐药性、糖肽类耐药性、四环素耐药性、土霉素耐药性、强力霉素耐药性；氯四环素耐药性、米诺环素耐药性、甘氨酰环素耐药性、头孢菌素耐药性、环丙沙星耐药性、呋喃妥因耐药性、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺药耐药性、哌拉西林/他唑巴坦耐药性、莫西沙星耐药性、万古霉素耐药性、替考拉宁耐药性、青霉素耐药性和大环内酯耐药性。
优选的糖肽类耐药性是万古霉素耐药性。在另一个优选实施方案中，感染包括显示了选自糖肽类耐药性、四环素耐药性、米诺环素耐药性、甲氧西林耐药性、万古霉素耐药性以及除替加环素之外的甘氨酰环素抗生素耐药性的金黄色酿脓葡萄球菌。
在另一个实施方案中，感染包括鲍氏不动杆菌，其可以显示或不显示选自头孢菌素耐药性、环丙沙星耐药性、呋喃妥因耐药性、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺药耐药性和哌拉西林/他唑巴坦耐药性的抗生素耐药性。
在另一个实施方案中，感染包括可以显示或不显示莫西沙星耐药性的脓肿分枝杆菌。在其它实施方案中，感染包括流感嗜血杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、普氏立克次氏体、斑疹伤寒立克次氏体或立氏立克次氏体。
本发明还提供了药理学有效量的替加环素用于治疗哺乳动物骨髓炎和/或脓毒性关节炎的应用。在另一个实施方案中，本发明提供了药理学有效量的替加环素和选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素的抗菌剂治疗骨髓炎和/或脓毒性关节炎的应用。在另一个实施方案中，本发明提供了药理学有效量的替加环素用于制备治疗哺乳动物骨髓炎和/或脓毒性关节炎的药物的应用。在另一个实施方案中，提供了药理学有效量的替加环素和选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素的抗菌剂用于制备治疗哺乳动物骨髓炎和/或脓毒性关节炎的药物的应用。
附图简介
附图举例说明了本发明的某些实施方案并不意在限制本发明的范围。
图1表明替加环素在正常的新西兰白兔体内的药物动力学，经14mg/kg的替加环素治疗后12小时内其体内建立了超过最低抑制浓度的血清水平。
图2表明了研究者对于如X-射线影像所示的骨感染程度的分级。数据证明了替加环素以及替加环素与利福平联合与对照组相比可有效地治疗骨髓炎。
图3表明了在各治疗中每克骨髓和骨的集落生成单位，其证明替加环素以及替加环素与利福平联合与对照组相比可有效地治疗骨感染和骨髓感染。
图4A提供了给予各种抗菌剂的整个过程中兔体重的图示说明。
图4B提供了给予各种抗菌剂的整个过程中兔体重变化的图示说明。
图5A和5B表明了给予各药物后在受感染的兔血清内替加环素(14mg/kg每天两次)以及万古霉素(30mg/kg每天两次)的峰值和谷值。数据证明在整个治疗中抗生素的血清水平高于最低抑制浓度。
发明详述
本发明涉及治疗哺乳动物骨和骨髓感染的方法。优选地，哺乳动物是人。在一个优选实施方案中，骨和骨髓感染引起骨髓炎。骨髓炎是骨和/或骨髓的急性或慢性感染，并包括由于化脓菌感染引起的骨及其结构的相关炎症过程。与骨髓炎相关的感染可以是局部化的或者可以通过骨膜、皮质、髓和海绵状组织散布。引起骨髓炎的普通细菌性病原体基于患者的年龄和感染机制而改变。急性骨髓炎包括两种主要类型：血原性(heamatogenous)骨髓炎和直接或邻近接种(contiguousinoculation)骨髓炎。
血原性骨髓炎是由血液中撒播的细菌引起的感染。急性血原性骨髓炎的特征在于从远端源将细菌撒播于骨内而引起的骨急性感染。血原性骨髓炎主要发生于儿童体内。最常见的位点为生长骨的快速生长且高度血管化的干骨后端。由于血管在远干骺端成为锐角，血流明显减慢或淤积使得血管形成血栓并使得骨本身局部化坏死和细菌撒播。在x-射线影像中可见这些骨结构改变。急性血原性骨髓炎，尽管其名称为急性，但在临床上发展缓慢并具有起病隐袭。
直接或邻近接种骨髓炎是由在创伤或手术期间组织和细菌直接接触而引起的。直接接种(邻近-病灶)骨髓炎是继发于通过直接创伤接种生物体的骨内感染，从邻近感染灶散布或是外科操作后的脓毒症。直接接种骨髓炎的临床表现比血原性骨髓炎更局部化且倾向于包括多种生物体/病原体。
其它的类型包括慢性骨髓炎和继发于周边血管疾病的骨髓炎。慢性骨髓炎持续或重复发作，不管其起因和/或机理且不管攻击性手段的介入。虽然列为病因学，但是周边血管疾病事实上是诱病因素而不是真正的感染原因。
骨髓炎的症状通常包括高烧、疲劳、易怒和不适。通常，受感染的肢体或关节内的运动受到了限制。通常伴随感染出现局部水肿、红斑以及触痛，且在受影响的区域可存在温热感。在感染后期还可出现窦道排脓。血原性骨髓炎通常伴随出现缓慢的症状隐袭进展，而慢性骨髓炎可以包括非愈合溃疡、窦道排脓、慢性疲劳和不适。直接骨髓炎通常在更加局部的区域伴随出现显著的体征和症状。
已知某些疾病状态使患者易于感染骨髓炎。包括糖尿病、镰状细胞病、获得性免疫缺损综合征(AIDS)、IV药物滥用、酒精中毒、慢性甾类应用、免疫抑制和慢性关节病。此外，存在的修复性整形外科装置是另一种危险因素，其是任何最近的矫形外科术或开口裂缝。
通常已知若干细菌性病原体引起急性和直接骨髓炎。例如，新生儿(小于4个月)体内的急性血原性骨髓炎通常由金黄色酿脓葡萄球菌、肠杆菌以及A组和B组链球菌引起。在4个月至4岁的儿童中，急性血原性骨髓炎通常由金黄色酿脓葡萄球菌、A组链球菌、流感嗜血杆菌和肠杆菌引起。在4岁的儿童和青年至成年，急性血原性的骨髓炎通常由金黄色酿脓葡萄球菌(80％)、A组链球菌、流感嗜血杆菌和肠杆菌引起。在成人中，急性血原性骨髓炎通常由金黄色酿脓葡萄球菌以及偶而由肠杆菌或链球菌引起。在过去，主要的治疗包括包括合用青霉素酶-抗性合成青霉素和第三代头孢菌素。可供选择的疗法包括万古霉素或克林霉素和第三代头孢菌素。除这些上述抗菌药物之外，环丙沙星和利福平已经用于联合治疗成年患者。在证实是革兰氏阴性杆菌感染的情况中，通常给药第三代头孢菌素。
直接骨髓炎通常由金黄色酿脓葡萄球菌、肠杆菌和假单胞菌引起。通常，直接骨髓炎由穿过运动鞋的刺伤引起。在这些情况下，直接骨髓炎通常由金黄色酿脓葡萄球菌和假单胞菌引起。在这些情况下，主要的抗生素包括头孢他定或头孢平。环丙沙星经常被用作可供选择的治疗。在镰状细胞病患者中，直接骨髓炎通常由金黄色酿脓葡萄球菌和沙门氏菌引起，且主要的治疗选择是氟喹诺酮抗生素(不用于儿童)。第三代头孢菌素(例如，头孢曲松)是备选。
对于因创伤引起的骨髓炎患者，感染物通常包括金黄色酿脓葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿色假单胞菌。主要的抗生素是萘夫西林和环丙沙星。替换物包括万古霉素和具有抗假单胞菌活性的第三代头孢菌素。
因此，如本文以及权利要求书中所用，术语“骨髓炎“包括血原性骨髓炎、直接或邻近接种骨髓炎、慢性骨髓炎和继发于外周血管疾病的骨髓炎。骨髓炎可以是任何上述病原体引发感染的结果，还包括具有感染骨、骨髓、关节和周边组织能力的其它病原体。
术语“治疗骨髓炎”包括根除引起与骨髓炎相关的潜在感染的病原体/细菌，抑制细菌生长，减少细菌浓度，减少从感染恢复的时间，改善、消除或减少感染的症状比如肿胀、坏死、发烧、疼痛、虚弱、以及本领域技术人员视情况而选择的其它合适的测量指标。
目前，对于骨髓炎的主要治疗是穿透骨和关节腔的肠胃外抗生素。治疗需要至少4-6周。基于住院病人开始静脉内注射抗生素后，根据感染的类型和部位以及基于门疹病人进行静脉注射或口服抗生素以继续治疗。
例如，由金黄色酿脓葡萄球菌感染引起的骨髓炎通常每六小时经静脉内或胃肠外给予2g的氯唑西林治疗至少初始的14天或至多6周的整个疗程。其它的治疗是每8小时给予1-2g的头孢唑啉持续6周或每八小时给予600mg的克林霉素持续6周。
由β-溶血链球菌引起的骨髓炎通常于每4-6个小时使用两百万国际单位(IU)的苄青霉素静脉内或胃肠外治疗2-4周。沙门氏菌spp.感染以每12小时口服750mg环丙沙星治疗6周。
通常每4-6小时经静脉注射或肠胃外给予25-50mg氯唑西林持续6天加上每24小时给予50-75mg/kg头孢曲松持续4-6天治疗儿童体内由流感嗜血杆菌引起的胃髓炎。该治疗继之以每8小时给予阿莫西林15mg/kg加上口服克拉维酸(最大500mg)持续四周。
在婴儿中，每4-6小时经静脉注射或肠胃外给予25-50mg/kg氯唑西林持续4-6天加上每8小时静脉注射或肠胃外给予50-75mg/kg氨噻肟头孢菌素持续4-6天而完成治疗。该治疗继之以每8小时给予15mg/kg阿莫西林加上口服克拉维酸(最大500mg)持续四周。
通常每4-6小时经静脉注射或肠胃外给予25-50mg氯唑西林持续6天加上每24小时给予50-75mg/kg头孢曲松持续4-6天治疗儿童体内的金黄色酿脓葡萄球菌感染。这些治疗继之以每6小时口服12.5mg/kg氯唑西林持续3-4周。
儿童体内沙门氏菌spp.感染的治疗取决于病原体的敏感性。治疗选择包括氯唑西林加头孢曲松继之以每12小时口服20mg/kg磺胺甲基异唑和4mg/kg甲氧苄氨嘧啶持续6周或每12小时口服7.5-15mg/kg阿莫西林持续6周，或每4-6小时10-15mg/kg环丙沙星持续4-6天加上每8小时静脉内给予50-75mg/kg氨噻肟头孢菌素持续4-6天，继之以磺胺甲基异唑和三甲氧苄二氨嘧啶或阿莫西林或者ciproflaxacin。
本发明另一个实施方案提供治疗哺乳动物体内关节感染和/或周边组织感染的方法。优选的哺乳动物是人。在优选实施方案中，关节感染和/或周边组织感染引起脓毒性关节炎。
脓毒性关节炎是关节和周边组织的感染并导致由所存在的关节内活微生物引起的关节炎症。脓毒性关节炎最常继发于骨髓炎，特别在孩童时期，并由细菌感染引起。
关节感染可通过若干途径发生。最常见地，感染病原体的散布是血原性的。通常，脓毒性关节炎由皮肤感染或脓肿引起。口腔和牙齿脓毒症或者牙科操作后或与呼吸道或泌尿生殖道感染相关的脓毒症也可引起脓毒性关节炎。尖锐物体或重大跌打损伤对于关节的直接穿透性创伤同样可引起关节感染。关节抽气或注射以及外科操作比如关节置换也可导致关节感染。此外，骨髓炎经常蔓延包围关节。这在年幼儿童中尤为普遍。最后，与关节相邻接的软组织感染比如炎性粘液囊或腱鞘，可以蔓延包围关节空间。感染通过血原性途径的散布仍是关节脓毒症的最常见原因。
脓毒性关节炎的症状包括不适和发烧、与急性炎症并发的急性热关节：肿胀和关节渗液、红肿、疼痛和损失功能。
最常见的脓毒性关节炎的致病微生物是金黄色酿脓葡萄球菌。在新生儿脓毒性关节炎中，大肠杆菌和流感嗜血杆菌也是常见的病原体。在至多5岁的儿童中，流感嗜血杆菌是血原性性关节脓毒症的最常见原因。在老年人和患有糖尿病或装有假体关节的人中，革兰氏阴性大肠菌是常见的病原体。在刺穿性损伤的情况下，以及在静脉注射药物上瘾者中，通常发现铜绿色假单胞菌或表皮葡萄球菌感染。健康的年轻成人中，有时由奈瑟氏淋病双球菌或脑膜炎球菌感染引起脓毒性关节炎。慢性轻度的脓毒性关节炎，特别是在脊柱中，可能由微生物如分枝杆菌或流产杆菌感染引起。此外，在获得性免疫缺损综合征患者中，关节病原体的范围是不同的。
一些最常见的脓毒性关节炎病原体包括但是不局限于：(1)革兰氏阳性菌：金黄色酿脓葡萄球菌(80％的情况)、酿脓链球菌/肺炎链球菌；(2)革兰氏阴性菌：流感嗜血杆菌，奈瑟氏淋病双球菌/脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿色假单胞菌、脆弱拟杆菌、布鲁氏菌种、沙门氏菌种、梭形细菌；(3)耐酸杆菌：结核分枝杆菌、非典型分支杆菌；和(4)螺旋菌：出血性黄疸钩端螺旋体。
因此，在此所用以及权利要求中的术语“脓毒性关节炎”包括由上示病原体以及具有感染关节和周边组织能力的任何其它病原体引起的关节和周边组织感染。周边组织包括但是不局限于：周边肌肉、相关腱、连接骨、粘液囊、腱鞘、滑膜、滑液以及相关软骨。
术语“治疗脓毒性关节炎”包括根除引起与脓毒性关节炎相关的潜在感染的病原体/细菌，抑制的细菌生长，减少细菌浓度，减少从感染恢复的时间，改善、消除或减轻感染症状如肿胀、坏死、发烧、疼痛、虚弱以及视本领教技术人员测量情况而选择的其它指征。
脓毒性关节通常经4-6周治疗，而感染的关节成形术则经4-6周或更长时间的治疗。(Calhoun等，Am.J.of Surgery 1989；157：443-449，Calhoun等，Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery 1988；114：1157-1162，Gordon等，Antimicrob Agents Chemother 2000；44(10)：2747-2751，Mader等，West J Med 1988；148：(5)568，Mader等，Orthopaedic Review 1989；18：581-585，Mader等Drugs &Aging 2000；16(1)：67-80)。在存在耐药菌如甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌时，这些漫长的抗生素治疗更加成问题。
在表征病原体之前，成人体内脓毒性关节炎的治疗在开始时通常每6小时静脉内或肌内给予2克氯唑西林并联合每24小时1-2克头孢曲松。在大于两个月的儿童中，治疗包括每6小时静脉内或肌内给予25-50mg/kg达最高2克的氯唑西林并联合每24小时25-50mg/kg达最高2克的头孢曲松。在婴儿中，治疗包括每八小时静脉内或肌内给予50-75mg/kg达最高2克的氯唑西林。其它抗生素治疗包括氨噻肟头孢菌素、氟氯青霉素、苄基青霉素和青霉素。
一旦确定病原体，普通的疗程基于存在的感染病原体。例如，当确定该感染包含金黄色酿脓葡萄球菌时，脓毒性关节炎经常经静脉内每6小时给予氯唑西林或每8小时给予头孢唑啉或每8小时给予克林霉素治疗，所选择治疗持续2-3周。甲氧西林-耐药的金黄色酿脓葡萄球菌通过胃肠外给予万古霉素治疗。
骨髓炎和脓毒性关节炎的抗生素治疗对于医师仍是挑战。许多整形外科感染是在医院环境中获得的(Holtom等，Clin Orthop 2002；403：38-44)。此外，这些感染的病原体通常是多药耐药性。葡萄球菌是最普通的医院生物体且是耐药性生物体，但同样可包括革兰氏阴性病原体(Cunha，Clin Infect Dis 2002；35：287-293)。
与甲氧西林-敏感的金黄色酿脓葡萄球菌相比，由甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌引起的感染更难以治疗并且预后较差(Cosgrove等，Clin Infect Dis 2003；36：53-59)。对于这些感染的治疗选择受到限制。具有抵抗所有葡萄球菌菌株恒定效力并且已经在治疗骨感染中进行了广泛研究的唯一药物是糖肽。不幸的是，已确认对于这些抗生素的耐药性是治疗革兰氏阳性病原体中的主要问题。万古霉素耐药性肠道球菌在世界范围内扩散，且这一耐药性已在体外被证明可转移至其它革兰氏阳性生物体(Noble，等，FEMS Microbiology Letters 1992；72：195-198)。此外，万古霉素-耐药性金黄色酿脓葡萄球菌的散发性菌株已经在若干国家得到分离(Hiramatsu，Am J Med 1998；104：75-10S，Hamilton-Miller，Infection 2002；30：118-124)。因此，提供治疗多药耐药性病原体的可供选择抗菌剂是至关重要的。
替加环素(先前且经常被称为″GAR-936″)是一类被称为甘氨酰环素的新型抗生素9-叔丁基甘氨酰胺合成衍生物。已经证明这类新型四环素衍生物表现出出色的体外活性，可抵抗大量革兰氏阳性和革兰氏阴性、需氧的和厌氧生物体，包括甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药性肠道球菌(包括粪肠球菌)、青霉素耐药性/大环内酯耐药性肺炎球菌、普雷沃菌，peptostreptococci和分枝杆菌spp.(Boucher等，Antimicrob Agents Chemother.2000；44(8)：2225-2229，Gales等，Antimicrob Agents Chemother.2000；46：19-36，Goldstein等，Antimicrob Agents Chemother.2000；44(10)：2747-2751)。四环素是抑菌剂，其作用是抑制细菌蛋白合成。尽管还没有确定它们的确切作用机理，但开发了甘氨酰环素以克服对于四环素耐药的细菌机理(Rasmussen等，Antimicrob AgentsChemother 1995；38：1658-1660)。
替加环素集中于骨、骨髓、关节和滑液以及许多其它有意义的器官和组织中。此外，已经发现替加环素集中在上述组织的感染部分。在人体内静脉内给予替加环素的药物动力学研究表明存在快速分布期，具有延长的半衰期(40-60小时)且在稳态具有高分布容积(7至14L/kg)。使用放射标记的替加环素的动物研究表明这一快速分布阶段和稳态的高分布容积代表替加环素渗透入包括肺和骨的组织。
例如，当通过30分钟静脉内输注以3mg/kg的剂量给予[14C]替加环素时，已在Sprague Dawley大鼠体内显示了替加环素在大鼠组织中的分布。通常，辐射性很好地分布于多数组织，且在骨中观察到最高的总暴露量。显示最高浓度暴露量的组织如下：骨＞骨髓＞唾液腺，甲状腺，脾和肾。在这些组织的每一个中，组织内浓度-时间曲线下面积(AUC)与血浆中AUC的比值大于10。在这一研究中，大鼠肺中AUC与血浆中AUC的比值为4.4。此外，已经证明在人体内静脉内给予的替加环素穿透了人体内骨组织且静脉给药延伸了随时间推移人滑液内替加环素的浓度。
本发明人已经发现替加环素适用于治疗骨髓炎和脓毒性关节炎。其抗菌谱广泛，包括在医院内骨和关节感染中所发现的所有病原体。其药物动力学性质是有利的，因为该药物可以是每日给予两次。此外，在所采集的几乎每一样品中均发现骨渗透和超过最低抑制浓度(MIC)的药物水平。最低抑制浓度是确定化合物抑制细菌生长效力的方法。它是抗菌剂抑制微生物生长的最低浓度并应与哺乳动物血清中所需的最低治疗浓度相对应。此外，替加环素在人体内提供良好的安全性分布，证明该抗菌素应适于整形外科感染的临床研究。
因此，本发明一方面提供通过给予哺乳动物药理学有效量的替加环素在哺乳动物体内治疗骨、骨髓、关节和周边组织感染的方法，以及治疗骨髓炎和/或脓毒性关节炎的方法。骨、骨髓、关节和周边组织感染以及骨髓炎和/或脓毒性关节炎可能由任何常见病原体引起，比如上述病原体，其包括革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、厌氧菌和需氧菌。例如，该感染可以包括但不限于，葡萄球菌、不动杆菌、分枝杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌、链球菌、肠杆菌科、肠球菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、奈瑟氏球菌、立克次氏体、肺炎球菌、普雷沃菌、peptostreptococci、军团拟杆菌、β-溶血的链球菌、以及B组链球菌。在优选实施方案中，该感染包括奈瑟氏球菌、分枝杆菌、葡萄球菌、以及嗜血杆菌。在更优选实施方案中，该感染包括大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、奈瑟氏淋病双球菌、结核分枝杆菌、金黄色酿脓葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、类肠球菌、普氏立克次氏体、斑诊伤寒立克次氏体、立氏立克次氏体、麻风分枝杆菌、脓肿分枝杆菌或肺炎支原体。
在本发明一种实施方案中，提供了通过给予药学上有效量的替加环素治疗由证明为抗生素-耐药性菌株(如上所述菌株)引起的骨、骨髓、关节和周边组织感染以及骨髓炎和/或脓毒性关节炎的方法。例如，所表现的耐药性可以是，但是不局限于，甲氧西林耐药性、糖肽耐药性、四环素耐药性、土霉素耐药性、强力霉素耐药性；氯四环素耐药性、米诺环素耐药性、甘氨酰环素耐药性、头孢菌素耐药性、环丙沙星耐药性、呋喃妥因耐药性、甲氧苄氨嘧啶-磺胺药剂的耐药性、哌拉西林/他唑巴坦耐药性、莫西沙星、万古霉素耐药性、替考拉宁耐药性、青霉素耐药性和大环内酯耐药性。
在优选实施方案中，糖肽耐药性是万古霉素耐药性。
在另一个优选实施方案中，该感染包括表现出糖肽耐药性、四环素耐药性、米诺环素耐药性、甲氧西林耐药性、万古霉素耐药性以及除替加环素之外的甘氨酰环素抗生素耐药性的金黄色酿脓葡萄球菌。
在另一个优选实施方案中，该感染包括鲍曼不动杆菌，其可表现出也可不表现抗生素抗性比如头孢菌素耐药性，环丙沙星耐药性，呋喃妥因耐药性，甲氧苄氨嘧啶-磺胺药剂的耐药性和哌拉西林/他唑巴坦耐药性。在另一个实施方案中，该感染包括可表现也可不表现莫西沙星耐药性的脓肿分枝杆菌。
在治疗人类以及其它哺乳动物中，替加环素最常经静脉内给药，虽然本领域技术人员可以使用其它给药途径。在人受试者中，在一小时的输液期间可忍受的给药剂量最多为100mg。一天两次持续九天在一小时内给予输液前已进食30分钟的受试者含有75mg或更多药物的200ml输液，导致所有受试者胃肠无法忍受，包括恶心和呕吐。可以耐受一天两次在一小时内给予25-50mg的200ml输液。还可以耐受100mg的单次输液，导致0.9-1.1微克/ml的平均峰血清浓度。
一天两次向新西兰白兔给药14mg/kg导致高于最低抑制浓度的稳定水平。参见附图1。替加环素对于该研究中所用的MRSA菌株的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别低于0.2μg/ml和0.2μg/ml。测量MBC提供了测定化合物杀菌效力的方法。MBC技术确定了杀菌剂杀灭标准培养液中至少99.9％的生物体的最低浓度。
Mercier等测定了替加环素抵抗万古霉素耐药性粪肠球菌的MIC和MBC分别为0.125μg/ml和16-32μg/ml。对于金黄色酿脓葡萄球菌，最低抑制浓度和最低杀菌浓度分别是0.25-1μg/ml和16-64μg/ml。在同情使用研究中，本发明人发现替加环素抵抗人类患者体内M.Abcessus的最低抑制浓度为0.25μg/ml。
在哺乳动物中，甲氧西林-耐药性金黄色酿脓葡萄球菌可经每天两次给予5mg/kg-60mg/kg替加环素治疗，更优选10mg/kg-40mg/kg，更加优选12mg/kg-20mg/kg。治疗其它病原体的适当剂量对于本领域技术人员是显而易见的。
在同情使用研究中，一位人类患者患spina bifada并导致截瘫。该患者对磺胺类药物严重过敏并且由于感染的脚跟褥疮(decubitis)而存在甲氧西林耐药性细菌。该患者的右坐骨还有表面裂纹。溃疡被清除但没有愈合。MRI揭示了骨髓炎且骨切面对于鲍曼不动杆菌感染为阳性。
鲍氏不动杆菌对于头孢菌素、环丙沙星、呋喃妥因耐药，并且证明对于甲氧苄氨嘧啶-磺胺药以及哌拉西林/他唑巴坦中度耐药。生物体对于亚胺培南、庆大霉素和托普霉素敏感。患者经美罗培南和托普霉素治疗。后来由于嗜曙红细胞增多而使用氨曲南替换美罗培南。后来由于持续嗜曙红细胞增多而中止氨曲南。由于肌酸酐升高也中止了托普霉素。然后使用替加环素治疗该患者两个月，每12小时给药50mg或每24小时给药50mg。在接受替加环素治疗的一个月内，MRI显示骨髓炎消除且观察到从右坐骨区域采集的液体有明显的改进。使用替加环素治疗后十周，报道该患者情况良好。
在另一同情使用研究中，患有无汗外胚叶发育不良和免疫缺陷的患者具有三年半脓肿分枝杆菌感染的脊椎骨髓炎史。感染一年后进行清创术植入硬器械。该患者通过使用cefoxitan，克拉仙霉素和氨丁卡霉素显示了一定的改善。后来由于肾损害停止氨丁卡霉素。后来将利奈唑胺和阿齐霉素加到治疗方案中。该生物体被确定对于莫西沙星耐药。
后来在靠近该患者原先感染位点的上面出现了新的脊椎骨髓炎。进行活组织切片检查并确定不需要额外的清创术。发现该生物体仅对于头孢噻吩敏感。确定了其它抗菌剂将是有益的并发现该生物体对于替加环素敏感。给予替加环素直至MIC 0.25微克/ml。该患者的白血细胞数正常然而出现血内丙种球蛋白过少且淋巴细胞功能降低。该患者还经IL-12治疗，但仅在抗生素治疗期间持续使用IL-12。治疗后一年，据报道该患者情况良好。
本发明的另一个实施方案提供治疗哺乳动物优选人体内骨、骨髓、关节和周边组织感染的方法，以及治疗骨髓炎和/或脓毒性关节炎的方法，包括给予哺乳动物药理学有效量的替加环素和选自安沙霉素家族的抗菌剂，其包括抗生素利福霉素和曲张链菌素组。利福霉素家族包括利福平、利福喷丁、利福昔明，并且优选利福平。由于它们与RNA聚合酶相结合的倾向，这些大环抗生素具有杀菌活性。这些抗生素可用于与替加环素联合，因为它们影响细菌蛋白合成的不同步骤。利福霉素影响RNA聚合酶的活性并限制信使RNA的产生，同时替加环素影响核糖体的活性以及蛋白从信使RNA产生。替加环素的作用方式似乎与70S核糖体的失活相关，所述70S核糖体的失活通过以有些不同于四环素的方向结合于30S核糖体亚单位中的四环素结合位点而实现。(Bauers等，J.Antimicrob Chemother.2004；53(4)：592-599).
本发明人已经发现替加环素与抗菌剂的利福霉素类抗生素的联合在感染组织中提供了附加的抗菌作用。在使用甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌接种的兔胫骨研究中，使用替加环素与利福平联合治疗骨髓炎证明在10只兔的骨中没有感染，而对照组则表明在15只兔中有11只感染。在骨髓中的治疗还证明在10只兔中没有感染，而在对照组中所测试的15只兔有5只感染。此外，单独使用替加环素治疗兔体内骨髓炎证明10只兔中有一只免的骨感染且骨髓中没有感染。
在哺乳动物中，利福平治疗可以为10mg/kg-100mg/kg每日两次，更优选可为20mg/kg-70mg/kg每日两次，更优选可为30mg/kg-50mg/kg每日两次。在感染了MRSA的新西兰白兔中，40mg/kg的治疗导致杀菌活性。利福平抵抗MRSA菌株的最低抑制浓度和最低杀菌浓度水平分别是是0.78μg/mL和1.56μg/mL，比例为0.5。
人类口服利福平可采用150和300mg的胶囊。在健康人类成人中单次600mg剂量后，峰值血清浓度平均为7微克/ml但具有从4至32微克/ml的宽泛差异。
在30分钟内静脉内给予健康成人600mg导致平均峰值血清浓度约为17mcg/ml。
替加环素的给药优选静脉内或肌内给药，而利福平可以是静脉内、肌内、口服或本领域已知的其它方式给药比如经口含化、肺内或透皮递送系统。共同给药可以包括任何方法的联合。例如，替加环素可以经静脉内给药而利福平可以口服给药。共同给药包括同时或顺序给药，可以以任何顺序，且不必意味着同时或同一天或相同的时间表给药。优选地，替加环素和利福平的浓度同时维持在远高于最低抑菌浓度的水平。
在本发明人进行的试验中，与受感染、未经治疗的对照组或者在治疗末期使用万古霉素治疗的组相比，感染甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌并经替加环素治疗的一组兔显示在骨和骨髓中菌落数较少。替加环素(0.2μg/ml)的MIC和MBC较万古霉素(0.39μg/ml和0.78μg/ml)更低，其更有助于消除骨髓炎感染。替加环素与利福平的结合可以从骨和骨髓彻底根除细菌，而在万古霉素加利福平组中样品仍然为阳性。参见附图3。每日两次皮下给予14mg/kg的替加环素并且每日两次口服给予40mg/kg的利福平的治疗获得成功。这些数据证明兔体内甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌感染的骨髓炎经替加环素和利福平联合治疗是有效的。
因此，根据本文的公开内容，比如上述同情应用研究中所用的剂量和治疗方案(即给药的长短和方式，以及疗法的时间过程)、为了治疗所示病原体感染而给予患者普通抗生素的典型剂量和治疗方案、以及在兔研究中所用的剂量和治疗方案，本领域技术人员将知道适当的剂量和治疗方案从而对哺乳动物给药以达到药理学有效量的替加环素和/或其它抗生素如利福平，从而治疗骨髓炎和/或脓毒性关节炎。本领域技术人员将理解会影响所需剂量和治疗方案的那些因素如患者感染的程度、总体健康水平、体重和年龄。
术语“药理学有效量”意指，与本领域已知的考虑一致，有效地实现药理学作用或治疗改善而没有过度不良副作用的抗菌剂的量，包括但不限于，抑制细菌生长、减少细菌浓度、减少从感染恢复的时间、改善、消除或减少感染症状或其它疾病如肿胀、坏死、发烧、疼痛、虚弱以及本领域技术人员视测量情况而定的其它指征。
本发明另一个实施方案提供了替加环素连同或不连同选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素(优选利福平)的抗菌剂用于制备治疗哺乳动物优选人体内的骨、骨髓、关节和周边组织感染以及骨髓炎和/或脓毒性关节炎的药物的应用。
另一个实施方案提供一种用于治疗哺乳动物优选人体内骨、骨髓、关节和周边组织感染以及骨髓炎和/或脓毒性关节炎的药物组合物，含有替加环素，还含有或不含有选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素(优选利福平)的抗菌剂，以及药学上可接受的通常用于药物和兽医制剂中的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、助剂和/或载体。该药物制剂可以被改造以适合给予人类和/或动物。
本发明另一个实施方案提供了替加环素连同或不连同选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素(优选利福平)的抗菌剂用于制备治疗哺乳动物优选人体内的骨、骨髓、关节和周边组织感染以及骨髓炎和/或脓毒性关节炎的药物的应用。
应理解为在本发明的各种实施方案中，替加环素和/或利福平或其它抗菌剂可以以其药学上可接受的盐存在。例如，这些盐可包括但不限于盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐。还可包括例如乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐。
该药物或药物组合物是以达到药理学有效量的替加环素和药理学有效量的选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素(优选利福平)的抗菌剂给药。该药物组合物和/或药物另外包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、助剂和/或载体。可包括但不限于蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、卵磷脂、聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、聚丙烯酸酯、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其衍生物、甘油三乙酸酯、酞酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸酯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、滑石或硅油。
对于口服给药，该药物制剂可以是作为例如片剂、胶囊、乳剂、溶液、糖浆或悬浮液使用。对于肠胃外给药，该制剂可以作为安瓿使用，还可作为悬浮液、溶液或在水性或油性赋形剂中的乳剂。对于悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的需要当然应考虑活性化合物在具体实施方案所用的赋形剂中的溶解度。该制剂还可包含生理学上相容的防腐剂和抗氧化剂。
该药物制剂还作为栓剂使用，含有常规的栓剂基质比如可可脂或其它甘油酯。或者，该制剂可以被制备成有效的储存形式，其将在体内在预定时间内释放活性组合物。
为了说明本发明的各种实施方案给出了下面实施例，而不意在以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：在兔体内使用替加环素治疗骨髓炎
本实施例表明在兔体内使用替加环素以及替加环素与利福平的联合治疗骨髓炎。还进行了使用万古霉素以及万古霉素联合利福平的比较研究。数据证明了使用替加环素较万古霉素以及使用替加环素联合利福平较万古霉素联合利福平改善了抗微生物效能。此外，在测试组内，替加环素联合利福平提供了对抗甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌的完全保护作用。
扩散生物测定生成的标准曲线
使用正常NZW兔血清(Fisher Sciontific)与正常的、未感染的兔胫骨生成替加环素(Wyeth-Ayerst Research，Pearl River，New York)、万古霉素(Abbott Laboratories，Chicago，Illinois)和利福平(MerrellPharmaceuticals Inc.Kansas，Missouri)的标准曲线。使用各药物进行生物测定以产生血清和/或胫骨中抗生素浓度标准曲线。
用于生物测定的生物体为腊样芽胞杆菌ATCC11778。使用含有各抗生素的两倍系列稀释液制备血清标准品，使得正常NZW兔血清中的药物浓度为25μg/ml至0.20μg/ml。在灭菌通风橱中通过使用70％乙醇彻底清洗未感染的兔胫骨而制备替加环素的骨洗脱标准品。使用粉碎机将各胫骨粉碎成约0.5cm2的小碎片。将碎片置于无菌的50ml圆锥形离心管中并称重。向每一克骨碎片加入一毫升无菌的0.9％生理盐水。该溶液经充分涡流两分钟。允许将所得骨洗脱液在4℃冷室中于180rpm振动12小时。在测定之前，样品以4000rpm离心3分钟从而将碎片压成小球。
测量围绕各孔的生长抑制区域的直径，单位为毫米。针对替加环素在血清和骨洗脱液中的浓度并针对血清中的万古霉素，通过描绘已知抗生素浓度相对于其所得的抑制区域测量而生成标准曲线。
替加环素的药物动力学
每12小时经皮下给予6只未感染兔的基准组14mg/kg的替加环素，其在无菌水中重组，持续8天。以下面的大概间隔抽取血样：最初抗生素治疗后的1小时、3小时、6小时、12小时、171小时和180小时(处死时间)。通过标准技术采集半毫升血。样品立即被投入无菌的1.5毫升离心管中。安乐死并除去所有软组织后，两个胫骨均经70％乙醇充分清洗并收获。将胫骨置于单独的、无菌的50ml离心管中并于-70℃储存。
血清样品被储存于-70℃直到进行生物测定。骨样品的制备如前所述。制备排种的琼脂平板并将样品一式三份装填到排种板中，于30℃培养18小时。测量围绕各孔的生长抑制区域的直径并根据标准曲线外推替加环素的浓度。
最低抑制浓度和最低杀菌浓度的确定
使用抗生素两倍管稀释法测定替加环素、万古霉素和利福平的最低抑制浓度(MIC)。也测定最低杀菌浓度。该方法灵敏度的极限是25μg/ml-0.20μg/ml。
胫骨骨髓炎的诱发
在所有六个研究组内在所有兔左侧胫骨干骺端中经皮诱发局部金黄色酿脓葡萄球菌骨髓炎。甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌菌株得自接受治疗的骨髓炎患者。
感染性培养基的制备：于37℃，在含有40μg/ml苯唑西林的Mueller Hinton Broth(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)培养基中培养金黄色酿脓葡萄球菌过夜。将培养基的细菌浓度调整至107CFU/ml。
兔感染方法：本研究使用8-12周龄且重2.0-3.5kg的新西兰白兔(Ray Nicholl′s Rabbitry，Lumberton，Texas)。给予麻醉药后，将18号针经皮插过左胫骨干骺端侧面进入髓内腔。接着，相继注射0.15ml5％鱼肝油酸钠(American Regent Laboratories，Inc.，Shirley，NewYork)，0.1ml金黄色酿脓葡萄球菌(107CFU/ml)以及0.2ml 0.9％无菌生理盐水。允许该感染发展2周，此时经放射照射测定骨髓炎的严重程度(表1)。
治疗组：在感染后两周末，将局部患邻近胫骨髓炎(经射线照射确定为2-4级)的兔分成六个研究组。组1(对照组)：感染了但在研究期间未治疗。组2：兔经皮下给予30mg/kg万古霉素每天两次治疗4周。组3：兔经皮下给予30mg/kg万古霉素每天两次加上口服0.5％甲基纤维素中40mg/kg的利福平每天两次治疗4周。组4：兔经皮下给予14mg/kg替加环素每天两次治疗4周。组5：兔经皮下给予与组4中兔相同剂量的替加环素加上口服40mg/kg利福平每天两次治疗4周，其中利福平为0.5％的甲基纤维素溶液。每天给予接受口服利福平的兔(组3和5)口服营养补充物(Ensure Plus Abbott Laboratories，Columbus，Ohio)和Lactobacillus spp.制剂(Kvvet Supply，3190NRoad，David City，Nebraska)。组6：兔经皮下给予与组4剂量相同的替加环素治疗1周，但在末次给药后3小时处死。此时，采集血液和感染的骨样品并测定替加环素浓度。在本试验的治疗期后，在2周内对组1-5不进行治疗，在感染后8周处死动物。
放射照相评价
在开始治疗(感染后2周)时、在抗生素治疗末期(感染后6周)以及处死(感染后8周)时进行双侧胫骨的放射照相。根据三名研究者的视觉分级给放射照相评分并取平均分，各研究者不知道试验组别。
表1 兔体内放射照相的骨髓炎严重级别的标准
  级别*   变化描述
  0   正常，与右胫骨相比没有变化
  1+   骨膜隆凸或破裂，或两者；软组织肿胀
  2+   ＜10％的正常骨组织破裂
  3+   10-40％的正常骨组织破裂
  4+   ＞40％的正常骨组织破裂
*视觉评价骨破裂百分比。
抗生素血清水平的测定
开始抗生素给药后于1小时(峰值)和12小时(谷值)测定组2和4的抗生素峰和谷水平。参见附图5A和5B。通过生物测定的方法测定抗生素浓度。如上所述进行抗生素扩散测试。根据各标准曲线外推抗生素的浓度。
每克骨和骨髓中细菌浓度的测定
处死后，对于左胫骨和右胫骨进行总体培养。测定所有研究组中左胫骨和骨髓的金黄色酿脓葡萄球菌定量计数，以CFU每克表示。
培养基的制备：为了左胫骨的总体培养分析和右胫骨的品质确保检查，使用灭菌棉花头涂药器拭抹双边胫骨骨髓和髓内管。将接种的涂药器划痕于血液平板上然后置于5ml无菌TSB中。然后于37℃培养该板和管24小时并记录生长和/或浊度。
将骨髓置于无菌的50ml离心管中并称重。将骨片段打碎成0.5cm2碎片，置于无菌的50ml离心管中，并称重终产物。以3比1的比例加入0.9％的无菌生理盐水(3ml盐水/克骨和骨髓)并使悬浮液涡流2分钟。使用0.9％的无菌生理盐水制备各悬浮液的六个10倍稀释液。将20微升的各稀释液样品，包括起始悬浮液，一式三份置于血琼脂板上并于37℃培养24小时。计数各胫骨样品最大稀释液的CFU。以CFU每克骨和骨髓计算金黄色酿脓葡萄球菌浓度。对于骨样品，将计算结果乘以3，对于骨髓乘以4，以说明它们在盐水中的最初稀释度以及说明骨髓吸附入盐水中。计算各自金黄色酿脓葡萄球菌的平均对数值。
试验数据的统计分析
对于所有原始数据计算均值的标准偏差和标准误差，包括盘扩散测定(disc diffusion measurements)、重量差异、放射照相等级以及细菌计数。对于利用抗生素浓度的以10为底的对数值绘制出浓度(μg/ml)与所测量抑制区域(mm)之间关系的抗生素扩散标准曲线进行线性回归分析、最小二乘法。利用源于最小二乘法计算的斜率和Y-截距值由标准曲线将所有后来扩散测量值外推至微克/毫升的抗生素浓度。
最低抑制浓度和最低杀菌浓度
对于本研究所用的甲氧西林-耐药金黄色酿脓葡萄球菌(106CFU/毫升接种体)，替加环素的最低抑制浓度和最低杀菌浓度分别低于0.2μg/ml和0.2μg/ml。万古霉素的最低抑制浓度和最低杀菌浓度分别是0.39μg/ml和0.78μg/ml，MIC/MBC比值为0.5。利福平的最低抑制浓度和最低杀菌浓度分别是0.78μg/ml和1.56μg/ml，MIC/MBC比值为0.5。
在骨和血清中的药物动力学水平
所有的抗生素浓度源于各自的标准曲线。未感染动物组的血清中替加环素浓度(14mg/kg，每日两次)的对数趋势示于附图1中。替加环素，如同附图1所示，缓慢地清除，维持高于MIC(0.2μg/ml)的稳定水平至12小时(谷值)。给予各药物后受感染的兔血清中替加环素(14mg/kg，每日两次)和万古霉素(30mg/kg，每日两次)峰值和谷值示于附图5a和5b中。在治疗末在受感染的胫骨内分别测量受感染兔组中替加环素(14mg/kg，每日两次)的骨浓度，其均值为0.78μg/ml+/-0.01μg/ml，在未感染的胫骨内均值为0.49μg/ml+/-0.01μg/ml。该差别在统计学上显著(p＜0.05)。
放射照相结果
根据表1，将2-4级骨髓炎引入所有的受感染动物。各组间起始的放射照相等级相似。t＝14天时替加环素、替加环素+利福平以及万古霉素+利福平组的平均等级显著高于t＝56天的平均等级(p＜0.05)。与万古霉素(0.5+/-0.2或25％)、与替加环素(0.9+/-0.1或40.9％)、万古霉素+利福平(0.9+/-0.1或40.9％)或与替加环素+利福平(0.8+/-0.1或40.0％)组相比，对照组放射照相显示了最低量的改善(0.2+/-0.2或9.1％)。
附图2描述了t＝14和t＝56天各组的平均放射照相的严重程度。在本研究末(t＝56天)，比较不同组之间的平均放射照相等级。t＝56天时的替加环素组、替加环素+利福平组以及万古霉素+利福平组的平均等级显著低于t＝56天时的对照组平均等级(p＜0.05)。附图2的关键词如下：对照＝对照组，未治疗；万古霉素＝皮下给予万古霉素治疗组；Van+Rifam＝皮下给予万古霉素且口服利福平治疗组；Gar-936＝皮下给予Gar-936治疗组；Gar+Rifam＝皮下给予Gar-936且口服利福平治疗组。
骨培养
未治疗的受感染对照组(n＝15)胫骨的高比率显示了甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌阳性培养物(80％)的平均浓度为9.21×104CFU/g骨。当与未治疗的对照组相比，万古霉素组(n＝11)、替加环素组以及替加环素+利福平组均表明了阳性甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌感染率显著下降。在万古霉素组中，11个样品中的2个(18.2％)为MRSA阳性，该组的平均细菌浓度为1.4×102CFU/克骨(p＜0.05)。在替加环素组中，10个样品中有1个为甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌阳性且该组的平均细菌浓度为20CFU/克骨，其较对照组或万古霉素组均更低(p＜0.05)。万古霉素+利福平组中有一只兔显示了高于对照组的细菌浓度。接受替加环素+利福平治疗组的兔表明了完全根除胫骨细菌(在所有样品中为0.0CFU/克骨)。附图3比较了所有组之间的CFU/克骨髓和骨。附图3证明了替加环素以及替加环素联合利福平相对于对照组有效地治疗骨感染和骨髓感染。
附图3的关键词如下：对照＝对照组，未治疗；万古霉素＝皮下给予万古霉素治疗组；Gar-936＝皮下给予Gar-936治疗组；万古霉素+利福平＝皮下给予万古霉素且口服利福平治疗组；Gar+利福平＝皮下给予Gar-936且口服利福平治疗组。
不良事件
66只受感染的兔中，共有6只在完成治疗之前死去。5只兔死于替加环素治疗组中，其中1只因为营养状况严重损害而在第19天被处以安乐死。另一只兔由于胃小肠结肠炎死于替加环素治疗的第17天。本组中有三只由于胃小肠结肠炎和无法耐受麻痹而死于第28天。替加环素+利福平组中一只兔由于胃小肠结肠炎死于治疗期间的第15天。
胃小肠结肠炎很可能是由大肠正常菌丛的变化而引起的。每周监测所有兔的重量变化。对照组显示了最大的平均增重(0.58kg+/-0.27)，万古霉素组第二(0.39kg+/-0.26)，万古霉素+利福平组第三(0.21kg+/-0.32)。替加环素组(-0.05kg+/-0.32)和替加环素+利福平(-0.39+/-0.31)组均在抗生素治疗后减重。启用抗生素后约1.0-1.5周，替加环素组和替加环素+利福平组中几乎所有兔均表现了轻度至严重的胃功能障碍症状，包括胃口减弱、脱水、腹泻和/或减重。附图4A和B表明了所有组之间的重量变化。附图4A和B的关键词如下：对照＝对照组，未治疗；万古霉素＝皮下给予万古霉素治疗组；万古霉素+利福平＝皮下给予万古霉素且口服利福平治疗组；Gar-936＝皮下给予Gar-936治疗组；Gar+利福平＝皮下给予Gar-936且口服利福平治疗组。
至于安全性，在使用替加环素治疗的兔组中观察到较大数目的死亡和副作用。由替加环素引发的小肠结肠炎可能是正常肠菌丛的广泛破坏所导致。这些症状通过口服给予益生素而减弱。替加环素的宽广抗菌谱，与万古霉素的较窄谱相反，可帮助解释在治疗组之间所观察到的差别。
结果
各组织中各动物的计数数据列于表2中。表中计数是针对各组织一式三份测量的均值。检查表2中计数显示了在使用测试品治疗的治疗组中，大多数或者全部动物的计数是0。在对照组中，15只动物中有5只骨髓内测量为非零计数，15只动物中有11只骨内测量为非零计数。对照组中非零计数的大小存在相当大的变化，尤其对于骨而言。
在各治疗组中，阳性和阴性培养物的数目以及与对照组相比较的p值如下：
表2
兔体内骨髓炎研究的每克骨和骨髓的菌落形成单位计数
  治疗组   骨髓计数(CFU/克)   骨计数(CFU/克)
  对照组1   0   238
  2   0   0
  3   83,000,000   97
  4   0   0
  5   0   5000
  6   0   2380
  7   610,000   100000
  8   22,000   1000
  9   0   0
  10   0   50
  11   1700   1,100,000
  12   0   0
  13   4400   10,8000
  14   0   72.9
  15   0   106.3
  替加环素1   0   178.6
  2   0   0
  3   0   0
  4   0   0
  5   0   0
  6   0   0
  7   0   0
  8   0   0
  9   0   0
  10   0   0
  替加环素+   0   0
  2   0   0
  3   0   0
  4   0   0
  5   0   0
  6   0   0
  7   0   0
  8   0   0
  9   0   0
  10   0   0
  万古霉素1   1250   270.3
  2   0   1315.8
  3   0   0
  4
  5   0   0
  6   0   0
  7   0   0
  8   0   0
  9   0   0
  10   0   0
  11   0   0
  万古霉素+   0   0
  2   530,000,000   1,040,000
  3   0   0
  4   0   0
  5   0   0
  6   0   0
  7   0   0
  8   0   0
  9   0   0
  10   0   0
替加环素、万古霉素和利福平治疗兔骨髓炎的比较数据
在骨髓中，替加环素和替加环素+利福平治疗组中阳性培养物的比例为0，其与对照组中0.33(5/15)的比例相比在常规的p＝0.05水平上几乎有统计学上的显著性(p＝0.06)。万古霉素以及万古霉素+利福平组中的比例相对于对照组没有统计学上的显著差异。在骨中。使用测试品治疗的各组中阳性培养物的比例在统计学上显著地低于对照组中的比例。
在甲氧西林耐药性金黄色酿脓葡萄球菌的动物模型中，心内膜炎，14mg\kg每天两次的替加环素显示较40mg\kg万古霉素更为有效(Murphy，Antimicrob Agents Chemother 2000；44(11)：3022-3027)。在大鼠模型中，给予高达80mg\kg\天的剂量。但是，在本文说用的兔模型中，高于14mg/kg每天的给药剂量在动物体内导致相应的发病率和死亡率(未显示数据)。因此，在本研究中使用上述剂量。即使目标不是研究替加环素在兔子体内的药物动力学，也进行多药物水平的测量从而确保在动物模型中使用了足够的剂量。数据证明末次给药后12小时血清中药物水平仍高于所用葡萄球菌株的MIC，而且，该药物业示了相关的骨渗透，并在受感染或未感染的骨内发现治疗水平的替加环素。另一个相关发现是在受感染的骨内发现较高浓度的药物，其需要进一步研究。
实施例2：静脉内一次给药100mg后替加环素在人组织内的分布。
本实施例表明了单次静脉内给予替加环素后人类受试者体内所选组织的渗透。数据证明了快速分布期、具有延长的半衰期并在稳态时具有高分布容积。进一步证实了在人类受试者体内的骨、滑液、肺、胆囊和结肠的渗透。渗透改善了骨和关节感染的治疗。
人体内静脉内给予替加环素的药物动力学研究已表明存在快速分布期、具有延长的半衰期(40-60小时)并在稳态时具有高分布容积。使用放射标记替加环素的动物研究表明该快速分布期和稳态时的高分布容积代表替加环素渗透入包括肺和骨的组织。以3mg/kg的剂量经30分钟输注给予Sprague-Dawley大鼠(18只雄性)碳-14替加环素。在输注末以及输注结束后1、8、24、72和168小时，各时间点测定3只大鼠组织内的放射能浓度。对于所有组织，于输注结束时观察到放射能峰浓度。通常，放射能良好地分布于大多数组织，最高浓度如下：骨＞骨髓＞唾液腺，甲状腺，脾和肾。在各组织中，组织内浓度-时间曲线下面积与血浆内浓度-时间曲线下面积的比值＞10。
本研究的目的在于确定在选定的时间点肺、结肠、胆囊组织、骨和滑液中的替加环素组织浓度以及相应的血清浓度。单次剂量静脉内给予替加环素的受试者经预定的肺、结肠、胆囊或骨手术或者腰椎穿刺而取出样品。
开始在30分钟内给予单次剂量的100mg替加环素后，于4小时、8小时、12小时或24小时在手术期间针对各受试者采集预定的肺、结肠、胆囊、骨和滑液的组织/液体样品。在0小时(首剂量之前)、大约30分钟(输注结束时)以及在相应于组织/液体采集的时间，从所有受试者采集血清。根据下面阐述的方法测定组织和血清浓度。
血清样品的研究参数
根据已验证的方法分析来自接受替加环素的研究受试者的人类血清和组织。血清样品和滑液(0.2ml)与0.6ml溶于乙腈中的内标混合，上清液蒸发至干和并使残留物重新构成200微升的流动相。将重新构成的等分样品(10微升)注射到LC/MS/MS中。
根据PE SCIEX″Analyst″1.3版软件获得并分析数据。具有1/x2权重的线性回归用于获得校准曲线的最匹配数据。定量的下限是10ng/ml血清和滑液样品、10ng/ml结肠和胆囊样品、以及30ng/ml骨样品。
使用各组血清样品分析在人血清中制备的低(25ng/ml)、中(500ng/ml)和高(1500ng/ml)定性对照样品(2套)。
对于结肠、胆囊和肺样品，使用各组组织样品分析了25、500和1500ng/g的两套定性对照样品。对于骨，使用各套组织样品分析了100、500和1500ng/g的两组定性对照样品。
血清和滑液的曲线在10-2000ng/ml范围内是线性的，组织的曲线在定量下限至2000ng/ml范围内是线性的。如果至多两个定性对照样品在目标的85-115％范围外且没有两个相同浓度的定性对照样品在该范围外，那么该过程是成功的。如果两个相同浓度的定性对照样品在该范围外，则仅报道剩余定性对照样品之间的浓度。
血清样品的材料和方法
在人血清中使用LC/MS/MS法测量替加环素。通过溶解于甲醇中制备1mg/ml的替加环素初级储备液。由初级储备液通过使用乙腈稀释至约40,000ng/ml的浓度制备二级储备液。不用时，将储备液置于-20℃储存。在甲醇中制备浓度为1mg/ml的叔丁基-d9-替加环素的初级内标溶液。通过在乙腈中将初级储备液稀释至100微克/ml并加入0.1％三氟乙酸酯而制备二级内标标准储备液。初级和二级储备液于-20℃储存。通过使用乙腈/0.1％三氟乙酸酯稀释至容积而制备工作内标。不用时，该工作内标于4℃储存。在分析当天，用于制备标准曲线操作溶液之前使二级储备液升至室温。通过系列稀释于空白人血清于大约2000、1600、1000、500、250、100、50、20和10ng/ml制备标准曲线。
提取方法如下：向200微升校准液、定性对照品或样品，加入600微升内标工作液并涡流混合。样品于13000rpm离心10分钟以分离各层并将上清液转移至培养管中。在Speed Vac中蒸发样品至干。残留物在200微升流动相中经超声处理重新构成并向LC/MS/MS中注射10微升。
LC/MS/MS由HPLC(Agilent 1100)、质谱仪(Applied BiosystemsAPI3000)、柱(Aquasil C18，50×2.1mm i.s.，5微米(ThermoKeystone)组成，流动相为16％乙腈、6％甲醇、78％水和0.1％四氟乙酸酯，流速约为0.35ml/min，注射容积为10微升。检测器条件：周期内119次扫描、MRM扫描类型、正极性、涡轮离子喷雾源，低分辨率，使用6psi氮气作为雾化气、屏蔽气和碰撞气，具有4500mv的离子能，且离子喷雾的温度为450℃。该检测器监测替加环素和内标。
在三个分析流程中分析样品。在样品分析的各天，连同定性对照样品和研究受试样品一起运行完整的标准曲线。对测定浓度大于最高校准物的样品进行稀释，混合100微升样品与900微升空白人血清并如前所述分析200微升该混合物。通过与在适当基质中得到并使用(1/浓度)2加权因子计算的标准曲线相比较从而量化血清中的替加环素。
替加环素的定量界限为10ng/ml。在任一预剂量样品中，未检测到干扰任一替加环素异构体测定的峰。所有校准物和定性控制样品均在范围之内(目标的85-115％)。样品结果示于表1中。标准曲线和校准物的结果示于表4中。
组织样品的研究参数
根据上面的血清样品调查研究参数制备储备液和内标溶液。标准曲线工作溶液被配制为约10000、8000、5000、2500、500、250、100和50mg/ml。在分析当天，将40微升的工作溶液加入在200mg组织中以制备的2000、1600、1000、500、250、100、50、20和10μg/ml校准物。犬组织代替人类组织从而制备校准物和定性对照样品。由于犬胆囊的可获得性有限，犬结肠被用于制备分析人类胆囊的标准曲线。已证明结肠是分析胆囊样品的适当替代基质。
提取方法如下：向200mg校准物、定性对照品或样品，加入3ml内标工作液，使用手动均匀器搅匀样品。样品于14000rpm离心10分钟以分离各层并将上清液转移至离心管中。样品在Speed Vac中蒸发样品至干。残留物在200微升流动相中经超声处理重新构成并向LC/MS/MS中注射10微升。LC/MS/MS的条件与分析血清样品中所用的相同。以与血清样品相同的方法萃取滑液样品。
样品经若干分析操作进行分析。在分析样品的各天，连同定性对照样品和组织一起运行完整的标准曲线。在与所分析的组织样品相称的替代基质中制备标准曲线。测定浓度大于最高校准物(200ng/g)的样品与10或20倍浓度的内标进行均匀化以用于标准曲线。将等分样品(300微升)(10倍稀释液)蒸发至干且重新构成样品以至峰面积比和峰面积在标准曲线范围内。
通过与在适当基质中得到并使用(1/浓度)2加权因子计算的标准曲线相比较从而量化组织中的替加环素。对于滑液，在磷酸缓冲盐水中制备校准物。在人造滑液中制备第二套校准物，人造滑液的组成为：100mmol/L葡萄糖、2.03-2.26g/L透明质酸盐以及约8g/L白蛋白并调整至pH 7.4。在PBS中制备的校准曲线和恢复，校正因子的计算是通过使用幂方程(y＝y0+axb)对于从PBS曲线测定的人造滑液样品的浓度相对于那些样品的理论浓度进行线性回归。因为研究受试样品的测定浓度在校准曲线的低范围内，仅使用20-500ng/ml的校准物进行计算该回归。该回归的结果表明了高度相关(r2＝0.9996)，而且在标准曲线的整个范围(20-2000ng/ml)内ASF校准物的回算浓度在它们目标值的94-122％之间。然后将该回归方程用于来自PBS标准曲线的研究受试样品浓度并确定滑液校品中替加环素的校正浓度。
替加环素的定量界限为10ng/ml。在分析的所有基质中均可测量出替加环素的浓度。浓度与该样品相似的所有校准物和定性对照样品均在范围之内(目标的85-115％)。样品结果示于表4(组织)和表5(滑液)中。
结果
数据证明了快速分布期、具有延长半衰期并在稳态时具有高分布容积。还证实了在人受试者体内的骨、滑液、肺、胆囊和结肠渗透。因此，滑液中浓度表明了快速分布并且与处于相似时间的血清数据相比延长了替加环素的保留。
表3
血清分析结果
  计算的样品   计算的浓度   计算的时间 样品 浓度 时间 样品 浓度 时间
  ID1A1B1C2A2B2C4A4B4C5A5B5C6A6B6C7A7B7C8A8B8C9A9B9C10A10B10C11A11B11C12A12B12C15A15B15C16A16B16C17A17B17C18A18B18C19A19B19C20A20B   In&mllBQL′545081.6BQL1080151BQL1490175BQL1100116BQL1170113BQL164097.2BQL1710186BQL1860221BQL27400244BQL132047.2BQL695054.4BQL1960250BQL741107BQL111051BQL761133BQL1240162BQL903   小时00.52400.5400.5400.51200.51200.51200.5400.5400.5400.51200.52400.5400.51200.52400.5800.5400.5   I.D.22A22B22C23A23B23C24A24B24C25A25B25C26A26B26C27A27B27C28A28B28C29A29B29C30A30B30C31A31B31C32A32B32C33A33B33C34A34B34C35A35B35C36A36B36C37A37B37C38A38B   fnpJmlZBQL1810251BQL153074.4BQL165085.6BQL3550136BQL878120BQL84778.9BQL922120BQL5190147BQL119050.8BQL2320166BQL355042.1BQL62043.7BQL408092.7BQL243053.6BQL230065.7BQL241595.7BQL4600   小时00.5400.52400.51200.5400.51200.51200.51200.5400.52400.5400.52400.52400.51200.52400.52400.51200.5   I.D40A40B40C41A41B41C42A42B42C43A43B43C44A44B44C45A45B45C46A46B46C47A47B47C48A48B48C49A49B49C50A50B50C51A51B51C52A52B52C53A53B53C54A54B54C55A55B55C   fnpJmllBQL195080.6BQL2580191BQL789198BQL115077.4BQL954144BQL894299BQL142066.6BQL447252BQL97686.9BQL1200102BQL1430186BQL72644.7BQL821125BQL1060209BQL1850206BQL628431   小时00.52400.51200.5800.52400.5400.5400.52400.5400.52400.51200.5800.52400.5400.5400.5800.54
  20C21A21B21C   106BQL870778   1200.54   38C39A39B39C   106BQL5130342   1200.54
1BQP＝低于定量界限
表4
计算的组织分析结果       *BQP＝低于定量界限(＜33.2ng/ml)
  样品I.D.            浓度
  (n2/2)   组织
  001002004005006007008009010011012015016017018019020021022023024   8210156041.62070046.533.379.318901417640BQL840082493.337501890026986.650.01180BQL   胆囊胆囊骨胆囊骨骨骨肺骨胆囊骨胆囊胆囊骨胆囊胆囊骨结肠骨胆囊骨
  025026027028029030031032033034035037038039040041042043044045046047048050051052053054055   155091.2BQL5983240BQL5960938BQL34807783850BQL1981500106238995725814BQL453BQL61865335.5BQL36.1118   胆囊结肠骨结肠胆囊骨胆囊胆囊骨胆囊胆囊胆囊骨结肠胆囊结肠胆囊结肠结肠结肠骨结肠骨结肠肺骨骨骨结肠
表5
滑液分析结果
计算值
  样品   浓度(ng/ml)   时间I.D.(小时)
  468101220222430333846485254   39.962.815913046.411118165.037.825.965.755.445.070.670.9   412442412412242412242448
实施例3：使用替加环素治疗的大鼠体内的组织分布
本研究旨在量化组织中[14C]-替加环素产生的放射能，在对于雄性Sprague-Dawley和Long-Evans大鼠单次的30分钟3mg/kg静脉输注[14C]-替加环素后，使用荧光成像的整体放射自显影法。
材料和方法
替加环素由Analytical Department，Wyeth-Ayerst Research，Montreal，Canada提供。[14C]-替加环素由Amersham(Boston，MA)提供。主体[14C]-替加环素的放射化学纯度和比放射性分别为98％和93.6微Ci/mg。
使用无菌水制备静脉内给药溶液。用于计数血浆和尿中放射能的液体闪烁混合物为Ultima Gold(Packard Instruments Co.，Meriden，CT)。
装有Oximate-80 Robotic Automatic Sampler(Canberra-PackardCo.，Downers Grove，IL)的Model 3078 Tri-Carb Sample Oxidizer用于燃烧血样。使用Permafluor E液体闪烁混合物(cocktail)(PackardInstruments Co.，Meridan，CT)、Carbo-Sorb-E(Packard InstrumentsCo.，Meridan CT)二氧化碳吸附剂和去离子水捕获在氧化器中燃烧样品所产生的放射性二氧化碳。将血液等分样品转移至combustocones并覆盖垫子(Canberra-Packard Co.，Downers Grove，IL)进行燃烧。
使用具有Ultima Gold或甲苯标准曲线的Tri-Carb Model 2700 TR液体闪烁计数器(Canberra-Packard Co.，Downers Grove，IL)进行所有的放射能测定。通过应用已知放射能的外标将每分钟计数(CPM)转化为每分钟衰变数(DPM)。通过外部放射性标准的转换光谱指数(TSIE)确定每一标准的猝灭。检测下限被定义为两倍背景值。
雄性Sprague-Dawley和Long-Evans大鼠从Charles RiverBreeding Laboratories，Raleigh，NC获得，并在开始研究前至少一周被隔离。通过在12ml无菌水中溶解6.90mg未标记的替加环素和5.30mg[14C]-替加环素而制备静脉内给药溶液(1.02mg/ml)。该给药溶液经稀释并在Ultima Gold闪烁计数混合物(Packard Inc.)中直接进行放射测定。使用Packard 2700 TR液体闪烁谱仪(Canberra-PackardCo.)进行总放射能的全部测定。
大鼠体重为0.206-0.301kg。所有大鼠经由颈静脉插管接受单次30分钟静脉内输注给药[14C]-替加环素(3ml/kg，3mg/kg活性部分，40微Ci/kg)，使用Harvard输注泵22(Harvard Apparatus，Southnatick，MA)。在给予化合物之前校正所有泵。在给药预定时间之后穿心取血之前使用异氟烷麻醉大鼠。在给药后0.5、8.5、24、72、168和336小时每一时间点处死一只Sprague-Dawley和Long-Evans大鼠。
从雄性Sprague-Dawley大鼠将对照全血采集入含有肝素钠的管中。采集的血液用于制备校正标准物和定性对照样品。该标准用来构建标准曲线以量化全血低温切割的组织中放射标记药物的分布。定性对照品，其被包埋在各大鼠的相同CMC块中，用于评价大鼠整体低温切片内部和之间的厚度变化。
使用来自雄性Sprague-Dawley大鼠的全血逐次稀释200微Ci/ml的[14C]-葡萄糖储备液(New England Nuclear，Boston，MA)得到如下十四个浓度的标准液：832、485、250、122、48.6、24.3、12.0、4.72、2.36、0.853、0.638、0.405、0.327和0.221nCi当量/ml。低、中和高GC浓度为12.39、25.9和508nCi当量/ml。
安乐死后立即将各大鼠完全浸入己烷和干冰浴(-75℃)中直至冷冻。干燥各尸体并于-30℃储存直至包埋。通过加入低粘度10％羧甲基纤维素(CMC)在模具(15cm×45cm)中包埋各尸体并置于己烷-干冰混合物中冷冻。
将冻块转移至Jung Cryomacrocut 3000(Leica InstrumentsGmbH，Nussloch，Germany)并在切片前允许过夜平衡至低温切片机内部温度至少12小时。
于-20℃将各冷冻大鼠矢向切片。采集足够数目的切片以确保对所有目标组织采样。切片在冷冻室内脱水过夜然后被快速地转入包含CaSO4的干燥器中以防止湿气凝结同时平衡至室温。
将该切片安置于纸板上并使用[14C]-标记的黑墨水以唯一标识数字标记。放射性墨水由等量的印度墨汁和[14C]-CL-284846(100微Ci/ml)制备。将一小片Scotch胶带置于干燥后的放射性墨水上以防止污染储存荧光板。
将荧光成像板，BAS-SR 2025(Fuji Photo Film Co.，Japan)，置于亮可见光下照射20分钟使用IP擦除器(Raytest，USA Inc.，NewCastle，DE)除去背景照射。使切片和校正血液标准同时与Ips直接接触并照射7天。所有切片于室温下储存在铅屏蔽盒中以使背景水平最小化。使用Fujifilm BAS-5000 Bio-Imaging Analyzer产生荧光成像并使用MCID M2软件3.2版(Imaging Research Inc.，St.Catherines，Ontario，Canada)定量。使用环形取样工具在MICD软件程序中分析STD和QC。使用区域取样工具手动描绘全血切片中的目标面积以产生计数数据。
在校准曲线的基础上，通过数字分析所得放射自显影图确定所选组织中的放射性浓度。通过加权(1/x2)线性回归分析产生各标准液的所述浓度(nCi/g)相对于MCID应答、光激发光/mm2(PSL/mm2-减去变换为nCi/g的背景值)的校准曲线。线性回归曲线用于确定未知放射能的研究样品的浓度。使用取样工具分别列出或自动扫描在视觉上表现出放射能级的研究区(ROI)以获得放射能浓度。为了确定QwBAR的定量界限，确定了来自所测试血液标准的变异系数，定量的界限被定义为变异系数不超过15％的最低浓度。
将血浆等分样品与10ml Ultima GoldTM闪烁计数混合物(PackardInc.)合并并直接计数。使用Model 307样品氧化器(Packard InstrumentCompany)燃烧血样。使所得[14C]O2俘获于Carbo-Sorb中，加入闪烁混合物(Perma Flour E+)并使用LSC定量样品。
在Packard 2700 TR液体闪烁分光光度计(Canberra-PackardCo.)中计数样品10分钟或0.2sigma。通过使用已知放射能的外标生成的猝灭曲线将每分钟计数转变为每分钟衰变数。通过全光谱位移确定各标准和样品的猝灭。LSC定量的界限(LOQ)被定义为两倍背景值。
使用静脉内输注(Model 202)，Non-Compartment Analysis Moduleof WinNonlin，1.1版，(Scientific Consultants，Inc.Research TrianglePark，NC)计算[14C]-GAR-936产生的放射能的药物动力学参数，其采用与模型无关的方法且标准方法描述于Gibaldi和Perrier.Gibaldi，Pharmacokinetics，1982中。在测定平均浓度中，零替代低于定量下限(5.10ng当量/g)的任何值。对于静脉内输注给药，C30分钟为30分钟时的浓度，其是第一个取样点。静脉内给药后的最大血浆浓度(Cmax)和峰浓度的相应时间通过单独的浓度-时间数据的数值检查直接获得。通过Cn2/λz的比值计算终点半衰期，其中λz来自浓度时间曲线的最终斜率。使用梯形规则计算血浆浓度对从零点至无限大的时间曲线下的面积，其中C最终是最终可测量的血浆浓度。根据如下方程计算组织与血浆浓度的比值：C组织/C血浆，其中C组织等于组织中的药物浓度(ng当量/g)，且C血浆等于血浆中的药物浓度(ng当量/g)。
通过重量分析测试法测定[14C]-替加环素(基础)的比放射性为43.94μCi/mg(表1)。剂量溶液的浓度为1.02mg/ml。与3mg/kg的目标剂量相比动物所接受的平均剂量为3.09±0.11/kg。
结果
以3mg/kg静脉内输注[14C]-替加环素后Sprague-Dawley大鼠组织中总放射能的个体浓度(ng当量/g)示于表6中。组织中的药物动力学参数示于表7中。组织与血浆的比值示于表8中。
实际上对于所有组织，总放射能的个体峰浓度(Cmax)均出现在输注末期。放射能浓度最高的组织是肾(7601ng当量/g)、肝(7300ng当量/g)和脾(6627ng当量/g)(表7)。放射能峰浓度最低的组织是脑(54ng当量/g)和眼(108ng当量/g)(表7)。多数(70％)组织的Cmax高于2000ng当量/g。Cmax时血浆中替加环素产生的放射能低于除脑、眼、脂肪和睾丸以外的所有组织(表7)。经过24小时，除眼外所有组织中[14C]替加环素产生的放射能浓度(表6)均高于血浆。
对于除骨、肾、肝、皮肤、脾和甲状腺外的多数组织，在168小时放射能的个体组织浓度降至它们Cmax的1％或更低(表6)。在336小时，除骨、肾、皮肤和甲状腺外的多数组织中的浓度低于定量界限(5.10ng.当量/g)。然而，这些组织(骨、甲状腺、肾和皮肤)中的浓度从Cmax显著下降。通常，在336小时骨、肾、皮肤和甲状腺中[14C]-替加环素产生的放射能的组织浓度分别为Cmax的19％、0.18％、0/43％和6％。
使用AUC作为组织负担的指标，骨和甲状腺较其它组织具有较高负担。最高的AUC值出现在骨(794704ng当量·hr/g)、甲状腺(330047ng当量·hr/g)、唾液腺(110979ng当量·hr/g)、肾(70704ng当量·hr/g)、甲状腺(33047ng当量·hr/g)、脾(70522ng当量·hr/g)和肝(53527ng当量·hr/g)内。最低负担的组织是脑(2865ng当量·hr/g)、脂肪(3500ng当量·hr/g)和睾丸(10303ng当量·hr/g)。骨内的AUC暴露量高于第二高组织(甲状腺)两倍。对于大部分组织而言组织：血浆AUC比值高于1(表7)。
[14C]-替加环素产生的放射能的最终半衰期在低至脂肪中的5小时高至骨和甲状腺中超过200小时之间，相比血浆中的t1/2为24小时(表7)。具有最长清除半衰期的组织是甲状腺(804小时)、骨(217小时)、皮肤(182小时)和肾(118小时)(表7)。
对于除了脑、眼、睾丸和脂肪的大部分组织而言，在0.5和8.5小时时间点组织：血浆浓度比值(表8)高于1。在24小时，所有比值高于1。在72小时一些组织出现最高的组织与血浆比值：骨(414)、甲状腺(56)、皮肤(19.3)、脾(16.7)和肾(11.1)。血液：血浆比值在所有时间点均高于1，表明[14C]-替加环素产生的放射能大量分配于血细胞中。
还评价了给药后长达336小时，[14C]-替加环素产生的放射能向Long-Evans大鼠体内含有黑色素组织(皮肤和葡萄膜)的分布。Long-Evans大鼠体内[14C]-替加环素产生的放射能的血液和血浆浓度类似于Sprague-Dawley大鼠(表2和5)。在灌输结束(0.5h)时，观察到皮肤、葡萄膜、血浆和血液的放射能峰浓度(Cmax)(表9)。皮肤和葡萄膜中[14C]-替加环素产生的放射能的Cmax分别是1997和2502ng当量/g。皮肤和葡萄膜中[14C][14C]-替加环素产生的放射能的AUC分别为109296和233288ng当量·hr/g。皮肤和葡萄膜中的最终半衰期分别为473和20小时(表10)。半衰期值具有不可靠的含义，因为浓度-时间曲线中的清除期不具有必然性。这也反应在葡萄膜和皮肤AUC数据的外推中。
在所有时间点皮肤和葡萄膜的组织：血浆浓度比值均高于1(表7)。皮肤(179)和葡萄膜(393)的总体最高的组织与血浆比值出现在72小时。皮肤和葡萄膜的组织：血浆AUC比值分别是8.45和18.0，并表明这些组织选择性保留显著高浓度的[14C]-替加环素产生的放射能。数据表明放射能选择性分配于大鼠眼中含有黑色素区域。在336小时，皮肤和葡萄膜的放射能平均组织浓度分别降至Cmax的8和1％。
表6
单次30分钟输注[14C]-替加环素后雄性Sprague-Dawley大鼠体内组织中的总放射能平均浓度
  组织类型   0.5小时   8.5小时   24小时   72小时   168小时   336小时
  血液   1277   624   44.5   11.8   1.87   ＜1.03
  血浆   895   504   14.8   4.31   ＜1.03   ＜1.03
  肾上腺   3580   941   68.9   19.3   ＜5.10   ＜5.10
  骨   3312   3794   2711   1787   1526   720
  骨髓   4376   1562   291   22.5   ＜5.10   ＜5.10
  脑   35.8   54.3   35.8   13.3   ＜5.10   ＜5.10
  眼   106   108   36.6   6.76   ＜5.10   ＜5.10
  脂肪   450   144   ＜5.1   ＜5.10   ＜5.10   ＜5.10
  心脏   5657   1138   69.9   6.98   ＜5.10   ＜5.10
  肾   7601   1725   140   47.9   41.3   13.9
  肝   7300   1192   160   22.7   13.3   ＜5.10
  肺   2981   496   73.1   13.5   ＜5.10   ＜5.10
  淋巴结   3473   1276   180   29.1   ＜5.10   ＜5.10
  肌肉   2260   1863   85.8   6.24   ＜5.10   ＜5.10
  胰   4437   971   70.0   7.41   ＜5.10   ＜5.10
  脑垂体   3693   2014   144   18.8   ＜5.10   ＜5.10
  唾液腺   5771   6313   300   31.6   ＜5.10   ＜5.10
  皮肤   1929   577   249   83.1   7.32   8.34
  脾   6627   1691   476   72.0   18.8   ＜5.10
  睾丸   347   361   119   16.4   ＜5.10   ＜5.10
  胸腺   2528   1590   158   15.3   ＜5.10   ＜5.10
  甲状腺   2992   1762   354   242   218   187
表7
单次30分钟输注[14C]-替加环素后雄性Sprague-Dawley大鼠组织内总放射能的药物动力学参数
  组织类型   CmaxNg当量/g   T1/2   AUCNg当量hr/g   AUCNg当量hr/g   组织：血浆AUC
  血液   1277   105   12063   1261   1.15
  血浆   895   24   10643   10652   1.00
  肾上腺   3580   13   29153   29515   2.77
  骨   3794   217   569498   794704   74.6
  骨髓   4376   11   47116   47468   4.46
  脑   54   32   2256   2865   0.269
  眼   108   17   3060   3221   0.302
  脂肪   450   5   2489   3500   0.329
  心脏   5657   9   40083   40179   3.77
  肾   7601   118   68333   70704   6.64
  肝   7300   44   52676   53527   5.03
  肺   2981   13   21263   21523   2.02
  淋巴结   3473   13   36478   37010   3.47
  肌肉   2260   8   34833   34910   3.28
  胰   4437   10   32908   33014   3.10
  脑垂体   3693   10   44882   45164   4.24
  唾液腺   6313   9   110558   110979   10.4
  皮肤   1929   182   31819   36471   3.42
  脾   6627   33   69638   70522   6.62
  睾丸   361   15   9975   10323   0.97
  胸腺   2528   10   35204   35430   3.33
  甲状腺   2992   804   113022   330047   31.0
表8
单次30分钟输注[14C]-替加环素后雄性Sprague-Dawley大鼠体内的组织：血浆比值
  组织类型   0.5小时   8.5小时   24小时   72小时   168小时   336小时
  血液   1.43   1.24   3.01   2.74   NA   NA
  血浆   1.00   1.00   1.00   1.00   NA   NA
  肾上腺   4.00   1.87   4.67   4.47   NA   NA
  骨   3.70   7.53   184   414   NA   NA
  骨髓   4.89   3.10   19.7   5.21   NA   NA
  脑   0.040   0.108   2.42   3.10   NA   NA
  眼   0.118   0.215   2.46   1.57   NA   NA
  脂肪   0.50   0.287   NA   NA   NA   NA
  心脏   6.32   2.26   4.74   1.62   NA   NA
  肾   8.49   3.42   9.49   11.1   NA   NA
  肝   8.16   2.37   10.8   5.26   NA   NA
  肺   3.33   0.984   4.96   3.13   NA   NA
  淋巴结   3.88   2.53   12.2   6.75   NA   NA
  肌肉   2.52   3.70   5.801   1.45   NA   NA
  胰   4.96   1.93   4.75   1.72   NA   NA
  脑垂体   4.13   4.00   9.79   4.36   NA   NA
  唾液腺   6.45   12.53   20.3   7.32   NA   NA
  皮肤   2.15   1.14   16.9   19.3   NA   NA
  脾   7.40   3.36   32.3   16.7   NA   NA
  睾丸   0.388   0.716   8.08   3.80   NA   NA
  胸腺   2.82   3.16   10.7   3.55   NA   NA
  甲状腺   3.34   3.50   24.0   56.0   NA   NA
表9
单次30分钟输注[14C]-替加环素后雄性Long-Evans大鼠体内组织中的总放射能平均浓度(ng当量/g)
  组织类型   0.5小时   24小时   72小时   168小时   336小时
  血液   1296   340   11.8   2.72   1.24
  血浆   975   70.5   4.31   ＜1.03   ＜1.03
  葡萄膜   1997   124   96.5   74.8   19.3
  皮肤   2502   2363   1787   351   211
表10
单次30分钟输注[14C]-替加环素后雄性Long-Evans大鼠组织内总放射能的药物动力学参数
  组织类型   CmaxNg当量/g   T1/2   AUCNg当量hr/g   AUCNg当量hr/g   组织：血浆AUC
  血液   1296   62   21843   21954   1.70
  血浆   975   19   12923   12938   1.00
  皮肤   1997   473   58287   109296   8.45
  葡萄膜   2502   201   131346   233288   18.0
表11
单次30分钟输注[14C]-替加环素后雄性Long-Evans大鼠体内的组织：血浆比值
  组织类型   0.5小时   24小时   72小时  168小时  336小时
  血液   1.33   4.81   5.05  5.05  NA
  血浆   1.00   1.00   1.00  1.00  NA
  皮肤   2.05   8.76   179  179  NA
  葡萄膜   2.57   25.7   393  393  NA
讨论
向Sprague-Dawley和Long-Evans大鼠单次三十分钟静脉内输注(3mg/kg)[14C]-替加环素后评价放射能向组织的分布。放射能快速分布于组织，在输注结束时(0.5hr)观察到多数组织的Cmax。组织浓度与先前进行的组织切片法研究类似。替加环素向多种组织的广泛分布表明了很大的分布容积。本发现证实了先前在大鼠和狗体内观察到的高分布容积。通常，放射能从多数组织的清除慢于从血浆的清除。
在多数时间点，Sprague-Dawley大鼠组织内的[14C]-替加环素产生的放射能浓度高于血浆。在168小时，多数组织的放射能组织浓度降至其输注结束值的1％或更低。经过336小时，骨、甲状腺、肾和皮肤内的浓度分别降至Cmax值的19％、6.25％、0.18％和0.43％。
如平均AUC值所示，Sprague-Dawley大鼠体内具有最高暴露水平的组织是骨、甲状腺、唾液腺、肾和脾。清除半衰期相当长(5-217小时)，骨、皮肤和甲状腺具有最长的清除半衰期。甲状腺组织的半衰期值具有不可靠的含义，因为浓度-时间曲线中的清除期不具有必然性。这还反应在由AUC数据外推AUC中。
所有时间点的组织与血浆以及血液与血浆的比值高于1表明[14C]-替加环素产生的放射能基本上分配进入组织和血细胞。根据本研究的组织与血浆比值结果类似于静脉内给予米诺环素后大鼠的组织与血浆比值结果。
尽管不限于理论，骨内高放射能浓度可能是由于替加环素与钙螯合。文献已报道了四环素(米诺环素、choloretetracyclines)与钙或其它金属离子形成螯合复合物并由此粘附于骨的能力。在本研究中，[14C]-替加环素产生的放射能显著地保留于骨内，AUC为794704ng当量·hr/g。该值约高出血浆75倍。还在骨中观察到217小时的表观清除半衰期。骨内保留的放射能可解释静脉内给药5mg/kg后在雄性Sprague-Dawley大鼠体内质量平衡研究中观察到的某些未完全回收(89.4+2.50％)的[14C]-替加环素。骨内的暴露量(AUC)高于第二高组织(甲状腺)2.5倍。[14C]-替加环素产生的放射能还表现了对于骨和甲状腺组织的强烈亲和力以及长半衰期，这也类似于其它已知的四环素。
在肾中长达336小时内可检测到[14C]-替加环素产生的放射能浓度且高于除骨和甲状腺外的其它组织的浓度。但是，在质量平衡研究以及胆汁和尿排泄研究中，大部分[14C]-替加环素产生的放射能在开始的48小时被排泄，表明一些[14C]-替加环素产生的放射能可以以高亲和力结合于肾组织。也已知四环素结合于肾组织。
如QWBAR所测定的，大鼠眼组织中的放射能仅选择性分布于Long-Evans大鼠体内含有黑色素组织，即葡萄膜以及皮肤。在0.5小时后所有时间点，葡萄膜具有相对高浓度的放射能，表明了显著的暴露水平和长半衰期。在先前进行的使用组织切割法的研究中，对完整眼球的评价揭示了该器官中存在放射能，但无法将该放射能定位于任一特定眼组织。
通过常规的液体闪烁计数(LSC)测定的14个标准液以及28个QCS浓度类似于对于这些相同标准液的QWVAR评价。这些标准液暴露于14个不同储存荧光屏导致可靠的MCID应答，其与LCS测定的比活性相关，表明了不同天之间以及同一天之内的变化非常低。QWBAR法的CV和准确度在可接受界限内(≤20％)。MCID应答的再现性和常规LSC与QWBAR之间比活性的良好相关性证明了RBC标准是放射能的均匀浓度。本研究中观察到的变化被认为与低温切割、QWBAR技术以及显像分析等多种方面相关。表明QWBAR是可重现的，其灵敏度为0.221nCi/g(定量的下限)。动态范围在0.221-832nCi/g四个数量级是线性的。
因此，大多数组织中[14C]-替加环素产生的放射能的组织浓度高于血浆浓度。通常，放射能从大多数组织中的清除慢于从血浆中的速率。大多数组织中的AUC高于血浆，表明大多数组织缓慢地清除[14C]-替加环素产生的放射能。

Claims (48)

1.一种治疗哺乳动物体内骨或骨髓感染的方法，包括给予哺乳动物药理学有效量的替加环素。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括给予选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素的抗菌剂。
3.根据权利要求2的方法，其中抗菌剂是利福平。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中感染包括选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌和需氧菌的病原体。
5.根据权利要求4的方法，其中病原体选自包括葡萄球菌、不动杆菌、分枝杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌、链球菌、肠杆菌科、肠球菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、奈瑟氏球菌、立克次氏体、肺炎球菌、普雷沃菌、peptostreptococci、军团拟杆菌、β-溶血的链球菌、B组链球菌和螺旋体的病原体。
6.根据权利要求5的方法，其中感染包括奈瑟氏球菌、分枝杆菌、葡萄球菌和嗜血杆菌。
7.根据权利要求6的方法，其中感染包括脑膜炎奈瑟氏球菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、金黄色酿脓葡萄球菌、表皮葡萄球菌或流感嗜血杆菌。
8.根据权利要求4的方法，其中病原体显示抗生素耐药性。
9.根据权利要求8的方法，其中抗生素耐药性选自甲氧西林耐药性、糖肽类耐药性、四环素耐药性、土霉素耐药性、强力霉素耐药性；氯四环素耐药性、米诺环素耐药性米诺环素耐药性、甘氨酰环素耐药性、头孢菌素耐药性、环丙沙星耐药性、呋喃妥因耐药性、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺药耐药性、哌拉西林/他唑巴坦耐药性、莫西沙星耐药性、万古霉素耐药性、替考拉宁耐药性、青霉素耐药性和大环内酯耐药性。
10.根据权利要求9的方法，其中糖肽类耐药性是万古霉素耐药性。
11.根据权利要求5的方法，其中病原体选自金黄色酿脓葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌或酿脓链球菌。
12.根据权利要求11的方法，其中感染包括金黄色酿脓葡萄球菌。
13.根据权利要求12的方法，其中金黄色酿脓葡萄球菌显示选自糖肽类抗生素耐药性、四环素耐药性、米诺环素耐药性、甲氧西林耐药性、万古霉素耐药性以及除替加环素之外的甘氨酰环素耐药性的抗生素耐药性。
14.根据权利要求5的方法，其中感染包括鲍氏不动杆菌。
15.根据权利要求14的方法，其中鲍氏不动杆菌显示选自头孢菌素耐药性、环丙沙星耐药性、呋喃妥因耐药性、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺药耐药性和哌拉西林/他唑巴坦耐药性的抗生素耐药性。
16.根据权利要求5的方法，其中感染包括脓肿分枝杆菌。
17.根据权利要求16的方法，其中脓肿分枝杆菌显示莫西沙星耐药性。
18.根据权利要求5的方法，其中感染包括流感嗜血杆菌。
19.根据权利要求5的方法，其中感染包括粪肠球菌。
20.根据权利要求5的方法，其中感染包括大肠杆菌。
21.根据权利要求5的方法，其中感染包括淋病奈瑟氏菌。
22.根据权利要求5的方法，其中感染包括普氏立克次氏体、斑诊伤寒立克次氏体或立氏立克次氏体。
23.根据权利要求4的方法，其中感染引起骨髓炎。
24.一种治疗哺乳动物体内关节感染或关节周边组织感染的方法，包括给予哺乳动物药理学有效量的替加环素。
25.根据权利要求1的方法，进一步包括给予选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素的抗菌剂。
26.根据权利要求25的方法，其中抗菌剂是利福平。
27.根据权利要求24、25或26的方法，其中感染包括选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌和需氧菌的病原体。
28.根据权利要求27的方法，其中病原体选自包括葡萄球菌、不动杆菌、分枝杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌、链球菌、肠杆菌科、肠球菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、奈瑟氏球菌、立克次氏体、肺炎球菌、普雷沃菌、peptostreptococci、军团拟杆菌、β-溶血的链球菌、B组链球菌和螺旋体的病原体。
29.根据权利要求28的方法，其中感染包括奈瑟氏球菌、分枝杆菌、葡萄球菌和嗜血杆菌。
30.根据权利要求29的方法，其中感染包括脑膜炎奈瑟氏球菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、金黄色酿脓葡萄球菌、表皮葡萄球菌或流感嗜血杆菌。
31.根据权利要求27的方法，其中病原体显示抗生素耐药性。
32.根据权利要求31的方法，其中抗生素耐药性选自甲氧西林耐药性、糖肽类耐药性、四环素耐药性、土霉素耐药性、强力霉素耐药性；氯四环素耐药性、米诺环素耐药性米诺环素耐药性、甘氨酰环素耐药性、头孢菌素耐药性、环丙沙星耐药性、呋喃妥因耐药性、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺药耐药性、哌拉西林/他唑巴坦耐药性、莫西沙星耐药性、万古霉素耐药性、替考拉宁耐药性、青霉素耐药性和大环内酯耐药性。
33.根据权利要求32的方法，其中糖肽类耐药性是万古霉素耐药性。
34.根据权利要求28的方法，其中病原体选自金黄色酿脓葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌或酿脓链球菌。
35.根据权利要求34的方法，其中感染包括金黄色酿脓葡萄球菌。
36.根据权利要求35的方法，其中金黄色酿脓葡萄球菌显示选自糖肽类抗生素耐药性、四环素耐药性、米诺环素耐药性、甲氧西林耐药性、万古霉素耐药性以及除替加环素之外的甘氨酰环素耐药性的抗生素耐药性。
37.根据权利要求28的方法，其中感染包括鲍氏不动杆菌。
38.根据权利要求37的方法，其中鲍氏不动杆菌显示选自头孢菌素耐药性、环丙沙星耐药性、呋喃妥因耐药性、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺药耐药性和哌拉西林/他唑巴坦耐药性的抗生素耐药性。
39.根据权利要求28的方法，其中感染包括脓肿分枝杆菌。
40.根据权利要求39的方法，其中脓肿分枝杆菌显示莫西沙星耐药性。
41.根据权利要求28的方法，其中感染包括选自流感嗜血杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、普氏立克次氏体、斑诊伤寒立克次氏体或立氏立克次氏体的病原体。
42.根据权利要求27的方法，其中关节感染或关节周边组织的感染引起脓毒性关节炎。
43.药理学有效量的替加环素用于治疗哺乳动物体内骨、骨髓或关节感染的应用。
44.药理学有效量的替加环素和选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素的抗菌剂用于治疗哺乳动物体内骨、骨髓或关节感染的应用。
45.药理学有效量的替加环素用于制备治疗哺乳动物体内骨、骨髓或关节感染的药物的应用。
46.药理学有效量的替加环素和选自利福霉素、利福平、利福喷丁、利福昔明或曲张链菌素的抗菌剂用于制备治疗哺乳动物体内骨、骨髓或关节感染的药物的应用。
47.根据权利要求43-45的应用，其中骨或骨髓感染引起骨髓炎。
48.根据权利要求43-45的应用，其中关节感染或关节周边组织感染引起脓毒性关节炎。
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