PT1635855E - ¿antagonistas de r-caderina selectivos e métodos - Google Patents

Description

ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Antagonistas de R-caderina selectivos e métodos" Referência cruzada com aplicações relacionadas 0 presente pedido reivindica o beneficio do pedido provisório dos E.U.A para a patente com o N° de série 60/467188, apresentado em 1 de Maio, 2003.

Declaração de interesse do governo A presente invenção foi realizada com apoio do governo dos Estados Unidos da América sob as bolsas N° EY11254 e EY12598 do National Institutes of Health. O governo dos Estados Unidos da América detém alguns direitos sobre a presente invenção.

Campo da invenção A presente invenção refere-se em geral a antagonistas de moléculas de adesão celular de mamífero. Mais especificamente, a invenção refere-se a antagonistas peptídicos selectivos da R-caderina de mamífero (caderina-4) que são úteis para inibir a adesão celular e a angiogénese retinal.

Antecedentes da invenção A família de moléculas de caderina consiste de glicoproteínas transmembranares que actuam em interacções célula-célula selectivas, dependentes de cálcio. Estas moléculas desempenham papéis importantes durante o desenvolvimento embrionário e morfogénese de tecidos, ao mediar o reconhecimento celular e discriminação celular. As subfamílias de caderinas (caderinas clássicas, protocaderinas, desmocolinas e outras proteínas relacionadas com caderina) caracterizam-se por números variáveis de domínios de caderina extracelulares, um único segmento transmembranar e um único domínio citoplásmico. Está descrito que as designadas caderinas clássicas (i.e., E, P, N, e R-caderina) têm cinco domínios de caderina extracelulares, repetidos uns a seguir 3 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ aos outros (EC1-EC5) que estão envolvidos em interacções preferencialmente homofílicas e uma cauda citoplásmica altamente conservada que medeia a sinalização intracelular especifica de adesão.

As adesões célula-célula mediadas por caderina ocorrem à medida que múltiplas moléculas de caderina expressas em células adjacentes interagem, levando à formação de junções aderentes. De acordo com o modelo de fecho de correr de caderina proposto por Shapiro et al. Nature 1995; 374(6520):327-37, as moléculas de caderina no seio da membrana da mesma célula formam dimeros de cadeias paralelas, coesos (i.e., os designados dimeros-cis). Como ilustrado na FIG. 1, estes dimeros-cis ligam-se em seguida a dimeros de caderina expressos em células adjacentes (i.e., trans-dimerização). Quando existe uma interacção suficiente mantida, pode ocorrer a aglomeração de caderina à medida que mais moléculas de caderina são recrutadas para o local, levando à interdigitação de moléculas das duas superfícies celulares. Deste modo, poderá ocorrer a combinação de interacções relativamente fracas formando adesões célula-célula relativamente fortes.

Após a adesão inicial de caderina, sinais intracelulares, transmitidos através de interacções das caudas de caderina citoplásmicas com moléculas de α e β-catenina, levam à reorganização do citoesqueleto. Embora se pense que a associação com filamentos de actina não afecta a ligação homofilica, a sua associação ajuda a manter as moléculas de caderina nos locais de interacção. Numa relação do tipo simbiótico, a aglomeração de caderina provoca a reorganização do citoesqueleto e proporciona pontos de ligação à membrana, que são importantes para as alterações celulares que ocorram após formação das junções aderentes. Entretanto, a associação com o citoesqueleto mantém as caderinas nos locais de interacção e ajuda a recrutar novas moléculas de caderina, mediando deste modo a aglomeração de caderina. O cálcio desempenha um papel importante como co-factor durante a aglomeração de caderina. A função de caderina é perdida e as moléculas tornam-se mais susceptiveis à degradação por proteases em soluções com concentrações insuficientes de iões cálcio (i.e., inferiores a cerca de 2 mM) . isto deve-se à 4 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ necessidade de cálcio para estabilizar a estrutura das moléculas de caderina e proporcionar a orientação adequada de interfaces de caderina adjacentes.

Embora esteja descrito que cada um destes cinco domínios de caderina clássicos, extracelulares, EC1 a EC5 desempenha um papel importante na mediação da dimerização de caderina, a análise mutacional suqeriu que a maioria dos resíduos que formam a interface de dimerização são encontrados no domínio de caderina mais N-terminal (EC1) (Kitagawa, et ai., Biochem. Bíophys. Res. Commun., 2000; 271(2):358-63.). No entanto, pouco é conhecido acerca dos mecanismos de homodimerização específica entre moléculas de caderina.

As caderinas desempenham um papel significativo durante a orientação neuronal e desenvolvimento do sistema nervoso central. Diferentes subdivisões do cérebro estão definidas pela expressão diferencial de tipos de caderina. As caderinas também desempenham um papel importante no desenvolvimento retinal neural por expressão específica em diferentes regiões da retina em desenvolvimento. Por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário de retina de pintainho, a B-caderina é apenas encontrada na glia de Miiller, enquanto que algumas populações de células bipolares expressam R-caderina (também conhecida como caderina-4). As células amácrinas e um subconjunto de células ganglionares expressam as caderinas 6B e 7. Na camada plexiforme interna da retina, estas mesmas caderinas são apenas expressas em sublâminas associadas com terminais nervosos positivos de sinapsina-I, sugerindo que perfis de expressão distintos contribuem para a formação de sinapses entre subpopulações específicas de neurónios durante o desenvolvimento da retina. No nervo óptico embrionário, o crescimento do axónio da célula ganglionar é mediado por adesão de N-caderina com células gliais que expressam R-caderina. A adesão de caderina também desempenha um papel na vascularização retinal durante o desenvolvimento (Dorrell, et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2002; 43(11):3500-10). A interrupção da adesão de R-caderina durante a formação do plexo vascular superficial resulta na perda de interconexões vasculares complexas, observadas durante a formação do padrão 5 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ vascular normal. Quando a adesão de R-caderina é bloqueada durante a formação subsequente de camadas vasculares profundas, as vias de orientação chave são perdidas, fazendo com que os vasos migrem para além dos plexos vasculares profundos normais e para dentro da camada fotorreceptora. A retina consiste de camadas neuronais, gliais e de elementos vasculares bem definidas. Qualquer doença ou condição que altere as camadas retinais, mesmo que ligeiramente, pode levar à degeneração neuronal e perda visual significativa. 0 ratinho de degeneração retinal (ratinho rd/rd) tem sido investigado desde há mais de 70 anos como modelo para muitas doenças que levam à morte de células fotorreceptoras. No ratinho rd/rd, a degeneração de fotorreceptores começa durante as primeiras três semanas após o nascimento, à medida que os bastonetes sofrem apoptose, atribuída a uma mutação na subunidade p da fosfodiesterase dependente de cGMP, seguido de morte de cones fotorreceptores A atrofia vascular no seio da retina também é temporariamente associada com a morte celular de fotorreceptores em ratinhos rd/rd. A vasculatura parece formar-se do modo normal caracteristico, dado que se desenvolvem três camadas funcionais durante as três primeiras semanas. No entanto, os vasos na camada vascular profunda começam a degenerar durante a segunda semana e no final da quarta semana pós-natal observa-se uma redução vascular drástica, dado que os plexos profundo e intermédio praticamente desaparecem por completo.

Existe uma população de células hematopoiéticas residente na circulação e medula óssea normais de um adulto, a partir da qual diferentes subpopulações de células se podem diferenciar em linhagens positivas para linhagem (Lin+HSC), ou negativas para linhagem (Lin“HSC). Adicionalmente, os presentes inventores verificaram que as células precursoras endoteliais (EPCs), capazes de formar vasos sanguíneos in vitro e in vivo, estão presentes na subpopulação Lin“HSC. As EPCs na população de Lin“ HSCs podem dirigir-se para e estabilizar a vasculatura em degeneração nos ratinhos rd/rd quando injectadas intravitrealmente nos olhos dos ratinhos. As Lin“ HSCs injectadas intravitrealmente têm como alvo os astrócitos na camada vascular superficial e são encontrados à frente da rede vascular em desenvolvimento, endógena, quando 6 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ injectados no dia 2 pós-natal (P2) . À medida que a vasculatura endógena atinge a periferia da retina, para onde as Lin~HSCs se dirigiram, as células são incorporadas em novos vasos sanguíneos, formando vasos em mosaico funcionais com populações mistas de Lin~HSCs injectados e células endoteliais endógenas. Adicionalmente, as Lin“HSCs têm como alvo as regiões de camadas vasculares profundas e intermédias da retina, antes de ocorrer a vascularização destas camadas por células endoteliais endógenas. A incorporação de Lin~HSCs recupera a vasculatura profunda de ratinhos rdlrd cerca de 2 a cerca de 3 vezes, em relação aos ratinhos normais e de controlo injectados com Lin+HSC. Além disso, a recuperação da vasculatura profunda impede a degradação de fotorreceptores na camada nuclear externa da retina. No entanto, dado que não há evidências que sugiram que estes hemocitoblastos podem sofrer diferenciação em neurónios retinais ou células gliais, o mecanismo de protecção neuronal permanece desconhecido. 0 direccionamento de Lin~HSCs para os astrócitos e regiões de vasculatura profunda à frente da vascularização natural que ocorre durante o desenvolvimento, sugere que as Lin~HSCs expressam moléculas de superfície celular que actuam no direccionamento para um alvo, à semelhança do direccionamento para um alvo das células endoteliais endógenas durante o desenvolvimento. A adesão de R-caderina desempenha um papel importante no direccionamento de células endoteliais para os astrócitos e plexos vasculares durante a angiogénese retinal que ocorre durante o desenvolvimento. A R-caderina foi identificada e sequenciada em vários mamíferos. A FIG. 2 apresenta a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:1) de uma variante humana da pré-proteína de R-caderina, descrita por Kitagawa et al. na base de dados SWISS-PROT com o N° de acesso NP 001785, versão NP 001785.2, GI:14589893. A SEQ ID NO:l inclui a sequência de aminoácidos IDSMSGR (SEQ ID NO:2) nas posições 222- 228.

A FIG. 3 apresenta sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:3) de outra variante humana da pré-proteína de R-caderina, descrita por Tanihara et al. na base de dados SWISS-PROT com o N° de acesso P55283, versão P55283, GI: 1705542. A SEQ ID 7 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ Ν0:3 inclui a sequência de aminoácidos INSMSGR (SEQ ID NO:4) nas posições 222-228.

A FIG. 4 apresenta a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:5) de uma variante de murino (mus musculus) da pré- proteína de R-caderina, descrita por Hutton et al. na base de dados SWISS-PROT com o N° de acesso NP 033997, versão NP 033997.1, Gl:6753376. A SEQ ID NO:5 inclui a sequência de aminoácidos IDSMSGR (SEQ ID NO:2) nas posições 219-225.

Antagonistas peptídicos de caderinas, não selectivos, incluindo a sequência de aminoácidos His-Ala-Val (HAV) foram descritos por Blaschuk et al. nas patentes US N° 6465427, N° 63456512, N° 6169071, e N° 6031072. Blaschuk et al. descreveram antagonistas peptídicos de caderina, quer lineares, quer cíclicos, sendo todos capazes de antagonizar vários tipos de moléculas de caderina, indiscriminadamente.

Os antagonistas peptídicos de N-caderina, selectivos, que compreendem a sequência de aminoácidos Ile-Asn-Pro (INP) foram descritos por Williams et al., Mol. Cell Neurosci., 2000; 15 (5):45 6-64. Apesar dos péptidos HAV serem antagonistas de caderina não específicos, os antagonistas peptídicos de INP descritos por Williams et al. são específicos para N-caderina e não exibem uma ligação significativa a outras moléculas de caderina, tais como R-caderina.

Os agentes para inibir ou reforçar a adesão celular mediada por caderinas, não clássica, e os agentes para modular as funções mediadas por caderina estão descritos nos documentos WO 99/57149 e WO 00/02917, respectivamente.

Devido à distribuição diferencial de moléculas de adesão celular em vários tecidos do corpo, há uma necessidade de antagonistas que sejam altamente selectivos para moléculas de adesão celular específicas, em particular para antagonistas que sejam selectivos para a R-caderina. Os péptidos antagonistas de R-caderina, selectivos, da presente invenção preenchem esta necessidade. 8 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

Sumário da invenção Péptido que é um antagonista selectivo de R-caderina que consiste de sete resíduos de aminoácido e que tem a sequência de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEQ ID N0:6); em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin. De preferência, Xaa é Asp ou Asn. Péptido que consiste da sequência de aminoácidos Ile-Asp-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEQ ID NO:2) ou Ile-Asp-Ser-Ala-Ser-Gly-Arg (SEQ ID NO:10). Péptido que é um antagonista selectivo de R-caderina; em que o péptido é representado pela fórmula: X1—Y*—Ile-Xaa-Se?—γ*—χ1

I I s-——--s em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin; X1 e X2 são independentemente um resíduo de aminoácido, ou vários, até 10 resíduos de aminoácido ligados por ligações peptídicas; e Y1 e Y2 são independentemente resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por uma ligação dissulfureto. De preferência, Y1 e Y2 são resíduos de cisteína ligados um ao outro por uma ligação dissulfureto. Péptido cíclico que tem a sequência de aminoácidos Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys (SEQ ID NO: 7); em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste de Asp, Asn, Glu, e Gin, e o péptido inclui uma ligação dissulfureto entre os dois resíduos de Cys. De preferência Xaa é Asp.

Composição farmacêutica para inibir a angiogénese retinal que compreende um péptido da invenção, e um seu transportador farmaceuticamente aceitável, juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Método in vitro para inibir a adesão celular mediada por R-caderina, compreendendo contactar células de mamífero que 9 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ expressam moléculas de R-caderinas na sua superfície celular com uma quantidade inibidora de adesão celular de um péptido da invenção.

Utilização de um péptido da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir o direccionamento de hemocitoblastos para a vasculatura em desenvolvimento, para tratar uma doença associada com um desenvolvimento anormal da vasculatura, em que a composição farmacêutica se destina a fazer contactar hemocitoblastos com uma quantidade do referido péptido inibidora do direccionamento para a vasculatura. De preferência, a doença é degeneração macular ou retinopatia diabética. De preferência, os hemocitoblastos são hemocitoblastos hematopoiéticos negativos para a linhagem, tais como células precursoras endoteliais.

Utilização de um péptido isolado que é um antagonista selectivo de R-caderina de mamífero e compreende 3 a 30 resíduos de aminoácido, em que três resíduos contíguos do péptido têm a sequência de aminoácidos ile-Xaa-Ser (ixs); em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin, para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a angiogénese retinal num paciente que sofre de angiogénese vascular retinal anormal, ou para o tratamento da degeneração macular relacionada com a idade, ou retinopatia diabética. De preferência, Xaa é Asp ou Asn. Numa concretização preferida, o péptido compreende pelo menos sete resíduos de aminoácido e sete resíduos de aminoácido contíguos do péptido têm a sequência de aminoácidos ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEQ id NO:6), sendo Xaa o mesmo que definido acima.

Numa concretização preferida, o péptido é um péptido cíclico com 3 a 10 resíduos de aminoácido organizados num anel, em que três resíduos de aminoácido contíguos do péptido têm a sequência de aminoácidos Ile-Xaa-Ser; em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin. De preferência, Xaa é Asp ou Asn.

Um péptido cíclico preferido tem a fórmula: 10 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ X1

Υ1—Πβ-Xaa-Sw—Υ1—χ2 S-S em que X1 e X1 são independentemente um resíduo de aminoácido ou vários, até 10 resíduos de aminoácido ligados por ligações peptídicas; Y1 e Y2 são independentemente resíduos de aminoácido ligados um ao outro por uma ligação dissulfureto e Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo que consiste de Asp, Asn, Glu, e Gin.

Um péptido cíclico particularmente preferido tem a sequência de aminoácidos Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys cíclico (SEQ ID NO:7); em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin, e o anel peptídico é formado por uma ligação dissulfureto entre os dois resíduos de cisteína.

Breve descrição das figuras

Nas figuras, a FIG. 1 é uma representação esquemática da aglomeração de caderina e adesão celular modulada por caderina; A FIG. 2 mostra a sequência de aminoácidos de uma variante humana da pré- proteína de R-caderina (SEQ ID NO: D, que inclui a sequência IDSMSGR (SEQ ID NO: 2) nos resíduos 222-228; A FIG. 3 mostra a sequência de aminoácidos de uma variante humana da pré- proteína de R-caderina (SEQ ID NO: 3), que inclui a sequência INSMSGR (SEQ ID NO: 4) nos resíduos 222-228; A FIG. 4 mostra a sequência de aminoácidos de uma variante de murino da pré-proteína de R-caderina ( !SEQ ID NO:5), que inclui a sequência IDSMSGR (SEQ ID NO: 2) nos resíduos 229-225; 11 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ A FIG. 5 (A) ilustra a homologia de sequência entre os residuos 24-92 de N-caderina de murino e várias R-caderinas (residuos conservados (azul) e residuos não conservados (vermelhos)); note-se as homologias entre as R-caderinas de mamifero de humano, ratinho e rato, sendo que todas compreendem uma sequência IDS ou INS nos residuos 53-55, em contraste com a R-caderina de galinha e N-caderina de ratinho, que têm a sequência IDP e INP, respectivamente nos residuos 53-55; (B) péptidos ciclicos e lineares que correspondem a resíduos nesta região de R-caderina de murino e humana e N-caderina de murino foram sintetizados juntamente com os péptidos de controlo correspondentes: CIDSC ciclico (SEQ ID NO:8), CINPC cíclico (SEQ ID NO:9), IDSMSGR (SEQ ID NO:2), IDSASGR (SEQ ID NO:10), INPASGQ (SEQ ID NO:11), CSDIC ciclico (SEQ ID NO:12), e CRADC cíclico (SEQ ID NO:13); as sequências parciais de caderina listadas na FIG. 5(A) são, de cima para baixo, N-caderina de murino (SEQ ID NO:14), R-caderina de murino (SEQ ID NO:15), R-caderina de rato (SEQ ID NO:16), uma R-caderina humana (SEQ ID NO:17), outra R-caderina humana (SEQ ID NO:18), e R-caderina de galinha (gallus gallus) (SEQ ID NO:19); A FIG. 6 (A) mostra fotomicrografias que demonstram a agregação de células-L que expressam R-caderina e N-caderina; (B) é um gráfico de barras da percentagem de agregação de células-L mediada por R- e N-caderinas na presença e ausência de cálcio; A FIG. 7 demonstra a transfecção estável de células-L com R-caderina e N-caderina; (A) imunotransferência de R-caderina; (B) imunotransferência de N-caderina; (C-E) fotomicrografias de células-L coradas demonstrando a expressão de R-caderina (C), e N-caderina (D), em comparação com células que não expressam nem R-, nem N-caderina (E); A FIG. 8 ilustra graficamente a inibição selectiva da agregação de células-L que expressam caderina por péptidos que contêm IDS, que se ligam a células que expressam R-caderina, em comparação com péptidos que contêm INP, que se ligam a células que expressam N-caderina; 12 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ A FIG. 9 ilustra a inibição selectiva da vascularização retinal de ratinho após injecção intravitreal de CIDSC cíclico (SEQ ID NO:8), em comparação com CINPC cíclico (SEQ ID N0:9); (A) mostra fotomicrografias de retinas de ratinho rd/rd na fase de desenvolvimento P2; (B) mostra fotomicrografias de retinas de ratinho rd/rd na fase de desenvolvimento P7; (C) é um gráfico de barras da vascularização superficial; (D) é um gráfico de barras da vascularização profunda; A FIG. 10 ilustra os resultados da análise de citometria de fluxo da expressão de R-caderina em hemocitoblastos hematopoiéticos (HSC); A FIG. 11 mostra fotomicrografias em corte transversal de retinas de ratinho rd/rd tratado; e A FIG. 12 ilustra o bloqueio do direccionamento de Lin~ HSC para a vasculatura retinal.

Descrição detalhada de concretizações preferidas

Tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, o termo "péptido cíclico" refere-se a moléculas que compreendem vários aminoácidos ligados uns aos outros numa cadeia, por ligações peptídicas, em que as extremidades da cadeia estão ligadas uma à outra formando um anel de resíduos de aminoácido. O péptido cíclico pode ser ligado por uma ligação peptídica, uma ligação dissulfureto entre dois resíduos de aminoácido, tais como resíduos de cisteína, ou por qualquer outro grupo ligante adequado. Os grupos de ligação não peptídica podem ser qualquer porção química que pode reagir com grupos funcionais em cada extremidade da cadeia peptídica, para formar uma ligação entre estas. Por exemplo, duas extremidades de uma cadeia peptídica podem ser ligadas uma à outra por um aminoácido não proteico, tal como ácido 3-aminobutírico, ou por um dissulfureto formado a partir de grupos tiol não peptídicos, tais como uma amida tioglicólica na extremidade de terminal amino e uma amida formada a partir de 2-aminoetanotiol na extremidade de terminal carboxilo, por exemplo. 13 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

Tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, o termo "farmaceuticamente aceitável" e suas variações gramaticais, em referência a transportadores e outros excipientes, significa que os materiais são capazes de ser administrados a um paciente humano, sem a produção de efeitos secundários fisiológicos indesejáveis, tais como irritação retinal ou ocular, náusea, tonturas, visão desfocada ou diminuída, citotoxicidade e semelhantes. 0 termo "aminoácido", tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, refere-se em geral a qualquer alfa-aminoácido. De preferência, os péptidos da presente invenção compreendem os 21 aminoácidos codificados pelo código genético, embora também se possam incluir resíduos de aminoácido modificados. Os aminoácidos podem estar na forma L, D, ou D, L. De preferência, os péptidos da presente invenção compreendem aminoácidos na forma-L. Para minimizar a probabilidade de degradação pela proteinase in vivo, os péptidos da presente invenção administrados podem incluir um ou mais resíduos de aminoácido na forma-D.

Os péptidos antagonistas de R-caderina selectivos, da presente invenção, mimetizam as sequências Ile-Asp-Ser e Ile-Asn-Ser encontradas no domínio EC1 da R-caderina de mamífero, mas não noutras moléculas de caderina. Os péptidos que compreendem a sequência Ile-Xaa-Ser podem-se ligar a, e antagonizar moléculas de R-caderina de mamífero. 0 Xaa é de preferência um resíduo de ácido aspártico (Asp), ou um resíduo de aspargina (Asn), para corresponder às sequências que ocorrem naturalmente nas moléculas de R-caderina de mamífero. Os resíduos de ácido glutâmico (Glu) e glutamina (Gin) também são adequados para Xaa, devido à sua semelhança química com Asp e Asn, respectivamente.

Para o direccionamento selectivo ou antagonismo de R-caderina, os péptidos e composições da presente invenção podem ser administrados numa quantidade terapeuticamente eficaz parentericamente, oralmente, por inalação, ou topicamente, na forma de dosagem unitária, juntamente com transportadores, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "parentérico", tal como aqui utilizado, inclui administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, 14 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ intrasternal, intraocular (e.g. intravitreal), e intraperitoneal, bem como administração por técnicas de infusão.

Pode-se utilizar qualquer via de administração adequada e a composição farmacêutica que inclui um péptido antagonista de R-caderina selectivo, da presente invenção, é administrado numa dose eficaz para o tratamento pretendido. As quantidades terapeuticamente eficazes necessárias para tratar uma condição médica particular, ou inibir o seu progresso, são facilmente determinadas pelos peritos na arte utilizando estudos pré-clinicos e clinicos conhecido em medicina. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, refere-se à quantidade de ingrediente activo que desencadeia a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal ou humano, pretendida por um clinico ou investigador. 0 termo "inibe", tal como aqui utilizado, refere-se a retardar, interromper, ou parar a condição médica ou uma interacção bioquímica, mas não indica necessariamente uma eliminação total da condição, ou interrupção completa da interacção. Sobrevivência prolongada de um paciente ou redução prolongada na gravidade dos sintomas, per se, indica que a condição médica é controlada beneficamente (i.e., inibida).

Os regimes de dosagem para os péptidos antagonistas de R-caderina presentes e composições que os contêm, baseiam-se em vários factores, tais como idade, peso, sexo e tipo de condição médica do paciente, gravidade da condição, via de administração e actividade antagonista do antagonista peptídico particular utilizado. 0 regime de dosagem pode variar, dependendo dos factores acima referidos. Os níveis de dosagem da ordem de cerca de 0,01 miligramas a cerca de 1000 miligramas por quilograma de peso corporal são úteis para inibir a angiogénese retinal, por exemplo. Níveis de dosagem preferidos são na gama de cerca de 0,01 miligramas a cerca de 100 miligramas por quilograma de peso corporal. 15 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

Para administração por injecção, uma composição que contém um péptido da presente invenção é formulada com um transportador farmaceuticamente aceitável, tal como água, solução salina ou uma solução aquosa de dextrose. Para injecção, uma dose diária típica é de cerca de 0,01 miligramas a cerca de 100 miligramas por quilograma de peso corporal, injectadas diariamente como uma dose individual, ou como doses múltiplas, dependendo dos factores acima referidos

As composições farmacêuticas da presente invenção que compreendem um péptido antagonista de R-caderina, selectivo, da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável também podem incluir excipientes farmaceuticamente aceitáveis Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem, por exemplo, tensioactivos fisiologicamente toleráveis, solventes, agentes tamponantes, conservantes e semelhantes, que são bem conhecidos na arte.

Para inibir a angiogénese retinal, por exemplo, deve administrar-se a um paciente que sofre de proliferação vascular retinal anormal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um péptido antagonista de R-caderina. O péptido administrado liga-se selectivamente a R-caderina na retina, interrompendo e inibindo deste modo a angiogénese na mesma. De preferência, o antagonista peptídico deve ser administrado por injecção intravitreal. O direccionamento de Lin~HSCs para a vasculatura em desenvolvimento é inibido por contacto dos hemocitoblastos com uma quantidade inibidora do direccionamento para a vasculatura de um péptido antagonista de R-caderina, selectivo, da presente invenção. A inibição do direccionando de Lin~HSCs, tais como células precursoras endoteliais, para um alvo de vasculatura em desenvolvimento é útil para tratar doenças associadas com um desenvolvimento anormal de vasculatura, tais como degeneração macular relacionada com a idade e retinopatia diabética. As Lin“HSCs são contactados in vivo por administração dos presentes péptidos antagonistas de R-caderina a um mamífero, tal como um humano que sofre de uma doença ou condição de proliferação vascular. 16 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

Os exemplos seguintes são proporcionados para melhor ilustrar os vários aspectos da invenção.

Exenqplo 1. Síntese de péptidos

Os péptidos da presente invenção e vários péptidos de controlo foram sintetizados pelo The Scripps Research Institute Protein and Nucleic Acids core facility utilizando o método de síntese em fase sólida e foram purificados até ao mais alto grau possível (>95% puros), tal como analisado por análise de HPLC. As sequências dos péptidos foram analisadas por espectrometria de massa para assegurar a síntese dos péptidos correctos. Todos os péptidos foram bloqueados com amida no terminal amino e acetilados no terminal carboxilo. Os péptidos cíclicos foram preparados com resíduos de cisteína nas extremidades de terminal amino e carboxilo, para criar uma fixação de dissulfureto e formar um anel contendo cinco resíduos de aminoácido. A FIG. 5 (B) ilustra os péptidos preparados: CIDSC cíclico (SEQ ID NO:9), CINPC cíclico (SEQ ID NO:9), IDSMSGR (SEQ ID N0:2), IDSASGR (SEQ ID NO:10), INPASGQ (SEQ ID NO:ll), CSDIC cíclico (SEQ ID NO:12), e CRADC cíclico (SEQ ID NO:13).

Exemplo 2. Transfecções de células-L

Os plasmídeos de R-caderina e N-caderina de ratinho foram gentilmente cedidos pelo Dr. Masatoshi Takeichi (Universidade de Kyoto, Japão). Os plasmídeos foram subclonados em vectores pDsRed2 Nl (Clontech) para codificar para proteínas de fusão com a proteína fluorescente vermelha (RFP) ligada à extremidade de terminal-C das moléculas de caderina. As células-L (células L929 de fibroblastos de ratinho, ATCC #CRL-2148) foram transfectadas de forma estável com pDsRed2 Nl quer de R, quer N-caderina, utilizando o sistema de transfecção com fosfato de cálcio (Life

Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. Após pesquisa através de crescimento em meio suplementado com Geneticina (Geneticina G418 700 pg/mL, Gibco BRL), seleccionaram-se clones positivos. As células foram

analisadas quanto à expressão de RFP e foram testadas quanto à expressão de caderina por imunotransferência e coloração de imunofluorescência. A FIG. 6 ilustra a agregação de células-L 17 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ que expressam R e N-caderinas. A FIG. 6 (A) mostra fotomicrografias de células-L que expressam R-caderina (esquerda) e N-caderina (meio) que se agregam em meios contendo cálcio, em comparação com células-L não transfectadas, que não se agregaram. A FIG. 6(B) é um gráfico de barras que ilustra a percentagem de agregação de células apresentada na FIG. 6(A). As células transfectadas com N-caderina e R-caderina tripsinizadas num tampão que contém cloreto de cálcio cerca de 5 mM (marcado como TC) formaram grandes aglomerados de células, enquanto que as células-L endógenas apresentaram pouca agregação no tampão que contém cálcio. As células que foram tripsinizadas com EDTA num tampão isento de cálcio (marcado como TE) apresentaram pouca agregação, independentemente do facto de as células terem sido transfectadas com caderinas ou não.

Exemplo 3. Cultura de células e imunofluorescência

Cresceram-se células-L transfectadas ou do tipo selvagem em meio de Eagles modificado (MEM), suplementado com solução salina básica de Earl, Glutamax 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM e soro fetal de bovino a 10%. As linhas celulares transfectadas foram crescidas em meio suplementado com G418 cerca de 700 pg/mL (todos os meios reagentes eram da Gibco brl). Para imunofluorescência, as células foram crescidas até cerca de 75% de confluência em lamelas de vidro. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante cerca de meia hora, seguido de bloqueio com soro de cabra normal a 5% e soro fetal de bovino a 5% em lx solução salina tamponada com fosfato (PBS). Utilizaram-se anticorpos policlonais de cabra contra R-caderina ou N-caderina (Santa Cruz) a uma diluição 1:200 e a fluorescência foi conferida por incubação com anticorpos secundários anti-IgG de cabra marcados com Alexa488 (Molecular Probes). Obtiveram-se imagens utilizando um microscópio confocal de fluorescência, Radiance 200 (BioRad). Para análise de imunofluorescência as células foram lisadas em tampão contendo Triton X-100 a 1%. Adicionaram-se cerca de 50 pg do lisado de células totais a cada coluna de um gel de poliacrilamida a 8% e as proteínas foram separadas por electroforese. Utilizaram-se anticorpos monoclonais (1:1000, 18 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ BD Biosciences) específicos para N-caderina ou R-caderina para visualizar as bandas correspondentes. A FIG. 7 (A) mostra uma imunotransferência de células-L nativas e células-L transfectadas com R-caderina e N-caderina e coradas com anticorpo de R-caderina. Apenas as células transfectadas com R-caderina exibiram níveis significativos de expressão de R-caderina. A FIG. 7 (B) mostra uma imunotransferência de células L nativas e células-L transfectadas com R-caderina e N-caderina e coradas com anticorpo de N-caderina. Apenas as células transfectadas com N-caderina exibiram níveis significativos de expressão de N-caderina. A FIG. 7(C) é uma fotomicrografia de fluorescência de células gue expressam R-caderina marcadas com anticorpos de caderina fluorescentes, demonstrando expressão de superfície celular apenas das moléculas de R-caderina. A FIG. 7 (D) é uma fotomicrografia de fluorescência de células que expressam N-caderina marcadas com anticorpos de caderina fluorescentes, demonstrando expressão de superfície celular de apenas moléculas de N-caderina. A FIG. 7(E) é uma fotomicrografia de fluorescência de células-L expostas a anticorpos de caderina fluorescentes, mas que não apresentam expressão de superfície celular de moléculas de caderina de nenhum tipo.

Exemplo 4. Ensaio de agregação

Cresceram-se células-L até próximo da confluência, seguido de tripsinização com tripsina a 0,01% + CaCl2 5mM e sem EDTA (TC), ou tripsina a 0,01% com EDTA 0,1 mM e sem cálcio (TE). As células foram recolhidas e lavadas, seguido de ressuspensão em solução de tampão de Hanks (HBSS) + BSA a 1% com (TC), ou sem (TE) CaCl2 5mM. As células foram incubadas a 37°C em 0,5 mL de solução a 2 x 105 células por poço, de uma placa de 24 poços, com agitação tipo balancé a cerca de 60-70 rpm com várias concentrações de péptido. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. A extensão de agregação celular foi representada pela razão entre o número total de partículas após 2 horas de incubação (N2hr) e o número inicial de partículas (N0) . As partículas foram contadas num hemocitómetro utilizando a soma de 8 contagens 19 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ de 20 pL separadas/poço, antes (N0), e após (Nt) incubação. Os resultados estão ilustrados na FIG. 8.

Exemplo 5. Tratamento de ratinhos por injecção intravitreal de péptidos

Dissolveram-se péptidos em PBS + DMSO a 10% a uma concentração de 10 mM. Injectaram-se 0,5 pL ou 1,0 pL de

solução de péptido 10 mM na cavidade vitreal de ratinhos de 2 dias ou 7 dias de idade, respectivamente. A P5 ou Pll, as retinas foram dissecadas como descrito e os vasos e astrócitos visualizados por imunohistoquimica. A quantificação da vascularização periférica, comprimento vascular e área vascular durante a formação vascular superficial foi obtida por imagiologia de retinas injectadas sob as mesmas condições de microscopia. Os números foram então gerados utilizando o programa LASERPIX® (BioRad) com animais de controlo equivalentes, não injectados, utilizados para normalização da linha de base da extensão de vascularização retinal. A quantificação do efeito na formação vascular profunda foi conseguida focando anteriormente ao plexo vascular profundo normal, utilizando microscopia confocal e contando o número de vasos que migraram para a camada fotorreceptora. Os resultados são apresentados na FIG. 9.

Exemplo 6. Isolamento e enriquecimento de hemocitoblastos

As células de medula óssea foram isoladas de ratinhos transgénicos adultos nos quais se fundiu GFP melhorado com o promotor de β-actina (ACTbEGFP, the Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Em seguida colheram-se monócitos por separação em gradiente de densidade utilizando Histopaque (Sigma) e marcaram-se com anticorpos do painel de linhagem, conjugados com biotina (CD45, CD3, Ly-6G, CDll, ter-119, Pharmingen, San Diego, CA) para selecção de Lin~. As células Lin+ e Lin“ foram separadas utilizando uma coluna de separação magnética (MACS, Miltenyi Biotech, Auborn, Califórnia) . Uma vez que se determinou que as células CD31~ representam um melhor controlo de uma subpopulação de HSCs não funcional, como determinado por direccionamento vascular, as células CD31“ foram isoladas dos monócitos por separação 20 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ por MACS, utilizando anticorpos CD31 e utilizadas como controlo negativo para as Lin~ HSCs funcionais. As HSCs de ratinhos do tipo selvagem foram analisadas quanto à expressão de R-caderina, marcando as células com anticorpos anti-R-caderina (sc-6456, Santa Cruz Biotech) e anticorpos secundários de burro anti-cabra, marcados com Alexa-488 (Molecular Probes), e utilizando um citómetro de fluxo FACS calibur (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Os resultados são apresentados na FIG. 10.

Exemplo 7. Incubações, Injecções e quantificação de células HSC

As células Lin~ HSCs foram incubadas com 100 nM de anticorpo bloqueador de R-caderina (SC-6456, Santa Cruz Biotech), ou IgG de cabra pré-imune em solução salina tamponada com fosfato durante cerca de 1 hora, a cerca de 37°C antes de injecção. As injecções intravitreais em olhos P6 foram realizadas utilizando 0,5 pL de solução HSC. As retinas foram analisadas em P12 na totalidade, ou por secções O direccionamento de Lin“HSCs foi quantificado contando o número total de hemocitoblastos na retina, utilizando oito campos de observação diferentes por retina: quadrantes da esquerda, direita, de topo e inferior (¾ distância à periferia da retina), dois quadrantes intermédios (¼ - ^ de distância à periferia), o sitio de injecção e a região da cabeça do nervo óptico. Estas células foram caracterizadas pela sua localização nas camadas superficial, intermédia ou profunda, ou pela ausência de direccionamento (células que se situam na parte de trás da camada fotorreceptora). O número de células não almejadas na camada fotorreceptora é dado como a percentagem do número total de hemocitoblastos observados. Os resultados são apresentados na FIG. 11 e FIG. 12.

DISCUSSÃO

Os péptidos antagonistas de R-caderina, selectivos, da presente invenção actuam como miméticos de péptidos de motivos de reconhecimento chave de R-caderina (i.e, as sequências IDS e INS encontradas em R-caderinas de mamifero). Sem pretender estar cingido à teoria, os presentes péptidos antagonistas bloqueiam provavelmente a função de adesão de 21 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ moléculas de R-caderina por interacção competitiva com os domínios EC1 de moléculas de R-caderina em superfícies celulares. Os presentes péptidos antagonistas são úteis para o estudo das funções moleculares e para o tratamento de doenças relacionadas com a adesão celular e são geralmente mais difusíveis num tecido por injecção in vivo, do que os antagonistas baseados em anticorpos. A morfogénese de tecido durante o desenvolvimento da maioria dos tecidos, incluindo tecido neural da retina, envolve a ligação selectiva de moléculas de adesão célula-célula. Esta selectividade de ligação permite que células diferenciadas de forma semelhante se organizem umas com as outras e impede que os tipos de células invadam estruturas tecidulares incorrectas. No entanto, apesar de estudos extensos sobre as propriedades e função da caderina, em particular N- e E-caderinas, ainda não foi descrito um mecanismo geral que justifique a especificidade da caderina. Os presentes péptidos antagonistas de R-caderina interagem de forma selectiva com moléculas de R-caderina de mamífero, sem ligação significativa a outras classes de caderina. Estes péptidos contêm a sequência de IDS (ou os seus homólogos INS, IES, e IQS), que correspondem a uma região no domínio ECl de caderina, resíduos 53-55 de SEQ ID NO:17 e 18, onde interacções importantes na interface de adesão estão alegadamente situadas, com base em análises estruturais, mutacionais e de homologia de sequência.

Sem pretender estar cingido à teoria, pensa-se que o motivo IDS estabelece contacto directo com a sequência vdi de uma molécula de caderina adjacente, na interface de adesão. Uma vez que os resíduos 53-55 de caderinas parecem ser necessários para a transdimerização e porque ao contrário de outras regiões importantes para a adesão, esta sequência de aminoácidos curta não foi conservada entre membros da família de caderinas clássicos, esta região actua como determinante para a especificidade da caderina. De facto, o IDS cíclico (CIDSC, SEQ ID NO:8) inibe selectivamente a agregação celular mediada por R-caderina, enquanto que o equivalente de N-caderina correspondente, INP cíclico (CINPC, SEQ ID NO: 9) inibe selectivamente a agregação mediada por N-caderina. A N-caderina e R-caderina são os membros mais homólogos da 22 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ família da caderina. De facto, embora todas as caderinas, incluindo a R e N-caderina prefiram interagir de um modo homofílico, a R- e N-caderina são os únicos dois membros da família de caderina clássicos em que se observaram heterodímeros funcionais. Deste modo, é muito improvável que o IDS cíclico e INP cíclico tenham propriedades funcionais distintas para N e R-caderina, mas propriedades sobreponíveis para qualquer outro membro de caderinas. Estes estudos demonstram que o motivo IXS (em que X és D, N, E, ou Q) (i.e. correspondente aos resíduos 53-55 de R-caderina e seus homólogos), desempenha um papel importante na mediação da associação de moléculas de R-caderina. É provável, com base na especificidade de IXS para R-caderina e de INP para N-caderina, que os resíduos colocados correspondentemente noutros membros da família de caderinas (e.g., o motivo IER de E-caderina e o motivo IEK de P-caderina) também confiram especificidade às outras caderinas clássicas.

Estudos prévios demonstraram que anticorpos contra a R-caderina interrompem a vascularização retinal in vivo. A vascularização do plexo superficial foi provavelmente interrompida devido à interrupção de vias guia mediadas por R-caderina repostas por astrócitos que se situam à frente das células endoteliais. A expressão de R-caderina também é observada nas regiões em que os plexos vasculares profundos estão subsequentemente localizados, mesmo à frente da invasão vascular. Pensa-se que as moléculas de R-caderina nestas regiões guiam as células endoteliais para os plexos vasculares correctos, uma vez que a injecção de anticorpos bloqueadores de R-caderina faz com que os vasos contornem as camadas vascularizadas normais.

Foram agora gerados fenótipos vasculares semelhantes por injecção de IDS cíclico (CIDSC, SEQ ID NO:8) durante a vascularização retinal, quer superficial, quer profunda. Uma vez que o IDS cíclico interrompeu selectivamente a agregação mediada por R-caderina numa extensão significativa in vitro (i.e., sem interrupção significativa da agregação mediada por N-caderina), é provável que o fenótipo vascular in vivo tenha sido igualmente gerado por interacções de afinidade elevada de IDS cíclico com R-caderina. Adicionalmente, a injecção de INP cíclico (CINPC, SEQ ID NO:9), que era um inibidor eficaz 23 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ da agregação mediada por N-caderina, mas não da agregação de R-caderina in vitro, não resultou num fenótipo vascular retinal significativo. Em conjunto, estes resultados confirmam um papel especifico para a R-caderina durante a orientação vascular. A concepção dos péptidos antagonistas de R-caderina selectivos da presente invenção baseou-se numa análise estrutural, bioquímica a mutacional de vários membros da família de caderina clássica. É conhecido que o triptofano-2 é importante para a função da caderina, juntamente com a sequência HAV nos resíduos de aminoácido 79-81 de N-caderina e R-caderina. De facto, está descrito que os péptidos lineares e cíclicos que contêm sequências HAV bloqueiam o crescimento de neurites mediado por N-caderina, in vitro. No entanto, estas sequências estão absolutamente conservadas em todas as moléculas de caderina e portanto não podem conferir especificidade de ligação. Outros resíduos também deverão estabelecer contactos importantes na interface de dimerização com alguns resíduos não conservados importantes para o reconhecimento de caderina. A atenção focou-se nos resíduos dentro da repetição de caderina de terminal amino (EC1). A maioria dos resíduos importantes para contacto localizava-se em três regiões, aminoácidos 35-45, aminoácidos 53-59, e aminoácidos 79-86. Os resíduos 53-59 continham a maioria destes resíduos específicos de caderina, potencialmente importantes na formação da interface de dimerização. De entre estes, os resíduos 53-55 tinham um significado particular. Deste modo, foram concebidas mimetizações de péptidos a partir desta região, para optimizar a probabilidade de os péptidos específicos de R-caderina serem produzidos. Péptidos semelhantes contra sequências de N-caderina de ratinho, o membro da família de caderina mais proximamente relacionado e outros péptidos de controlo foram concebidos e utilizados para análise comparativa.

Agregação mediada por caderina

Escolheram-se células de fibroblasto de ratinho (linhagem L929), normalmente designadas por células-L, por ser conhecido que não contêm expressão endógena de caderinas. Produziram-se transfectantes estáveis de R-caderina e 24 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ utilizaram-se para testar os efeitos dos péptidos concebidos na agregação mediada por R-caderina. Também se criaram transfectantes estáveis para N-caderina e estes foram utilizados para avaliar os péptidos quanto à selectividade para caderina, com base nos seus efeitos na agregação mediada por N-caderina. A análise de imunotransferência detectou níveis elevados de R-caderina e nenhuma expressão de N-caderina no clone 8 de R-caderina (R-cad8), enquanto que se observaram níveis elevados de expressão de N-caderina e nenhuma expressão de R-caderina no clone 3 de N-caderina (N-cad3), como se mostra na FIG. 7. A imunofluorescência confirmou a expressão da caderina adequada nestes clones seleccionados. Quando testado no ensaio de agregação, a morfologia das linhas celulares transfectadas foi alterada como resultado da transfecção de caderina. Enquanto que as células-L progenitoras (i.e., não transfectadas) permaneceram dissociadas como partículas de células individuais, os transfectantes de R-caderina e N-caderina de ratinho formaram aglomerados de células grandes, dependentes de cálcio (tampão TC), devido a associações intercelulares coesas, como se mostra na FIG. 6(A). Os aglomerados de agregação mediada por caderina foram eliminados por tripsinização inicial das células com solução de EDTA e agregação em tampão isento de cálcio (tampão TE), como se mostra na FIG. 6(B).

Efeitos dos péptidos na agregação de células

Adicionaram-se péptidos a várias concentrações aos poços de agregação para testar a sua eficácia no bloqueio da adesão mediada por caderina. 0 IDS cíclico inibiu a agregação mediada por R-caderina com uma IC5o de cerca de 300 μΜ. O péptido linear IDSMSGR (SEQ ID NO:2), também bloqueou a adesão mediada por R-caderina. No entanto, a sua eficácia (IC50 □ 900 μΜ) era cerca de 3 vezes inferior à de IDS cíclico. Dado que os péptidos cíclicos também demonstraram ser muito mais solúveis e fáceis de trabalhar do que os péptidos lineares, novo ênfase focou-se apenas na análise de péptidos cíclicos (FIG. 8(A)). Os efeitos do IDS cíclico eram específicos para a R-caderina, dado que se observou pouco efeito na agregação de N-caderina. Pelo contrário, a sequência específica de N-caderina correspondente, INP cíclico, inibiu a agregação mediada por N-caderina com uma 25 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ lC5o mesmo inferior a 300 μΜ (FIG. 8(B)), semelhante aos efeitos da IDS cíclica na agregação de R-caderina. O INP cíclico tinha pouco efeito na agregação mediada por R-caderina.

Os outros péptidos de controlo, RAD cíclico (CRADC, SEQ ID NO: 13) e SDI cíclico (CSDIC, SEQ ID NO: 12) tiveram pouco efeito quer na agregação mediada por R-caderina, quer N-caderina. Um péptido HAV cíclico (CHAVC, SEQ ID NO:20), já conhecido por ser eficaz em bloquear a adesão mediada por quaisquer moléculas de caderina clássicas, foi testado como comparação. Noutro ensaio, o HAV cíclico bloqueou a agregação mediada por R-caderina e N-caderina com lC50s entre 150 e 200 μΜ. Deste modo, o IDS cíclico e INP cíclico bloquearam selectivamente a adesão de R ou N caderina respectivamente, com afinidades apenas ligeiramente menores do que o péptido bloqueador de caderina pan, não específico. Estudos anteriores utilizando anticorpos contra a R-caderina mostraram que estes interrompem a vascularização da retina normal durante o desenvolvimento. Estes anticorpos também eram eficazes em interromper a agregação mediada por caderina no nosso sistema de ensaio com uma IC50 de cerca de 10 nM, como se mostra na FIG. 8(C).

Efeitos dos péptidos na vascularização retinal

Os péptidos foram injectados na cavidade vitreal de olhos de ratinho pós-natal. Quando os péptidos IDS cíclico ou HAV cíclico foram injectados em olhos de ratinhos de dois dias de idade e a vasculatura resultante foi analisada três dias mais tarde, no dia 5 pós-natal, (P5), a formação vascular foi interrompida, com resultados semelhantes aos observados por injecções de anticorpo. Estas retinas caracterizavam-se por ter uma vascularização periférica menos extensa e menos vasos de interconexão nas regiões vascularizadas, em comparação com controlos equivalentes não injectados, normais. No global, a vascularização da camada superficial foi cortada ao meio por péptidos bloqueadores de R-caderina, enquanto que as retinas com injecções de INP cíclico específico de N-caderina eram relativamente normais (ver FIG. 9 (A-C)). 26 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

Os péptidos antagonistas de R-caderina, selectivos, da presente invenção, interromperam igualmente a vascularização normal das camadas retinais profundas. Quando o péptido IDS cíclico foi injectado em P7, mesmo antes de os vasos da rede vascular superficial aprofundarem e começarem a formar o plexo vascular profundo, e a vasculatura de Pll resultante caracterizava-se por vários rebentos vasculares gue tinham migrado para além do plexo vascular profundo e para a camada fotorreceptora avascular. Mais uma vez, isto é semelhante aos efeitos observados anteriormente quando se injectaram anticorpos de R-caderina. Pelo contrário, o plexo vascular profundo de olhos injectados com o péptido INP cíclico formou-se normalmente, como se pode ver na FIG. 9 (B e D). A R-caderina é expressa por Lin" HSCs A expressão de R-caderina de hemocitoblastos hematopoiéticos (HSC) foi analisada para determinar se as moléculas de adesão celular de R-caderina eram expressas na superfície celular de células com direccionamento funcional. Utilizando análise de citometria de fluxo, a R-caderina foi expressa na superfície celular de quase 80% da subpopulação Lin“ de HSCs, enquanto que apenas 30% das células Lin+ expressaram R-caderina (FIG. 10). Com base nas intensidades de fluorescência relativas entre as duas populações de células, é provável que as células Lin“ também expressem concentrações mais elevadas de R-caderina na sua superfície celular do que a pequena porção de células Lin+ positivas para R-caderina. Deste modo, a maioria das células da subpopulação que tem como alvo funcional a vasculatura retinal expressam R-caderina, ao contrário da maioria das células da subpopulação não direccionada para o alvo. De notar que uma subpopulação diferente de HSCs, que são CD31, CD34, e Macl negativo e não têm de todo função de direccionamento para um alvo, continham ainda menos células que expressam R-caderina.

Anticorpos e péptidos bloqueadores de R-Caderina interrompem o direccionamento para um alvo de HSC

Para analisar o grau em que a adesão célula-célula de R-caderina actua no direccionamento de HSCs para as diferentes camadas vasculares retinais, bloquearam-se Lin~HSCs com 27 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ anticorpos bloqueadores específicos de R-caderina, antes da injecção. Seis dias após a injecção, as Lin“HSCs normais apenas são encontradas nas três camadas vasculares: 1) o plexo vascular superficial localizado na camada de células ganglionar, 2) o plexo vascular profundo localizado próximo da camada plexiforme exterior e 3) a camada intermédia localizada na fronteira frontal da camada nuclear interna. A FIG. 11(A) mostra cortes transversais de retinas após injecção de Lin~HSCs normais (esquerda), Lin“HSCs incubadas com anticorpos de R-caderina bloqueadores da adesão (meio) e Lin“ HSCs incubados com IgG de cabra pré-imune (direita).

Quando as Lin“HSCs foram pré-incubadas com anticorpos anti-R-caderina antes da injecção, muitas destas células perderam a sua capacidade de se direccionar correctamente para um alvo, enquanto que as células pré-incubadas com IgG pré-imune funcionam de modo semelhante às HSCs não bloqueadas. 0 direccionamento para as camadas vasculares profunda e intermédia parece ser especialmente afectado ao bloquear a adesão de R-caderina, uma vez que poucas HSCs bloqueadas por R-caderina foram encontradas nestas regiões. As células localizadas no plexo vascular superficial também parecem menos organizadas e não estavam no mesmo local que a vasculatura endógena na mesma extensão em que as Lin~HSCs normais, ou as pré-incubadas com IgG pré-imune.

Muitas das Lin“HSCs pré-incubadas com anticorpo de R-caderina migraram através da retina e passaram para além de todas as três camadas vasculares e ligaram-se limite exterior dos fotorreceptores, próximo da camada RPE. Quase metade das HSCs bloqueadas por R-caderina foram encontradas no limite exterior da camada fotorreceptora (FIG. 11 (B)) . Em comparação, as retinas de controlo injectadas com HSCs pré-incubadas com IgG pré-imune apenas tinham 15% das HSCs com um direccionamento incorrecto para esta região. Uma grande porção das células mal direccionadas de retinas de controlo foi encontrada próximo do local de injecção e podem ser provavelmente atribuídas a células que foram libertadas sub-retinalmente, à medida que a agulha era removida. Quando o local de injecção foi excluído do cálculo, o número de HSCs incubadas com IgG pré-imune mal direccionadas diminuiu para 10%. Uma vez que a maioria das Lin“HSCs são observadas 28 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ normalmente nesta camada "extra profunda", esta pequena percentagem de HSCs incubadas com IgG controlo, mal direccionadas, pode ser provavelmente atribuída ao facto de a IgG pré-imune ser capaz de se ligar a cerca de 10% das células Lin“ (FIG. 10). Estas moléculas de IgG ligadas podem prevenir de forma não específica a adesão normal, simplesmente devido a impedimentos estéreos. No entanto, a diferença entre o número de células mal direccionadas devido ao bloqueio de R-caderina específico e bloqueio de IgG não específico é significativa. A FIG. 12 (A) mostra imagens confocais através de planos-z dos três plexos vasculares e o limite exterior da camada fotorreceptora. Observou-se um direccionamento para um alvo normal no seio de plexos vasculares correctos e ao longo de vasos endógenos (vermelho) por Lin“HSCs (verde) bloqueadas com IgG de cabra pré-imune. O bloqueio da adesão de R-caderina fez com que muitas Lin‘HSCs se localizassem no limite exterior da camada fotorreceptora e as células direccionadas para os plexos vasculares normais tendem a aglomerar-se umas com as outras e não se localizam ao longo de vasos endógenos (vermelho). A FIG. 12(B) é um gráfico de barras que demonstra que a percentagem de células mal direccionadas em relação a toda a população de HSCs na retina era significativamente maior para a população de Lin“HSCs bloqueadas com R-caderina (valores de P <0,01).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

<110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE

<120> ANTAGONISTAS DE R-CADERINA SELECTIVOS E MÉTODOS <13 0 > 18-196 <140> EP 04 750 884.1 <141> 2004-04-30 <150> US 60/467, 188 <151> 2003-05-01 <160> 20 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0 29 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

< 210 > 1 <211> 916 <212> PRT <213> ΗΟΜΟ SAPIENS <4 0 0> 1

Met Thr Ala Gly Ala Gly vai Leu Leu 1 5

Ala Leu Arg Ala His Asn Glu Asp Leu 20 25

Ala Gly Phe Ser Glu Asp Asp Tgr Thr

Leu Glu Gly Glu Lys Leu Leu Gin vai 50 55

Thr Lys Gly Thr Gin Tyr Glu Thr Asn 65 70

Gin vai Ala Phe Thr vai Thr Ala Trp 100 105

Trp Asp Ala vai vai Arg Leu Leu Vai 115 120

Ser Gly His Lys Pro Gin Lys Gly Lys 130 135

Ser Pro pro Pro Lys Asp Thr Leu Leu 145 ISO

Ala Asn Gly Leu Arg Arg Arg Lys Arg 165

Asn Vai Pro Glu Asn ser Arg Gly Pro 180 185 lie Arg Ser Asp Lys Asp Asn Asp lie 195 200

Gly vai Gly Ala Asp Gin Pro pro Met 210 215

Met ser Gly Arg Met Tyr vai Thr Arg 225 230

Ala Ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala 245 vai Glu Asn Pro lie Asp Leu Tyr Ile 260 265

Asn Arg Pro Glu Phe Ile Asn Gin Vai 275 280

Gly Ser Lys Pro Gly Thr Tyr vai Met 290 295

Asp Asp ser Thr Thr Ala Asn Gly Met 305 310

Gin Thr pro Gin ser Pro Ser Gin Asn 325

Leu Leu Leu ser Leu ser Gly 10 15 Thr Thr Arg Glu Thr cys Lys 30 Ala Leu lie ser Gin Asn ile 45 Lys Phe ser ser Cys vai Gly 60 Ser Met Asp Phe Lys Vai Gly 75 80 ri«I I ΔΙΙ A QUA riu v IM bCU VIII να· Γ · v w· VIM 90 95 Asp Ser Gin Thr Ala Glu Lys 110 Ala Gin Thr Ser Ser Pro His 125 Lys Vai vai Ala Leu Asp Pro 140 Pro Trp Pro Gin His Gin Asn 155 160 Asp Trp Vai Ile Pro Pro Ile 170 175 Phe Pro Gin Gin Leu vai Arg 190 Pro Ile Arg Tyr ser ile Thr 205 Glu vai Phe ser ile Asp ser 220 pro Met Asp Arg Glu Glu His 235 240 Vai Asp Met Asn Gly Asn Lys 250 255 Tyr val ile Asp Met Asn Asp 270 Tyr Asn Gly ser Val Asp Glu 285 Thr Val Thr Ala Asn Asp Ala 300 val Arg Tyr Arg ile val Thr 315 320 Met Phe Thr ile Asn ser Glu 330 335 30 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

Thr Gly Asp ile val Thr val Ala Ala dy Leu Asp Arg Glu Lys val 340 345 350 Gin Gin Tyr Thr val Ile val Gin Ala Thr Asp Met Glu Gly Asn Leu 355 360 365 Asn Tyr Gly Leu Ser Asn Thr Ala Thr Ala Ile Ile Thr val Thr Asp 370 375 380 vai Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Thr Ala ser Thr phe Ala Gly Glu 385 390 395 400 val Pro Glu Asn Arg val Glu Thr val val Ala Asn Leu Thr val Met 405 410 415 Asp Arg Asp Gin Pro His Ser Pro Asn Trp Asn Ala val Tyr Arg Ile lie 420 425 430 ser Gly Asp pro ser Gly His Phe Ser val Arg Thr Asp Pro Val Thr 435 440 445 Asn Glu Gly Met val Thr val Val Lys Ala val ASP Tyr Glu Leu 450 455 460 Asn Arg Ala Phe Met Leu Thr val Met val ser Asn Gin Ala Pro Leu 465 470 475 480 Ala Ser Gly ile Gin Met ser Phe Gin Ser Thr Ala Gly val Thr Ile Ile 485 490 495 Ser Met Asp ile Asn Glu Ala Pro Tyr phe pro ser Asn His Lys 500 505 1 510 Leu Ile Arg Leu Glu Glu Gly val Pro pro Gly Thr val Leu Thr Thr 515 520 525 Phe Ser Ala Val Asp Pro Asp Arg Phe Met Gin Gin Ala val Arg Tyr 530 535 540 Ser Lys Leu Ser Asp Pro Ala Ser Trp Leu His ile Asn Ala Thr Asn 545 550 555 560 Gly Gin Ile Thr Thr Ala Ala Val Leu Asp Arg Glu Ser Leu Tyr Thr 565 570 575 Lys Asn Asn val Tyr Glu Ala Thr Phe Leu Ala Ala Asp Asn Gly ile 580 585 590 pro pro Ala ser Gly Thr Gly Thr Leu Gl π Ile Tyr Leu Ile Asp ile 595 600 605 Asn Asp Asn Ala pro Glu Leu Leu Pro Lys Glu Ala Gin Ile Cys Glu 610 615 620 Lys Pro Asn Leu Asn Ala Ile Asn Ile Thr Ala Ala Asp Ala Asp val 625 630 635 640 Asp Pro Asn ile Gly 645 Pro Tyr val phe Glu 650 Leu Pro Phe val Pro 655 Ala Ala Vál Arg Lys Asn Trp Thr ile Thr Arg Leu Asn Gly Asp Tyr Ala 660 665 670 Gin Leu ser Leu Arg ile Leu Tyr Leu Glu Ala Gly Met Tyr Asp val 675 680 685 pro Ile ile val Thr Asp ser Gly Asn Pro Pro Leu Ser Asn Thr ser 690 695 700 Ile Ile Lys val Lys Val Cys Pro Cys Asp Asp Asn Gly Asp cys Thr 705 710 715 720 Thr 11 e Gly Ala val Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Gly Ala Ile val 725 730 735 Ala ile Leu lie cys Ile Leu Ile Leu Leu Thr Met Val Leu Leu Phe val 740 745 750 Met Trp Met Lys Arg Arg Glu Lys Glu Arg His Thr Lys Gin Leu 755 760 765 Leu Tla &cn ΡΓΟ Glu ASp Acr\ val Arg &cn r-wp Asn ile Leu '-ys Tvip ' J 1 Asp 770 775 780 Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gin Asp Tyr Asp Leu Ser Gin Leu 785 790 795 800 Gin Gin Pro Glu Ala Met Gly His Val Pro Ser Lys Ala Pro Gly val 805 810 815 Arg Arg val Asp Glu Arg Pro val Gly R7S Ala Glu Pro Gin Tyr Pro Ile Arg Pro Met 0£ls Val Pro His Pro Gly OLJ Asp Ile Gly Asp Phe OjU ile Asn Glu 835 840 845 dy Leu Arg Ala Ala ASP Asn Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser 850 855 860 Leu Leu val Phe Asp Tyr Glu Gly ser Gly ser Thr Ala Gly Ser Val 865 870 875 880 ser Ser Leu Asn ser 885 Ser ser Ser Gly ASp 890 Gin Asp Tyr Asp Tyr 895 Leu Asn Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly 900 905 910

Gly Glu Glu Asp 915 31 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

<210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <2 2 3> Sequência parcial de uma variante humana de pré-proteína R-caderina <400> 2

Ile Asp ser Met Ser Gly Arg

<210> 3 <211> 916 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 3

Met Thr 1 Ala Gly Ala c Gly val Leu Leu Leu Leu 10 Thr Thr Leu ser Leu Ser 15 cys Gly X Ala Leu Arg Ala 20 ser His Asn Glu Asp Leu 25 Asp Tyr Thr Arg Glu Thr 30 Gin Lys Ala Gly Phe Glu Asp Ala Leu ile ser Asn Ile 35 40 45 Leu Glu 50 Thr Lys 65 Ala Asp Gly Glu Lys Leu Leu Gin val 55 Glu Thr Asn Lys Phe Ser 60 Asp ser cys val Gly Gly Thr Gin Tyr 70 Phe ser Met 75 Glu Leu Phe Lys val Gly 80 Glu Gly Thr val Ala Thr Arg Gin val Pro Ser 85 90 95 Gin Vai Ala Phe Thr val Thr Ala Trp Asp ser Gin Thr Ala Glu Lys 100 105 110 Trp Asp Ala val val Arg Leu Leu val Ala Gin Thr Ser Ser Pro His 115 120 125 Ser Gly 130 His Lys pro Gin Lys Gly Lys 135 Lys val val 140 Pro Ala Leu Asp Pro ser pro Pro Pro Lys Asp Thr Leu Leu Pro Trp Gin His Gin Asn 145 150 155 160 Ala Asn Gly Leu Arg Arg Arg Lys Arg Asp Trp Val Ile Pro Pro ile 165 170 175 Asn Vai Pro Glu Asn Ser Arg Gly Pro Phe Pro Gin Gin Leu val Arg Ile Arg ISO 185 190 Ser Asp Lys Asp Asn asp He Pro Ile Arg Tyr ser Ile Thr Gly vai 195 200 205 Gly Ala Asp Gin pro pro Met Glu Val Phe Ser ile Asn ser 210 215 220 Met ser Gly Arg Met Tyr val Thr Arg Pro Met ASp Arg Glu Glu His 225 230 235 240 Ala ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala Val Asp Met Asn Gly Asn Lys 245 250 255 val Glu Asn Pro Ile Asp Leu Tyr ile Tyr val Ile Asp Met Asn ASp 260 ile 265 270 Asn His Pro Glu Phe Asn Gin Val Tyr Asn Cys Ser Val Asp Glu 275 280 285 Gly Ser Lys Pro Gly Thr Tyr Val Met Thr ile Thr Ala Asn Asp Ala 290 Ala 295 300 ASp ASp ser Thr Thr Asn Gly Met val Arg Tyr Arg He val Thr 305 310 315 320 Gin Thr Pro Gin ser pro Sêr Gin Asn Met Phe Thr Ile Asn ser Glu 32 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 325 330 335 Thr Gly Asp ile val Thr val Ala Ala Gly Trp Asp Arg Glu Lys Val 340 345 350 Gin Gin Tyr Thr val Ile val Gin Ala Thr Asp Met Glu Gly Asn Leu 355 360 365 Asn Tyr Gly Leu Ser Asn Thr Ala Thr Ala ile He Thr val Thr ASP 370 375 380 vai Asn ASp Asn pro Ser Glu Phe Thr Ala ser Thr Phe Ala Gly Glu 3S5 390 395 400 val Pro Glu Asn ser val Glu Thr Val val Ala Asn Leu Thr val Met 405 410 415 Asp Arg Asp Gin 420 Asp Pro His Ser Pro Asn 425 Phe Trp Asn Ala Val Tyr 430 Asp Arg Ile lie Ser Gly pro ser Gly His ser val Arg Thr Pro val 435 440 445 Thr Asn Glu Gly Met val Thr val val Lys Ala val Asp Tyr Glu Leu 450 455 460 Asn Arg Ala Phe Met Leu Thr Val Met val Ser Asn Gin Ala Pro Leu 465 470 47S 480 Ala ser Gly ile Gin Met ser Phe Gin ser Thr Ala Gly val Thr lie 485 490 495 Ser Ile Met Asp ile Asn Glu Ala pro Tyr Phe pro Ser Asn HÍS Lys 500 505 510 Leu ile Arg Leu Glu Glu Gly Val Pro Pro Gly Thr Val Leu Thr Thr 515 520 525 Phe Ser 530 ser Lys Ala val ASp Pro Asp Arg 535 pro Ala Ser phe Met Gin Gin 540 Leu His ile Ala val Arg Tyr Leu Ser ASP Trp Asn Ala Thr Asn 545 550 555 560 Gly Gin ile Thr Thr 565 Tyr val Ala val Leu Asp Arg Glu 570 Leu Ala Ala ser Leu Tyr 575 Gly Thr Lys Asn Asn val Glu Ala Thr Phe Asp Asn Ile 580 585 Gin Ile Tyr 590 Pro Pro Ala Ser Gly Thr Gly Thr Leu Leu Ile Asp Ile 595 600 Lys Glu Ala 605 Asn Asp Asn Ala Pro Glu Leu Leu Pro Gin ile Cys Glu 610 615 620 Arg pro Asn Leu Asn Ala lie Asn ile Thr Ala Ala Asp Ala ASP val 625 630 635 640 His Pro Asn ile Gly Pro Tyr Val Phe Glu Leu Pro Phe val Pro Ala 645 650 655 Ala vai Arg Lys Asn Trp Thr ile Thr Arg Leu Asn Gly Asp Tyr Ala 660 665 67b Gin Leu Ser Leu Arg ile Leu Tyr Leu Glu Ala Gly Met Tyr Asp val 675 680 685 Pro ile ile val Thr Asp ser Gly Asn Pro Pro Leu Ser Asn Thr ser 690 695 700 ile ile Lys val Lys Val Cys Pro Cys Asp Asp Asn Gly Asp Cys Thr 705 710 715 720 Thr ile Gly Ala val Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Gly Ala Ile Val 725 730 735 Ala Ile Leu Ile cys He Leu ile Leu Leu Thr Met val Leu Leu Phe 740 745 Glu Arg His 750 val Met ΪΒ Asp Met Lys Arg Arg Glu 760 Asp Asg Val Glu Glu Asp Lys Thr 765 Leu Lys Gin Leu Leu lie 770 Pro Glu Arg Glu Lys ile 780 Asp Tyr Asp Lys Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Gin Leu ser Gin Leu 785 790 795 800 Gin Gin Pro Glu Ala Met Gly His Val Pro Ser Lys Ala Pro Gly val 805 810 815

Arg Arg Arg Pro Gly Leu 850 Leu Leu 865 Ser Ser Asn Asp Gly Glu vai Asp 820 Met Vai 835 Arg Ala Vai Phe Leu Asn Trp Gly 900 Glu ASp 915

Glu Arg pro vai Gly Pro Glu Pro Gin Tyr Pro lie 825 830 Pro His Pro Gly Asp lie Gly Asp Phe He Asn Glu 840 845 Ala Asp Asn Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp ser 855 860 Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Thr Ala Gly Ser Vai 870 ser ser 885 Pro Arg 875 880 Gly Asp Gin Asp Tyr Asp Tyr Leu 890 895

Ser Ser Phe Lys L^j Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly 910 33 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

<210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Sequência parcial de uma variante humana de pré-proteina R-caderina <400> 4 lie Asn ser Met Ser Gly Arg <210> 5 <211> 913 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 5 Met Thr Thr Gly Ser Val Leu pro Leu Leu Leu Leu Gly Leu ser Gly 1 5 10 15 Ala Leu Arg Ala HiS Arg Glu Asp Leu Thr Val Arg Glu Ala Cys Lys 20 25 30 Ala Gly Phe ser Glu Glu Gly Tyr Thr Ala Leu ile Ser Pro Asn Val 35 40 45 Leu Glu Gly Glu Lys Leu Leu Lys val Glu Phe ser ser cys val Gly 50 55 60 Thr Lys Gly Met Gin Tyr Glu Thr Asn ser Leu Asp Phe Lys val Gly 65 70 75 80 Ala Asp Gly Thr val Phe Ala Thr Arg Glú Leu Lys Ile Pro Ser Glu 85 90 95 Gin vai Ala phe 100 Thr val Thr Ala Ar| Glu Arg Gin ser Ala 110 Glu Gin Trp Ala Ala Met Vai Arg Leu Leu val Ala Gin Thr Ser Ser Ala His 115 120 125 Ser Glu His Lys Lys Gly Gin Thr Val Ala Leu Asp Pro Ser Gin Pro 130 135 140 Gly Gly Pro Asn Asp Thr Leu Leu Pro Trp Pro Gin His Gin Ser Ser 145 150 155 160 Leu Arg Arg Gin Lys Arg Asp Trp val ile Pro pro ile Asn val Pro 165 170 175 Glu Asn Ser Arg 180 6ly Pro Phe Pro Gin 185 Gin Leu val Arg Ile 190 Arg Ser ASp Lys Asp Asn Asp ile Pro lie Arg Tyr Ser Ile Thr Gly Val Gly 195 200 205 Ser Gly Ala Asp Gin Pro Pro Met Glu val Phe Asn rle Asp Ser Met 210 215 220 Ala Arg 225 Met Tyr vai Thr Arg 230 Pro Met Asp Arg Glu 235 Glu Arg Ser Tyr 240 His Leu Arg Ala His Ala val Asp Met Asn Gly Asn Lys val Glu Asn 245 250 255 Pro Ile Asp Leu Tyr Ile Tyr Val ile Asp Met Asn ASp Asn Arg Pro 260 265 270 Glu Phe Ile Asn Gin val Tyr Asn Gly Ser val Asp Glu Gly Ser Lys 275 280 285 Pro Gly Thr Tyr val Met Thr Val Thr Ala Asn Asp Ala Asp Asp Ser 290 295 300 Thr Pro Thr Thr Ala Asn ciy Met val Arg Tyr Arg ile val Thr Gin 305 310 315 320 34 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

Gin Ser Pro Ser Gin 325 Asn Met phe Thr ile Asn 330 Ser Glu Thr 33? *SP lie vai Thr val Ala Ala Gly Leu Asp Arg Glu Lys val Gin Gin Tyr 340 345 350 Thr vai lie Val Gin Ala Thr Asp Met Glu Gly Asn Leu Asn Tyr Gly 355 360 365 Leu ser Asn Thr Ala Thr Ala Ile Ile Thr val Thr Asp val Asn Asp 370 375 380 Asn ΡΓΟ Pro Glu Phe Thr Thr ser Thr Phe Ala Gly Glu val Pro Glu 385 390 395 400 Asn Arg Ile Glu Thr 405 Val Val Ala Asn Leu Thr 410 val Met Asp Sí?A5P Gin pro h1s ser pro Asn Trp Asn Ala val Tyr Arg ile Ile Ser Gly 420 425 430 Asp pro Ser Gly HÍS phe Ser val Arg Thr Asp Pro val Thr Asn Glu 435 440 445 Gly Met val Thr Val val Lys Ala val Asp Tyr Glu Leu Asn Arg Ala 450 455 460 Phe Met Leu Thr val Met Val Ser Asn Gin Ala Pro Leu Ala ser Gly 465 470 475 480 lie Gin Met Ser phe Gin ser Thr Ala Gly val Thr ile Ser val Thr 485 Phe 490 His , 495 Asp Val Asn Glu Ala Pro Tyr Pro Ser Asn Lys Leu ile Arg 500 505 510 Leu Glu Glu Gly val Pro Ala Gly Thr Ala Leu Thr Thr Phe ser Ala 515 520 Ala val 525 Vai ASp 530 ASP Pro Asp Arg Phe Met 535 Leu Gin Gin Arg 540 ser Tyr Ser Lys Leu Ser Pro Ala Asn Trp His ile Asn Thr Asn Gly Gin He 545 550 Glu 555 560 Thr Thr Ala Ala He Leu Asp Arg Ser Leu Tyr Thr Lys Asn Asn 565 570 575 vai Tyr Glu Ala Thr Phe Leu Ala Ala Asp Asn Gly ile Pro Pro Ala 580 585 590 Ser Gly Thr Gly Thr Leu Gin Ile Tyr Leu Ile ASp ile Asn Asp Asn 595 600 605 Ala pro Gin Leu Leu Pro Lys Glu Ala Gin ile cys Glu Arg Pro Gly 610 615 Ala 620 Leu Asn Ala ile Asn ile Thr Ala Asp Ala Asp Met ASp Pro Asn 625 630 635 640 lie Gly Pro Tyr Val Phe Glu Leu Pro phe ile pro Thr Thr val Arg 645 650 Ala 655 Lys Asn TrP Thr Ile Thr Arg Leu Asn Gly Asp Tyr Gin Leu ser 660 665 670 Leu Arg He Leu Tyr Leu Glu Ala Gly val Tyr Asp val Pro ile ile 675 680 685 vai Thr Asp Ser Gly Asn pro Pro Leu ser Asn Thr Ser val ile Lys 690 695 700 vai Lys val Cys Pro Cys ASp Glu Asn Gly Asp Cys Thr Thr Val Gly 705 710 715 Ile 720 Ala val Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Gly Ala Val Ala lie Leu 725 730 735 He Cys Ile val Ile Leu Leu Ile Met val Leu Leu Phe val Val Trp 740 745 750 Met Lys 53 Arg Glu Lys Glu Arg 760 His Thr Lys Gin Leu 765 Leu Ile Asp Pro Glu ASp Asp Val Arg Asp Asn Ile Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Gly 770 775 780 Gin Pro 800 Arg val Gly 785 Glu Gly Glu Glu Asp Gin 790 Val ASp Tyr ASp Leu ser 795 Thr pro Gin Leu Gin Ala Met Glu His Leu Ser Lys Gly val Arg 805 810 815 Asp Glu Arg Pro val Gly Ala Glu Pro Gin Tyr Pro val Arg Pro val 820 825 830 val Pro HÍS Pro Gly Asp Ile Gly Asp Phe ile Asn Glu Gly Leu Arg 835 840 845 Leu val Ala Ala Asp Asn ASP Pro Thr Ala Pro pro Tyr Asp Ser Leu 850 855 860 Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Thr Ala Gly Ser val ser ser Leu 865 ' 870 Gin 875 880 Asn Ser ser Ser ser 885 Lys Gly Asp Asp Tyr Asp 890 Met Tyr Tyr Leu Asn Asp Trp 895 Glu Glu Gly Pro Arg Phe Lys Leu Ala Asp Gly Gly Gly 900 905 910 ASp 35 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

<210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Antagonista de caderina <221> VARIANTE <222> 2 <223> xaa = Asp, Asn, Glu or Gin <400> 6 ile Xaa Ser Met Ser Gly Arg

<210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Antagonista de caderina cíclico, ligação dissulfureto entre Cysl e Cys5 <221> VARIANTE <222> 3 <223> Xaa = Asp, Asn, Glu or Gin <400> 7 cys ile xaa ser cys 1 5

<210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> Antagonista de caderina cíclico, ligação dissulfureto entre Cysl e Cys5 <400> 8 cys Ile Asp ser C^s

<210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Antagonista de caderina cíclico, ligação dissulfureto entre Cysl e Cys5 < 4 0 0 > 9 cys ile Asn Pro Cys 1 5 36 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ

<210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Antagonista de caderina <4 0 0> 10 lie Asp Ser Ala ser Gly Arg

<210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> Antagonista de caderina <4 0 0> 11 ile Asn Pro Ala ser Gly Gin 1 5

<210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Antagonista de caderina cíclico, ligação dissulfureto entre Cysl e Cys5 <4 0 0> 12

Cys Ser Asp Ile Cys

<210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> Antagonista de caderina cíclico, ligação dissulfureto entre Cysl e Cys5 <4 0 0> 13 C^s Arg Ala Asp Cys

<210> 14 <211> 69 <212> PRT <213> Sequência artificial 37 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Sequência parcial de N-caderina de murino <4 0 0> 14 ile Arg ser Asp Arg Asp Lys Asn Leu Ser Leu Arg Tyr Ser Vai Thr 15 10 15

Gly pro Gly Ala Asp Gin Pro Pro Thr Gly Ile Phe Ile ile Asn Pro 20 25 30 ile Ser Gly Gin Leu Ser Vai Thr Lys Pro Leu Asp Arg Glu Leu ile 35 40 45

Ala Arg Phe His Leu Arg Ala His Ala Vai Asp Ile Asn Gly Asn Gin 50 55 60 val Glu Asn pro ile 65

<210> 15 <211> 69 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência parcial de R-caderina de murino <400> 15

Pro Ile Arg Tyr Ser ile Thr 10 15 Glu val Phe Asn ile Asp Ser 30 Pro Met Asp Arg Glu Glu Arg 45 val Asp Met Asn Gly Asn Lys 60 lie Arg Ser Asp Lys Asp Asn Asp ile 1 5

Gly val Gly Ala Asp Gin Pro Pro Met 20 25

Met Ser Gly Arg Met Tyr Val Thr Arg 35 40

Ala Ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala 50 55 val Glu Asn Pro ile 65

< 210 > 16 <211> 69 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência parcial de R-caderina de rato < 4 0 0 > 16

Ile Arg ser Asp Lys Asp Asn Asp Ile Pro Ile Arg Tyr Ser ile Thr 1 5 10 15

Gly val Gly Ala Asp Gin Pro pro Met Glu val Phe Asn ile Asp ser 20 25 30

Met Ser Gly Arg Met Tyr Val Thr Arg Pro Met Asp Arg gIu Glu Arg 35 40 45

Ala Ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala val Asp Met Asn Gly Asn Lys 50 55 60 val Glu Asn Pro ile 65

< 210 > 17 <211> 69 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência parcial de uma R-caderina humana 38 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ <4 Ο 0> 17

Ile Arg Ser Asp Lys Asp Asn Asp Ile Pro Ile Arg Tyr ser ile Thr 1 S 10 15

Gly vai Gly Ala Asp Gin Pro Pro Met Glu Vai Phe Ser Ile Asp ser 20 25 30

Met ser Gly Arg Met Tyr vai Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu His 35 40 45

Ala ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala vai Asp Met Asn Gly Asn Lys ,50 55 60 vai Glu Asn Pro ile 65

<210> 18 <211> 69 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Sequência parcial de uma R-caderina humana <4 0 0> 18 ile Arg ser Asp Lys Asp Asn Asp ile Pro ile Arg Tyr ser ile Thr 15 10 15

Gly Val Gly Ala Asp Gin Pro Pro Met Glu Vai Phe Ser Ile Asn ser 20 25 30

Met Ser Gly Arg Met Tyr val Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu His 35 40 45

Ala ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala val Asp Met Asn Gly Asn Lys 50 55 60 val Glu Asn pro ile 65

<210> 19 <211> 69 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Sequência parcial de R-caderina de galinha <4 0 0> 19

ile Arg Ser Asp Lys Asp Lys Glu ile His ile Arg Tyr ser ile Thr 15 10 IS

Gly Val Gly Ala Asp Gin Pro Pro Met Glu Val Phe Ser Ile Asp Pro 20 25 30 val Ser Gly Arg Met Tyr val Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu Arg 35 40 45

Ala ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala val Asp Met Asn Gly Asn Lys 50 55 60

Val Glu Asn Pro Ile 65

<210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Antagonista de caderina cíclico, ligação dissulfureto entre Cysl e Cys5 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ <4Ο0> 20 cys His Ala vai Cys 1 5

Lisboa, 2011-02-15

Claims (19)

1. ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido que é um antagonista selectivo de R-caderina, consistindo de sete resíduos de aminoácido e tendo a sequência de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEQ ID NO:6); em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin.
2. 2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 em que Xaa é Asp ou Asn.
3. 3. Péptido que consiste da sequência de aminoácidos Ile-Asp-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEQ ID NO:2) ou Ile-Asp-Ser-Ala-Ser-Gly-Arg (SEQ ID NO:10).
4. 4. Péptido que é um antagonista de R-caderina selectivo; em que o péptido é representado pela fórmula: X1-Y1—Ile-Xaa-Sef—γ1—χ* I I s-$ em que Xaa é um resíduo de aminoácido do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin; X1 e X2 são independentemente um resíduo de aminoácido ou vários, até 10 resíduos de aminoácido ligados por ligações peptídicas; e Y1 e Y2 são independentemente resíduos de aminoácido ligados um ao outro por uma ligação dissulfureto.
5. 5. Péptido de acordo com a reivindicação 4 em que Y1 e Y2 são resíduos de cisteína ligados um ao outro por uma ligação dissulfureto.
6. 6. Péptido cíclico com a sequência de aminoácidos Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys (SEQ ID NO: 7); em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin, e o péptido inclui uma ligação dissulfureto entre os dois resíduos de Cys.
7. 7. Péptido de acordo com a reivindicação 6; em que Xaa é Asp ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 2/3
8. 8. Composição farmacêutica para inibir a angiogénese retinal compreendendo um péptido de acordo com gualguer uma das reivindicações 1 a 7, e um seu transportador farmaceuticamente aceitável, juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. 9. Método ín vitro para inibir a adesão celular mediada por R-caderina compreendendo contactar células de mamífero que expressam moléculas de R-caderina na sua superfície celular com uma quantidade inibidora de adesão celular de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
10. 10. Utilização de um péptido que é um antagonista de R- caderina selectivo e compreende 3 a 30 resíduos de aminoácido, em que três resíduos contíguos do péptido têm a sequência de aminoácidos Ile-Xaa-Ser; em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin, para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a angiogénese retinal num paciente que sofre de angiogénese vascular retinal anormal.
11. 11. Utilização de um péptido que é um antagonista de R- caderina selectivo e compreende 3 a 30 resíduos de aminoácido, em que três resíduos contíguos do péptido têm a sequência de aminoácidos Ile-Xaa-Ser; em que Xaa é um resíduo de aminoácido seleccionado do grupo constituído por Asp, Asn, Glu, e Gin, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar a degeneração macular relacionada com a idade, ou retinopatia diabética.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 10 ou 11 em que o péptido compreende pelo menos 7 resíduos de aminoácido, em que sete resíduos de aminoácido contíguos do péptido têm a sequência de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEQ ID NO:6).
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o péptido compreende 3 a 10 resíduos de aminoácido organizados num anel.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o péptido compreende pelo menos 7 resíduos de aminoácidos, em ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 3/3 que sete resíduos de aminoácido contíguos do péptido têm a sequência de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEQ ID NO:6).
15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14 em que Xaa é Asp ou Asn.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o péptido é um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
17. 17. Utilização de um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir o direccionamento dos hemocitoblastos para a vasculatura em desenvolvimento, para tratar uma doença associada com um desenvolvimento vascular anormal, em que a composição farmacêutica se destina a contactar hemocitoblastos de mamífero com uma quantidade do referido péptido inibidora do direccionamento para a vasculatura.
18. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que a doença é a degeneração macular ou retinopatia diabética.
19. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que os hemocitoblastos são células precursoras endoteliais. Lisboa, 2011-02-15 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 1/12 _ I <Γ^ Caderina α-Catenina B-Catenina Vinculina α-Actinina Interior

    Exterior Interior 1) Ligação homofilica 2) Aglomeração de caderina 3) Estabilização via organização do citoesqueleto 4) Remodelação do citoesqueleto FIG.l EP 1 635 855/PT 2/12 Variante humana da pré—proteína de R—caderina to rH d) Λ 4-> tr tr h cr p Λί Ρ •P tn tn Ή i—i o* d> > > TJ a tr tn P υ G a 3 Λί P > d) P •H P oj ε P > d d A d > > C P P > d tr MH tn (0 tn P a G CT > -H d p> 4J P G P to (ti G > > rH I—1 td a £ >1 >. p> to d tti a d d £ >1 rH τ3 a a 4-i tr 4-1 > a a > d d a d M 3 Ή P tn tr H P d a <P u φ P >1 Φ Λί > P a > G > > *r| a a a •H d tn d) 3 > Λί Λί rti P (0 tn rH υ d a tr Φ (ti d >1 to dJ > rH to c Φ > •P >i d I—1 P P £ tn P > ε MH d MH Λί rH tr tn •P tr m U Φ TJ P *P P te > > t—( a to c (0 P hi d rH Φ (0 P d >1 λ; tr φ to tr d P 0) > tn > P rH rH a Ρ Λί to 10 co 3 P 6 to (0 P c > tp tn •Ρ P tn to H (0 Ή 0J tn (ti G i—1 P P H ιο A > G 1—1 -p tn *0 C > d) d) tn (tí G Ρ P a rH <ti > c H > P a >1 a tu a G φ P to p 4-1 (0 to > > > d a >< d ίΟ Λί φ CO >1 MH G tp tr H d> > > > > ι—1 Φ d > d (ti tr > c TJ tn (0 tn G d a P > to 1 L. r* .L i y» j*4 iu L J A\ III /* mH Λ t 1 1 i >T\ d) tr cr £ <P 4-· MH > cu Λί d G Λί P (d to oj a a d) CL) 4J > •H P (D tn £ > P Ή to 3 a a (0 to P M >1 (D to 3 tn to tn a a D1 P G (ti > •H H P d p a tn (ti > Ή d c •P -P Ê Ή to •H Ρ p (d to Λί td h tti T) 4-) MH tn Λί Φ c > P Λί tn CH 0 rH 4-1 tn g MH tti d) A P •P Η 1—1 to φ p d) d > ε £ a c G d <0 •Η rH a >1 õ φ P Λί tn TJ C a p to rH c a > > d P p a 4-> •H tr c > a > Ή > £ A 4H P (d a H > to d a tp φ c d P tn > iJ 4h a cn >! 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    Β PT2h-contagem de partículas após ensaio de agregação de 2 h PTO-contagem inicial de partículas

    Células-L R-cad8 N-cad3 Agregação de células-L mediada por caderina A) As células que expressam caderina formam aglomerados grandes no final do ensaio de agregação, enquanto que as células-L progenitoras permanecem não associadas. B)A agregação de células transfectadas com R- e N-caderina é dependente de cálcio. Quando as células foram deixadas agregar em tampão contendo Cacl2 5 mM (TC), ocorreu 80% de aglomeração. Quando estas mesmas células foram tripsinizadas com EDTA e incubadas em tampão isento de cálcio, a capacidade de aglomeração FIG.6 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 7/12 Imunotransferência de R-caderina Imunotransferência de N-caderina

    I_I Transfectantes estáveis de R- e N-caderina A) Análise de imunotransferência da expressão de R-caderina. As células-L progenitoras (coluna 1) e transfectantes estáveis de N-caderina (coluna 6) não expressam R-caderina, enquanto que 4 clones transfectados com R-caderina expressam níveis variáveis de R-caderina. 0 clone 8 foi escolhido para estudo posterior devido aos seus níveis elevados de expressão de proteína R-caderina B) Análise de imunotransferência da expressão de N-caderina. As células-L progenitoras (coluna 1) e transfectantes estáveis de R-caderina (coluna 6) não expressam N-caderina, enquanto que 3 clones transfectados com N-caderina expressam níveis variáveis de N-caderina. 0 clone 8 foi escolhido para estudo posterior devido aos seus níveis elevados de expressão de proteína N-caderina. C-E) A análise imunohistoquímica de transfectantes que expressam R-caderina (C) e transfectantes que expressam N-caderina (D) confirma a presença das moléculas de caderina adequadas na superfície celular. As células-L progenitoras não transfectadas (E) não expressam nenhuma das caderinas FIG.7 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 8/12

    Ensaio de agregação de R-caderina (8) PTo=Número de péptidos no tempo 0 PT2h=Número de péptidos após 2 h de incubação

    R-cad8 + R-cad8 + 300μΜ cIDS 300μΜ cINP

    Ensaio de agregação de N-caderina

    com agitaçao tipo balancé Ensaio de agregação de R-caderina

    N-cad3 + N-cad3 + 300μΜ cIDS 300μΜεΙΝΡ agitação tipo balancé FIG.8 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 9/12 Retinas normais Injectado com INP Injectado com IDS

    Vascularização superficial (inj. P2) Vascularização profunda (inj. P7) arau de vasa cerif. earorimento total de vase. 120:-"-^-

    clOS cINP cSDI veículo dDS cHAV dNP veículo dDS cHAV dNP veículo FIG.9 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 10/12 Anti-R-caderina de cabra IgG pré-imune de cabra

    ΑΙβΧβ489 0.01 0.06 ΙΒΙΚΡΒ^··"': 79.81 io° Vo’ Ϊ5* ib» io* Ate*· 488 coυ ffi I m O υ 'd" ro Qυ υ co a fO Ωυ υ cd (Λ

    Atexa 488

    FIG. 10 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 11/12 Injecção de HSC normais HScs + anbl R-caderina HSCs + IgG de cabra

    O bloqueio da adesão de R-caderina interrompe o direccionamento de Lin~ HSCs para as camadas vasculares retinais A)Secções transversais de retinas após injecção de Lin~ HSCs normais (esquerda), Lin" HSCs pré-incubadas com anticorpos de R-caderina bloqueadores de função (meio), ou Lin~ HSCs pré-incubadas com IgG de cabra pré-imune (direita). As Lin~ HSCs normais direccionaram-se para todas as três camadas vasculares após injecção P6. Observaram-se HSCs marcadas com GFP (verde) na camada de células ganglionares (GCL), onde se forma o plexo vascular superficial (estrela), no limite interior da camada nuclear interior (INL), onde se forma o plexo vascular intermédio (ponta de seta) e próximo da camada plexiforme externa (OPI), onde se forma o plexo vascular profundo. Não se encontraram HSCs não bloqueadas para além do plexo vascular profundo. Encontraram-se algumas Lin“HSC nestas áreas, após bloqueio das moléculas de adesão de R-caderina antes de injecção (meio). A maioria destas HSCs migraram para e direccionaram-se para uma região no limite exterior da camada fotorreceptora (camada nuclear exterior, ONL). As Lin“ HSCs pré-bloqueadas com IgG pré-imune tinham um direccionamento bastante normal (direita). B) A secção transversal através de toda a retina mostra uma distribuição representativa da localização de Lin“HSC bloqueadas por R-caderina (verde). Os vasos são apresentados por coloração de CD31 (vermelho). Barras de tamanho -50 pm FIG. 11 ΕΡ 1 635 855/ΡΤ 12/12 Plexo vascular Plexo vascular Plexo vascular Limite exterior da superficial intermédio intermédio camada fotorreceptora

    R-ad CrtlgCl R-cad OtlgG Local de injecção excluído A) Imagens confocais através de planos-z dos três plexos vasculares e limite exterior da camada fotorreceptora. Observou-se um direccionamento para o alvo normal nos plexos vasculares correctos e ao longo de vasos endógenos (vermelho) por Lin~HSCs (verde) bloqueadas com IgG de cabra pré-imune. 0 bloqueio da adesão de R-caderina fez com que muitas Lin"HSCs se localizassem no limite exterior da camada fotorreceptora e as células direccionadas para os plexos vasculares normais tendem a aglomerar-se umas com as outras e não estão localizadas ao longo dos vasos endógenos (vermelho) . B) A percentagem de células incorrectamente direccionadas em relação a toda a população de HSCs na retina é significativamente maior para a população de Lin" HSCs bloqueadas com R-caderina (valores de p < 0,01). [As barras de tamanho representam 50 μιη]