ES2355260T3 - Antagonistas de cadherina r selectivos y procedimientos. - Google Patents
Antagonistas de cadherina r selectivos y procedimientos. Download PDFInfo
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Abstract
Péptido que es un antagonista selectivo de la cadherina R, constituido por de siete residuos aminoácidos y que presenta la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 6), en el que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln.
Description
REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica los derechos de la solicitud provisional de patente US nº de serie 60/467.188, presentada el 1 de mayo de 2003.
DECLARACIÓN DE LOS DERECHOS GUBERNAMENTALES 5
La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos mediante las subvenciones nº EY11254 y nº EY12598 del National Institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos posee determinados derechos sobre la presente invención.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere de manera general a los antagonistas de las moléculas de adhesión celular de 10 mamífero. Más específicamente, la invención se refiere a antagonistas peptídicos selectivos de la cadherina R de mamífero (cadherina-4) que resultan útiles para inhibir la adhesión celular y la angiogénesis retiniana.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La familia de moléculas de la cadherina está constituida por glucoproteínas transmembranales que actúan en interacciones célula-célula selectivas dependientes del calcio. Estas moléculas desempeñan importantes papeles 15 durante el desarrollo embrionario y la morfogénesis de tejidos al mediar en el reconocimiento y la distribución celulares. Las subfamilias de cadherinas (cadherinas clásicas, protocadherinas, desmocolinas y otras proteínas de tipo cadherina) se caracterizan por un número variable de dominios extracelulares de la cadherina, un único segmento transmembranal y un único dominio citoplasmático. Se ha informado de que las cadherinas denominadas clásicas (es decir, las cadherinas E, P, N y R) presentan cinco dominios extracelulares de cadherina repetidos en tándem (EC1-EC5) que 20 intervienen en interacciones preferentemente homofílicas, y una cola citoplasmática altamente conservada que media en la señalización intracelulares específica de la adhesión.
Las adhesiones célula-célula mediadas por la cadherina se producen al interactuar múltiples moléculas de cadherina expresadas en células contiguas, conduciendo a la formación de uniones adherentes. Según el modelo de cremallera de cadherinas propuesto por Shapiro et al., Nature 374(6520):327-37, 1995, las moléculas de cadherina 25 dentro de la membrana de la misma célula forman dímeros de cadenas paralelas estrechamente unidos (es decir los denominados dímeros cis). Tal como se ilustra en la figura 1, estos dímeros cis se unen a continuación a dímeros de cadherina expresados sobre células contiguas (transdimerización). Tras haberse producido una interacción suficiente, puede producirse el agrupamiento de cadherinas, a medida que se reclutan más moléculas de cadherina en el sitio, conduciendo a la interdigitación de moléculas de las dos superficies celulares. De esta manera pueden combinarse 30 interacciones relativamente débiles para formar adhesiones célula-célula bastante fuertes.
Tras la adhesión inicial de las cadherinas, las señales intracelulares, transmitidas mediante interacciones de las colas citoplasmáticas de las cadherinas con las moléculas de cadherina α y β, conducen a la reorganización del citoesqueleto. Aunque la asociación con los filamentos de actina no se cree que afecte a la unión homofílica, su asociación ayuda a mantener las moléculas de cadherina en los sitios de la interacción. En una relación de tipo 35 simbiótico, el agrupamiento de cadherinas provoca la reorganización del citoesqueleto y proporciona puntos de unión en la membrana, que resultan importantes para la producción de cambios celulares tras la formación de uniones adherentes. Simultáneamente, la asociación con el citoesqueleto mantiene las cadherinas en los sitios de interacción y ayuda a reclutar nuevas moléculas de cadherinas, mediando de esta manera en el agrupamiento de las cadherinas. El calcio desempeña un papel importante como cofactor durante el agrupamiento de cadherinas. Se pierde la función de 40 cadherina y las moléculas adquieren susceptibilidad a la degradación por proteasas en soluciones con una concentración insuficiente de iones calcio (es decir, inferior a aproximadamente 2 mM). Esto se debe al requisito de que el calcio estabilice la estructura de las moléculas de cadherina y proporcione la orientación correcta de los interfaz contiguos de cadherina.
Aunque se ha informado de que cada uno de los cinco dominios extracelulares de la cadherina clásica, EC1 a 45 EC5, desempeña un papel importante en la mediación de la dimerización de las cadherinas, el análisis de mutaciones sugiere que la mayoría de los residuos que se forman en la interfaz de dimerización se encuentra dentro del dominio más N-terminal de la cadherina (EC1) (Kitagawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 271(2):358-63, 2000). Sin embargo, se conoce relativamente poco sobre los mecanismos de homodimerización específica entre las moléculas de cadherina. 50
Las cadherinas desempeñan un papel significativo durante la guía neuronal y el desarrollo del sistema nervioso central. Se ha publicado que algunas subdivisiones del cerebro se definen a partir de la expresión diferencial de tipos de cadherina. Las cadherinas también desempeñan un papel importante en el desarrollo neural retiniano a través de la expresión específica en diferentes regiones de la retina en desarrollo. Por ejemplo, durante el desarrollo embrionario de la retina de pollo, se ha informado de que la cadherina B únicamente se encuentra en la glía de Müller, mientras que 55
determinadas poblaciones de células bipolares expresan cadherina R (también conocida como cadherina-4). Las células amacrinas y un subconjunto de células ganglionares expresan las cadherinas 6B y 7. Dentro de la capa plexiforme interna de la retina, estas mismas cadherinas únicamente se expresan en la sublámina asociada a los terminales nerviosos positivos para sinapsina I, sugiriendo que los perfiles de expresión diferentes contribuyen a la formación de sinapsis entre subpoblaciones específicas de neuronas durante el desarrollo de la retina. En el nervio óptico 5 embrionario, el crecimiento de los axones de las células ganglionares se encuentra mediado por la adhesión de la cadherina N con células gliales que expresan cadherina R.
La adhesión de la cadherina también desempeña un papel en la vascularización retiniana durante el desarrollo (Dorrell et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43(11):3500-10, 2002). La alteración de la adhesión de la cadherina R durante la formación del plexo vascular superficial resulta en la pérdida de las interconexiones vasculares complejas 10 observadas durante la formación normal de patrón vascular. Al bloquear la adhesión de la cadherina R durante la formación posterior de capas vasculares profundas, se pierden claves cruciales de la guía, provocando que los vasos migren más allá de los plexos vasculares profundos normales y hacia el interior de la capa de fotorreceptores.
La retina está constituida por capas bien definidas de elementos neuronales, gliales y vasculares. Cualquier enfermedad o estado que altere las capas retinianas incluso ligeramente puede conducir a la degeneración neuronal y a 15 una pérdida visual significativa. La degeneración retiniana del ratón (ratón rd/rd) ha sido investigada durante más de 70 años como modelo de muchas enfermedades que conducen a la muerte de las células fotorreceptoras. En el ratón rd/rd, la degeneración de los fotorreceptores se inicia durante las primeras tres semanas después del nacimiento, al experimentar apoptosis las células bastones, lo que se atribuye a una mutación en la subunidad de la fosfodiesterasa dependiente de GMPc, seguido de la muerte de los fotorreceptores conos. 20
La atrofia vascular en el interior de la retina está asociada temporalmente con la muerte de las células fotorreceptoras en asimismo los ratones rd/rd. La vasculatura aparentemente se forma del modo característico normal a medida que se forman tres capas funcionales durante las tres primeras semanas. Sin embargo, los vasos en la capa vascular profunda empiezan a degenerar durante la segunda semana y al final de la cuarta semana posnatal, se observa una drástica reducción vascular al desaparecer prácticamente por completo los plexos profundo e intermedio. 25
En la circulación y la médula ósea adultas normales se aloja una población células madre hematopoyéticas a partir de las que pueden diferenciarse diferentes subpoblaciones de células a lo largo de linajes positivos (HSC Lin+) o negativos (HSC Lin-). Además, se ha descubierto que las células precursoras endoteliales (EPC), que pueden formar vasos sanguíneos in vitro e in vivo, se encuentran presentes dentro de la subpoblación HSC Lin-. Las EPC en la población de HSC Lin- pueden reconocer y estabilizar la vasculatura en degeneración en ratones rd/rd al inyectarse 30 intravitrealmente en los ojos de los ratones. Las HSC Lin- inyectadas intravitrealmente reconocen los astrocitos en la capa vascular superficial y se observan delante de la red vascular endógena en desarrollo al inyectarse el día posnatal 2 (P2). A medida que la vasculatura endógena alcanza la periferia de la retina, a la que se han dirigido las HSC Lin-, las células se incorporan en nuevos vasos sanguíneos, formando vasos mosaico funcionales con poblaciones mixtas de HSC Lin- inyectadas y células endoteliales endógenas. Además, las HSC Lin- se dirigen a las regiones de capas 35 vasculares profundas e intermedias de la retina antes de que se produzca la vascularización de estas capas por parte de las células endoteliales endógenas. La incorporación de las HSC Lin- rescata la vasculatura profunda de los ratones rd/rd a niveles de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3 veces los niveles de ratones normales y de control inyectados con HSC Lin+. Además, el rescate de la vasculatura profunda evita la degradación de los fotorreceptores en la capa nuclear externa de la retina. Sin embargo, debido a que no se dispone de datos que sugieran que estas células 40 madre puedan diferenciarse en neuronas retinianas o células gliales, sigue sin conocerse cuál es el mecanismo de protección neuronal.
El direccionamiento de las HSC Lin- a los astrocitos y regiones vasculares profundas avanzándose a la vascularización natural durante el desarrollo sugiere que las HSC Lin- expresan moléculas de superficie celular que actúan en el direccionamiento, de manera similar al direccionamiento de las células endoteliales endógenas durante el 45 desarrollo. La adhesión de la cadherina R desempeña un papel importante en el direccionamiento de las células endoteliales a los astrocitos y plexos vasculares durante la angiogénesis retiniana durante el desarrollo.
La cadherina R ha sido identificada y secuenciada en varios mamíferos. La figura 2 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 1) de una variante humana de la preproteína de la cadherina R publicada por Kitagawa et al. en la base de datos SWISS-PROT con el nº de acceso NP 001785, versión NP 001785.2, GI: 14589893. La SEC ID nº 1 50 incluye la secuencia de aminoácidos IDSMSGR (SEC ID nº 2) en las posiciones 222 a 228.
La figura 3 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 3) de otra variante humana de la preproteína de la cadherina R publicada por Tanihara et al. en la base de datos SWISS-PROT con los números de acceso P55283, versión P55283, GI: 1705542. La secuencia SEC ID nº 3 incluye la secuencia de aminoácidos INSMSGR (SEC ID nº 4) en las posiciones 222 a 228. 55
La figura 4 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 5) de una variante murina (Mus musculus) de la preproteína de la cadherina R publicada por Hutton et al. en la base de datos SWISS-PROT con el nº de acceso NP
033997, versión NP 033997.1, GI: 6753376, SEC ID nº 5 incluye la secuencia de aminoácidos IDSMSGR (SEC ID nº 2) en las posiciones 219 a 225.
Los péptidos antagonistas no selectivos de las cadherinas que incluyen la secuencia de aminoácidos His-Ala-Val (HAV) han sido publicados en Blaschuk et al., en las patentes US nº 6.465.427, nº 6.3456.512, nº 6.169.017 y nº 6.031.072. Blaschuk et al. han informado de péptidos antagonistas tanto lineales como cíclicos de cadherinas, la 5 totalidad de los cuales es capaz de antagonizar varios tipos de moléculas de cadherina indiscriminadamente.
Los péptidos antagonistas selectivos de la cadherina N, que comprenden la secuencia de aminoácidos Ile-Asn-Pro (INP) han sido informados por Williams et al., Mol. Cell Neurosci. 15(5):456-64, 2000. Mientras que los péptidos HAV son antagonistas no específicos de la cadherina, los péptidos antagonistas de INP informados por Williams et al. son específicos de la cadherina N y no muestran unión significativa a otras moléculas de cadherina, tales como la cadherina 10 R.
Los agentes que inhiben o potencian la adhesión celular mediada por cadherinas no clásicas y los agentes para modular las funciones mediadas por cadherina se describen en los documentos WO 99/57149 y WO 00/02917, respectivamente.
Debido a la distribución diferencial de las moléculas de adhesión celular en diversos tejidos del cuerpo, todavía 15 existe una necesidad de antagonistas que sean altamente selectivos para moléculas de adhesión celular específicas, en particular de antagonistas que sean selectivos para la cadherina R. Los péptidos antagonistas selectivos para la cadherina R de la presente invención satisfacen dicha necesidad.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un péptido que es un antagonista selectivo de la cadherina R, constituido por siete residuos aminoácidos y que 20 presenta la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 6), en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln. Preferentemente Xaa es Asp o Asn.
Un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos Ile-Asp-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 2) o Ile-Asp-Ser-Ala-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 10).
Un péptido que es un antagonista selectivo de la cadherina R, en el que el péptido se encuentra representado 25 por la fórmula:
en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln; X1 y X2 son independientemente un residuo aminoácido o una pluralidad de hasta 10 residuos aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos; e Y1 y Y2 son independientemente residuos aminoácidos unidos entre sí mediante un 30 enlace disulfuro. Preferentemente Y1 e Y2 son residuos cisteína unidos entre sí mediante un enlace disulfuro.
Un péptido cíclico que presenta la secuencia de aminoácidos Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys (SEC ID nº 7), en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln, y el péptido incluye un enlace disulfuro entre los dos residuos de Cys. Preferentemente Xaa es Asp.
Una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis retiniana comprende un péptido de la invención, y 35 un portador farmacéuticamente aceptable para la misma, conjuntamente con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un método in vitro para inhibir la adhesión celular mediada por la cadherina R que comprende poner en contacto células de mamífero que expresan moléculas de cadherina R sobre su superficie celular con una cantidad inhibidora de la adhesión celular de un péptido de la invención. 40
Una utilización de un péptido de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el direccionamiento de las células madre a la vasculatura en desarrollo, para el tratamiento de una enfermedad asociada al desarrollo vascular anormal, en el que la composición farmacéutica está destinada a poner en contacto las células madre de mamífero con una cantidad inhibidora del direccionamiento a la vasculatura de dicho péptido. Preferentemente la enfermedad es la degeneración macular o la retinopatía diabética. Preferentemente las células madre son células 45 madre hematopoyéticas de linaje negativo, tales como células precursoras endoteliales.
Una utilización de un péptido aislado que es un antagonista selectivo de la cadherina R de mamífero y que comprende 3 a 30 residuos aminoácidos, presentando tres residuos contiguos del péptido la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser (IXS), en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln, para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis retiniana en un paciente que 50 sufre de angiogénesis vascular retiniana anormal o para el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad
o de la retinopatía diabética. Preferentemente Xaa es Asp o Asn. En una forma de realización preferida, el péptido comprende por lo menos siete residuos aminoácidos y siete residuos aminoácidos contiguos del péptido, presentando la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 6), siendo Xaa tal como se ha definido anteriormente.
En una forma de realización preferida, el péptido es un péptido cíclico que presenta 3 a 10 residuos 5 aminoácidos dispuestos en un anillo, presentando tres residuos contiguos del péptido la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser, en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln. Preferentemente Xaa es Asp o Asn.
Un péptido cíclico preferido presenta la fórmula:
10
en la que X1 y X2 son, independientemente, un residuo aminoácido o una pluralidad de hasta 10 residuos aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos; Y1 e Y2 son, independientemente, residuos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace disulfuro y Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln.
Un péptido cíclico particularmente preferido presenta la secuencia de aminoácidos Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys cíclico 15 (SEC ID nº 7), en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln, y el anillo peptídico se forma mediante un enlace disulfuro entre los dos residuos de cisteína.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
En los dibujos, la figura 1 es una representación esquemática del agrupamiento de las cadherinas y de la adhesión celular modulada por la cadherina; 20
la figura 2 representa la secuencia de aminoácidos de una variante humana de la preproteína de la cadherina R (SEC ID nº 1), que incluye la secuencia IDSMSGR (SEC ID nº 2) en los residuos 222 a 228,
la figura 3 representa la secuencia de aminoácidos de una variante humana de la preproteína de la cadherina R (SEC ID nº 3), que incluye la secuencia INSMSGR (SEC ID nº 4) en los residuos 222 a 228,
la figura 4 representa la secuencia de aminoácidos de una variante humana de la preproteína de la cadherina R 25 (SEC ID nº 5), que incluye la secuencia IDSMSGR (SEC ID nº 2) en los residuos 229 a 225;
la figura 5(A) ilustra la homología de secuencias en los residuos 24 a 92 de la cadherina N murina y diversas cadherinas R (residuos conservados (en azul) y no residuos no conservados (en rojo)); observar las homologías entre las cadherinas R de mamífero de origen humano, de ratón y de rata, la totalidad de las cuales comprende una secuencia IDS e INS en los residuos 53 a 55, en contraste con la cadherina R de pollo y la cadherina N de ratón, que presentan las 30 secuencias IDP e INP, respectivamente, en los residuos 53 a 55; (B) péptidos cíclicos y lineales correspondientes a los residuos dentro de esta región de la cadherina R murina y humana y de la cadherina N murina se sintetizaron conjuntamente con los péptidos de control correspondientes: CIDSC cíclico (SEC ID nº 8), CINPC cíclico (SEC ID nº 9), IDSMSGR (SEC ID nº 2), IDSASGR (SEC ID nº 10), INPASGQ (SEC ID nº 11), CSDIC cíclico (SEC ID nº 12) y CRADC cíclico (SEC ID nº 13); las secuencias de cadherina parciales indicadas en la figura 5(A) son, de parte superior a inferior, 35 cadherina N murina (SEC ID nº 14), cadherina R murina (SEC ID nº 15), cadherina R de rata (SEC ID nº 16), cadherina R humana (SEC ID nº 17), otra cadherina R humana (SEC ID nº 18), y cadherina R de pollo (Gallus gallus) (SEC ID nº 19);
la figura 6(A) ilustra fotomicrografías que demuestran la agregación de las células L que expresan cadherina R y cadherina N; (B) es un gráfico de columnas del porcentaje de agregación de células L mediada por cadherinas R y N 40 en presencia y en ausencia de calcio;
la figura 7 demuestra la transfección estable de las células L con cadherina R y cadherina N; (A) filtro de inmunotransferencia de cadherina R, (B) filtro de inmunotransferencia de N-cadherina, (C-E) fotomicrografías de células L teñidas que demuestran la expresión de cadherina R (C) y cadherina N (D), en comparación con células que no expresan ni cadherina R ni cadherina N (E); 45
la figura 8 ilustra gráficamente la inhibición selectiva de la agregación de células L que expresan cadherina por parte de péptidos que contienen IDS, que se unen a células que expresan cadherina R, en comparación con péptidos que contienen INP, que se unen a células que expresan cadherina N;
la figura 9 ilustra la inhibición selectiva de la vascularización retiniana del ratón tras la inyección intravitreal de CIDSC cíclico (SEC ID nº 8), en comparación con CINPC cíclico (SEC ID nº 9); (A) ilustra fotomicrografías de retinas de 50
ratones rd/rd en el estadio P2 del desarrollo, (B) ilustra fotomicrografías de retinas de ratones rd/rd en el estadio P7 del desarrollo, (C) es un gráfico de columnas de la vascularización superficial, (D) es un gráfico de columnas de la vascularización profunda;
la figura 10 ilustra los resultados del análisis de citometría de flujo de la expresión de la cadherina R en células madre hematopoyéticas (HSC); 5
la figura 11 ilustra fotomicrografías de secciones transversales de retinas de ratones rd/rd tratados, y
la figura 12 ilustra el bloqueo del direccionamiento de HSC Lin- a la vasculatura retiniana en desarrollo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS
Tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, la expresión "péptido cíclico" se refiere a moléculas que comprenden una pluralidad de aminoácidos unidos entre sí en una cadena mediante enlaces 10 peptídicos, encontrándose unidos entre sí los extremos de la cadena para formar un anillos de residuos aminoácidos. El péptido cíclico puede unirse mediante un enlace peptídico, un enlace disulfuro entre dos residuos aminoácidos tales como residuos cisteína, o mediante cualquier otro grupo de enlace adecuado. Los grupos de unión no peptídicos pueden ser cualquier grupo químico que pueda reaccionar con grupos funcionales en cada extremo de la cadena de péptidos para formar un enlace entre ellos. Por ejemplo, dos extremos de una cadena de péptidos pueden unirse entre sí 15 mediante un aminoácido no proteico, tal como el ácido 3-aminobutírico, o mediante un disulfuro formado a partir de grupos tiol no peptídicos, tales como una amida tioglicólica en el extremo aminoterminal y una amida formada a partir del 2-aminoetanotiol en el extremo carboxi-terminal, por ejemplo.
Tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, la expresión "farmacéuticamente aceptable" y las variaciones gramaticales de la misma, haciendo referencia a portadores y otros excipientes, se refiere a 20 que los materiales son capaces de administrarse a un paciente humano sin producir efectos secundarios fisiológicos no deseables, tales como irritación retiniana u ocular, náusea, mareo, visión borrosa o alterada, citotoxicidad, y similares.
El término "aminoácido" tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas se refiere de manera general a cualquier aminoácido alfa. Preferentemente, los péptidos de la presente invención comprenden los 21 aminoácidos codificados por el código genético, aunque también pueden incluirse residuos aminoácidos modificados. 25 Los aminoácidos pueden encontrarse en forma L, D o D,L. Preferentemente, los péptidos de la presente invención comprenden aminoácidos en forma L. Para minimizar la probabilidad de degradación por proteinasas in vivo, los péptidos administrados de la presente invención pueden incluir uno o más residuos aminoácidos de forma D.
Los péptidos antagonistas selectivos para la cadherina R de la presente invención imitan las secuencias Ile-Asp-Ser e Ile-Asn-Ser presentes en el dominio EC1 de la cadherina R de mamífero, pero no en otras moléculas de 30 cadherina. Los péptidos que comprenden la secuencia Ile-Xaa-Ser pueden unirse y antagonizar las moléculas de cadherina R de mamífero. Xaa preferentemente es un residuo de ácido aspártico (Asp) o un residuo asparagina (Asn), correspondiente a las secuencias naturales en las moléculas de cadherina R de mamífero. Los residuos ácido glutámico (Glu) y glutamina (Gln) también resultan adecuados como Xaa, debido a su similitud química a Asp y Asn, respectivamente. 35
Para el direccionamiento o antagonismo selectivo de la cadherina R, los péptidos y composiciones de la presente invención pueden administrarse en una cantidad terapéuticamente efectiva por vía parenteral, oral, mediante inhalación, o tópicamente en forma de dosificación unitaria conjuntamente con portadores, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. El término "parenteral", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraesternal, intraocular (por ejemplo intravitreal) e 40 intraperitoneal, así como la administración mediante técnicas de infusión.
Puede utilizarse cualquier vía de administración, y la composición farmacéutica que incluye un péptido antagonista selectivo para la cadherina R de la presente invención se administra en una dosis efectiva para el tratamiento pretendido. Las cantidades terapéuticamente efectivas necesarias para tratar una afección particular, o para inhibir el avance de la misma, resultarán fáciles de determinar por el experto en la materia utilizando estudios preclínicos 45 y clínicos conocidos de la técnica médica.
La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la cantidad de principio activo que induzca la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano, que desea el médico clínico o investigador.
El término "inhibe", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un enlentecimiento, una interrupción 50 o una detención de la afección o de una interacción bioquímica, aunque no indica necesariamente una eliminación total de la condición o interrupción completa de la interacción. Una supervivencia prolongada de un paciente, o una reducción prolongada de la severidad de los síntomas, por sí mismo y por sí solo indica que la afección ha sido beneficiosamente controlada (es decir, ha sido inhibida).
Los regímenes de dosificación para los presentes péptidos antagonistas de la cadherina R y composiciones que 55
contienen los mismos, se basan en varios factores, tales como la edad, el peso, el sexo y el tipo de afección del paciente, la severidad de la condición, la vía de administración, y la actividad antagonista del péptido antagonista particular utilizado. El régimen de dosificación puede variar dependiendo de los factores anteriormente indicados. Los niveles de dosificación del intervalo de entre aproximadamente 0,01 miligramos y aproximadamente 1.000 miligramos por kilogramo de peso corporal resultan útiles para inhibir la angiogénesis retiniana, por ejemplo. Los niveles de 5 dosificación preferidos se encuentran comprendidos en el intervalo de entre aproximadamente 0,01 miligramos y aproximadamente 100 miligramos por kilogramo de peso corporal.
Para la administración mediante inyección, se formula una composición que contiene péptido que materializa la presente invención, con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como agua, solución salina o una solución acuosa de dextrosa. Para la inyección, una dosis diaria típica es de entre aproximadamente 0,01 miligramos y aproximadamente 10 100 miligramos por kilogramo de peso corporal, inyectados diariamente en forma de una única dosis o de múltiples dosis, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención que comprenden un péptido antagonista selectivo para la cadherina R de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable también pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables. Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden incluirse en las 15 composiciones farmacéuticas de la presente invención se incluyen, por ejemplo, surfactantes fisiológicamente tolerables, solventes, agentes tamponadores, conservantes, y similares, que son bien conocidos en la técnica.
Para inhibir la angiogénesis retiniana, por ejemplo, debe administrarse en un paciente que sufre proliferación vascular retiniana anormal una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido antagonista de la cadherina R. El péptido administrado se une selectivamente a la cadherina R en la retina, alterando e inhibiendo de esta manera la 20 angiogénesis en la misma. Preferentemente, el péptido antagonista debe administrarse mediante inyección intravítrea.
El direccionamiento de las HSC Lin- a la vasculatura en desarrollo resulta inhibido por la puesta en contacto de las células madre con una cantidad inhibidora del direccionamiento a la vasculatura de un péptido antagonista selectivo para la cadherina R de la presente invención. La inhibición de direccionamiento de las HSC Lin-, tales como las células precursoras endoteliales, a la vasculatura en desarrollo resulta útil para tratar enfermedades asociadas al desarrollo 25 vascular anormal, tal como la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopatía diabética. Las HSC Lin- se ponen en contacto in vivo mediante la administración de los presentes péptidos antagonistas de la cadherina R en un mamífero, tal como un ser humano, que sufre una enfermedad o afección proliferativa vascular.
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo de diversos aspectos de la invención.
EJEMPLO 1. SÍNTESIS DE PÉPTIDOS 30
Los péptidos de la presente invención y diversos péptidos de control se sintetizaron en las instalaciones centrales para el análisis de proteínas y ácidos nucleicos de The Scripps Research Institute utilizando el método de síntesis en fase sólida, y se purificaron hasta el grado máximo posible (pureza superior al 95%) según el análisis de HPLC. Las secuencias de los péptidos se analizaron mediante espectrometría de masas para garantizar la síntesis de los péptidos correctos. Todos los péptidos se bloquearon en la amida del extremo aminoterminal y se acetilaron en el 35 extremo carboxi-terminal. Los péptidos cíclicos se prepararon con residuos cisteína en los extremos aminoterminal y carboxi-terminal para crear un anclaje disulfuro y formar un anillo que contuviese cinco residuos aminoácidos. La figura 5(B) ilustra los péptidos preparados: CIDSC cíclico (SEC ID nº 9), CINPC cíclico (SEC ID nº 9), IDSMSGR (SEC ID nº 2), IDSASGR (SEC ID nº 10), INPASGQ (SEC ID nº 11), CSDIC cíclico (SEC ID nº 12), y CRADC cíclico (SEC ID nº 13).
EJEMPLO 2: TRANSFECCIONES DE CÉLULAS L 40
Los plásmidos de cadherina R y cadherina N de ratón fueron obtenidos del Dr. Masatoshi Takeichi (Kyoto University, Japón). Los plásmidos se subclonaron en vectores pDsRed2 N1 (Clontech) para codificar proteínas de fusión con la proteína fluorescente roja (RFP) unida al extremo C-terminal de las moléculas de cadherina. Las células L (células fibroblásticas L929 de ratón, ATCC nº CRL-2148) se transfectaron establemente con pDsRed2 N1 cadherina R o N utilizando el sistema de transfección con fosfato de calcio (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante. 45 Tras cribar mediante crecimiento en medio suplementado con geneticina (700 µg/ml de geneticina G418, Gibco BRL), se seleccionaron los clones positivos. Las células se examinaron para la expresión de RFP y se sometieron a ensayo para la expresión de cadherina mediante inmunotransferencia y tinción de inmunofluorescencia. La figura 6 ilustra la agregación de las células L que expresan cadherinas R y N. La figura 6(A) muestra fotomicrografías de células L que expresan cadherina R (izquierda) y cadherina N (parte media) que se agregan en medio que contiene calcio, en 50 comparación con células L no transfectadas, que no se agregan. La figura 6(B) es un gráfico de columnas que ilustra el porcentaje de agregación de las células representadas en la figura 6(A). Las células transfectadas con cadherina N y cadherina R tripsinizadas en un tampón que contiene cloruro de calcio aproximadamente 5 mM (etiquetado como TC) formaron grandes grupos celulares, mientras que las células L endógenas mostraron poca agregación en el tampón que contenía calcio. Las células que se tripsinizaron con EDTA en un tampón sin calcio (etiquetado TE) mostraron poca 55 agregación, con independencia de si las células se habían transfectado con cadherinas o no.
EJEMPLO 3: CULTIVO CELULAR E INMUNOFLUORESCENCIA
Las células L transfectadas o de tipo salvaje se cultivaron en medio de Eagles modificado (MEM) suplementado con solución salina básica de Earl, Glutamax 2 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y suero de feto bovino al 10%. Las líneas celulares transfectadas se cultivaron en medio suplementado con aproximadamente 700 µg/ml de G418 (todos los reactivos de medios se obtuvieron de Gibco BRL). Para la inmunofluorescencia, las 5 células se cultivaron hasta una confluencia de aproximadamente 75% en cubreobjetos de vidrio. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante aproximadamente media hora, seguido del bloqueo con suero de cabra normal al 5% y suero de feto bovino al 5% en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS). Los anticuerpos policlonales de cabra contra cadherina R y cadherina N (Santa Cruz) se utilizaron a una dilución de 1:200, y se proporcionó la fluorescencia mediante incubación con IgG secundarias anticabra marcadas con Alexa488 (Molecular Probes). Las imágenes se 10 crearon utilizando un microscopio confocal de fluorescencia Radiance 200 (BioRad). Para el análisis de inmunotransferencia, las células se lisaron en tampón que contenía Triton X-100 al 1%. Se añadieron aproximadamente 50 µg de lisado celular total a cada carril de un gel de poliacrilamida al 8% y las proteínas se separaron mediante electroforesis. Los anticuerpos monoclonales (1:1.000, BD Biosciences) específicos para la cadherina N o la cadherina R se utilizaron para visualizar las bandas correspondientes. 15
La figura 7(A) representa un filtro de inmunotransferencia de células L nativas y células L transfectadas con cadherina R y cadherina N y teñido con anticuerpo de cadherina R. Únicamente las células transferectadas con cadherina R mostraron niveles significativos de expresión de cadherina R. La figura 7(B) muestra un filtro de inmunotransferencia de células L nativas y células L transfectadas con cadherina R y cadherina N y teñidas con anticuerpo de cadherina N. Únicamente las células transfectadas con cadherina N mostraron niveles significativos de 20 expresión de cadherina N. La figura 7(C) es una fotomicrografía de fluorescencia de células que expresan cadherina R marcadas con anticuerpos fluorescentes de cadherina, demostrando la expresión en la superficie celular de únicamente las moléculas de cadherina R. La figura 7(D) es una fotomicrografía de fluorescencia de células que expresan cadherina N marcadas con anticuerpos fluorescentes de cadherina, que demuestra la expresión en la superficie celular de únicamente las moléculas de cadherina N. La figura 7(E) es una fotomicrografía de fluorescencia de células L nativas 25 expuestas a anticuerpos fluorescentes de cadherina, pero que no muestra expresión en la superficie celular de moléculas de cadherina de cualquiera de los dos tipos.
EJEMPLO 4. ENSAYO DE AGREGACIÓN
Se cultivaron células L hasta prácticamente la confluencia, seguido de la tripsinización con tripsina al 0,01% + CaCl2 5 mM y sin EDTA (TC) o con tripsina al 0,01% con EDTA 0,1 mM y sin calcio (TE). Las células se recogieron y se 30 lavaron, seguido de la resuspensión en solución tampón de Hanks (HBSS) + BSA al 1% con (TC) o sin (TE) CaCl2 5 mM. Las células se incubaron a 37ºC en 0,5 ml de solución a una densidad de 2x105 células por pocillo en una placa de 24 pocillos con balanceo a aproximadamente 60 a 70 rpm con concentraciones variables de péptidos. Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado. El grado de agregación celular se representó por la proporción entre el número total de partículas tras 2 horas de incubación (N2h) y el número inicial de partículas (N0). Las partículas se contaron en 35 un hemocitómetro utilizando la suma de 8 recuentos de 20 µl/pocillo, antes (N0) y después (Nt) de la incubación. Se ilustran los resultados en la figura 8.
EJEMPLO 5. TRATAMIENTO DE RATONES MEDIANTE INYECCIÓN INTRAVÍTREA DE PÉPTIDOS
Se disolvieron los péptidos en PBS + DMSO al 10% hasta una concentración de 10 mM. Se inyectaron aproximadamente 0,5 µl o 1,0 µl de solución de péptido 10 mM en la cavidad vítrea de ratones de 2 ó 7 días, 40 respectivamente. En P5 o en P11 se diseccionaron las retinas tal como se encuentra descrito y se visualizaron los vasos y astrocitos mediante inmunohistoquímica. La cuantificación de la vascularización periférica, longitud y área vasculares durante la formación vascular superficial se llevó a cabo mediante formación de imágenes de retinas inyectadas bajo los mismos parámetros de microscopía. A continuación, se generaron los datos utilizando software LASERPIX® (BioRad) utilizando compañeros de camada de control no inyectados para la normalización respecto a la línea base del grado de 45 vascularización retiniana. La cuantificación del efecto sobre la formación vascular profunda se llevó a cabo mediante enfoque anterior respecto al plexo vascular profundo normal utilizando microscopía confocal y realizando un recuento del número de vasos que habían migrado hacia el interior de la capa de fotorreceptores. Se presentan los resultados en la figura 9.
EJEMPLO 6. AISLAMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO DE CÉLULAS MADRE 50
Se aislaron células de médula ósea a partir de ratones transgénicos adultos en los que se fusionó GFP intensificado con el promotor β-actina (ACTbEGFP, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). A continuación, se recogieron los monocitos mediante separación en gradiente de densidades utilizando Histopaque (Sigma) y se marcaron con un panel de anticuerpos de linaje conjugados con biotina (CD45, CD3, Ly-6G, CD11, TER-119, Pharmingen, San Diego, CA) para la selección de Lin-. Las células Lin+ y Lin- se separaron utilizando una columna de separación 55 magnética (MACS, Miltenyi Biotech, Auborn, California). Debido a que se había determinado que las células CD31- representaban un mejor control de una subpoblación no funcional de las HSC según se determinó mediante direccionamiento vascular, se aislaron las células CD31- de los monocitos mediante separación MACS utilizando anticuerpos de CD31 y se utilizaron como control negativo para las HSC Lin- funcionales. Las HSC procedentes de
ratones de tipo salvaje se analizaron para la expresión de cadherina R mediante marcaje de las células con anticuerpos anticadherina R (sc-6456, Santa Cruz Biotech) y anticuerpos secundarios anticabra de burro marcados con Alexa-488 (Molecular Probes) y utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se presentan los resultados en la figura 10.
EJEMPLO 7. INCUBACIONES, INYECCIONES Y CUANTIFICACIÓN DE CÉLULAS HSC 5
Se incubaron HSC Lin- con 100 nM de anticuerpo bloqueante de cadherina R (SC-6456, Santa Cruz Biotech) o IgG de cabra preinmunológica en solución salina tamponada con fosfato durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 37ºC antes de la inyección. Se llevaron a cabo inyecciones intravitreales en ojos P6 utilizando 0,5 µl de solución para HSC. Se examinaron a continuación las retinas en P12 en montajes completos o en secciones. Se cuantificó el direccionamiento de las HSC Lin- mediante recuento del número total de células madre dentro de la retina 10 utilizando ocho campos de visión diferentes por retina: cuadrantes izquierdo, derecho, superior e inferior (3/4 de la distancia hasta la periferia de la retina), dos cuadrantes intermedios (1/4-1/2 de la distancia hasta la periferia), el sitio de inyección y la región de la cabeza del nervio óptico. Estas células se caracterizaban por su localización en capas superficiales, intermedias o profundas, o por la falta de direccionamiento (las células situadas en la parte posterior de la capa de fotorreceptores). Se proporciona el número de células no direccionadas dentro de la capa de fotorreceptores 15 como porcentaje del número total de células madre observado. Se presentan los resultados en las figuras 11 y 12.
COMENTARIO
Los péptidos antagonistas selectivos para la cadherina R de la presente invención actúan como miméticos de péptidos de motivos de reconocimiento cruciales de la cadherina R (es decir, las secuencias IDS e INS observadas en las cadherinas R de mamífero). Sin vincularse a ninguna teoría en particular, los presentes péptidos antagonistas 20 probablemente bloquean la función de adhesión de las moléculas de cadherina R mediante interacción competitiva con los dominios EC1 de las moléculas de cadherina R sobre las superficies celulares. Los presentes péptidos antagonistas resultan útiles para el estudio de las funciones moleculares y para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la adhesión celular, y generalmente pueden difundirse más dentro de un tejido tras la inyección in vivo que los antagonistas basados en anticuerpos. 25
La morfogénesis de tejidos durante el desarrollo de la mayoría de tejidos, incluyendo el tejido neural retiniano, implica la unión selectiva de moléculas de adhesión célula-célula. Esta selectividad de unión permite que células diferenciadas de manera similar se organicen conjuntamente, y evita que los tipos celulares invadan estructuras de tejidos incorrectas. Sin embargo, a pesar de estudios exhaustivos sobre las propiedades y función de las cadherinas, particularmente las cadherinas N y E, todavía no ha emergido un mecanismo general que explique la especificidad de 30 las cadherinas. Los presentes péptidos antagonistas de la cadherina R interactúan selectivamente con las moléculas de cadherina R de mamífero sin unión significativa a otras clases de cadherina. Estos péptidos contienen la secuencia IDS (o sus homólogos INS, IES e IQS), que corresponden a una región dentro del dominio de cadherina EC1, residuos 53 a 55 de las secuencias SEC ID nº 17 y 18, en las que se informa de que se localizan importantes interacciones dentro de la interfaz de adhesión basándose en análisis estructural, mutacional y de homología de secuencias. 35
Sin respaldo teórico, se cree que el motivo IDS establece contactos directos con la secuencia VDI de una molécula contigua de cadherina en la interfaz de adhesión. Debido a que los residuos 53 a 55 de las cadherinas aparentemente resultan necesarios para la transdimerización y debido a que, al contrario que otras regiones importantes para la adhesión, esta secuencia corta de aminoácidos no se encontraba conservada entre los miembros de la familia de la cadherina clásica, esta región actúa como determinante para la especificidad de las cadherinas. En efecto, la IDS 40 cíclica (CIDSC, SEC ID nº 8) inhibe selectivamente la agregación celular mediada por la cadherina R, mientras que la contrapartida correspondiente de la cadherina N, INP cíclica (CINPC, SEC ID nº 9) inhibe selectivamente la agregación mediada por la cadherina N. La cadherina N y la cadherina R son los más homólogos de los miembros de la familia de las cadherinas. De hecho, aunque todas las cadherinas, incluyendo la cadherina R y la cadherina N prefieren interactuar de un modo homofílico, las cadherinas R y N son los únicos dos miembros de la familia de la cadherina clásica en los 45 que se han observado heterodímeros funcionales. De esta manera, resulta altamente improbable que el IDS cíclico y el INP cíclico presenten propiedades funcionales diferentes para las cadherinas N y R, pero propiedades solapadas para cualquier otro miembro cadherina. Estos estudios demuestran que el motivo IXS (en el que X es D, N, E o Q) (es decir, correspondiente a los residuos 53 a 55 de la cadherina R y homólogos del mismo) desempeña un papel importante en la mediación de la homoasociación entre las moléculas de cadherina R. Resulta probable, basándose en la especificidad 50 de IXS para la cadherina R e INP para la cadherina N, que residuos situados correspondientemente en otros miembros de la familia de las cadherinas (por ejemplo el motivo IER de la cadherina E y el motivo IEK de la cadherina P) también confieran especificidad a las otras cadherinas clásicas.
Algunos estudios anteriores han demostrado que los anticuerpos de la cadherina R alteran la vascularización retiniana in vivo. La vascularización del plexo superficial probablemente se había alterado debido a la interrupción de la 55 guía mediada por señales de guía transmitidas por astrocitos situados delante de las células endoteliales. También se observó la expresión de cadherina R en las regiones en las que posteriormente se localizarán los plexos vasculares profundos, inmediatamente antes de la invasión vascular. Las moléculas de cadherina R dentro de estas regiones se cree que guían las células endoteliales al plexo vascular correcto, debido a que la inyección de anticuerpos bloqueantes de la cadherina R provocan que los vasos eviten las capas vascularizadas normales. 60
Se han generado fenotipos vasculares similares mediante inyección de IDS cíclico (CIDSC, SEC ID nº 8) durante la vascularización retiniana tanto superficial como profunda. Debido a que el IDS cíclico altera selectivamente la agregación mediada por la cadherina R en un grado significativo in vitro (es decir, sin alteración significativa de la agregación mediada por cadherina N), probablemente también se generó el fenotipo vascular in vivo mediante interacciones de alta afinidad del IDS cíclico con la cadherina R. Además, la inyección de INP cíclico (CINPC, SEC ID 5 nº 9), que resultó ser un inhibidor efectivo de la agregación mediada por cadherina N pero no la agregación por cadherina R in vitro, no resultó en un fenotipo vascular retiniano significativo. Conjuntamente, estos resultados confirman un papel específico para la cadherina R durante la guía vascular.
El diseño de péptidos antagonistas selectivos para cadherina R de la presente invención se basó en el análisis estructural, bioquímica y mutacional de diversos miembros de la familia de la cadherina clásica. El triptófano-2 es 10 conocido que resulta importante para la función de la cadherina conjuntamente con la secuencia HAV en los residuos aminoácidos 79 a 81 de la cadherina N y de la cadherina R. De hecho, los péptidos lineales y cíclicos que contienen la secuencia HAV se informa que bloquean el crecimiento de neuritas mediado por cadherina N in vitro. Sin embargo, estas secuencias se encuentran absolutamente conservadas en todas las moléculas de cadherina y por lo tanto no pueden proporcionar especificidad de unión. Otros residuos también deben realizar contactos importantes dentro de la 15 interfaz de dimerización, resultando importantes algunos residuos no conservados para el reconocimiento de las cadherinas. Se ha centrado la atención en residuos dentro de la repetición aminoterminal de cadherina (EC1). La mayoría de los residuos importantes para el contacto se localizaron en tres regiones, aminoácidos 35 a 45, aminoácidos 53 a 59 y aminoácidos 79 a 86. Los residuos 53 a 59 contenían la mayoría de esto residuos específicos de cadherina que resultan potencialmente importantes en la formación de la interfaz de dimerización. De ellos, los residuos 53 a 55 20 resultaron de significancia particular. De esta manera, se diseñaron miméticos de péptidos de esta región para optimizar la probabilidad de que se produjesen péptidos específicos de la cadherina R. Se diseñaron péptidos similares contra secuencias de la cadherina N de ratón, el miembro de la familia de las cadherinas más estrechamente relacionado, y otros péptidos de control, y se utilizaron para el análisis comparativo.
Agregación mediada por cadherinas 25
Se seleccionaron las células fibroblásticas de ratón (linaje L929), denominadas comúnmente células L, debido a que es conocido que no presentan expresión endógena de cadherinas. Se crearon transfectantes estables para cadherina R y se utilizaron para someter a ensayo los efectos de los péptidos diseñados sobre la agregación mediada por cadherina R. También se crearon transfectantes estables para cadherina N y se utilizaron para evaluar los péptidos para la selectividad de cadherina basándose en sus efectos sobre la agregación mediada por cadherina N. El análisis de 30 inmunotransferencia detectó niveles elevados de expresión de cadherina R y de cadherina N en el clon 8 de cadherina R (R-cad8), mientras que se encontraron niveles elevados de expresión de cadherina N y la ausencia de expresión de cadherina R en el clon 3 de cadherina N (N-cad3), tal como se muestra en la figura 7. La inmunofluorescencia confirmó la expresión de la cadherina apropiada en dichos clones seleccionados. Al someterlos a ensayo en el ensayo de agregación, la morfología de las líneas celulares transfectada resultó alterada como resultado de la transfección con 35 cadherina. Aunque las células L parentales (es decir, no transfectadas) seguían disociadas como partículas celulares individuales, los ratones transfectados con cadherina R y cadherina N formaron agrupaciones celulares grandes dependientes de calcio (tampón TC) debido a las fuertes asociaciones intercelulares, tal como se muestra en la figura 6(A). Los grupos de agregación mediada por cadherina se eliminaron mediante tripsinización inicial de las células con solución de EDTA y agregación en tampón sin calcio (tampón TE), tal como se muestra en la figura 6(B). 40
Efectos de los péptidos sobre la agregación celular
Se añadieron péptidos en diversas concentraciones a los pocillos de agregación para someter a ensayo su efectividad en el bloqueo de la adhesión mediada por cadherina. El IDS cíclico inhibió la agregación mediada por cadherina R con una IC50 de aproximadamente 300 µM. El péptido lineal IDSMSGR (SEC ID nº 2) también bloqueó la adhesión mediada por cadherina R. Sin embargo, su efectividad (IC50 ~900 µM) era aproximadamente 3 veces inferior a 45 la del IDS cíclico. Debido a que los péptidos cíclicos también demostraron ser mucho más solubles y fáciles de manipular que los péptidos lineales, se enfatizó más el análisis de únicamente los péptidos cíclicos (figura 8(A)). Los efectos del IDS cíclico eran específicos para la cadherina R, debido a que se observó un efecto reducido sobre la agregación por cadherina N. En contraste, la secuencia específica para la cadherina N, INP cíclico, inhibió la agregación mediada por cadherina N con una IC50 ligeramente inferior a 300 µM (figura 8(B)), de manera similar a los efectos del 50 IDS cíclico sobre la agregación de la cadherina R. El INP cíclico presentó pocos efectos sobre la agregación mediada por cadherina R.
Los otros péptidos de control, el RAD cíclico (CRADC, SEC ID nº 13) y el SDI cíclico (CSDIC, SEC ID nº 12) presentaron un efecto reducido sobre la agregación mediada por cadherina R o por cadherina N. Se sometió a ensayo un péptido HAV cíclico (CHAVC, SEC ID nº 20), que ya es conocido que resulta efectivo para bloquear la adhesión 55 mediada por cualquier molécula de cadherina clásica, en forma de comparación. En este ensayo, el HAV cíclico bloqueó la agregación mediada por cadherina R y por cadherina N con IC50 comprendidas entre 150 y 200 µM. De esta manera, el IDS cíclico y el INP cíclico bloquearon selectivamente la adhesión por cadherina R o N, respectivamente, con afinidades sólo ligeramente inferiores a las del péptido de bloqueo no específico pan-cadherina. Algunos estudios anteriores con anticuerpos contra la cadherina R han demostrado la alteración de la vascularización normal de la retina 60
durante el desarrollo. Estos anticuerpos también resultaron efectivos para alterar la agregación mediada por cadherina en nuestro sistema de ensayo, con una IC50 de aproximadamente 10 nM, tal como se muestra en la figura 8(C).
Efectos de los péptidos sobre la vascularización retiniana
Se inyectaron los péptidos en la cavidad vítrea de los ojos posnatales de ratón. Al inyectar péptidos con IDS cíclico o HAV cíclico en ojos de ratones de dos días de edad, y se examinó la vasculatura resultante tres días después, 5 el día posnatal 5 (P5), la formación vascular se encontraba alterada, con resultados similares a los observados mediante inyecciones de anticuerpos. Estas retinas se caracterizaban porque presentaban una vascularización periférica menos extensiva, y menos vasos interconectantes dentro de las regiones vascularizadas en comparación con los controles compañeros de camada normales no inyectados. Globalmente, la vascularización de la capa superficial se redujo a la mitad con los péptidos bloqueantes de la cadherina R, mientras que las inyecciones de INP cíclico específicas para 10 cadherina N presentaron resultados relativamente normales (ver la figura 9(A-C)).
Los péptidos antagonistas selectivos para la cadherina R de la presente invención también alteraron la vascularización normal de las capas retinianas profundas. Al inyectar el péptido con IDS cíclico en P7, inmediatamente antes de que los vasos de la red vascular superficial se sumerjan e inicien la formación del plexo vascular profundo, la vasculatura en P11 resultante se caracterizaba por numerosos brotes vasculares que habían migrado más allá del plexo 15 vascular profundo normal y hacia el interior de la capa avascular de fotorreceptores. Nuevamente, lo expuesto anteriormente es similar a los efectos observados anteriormente al inyectar anticuerpos de la cadherina R. En contraste, el plexo vascular profundo de ojos inyectados con péptidos con INP cíclico se formó normalmente, tal como se muestra en la figura 9 (B y D).
La cadherina R se expresa en HSC Lin- 20
Se analizó la expresión de la cadherina R en células madre hematopoyéticas (HSC) para determinar si las moléculas de adhesión celular de cadherina R se expresaban en la superficie celular de células direccionadas funcionales. Utilizando el análisis de citometría de flujo, se expresó la cadherina R en la superficie celular de prácticamente el 80% de la subpoblación Lin- de HSC, mientras que únicamente el 30% de las células Lin+ expresaba cadherina R (figura 10). Basándose en las intensidades relativas de fluorescencia de las dos poblaciones celulares, 25 probablemente las células Lin- también expresan concentraciones más altas de cadherina R en su superficie celular que la pequeña proporción de células Lin+ positivas para cadherina R. De esta manera, la mayoría de células dentro de la subpoblación funcionalmente con diana en la vasculatura retiniana expresan cadherina R, mientras que la mayoría de células de la subpoblación no direccionada, no la expresan. Resulta interesante que una subpoblación diferente de HSC que son negativas para CD31, CD34 y Mac1 y que no presentan función de direccionamiento en absoluto contenían 30 incluso menos células expresantes de cadherina R.
Anticuerpos y péptidos bloqueantes de la cadherina R alteran el direccionamiento de las HSC
Con el fin de examinar el grado con el que actúa la adhesión célula-célula de la cadherina R en el direccionamiento de las HSC a las diferentes capas vasculares retinianas, se bloquearon HSC Lin- con anticuerpos bloqueantes específicos de cadherina R antes de la inyección. Seis días después de la inyección, únicamente se 35 encontraron HSC Lin- normales localizadas en las tres capas vasculares: 1) el plexo vascular superficial localizado dentro de la capa de células ganglionares, 2) el plexo vascular profundo localizado próximo a la capa plexiforme externa, y 3) la capa intermedia localizada en el borde frontal de la capa nuclear interna. La figura 11(A) muestra secciones transversales de retinas tras la inyección de HSC Lin- normales (izquierda), HSC Lin- incubadas con anticuerpos de cadherina R bloqueantes de la adhesión (parte media) y HSC Lin- incubadas con IgG de cabra preinmunológica 40 (derecha).
Al preincubar las HSC Lin- con anticuerpos anticadherina R antes de la inyección, muchas de estas células perdieron su capacidad de direccionar correctamente, mientras que las células preincubadas con IgG preinmunológica funcionaban de manera similar a las HSC no bloqueadas. El direccionamiento a las capas vasculares profunda e intermedia resultó aparentemente especialmente afectado por el bloqueo de la adhesión por cadherina R, debido a que 45 se encontraron relativamente pocas HSC bloqueadas por cadherina R localizadas en estas regiones. Las células localizadas en el plexo vascular superficial aparentemente también se encontraban menos organizadas y no colocalizadas con la vasculatura endógena en el mismo grado que las HSC Lin- normales o aquéllas preincubadas con IgG preinmunológica.
Muchas de las HSC Lin- preincubadas con anticuerpo de cadherina R migraron a través de la retina más allá de 50 las tres capas vasculares y se engancharon al borde exterior de los fotorreceptores, próximas a la capa RPE. Prácticamente la mitad de las HSC bloqueadas con cadherina R se encontraron en el borde externo de la capa de fotorreceptores (figura 11(B)). En comparación, la retinas de control inyectadas con HSC preincubadas con IgG preinmunológica únicamente mostró un 15% de HSC erróneamente direccionadas a esta región. Una gran parte de las células erróneamente direccionadas de las retinas de control se encontró próxima al sitio de inyección, y probablemente 55 puede atribuirse a células que fueron liberadas subretinianamente al extraer la aguja. Al excluir el sitio de inyección del cálculo, se redujo el número de HSC incubadas con IgG preinmunológica erróneamente direccionadas al 10%. Debido a que prácticamente no se observaron HSC Lin- dentro de esta capa "extraprofunda" normalmente, este pequeño
porcentaje de HSC incubadas con IgG de control erróneamente direccionadas probablemente puede atribuirse al hecho de que la IgG preinmunológica fue capaz de unirse a aproximadamente 10% de las células Lin- (figura 10). Estas moléculas de IgG unidas podría evitar no específicamente la adhesión normal simplemente debido a impedimentos estéricos. Sin embargo, la diferencia entre el número de células erróneamente direccionadas debido al bloqueo específico de la cadherina R y el bloqueo no específico de IgG, es significativa. 5
La figura 12(A) representa imágenes confocales a través de los planos z de los tres plexos vasculares y el borde externo de la capa de fotorreceptores. Se observó un direccionamiento normal dentro de los plexos vasculares correctos y a lo largo de vasos endógenos (en rojo) por parte de las HSC Lin- (en verde) bloqueadas con IgG preinmunológica de cabra. El bloqueo de la adhesión por cadherina R provocó que muchas HSC Lin- se localizasen en el borde externo de la capa de fotorreceptores, y las células direccionadas a los plexos vasculares normales tendieron a 10 agruparse entre sí y no se localizaron a lo largo de los vasos endógenos (en rojo). La figura 12(B) es un gráfico de columnas que demuestra que el porcentaje de células erróneamente direccionadas respecto a la población total de HSC en la retina era significativamente superior en la población de HSC Lin-bloqueada con cadherina R (valores de P<0,01).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE 15
<120> Antagonistas de la cadherina R selectivos y procedimientos
<130> 18-196
<140> EP 04 750 884.1
<141> 2004-04-30
<150> US 60/467.188 20
<151> 2003-05-01
<160> 20
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
<210> 1
<211> 916 25
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 1
5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT 5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia parcial de una variante humana de la preproteína de la cadherina R
<400> 2
10
<210> 3
<211> 916
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 3 15
<210> 4
<211> 7
<212> PRT 5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia parcial de una variante humana de la preproteína de la cadherina R
<400> 4
10
<210> 5
<211> 913
<212> PRT
<213> MUS MUSCULUS
<400> 5 15
<210> 6 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Antagonista de la cadherina 10
<221> VARIANTE
<222> 2
<223> xaa = Asp, Asn, Glu o Gln
<400> 6
15
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20
<223> Antagonista de la cadherina cíclico, enlace disulfuro entre Cys1 y Cys5
<221> VARIANTE
<222> 3
<223> Xaa = Asp, Asn, Glu o Gln
<400> 7
5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 10
<223> Antagonista de la cadherina cíclico, enlace disulfuro entre Cys1 y Cys5
<400> 8
<210> 9
<211> 5 15
<212> PRT
213> Secuencia artificial
<220>
<223> Antagonista de la cadherina cíclico, enlace disulfuro entre Cys1 y Cys5
<400> 9 20
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 25
<220>
<223> Antagonista de la cadherina
<400> 10
<210> 11 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Antagonista de la cadherina 35
<400> 11
<210> 12
<211> 5
<212> PRT 5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Antagonista de la cadherina cíclico, enlace disulfuro entre Cys1 y Cys5
<400> 12
10
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15
<223> Antagonista de la cadherina cíclico, enlace disulfuro entre Cys1 y Cys5
<400> 13
<210> 14
<211> 69 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia parcial de la cadherina N murina
<400> 14 25
<210> 15
<211> 69
<212> PRT 30
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia parcial de la cadherina R murina
<400> 15
<210> 16 5
<211> 69
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia parcial de la cadherina R murina 10
<400> 16
<210> 17
<211> 69
<212> PRT 15
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia parcial de la cadherina R murina
<400> 17
20
<210> 18
<211> 69
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia parcial de la cadherina R murina
<400> 18
<210> 19 5
<211> 69
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia parcial de la cadherina R de pollo 10
<400> 19
<210> 20
<211> 5
<212> PRT 15
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Antagonista de la cadherina cíclico, enlace disulfuro entre Cys1 y Cys5
<400> 20
20
Claims (19)
- REIVINDICACIONES1. Péptido que es un antagonista selectivo de la cadherina R, constituido por de siete residuos aminoácidos y que presenta la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 6), en el que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln.
- 2. Péptido según la reivindicación 1, en el que Xaa es Asp o Asn. 5
- 3. Péptido constituido por la secuencia de aminoácidos Ile-Asp-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 2) o Ile-Asp-Ser-Ala-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 10).
- 4. Péptido que es un antagonista selectivo de la cadherina R, en el que el péptido se encuentra representado por la fórmula:10en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln; X1 y X2 son independientemente un residuo aminoácido o una pluralidad de hasta 10 residuos aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, e Y1 e Y2 son independientemente residuos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace disulfuro.
- 5. Péptido según la reivindicación 4, en el que Y1 e Y2 son residuos cisteína unidos entre sí mediante un 15 enlace disulfuro.
- 6. Péptido cíclico que presenta la secuencia de aminoácidos Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys (SEC ID nº 7), en el que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln, y el péptido incluye un enlace disulfuro entre los dos residuos de Cys.
- 7. Péptido según la reivindicación 6, en el que Xaa es Asp. 20
- 8. Composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis retiniana, que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador farmacéuticamente aceptable de la misma, conjuntamente con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 9. Método in vitro para inhibir la adhesión celular mediada por cadherina R, que comprende poner en contacto las células de mamífero que expresan las moléculas de cadherina R sobre su superficie celular con una 25 cantidad inhibidora de la adhesión celular de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
- 10. Utilización de un péptido que es un antagonista selectivo de la cadherina R y que comprende 3 a 30 residuos aminoácidos, presentando los tres residuos contiguos del péptido la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser, en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir la angiogénesis retiniana en un paciente que sufre de 30 angiogénesis vascular retiniana anormal.
- 11. Utilización de un péptido que es un antagonista selectivo de la cadherina R y que comprende 3 a 30 residuos aminoácidos, presentando los tres residuos contiguos del péptido la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser; en la que Xaa es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Asp, Asn, Glu y Gln, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de la degeneración macular relacionada con la 35 edad o de la retinopatía diabética.
- 12. Utilización según la reivindicación 10 u 11, en la que el péptido comprende por lo menos 7 residuos aminoácidos, presentando los siete residuos aminoácidos contiguos del péptido la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 6).
- 13. Utilización según la reivindicación 10 u 11, en la que el péptido comprende 3 a 10 residuos aminoácidos 40 dispuestos en un anillo.
- 14. Utilización según la reivindicación 13, en la que el péptido comprende por lo menos 7 residuos aminoácidos, presentando los siete residuos aminoácidos contiguos del péptido la secuencia de aminoácidos Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEC ID nº 6).
- 15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en la que Xaa es Asp o Asn. 45
- 16. Utilización según la reivindicación 10 u 11, en la que el péptido es un péptido según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 17.
- 17. Utilización de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el direccionamiento de las células madre a la vasculatura en desarrollo destinada a tratar una enfermedad asociada al desarrollo vascular anormal, en la que la composición farmacéutica está destinada a poner en contacto células madre de mamífero con una cantidad inhibidora del direccionamiento vascular de dicho péptido. 5
- 18. Utilización según la reivindicación 17, en la que la enfermedad es la degeneración macular o la retinopatía diabética.
- 19. Utilización según la reivindicación 17, en la que las células madre son células precursoras endoteliales.
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