KR20110099065A

KR20110099065A - 선택적 ｒ-카데린 길항제 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20110099065A
Application number: KR1020117019034A
Authority: KR
Inventors: 마틴 프리들랜더; 마이클 아이 도렐
Original assignee: 더 스크립스 리서치 인스티튜트
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2011-09-05
Also published as: WO2004099232A3; BRPI0409850A; ES2355260T3; PT1635855E; ATE491718T1; CN1812804B; RU2349598C2; DE602004030565D1; KR20060009283A; US20090124538A1; CN103272219A; JP4613300B2; US8163697B2; EP1635855A4; MXPA05011751A; DK1635855T3; KR101120419B1; WO2004099232A2; US20050004013A1; CA2523932A1

Abstract

포유동물 R-카데린의 선택적 길항제로서 유용한 분리된 펩타이드는 아미노산 잔기 3 내지 30개를 포함하고 당해 펩타이드의 3개의 연속적 잔기는 아미노산 서열 Ile-Xaa-Ser(여기서, Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)을 갖는다. 바람직하게는, Xaa는 Asp 또는 Asn이다. 바람직한 하나의 양태에서, 당해 펩타이드는 환으로 배열된 3 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 사이클릭 펩타이드이다. 본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드는 내피세포의 전구 세포와 같은 줄기세포의 발달중인 혈관구조로의 표적화를 억제하고, R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하고, 망막 혈관형성을 억제하는데 유용하다.

Description

선택적 Ｒ-카데린 길항제 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{Selective R-cadherin antagonists and a pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 일반적으로 포유동물 세포 부착 분자의 길항제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 포유동물 R-카데린(카데린-4)의 선택적 펩타이드 길항제 및 이를 이용한 세포 부착 및 망막 혈관형성의 억제방법에 관한 것이다.

카데린(cadherin) 계열의 분자는 칼슘 의존적인 선택적 세포-세포 상호작용에서 작용하는 경막 당단백질로 이루어진다. 이러한 분자는 배아 발달 및 조직 형태형성 동안 세포 인식 및 세포 분류를 매개함으로써 중요한 역할을 한다. 카데린의 아계열(고전적 카데린, 프로토카데린, 데스모콜린 및 기타 카데린 관련 단백질)은 다양한 수의 세포외 카데린 도메인, 단일 경막 절편 및 단일 세포질 도메인을 특징으로 한다. 소위 고전적 카데린(즉, E, P, N 및 R-카데린)은 주로 동종친화성 상호작용에 관여하는 5개의 탠덤 반복된 세포외 카데린 도메인(EC1-EC5), 및 부착 특이적 세포내 신호전달을 매개하는 고도로 보존된 세포질 테일(tail)을 보유하고 있는 것으로 보고된 바 있다.

카데린 매개된 세포-세포 부착은 인접 세포에서 발현되는 복수의 카데린 분자가 상호작용할 때 일어나서, 부착 접합점의 형성을 유도한다. 문헌[참조: Shapiro et al. Nature 1995; 374(6520): 327-37]에 제시된 카데린 지퍼 모델에 따르면, 동일 세포의 막에 존재하는 카데린 분자는 단단한 평행 가닥의 이량체(즉, 소위 시스 이량체)를 형성한다. 도 1에 도시한 바와 같이, 이러한 시스(cis) 이량체는 그 다음 인접 세포에서 발현되는 카데린 이량체에 결합한다(즉, 트랜스(trans) 이량체화). 일단 충분한 상호작용이 지속되면, 더 많은 카데린 분자가 그 부위로 모일 때 카데린 군집화가 일어날 수 있고, 이로써 두 세포 표면 유래 분자의 교합이 유도된다. 이러한 방식으로, 비교적 약한 상호작용이 조합되어 다소 강한 세포-세포 부착을 형성할 수 있다.

초기 카데린 부착시, α 및 β 카테닌 분자와 세포질 카데린 테일의 상호작용을 통해 전달되는 세포내 신호는 세포골격의 재구성을 유도한다. 액틴 미세섬유와의 연합이 동종친화성 결합에 영향을 미치지는 않는 것으로 생각되지만 그 연합은 상호작용 부위에 카데린 분자들이 유지되는 것을 돕는다. 공생형 관계에서, 카데린 군집화는 세포골격의 재구성을 유발하고 막에 부착점들을 제공하는데, 이러한 지점들은 부착 접합점 형성시 일어나는 세포 변화에 중요한 역할을 한다. 한편, 세포골격과의 연합은 상호작용 부위에서 카데린들을 유지시켜 새로운 카데린 분자의 보충을 도움으로써 카데린 군집화를 매개한다. 칼슘은 카데린 군집화 동안 보조인자로서 중요한 역할을 한다. 칼슘 이온의 농도가 불충분한 용액에서(즉, 약 2mM 미만)는 카데린 기능이 상실되고 분자가 프로테아제 분해에 더욱 민감하게 된다. 이러한 이유는, 카데린 분자의 구조를 안정시키고 인접 카데린 계면의 적당한 배향을 제공하는데 칼슘이 필요하기 때문이다.

5개의 세포외 고전적 카데린 도메인 EC1 내지 EC5는 각각 카데린 이량체화를 매개하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있지만, 돌연변이 분석은 이량체화 계면을 형성하는 잔기의 대부분이 가장 N-말단측에 있는 카데린 도메인(EC1)에서 발견됨을 제시하였다[참조: Kitagawa, et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 2000; 271(2):358-63]. 하지만, 카데린 분자 사이의 특수한 동종이량체화 기작에 대해서는 알려진 것이 거의 없다.

카데린은 중추신경계의 신경세포 유도 및 발달 동안 중요한 역할을 한다. 뇌의 상이한 세부영역은 카데린 종류의 차별적 발현에 의해 한정되는 것으로 보고되고 있다. 카데린은 또한 발달중인 망막의 다른 영역내에서 특이적 발현을 통해 신경세포 망막 발달에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 병아리 배아 망막 발달 동안, B-카데린은 뮬러(Muller) 아교세포에서만 유일하게 발견되는 것으로 보고되고 있는 반면, 양극성 세포의 특정 집단은 R-카데린(카데린-4로도 알려져 있음)을 발현한다. 무축삭 세포와 신경절 세포의 아집단은 카데린 6B와 7을 발현한다. 이들 동일한 카데린은 망막의 내망상층 내부에서 시냅신-I 양성 신경 말단과 연합된 기저판하부에서만 발현되는데, 이는 현저한 발현 프로필이 망막 발달 동안에 신경세포의 특정 아집단 사이의 시냅스 형성에 기여함을 시사한다. 배아의 시신경에서, 신경절 세포 축삭 분지화는 R-카데린 발현 아교세포와 N-카데린 부착에 의해 매개된다.

또한, 카데린 부착은 발생상의 망막 혈관형성의 발달에도 관여한다(Dorrell, et al. Invest. Ophthalmol.Vis.Sci. 2002; 43(11):3500-10). 표재성 혈관 총(plexus) 형성 동안 R-카데린 부착의 파괴는 정상적인 혈관 패턴화 중 관찰되는 복잡한 혈관 상호연결이 상실되게 한다. R-카데린 부착이 후속 심부 혈관층의 형성동안 차단된다면, 주요 유도 단서를 잃고 혈관은 정상적인 심부 혈관 총을 지나 광수용체 층으로 이동하게 된다.

망막은 분명하게 밝혀진 신경세포, 아교세포 및 혈관 요소들의 잘 한정된 층으로 구성되어 있다. 이러한 망막 층을 약간이라도 변경시키는 임의의 질환이나 증상은 신경세포 변성과 심각한 시력 손상을 초래할 수 있다. 망막 변성 마우스(rd/rd 마우스)는 광수용체 세포사를 초래하는 다수 질환의 모델로서 70년 이상 연구되고 있다. rd/rd 마우스에서, 광수용체 변성은, 간상 세포가 cGMP 의존적 포스포디에스터라제의 β 서브유닛의 돌연변이 및 후속적 원추상 광수용체 사멸에 기인하는 아폽토시스 과정을 겪게됨에 따라 출생 후 처음 3주중에 개시된다. 망막내의 혈관 위축은 또한 rd/rd 마우스에서의 광수용체 세포사와 일시적으로 관련이 있다. 이러한 혈관구조는 처음 3주 내에 3개의 기능성 층들이 발달함에 따라 정상적인 특징적 방식으로 형성되는 것으로 보인다. 하지만, 심부 혈관층의 혈관이 제2주째 동안 및 출생후 4주 말기까지 변성하기 시작하여, 심부 망 및 중간 총이 거의 완전히 사라짐으로써 급격한 혈관 감소가 관찰된다.

조혈 줄기세포 집단은 정상 성체 순환 및 골수에 존재하며, 이로부터 세포의 여러 아집단이 계통 양성(Lin⁺HSC) 또는 계통 음성(Lin^-HSC) 계통을 따라 분화할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 시험관내 및 생체내에서 혈관을 형성할 수 있는 내피 전구세포(EPC)가 Lin^-HSC 아집단 내에 존재한다는 것을 발견했다. Lin^-HSC 집단 내의 EPC는 마우스 안구에 유리체내로 주사했을 때 rd/rd 마우스에서 변성 혈관구조를 표적화하고 안정화시킬 수 있다. 유리체내로 주사된 Lin^-HSC는 표재성 혈관층에 있는 성상세포를 표적화하고, 출생후 2일(P2)째 주사한 경우 내인성의, 발달단계의 혈관 망보다 앞서서 관찰된다. 내인성 혈관구조가, Lin^-HSC가 표적으로 하는 망막의 표면에 도달하면, 이 세포들은 새로운 혈관으로 혼입되어, 주사된 Lin^-HSC 및 내인성 내피 세포의 혼합 집단과 함께 기능성 모자이크 혈관을 형성한다. 또한, Lin^-HSC는 내인성 내피 세포에 의한 층의 혈관신생이 일어나기 전에 망막의 심부 및 중간 혈관층의 영역을 표적화한다. Lin^-HSC의 혼입은 rd/rd 마우스의 심부 혈관구조를 정상 및 대조군 Lin⁺HSC 주사된 마우스에 비해 약 2 내지 약 3배 구제한다. 또한, 심부 혈관구조의 구제는 망막의 외핵층에 있는 광수용체의 분해를 방지한다. 하지만, 이러한 줄기세포가 망막 신경세포 또는 아교세포로 분화를 일으킬 수 있음을 암시하는 증거가 전혀 없어서, 신경세포 보호 기작에 대해서는 알려진 바가 전혀 없다.

천연 발달 혈관형성 전에 성상세포 및 심부 혈관 영역으로의 Lin^-HSC의 표적화는 Lin^-HSC가 발달 동안 내인성 내피세포의 표적화와 유사한 표적화에서 기능을 하는 세포 표면 분자를 발현한다는 것을 암시한다. R-카데린 부착은 발달단계의 망막 혈관신생 동안 성상세포 및 혈관 총으로의 내피세포 표적화에서 중요한 역할을 한다.

R-카데린은 다양한 포유동물에서 동정되고 서열분석되었다. 도 2는 기타가와(Kitagawa) 등에 의해 SWISS-PROT 데이터베이스에 수탁번호 NP001785, 버전 NP001785.2, GI:14589893(이의 관련 내용은 본원에 참고원용된다)로 보고된 R-카데린 프리프로단백질의 사람 변이체의 아미노산 서열(서열번호 1)을 도시한 것이다. 서열번호 1은 위치 222 내지 228에 있는 아미노산 서열 IDSMSGR(서열번호 2)을 포함한다.

도 3은 타니하라(Tanihara) 등에 의해 SWISS-PROT 데이터베이스에 수탁번호 P55283, 버전 P55283, GI:1705542(이의 관련 내용은 본원에 참고원용된다)로 보고된 R-카데린 프리프로단백질의 또 다른 사람 변이체의 아미노산 서열(서열번호 3)을 도시한 것이다. 서열번호 3은 위치 222 내지 228에 있는 아미노산 서열 INSMSGR(서열번호 4)을 포함한다.

도 4는 헛튼(Hutton) 등에 의해 SWISS-PROT 데이터베이스에 수탁번호 NP033997, 버전 NP033997.1, GI:6753376(이의 관련 내용은 본원에 참고원용된다)으로서 보고된 R-카데린 프리프로단백질의 쥐(야생 마우스) 변이체의 아미노산 서열(서열번호 5)을 도시한 것이다. 서열번호 5는 위치 219 내지 225에 있는 아미노산 서열 IDSMSGR(서열번호 2)을 포함한다.

아미노산 서열 His-Ala-Val(HAV)을 포함하는 카데린의 비선택적 펩타이드 길항제는 미국 특허 제6,465,427호, 제6,3456,512호, 제6,169,071호 및 제6,031,072호에 블래스처크(Blaschuk) 등에 의해 보고된 바 있다. 블래스처크 등은 모두 다양한 종류의 카데린 분자들을 무차별적으로 길항시킬 수 있는, 카데린의 선형 및 사이클릭 펩타이드 길항제 둘다를 보고하였다.

아미노산 서열 Ile-Asn-Pro(INP)을 포함하는 N-카데린의 선택적 펩타이드 길항제는 문헌[참조: Williams et al., Mol.Cell Neurosci., 2000; 15(5):456-64]에 의해 보고되었다. HAV 펩타이드는 비특이적인 카데린 길항제인 반면, 윌리암스 등에 의해 보고된 INP 펩타이드 길항제는 N-카데린에 특이적이며, R-카데린과 같은 다른 카데린 분자에 대한 유의적 결합을 나타내지 않는다.

체내의 다양한 조직내의 세포 부착 분자의 차등적 분포로 인해, 특정 세포 부착 분자에 대해 고도로 선택적인 길항제, 특히 R-카데린에 대해 선택적인 길항제에 대한 필요성이 대두되고 있다. 본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드는 이러한 필요성을 충족시킨다.

포유동물 R-카데린의 선택적 길항제로서 유용한 분리된 펩타이드는 3 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하며, 당해 펩타이드의 3개의 연속적 잔기는 아미노산 서열 Ile-Xaa-Ser(IXS)(여기서, Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다)을 갖는다. 바람직하게는, Xaa는 Asp 또는 Asn이다. 바람직한 하나의 양태에서, 펩타이드는 적어도 7개의 아미노산 잔기를 포함하고, 당해 펩타이드의 7개의 연속적 아미노산 잔기는 아미노산 서열 Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(서열번호 6)(여기서, Xaa는 상기 정의한 바와 같다)을 갖는다. 또한, 본 발명은 R-카데린 길항제 펩타이드를 약제학적으로 허용되는 담체 중에 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.

다른 바람직한 구체예에서, 펩타이드는 환으로 배열된 3개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하고, 당해 펩타이드의 3개의 연속적 잔기는 아미노산 서열 Ile-Xaa-Ser(여기서, Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다)을 갖는 사이클릭 펩타이드이다. 바람직하게는, Xaa는 Asp 또는 Asn이다.

바람직한 사이클릭 펩타이드는 하기 화학식으로 표시된다:

상기 화학식에서,

X¹ 및 X²는 독립적으로 하나의 아미노산 잔기이거나 또는 펩타이드 결합에 의해 연결된 10개 이하의 다수의 아미노산 잔기이고;

Y¹ 및 Y²는 독립적으로 이황화 결합에 의해 서로 연결된 아미노산 잔기이며;

Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다.

특히 바람직한 사이클릭 펩타이드는 아미노산 서열 사이클릭 Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys(서열번호 7)(여기서, Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다)을 갖는 것으로, 펩타이드 환은 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 형성된다.

R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하는 방법은 R-카데린 발현 세포를 본 발명의 선택적인 R-카데린 길항제 펩타이드의 부착 억제량과 접촉시킴을 포함한다. 예를 들어, 망막 혈관신생은, 비정상적 망막 혈관의 혈관신생을 겪고 있는 환자에게 본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드의 혈관형성 억제량을 투여함으로써 억제된다. 마찬가지로, 계통 음성 조혈 줄기세포의 발달중인 혈관구조로의 표적화는, 상기 줄기세포를 본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드의 혈관구조 표적화 억제량과 접촉시킴으로써 억제된다. 내피 전구세포와 같은 Lin^-HSC의 발달중인 혈관구조로의 표적화를 억제하는 방법은 연령 관련 황반 변성 및 당뇨성 망막증과 같은 비정상적 혈관 발달과 관련된 질환의 치료에 유용하다.

본원 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, "사이클릭 펩타이드"란 용어는 다수의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 한 쇄에 함께 결합되어 있고, 이 쇄의 말단들이 함께 결합되어 아미노산 잔기의 환을 형성하는 분자를 의미한다. 이러한 사이클릭 펩타이드는 펩타이드 결합, 시스테인 잔기와 같은 2개의 아미노산 잔기 사이의 이황화 결합 또는 임의의 적합한 다른 결합기에 의해 함께 결합될 수 있다. 비펩타이드성 결합 그룹에는 펩타이드 쇄의 각 말단에 있는 작용기와 반응하여 그 사이에 결합을 형성할 수 있는 임의의 화학 잔기일 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 쇄의 두 말단은 3-아미노부티르산과 같은 비단백질 아미노산, 또는 예를 들어, 아미노 말단 단부에 위치한 티오글리콜산 아미드와 같은 비펩타이드성 티올기로부터 형성된 이황화물과 카르복시 말단 단부에 위치한 2-아미노에탄 티올로부터 형성된 아미드에 의해 함께 결합될 수 있다.

본원 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 담체 및 다른 부형제와 관련하여 "약제학적으로 허용되는"이란 용어 및 이의 문법상 변형어는 그 물질을 망막 또는 안구의 자극, 멀미, 현기증, 흐린 시력 또는 손상된 시력, 세포독성 등과 같은 부적합한 생리학적 부작용을 유발함이 없이 사람 환자에게 투여할 수 있음을 의미한다.

본원 및 첨부되는 청구의 범위에 사용된 "아미노산"이란 용어는, 일반적으로 모든 알파 아미노산을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 유전자 코드에 의해 암호화되는 21개 아미노산을 포함하나, 변형된 아미노산 잔기도 포함할 수 있다. 이러한 아미노산은 L형, D형 또는 D,L형일 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 L형 아미노산을 함유하는 것이 바람직하다. 생체내에서 프로테이나제에 의한 분해의 가능성을 최소화하기 위하여, 본 발명의 투여되는 펩타이드는 1종 이상의 D형 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.

포유동물 R-카데린의 선택적 길항제인 분리된 펩타이드는 3 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로서, 당해 펩타이드의 3개의 연속적 잔기는 아미노산 서열 Ile-Xaa-Ser(여기서, Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다)을 갖는다. 바람직하게는, Xaa는 Asp 또는 Asn이다. 본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드는 선형 또는 사이클릭일 수 있다.

본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드는 포유동물 R-카데린의 EC1 도메인에서는 발견되지만 다른 카데린 분자에서는 발견되지 않는 Ile-Asp-Ser 및 Ile-Asn-Ser 서열을 모사한다. Ile-Xaa-Ser 서열을 포함하는 펩타이드는 포유동물 R-카데린 분자에 결합하고 길항시킬 수 있다. Xaa는 포유동물 R-카데린 분자에 존재하는 천연 서열에 부합하도록 아스파르트산 잔기(Asp) 또는 아스파라긴 잔기(Asn)인 것이 바람직하다. 또한, 각각 Asp 및 Asn과의 화학적 유사성 때문에, 글루탐산(Glu) 및 글루타민(Gln)도 Xaa에 적합하다.

하나의 바람직한 양태에서, 펩타이드는 적어도 7개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이러한 펩타이드의 7개 연속적 아미노산 잔기는 아미노산 서열 Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(서열번호 6)을 갖는다. Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다. 바람직하게는 Xaa는 Asp 또는 Asn이다.

또 다른 바람직한 양태에서, 펩타이드는 환으로 배열된 3개 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 사이클릭 펩타이드로서, 당해 펩타이드의 3개의 연속적 잔기가 아미노산 서열 Ile-Xaa-Ser(여기서, Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다)을 갖는 사이클릭 펩타이드이다. 바람직하게는, Xaa는 Asp 또는 Asn인 것이다.

환으로 배열된 5개의 아미노산을 갖는 바람직한 사이클릭 펩타이드는 하기 화학식으로 표시된다:

상기 화학식에서,

Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다. 바람직하게는, Y¹ 및 Y²는 둘다 이황화 결합에 의해 함께 연결된 시스테인 잔기(즉, 시스틴 잔기)이다.

특히 바람직한 사이클릭 펩타이드는 아미노산 서열 사이클로 Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys(서열번호 7)(여기서, Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다)을 갖는 것으로, 환은 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 형성된다. 바람직하게는, Xaa는 Asp 또는 Asn이다.

R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하는 방법은 본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드의 부착 억제량과 R-카데린 발현 세포를 접촉시킴을 포함한다. R-카데린 매개된 세포 부착의 억제를 통해 치료가능한 질환이나 증상(예를 들면, 비정상적 혈관 증식을 특징으로 하는 망막 질환)을 앓는 포유동물에게 세포 부착 억제량의 길항제를 투여함으로써, 펩타이드 길항제와 세포를 생체내에서 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 연령 관련 황반 변성 또는 당뇨성 망막증을 앓는 사람 환자는 본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드에 의해 효과적으로 치료될 수 있다. 길항제는 이 길항제와 이의 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물로서 투여하는 것이 바람직하다.

R-카데린의 선택적 표적화 또는 길항작용을 위해, 본 발명의 펩타이드 및 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 단위 투여량 형태로 비경구, 경구, 흡입 또는 국소적으로 치료학적 유효량으로서 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 "비경구"란 용어에는 정맥내, 피하, 근육내, 흉골내, 안내(예를 들면, 유리체내) 및 복강내 투여 뿐만 아니라 주입 기법에 의한 투여가 포함된다.

적합한 임의의 투여 경로가 사용될 수 있으며, 본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 의도한 치료에 효과적인 용량으로 투여한다. 특정 의학 상태의 치료 또는 이의 진행 억제에 필요한 치료학적 유효량은 의학 기술분야에 알려진 전임상 및 임상 연구를 통해 당업자라면 용이하게 측정할 수 있다.

본원에서 사용된 "치료학적 유효량"이란 용어는 임상의 또는 연구자에 의해 조사된, 조직, 시스템, 동물 또는 사람의 생물학적 반응 또는 의학 반응을 유도하는 활성 성분의 양을 의미한다.

본원에서 사용된 "억제하다"란 용어는 의학적 증상이나 생화학적 상호작용의 지연, 중단 또는 정지를 의미하지만, 반드시 증상의 완전한 제거 또는 상호작용의 완전한 중단을 나타내는 것은 아니다. 환자의 연장된 생존능 또는 증후군의 중증도의 연장된 감소는 의학적 상태가 효과적으로 제어(즉, 억제)된다는 것을 본질적이고 자연적으로 나타낸다.

본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드 및 이를 함유하는 조성물의 투여 섭생은 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 증상의 종류, 증상의 병도, 투여 경로 및 이용되는 특정 펩타이드 길항제의 길항작용 활성과 같은 여러 요인에 근거하여 결정한다. 투여 섭생은 전술한 요인에 따라 상이할 수 있다. 예를 들면, 망막 혈관형성 억제에는 체중 1kg 당 약 0.01mg 내지 약 1000mg 정도의 투여량 수준이 유용하다. 바람직한 투여량 수준은 체중 1kg 당 약 0.01mg 내지 약 100mg 범위이다.

주사에 의해 투여인 경우, 본 발명을 구체화하는 펩타이드 함유 조성물은 물, 식염수 또는 덱스트로스 수용액과 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 조제한다. 주사제로서, 일반적인 1일 용량은 전술한 요인에 따라서 단독 용량 또는 분할 용량으로서 매일 주사될 때 체중 1kg당 약 0.01mg 내지 약 100mg이다.

본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 부형제에는, 예를 들면 당업계에 공지되어 있는 생리학적으로 허용되는 계면활성제, 용매, 완충화제, 보존제 등이 포함된다.

예를 들면, 망막 혈관신생 억제를 위해, 비정상적 망막 혈관의 혈관형성을 겪고 있는 환자에게 본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드의 치료적 유효량을 투여한다. 투여된 펩타이드는 망막에 있는 R-카데린에 선택적으로 결합함으로써 망막내 혈관형성을 파괴하고 억제한다. 이러한 펩타이드 길항제는 유리체내 주사로 투여되는 것이 바람직하다.

Lin^-HSC의 발달중인 혈관구조로의 표적화는 상기 줄기세포를 본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드의 혈관구조 표적화 억제량과 접촉시킴으로써 억제된다. 내피 전구세포와 같은 Lin^-HSC의 발달중인 혈관구조로의 표적화를 억제하는 방법은 연령 관련 황반 변성 및 당뇨성 망막증과 같은 비정상적 혈관 발달과 관련된 질환의 치료에 유용하다. Lin^-HSC는, 본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드를 혈관 증식 질환 또는 증상을 앓는 사람과 같은 포유동물에게 투여함으로써, 생체내에서 접촉되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 다양한 양태를 보다 상세히 설명하기 위해 실시예를 비제한적으로 제시한다. 당업자는, 본 상세한 설명에 개시된 실시예 및 예시된 구체예들이 본 발명의 취지와 영역을 벗어나지 않는 범위내에서 변형될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.

본 발명의 사이클릭 펩타이드는 망막 혈관형성 억제용 약제학적 조성물 또는 R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하기 위한 약제학적 조성물에 사용될 수 있다.

도면에서, 도 1은 카데린 군집화 및 카데린 조절된 세포 부착의 도식적 설명이다.
도 2는 잔기 222-228에 서열 IDSMSGR(서열번호 2)을 포함하는 사람 R-카데린 프리프로단백질의 변이체의 아미노산 서열(서열번호 1)을 도시한 것이다.
도 3은 잔기 222-228에 서열 INSMSGR(서열번호 4)을 포함하는 사람 R-카데린 프리프로단백질의 변이체의 아미노산 서열(서열번호 3)을 도시한 것이다.
도 4는 잔기 229-225에 서열 IDSMSGR(서열번호 2)을 포함하는 R-카데린 프리프로단백질의 쥐 변이체의 아미노산 서열(서열번호 5)을 도시한 것이다.
도 5의 (A)는 쥐 N-카데린 및 다양한 R-카데린의 잔기 24 내지 92에 존재하는 서열 상동성(보존적 잔기(청색) 및 비보존적(적색) 잔기)을 도시한 것으로서, 각각 잔기 53 내지 55에 서열 IDP 및 INP를 갖는 닭 R-카데린 및 마우스 N-카데린과 달리, 모두 잔기 53 내지 55에 서열 IDS 또는 INS를 포함하는 사람, 마우스 및 래트 유래의 포유동물 R-카데린 사이의 상동성을 주지시킨다; 도 5의 (B); 이들 쥐 및 사람 R-카데린과 쥐 N-카데린의 영역내의 잔기에 해당하는 사이클릭 및 선형 펩타이드를 상응하는 대조군 펩타이드들과 함께 합성했다: 사이클릭 CIDSC(서열번호 8), 사이클릭 CINPC(서열번호 9), IDSMSGR(서열번호 2), IDSASGR(서열번호 10), INPASGQ(서열번호 11), 사이클릭 CSDIC(서열번호 12) 및 사이클릭 CRADC(서열번호 13); 도 5의 (A)에 열거된 부분적 카데린 서열은 위에서부터 아래로 쥐 N-카데린(서열번호 14), 쥐 R-카데린(서열번호 15), 래트 R-카데린(서열번호 16), 사람 R-카데린(서열번호 17), 다른 사람 R-카데린(서열번호 18) 및 닭(적색야계; gallus gallus) R-카데린(서열번호 19)의 서열이다.
도 6의 (A)는 R-카데린 및 N-카데린을 발현하는 L-세포의 응집을 입증하는 현미경 사진이다; 도 6의 (B)는 칼슘의 존재 및 부재하에 R-카데린 및 N-카데린에 의해 매개되는 L-세포의 응집율(%)을 도시한 막대그래프이다.
도 7은 R-카데린 및 N-카데린을 이용한 L-세포의 안정된 형질감염을 입증한 것이다; (A) R-카데린 면역블롯; (B) N-카데린 면역블롯; (C)내지 (E) R-카데린 또는 N-카데린 어떠한 것도 발현하지 않는 세포(E)와 비교한, R-카데린 발현(C) 및 N-카데린 발현(D)을 나타내는 염색된 L-세포의 현미경 사진이다.
도 8은 N-카데린 발현 세포에 결합하는 INP 함유 펩타이드와 비교한, R-카데린 발현 세포에 결합하는 IDS 함유 펩타이드에 의한 카데린 발현 L-세포 응집의 선택적 억제를 도시한 그래프이다.
도 9는 사이클릭 CINPC(서열번호 9)와 비교한, 사이클릭 CIDSC(서열번호 8)의 유리체내 주사 후 나타나는 마우스 망막 혈관형성의 선택적 억제를 예시한 것이다: (A) P2 발달 단계에서 rd/rd 마우스 망막을 촬영한 현미경 사진을 도시한 것이다; (B) P7 발달 단계에서 rd/rd 마우스 망막을 촬영한 현미경 사진을 도시한 것이다; (C) 표재성 혈관형성을 나타낸 막대 그래프이다; (D) 심부 혈관형성을 나타낸 막대 그래프이다.
도 10은 조혈줄기세포(HSC)에서의 R-카데린 발현의 유동 세포측정 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 각종 펩타이드들과 대조군 펩타이드들로 처리한 rd/rd 마우스 망막의 횡단면을 촬영한 현미경사진이다.
도 12는 본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드들에 의한, 발달중인 망막 혈관구조로의 Lin^-HSC 표적화의 차단을 도시한 것이다.

실시예 1. 펩타이드 합성

본 발명의 펩타이드 및 다양한 대조군 펩타이드는 스크립스 연구소(Scripps Research Institute)의 단백질 및 핵산 코어 장비에서 고체상합성법을 이용하여 합성하고, HPLC 분석으로 분석되는 바에 따라 가능한 최상급(>95% 순도)으로 정제했다. 펩타이드의 서열은 정확한 펩타이드 합성을 보장하기 위해 질량 분광분석법으로 분석하였다. 모든 펩타이드는 아미노 말단에서 아미드 차단시키고, 카르복시 말단에서 아세틸화시켰다. 사이클릭 펩타이드는 아미노 및 카르복시 말단 단부에 있는 시스테인 잔기로 이황화 쇄를 만들고 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 환을 형성시켜 제조했다. 제조한 펩타이드는 도 5의 (B)에 도시한다: CIDSC(서열번호 8), 사이클릭 CINPC(서열번호 9), IDSMSGR(서열번호 2), IDSASGR(서열번호 10), INPASGQ(서열번호 11), 사이클릭 CSDIC(서열번호 12) 및 사이클릭 CRADC(서열번호 13).

실시예 2. L-세포 형질감염

마우스 R-카데린 및 N-카데린 플라스미드는 마사토시 다케이치(일본, 교토 대학)로부터 증여받았다. 상기 플라스미드를 카데린 분자의 C-말단 단부에 RFP(적색 형광 단백질)가 부착된 융합 단백질을 암호화하는 pDsRed2 N1 벡터(Clontetch)에 서브클로닝하였다. 그 다음, L-세포(마우스 섬유아세포 L929 세포, ATCC #CRL-2148)를, 인산칼슘 형질감염 시스템(Life Technologies)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 R- 또는 N-카데린 pDsRed2 N1로 안정하게 형질감염시켰다. 제네티신(G418 제네티신, Gibco BRL, 700㎍/ml)이 보충된 배지에서 성장을 통해 스크리닝한 후, 양성 클론을 선별하였다. 세포를 RFP 발현에 대해 조사하고, 면역블롯팅과 면역형광 염색법으로 카데린 발현을 검사했다. R- 및 N-카데린 발현성 L-세포의 응집성을 도 6에 도시했다. 도 6의 (A)는 칼슘 함유 배지에서 응집하는 R-카데린(좌) 및 N-카데린(중간) 발현 L-세포의 현미경사진을, 응집하지 않는 형질감염되지 않은 L-세포와 비교하여 도시한 것이다. 도 6의 (B)는 도 6의 (A)에 도시한 세포의 응집 백분율을 나타낸 막대 그래프이다. 약 5mM 염화칼슘을 함유하는 완충액(표지된 TC)에서 트립신처리된 N-카데린 및 R-카데린 형질감염 세포는 거대한 세포 군집을 형성한 반면, 내인성 L-세포는 칼슘 함유 완충액에서 거의 응집되지 않았다. 칼슘 비함유 완충액(표지된 TE)에서 EDTA와 트립신처리된 세포는 카데린으로의 형질감염 여부에 관계없이 거의 응집되지 않았다.

실시예 3. 세포 배양 및 면역형광

형질감염된 L-세포 및 야생형 L-세포를, 얼스 기본 염용액, 2mM Glutamax, 1mM 피루브산나트륨, 0.1mM 비필수 아미노산 및 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 변형 이글스 배지(MEM)에서 성장시켰다. 형질감염된 세포주는 약 700㎍/ml의 G418이 보충된 배지(모든 배지 시약은 Gibco BRL 제품이다)에서 성장시켰다. 면역형광을 위해, 세포를 유리 커버 슬립상에서 약 75%의 융합성(confluency)까지 성장시켰다. 이러한 세포를 약 30분 동안 4% 파라포름알데하이드에 고정시킨 후, 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 5% 정상 염소 혈청 및 5% 태내 송아지 혈청으로 차단시켰다. R-카데린 또는 N-카데린에 대한 염소 폴리클로날 항체(Santa Cruz)는 1:200 희석율로 사용하고, Alexa488 표지된 항-염소 IgG 2차 항체(Molecular Probes)와 항온처리하여 형광을 부여했다. Radiance 200 형광 공초점 현미경(BioRad)을 사용하여 영상화하였다. 면역블롯 분석을 위해, 1% Triton X-100을 함유하는 완충액에 세포를 용해시켰다. 총 세포 용해물중 약 50㎍을 8% 폴리아크릴아마이드 겔의 각 레인에 첨가하고 전기영동으로 단백질을 분리시켰다. 해당 밴드를 가시화하기 위해 N-카데린 또는 R-카데린에 특이적인 모노클로날 항체(1:1000, BD Biosciences)를 사용했다.

도 7의 (A)는 천연 L-세포 및 R-카데린 및 N-카데린으로 형질감염된 L-세포를 R-카데린 항체로 염색한 면역블롯을 보여준 것이다. R-카데린으로 형질감염된 세포만이 R-카데린 발현 수준이 유의적인 것으로 확인되었다. 도 7의 (B)는 천연 L-세포 및 R-카데린 및 N-카데린으로 형질감염된 L-세포를 N-카데린 항체로 염색한 면역블롯을 보여준 것이다. N-카데린으로 형질감염된 세포만이 N-카데린 발현의 유의적 수준을 나타냈다. 도 7의 (C)는 형광성 카데린 항체로 표지된 R-카데린 발현 세포의 형광 현미경사진으로서, R-카데린 분자만이 세포 표면에 발현됨을 보여주고 있다. 도 7의 (D)는 형광성 카데린 항체로 표지된 N-카데린 발현 세포의 형광 현미경사진으로서, N-카데린 분자만이 세포 표면에 발현됨을 보여주고 있다. 도 7의 (E)는 형광성 카데린 항체에 노출시킨 천연 L-세포의 형광 현미경사진으로서, 세포 표면에 어떤 종류의 카데린 분자도 발현되지 않음을 보여주고 있다.

실시예 4. 응집 분석

L-세포를 거의 융합성까지 증식시킨 후 EDTA 첨가없이 0.01% 트립신와 5mM CaCl₂(TC) 또는 칼슘 첨가없이 0.1mM EDTA와 0.01% 트립신(TE)으로 트립신처리했다. 그 후 세포를 수거하고 세척한 후, 5mM CaCl₂를 첨가하거나(TC) 또는 첨가하지 않은(TE) 행크스 완충액(HBSS)과 1% BSA에 재현탁시켰다. 이러한 세포를 다양한 농도의 펩타이드 첨가하에 약 60 내지 70rpm으로 진탕시키면서 0.5ml 용액에서 24웰 평판의 웰당 2x10⁵ 세포로서 37℃에서 항온처리했다. 모든 분석은 3회 실시했다. 세포 응집의 정도는 항온처리 2시간 후의 총 입자 수(N_2hr) 대 초기 입자수(N₀)의 비로 나타내었다. 입자 수는 항온처리전(N₀)과 후(N_t)에 20㎕ 계수/웰의 8회 개별적 양의 합을 사용하여 혈구계로 계수하여 수득했다. 그 결과는 도 8에 도시했다.

실시예 5. 펩타이드의 유리체내 주사에 의한 마우스 처리

펩타이드는 PBS와 10% DMSO에 10mM 농도로 용해시켰다. 10mM 펩타이드 용액 약 0.5㎕ 또는 1.0㎕를 각각 2일령 마우스 또는 7일령 마우스의 유리체강으로 주사했다. P5 또는 P11에서, 망막을 상기한 바와 같이 절개하고, 혈관과 성상세포를 면역조직화학법으로 가시화했다. 표재성 혈관형성 동안 말초 혈관형성, 혈관 길이 및 혈관 면적의 정량을, 주사된 망막을 동일한 현미경 환경하에서 영상화하여 달성하였다. 그 다음, 망막 혈관형성의 정도의 기준 규정화를 위해 주사하지 않은 동복자 마우스 대조군을 사용하여 LASERPIX® 소프트웨어(BioRad)를 사용하여 혈관 수를 수득했다. 심부 혈관형성에 미치는 효과의 정량은 공초점 현미경을 사용하여 정상적인 심부 혈관 총 전방에 초점을 맞추고, 광수용체 층으로 이동된 혈관 수를 계수하여 측정했다. 그 결과는 도 9에 도시한다.

실시예 6. 줄기세포 분리 및 증대

골수세포는 증강된 GFP(ACTbEGFP, Jackson Laboratory, 미국 메인주 바 하버 소재)가 β-액틴 프로모터에 융합된 유전자전이된 성체 마우스로부터 분리했다. 그 다음, 단핵구를 히스토파크(Histopaque, 제조원: Sigma)를 사용하여 밀도구배분리로 수집하고, Lin^- 선발을 위해 바이오틴 접합된 계통 패널 항체들(CD45, CD3, Ly-6G, CD11, TER-119, 제조원: Pharmingen, 미국 캘리포니아 산디에고 소재)로 표지화했다. 자기 분리 컬럼(MACS, Miltenyi Biotech, 미국 캘리포니아 오우번 소재)을 사용하여 Lin⁺ 세포 및 Lin^- 세포를 분리했다. 혈관 표적화로 측정한 결과, CD31^- 세포가 HSC의 비기능성 아집단의 보다 우수한 대조군을 대표하는 것으로 결정되었기 때문에, CD31 항체를 이용한 MACS 분류법으로 단핵구로부터 CD31^- 세포를 분리하고, 기능성 Lin^- HSC의 음성 대조군으로 사용했다. 야생형 마우스의 HSC는 이 세포를 항-R-카데린 항체(sc-6456, Santa Cruz Biotech) 및 Alexa-488 표지된 당나귀 항-염소 2차 항체(Molecular Probes)로 표지하고, FACS 칼리버(Beckton Dickinson, 미국 뉴저지 프랭클린 레이크스 소재) 유세포측정기를 사용하여 R-카데린 발현에 대해 분석했다. 그 결과는 도 10에 제시한다.

실시예 7. HSC 세포 항온처리, 주사 및 정량

Lin^-HSC를 주사 전에 인산염 완충 식염수 용액 중의 100nM R-카데린 차단 항체(SC-6456, Santa Cruz Biotech) 또는 면역전 염소 IgG와 함께 약 1시간 동안 약 37℃에서 항온처리했다. 그 다음, 0.5㎕의 HSC 용액을 사용하여 P6 안구에 유리체내 주사를 실시했다. 그 다음, P12에서 전조직 표본 또는 절편을 통해 망막을 조사했다. 망막당 8가지 다양한 시야, 즉 좌,우, 최상단 및 기저 4분면(망막 표면까지 3/4 거리), 2개의 중간 4분면(망막 표면까지 1/4 내지 1/2 거리), 주사 부위 및 시신경 두부를 사용하여, 망막내의 줄기세포의 총수를 계수하여 Lin^-HSC의 표적화를 정량분석했다. 이들 세포들을 이들의 표재층, 중간층 또는 심부층으로의 국재화 또는 표적화 결여에 의해 특정화하였다. 광수용체층내의 비표적화된 세포의 수를 관찰된 줄기세포의 총 수의 백분율로 제시했다. 그 결과는 도 11과 도 12에 나타냈다.

결론

본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드는 R-카데린의 주요 인식 모티프(즉, 포유동물 R-카데린에서 발견되는 IDS 및 INS 서열)의 펩타이드 모사체(mimetic)처럼 작용한다. 이론적 한정 의도 없이, 본 발명의 길항제 펩타이드는 세포 표면에 존재하는 R-카데린 분자의 EC1 도메인과 경쟁적 상호작용을 통해 R-카데린 분자의 부착 기능을 차단하는 것으로 생각된다. 본 발명의 길항제 펩타이드는 분자 기능의 연구 및 세포 부착 관련 질환의 치료에 유용하며, 생체내 주사시, 항체 기본 길항제보다 조직내 확산성이 일반적으로 더 크다.

망막 신경조직을 비롯한 대부분의 조직의 발달 동안 나타나는 조직 형태형성은 세포-세포 부착 분자의 선택적 결합을 수반한다. 이러한 결합 선택성으로 인해, 유사하게 분화된 세포는 함께 조직화되고, 세포 유형이 부정확한 조직 구조에 침범하지 않게 된다. 하지만, 카데린 특성과 기능, 특히 N-카데린과 E-카데린에 대한 집중적 연구에도 불구하고, 카데린 특이성을 설명하는 일반적인 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 본 발명의 R-카데린 길항제 펩타이드는 다른 카데린류에는 현저하게 결합하지 않으면서 포유동물 R-카데린 분자와 선택적으로 상호작용한다. 이들 펩타이드는 구조, 돌연변이 및 서열 상동성 분석에 근거할 때 부착 계면에서의 중요한 상호작용이 존재하는 것으로 보고된, 서열번호 17 및 18의 잔기 53 내지 55인 카데린 도메인 EC1 내의 영역에 상응하는 IDS 서열(또는 이의 동족체 INS, IES 및 IQS)을 함유한다.

이론적 한정 의도 없이, IDS 모티프는 부착 계면에서 인접 카데린 분자 유래의 VDI 서열과 직접 접촉하는 것으로 생각된다. 카데린의 잔기 53 내지 55가 트랜스이량체화(transdimerization)에 필수적인 인자로 보이고 다른 부착에 중요한 영역들과 달리, 이러한 짧은 아미노산 서열이 고전적 카데린 계열 구성원 중에서 보존되지 않았기 때문에, 이 영역은 카데린 특이성의 결정인자로 작용한다. 사실상, 사이클릭 IDS(CIDSC, 서열번호 8)는 R-카데린 매개된 세포 응집을 선택적으로 억제하는 반면, 이에 상응하는 N-카데린 대응물인 사이클릭 INP(CINPC, 서열번호 9)는 N-카데린 매개된 응집을 선택적으로 억제한다. N-카데린 및 R-카데린은 카데린 계열 구성원 중에서 가장 상동성이다. 사실상, R- 및 N-카데린을 비롯한 모든 카데린이 동종친화성 방식으로 상호작용하는 것을 선호하지만, R- 및 N-카데린은 기능성 이종이량체가 관찰된 유일한 2가지 고전적 카데린 계열 구성원이다. 따라서, 사이클릭 IDS 및 사이클릭 INP가 N- 및 R-카데린에 대해 상이한 기능적 특성을 갖지만, 다른 임의의 카데린 성분에 대해서는 중복된 특성을 가질 가능성은 매우 적다. 이러한 연구는 IXS 모티프(X가 D, N, E 또는 Q인 경우)(즉, R-카데린 잔기 53 내지 55에 해당하는 것 및 이의 동족체)가 R-카데린 분자의 동종연합을 매개하는데 있어 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다. R-카데린에 대한 IXS의 특이성과 N-카데린에 대한 INP의 특이성을 감안해 볼 때, 다른 카데린 계열 구성원내에 상응하게 위치한 잔기(예를 들면, E-카데린의 IER 모티프 및 P-카데린의 IEK 모티프)도 역시 다른 고전적 카데린에 대해 특이성을 부여하는 것으로 생각된다.

R-카데린에 대한 항체가 생체내 망막 혈관형성을 파괴한다는 것은 선행 연구에서 밝혀져 있다. 이와 유사하게, 표재성 망의 혈관형성도 내피세포에 앞서 놓인 성상세포로 대체된 R-카데린 매개된 유도 단서의 방해로 인해 파괴되었다. R-카데린 발현은 또한 혈관 침범 직전에 심부 혈관 망이 후속 위치하는 영역에서 관찰된다. R-카데린 차단 항체를 주사했을 때 혈관이 정상적인 혈관형성 층을 형성하지 못하도록 하기 때문에, 이러한 영역내의 R-카데린 분자는 내피 세포를 정확한 혈관 총으로 유도하는 것으로 생각된다.

유사한 혈관 표현형은 표재성 및 심부 망막 혈관신생 동안 사이클릭 IDS(CIDSC, 서열번호 8)를 주사하여 생성시켰다. 사이클릭 IDS는 R-카데린 매개된 응집을 시험관내에서 유의적인 정도로 선택적으로 파괴했기 때문에(즉, N-카데린 매개 응집의 유의적 파괴 없이), 생체내 혈관 표현형도 역시 R-카데린과 사이클릭 IDS의 높은 친화성 상호작용을 통해 생성되었을 것으로 생각된다. 또한, N-카데린 매개된 응집의 효과적인 억제제이지만 시험관내 R-카데린 응집을 억제하지는 않는 사이클릭 INP(CINPC, 서열번호 9)의 주사는 유의적인 망막 혈관 표현형을 야기하지 않았다. 이러한 결과들은 모두 혈관 유도 동안에 R-카데린의 특이적 역할을 확인시켜준다.

본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드의 고안은 고전적 카데린 계열의 다양한 성분들에 대한 구조, 생화학 및 돌연변이 분석을 기반으로 실시했다. 트립토판-2는 N-카데린 및 R-카데린의 아미노산 잔기 79 내지 81에 있는 HAV 서열과 함께 카데린 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 실제, HAV 서열을 함유하는 선형 및 사이클릭 펩타이드는 시험관내에서 N-카데린 매개된 신경돌기 과성장을 차단한다고 보고되고 있다. 하지만, 이러한 서열은 모든 카데린 분자에 절대적으로 보존되어 있으므로, 결합 특이성을 부여할 수 없다. 또한, 다른 잔기들도 카데린 인식에 중요한 일부 비보존된 잔기들과 이량체화 계면에서 중요한 접촉을 형성해야 한다. 아미노 말단의 카데린 반복체(EC1)에 있는 잔기들에 관심이 집중되었다. 접촉에 중요한 잔기들은 대부분 3개 영역, 즉 아미노산 35 내지 45, 아미노산 53 내지 59 및 아미노산 79 내지 86에 위치해 있었다. 잔기 53 내지 59는 이량체화 계면 형성에 잠재적으로 중요한 것으로 보이는 상기 카데린 특이적 잔기들을 대부분 함유하였다. 이 중에서, 잔기 53 내지 55는 특히 중요했다. 따라서, R-카데린 특이적 펩타이드들이 생산될 가능성을 최적화하기 위해, 펩타이드 모사체를 고안했다. 또한, 비교 분석을 위해, 마우스 N-카데린, 가장 밀접하게 관련된 큰 카데린 계열 성분 유래의 서열에 대한 유사 펩타이드들과 다른 대조군 펩타이드를 고안하여 사용했다.

카데린 매개된 응집

통상 L-세포로 불리는 마우스 섬유아세포(L929 계통)를 선택했는데, 그 이유는 내인성 카데린 발현을 함유하지 않는 것으로 알려졌기 때문이다. R-카데린 안정한 형질감염체를 생성시켜, 고안된 펩타이드가 R-카데린 매개된 응집에 미치는 효과를 시험하는데 사용했다. 또한, N-카데린 안정한 형질감염체도 작제하고, N-카데린 매개 응집에 미치는 효과에 근거하여 펩타이드가 카데린 선택성이 있는지를 평가하는데 사용했다. 도 7에 도시한 바와 같이, 면역블롯 분석으로 R-카데린 클론 8(R-cad8)에서는 N-카데린이 발현됨이 없이 R-카데린의 높은 발현 수준이 검출된 반면, N-카데린 클론 3(N-cad3)에서는 R-카데린이 발현됨이 없이 N-카데린의 높은 발현 수준이 발견되었다. 이들 선택된 클론에서의 적절한 카데린의 발현은 면역형광법으로 확인했다. 응집 분석으로 시험한 경우, 형질감염된 세포주의 형태는 카데린 형질감염의 결과로서 변경된 것이 확인되었다. 모(즉, 비형질감염된) L-세포는 단세포 입자로서 해리 상태를 유지하는 반면, 마우스 R-카데린 및 N-카데린 형질감염체는 도 6의 (A)에 도시된 바와 같이 단단한 세포간 연합에 기인하는 거대한 칼슘 의존적(TC 완충액) 세포 군집을 형성했다. 카데린 매개된 응집 군집은 세포를 EDTA 용액으로 초기에 트립신처리하고 칼슘 비함유 완충액(TE 완충액)에서 응집시켜 제거하였다(도 6의 (B)).

세포 응집에 미치는 펩타이드 효과

카데린 매개된 부착을 차단하는데 있어서의 펩타이드의 효과를 시험하기 위하여, 응집 웰에 다양한 농도의 펩타이드를 첨가했다. 사이클릭 IDS는 약 300μM의 IC₅₀에서 R-카데린 매개된 응집을 억제했다. 또한, 선형 펩타이드 IDSMSGR(서열번호 2)도 R-카데린 매개된 부착을 억제했다. 하지만, 이의 효과(IC₅₀ 약 900μM)는 사이클릭 IDS보다 약 3배 더 낮았다. 또한, 사이클릭 펩타이드는 선형 펩타이드보다 훨씬 더 용해성이고 작업이 용이한 것으로 증명되었기 때문에, 사이클릭 펩타이드만을 단독으로 집중적으로 분석하였다(도 8의 (A)). 사이클릭 IDS의 효과는 N-카데린 응집의 효과는 거의 관찰되지 않았기 때문에 R-카데린에 특이적인 것이었다. 이에 반해, 이에 대응하는 N-카데린 특이적 서열인 사이클릭 INP는, 사이클릭 IDS가 R-카데린 응집에 미치는 효과와 유사하게, IC₅₀이 단지 300μM 미만으로서 N-카데린 매개된 응집을 억제했다(도 8의 (B)). 이러한 사이클릭 INP는 R-카데린 매개된 응집에는 영향을 거의 미치지 않았다.

다른 대조군 펩타이드인 사이클릭 RAD(CRADC, 서열번호 13) 및 사이클릭 SDI(CSDIC, 서열번호 12)는 R-카데린 또는 N-카데린 매개된 응집 모두에 거의 영향을 미치지 않았다. 임의의 고전적 카데린 분자에 의해 매개되는 부착을 차단하는데 효과적인 것으로 알려져 있는 사이클릭 HAV 펩타이드(CHAVC, 서열번호 20)는 비교군으로 검사했다. 본 분석에서, 사이클릭 HAV는 IC_50S 150 내지 200μM 사이에서 R-카데린 및 N-카데린 매개된 응집을 차단했다. 따라서, 사이클릭 IDS 및 사이클릭 INP는 비특이적인 범 카데린 차단 펩타이드보다 약간 낮은 친화성으로 각각 R 카데린 부착 또는 N 카데린 부착을 선택적으로 차단했다. R-카데린에 대한 항체를 이용한 종래 연구에서는 정상적인 망막의 발생상의 혈관형성의 파괴를 밝힌 바 있다. 이러한 항체는 또한 본 분석 시스템에서 약 10nM의 IC₅₀에서 카데린 매개 응집을 파괴하는데 효과적이었다(도 8C).

망막 혈관형성에 미치는 펩타이드의 효과

출생후 마우스 눈의 유리체강에 펩타이드를 주사했다. 사이클릭 IDS 또는 사이클릭 HAV 펩타이드를 2일령의 마우스 눈에 주입하고, 수득되는 혈관구조를 3일 후인 출생후 5일(P5)째 조사했을 때, 혈관 형성이 항체 주사 시 관찰되는 것과 유사한 결과로 파괴되었다. 이러한 망막은 정상적인 비주사된 동배 마우스 대조군에 비해, 광범위한 말초 혈관형성이 적고 혈관형성된 부위에 상호연결 혈관이 적은 것으로 나타났다. 결론적으로, 표재 층의 혈관형성은 R-카데린 차단 펩타이드에 의해 절반으로 줄은 반면, N-카데린 특이적인 사이클릭 INP 주사된 망막은 비교적 정상이었다(도 9의 (A) 내지 (C)).

본 발명의 선택적 R-카데린 길항제 펩타이드는 또한 심부 망막 층의 정상적인 혈관형성을 파괴했다. 표재성 혈관망의 혈관이 침투하여 심부 혈관 총을 형성하기 시작하기 직전인 P7에 사이클릭 IDS 펩타이드를 주사했을 때, P11에 나타나는 혈관구조는 수많은 혈관 분지가 정상적인 심부 혈관 총을 통해 무혈관 광수용체 층으로 이동된 것으로 나타났다. 이러한 효과는 앞서 R-카데린 항체가 주사되었을 때 관찰된 효과와 유사한 것이었다. 이에 반해, 사이클릭 INP 펩타이드가 주사된 눈의 심부 혈관 총은 도 9의 (B)와 (D)에서 확인되는 바와 같이 정상적으로 형성되었다.

R- 카데린은 Lin ^- HSC 에 의해 발현된다.

조혈줄기세포(HSC)의 R-카데린 발현은, 기능적 표적 세포의 세포 표면에서 R-카데린 세포 부착 분자의 발현 여부를 측정하기 위해 분석했다. 유동 세포측정법 분석을 사용한 결과, Lin^- 아집단의 HSC는 거의 80%가 세포 표면에서 R-카데린을 발현하는 반면, Lin⁺ 세포는 30%만이 R-카데린을 발현하는 것을 확인했다(도 10). 두 세포 집단 사이의 상대적 형광 강도를 기준으로 보면, Lin^- 세포는 소량의 일부 R-카데린 양성 Lin⁺ 세포보다 더 높은 농도의 R-카데린을 그 세포 표면에서 발현하는 것으로 보인다. 따라서, 망막 혈관구조를 기능적으로 표적화하는 아집단에 속하는 세포의 대부분은 R-카데린을 발현하는 반면, 비표적성인 아집단 유래의 세포는 대부분이 R-카데린을 발현하지 않는다. 흥미로운 사실은, CD31, CD34 및 Mac1 음성이고 표적화 기능이 전혀 없는 다른 아집단의 HSC가 훨씬 적은 R-카데린 발현 세포를 함유한다는 점이다.

R-카데린 차단 항체 및 펩타이드는 HSC 표적성을 파괴한다.

HSC를 특정 망막 혈관층으로 유도하는 표적성에 R-카데린 세포-세포 부착이 기능하는 정도를 조사하기 위하여, Lin^- HSC를 주사하기 전에 R-카데린 특이적 차단 항체로 차단시켰다. 주사 6일 후, 정상적인 Lin^- HSC만이 다음과 같은 세 혈관층에 국재적으로 관찰되었다: 1) 신경절 세포층에 위치한 표재성 혈관 총, 2) 외망상층 인접 위치한 심부 혈관 총, 및 3) 내핵층의 전방 경계에 위치한 중간층. 도 11의 (A)는 정상적인 Lin^-HSC(좌), 부착 차단성 R-카데린 항체와 함께 항온처리된 Lin^-HSC(중간) 및 면역전 염소 IgG와 항온처리된 Lin^-HSC(우)의 주사 후 나타나는 망막의 단면을 도시한 것이다.

Lin^-HSC를 주사하기 전 항-R-카데린 항체와 예비항온처리한 경우, 이 세포들의 대부분은 정확한 표적성을 상실한 반면, 면역전 IgG와 예비항온처리한 세포는 비차단성 HSC와 유사하게 기능했다. 심부 및 중간 혈관층에 대한 표적성은 R-카데린 차단된 HSC가 이들 부위에서 비교적 거의 관찰되지 않는 것을 볼 때 R-카데린 부착의 차단에 의해 특히 영향을 많이 받는 것으로 보인다. 또한, 표재성 혈관 총으로 국재화되는 세포도 역시 정상적인 Lin^-HSC 또는 면역전 IgG와 예비항온처리된 Lin^-HSC와 동일한 정도로 조직화되지 못하고 내인성 혈관구조와 함께 국재화되지 않는 것으로 관찰되었다.

R-카데린 항체와 예비항온처리된 Lin^-HSC은 대부분 세 혈관층 모두를 지나서 망막을 통해 이동하여 RPE 층에 인접한 광수용체의 외경계면에 부착되었다. R-카데린 차단된 HSC의 거의 절반은 광수용체층의 외경계면에서 관찰되었다(도 11의 (B)). 이에 반해, 면역전 IgG와 예비항온처리된 HSC를 주사한 대조군 망막은 이 HSC의 15%만이 이 영역으로 잘못 표적화되었다. 대조군 망막 유래의 잘못 표적화된 세포의 대부분은 주사 부위 부근에서 관찰되었는데, 이는 주사 바늘을 뺄 때 세포가 망막밑으로 방출되었기 때문인 것으로 보인다. 주사 부위를 계산에서 빼면, 잘못 표적화된 면역전 IgG와 항온처리된 HSC의 수는 10%로 감소되었다. 이러한 "초심부" 층에서는 정상적으로 Lin^-HSC이 거의 관찰되지 않으므로, 상기 소량의 잘못 표적화된 대조군 IgG 와 항온처리된 HSC의 백분율은 면역전 IgG가 Lin^- 세포의 약 10%에 결합할 수 있다는 사실 때문인 것으로 보인다(도 10). 이와 같이 결합된 IgG 분자는 단순히 입자 장애로 인해 정상적인 부착을 비특이적으로 방해할 수 있다. 하지만, 특이적인 R-카데린 차단으로 인한 잘못 표적화된 세포의 수와 비특이적 IgG 차단으로 인한 잘못 표적화된 세포의 수는 유의적인 차이가 있다.

도 12의 (A)는 세 혈관 총 및 광수용체 층의 외경계면의 z면을 통해 관찰한 공초점 현미경 영상을 나타낸 것이다. 정확한 혈관 총 안에 내인성 혈관을 따라 나타나는 정상적인 표적화(적색)는 면역전 염소 IgG로 차단된 Lin^-HSC(녹색)에 의해 관찰되었다. R-카데린 부착의 차단은 다수의 Lin^-HSC가 광수용체 층의 외경계면에 위치하도록 유도했고, 정상적인 혈관 총으로 표적화된 세포는 함께 응집하는 경향을 보이며 내인성(적색) 혈관을 따라 국재화되지 않았다. 도 12의 (B)는 망막에 존재하는 HSC 총 집단에 대한 잘못 표적화된 세포의 백분율이 R-카데린 차단된 Lin^-HSC 집단에서 유의적으로 높음을 입증하는 막대 그래프이다(P값 < 0.01).

이상의 상세한 설명은 예시적인 것이지, 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지와 영역에 속하는 다른 변형예를 쉽게 구현할 수 있을 것이다.

<110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE <120> Selective R-cadherin antagonists and methods <130> TSRI-987.1-Div <150> US 60/467,188 <151> 2003-05-01 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 916 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 1 Met Thr Ala Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Gly 1 5 10 15 Ala Leu Arg Ala His Asn Glu Asp Leu Thr Thr Arg Glu Thr Cys Lys 20 25 30 Ala Gly Phe Ser Glu Asp Asp Tyr Thr Ala Leu Ile Ser Gln Asn Ile 35 40 45 Leu Glu Gly Glu Lys Leu Leu Gln Val Lys Phe Ser Ser Cys Val Gly 50 55 60 Thr Lys Gly Thr Gln Tyr Glu Thr Asn Ser Met Asp Phe Lys Val Gly 65 70 75 80 Ala Asp Gly Thr Val Phe Ala Thr Arg Glu Leu Gln Val Pro Ser Glu 85 90 95 Gln Val Ala Phe Thr Val Thr Ala Trp Asp Ser Gln Thr Ala Glu Lys 100 105 110 Trp Asp Ala Val Val Arg Leu Leu Val Ala Gln Thr Ser Ser Pro His 115 120 125 Ser Gly His Lys Pro Gln Lys Gly Lys Lys Val Val Ala Leu Asp Pro 130 135 140 Ser Pro Pro Pro Lys Asp Thr Leu Leu Pro Trp Pro Gln His Gln Asn 145 150 155 160 Ala Asn Gly Leu 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Gly Gly 145 150 155 160 Leu Arg Arg Gln Lys Arg Asp Trp Val Ile Pro Pro Ile Asn Val Pro 165 170 175 Glu Asn Ser Arg Gly Pro Phe Pro Gln Gln Leu Val Arg Ile Arg Ser 180 185 190 Asp Lys Asp Asn Asp Ile Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Thr Gly Val Gly 195 200 205 Ala Asp Gln Pro Pro Met Glu Val Phe Asn Ile Asp Ser Met Ser Gly 210 215 220 Arg Met Tyr Val Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu Arg Ala Ser Tyr 225 230 235 240 His Leu Arg Ala His Ala Val Asp Met Asn Gly Asn Lys Val Glu Asn 245 250 255 Pro Ile Asp Leu Tyr Ile Tyr Val Ile Asp Met Asn Asp Asn Arg Pro 260 265 270 Glu Phe Ile Asn Gln Val Tyr Asn Gly Ser Val Asp Glu Gly Ser Lys 275 280 285 Pro Gly Thr Tyr Val Met Thr Val Thr Ala Asn Asp Ala Asp Asp Ser 290 295 300 Thr Thr Ala Asn Gly Met Val Arg Tyr Arg Ile Val Thr Gln Thr Pro 305 310 315 320 Gln Ser Pro Ser Gln Asn Met Phe Thr Ile Asn Ser Glu Thr Gly Asp 325 330 335 Ile Val Thr Val Ala Ala Gly Leu Asp Arg Glu Lys Val Gln Gln Tyr 340 345 350 Thr Val Ile Val Gln Ala Thr Asp Met Glu Gly Asn Leu Asn Tyr Gly 355 360 365 Leu Ser Asn Thr Ala Thr Ala Ile Ile Thr Val Thr Asp Val Asn Asp 370 375 380 Asn Pro Pro Glu Phe Thr Thr Ser Thr Phe Ala Gly Glu Val Pro Glu 385 390 395 400 Asn Arg Ile Glu Thr Val Val Ala Asn Leu Thr Val Met Asp Arg Asp 405 410 415 Gln Pro His Ser Pro Asn Trp Asn Ala Val Tyr Arg Ile Ile Ser Gly 420 425 430 Asp Pro Ser Gly His Phe Ser Val Arg Thr Asp Pro Val Thr Asn Glu 435 440 445 Gly Met Val Thr Val Val Lys Ala Val Asp Tyr Glu Leu Asn Arg Ala 450 455 460 Phe Met Leu Thr Val Met Val Ser Asn Gln Ala Pro Leu Ala Ser Gly 465 470 475 480 Ile Gln Met Ser Phe Gln Ser Thr Ala Gly Val Thr Ile Ser Val Thr 485 490 495 Asp Val Asn Glu Ala Pro Tyr Phe Pro Ser Asn His Lys Leu Ile Arg 500 505 510 Leu Glu Glu Gly Val Pro Ala Gly Thr Ala Leu Thr Thr Phe Ser Ala 515 520 525 Val Asp Pro Asp Arg Phe Met Gln Gln Ala Val Arg Tyr Ser Lys Leu 530 535 540 Ser Asp Pro Ala Asn Trp Leu His Ile Asn Thr Ser Asn Gly Gln Ile 545 550 555 560 Thr Thr Ala Ala Ile Leu Asp Arg Glu Ser Leu Tyr Thr Lys Asn Asn 565 570 575 Val Tyr Glu Ala Thr Phe Leu Ala Ala Asp Asn Gly Ile Pro Pro Ala 580 585 590 Ser Gly Thr Gly Thr Leu Gln Ile Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Asp Asn 595 600 605 Ala Pro Gln Leu Leu Pro Lys Glu Ala Gln Ile Cys Glu Arg Pro Gly 610 615 620 Leu Asn Ala Ile Asn Ile Thr Ala Ala Asp Ala Asp Met Asp Pro Asn 625 630 635 640 Ile Gly Pro Tyr Val Phe Glu Leu Pro Phe Ile Pro Thr Thr Val Arg 645 650 655 Lys Asn Trp Thr Ile Thr Arg Leu Asn Gly Asp Tyr Ala Gln Leu Ser 660 665 670 Leu Arg Ile Leu Tyr Leu Glu Ala Gly Val Tyr Asp Val Pro Ile Ile 675 680 685 Val Thr Asp Ser Gly Asn Pro Pro Leu Ser Asn Thr Ser Val Ile Lys 690 695 700 Val Lys Val Cys Pro Cys Asp Glu Asn Gly Asp Cys Thr Thr Val Gly 705 710 715 720 Ala Val Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Gly Ala Ile Val Ala Ile Leu 725 730 735 Ile Cys Ile Val Ile Leu Leu Ile Met Val Leu Leu Phe Val Val Trp 740 745 750 Met Lys Arg Arg Glu Lys Glu Arg His Thr Lys Gln Leu Leu Ile Asp 755 760 765 Pro Glu Asp Asp Val Arg Asp Asn Ile Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Gly 770 775 780 Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Gln Gln Pro 785 790 795 800 Glu Ala Met Glu His Val Leu Ser Lys Thr Pro Gly Val Arg Arg Val 805 810 815 Asp Glu Arg Pro Val Gly Ala Glu Pro Gln Tyr Pro Val Arg Pro Val 820 825 830 Val Pro His Pro Gly Asp Ile Gly Asp Phe Ile Asn Glu Gly Leu Arg 835 840 845 Ala Ala Asp Asn Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Leu Val 850 855 860 Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Thr Ala Gly Ser Val Ser Ser Leu 865 870 875 880 Asn Ser Ser Ser Ser Gly Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Asp Trp 885 890 895 Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Gly Glu Glu 900 905 910 Asp <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CADHERIN ANTAGONIST <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Asp, Asn, Glu or Gln <400> 6 Ile Xaa Ser Met Gly Arg 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CADHERIN ANTAGONIST <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = Asp, Asn, Glu or Gln <400> 7 Cys Ile Xaa Ser Cys 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CYCLIC CADHERIN ANTAGONIST, DISULFIDE BOND BETWEEN Cys1 and Cys5 <400> 8 Cys Ile Asp Ser Cys 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CYCLIC CADHERIN ANTAGONIST, DISULFIDE BOND BETWEEN Cys1 and Cys5 <400> 9 Cys Ile Asn Pro Cys 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CADHERIN ANTAGONIST <400> 10 Ile Asp Ser Ala Ser Gly Arg 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CADHERIN ANTAGONIST <400> 11 Ile Asn Pro Ala Ser Gly Gln 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CYCLIC CADHERIN ANTAGONIST, DISULFIDE BOND BETWEEN Cys1 and Cys5 <400> 12 Cys Ser Asp Ile Cys 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CYCLIC CADHERIN ANTAGONIST, DISULFIDE BOND BETWEEN Cys1 and Cys5 <400> 13 Cys Arg Ala Asp Cys 1 5 <210> 14 <211> 69 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 14 Ile Arg Ser Asp Arg Asp Lys Asn Leu Ser Leu Arg Tyr Ser Val Thr 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Asp Gln Pro Pro Thr Gly Ile Phe Ile Ile Asn Pro 20 25 30 Ile Ser Gly Gln Leu Ser Val Thr Lys Pro Leu Asp Arg Glu Leu Ile 35 40 45 Ala Arg Phe His Leu Arg Ala His Ala Val Asp Ile Asn Gly Asn Gln 50 55 60 Val Glu Asn Pro Ile 65 <210> 15 <211> 69 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 15 Ile Arg Ser Asp Lys Asp Asn Asp Ile Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Thr 1 5 10 15 Gly Val Gly Ala Asp Gln Pro Pro Met Glu Val Phe Asn Ile Asp Ser 20 25 30 Met Ser Gly Arg Met Tyr Val Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu Arg 35 40 45 Ala Ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala Val Asp Met Asn Gly Asn Lys 50 55 60 Val Glu Asn Pro Ile 65 <210> 16 <211> 69 <212> PRT <213> RATUS NORWEGICUS <400> 16 Ile Arg Ser Asp Lys Asp Asn Asp Ile Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Thr 1 5 10 15 Gly Val Gly Ala Asp Gln Pro Pro Met Glu Val Phe Asn Ile Asp Ser 20 25 30 Met Ser Gly Arg Met Tyr Val Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu Arg 35 40 45 Ala Ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala Val Asp Met Asn Gly Asn Lys 50 55 60 Val Glu Asn Pro Ile 65 <210> 17 <211> 69 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 17 Ile Arg Ser Asp Lys Asp Asn Asp Ile Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Thr 1 5 10 15 Gly Val Gly Ala Asp Gln Pro Pro Met Glu Val Phe Ser Ile Asp Ser 20 25 30 Met Ser Gly Arg Met Tyr Val Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu His 35 40 45 Ala Ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala Val Asp Met Asn Gly Asn Lys 50 55 60 Val Glu Asn Pro Ile 65 <210> 18 <211> 69 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 18 Ile Arg Ser Asp Lys Asp Asn Asp Ile Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Thr 1 5 10 15 Gly Val Gly Ala Asp Gln Pro Pro Met Glu Val Phe Ser Ile Asn Ser 20 25 30 Met Ser Gly Arg Met Tyr Val Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu His 35 40 45 Ala Ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala Val Asp Met Asn Gly Asn Lys 50 55 60 Val Glu Asn Pro Ile 65 <210> 19 <211> 69 <212> PRT <213> GALLUS GALLUS <400> 19 Ile Arg Ser Asp Lys Asp Lys Glu Ile His Ile Arg Tyr Ser Ile Thr 1 5 10 15 Gly Val Gly Ala Asp Gln Pro Pro Met Glu Val Phe Ser Ile Asp Pro 20 25 30 Val Ser Gly Arg Met Tyr Val Thr Arg Pro Met Asp Arg Glu Glu Arg 35 40 45 Ala Ser Tyr His Leu Arg Ala His Ala Val Asp Met Asn Gly Asn Lys 50 55 60 Val Glu Asn Pro Ile 65 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CYCLIC CADHERIN ANTAGONIST, DISULFIDE BOND BETWEEN Cys1 and Cys5 <400> 20 Cys His Ala Val Cys 1 5

Claims

하기 화학식으로 표시되는, 분리된 사이클릭 펩타이드.

상기 화학식에서,
X¹ 및 X²는 독립적으로 하나의 아미노산 잔기이거나 또는 펩타이드 결합에 의해 연결된 10개 이하의 다수의 아미노산 잔기이고;
Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이고;
Y¹ 및 Y²는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 시스테인 잔기이다.
제1항에 있어서, Xaa가 Asp인, 분리된 사이클릭 펩타이드.
제1항에 있어서, Xaa가 Asn인, 분리된 사이클릭 펩타이드.
아미노산 서열 Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys(서열번호 7)(여기서, Xaa는 Asp, Asn, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 잔기이다)로 이루어지고 2개의 Cys 잔기 사이에 이황화 결합을 포함하는, 분리된 사이클릭 펩타이드.
제4항에 있어서, Xaa가 Asp인, 분리된 사이클릭 펩타이드.
제4항에 있어서, Xaa가 Asn인, 분리된 사이클릭 펩타이드.
제1항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 망막 혈관형성 억제용 약제학적 조성물.
제2항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 망막 혈관형성 억제용 약제학적 조성물.
제3항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 망막 혈관형성 억제용 약제학적 조성물.
제4항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 망막 혈관형성 억제용 약제학적 조성물.
제5항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 망막 혈관형성 억제용 약제학적 조성물.
제6항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 망막 혈관형성 억제용 약제학적 조성물.
제1항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
제2항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
제3항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
제4항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
제5항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
제6항의 분리된 사이클릭 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, R-카데린 매개된 세포 부착을 억제하기 위한 약제학적 조성물.