CN103272219A - 选择性r-钙黏着蛋白拮抗剂和方法 - Google Patents

选择性r-钙黏着蛋白拮抗剂和方法 Download PDF

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Abstract

一种用作哺乳动物R-钙黏着蛋白选择性拮抗剂的分离肽包含3-30个氨基酸残基，该肽的3个连续残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。Xaa优选是Asp或Asn。在一个优选实施方案中，该肽是具有3-10个环形排列的氨基酸残基的环形肽。本发明的选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽用于抑制干细胞例如内皮前体细胞靶向发育中的脉管系统，用于抑制R-钙黏着蛋白介导的细胞粘附并用于抑制视网膜血管形成。

Description

选择性R-钙黏着蛋白拮抗剂和方法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2004年4月30日，申请号为200480018405.2(PCT/US2004/013212)，发明名称为“选择性R-钙黏着蛋白拮抗剂和方法”。
相关申请的相互参照
本申请要求2003年5月1日提交的专利序号60/467,188的美国临时申请的权益，其通过引用结合在本文中。
政府利益声明
本发明受美国政府支持，在国立卫生研究院拨款号EY11254和EY12598下进行。美国政府在本发明中享有某些权利。
发明领域
本发明总的来说涉及哺乳动物细胞粘附分子拮抗剂。更具体地说，本发明涉及哺乳动物R-钙黏着蛋白(钙黏着蛋白-4)的选择性肽拮抗剂和抑制细胞粘附及随其产生的视网膜血管形成的方法。
发明背景
钙黏着蛋白家族的分子由跨膜糖蛋白组成，在依赖钙的选择性细胞-细胞间相互作用中发挥功能。通过介导细胞识别和细胞分选，钙黏着蛋白在胚胎发育和组织形态形成过程中发挥重要作用。钙黏着蛋白亚家族(经典钙黏着蛋白、原钙黏着蛋白、桥粒胶蛋白和其它钙黏着蛋白相关蛋白)其特征为可变数量的胞外钙黏着蛋白结构域、单个跨膜片断和单个细胞质结构域。据报道，所谓经典钙黏着蛋白(例如E、P、N和R-钙黏着蛋白)具有5个参与嗜同性相互作用的串联重复胞外钙黏着蛋白结构域(EC1-EC5)，以及高度保守的介导粘附特异性胞内信号的胞质尾区。
当多个表达在相邻细胞上的钙黏着蛋白分子相互作用时，发生钙黏着蛋白介导的细胞-细胞粘附，导致粘附连接的形成。根据Shapiro等提出的钙黏着蛋白拉链模型(Nature，1995，374(6520)：327-37)，同一细胞膜内的钙黏着蛋白分子形成紧密的平行链状二聚物(即所谓顺式二聚物)。如图1所示，然后这些顺式二聚物与表达在相邻细胞上的钙黏着蛋白二聚物结合(即反式二聚作用)。一旦维持了足够的相互反应，更多钙黏着蛋白分子被募集到该部位，出现钙黏着蛋白聚集，导致两细胞表面的分子交错结合。这样，相对较弱的相互作用可结合形成相当强的细胞-细胞粘附。
在最初的钙黏着蛋白粘附中，由胞质钙黏着蛋白尾区与α和β联蛋白分子的相互作用传输胞内信号，导致细胞骨架重组。虽然认为与肌动蛋白纤维的结合不会影响嗜同性结合，它们的结合有助于钙黏着蛋白分子保持在相互作用的位置。在共生型关系中，钙黏着蛋白的聚集引起细胞骨架重组并提供膜连接点，这对于发生在粘附连接形成时的细胞变化很重要。与此同时，与细胞骨架的结合保持钙黏着蛋白在相互作用的位置上，并帮助募集新的钙黏着蛋白分子，因此介导了钙黏着蛋白的聚集。钙作为辅助因子在钙黏着蛋白的聚集中发挥重要作用。在钙离子浓度不足(即低于约2mM)的溶液中，钙黏着蛋白功能丧失，并且分子对蛋白酶降解更加敏感。这是由于需要钙来稳定钙黏着蛋白分子的结构并且为相邻的钙黏着蛋白接触面提供合适的定位。
尽管有报道说经典钙黏着蛋白5个胞外域(EC1到EC5)中的每一个都在介导钙黏着蛋白二聚化过程中发挥重要作用，突变分析提示，形成二聚化接触面的残基中大多数发现于最N-末端的钙黏着蛋白域(EC1)内(Kitagawa，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2000；271(2)：358-63)。然而，有关钙黏着蛋白分子间特异性同源二聚的机制了解相对较少。
钙黏着蛋白在神经元引导和中枢神经系统发育中发挥重要作用。据报道，钙黏着蛋白类型的差异化表达定义了大脑的不同细分部分。通过在发育中的视网膜的不同区域内特异性表达，钙黏着蛋白也在神经视网膜发育中发挥重要作用。例如，在胚胎鸡的视网膜发育中，有报道指出B-钙黏着蛋白仅仅发现于Muller神经胶质中，而某些双极细胞群表达R-钙黏着蛋白(也称为钙黏着蛋白-4)。无长突细胞和神经节细胞的亚群表达钙黏着蛋白6B和7。在视网膜内网层中，这些相同的钙黏着蛋白仅仅表达在与突触蛋白-I阳性神经末梢结合的亚层(sublaminae)内，提示在视网膜发育中不同的表达特征有助于在特定神经元亚群之间形成突触。在胚胎视神经中，表达R-钙黏着蛋白的神经胶质细胞与N-钙黏着蛋白的粘附介导神经节细胞轴突的突起。
钙黏着蛋白粘附在发育的视网膜血管形成中也发挥重要作用(Dorrell，et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2002；43(11)：3500-10)。在表层血管丛形成过程中阻断R-钙黏着蛋白粘附导致丧失在正常血管模式中能观察到的复杂血管间互连。当在随后的深层血管层形成过程中R-钙黏着蛋白粘附被阻断时，关键指导信号丢失，导致血管迁移过正常的深层脉管丛并进入光感受器层。
视网膜由明确的神经元、神经胶质和脉管部分层组成。某些疾病或病症，即使是轻微地改变视网膜层，可导致神经元退化和显著的视力丧失。作为许多导致感光细胞死亡的疾病的模型，对视网膜退化小鼠(rd/rd小鼠)的研究已超过70年。在rd/rd小鼠中，由于杆细胞经历凋亡，在出生后最初三个星期内开始光感受器退化，这是因为cGMP依赖性磷酸二酯酶的β亚基中发生突变后锥细胞光感受器死亡。rd/rd小鼠中感光细胞的死亡也暂时性伴有视网膜内血管萎缩。最初三周内3个功能层发育时脉管系统似乎以正常特征方式形成。然而，出生后第二周时深层血管层中的血管开始退化，到第四周结束时观察到显著血管退化，深层和中间血管丛几乎完全消失。
造血干细胞群位于正常成年人的循环系统和骨髓中，其中不同的细胞亚群可沿阳性谱系(Lin+HSC)或阴性谱系(Lin-HSC)分化。此外，本发明人发现，Lin-HSC亚群中存在能在体内或体外形成血管的内皮前体细胞(EPC)。当EPC玻璃体内注射到小鼠眼内时，Lin-HSC群中的EPC可靶向并稳定rd/rd小鼠中退化中的脉管系统。当出生后第2天注射时，玻璃体内注射的Lin-HSC靶向表层血管层中的星形胶质细胞，并且在内源发育的血管网络形成前被发现。当内源脉管系统到达视网膜外周、即Lin-HSC靶向的部位时，该细胞结合到新的血管中，注射的Lin-HSC和内源上皮细胞的混合群形成有功能的镶嵌血管。此外，在内源上皮细胞在这些层出现血管形成之前，Lin-HSC靶向视网膜深层和中间血管层区域。与Lin-HSC的结合拯救了rd/rd小鼠的深层脉管系统，使之超出正常的和对照Lin+HSC注射小鼠约2-3倍。此外，深层脉管系统的拯救阻止了视网膜外核层中光感受器的退化。然而，因为没有证据表明这些干细胞可分化为视网膜神经元或神经胶质细胞，神经元保护的机制依然未知。
在自然产生血管形成之前Lin-HSC靶向星形细胞和深层血管区，提示Lin-HSC表达在靶向中发挥功能的细胞表面分子，与发育中内源上皮细胞的靶向相似。在发育视网膜血管形成中，R-钙黏着蛋白在内皮细胞靶向星形细胞和脉管丛中发挥重要作用。
在许多哺乳动物中鉴定并测序了R-钙黏着蛋白。图2描述了R-钙黏着蛋白前蛋白原人变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，该序列由Kitagawa等作为检索号NP001785，版本NP001785.2，GI：14589893在SWISS-PROT数据库中报道，其有关公开通过引用结合在本文中。SEQ ID NO：1包含222-228位的氨基酸序列IDSMSGR(SEQ ID NO：2)。
图3描述了R-钙黏着蛋白前蛋白原的另一个人变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，该序列由Tanihara等作为检索号P55283，版本P55283，GI：1705542在SWISS-PROT数据库中报道，其有关公开通过引用结合在本文中。SEQ ID NO：3包含222-228位的氨基酸序列INSMSGR(SEQ ID NO：4)。
图4描述了R-钙黏着蛋白前蛋白原的鼠(小家鼠)变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)，该序列由Hutton等作为检索号NP033997，版本NP033997.1，GI：6753376在SWISS-PROT数据库中报道，其有关公开通过引用结合在本文中。SEQ ID NO：5包含219-225位的氨基酸序列IDSMSGR(SEQ ID NO：2)。
包含氨基酸序列His-Ala-Val(HAV)的钙黏着蛋白非选择性肽拮抗剂由Blaschuk等在美国专利6,465,427、6,3456,512、6,169,071和6,031,072中报道。Blaschuk等已报道了钙黏着蛋白的环形和线形肽拮抗剂，它们都能无区别地对抗多种类型的钙黏着蛋白分子。
包含氨基酸序列Ile-Asn-Pro(INP)的N-钙黏着蛋白选择性肽拮抗剂由Williams等，Mol.Cell Neurosci.，2000；15(5)：456-64报道。HAV肽是非特异性钙黏着蛋白拮抗剂，而Williams等报道的INP肽拮抗剂对N-钙黏着蛋白有特异性，不与其他钙黏着蛋白分子例如R-钙黏着蛋白表现出明显的结合。
因为身体不同组织中细胞粘附分子的差异化分布，所以不断需要对特定细胞粘附分子有高度选择性的拮抗剂，特别是对R-钙黏着蛋白有选择性的拮抗剂。本发明的选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽满足了这一需要。
发明概述
用作哺乳动物R-钙黏着蛋白选择性拮抗剂的分离肽包含3-30个氨基酸残基，该肽的3个连续残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser(IXS)；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。优选Xaa是Asp或Asn。在一个优选实施方案中，本发明肽包含至少7个氨基酸残基，该肽的7个连续连续氨基酸残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)，其中Xaa定义如上述。本发明也提供包含R-钙黏着蛋白拮抗肽的药物组合物，该肽在药物可接受载体中。
在另一个优选实施方案中，本发明肽是环形肽，具有环形排列的3-10个氨基酸残基，该肽的3个连续残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。Xaa优选是Asp或Asn。
优选的环形肽具有下式：
Figure BDA00003170809700061
其中X1和X2独立是氨基酸残基，或是由肽键连接而成的多个(最多10个)氨基酸残基；Y1和Y2独立是彼此之间通过二硫键连接的氨基酸残基；Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。
尤其优选的环形肽具有环形氨基酸序列Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys(SEQ ID NO：7)；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基，通过两个半胱氨酸残基间的二硫键连接形成肽环。
抑制R-钙黏着蛋白介导细胞粘附的方法包括使R-钙黏着蛋白表达细胞与粘附抑制量的本发明选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽接触。例如，通过给予患异常视网膜血管形成的患者血管形成抑制量的本发明R-钙黏着蛋白拮抗肽，抑制视网膜血管形成。类似地，通过使干细胞与脉管系统靶向抑制量的本发明R-钙黏着蛋白拮抗肽接触，抑制阴性谱系造血干细胞靶向发育中的脉管系统。抑制Lin-HSC(例如内皮前体细胞)靶向发育中的脉管系统，用于治疗与异常血管发育有关的疾病，例如年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病。
附图简述
在附图中，图1图示了钙黏着蛋白的聚集和钙黏着蛋白调节的细胞粘附；
图2描述了R-钙黏着蛋白前蛋白原的人变体的氨基酸序列(SEQID NO：1)，其包括残基222-228处的序列IDSMSGR(SEQ ID NO：2)；
图3描述了R-钙黏着蛋白前蛋白原的人变体的氨基酸序列(SEQID NO：3)，其包括残基222-228处的序列INSMSGR(SEQ ID NO：4)；
图4描述了R-钙黏着蛋白前蛋白原的鼠变体的氨基酸序列(SEQID NO：5)，其包括残基229-225处的序列IDSMSGR(SEQ ID NO：2)；
图5(A)显示了鼠N-钙黏着蛋白和各种R-钙黏着蛋白在残基24-92内的序列同源性(保守残基(蓝色)和非保守残基(红色))；注意来自人类、小鼠、大鼠的哺乳动物R-钙黏着蛋白间的同源性，它们都在残基53-55处包含序列IDS或INS，与之相反，鸡R-钙黏着蛋白和小鼠N-钙黏着蛋白在残基53-55处分别有序列IDP和INP；(B)合成对应于鼠和人R-钙黏着蛋白和鼠N-钙黏着蛋白该区域中残基的环形和线形肽，以及相应的对照肽：环形CIDSC(SEQ ID NO：8)、环形CINPC(SEQ ID NO：9)、IDSMSGR(SEQ ID NO：2)、IDSASGR(SEQ ID NO：10)、INPASGQ(SEQ ID NO：11)、环形CSDIC(SEQ ID NO：12)和环形CRADC(SEQ ID NO：13)；从上至下在图5(A)中列举的部分钙黏着蛋白序列是：鼠N-钙黏着蛋白(SEQ ID NO：14)、鼠R-钙黏着蛋白(SEQID NO：15)、大鼠R-钙黏着蛋白(SEQ ID NO：16)、人R-钙黏着蛋白(SEQ ID NO：17)、另一种人R-钙黏着蛋白(SEQ ID NO：18)和鸡(原鸡)R-钙黏着蛋白(SEQ ID NO：19)；
图6(A)描述了表达R-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白的L-细胞聚集的显微照片；(B)是存在钙离子和不存在钙离子时R-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白介导的L-细胞聚集的百分比条形图；
图7显示了R-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白对L-细胞的稳定转染。(A)R-钙黏着蛋白免疫印迹；(B)N-钙黏着蛋白免疫印迹；(C-E)染色L-细胞的显微照片证实了R-钙黏着蛋白的表达(C)和N-钙黏着蛋白的表达(D)，与之相比的是既不表达R-钙黏着蛋白也不表达N-钙黏着蛋白的细胞(E)；
图8图示了与表达R-钙黏着蛋白的细胞结合的含IDS肽对表达钙黏着蛋白的L-细胞聚集的选择性抑制；与其相比的是与表达N-钙黏着蛋白的细胞结合的含INP肽；
图9显示了与环形CINPC(SEQ ID NO：9)相比，玻璃体内注射环形CIDSC(SEQ ID NO：8)后小鼠视网膜血管形成的选择性抑制；(A)显示了在发育P2阶段的rd/rd小鼠视网膜的显微照片；(B)显示了在发育P7阶段的rd/rd小鼠视网膜的显微照片；(C)是表层血管形成的条形图；(D)是深层血管形成的条形图；
图10显示了造血干细胞(HSC)中R-钙黏着蛋白表达的流式细胞分析结果；
图11显示了用本发明各种肽和对照肽治疗的rd/rd小鼠视网膜的横截面显微照片；
图12显示了通过本发明R-钙黏着蛋白拮抗肽阻断Lin-HSC靶向发育中的视网膜脉管系统。
优选实施方案详述
本文及所附权利要求书中使用的术语“环形肽”是指包含多个氨基酸的分子，所述氨基酸在链中通过肽键相连，链末端彼此相连形成氨基酸残基环。环形肽可通过肽键、两个氨基酸残基如半胱氨酸残基之间的二硫键或其它合适的连接基团连接。非肽连接基团可以是任何可与肽链每个末端的功能基团反应而在其间形成连接的化学部分。例如，肽链两端可以通过非蛋白氨基酸例如3-氨基丁酸连接，或通过非肽巯基基团形成的二硫化物连接，例如氨基端巯基乙酰胺和羧基端形成自2-氨基乙硫醇的酰胺。
本文及所附权利要求书中使用的术语“药物可接受的”及其语法变化，指载体和其他赋形剂时意思是能给予患者该材料而不产生不良的生理副作用，例如视网膜或眼刺激、恶心、头晕、模糊或视觉损伤、细胞毒性等。
本文及所附权利要求书中使用的术语“氨基酸”通常是指任何α-氨基酸。虽然也可包含修饰的氨基酸残基，本发明的肽优选包含21种遗传密码编码的氨基酸。氨基酸可以是L、D或D，L型。本发明的肽优选包含L-型氨基酸。为最小化体内蛋白水解酶降解的可能性，给予的本发明肽可以包含一个或多个D-型氨基酸残基。
作为哺乳动物R-钙黏着蛋白选择性拮抗剂的分离肽包含3-30个氨基酸残基，该肽的3个连续残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser。Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。Xaa优选是Asp或Asn。本发明的R-钙黏着蛋白拮抗肽可以是线形或环形。
本发明的选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽模拟了在哺乳动物R-钙黏着蛋白EC1区域中发现而未在其他钙黏着蛋白分子中发现的Ile-Asp-Ser和Ile-Asn-Ser序列。包含Ile-Xaa-Ser序列的肽可结合并拮抗哺乳动物R-钙黏着蛋白分子。Xaa优选是天冬氨酸残基(Asp)或天冬酰胺残基(Asn)，以匹配哺乳动物R-钙黏着蛋白分子中天然出现的序列。谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)残基也适合用作Xaa，因为它们分别与Asp和Asn的化学相似性。
在一个优选实施方案中，本发明肽包含至少7个氨基酸残基，该肽的7个连续氨基酸残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)。Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。Xaa优选是Asp或Asn。
在另一个优选实施方案中，本发明肽是具有环形排列的3-10个氨基酸残基的环形肽，该肽的3个连续残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser；其中Xaa如上所述是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。Xaa优选是Asp或Asn。
具有5个环形排列的氨基酸的优选环形肽具有式：
Figure BDA00003170809700091
其中X1和X2独立是氨基酸残基或由肽键连接而成的多个(最多10个)氨基酸残基；Y1和Y2独立是彼此之间通过二硫键连接的氨基酸残基；Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。Y1和Y2优选都是由二硫键连接的半胱氨酸残基(即胱氨酸残基)。
尤其优选的环形肽具有环形氨基酸序列Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys(SEQ ID NO：7)；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基，环由两个半胱氨酸残基间的二硫键连接而成。Xaa优选是Asp或Asn。
抑制R-钙黏着蛋白介导细胞粘附的方法包括使R-钙黏着蛋白表达细胞与粘附抑制量的本发明R-钙黏着蛋白拮抗肽接触。通过给予患疾病或病症的哺乳动物细胞粘附抑制量的拮抗剂，细胞可体内接触肽拮抗剂，所述疾病或病症可通过抑制R-钙黏着蛋白介导的细胞粘附治疗(例如特征为异常血管增生的视网膜疾病)。例如，患年龄相关性黄斑退化或糖尿病性视网膜病的患者可用本发明的选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽进行有益治疗。因此，本发明拮抗剂优选作为包含拮抗剂和药物可接受载体的药物组合物给予。
为选择性靶向或拮抗R-钙黏着蛋白，本发明的肽和组合物可以以治疗有效量胃肠外、口服、吸入或局部给予，该肽与药物可接受载体、赋形剂和辅料共同形成单位剂量形式。本文使用的术语“胃肠外”包括静脉内、皮下、肌内、胸骨内、眼内(例如玻璃体内)和腹膜内给药，以及通过输液技术给药。
可使用任何合适的给药途径，并且以有效达到预期治疗的剂量给予本发明包含选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽的药物组合物。本领域技术人员使用医学领域熟知的临床前研究和临床研究容易确定治疗具体医学病症或抑制其发展所必需的治疗有效量。
本文使用的术语“治疗有效量”是指引起临床医生或研究者寻找到的组织、系统、动物或人生物学或药学反应的活性成分量。
本文使用的术语“抑制”是指医学病症或生化相互作用的延缓、中断和停止，但并不是必须表示病症的完全消除或相互作用的完全中断。患者生存能力的延长或症状严重性的持续降低本身和实质上表明医学病症得到有益控制(即被抑制)。
本发明R-钙黏着蛋白拮抗肽及含有其的组合物的给药方案基于几个因素，例如年龄、体重、性别、患者医学病症的类型、病症的严重性、给药途径和所用具体肽拮抗剂的拮抗活性。给药方案可依据上述因素而改变。例如，对于抑制视网膜血管形成，与每千克体重约0.01mg-1000mg类似的剂量水平是有用的。优选剂量水平在每千克体重约0.01mg-100mg的范围内。
对于注射给药，具体的本发明含肽组合物用药物可接受载体例如水、盐水或葡萄糖水溶液配制。对于注射，典型的日剂量是每千克体重约0.01mg-100mg，根据上述因素每天单剂量或多剂量注射。
包含本发明选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽和药物可接受载体的本发明药物组合物也可包含药物可接受的辅料。可包含在本发明药物组合物中的药物可接受辅料包括例如本领域已知的生理可耐受表面活性剂、溶剂、缓冲剂、防腐剂等。
为抑制视网膜血管形成，例如，给予患异常视网膜血管增生的患者治疗有效量的本发明R-钙黏着蛋白拮抗肽。所给予的肽选择性结合视网膜中的R-钙黏着蛋白，因此破坏和抑制了其中的血管形成。肽拮抗剂优选通过玻璃体内注射给药。
通过使干细胞接触脉管系统靶向抑制量的本发明选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽，抑制Lin-HSC靶向至发育中的脉管系统。抑制Lin-HSC例如内皮前体细胞靶向至发育中的脉管系统，用于治疗与异常血管发育有关的疾病，如年龄相关性黄斑退化和糖尿病性视网膜病。优选通过给予患血管增生性疾病或病症的哺乳动物如人类本发明的R-钙黏着蛋白拮抗肽，使R-钙黏着蛋白拮抗肽在体内与Lin-HSC结合。
提供下列非限制性实施例以进一步说明本发明的各个方面。本领域技术人员应认识到，可修改本文公开的实施例和所说明的实施方案而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1.肽的合成
使用固相合成法，由Scripps研究所蛋白及核酸核心设备合成本发明的肽和各种对照肽，并且纯化到可能的最高等级(纯度＞95％)，如HPLC的分析。通过质谱法分析肽的序列以确保正确肽的合成。所有的肽在氨基端被酰胺封闭，在羧基端乙酰化。用氨基端和羧基端的半胱氨酸残基制备环形肽，产生二硫化物束缚，形成含5个氨基酸残基的环。图5(B)显示了制备的肽：环形CIDSC(SEQ ID NO：9)、环形CINPC(SEQ ID NO：9)、IDSMSGR(SEQ ID NO：2)、IDSASGR(SEQ ID NO：10)、INPASGQ(SEQ ID NO：11)、环形CSDIC(SEQ IDNO：12)和环形CRADC(SEQ ID NO：13)。
实施例2.L-细胞转染
Masatoshi Takeichi博士(Kyoto University，Japan)惠赠了小鼠R-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白质粒。质粒亚克隆至pDsRed2N1载体(Clontech)，以编码在钙黏着蛋白分子C-端连有红色荧光蛋白(RFP)的融合蛋白。根据厂家的方案，使用磷酸钙转染系统(Life Technologies)用R-或N-钙黏着蛋白pDsRed2N1稳定转染L-细胞(小鼠成纤维L929细胞，ATCC#CRL-2148)。在补充了遗传霉素(700μg/mL G418遗传霉素，Gibco BRL)的培养基中培养筛选，选择阳性克隆。检测细胞的RFP表达，并通过免疫印迹法和免疫荧光染色法测试钙黏着蛋白的表达。图6显示了表达R-和N-钙黏着蛋白的L-细胞的聚集。图6(A)显示了含钙培养基中表达R-钙黏着蛋白(左)和N-钙黏着蛋白(中)的L-细胞聚集的显微照片，并且与没有聚集的未转染L-细胞进行了比较。图6(B)是条形图，阐明了图6(A)中所示细胞聚集的百分比。在含有约5mM氯化钙(标注TC)的缓冲液中，N-钙黏着蛋白和R-钙黏着蛋白转染的细胞受胰蛋白酶作用形成巨大的细胞簇，然而内源L-细胞在含钙缓冲液中几乎不出现聚集。在不含钙(标注TE)的缓冲液中，与EDTA一起受胰蛋白酶作用的细胞几乎不出现聚集，无论细胞是否用钙黏着蛋白转染。
实施例3.细胞培养和免疫荧光
转染的或野生型L-细胞在改良的Eagle培养基(MEM)中生长，该培养基补充了Ear1碱式盐溶液、2mM Glutamax、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和10％胎牛血清。转染细胞系在补充约700μg/mLG418(所有培养基试剂来自Gibco BRL)的培养基中生长。对于免疫荧光检测法，细胞在玻璃盖玻片上生长至约75％融合。细胞在4％多聚甲醛中固定半小时，然后用5％正常山羊血清和5％胎牛血清在IX磷酸盐缓冲盐水(PBS)中封闭。抗R-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白的山羊多克隆抗体(Santa Cruz)以1∶200稀释使用，通过与Alexa488标记的抗山羊IgG第二抗体(secondaries)(Molecular Probes)的孵育而产生荧光。用Radiance200荧光共焦显微镜(BioRad)产生图像。对于免疫印迹分析，细胞在含1％Triton X-100的缓冲液中裂解。向8％聚丙烯酰胺凝胶的各道中加入约50μg总细胞裂解物，通过电泳法分离蛋白质。使用R-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白特异性单克隆抗体(1∶1000，BD Biosciences)以显影相应的条带。
图7(A)显示了天然L-细胞以及用R-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白转染并用R-钙黏着蛋白抗体染色的L-细胞的免疫印记。只有R-钙黏着蛋白转染细胞显示出显著的R-钙黏着蛋白表达水平。图7(B)显示了天然L-细胞以及用R-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白转染并用N-钙黏着蛋白抗体染色的L-细胞的免疫印记。只有N-钙黏着蛋白转染细胞显示出显著的N-钙黏着蛋白表达水平。图7(C)是用荧光钙黏着蛋白抗体标记的R-钙黏着蛋白表达细胞的荧光显微照片，证明了细胞表面仅有R-钙黏着蛋白分子表达。图7(D)是用荧光钙黏着蛋白抗体标记的N-钙黏着蛋白表达细胞的荧光显微照片，证明了细胞表面仅有N-钙黏着蛋白分子表达。图7(E)是暴露于荧光钙黏着蛋白抗体的天然L-细胞的荧光显微照片，但显示细胞表面没有任一类钙黏着蛋白分子表达。
实施例4.聚集测定
L-细胞生长至近乎融合，然后在用0.01％胰蛋白酶+5mM CaCl2并且无EDTA(TC)或用0.01％胰蛋白酶+0.1mM EDTA并且无钙(TE)胰蛋白酶消化。收集细胞并洗涤，然后重悬在含(TC)或不含(TE)5mMCaCl2的Hank缓冲液(HBSS)+1％BSA中。细胞在0.5mL溶液中37℃下培养，24孔平板中每孔2×105个细胞，根据不同的肽浓度以60-70rpm振荡。所有测定进行3次。以孵育2小时后(N2hr)的总颗粒数与最初颗粒数(N0)之比表示细胞聚集的程度。在孵育前(N0)和孵育后(Nt)，在血细胞计数器上用8个分离的20μL数量/孔的总和计数颗粒。结果显示在图8中。
实施例5.通过玻璃体内注射肽治疗小鼠
肽溶于PBS+10％DMSO至浓度为10mM。将约0.5μL或1.0μL10mM肽溶液分别注入2天或7天大的小鼠的玻璃体腔(vitreal cavity)内。在P5或P11时，如所述解剖视网膜，通过免疫组化显示血管和星形细胞。通过在相同显微镜设定下成像注射过的视网膜，定量表层血管形成过程中外周血管形成、血管长度和血管区。然后将未注射的对照同窝小鼠用于视网膜血管形成程度的基线归一化，用
Figure BDA00003170809700141
软件(BioRad)获得数字。通过用共焦显微镜聚焦在正常深层血管丛前，并计算移进光感受器层的血管数量，定量对深层血管丛形成影响。结果见图9。
实施例6.干细胞的分离与浓集
从增强GFP与β-肌动蛋白启动子融合的成年转基因小鼠(ACTbEGFP，the Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)中分离骨髓细胞。通过密度梯度分离法用Histopaque(Sigma)收集单核细胞，并用生物素偶联谱系表(lineage panel)抗体(CD45、CD3、Ly-6G、CD11、TER-119、Pharmingen，San Diego，CA)标记以进行Lin-筛选。Lin+细胞和Lin-细胞用磁性分离柱(MACS，Miltenyi Biotech，Auborn，California)分离。因为如血管靶向的测定，确定CD31-细胞代表较好的HSC无功能亚群对照，用CD31抗体经过MACS分选从单核细胞中分离得到CD31-细胞，用作功能性Lin-HSC的阴性对照。通过用抗R-钙黏着蛋白抗体(sc-6456，Santa Cruz Biotech)和Alexa-488标记的驴抗山羊第二抗体(Molecular Probe)标记细胞，使用FACS calibur(Beckton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)流式细胞仪分析野生型小鼠HSC的R-钙黏着蛋白表达。结果见图10。
实施例7.HSC细胞培养、注射及定量
在注射前Lin-HSC与100nM R-钙黏着蛋白封闭抗体(SC-6456，Santa Cruz Biotech)或免疫前山羊IgG的磷酸盐缓冲盐溶液在37℃孵育约1小时。将0.5μL HSC溶液玻璃体内注射至P6眼。在P12时通过全样载片或切片检查视网膜。通过计算视网膜内干细胞总数来定量Lin-HSC的靶向作用，每个视网膜使用8个不同的视野：左、右、上和下象限(距视网膜外周3/4)、2个中间象限(距外周1/4-1/2)、注射部位和视神经乳头区。这些细胞特征为它们定位在表层、中层或深层，或为缺乏靶向作用(细胞位于光感受器层的背面)。光感受器层中的非靶向细胞数量以观察到的干细胞总数百分比的形式给出。结果见图11和图12。
讨论
本发明的选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽用作R-钙黏着蛋白关键识别基序的肽模拟物(即哺乳动物R-钙黏着蛋白中发现的IDS和INS序列)。不受理论的约束，本发明的拮抗肽有可能通过与细胞表面R-钙黏着蛋白分子EC1区域竞争性相互作用来阻断R-钙黏着蛋白分子的粘附功能。本发明的拮抗肽用于分子功能的研究和细胞粘附相关疾病的治疗，并且通常在体内注射时比基于抗体的拮抗剂更容易在组织内扩散。
在大多数组织(包括视网膜神经组织)的发育过程中，组织形态的形成涉及细胞-细胞粘附分子的选择性结合。这种结合选择性允许相似分化的细胞组织在一起，并且防止细胞类型侵入不正确的组织结构中。然而，尽管对钙黏着蛋白、特别是N-和E-钙黏着蛋白的特性和功能进行了深入研究，仍未显示解释钙黏着蛋白特性的普遍机理。本发明的R-钙黏着蛋白拮抗肽选择性的与哺乳动物R-钙黏着蛋白分子相互作用，而与其他钙黏着蛋白类型无显著结合。这些肽包含IDS序列(或它的同系物INS、IES和IQS)，它们对应于钙黏着蛋白EC1域中的部位，即SEQ ID NO：17和18的残基53-55，基于结构、突变和序列同源性分析，据报道粘附接触面的重要相互作用位于该部位。
不受理论的约束，认为在粘附接触面上IDS基序和邻近钙黏着蛋白分子的VDI序列直接接触。因为钙黏着蛋白的残基53-55显示出是转二聚化(transdimerization)所必须的，并且不像其他重要的粘附区域，该短氨基酸序列在经典钙黏着蛋白家族成员中不是保守的，该区域作为钙黏着蛋白特异性的决定簇。实际上，环形IDS(CIDSC，SEQ ID NO：8)选择性抑制R-钙黏着蛋白介导的细胞聚集，而相应的N-钙黏着蛋白配对物环形INP(CINPC，SEQ ID NO：9)选择性抑制N-钙黏着蛋白介导的聚集。N-钙黏着蛋白和R-钙黏着蛋白在钙黏着蛋白家族中最同源。事实上，尽管所有钙黏着蛋白，包括R-和N-钙黏着蛋白优选以嗜同性方式相互作用，R-和N-钙黏着蛋白是仅有的两个观察到功能性异二聚体的经典钙黏着蛋白家族成员。因此，环形IDS和环形INP几乎不可能对N-或R-钙黏着蛋白有不同的功能特性，而对其它的钙黏着蛋白成员有重叠的特性。这些研究证实了IXS基序(其中X是D、N、E或Q)(即对应于R-钙黏着蛋白残基53-55及其同系物)，在介导R-钙黏着蛋白分子的同型缔合(homoassociation)中发挥重要作用。基于IXS对R-钙黏着蛋白和INP对N-钙黏着蛋白的特异性，有可能其他钙黏着蛋白家族成员中的相应残基(例如E-钙黏着蛋白的IER基序和P-钙黏着蛋白的IEK基序)也对其他经典钙黏着蛋白具有特异性。
先前的研究显示，抗R-钙黏着蛋白抗体破坏体内视网膜血管形成。因为阻碍了位于上皮细胞前的星形细胞中转的R-钙黏着蛋白介导指导线索，破坏了表层血管丛血管形成。在血管侵入之前，随后深层血管丛所在的区域中也可观察到R-钙黏着蛋白的表达。由于注射R-钙黏着蛋白封闭抗体导致血管绕过正常的血管形成层，认为这些区域中的R-钙黏着蛋白分子引导上皮细胞到达正确的血管丛。
在表层和深层视网膜血管形成过程中通过注射环形IDS(CIDSC，SEQ ID NO：8)现在已产生类似的血管表型。由于在体外环形IDS很大程度上选择性阻断R-钙黏着蛋白介导的聚集(即不显著阻断N-钙黏着蛋白介导的聚集)，有可能体内血管表型也通过环形IDS和R-钙黏着蛋白的高亲和性相互作用而产生。此外，注射环形INP(CINPC，SEQID NO：9)并没有产生显著的视网膜血管表型，该环形INP在体外是N-钙黏着蛋白介导聚集而不是R-钙黏着蛋白介导聚集的有效抑制剂。这些结果共同证实了在血管指导中R-钙黏着蛋白的特殊作用。
本发明选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽的设计基于经典钙黏着蛋白家族各成员的结构、生物化学和突变分析。众所周知，色氨酸-2连同N-钙黏着蛋白和R-钙黏着蛋白氨基酸残基79-81处的HAV序列一起对于钙黏着蛋白的功能很重要。事实上，据报道含HAV序列的线形和环形肽在体外阻断N-钙黏着蛋白介导的轴突突起。然而，这些序列在所有钙黏着蛋白分子中是绝对保守的，因此不能提供特异性结合。其他残基也必须在二聚化接触面中进行重要接触，其中某些非保守残基对于钙黏着蛋白识别很重要。注意力集中到氨基端钙黏着蛋白重复(EC1)中的残基上。大多数重要的接触性残基集中在3个区域：氨基酸35-45、氨基酸53-59和氨基酸79-86。残基53-59包含大多数这些钙黏着蛋白特异性残基，这些残基在二聚化接触面的形成中有潜在的重要性。因此残基53-55特别重要。因此，从该区域设计肽模拟物，以优化产生R-钙黏着蛋白特异性肽的机率。设计了抗小鼠N-钙黏着蛋白序列、抗最相关的钙黏着蛋白家族成员的类似肽和其它对照肽，用于比较分析。
钙黏着蛋白介导的聚集
选择小鼠成纤维细胞(L929谱系)，通常称为L-细胞，因为已知它们不表达内源钙黏着蛋白。产生R-钙黏着蛋白稳定转染子，用于检验设计的肽对R-钙黏着蛋白介导的聚集的效果。也产生N-钙黏着蛋白稳定转染子，基于本发明肽对N-钙黏着蛋白介导聚集的效果，用于评价它们对钙黏着蛋白的选择性。免疫印迹分析在R-钙黏着蛋白克隆8(R-cad8)中检测到高水平R-钙黏着蛋白表达而没有N-钙黏着蛋白表达，同时在N-钙黏着蛋白克隆3(N-cad3)中检测到高水平N-钙黏着蛋白表达而没有R-钙黏着蛋白表达，结果如图7所示。免疫荧光证实了这些所选克隆中适当钙黏着蛋白的表达。当在聚集测定中检测时，因为钙黏着蛋白的转染，转染细胞系形态发生改变。当亲代(即未转染的)L-细胞保持分散为单细胞颗粒时，小鼠R-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白转染子由于细胞间紧密结合而形成大的钙依赖性(TC缓冲液)细胞簇，如图6(A)所示。通过使细胞最初与EDTA溶液一起受胰蛋白酶作用并在不含钙缓冲液(TE缓冲液)中聚集，消除钙黏着蛋白介导的聚集簇，结果如图6(B)所示。
肽对细胞聚集的影响
以各种浓度将肽加到聚集细胞中，以检测它们阻断钙黏着蛋白介导的粘附的效果。环形IDS抑制R-钙黏着蛋白介导的聚集，其IC50约300μM。线形肽IDSMSGR(SEQ ID NO：2)也阻断R-钙黏着蛋白介导的粘附。然而，它的效力(IC50约900μM)比环形肽IDS低约3倍。由于也证实环形肽比线形肽有更好的溶解性和更容易操作，重点进一步单独集中在环形肽的分析上(图8(A))。环形IDS的效果特异性针对R-钙黏着蛋白，而几乎没有观察到对N-钙黏着蛋白聚集的效应。相反，相应的N-钙黏着蛋白特异性序列环形INP抑制N-钙黏着蛋白介导的聚集，其IC50在300μM以下(图8(B))，与环形IDS对R-钙黏着蛋白聚集的效应相似。环形INP对R-钙黏着蛋白介导的聚集几乎没有影响。
其他对照肽，环形RAD(CRADC，SEQ ID NO：13)和环形SDI(CSDIC，SEQ ID NO：12)对R-钙黏着蛋白介导或N-钙黏着蛋白介导的聚集均几乎没有影响。环形HAV肽(CHAVC，SEQ ID NO：20)已知有效阻断由任何经典钙黏着蛋白分子介导的粘附，作为比较加以检测。在我们的检测中，环形HAV阻断R-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白介导的聚集，其ID50S为150-200μM。因此，环形IDS和环形INP分别选择性阻断R-或N-钙黏着蛋白的粘附，亲和力仅稍低于非特异性钙黏着蛋白封闭肽。先前使用抗R-钙黏着蛋白抗体的研究显示出干扰正常视网膜发育的血管形成作用。在我们的检测系统中，这些抗体也有效阻断钙黏着蛋白介导的聚集，IC50为约10nM，结果如图8(c)所示。
肽对视网膜血管形成的作用
肽注射到出生后小鼠眼的玻璃体腔内。当环形IDS或环形HAV肽注射到2天大的小鼠眼中时，在3天后(即出生后第5天，P5)检查所产生的脉管系统，血管形成被破坏，与注射抗体所观察到的结果相似。与正常的未注射同窝对照相比，这些视网膜的特征为具有较小范围的外周血管形成和血管形成区域里较少的互连血管。总之，表层血管形成被R-钙黏着蛋白封闭肽减小了一半，而注射了N-钙黏着蛋白特异性环形INP的视网膜相对正常(见图9(A-C))。
本发明的选择性R-钙黏着蛋白拮抗肽也破坏深层视网膜层的正常血管形成。在表层血管网络的血管向下发展并开始形成深层血管丛之前的P7注射环形IDS肽，所得P11的脉管系特征为很多血管芽(vascular sprout)迁移过正常深层血管丛并进入无血管的光感受器层。这再一次与先前观察到的注射R-钙黏着蛋白抗体的结果相似。相反，注射环形INP肽的眼深层血管丛正常形成，结果如图9(B和D)所示。
Lin-HSC表达R-钙黏着蛋白
分析造血干细胞(HSC)表达的R-钙黏着蛋白以确定R-钙黏着蛋白细胞粘附分子是否在功能靶细胞的细胞表面上表达。用流式细胞仪分析，HSC近80％的Lin-亚群细胞在细胞表面表达R-钙黏着蛋白，而仅有30％的Lin+亚群细胞表达R-钙黏着蛋白(图10)。基于两个细胞群之间的相对荧光强度，而言，也有可能Lin-细胞在它们的细胞表面表达比小部分R-钙黏着蛋白阳性Lin+细胞更高浓度的R-钙黏着蛋白。因此，在功能性靶向视网膜脉管系统的亚群中大多数细胞表达R-钙黏着蛋白，当非靶向亚群的大多数细胞不表达R-钙黏着蛋白。有趣的是，为CD31、CD34和Macl阴性并且完全没有靶向功能的HSC不同亚群甚至包含更少的R-钙黏着蛋白表达细胞。
R-钙黏着蛋白封闭抗体和肽破坏HSC的靶向作用
为了检测R-钙黏着蛋白细胞-细胞粘附在将HSC靶向至不同视网膜血管层中的作用程度，在注射前将Lin-HSC用R-钙黏着蛋白特异性封闭抗体封闭。注射后6天，正常的Lin-HSC仅发现于3个血管层：1)位于神经节细胞层中的表层血管丛；2)位于外网层附近的深层血管丛；3)位于内核层前缘的中间层。图11(A)显示了注射了正常Lin-HSC(左)、与粘附阻断性R-钙黏着蛋白抗体孵育的Lin-HSC(中)和与免疫前山羊IgG孵育的Lin-HSC(右)后视网膜的横切片。
当Lin-HSC在注射前用抗R-钙黏着蛋白抗体预培养时，大多数这些细胞丧失了正确靶向的能力，而与免疫前IgG预孵育的细胞作用类似于未封闭的HSC。靶向深层和中层血管层似乎更受阻断R-钙黏着蛋白粘附的影响，因为在这些区域中相对很少发现R-钙黏着蛋白封闭的HSC。位于表层血管丛的细胞也显示较少的组织性，并且不以与正常Lin-HSC或用免疫前IgG预培养Lin-HSC相同的程度与内源脉管系统共同定位。
许多与R-钙黏着蛋白抗体预孵育的Lin-HSC迁移穿过视网膜的全部3个血管层，并且粘附在靠近RPE层的光感受器外缘。几乎一半的R-钙黏着蛋白封闭HSC发现于光感受器层的外缘(图11(B))。与此对照，注射免疫前IgG预孵育HSC的对照视网膜仅有15％的HSC错误靶向到该区域。对照视网膜中大部分错误靶向细胞发现于注射部位附近，可能是由于移走注射针时视网膜下释放的细胞。当将注射位置排除在计算之外时，错误靶向的免疫前IgG预孵育HSC的数量减到10％。由于正常情况下在此“特别深”层几乎观察不到Lin-HSC，小部分错误靶向的对照IgG孵育HSC有可能是由于免疫前IgG能结合约10％Lin-细胞的事实(图10)。这些结合的IgG分子可非特异性阻止正常的粘附，仅仅是因为空间阻碍。然而，特异性R-钙黏着蛋白封闭与非特异性IgG封闭所致的错误迁移细胞数目之间的差别具有显著性。
图12(A)显示了穿过3个血管丛和光感受器层外缘Z-平面的共焦点影像。通过用免疫前山羊IgG封闭Lin-HSC(绿色)，在正确血管丛中和沿着内源性血管(红色)观察到正常的靶向作用。阻断R-钙黏着蛋白粘附导致很多Lin-HSC定位至光感受器层的外缘，靶向正常血管丛的细胞倾向于聚集在一起并且不沿内源血管(红色)定位。图12(B)是条形图，显示对于R-钙黏着蛋白封闭的Lin-HSC群，视网膜中错误迁移细胞相对于全部HSC的百分比明显较大(P＜0.01)。
上述描述应认为是说明性而不是限制性的。本发明精神和范围内的其它变化容易由本领域技术人员提出。
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Claims (4)

1. 一种分离的环形肽，所述环形肽具有序列Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg (SEQ ID NO: 6)；其中Xaa是Asp或Asn。
2. 权利要求1的分离的环形肽，其中Xaa是Asp。
3. 一种抑制视网膜血管形成的药物组合物，所述组合物包含权利要求1的分离的环形肽和其药物可接受载体。
4. 权利要求3的组合物，其中所述肽的Xaa残基是Asp。
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