PT1631657E

PT1631657E - Estirpes maloláticas tolerantes ao alcool para a maturação dos vinhos de ph médio ou elevado

Info

Publication number: PT1631657E
Application number: PT47672878T
Authority: PT
Inventors: Magali Bou; Sibylle Krieger
Original assignee: Danstar Ferment Ag
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2013-11-04
Also published as: DK1631657T3; AU2004247919A1; US8114449B2; US7625745B2; FR2856074A1; ES2433921T3; WO2004111179A2; EP1631657B1; US20060153822A1; WO2004111179A3; AU2004247919B2; FR2856074B1; EP1631657A2; ZA200509133B; US20100040730A1

Description

ΕΡ1631657Β1

DESCRIÇÃO

ESTIRPES MALOLÁTICAS TOLERANTES AO ÁLCOOL PARA A MATURAÇÃO DOS VINHOS DE PH MÉDIO OU ELEVADO 0 presente invento refere-se a um processo de controlo da fermentação maloláctica nos vinhos por inoculação directa de estirpes de bactérias lácticas seleccionadas.

Tem por objecto estirpes de bactérias lácticas seleccionadas resistentes ao álcool, capazes de iniciarem e de realizarem uma fermentação maloláctica (FML) completa quando são introduzidas sem etapa prévia de aclimatização num vinho de pH médio a elevado. Esta resistência ao álcool é aproveitada num processo de condução da FML num vinho de pH médio a elevado, igualmente objecto do presente invento. A fermentação maloláctica (FML) é a descarboxilação de ácido málico em ácido láctico, que resulta da actividade metabólica de certas bactérias lácticas. Provenientes da superfície dos bagos de uva, das folhas de vinha, do solo e do material vinícola, estão naturalmente presentes numerosas bactérias lácticas em todas as etapas do processo de 5.9 vinificação e do armazenamento do vinho. Contudo, apenas alguns grupos de bactérias lácticas são capazes de se multiplicarem no sumo de uva e sobretudo no vinho, devido a condições de crescimento limitativas. Pertencem a 4 géneros: Oenococcus, Leuconostoc, Lactobacillus e Pediococcus. Encontram-se comummente no vinho três espécies de Pediococcus e sete espécies de Lactobacillus (Kunkee 1967 Adv. Appl. Microbiol., vol. 9, pp. 235-279) enquanto Leuconostoc e Oenococcus ali estão representadas cada uma, 1 ΕΡ1631657Β1 por uma única espécie (Leuconostoc mesenteroides e

Oenococcus oeni, respectivamente).

Faz-se referência à FML em artigos científicos: Carbo e al. Riv. Vitic. Envl. Vol. 48, N°4, 1995, p29.38; Carrie e al., Revue des Oenoloques N° 103, 2002, p. 16-18; Pilone,

Wine Industrie Journal, vol. 10, n°2, 1995, p.169-173 ; Lin e al. , Am. J. Envl. Vitric, vol 46, n°2, 1995, p. 166-174;

Joyeux e al., Connaissance Vigne Vin, vol.19, N° 3, 1985, p. 149-159. A diminuição da acidez e a modificação dos aromas do vinho que decorrem da FML são considerados como benéficos para a qualidade do vinho. Esta fermentação secundária contribui adicionalmente para a estabilização biológica do vinho. A sua boa realização reveste-se portanto de uma grande importância para a obtenção de vinhos de qualidade, o que levou os produtores a procurarem meios de controlar o seu início e o seu desenvolvimento.

Na vinificação tradicional, a FML produz-se graças ao crescimento espontâneo de uma flora indígena de bactérias lácticas. O processo de FML desencadeia-se por si próprio, quando a flora maloláctica está suficientemente desenvolvida, isto é, de maneira aleatória entre o fim da fermentação alcoólica e várias semanas, inclusivamente vários meses, depois da fermentação alcoólica. Quando as bactérias malolácticas alcançam uma concentração de cerca de 106 UFC/ml no meio, entram em fase metabólica activa e iniciam a fermentação do ácido málico. Nestas condições, Oenococcus oeni é a espécie mais frequentemente responsável pela FML. Efectivamente, se no início de fermentação alcoólica, é observada uma predominância das espécies 2 ΕΡ1631657Β1 homofermentativas Lactobacillus plantarum e Lactobacillus casei, estas desaparecem quando aumenta o teor em álcool. Após fermentação alcoólica são as espécies Pediococcus e Oenococcus, consoante o pH, que predominam e alcançam finalmente a concentração critica para desencadear a FML.

Foram propostos vários métodos destinados a melhor controlar o arranque e o desenvolvimento da FML, que assentam principalmente na indução da FML por inoculação dos mostos ou dos vinhos com estirpes de bactérias lácticas seleccionadas. Geralmente são utilizadas estirpes de Oenococcus oeni, sendo esta espécie conhecida por melhor convir à FML.

Um primeiro processo consiste em induzir a FML com a ajuda de uma biomassa que não prolifera Oenococcus oeni. Pelo facto das bactérias, que agem neste caso como uma preparação enzimática, a degradação completa do ácido málico só é obtida com uma inoculação maciça, à razão de pelo menos 108 UFC/ml, o que representa um custo demasiado elevado para encontrar uma aplicação prática real.

Um segundo processo consiste em introduzir na cuba de vinificação, preparações de Oenococcus oeni, antes do arranque da fermentação alcoólica, quando ainda não se produziu nenhum álcool e quando o mosto está rico em nutrientes. Este método tem por vantagem que as preparações podem ser adicionadas directamente ao mosto no estado liofilizado ou congelado, na medida em que não têm de experimentar uma tensão alcoólica que lhes seria fortemente prejudicial. Mas, os resultados não são satisfatórios nomeadamente devido à competição entre as leveduras e as bactérias lácticas: uma das duas populações multiplica-se 3 ΕΡ1631657Β1 mais rapidamente e pode suplantar a outra, nomeadamente sob a influência do pH do meio. Além disso, sendo Oenococcus oeni heterofermentativa, pode utilizar o açúcar como substrato para produzir o ácido acético. Por este motivo, o risco de ver uma produção de acidez volátil pelas bactérias lácticas é fortemente dissuasivo para os viticultores (Riberau-Gayon e al. 1975, Sciences et techniques du vin, Tome III, Dunod, Paris).

Face a este problema, recorreu-se a estirpes homofermentativas de Lactobaclllus plantarum, de maneira a que não haja produção de ácido acético a partir dos açúcares presentes no mosto ou no sumo de frutas e portanto não haja aumento da acidez volátil do vinho (pedido de patente EP 0 398 957). As estirpes seleccionadas são introduzidas no mosto ou sumo de fruta, antes ou nos primeiros momentos da FA. No entanto, sendo estas bactérias malolácticas incapazes de sobreviverem num vinho fermentado, a degradação do ácido málico abranda e termina-se quando o nivel de álcool atinge 5%. Finalmente, o ácido málico não é totalmente degradado e o vinho obtido não é bacteriologicamente estável.

Uma outra solução para evitar a produção de acidez volátil a partir dos açúcares pode consistir em inseminar o vinho apenas depois da fermentação alcoólica quando a taxa de açúcar é minima. As preparações de bactérias lácticas inoculadas nas cubas de vinificação devem neste caso ser capazes de sobreviver apesar da tensão devido a um grau de álcool já elevado no meio, sendo as bactérias lácticas tanto mais sensíveis à tensão quanto forem introduzidas no meio no estado liofilizado ou congelado. 4 ΕΡ1631657Β1

Desde há muitos anos são comercializadas preparações de Oenococcus oeni para a inseminação do vinho após fermentação alcoólica. É preconizada uma pré-cultura num meio enriquecido em vinho, para evitar a queda siqnificativa da população celular durante a inoculação em meio alcoolizado. Por exemplo, uma incubação a 25°C durante 1 a 6 dias permite melhorar a sobrevivência das bactérias colocando-as num estado fisiolóqico adaptado. Esta "reactivação" também chamada "aclimatação" deve permitir uma indução dos mecanismos de resistência das células confrontadas com um teor de álcool elevado, autorizando um aumento da população bacteriana e uma retoma da actividade metabólica (Lafon-Fourcade e al., 1993, Conn. Viqne Vin, vol. 17, pp 55-71). Este método embora eficaz, exige tempo, trabalho e requer certos conhecimentos microbiolóqicos. 0 tempo de pré-cultura e o momento da introdução devem ser respeitados precisamente sob pena de uma perda significativa de viabilidade, o que representa uma restrição séria durante o período das vindimas.

Mais recentemente foi explorada uma outra via para dispor preparações de bactérias lácticas que respondem à dupla exigência de poderem ser inoculadas num vinho sob forma liofilizada ou congelada, sem perda de viabilidade apesar do grau alcoólico, o que permite em particular realizar a FML em prazos mais curtos sem aumentar a biomassa introduzida. A patente EP 635 050 descreve um processo de indução da fermentação maloláctica por inoculação de um vinho com uma cultura liofilizada de bactérias lácticas que pertencem ao género Oenococcus oeni resistentes ao álcool, sem etapa prévia de aclimatização. As estirpes de Oenococcus oeni seleccionadas apresentam uma taxa de sobrevivência elevada que possibilita o desencadear da FML mesmo com 5 ΕΡ1631657Β1 baixas concentrações de introdução (1.106 a 5.107 UFC/ml) e na presença de álcool com teores compreendidos entre 10,5% e 13%. Nas condições definidas e para um pH compreendido entre 3,2 e 3,6 as células entram rapidamente em fase activa de fermentação maloláctica.

Embora estas preparações liofilizadas de Oenococcus oeni para a inseminação directa tenham provado a sua utilidade em diversos tipos de vinhos, existem numerosos casos nos quais a sua utilização não é satisfatória. Efectivamente, o pH do vinho é um factor essencial que intervém na selecção da espécie que realizará a FML.

Ora, uma grande parte destes vinhos tintos actualmente produzidos provêem das regiões quentes (como por exemplo o Sul da Europa). Estes vinhos têm um pH bastante elevado, quer dizer, da ordem de 3,5 ou superior a este valor, o que favorece o crescimento bacteriano e, em primeiro, lugar o desenvolvimento das bactérias indígenas, malolácticas ou outras. Estas bactérias, que resistem mal a pH inferiores a 3,5, são então favorecidas em detrimento de OE.oeni.

Isto conduz a dois tipos de problemas. Por um lado, embora as culturas de arranque de FML à base de Oe.oeni que são inoculadas nas cubas depois da fermentação alcoólica sejam resistentes ao álcool, a sua reidratação e a sua aclimatização requer um certo tempo antes da retoma de uma actividade fermentativa. Ora a microflora indígena sendo favorecida em pH elevados, podem desenvolver-se espécies indesejáveis mais rapidamente e suplantar Oe.oeni. A população bacteriana inoculada regressa abaixo da massa crítica de 106 UFC/ml, inclusivamente nunca a atingindo. A 6 ΕΡ1631657Β1 degradação do ácido málico pode não ser completamente realizada ou até nem mesmo ser iniciada.

Por outro lado, nos pH que favorecem o crescimento bacteriano, assiste-se frequentemente ao desencadear espontâneo da FML por uma ou várias estirpes malolácticas indígenas, mesmo antes que a fermentação alcoólica esteja terminada, num estado do processo onde os açúcares estão ainda presentes em quantidade notável, dissuadindo a introdução no meio das bactérias lácticas heterofermentativa.

Em ambos os casos, o controlo da FML, simplesmente não é possível, uma vez que o risco é significativo de que seja realizada por bactérias indefinidas, das quais não se conhecem as características. As espécies indígenas dominantes podem em particular, consumir vários substratos e produzirem compostos tóxicos ou conduzirem a modificações organolépticas desagradáveis e outros efeitos negativos no vinho.

Podem citar-se como exemplo, certas estirpes de Lactobacillus brevis, capazes de metabolizarem o ácido tartárico (doença da volta) o que reduz a acidez total e aumenta a acidez volátil. Certas estirpes de Lactobacillus brevis e Lactobacillus buchneri são capazes de degradar o glicerol, tendo então os metabolitos produzidos o papel de precursores da acroleína que reage com os taninos dos vinhos e dá um gosto amargo. Numerosas estirpes malolácticas de Pediococcus, mas também de Lactobacillus brevis e certas estirpes de Oenococcus oeni podem descarboxilar os ácidos aminados em aminas biogénicas, como a histidina em histamina que podem estar na origem de severas reacções alérgicas nas 7 ΕΡ1631657Β1 pessoas sensíveis. Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus brevis e outras espécies, nomeadamente Pediococcus são responsáveis pelos vinhos oleosos, doença dos vinhos causada pela produção de polissacarídeos exocelulares que aumentam a viscosidade do vinho. A presença de tais bactérias lácticas no seio de uma microflora indígena é um fenómeno largamente divulgado. A complexidade desta microflora reforça os riscos de que pelo menos uma estirpe indesejável esteja presente no mosto, e os valores de pH médios ou elevados lhes dêem a oportunidade de ali se desenvolverem rapidamente. Todas estas reacções metabólicas participam de uma maneira ou de outra na alteração da qualidade do vinho e estão na origem de sérios prejuízos económicos.

Os produtores, que têm objectivos quantitativos, mas também qualitativos em relação aos produtos a fim de responderem às expectativas do mercado, devem poder dominar o mais possível o processo de vinificação qualquer que seja o pH do vinho, e limitar os riscos de evolução não desejada ao longo de todo o processo. Desejam dispor de culturas de arranque da FML adaptadas às condições modernas de produções e às exigências dos consumidores, que os defendam vantajosamente destes riscos. 0 presente invento tem por objectivo responder a esta necessidade. Inesperadamente, a solução reside na selecção de estirpes de bactérias lácticas resistentes ao álcool que pertencem às espécies Lactobacillus e Pediococcus. São capazes de iniciar e realizar uma FML completa quando são introduzidas sem etapa prévia de aclimatização, num vinho de pH médio a elevado. Esta resistência ao álcool inéreferida 8 ΕΡ1631657Β1 nas bactérias lácticas destas espécies manifesta- -se por um lado por uma excelente taxa de sobrevivência durante a inoculação e por outro lado por um arranque rápido da actividade fermentativa.

Estas estirpes, além de serem tolerantes ao álcool, apresentam um metabolismo homofermentativo, que lhes permite ser inoculadas no vinho antes do fim da fermentação alcoólica sem produzir acidez volátil.

As caracteristicas combinadas de resistência ao álcool e de crescimento rápido com pH médio ou elevado, conferem às estirpes de acordo com o invento, a vantagem essencial de se desenvolverem mais rapidamente que a flora indígena, mesmo com pH que favorecem o crescimento desta última. 0 resultado particularmente vantajoso é que as espécies indígenas não podem desenvolver-se e são assim impedidas de produzirem compostos indesejáveis. É possível uma inseminação em curso de fermentação alcoólica sem prejudicar a qualidade do vinho, o que oferece uma garantia suplementar de que a FML seja realizada sob o controlo permanente do viticultor.

Este resultado é tanto mais surpreendente quanto as estirpes seleccionadas que respondem às exigências acima expostas pertencem às espécies Lactobacillus e Pediococcus. Estas bactérias lácticas têm até ao presente sido descartadas de uma utilização em meio alcoólico em particular pelo facto de estarem raramente presentes nos meios de fermentação alcoolizados e ainda mais nos vinhos. As raras tentativas de inverter este a priori conduziram a resultados decepcionantes. 9 ΕΡ1631657Β1

Por exemplo, viu-se mais acima que a inseminação com preparações de Lactobacillus plantarum antes da fermentação alcoólica não permitia uma FML completa devido à perda de actividade quando o grau de álcool atinge 5%. Mais recentemente, esta situação foi confirmada pelos trabalhos conduzidos na Universidade de Rioja em Espanha (Tenorio e al., 2002, XIII Congreso de Microbiologia de los Alimentos,

Universidade de Rioja). Foram inoculadas duas estirpes de cada uma das espécies Oenococcus oeni e Lactobacillus plantarum seleccionadas entre a flora indígena, com 5.106 UFC/ml num vinho da região de La Rioja (Sul de Espanha) depois da fermentação alcoólica. As estirpes Oe.oeni impuseram-se no meio e permitiram um bom desenvolvimento da FML enquanto as estirpes L. plantarum regrediram até já não serem detectáveis no fim da FML. Estes resultados mostram mais uma vez que quando é introduzida Lactobacillus em meio alcoolizado, definha e não é capaz de fermentar o ácido málico em ácido láctico.

Por outro lado, é bem sabido que as bactérias lácticas têm uma resistência á tensão fortemente reduzida depois de secagem, liofilização ou congelação. Quando são submetidas a condições desfavoráveis tais como um grau alcoólico elevado, a sua taxa de sobrevivência decresce drasticamente e a sua actividade fermentativa só pode iniciar-se depois de um período de adaptação ao meio, mais ou menos longa. Para iniciar a FML é adicionalmente necessário alcançar uma concentração da ordem de 106 UFC/ml o que necessitará frequentemente de uma fase de multiplicação celular que permite à população reconstituir-se. O presente invento faculta igualmente uma resposta a este problema graças às novas estirpes de bactérias 10 ΕΡ1631657Β1 malolácticas seleccionadas que pertencem aos géneros Lactobacillus e Pediococcus, sendo estas capazes de iniciarem e realizarem a FML quando são introduzidas directamente no estado seco, liofilizado ou congelado num vinho com pH médio ou elevado.

Um processo de indução da FML por inoculação directa destas bactérias malolácticas resistentes ao álcool é igualmente um objecto do presente invento.

Chamar-se-á "vinho" a um meio de fermentação tal como um mosto à base de sumo de uva ou de outros frutos, no qual a quantidade de álcool produzido por fermentação alcoólica é de pelo menos 5% em volume. Este vinho pode ter alcançado o seu grau alcoólico máximo se a fermentação alcoólica estiver terminada. Os teores em álcool são expressos pelo volume de álcool relativamente ao volume total.

Chamar-se-á "vinho maduro" ou "vinho com maturidade" um vinho no qual a FML se desenrolou completamente, quer dizer, no qual o teor em ácido málico é inferior a 0,2 g/1. Este vinho maduro é microbiologicamente estável contrariamente ao vinho não maduro.

Para um vinho, um pH médio será da ordem de 3,5 a 3,6, e um pH elevado poderá ir de cerca de 3,6 até pH máximos encontrados nos vinhos seja, cerca de 4,0, inclusivamente mais.

Por "inoculação directa" entende-se a introdução no meio de fermentação das bactérias lácticas escolhidas, sem etapa prévia de aclimatização ou de adaptação ao meio, com uma concentração economicamente aceitável, isto é, compreendida 11 ΕΡ1631657Β1 entre 106 e 5.107 UFC/ml de meio. Pode ser operada uma simples reidratação de 20 minutos na água a 22°C.

As propriedades vantajosas das estirpes seleccionadas de acordo com o invento manifestam-se pela sua capacidade de entrarem em fase fermentativa praticamente sem tempo de latência para iniciar a FML com prazos curtos, apesar das condições desfavoráveis do meio.

Na prática isto traduz-se pelo facto de que desde os primeiros dias depois da inoculação bacteriana, são transformadas fracções importantes do ácido málico, presentes no meio, em ácido láctico. Uma vez iniciado o processo de FML, as bactérias inoculadas conservam a sua posição predominante no meio e asseguram o bom desenvolvimento da FML, até ao esgotamento do substrato, garantindo sempre que o vinho maduro finalmente produzido será isento de compostos indesejáveis. É importante notar que as estirpes de acordo com o invento são resistentes ao álcool mesmo em condições que induzem habitualmente uma tensão importante e que conduzem a um definhamento celular, em particular durante a inoculação sob forma seca, liofilizada ou congelada sem etapa prévia de aclimatização.

Assim, uma estirpe de bactéria láctica seleccionada de acordo com o invento que pertence ao género Lactobacillus ou Pediococcus, tem a capacidade de realizar a conversão do ácido málico em ácido láctico de maneira que, quando é introduzida com uma concentração compreendida entre 106 e 5.107 UFC/ml, directamente no estado seco, liofilizado ou 12 ΕΡ1631657Β1 congelado num vinho que tem um grau de álcool de 10% ou mais e um pH superior ou igual a 3,5, i) converte pelo menos 5% e de preferência pelo menos 10% do ácido málico em ácido láctico em 5 dias após inoculação do referido vinho, e ii) converte pelo menos 10% e de preferência pelo menos 25% do ácido málico em ácido láctico em 10 dias após inoculação do referido vinho.

De maneira particularmente vantajosa, uma estirpe de bactéria láctica de acordo com o invento tem uma actividade fermentativa tal que, quando é introduzida com uma concentração compreendida entre 106 e 5.107 UFC/ml directamente no estado seco, liofilizado ou congelado num vinho que tem um grau de álcool de 10% ou mais e um pH superior ou igual a 3, 6 iii) converte pelo menos 10% e de preferência pelo menos 15% do ácido málico em ácido láctico em 5 dias após inoculação do referido vinho, e iv) converte pelo menos 25% e de preferência pelo menos 40% do ácido málico em ácido láctico em 10 dias após inoculação do referido vinho.

Estas estirpes são portanto particularmente interessantes como culturas de arranque da FML em vinhos de pH médio ou elevado, em curso ou em fim de fermentação alcoólica. Feito isto, a sua utilização é completamente possível nas condições usuais de pH e de concentração alcoólica, correspondendo então a sua capacidade de realizar 13 ΕΡ1631657Β1 a FML nos desempenhos comummente obtidos com outras culturas de arranque de FML.

Como explicado precedentemente, para se assegurar que não se desenvolvam bactérias indígenas, pode ser interessante inocular o meio de fermentação antes do fim da fermentação alcoólica, sem risco de produção da acidez volátil, a partir do açúcar ainda presente no meio. De acordo com uma característica vantajosa do presente invento, as estirpes seleccionadas de bactéria láctica são homofermentativas.

Além disso é interessante que as estirpes seleccionadas não sejam capazes de produzir compostos tóxicos ou conduzir a modificações organolépticas desagradáveis e outros efeitos negativos no vinho. É por isso que o invento se refere igualmente a estirpes de bactérias lácticas seleccionadas que não produzem aminas biogénicas a partir de precursores aminados presentes no vinho, que não degradam o glicerol nem o ácido tartárico. De preferência as estirpes de acordo com o invento possuem o conjunto destas propriedades.

De acordo com um modo vantajoso de realização, o presente invento refere-se a uma estirpe de bactérias láctica que possui o conjunto das características definidas precedentemente e que tem a capacidade quando é introduzida directamente com uma concentração de 2.106 UFC/ml num vinho com uma temperatura superior ou igual a 18°C tendo um teor em S02 compreendido entre 0 e 15 mg/1, um teor em álcool superior ou igual a 10% e um pH de 3,7 ou mais i) converter 15% do ácido málico em ácido láctico em 5 dias após inoculação do referido vinho, e 14 ΕΡ1631657Β1 ii) converter 40% do ácido málico em acido láctico em 10 dias após inoculação do referido vinho.

De maneira particularmente vantajosa, a referida estirpe de bactéria láctica possui o conjunto das caracteristicas definidas precedentemente e a capacidade quando é introduzida directamente com uma concentração de 2.106 UFC/ml num vinho com uma temperatura superior ou igual a 18°C, tendo um teor em S02 compreendido entre 0 e 15 mg/1, um teor em álcool superior ou igual a 10% e um pH de 3,7 ou mais i) converter 50% do ácido málico em ácido láctico em 5 dias após inoculação do referido vinho, e ii) converter 80% do ácido málico em acido láctico em 10 dias após inoculação do referido vinho.

As estirpes possuem as caracteristicas acima mencionadas quando são introduzidas num vinho que tem um teor em álcool de 10% inclusivamente de 12% e até de 13%. Obviamente, estas estirpes apresentam caracteristicas idênticas ou melhores quando são introduzidas mais precocemente no vinho, por exemplo quando o teor em álcool ainda só é de 5%.

Como indicado precedentemente, as bactérias malolácticas seleccionadas pertencem de maneira inesperada aos géneros Lactobacillus ou Pediococcus, até então consideradas como inaptas para se desenvolverem em meio alcoolizado. Particularmente são seleccionadas no grupo formado de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbruckii, Pediococcus acidilactici, Pediococcus damnosus Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus, Pediococcus cerevisiae damnosus. 15 ΕΡ1631657Β1

Em particular são reivindicadas as estirpes malolácticas homofermentativas seguintes: Lactobacillus plantarum CNCM I-2924, Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M, depositadas numa colecção de cultura de microorganismos em conformidade com as disposições do Tratado de Budapeste, regra 6.1.

Uma preparação de bactérias lácticas destinadas a serem utilizadas como cultura de arrangue da FML, isto é, para a inseminação de um vinho em vista da indução da FML, pode compreender uma ou várias estirpes de bactérias malolácticas tais como definidas precedentemente e eventualmente outros ingredientes conhecidos pelo especialista. Tais preparações podem apresentar-se no estado liguido, seco, liofilizado ou congelado.

As bactérias malolácticas resistentes ao álcool acima descritas ou uma preparação destas são destinadas a ser concretizadas para a realização controlada da FML em vinhos de pH médio ou elevado, nomeadamente num processo objecto do presente invento.

Este processo de conversão do ácido málico em ácido láctico num vinho que tem um pH superior ou igual a 3,5 consiste em produzir uma preparação que compreende pelo menos uma estirpe de bactéria láctica tal como precedentemente descrita, directamente no estado seco, liofilizado, ou congelado no referido vinho, com uma concentração compreendida entre 106 e 5.107 UFC/ml, com uma temperatura superior ou igual a 18°C guando o grau de álcool alcançou pelo menos 10% e em manter o vinho em condições gue permitem o desenvolvimento da FML para obter um vinho maduro cujo teor em ácido málico é inferior a 0,2 g/1. 16 ΕΡ1631657Β1 0 processo pode ser aplicado vantajosamente a qualquer vinho cujo pH é superior ou igual a 3,5 sem limitação superior. É concretizado de maneira particularmente vantajosa para vinhos de pH 3,6 e mais, para os quais o risco de desenvolvimento de bactérias indesejáveis com crescimento rápido é particularmente elevado.

Se o viticultor o desejar e a fim de evitar um arranque da FML por bactérias indígenas descontroladas, pode ser introduzida no vinho em curso de fermentação, uma preparação de bactérias lácticas de acordo com o invento, por exemplo quando o grau de álcool alcançou 5% ou mais, isto é, enquanto a quantidade de açúcar presente no vinho é ainda significativa. Neste caso, as bactérias lácticas que entram na preparação de inseminação são todas homofermentativas de maneira a eliminar o risco de produção de acidez volátil.

Além disso, o processo de conversão do ácido málico em ácido láctico objecto do presente invento, é concretizado de preferência com a ajuda de uma preparação de bactérias lácticas que possuem uma ou várias das características seguintes (sendo ideal que as possuam simultaneamente): - não produzam amina biogénica a partir de precursores aminados - não degradam o glicerol - não degradam o ácido tartárico

As preparações bacterianas utilizadas no processo reivindicado são preparadas a partir de uma ou várias estirpes que pertencem aos géneros Lactobacillus ou 17 ΕΡ1631657Β1

Pediococcus e podem ser escolhidas entre as espécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbruckii, Pediococcus acidilactici, Pediococcus damnosus Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus, Pediococcus cerevisiae.

Em particular podem ser utilizadas uma ou várias estirpes de bactéria maloláctica seleccionada no grupo composto de Lactobacillus plantarum CNCM 1-2924 e Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M.

Por exemplo, poder-se-á adicionar a um vinho de pH superior ou igual a 3,7 cuja concentração em álcool é superior a 11%, uma preparação de bactérias malolácticas que compreende Lactobacillus plantarum CNCM 1-2924.

Também se poderá inocular um vinho de pH superior ou igual a 3,7 cuja concentração em álcool é superior a 12% com uma preparação de bactérias malolácticas que compreende Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M.

Concentrações economicamente aceitáveis são da ordem de 5.105 a 5.107 UFC/ml de vinho. De preferência inocula-se o vinho com 2.106 de UFC/ml. As bactérias lácticas ou as preparações de bactérias lácticas são introduzidas directamente no meio de fermentação sem etapa prévia de aclimatização. Quando as bactérias são adicionadas no vinho sob a forma liofilizada, experimentam uma simples reidratação durante uma vintena de minutos. 0 presente invento pode ser utilizado para produzir um vinho maduro obtido com a ajuda de uma preparação de bactérias lácticas tais como as descritas precedentemente. 18 ΕΡ1631657Β1

Os exemplos seguintes permitirão ilustrar mais pormenorizadamente a realização do invento e os resultados obtidos. De notar que os modos de realização que incluem a estirpe lactobacillus plantarum DSM 9916 só são fornecidos a titulo ilustrativo. EXEMPLO 1

Protocolo de selecção das estirpes

Foi realizado um rastreio de estirpes naturais de bactérias lácticas provenientes de vinhos fermentados ou de sumos de frutas fermentados. Foram submetidos a pressões de selecção, isolados de bactérias lácticas naturais, consoante os seguintes critérios: - resistência a taxas de álcool h 10% - Crescimento a baixa temperatura (15°C) - Não formação de aminas biogénicas - Não degradação do glicerol - Não degradação do ácido tartárico EXEMPLO 2

Determinação da resistência ao etanol

As bactérias malolácticas são cultivadas num caldo CMB. 0 pH do meio é ajustado a 3,5 com soda 6N. Os tubos de ensaio são enchidos com 5 ml de meio CMB e de seguida ficam em autoclave durante 15 minutos a 121°C. Após arrefecimento, os niveis de álcool são ajustados com etanol puro a: 4%, 6%, 8%, 10%, 12% e 14%. Os tubos são inoculados a 0,5% com uma 19 ΕΡ1631657Β1 cultura MRS cultivada durante 48 h (Garvie, 1967, J. gen. Microbiol, vol. 48, pp. 431-4.38). O crescimento é seguido por medição da turbidez a 600 nm após 3 semanas. EXEMPLO 3

Determinação do crescimento a baixa temperatura O crescimento a baixa temperatura, é testado no mesmo meio consoante o mesmo protocolo que o utilizado para a determinação da resistência ao álcool descrito no Exemplo 1. O crescimento é acompanhado por medição da turbidez a 600 nm após depois de 3 semanas. EXEMPLO 4

Rastreio de produção de aminas biogénicas a partir de ácidos aminados A selecção de estirpes que não produzem as aminas biogénicas foram realizadas por cultura num meio modelo ME CM. As aminas biogénicas que foram procuradas são as que se encontram mais frequentemente em quantidade significativa nos vinhos: a histamina, a tiramina, a putrescina e a cadaverina. Para seleccionar as estirpes que não produzem aminas biogénicas, estas são cultivadas num meio modelo MECM suplementado com ácidos aminados precursores, a saber, a histidina para a histamina, a tirosina para a tiramina, a omitina para a putrescina e a lisina para a cadaverina. 20 ΕΡ1631657Β1

Composição do meio modelo Concentrações (g/1) Triptona O O \—1 Extracto de levedura 4,0 Tampão 80 1,0 MgS04, 7 H20 0,2 Mn S 0 4, 4H20 0,05 Pantotenato de Cálcio 0,01 Glucose 5, 0 Frutose 5, 0 Ácido L-málico 4,0 0 pH é ajustado a 5,0 com HCL ou NaOH e o meio é colocado em autoclave a 115°C durante 30 min. É adicionada ao meio modelo, uma solução-mãe de ácidos aminados precursores com 100 mg/1, esterilizada por filtração. A concentração final do meio modelo suplementado é de: - histidina 10 mg/1 - tirosina 10 mg/1 - omitina 10 mg/1 - lisina 10 mg/1 São realizadas pré-culturas das estirpes de bactérias lácticas num meio MRS e depois as células são lavadas num tampão fosfato e repostas em suspensão no mesmo volume de tampão fosfato. O meio modelo suplementado é seguidamente inoculado a 1% com as estirpes a testar. Depois da realização da FML (degradação do ácido málico), as amostras são centrifugadas e os sobrenadantes são congelados para a análise das aminas biogénicas. Só são conservadas as bactérias que não formam aminas biogénicas a partir dos ácidos aminados precursores. 21 ΕΡ1631657Β1 EXEMPLO 5

Controlo do metabolismo do glicerol e do ácido tartárico 0 estudo da degradação do ácido tartárico e do glicerol é realizado no meio MECMb, como segue

Composição do meio MECMb Concentração (g/1)

Triptona 10,0 Extracto de levedura 4,0 Tampão 80 1,0 MgS04, 7 H20 0,2 MnS04, 4H20 0,05 Pantotenato de Cálcio 0,01

Os diferentes compostos seguintes são adicionados ao meio MECMb para obtenção de diferentes meios suplementados:

Composto Concentração (g/1) Glucose 5, 0 Frutose 5, 0 Glicerol 5, 0 TMC: ácido tartárico + ácido málico + ácido cítrico Ácido tartárico 7,0 Ácido málico 4,0 Ácido cítrico 4,0 22 ΕΡ1631657Β1 A degradação é testada nas diferentes combinações seguintes:

Combinação Meio 1 MECMb 2 MECMB + TMC 3 MECMb + TMC + glucose 4 MECMb + TMC + frutose 5 MECMb + TMC + Glicerol 6 MECMb + TMC + glucose + frutose + glicerol

As bactérias previamente cultivadas em meio MRS são lavadas e são utilizadas para inocular os meios MECMb suplementados a 1% (v:v) . As culturas são incubadas a 28°C durante 7-15 dias e os metabolitos formados são analisados. Só são conservadas as bactérias que não degradam nem o ácido tartárico nem o glicerol. EXEMPLO 6

Ensaios de liofilização

As estirpes gue deram uma resposta positiva ao conjunto dos critérios de selecção são testadas com o objectivo de uma produção sob a forma liofilizada. Duas, estirpes de lactobacillus plantarum e uma estirpe de Pediococcus com as caracteristicas dadas, foram produzidas sob a forma liofilizada para a inoculação directa dos vinhos. A estirpe Lactobacillus plantarum DSM 9916 foi isolada num vinho Chardonnay californiano, a estirpe Lactobacillus plantarum CNCM 1-2924 foi isolada a partir de um mosto de frutas 23 ΕΡ1631657Β1 destinado a ser destilado, que foi conservado por adição de ácido e de SO2. EXEMPLO 7

Tolerância ao álcool A tolerância ao etanol foi testada no meio CMB para as seguintes estirpes: - as 2 estirpes seleccionadas de Lactobacillus plantarum CNCM I-292A e DSM-9916, - a estirpe seleccionada de Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M, uma estirpe comercial de Lactobacillus plantarum (Viniflora) preconizada para a inoculação de sumo,

- a estirpe de lactobacillus plantarum CNCM MA 18/5U comercializada para alimentação de animais, a estirpe de Lactobacillus casei CNCM MA 542/2V comercializada para a alimentação humana, - a estirpe de Oenococcus oeni EQ54 comercializada por Lallemand para a inseminação directa.

As células foram cultivadas em meio CMB contendo 0%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, e 14% de álcool etílico. O crescimento bacteriano foi determinado com 21 dias por medição espectrofotométrica da densidade óptica DO a 600 nm. 24 ΕΡ1631657Β1 A tolerância ao álcool TA(x) das estirpes na presença de uma quantidade de álcool x% é representada pela taxa de sobrevivência depois de 21 dias em meio alcoolizado relacionado com a taxa de sobrevivência depois de 21 dias num meio sem álcool. TA(x) = DO com x% de álcool / DO com 0% de álcool

Os resultados são apresentados no Quadro 1 QUADRO 1

Taxa de sobrevivência (%) aos teores Estirpes 4% 6% 8% em álcool 10% 12% 14% L. pl. CNCM 1-2924 90 76 71 66 62 3 L. pl. DSM-9916 88 84 71 68 57 3 P. acid. CNCM-MA 18/5m 114 106 102 71 46 8 L. pl. Viniflora 119 96 75 41 6 6 L. pl. CNCM MA 18/5U 82 68 52 25 6 4 L. cas. CNCM MA 542/2V 96 134 78 10 7 7 Oe. Oeni EQ54 100 100 95 87 78 77

Entre as estirpes Lactobacillus plantarum e Pediococcus acidilactici só as estirpes seleccionadas de L.Plantarum DSM-9916 e CNCM 1-2924 e a estirpe P. acidilactici CNCM-MA18/SM têm uma taxa de sobrevivência superior a 50% depois de 21 dias num meio contendo 10% de álcool, e podem desenvolver-se com concentrações em álcool superiores a 12%. Estes valores são igualmente alcançados com a estirpe Oe.oeni EQ54. 25 ΕΡ1631657Β1 EXEMPLO 8

Degradação do ácido málico por L.plantarum CNCM 1-2924 A FML foi realizada com a ajuda da estirpe L.plantarum CNCM 1-2924 por inoculação directa sob forma liofilizada à razão de 2,0.101 2 3 4 5 6 7 UFC/ml após realização da fermentação alcoólica nos vinhos seguintes: - vinho de teste pH =3,6 - vinhos das Vinhas de Buzet, pH = 3,54

Os ensaios são realizados no laboratório, em frascos de 200 ml.

Preparação do vinho de teste 26 1 O vinho foi fabricado a partir de sumo de uvas comerciais em três etapas: A) Vinificação: 2 0 sumo é suplementado por 70 g/1 de dextrose. 3 0 sumo é inoculado com 20g/hl de levedura seca 4 activa Lalvin CY3079; a levedura é previamente 5 reidratada num pequeno volume de fruta a 30°C durante 30 minutos. 6 3 - A fermentação é conduzida a uma temperatura 7 compreendida entre 20 e 25°C. ΕΡ1631657Β1 4 - Após uma semana, é medida a concentração em açúcares residuais. Se a concentração em açúcares residuais é inferior a 2g/l, o vinho é clarificado. B) Clarificação: 1- 0 vinho é clarificado por centrifugação (8500 rpm, 10 mn) 2- 0 vinho é colocado a 4°C durante 8 dias. 3 - Os cristais de ácido tartárico são eliminados por centrifugação (8500 rpm, 10 mn) C) Normalização 0 vinho é analisado após fermentação alcoólica e antes de inoculação de preparações liofilizadas de L.plantarum DSM-9916, o pH é ajustado a 3, 6, o teor em ácido málico é levado a 5 g/1. O vinho de teste assim obtido tem as características seguintes: Álcool (% vol.) 11, 94 Açúcares residuais (g/1) O O S02 livre (mg/1) 4 S02 total (mg/1) 5 Ácido acético (g/1) 0,23 PH 3,8 ajustado a 3,6 Acidez total (g/1 H2S04) 5, 0 Ácido málico (g/1) 3.1 levado a 5,0 27 ΕΡ1631657Β1

Vinho tinto (Vinhas de Buzet) 0 vinho tinto utilizado é um vinho comercial produzido pelas vinhas de Buzet. 0 vinho foi apenas filtrado e conservado a 4°C. 0 vinho foi analisado após fermentação alcoólica e antes de inoculação de preparações liofilizadas de L.plantarum DSM-9916. Álcool (% vol.) 12,30 Açúcares residuais (g/1) 0,5 S02 livre (mg/1) 4 S02 total (mg/1) 5 Ácido acético (g/1) 0,17 pH 3,54 Acidez total (g/1 H2S04) 3,6 Ácido málico (g/1) 1,5 A preparação bacteriana liofilizada é reidratada em água a 22°C durante 20 minutos. A solução é seguidamente adicionada directamente no vinho após fermentação alcoólica. A sobrevivência no vinho e a degradação do ácido málico são medidas até ao esgotamento do substrato. Para cada vinho, foram realizados dois ensaios. Um lote não inseminado serviu de prova.

Taxa de sobrevivência O quadro 2 dá os resultados das taxas de sobrevivência de L.plantarum CNCM 1-2924, 2 dias e 14 dias após inoculação. 28 ΕΡ1631657Β1

Quadro 2

Vinho Inocula -ção População no DO População no D2 % de sobrevivência População % de sobrevivência (UFC/ml) (UFC/ml) (UFC/ml) no D2 (UFC/ml) no D14 (UFC/ml) no D14 Teste 2.0E6 2.1E6 1.9E6 90 1. 8E6 86 Teste 2.0E6 2.1E6 1. 85E6 89 1.65E6 79 Buzet 2.0E6 1.9E6 1.6E6 84 1.7E6 89 Buzet 2.0E6 1.95E6 1.7E6 87 1.6E6 82

Degradação do ácido málico A dosagem do ácido málico é realizada para cada ensaio com intervalos regulares com a ajuda de um conjunto de dosagem (conjunto E 0139068, Boehringer Mannheim, Alemanha). A Figura 1 mostra a cinética de degradação do ácido málico no vinho de teste com pH =3,6 após inoculação de uma preparação liofilizada de L.plantarum CNCM 1-2924. A Figura 2 mostra a cinética de degradação do ácido málico no vinho de Buzet após inoculação com uma preparação liofilizada de plantarum CNCM 1-2924. EXEMPLO 9

Degradação do ácido málico por L.plantarum DSM-9916 A FML foi realizada com a ajuda da estirpe L.plantarum DSM-9916 por inoculação directa sob forma liofilizada à razão de 3,0.106 UFC/ml, após realização da fermentação alcoólica no mesmo vinho tinto das Vinhas de Buzet com pH = 3,54 que o utilizado no exemplo precedente. O vinho Buzet foi preparado como precedentemente e possui as mesmas 29 ΕΡ1631657Β1 características químicas (ver exemplo 8). 0 ensaio foi conduzido consoante o mesmo protocolo.

Taxa de sobrevivência: 0 quadro 3 dá os resultados das taxas de sobrevivência de L.plantarum CNCM 1-2924, 2 dias e 14 dias após inoculação. QUADRO 3

Inocula- Vinho ção (UFC/ml) População no D0 (UFC/ml) População no D2 (UFC/ml) % de sobrevivência no D2 População no D14 (UFC/ml) % de sobrevivência no D14 Buzet 3.0E6 2.3E6 2.3E6 97 1.8E6 78 Buzet 3.0E6 3.1E6 2.1E6 68 1.8E6 58 Degradação do ácido málico: A dosagem do ácido málico é realizada para cada ensaio com intervalos requlares com a ajuda de um conjunto de dosagem (conjunto E 0139068, Boehringer Mannheim, Alemanha). A figura 3 mostra a cinética de degradação do ácido málico no vinho de Buzet após inoculação de uma preparação liofilizada de L.plantarum DSM-9916. EXEMPLO 10

Degradação do ácido málico num vinho Cabernet por L. plantarum DSM 9916 e P. acidilactici CNCM MA-18/5M -Comparação com Oe.oenl EQ54. A FML foi realizada num vinho Cabernet Sauvignon do Chile em 2002, de pH 3,7. Os ensaios foram conduzidos em quatro pipas de 2251: 30 ΕΡ1631657Β1 - vinho inseminado com a ajuda da estirpe L.plantarum DSM 9916, - vinho inseminado com a ajuda da estirpe P.acidilactici CNCM MA-18/5M, - vinho inseminado com a ajuda da estirpe OE.oeni EQ54, - vinho de prova, não inseminado. 0 vinho foi analisado após fermentação alcoólica e antes de inoculação de preparações liofilizadas de bactérias lácticas. Álcool (% vol.) 12, 9 Açúcares residuais (g/D 0,3 S02 livre (mg/1) 6 S02 total (mg/1) 13 pH 3,7 Acidez málico (g/1) 1, 90 Ácido láctico (g/1) 0,08

As estirpes foram inoculadas sob a forma liofilizada à razão de 2,0.106 UFC/ml, a 18°C, directamente no vinho após realização da fermentação alcoólica. A dosagem do ácido málico foi realizada para cada ensaio com intervalos regulares com a ajuda de um conjunto de dosagem (conjunto E 0139068, Boehringer Mannheim, Alemanha). Os resultados são apresentados na Figura 4.

As cinéticas de degradação do ácido málico indicam uma boa implantação das estirpes DSM 9916 e CNCM MA-18/5M e um arrangue precoce e eficaz da actividade fermentativa. O 31 ΕΡ1631657Β1 ensaio de prova mostra que neste vinho com pH relativamente elevado (pH = 3,1), a FML é desencadeada espontaneamente logo nos primeiros dias. No ensaio realizado com inseminação por Oe.oeni, a cinética de degradação do ácido málico é muito próxima da do ensaio de prova, o que significa que se desenvolveram estirpes indígenas indesejáveis muito rapidamente para suplantar Oe.oeni. O controlo da FML que garante a segurança fermentar só foi obtido com as estirpes L.plantarum DSM 9916 e P.acidilactici CNCM MA-18/5M. EXEMPLO 11

Degradação do ácido málico num vinho Tempranillo por L.plantarum CNCM 1-2924 - Comparação com Oe.oeni EQ54. A FML foi realizada num vinho Tempranillo de Rioja (Espanha) em 2002, de pH 3,9. Nos vinhos desta região assiste-se frequentemente ao desencadear espontâneo da FML que se traduz geralmente por taxas elevadas de aminas biogénicas. Os ensaios foram conduzidos em 3 pipas de 225 1. - vinho inseminado com a ajuda da estirpe L.plantarum CNCM 1-2924, - vinho inseminado com a ajuda da estirpe Oe.oeni EQ54, - vinho de prova, não inseminado. O vinho foi analisado após fermentação alcoólica e antes de inoculação de preparações liofilizadas de bactérias lácticas. 32 ΕΡ1631657Β1 Álcool (% VOl.) Açúcares residuais (g/1) 11, 98 0,2

S02 livre (mg/1) S02 total (mg/1) pH 4 11 3, 9 2,35 0, 05 Ácido málico (g/1) Ácido láctico (g/1)

As estirpes foram inoculadas directamente sob a forma liofilizada à razão de 2,0.106 UFC/ml, a 18°C, após realização da fermentação alcoólica. A dosagem do ácido málico é realizada para cada ensaio com intervalos regulares com a ajuda de um conjunto de dosagem (conjunto E 0139068, Boehringer Mannheim, Alemanha). Em paralelo, o crescimento bacteriano foi medido nas três cubas. Os resultados são apresentados nas Figuras 5 e 6. A cinética de degradação do ácido málico (Figura 5) mostra uma indução rápida da fermentação com L.plantarum CNCM 1-2924. Em contrapartida, a FML, só arranca depois de 10 dias na cuba inseminada com Oe.oeni EQ54 e na cuba de prova: Não se observa diferença entre estes dois ensaios, o que significa que se desenvolveram estirpes indígenas indesejáveis muito rapidamente para suplantar Oe.oeni. O acompanhamento do crescimento celular (Figura 6) mostra por outro lado que a população de Oe.oeni EQ54 não decaiu durante a inoculação no vinho e permaneceu ao mesmo nível que a população de L.plantarum. Pode portanto atribuir-se o atraso de arranque da FML por Oe.oeni apesar de uma concentração celular a priori satisfatória, com uma 33 ΕΡ1631657Β1 ΕΡ1631657Β1 nas . A ;rio incapacidade de induzir uma actividade fermentativa condições de forte concentração alcoólica e pH elevado taxa de sobrevivência não constitui neste caso, o crité decisivo para assegurar um controlo eficaz da FML.

Lisboa, 25 de Outubro de 2013 34

Claims

ΕΡ1631657Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe de bactéria láctica seleccionada pertencente ao género Lactobacillus ou Pediococcus, tendo a capacidade de realizar a conversão do ácido málico em ácido láctico sendo a referida bactéria caracterizada por, quando é introduzida com uma concentração compreendida entre 106 e 5.107 UFC/ml, directamente no estado seco, liofilizado ou congelado num vinho que tem um grau de álcool de 10% ou mais e um pH superior ou igual a 3,5, i) - converte pelo menos 5% e de preferência pelo menos 10% do ácido málico em ácido láctico em 5 dias após inoculação do referido vinho, e ii) - converte pelo menos 10% e de preferência pelo menos 25% do ácido málico em ácido láctico em 10 dias após inoculação do referido vinho.
2. Estirpe de bactéria láctica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por, quando é introduzida com uma concentração compreendida entre 106 e 5.107 UFC/ml directamente no estado seco, liofilizado ou congelado num vinho que tem um grau de álcool de 10% ou mais e um pH superior ou igual a 3,6: iii) - converte pelo menos 10% e de preferência pelo menos 15% do ácido málico em ácido láctico em 5 dias após inoculação do referido vinho e iv) - converte pelo menos 25% e de preferência pelo menos 40% do ácido málico em ácido láctico em 10 dias após inoculação do referido vinho. 1 ΕΡ1631657Β1
3. Estirpe de bactéria láctica de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizada por ser homofermentativa.
4. Estirpe de bactéria maloláctica de acordo com uma das reivindicações precedentes que possui adicionalmente uma ou várias das caracteristicas seguintes: - não produz amina biogénica a partir de precursores aminados - não degrada o glicerol - não degrada o ácido tartárico.
5. Estirpe de bactéria láctica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ter a capacidade, quando é introduzida directamente com uma concentração de 2.101 UFC/ml num vinho com uma temperatura superior ou igual a 18°C que tem um teor em SO2 compreendido entre 0 e 15 mg/1, um teor em álcool superior ou igual a 10% e um pH de 3,7 ou mais i) - converter 15% do ácido málico em ácido láctico em 5 dias após inoculação do referido vinho, e ii) - converter 40% do ácido málico em acido láctico em 10 dias após inoculação do referido vinho. 2 1 Estirpe de bactéria láctica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ter a capacidade, quando é introduzida directamente com uma concentração de 2.106 UFC/ml num vinho com uma temperatura superior ou igual a 18°C, que tem um teor ΕΡ1631657Β1 em SO2 compreendido entre 0 e 15 mg/1, um teor em álcool superior ou igual a 10% e um pH de 3,7 ou mais i) - converter 50% do ácido málico em ácido láctico em 5 dias após inoculação do referido vinho, e ii) - converter 80% do ácido málico em acido láctico em 10 dias após inoculação do referido vinho.
7. Estirpe de bactéria maloláctica de acordo com uma das reivindicações precedentes seleccionada no grupo formado de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbruckii, Pediococcus acidilactici, Pediococcus damnosus Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus, Pediococcus cerevisiae.
8. Estirpe de bactéria maloláctica de acordo com a reivindicação precedente escolhida no grupo composto de Lactobacillus plantarum CNCM 1-2924, ou Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M.
9. Preparação de bactérias lácticas que compreende uma ou várias estirpes de acordo com uma das reivindicações precedentes.
10. Processo de conversão do ácido málico em ácido láctico num vinho que tem um pH superior ou igual a 3,5 que consiste em introduzir uma preparação de bactérias lácticas de acordo com a reivindicação 9, directamente no estado seco, liofilizado, ou congelado no referido vinho, com uma concentração compreendida entre 106 e 5.107 UFC/ml, com uma temperatura superior ou igual a 18°C quando o grau de álcool alcançou pelo menos 10% e em manter o vinho em condições que 3 ΕΡ1631657Β1 permitem o desenvolvimento da FML para obter um vinho maduro que tem um teor em ácido málico inferior a 0,2 g/1.
11. Processo de conversão do ácido málico em ácido láctico num vinho que tem um pH superior ou igual a 3,5 que consiste em introduzir uma preparação de bactérias lácticas que compreendem uma ou várias estirpes de acordo com a reivindicação 3, directamente no estado seco, liofilizado, ou congelado no referido vinho, com uma concentração compreendida entre 106 e 5.107 UFC/ml, com uma temperatura superior ou igual a 18°C quando o grau de álcool alcançou pelo menos 5% e em manter o vinho em condições que permitem o desenvolvimento da FML para obter um vinho maduro que tem um teor em ácido málico inferior a 0,2 g/1.
12. Processo de conversão do ácido málico em ácido láctico de acordo com uma das reivindicações 10 ou 11, no qual a referida preparação possui adicionalmente uma ou várias das caracteristicas seguintes: - não produz amina biogénica a partir de precursores aminados - não degrada o glicerol - não degrada o ácido tartárico.
13. Processo de conversão do ácido málico em ácido láctico de acordo com uma das reivindicações 10 a 12, no qual a referida preparação compreende uma ou várias estirpes de bactéria maloláctica seleccionada no grupo formado de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbriickii, Pediococcus acidilactici, Pediococcus damnosus 4 ΕΡ1631657Β1 Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus, Pediococcus cerevisiae.
14. Processo de conversão do ácido málico em ácido láctico de acordo com uma das reivindicações 11 a 13, no qual a referida preparação compreende uma ou várias estirpes de bactéria maloláctica seleccionada no grupo composto de Lactobacillus plantarum CNCM 1-1924 e Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14 no qual uma preparação de bactérias malolácticas que compreende Lactobacillus plantarum CNCM 1-2924 é adicionada a um vinho de pH superior ou igual a 3, 9 cuja concentração em álcool é superior a 11%.
16. Processo de acordo com a reivindicação 14 no qual uma preparação de bactérias malolácticas que compreende Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M é adicionada a um vinho de pH superior ou igual a 3,7 cuja concentração em álcool é superior a 12%. Lisboa, 25 de Outubro de 2013 5