PT1587907E

PT1587907E - Biblioteca de domínios de kunitz

Info

Publication number: PT1587907E
Application number: PT04700617T
Authority: PT
Inventors: Robert Charles Ladner; Andrew Nixon
Original assignee: Dyax Corp
Priority date: 2003-01-07
Filing date: 2004-01-07
Publication date: 2011-04-08
Also published as: US20040209243A1; US20080020394A1; JP2010162030A; EP1587907A4; EP2290107A1; WO2004063337A2; ATE500345T1; EP1587907A2; CA2512590A1; DE602004031589D1; DK1587907T3; AU2004204095B2; EP1587907B1; JP2007524348A; AU2004204095A1; ES2362424T3; WO2004063337A3

Description

DESCRIÇÃO "BIBLIOTECA DE DOMÍNIOS DE KUNITZ"

ANTECEDENTES A exposição em fagos pode ser utilizada para identificar ligandos de proteina que interagem com um alvo particular. Esta técnica utiliza partículas de bacteriófagos como veículos para ligação de candidatos a ligandos de proteína aos ácidos nucleicos que os codificam. 0 ácido nucleico codificante é empacotado no bacteriófago e, geralmente, a proteína codificada fica á superfície do fago. A exposição em fagos é descrita, por exemplo, em Ladner et al., Patente U.S. N° 5223409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; documentos WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; W092/15679; documento WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; e Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8. Outros métodos de avaliação de proteína, e. g., matrizes de proteína, podem também ser utilizados para identificar ligandos úteis.

Uma variedade de plataformas pode ser utilizada como um molde para identificar ligandos úteis. As plataformas úteis podem incluir posições de aminoácidos que contribuem para uma estrutura de plataforma estável e outras posições que podem ser variadas para produzir um sítio de ligação que interagem com um alvo. 1

Além disso o documento US 6423498 Bl refere-se a uma biblioteca de péptidos do domínio de Kunitz variada e sua utilização.

Além disso, Markland W et al. (Biochemistry 18 Jun 1996, vol. 35, n° 24) divulga "optimização iterativa de inibidores de proteases com elevada afinidade utilizando a exposição em fagos. 1. Plasmina".

Além disso, Clackson τ e Wells J (Trends in Biotechnology, vol. 12, 1994, página 173) descrevem a "Selecção in vitro a partir de bibliotecas de proteínas e péptidos".

SUMARIO São divulgadas bibliotecas, vectores, partículas de fago, células hospedeiras e métodos para expor um domínio de Kunitz. Uma biblioteca exemplificativa é uma biblioteca de fago que inclui partículas de fago que incluem genes de fago suficientes para produzir partículas de fago e uma proteína exposta que possui uma variedade do domínio de Kunitz. 0 domínio de Kunitz pode variar em, pelo menos, duas ansas de interacção, no que respeita a outros membros da biblioteca. Em uma forma de realização, os domínios de Kunitz variados podem ser expostos no fago filamentoso com uma valência baixa. Numa forma de realização, a valência baixa é proporcionada por um ácido nucleico de fago que inclui uma sequência que codifica a proteína exposta em fusão com um domínio funcional de uma proteína da cápsula menor e uma sequência que produz uma proteína equivalente que também inclui o domínio funcional. 2

Num aspecto, a invenção caracteriza uma biblioteca que inclui uma pluralidade de partículas de fago filamentoso como definido nas reivindicações. Cada partícula de fago da pluralidade inclui (i) uma proteína exposta que compreende um domínio de Kunitz, (ii) um ácido nucleico que inclui (a) opcionalmente, genes de fago suficientes para produzir uma partícula infecciosa de fago e (b) uma sequência que codifica a proteína exposta. 0 domínio de Kunitz inclui, pelo menos, uma posição de aminoácido variada em cada uma de duas ansas de interacção. As posições nas respectivas ansas são variadas entre as partículas da pluralidade. 0 número médio de cópias do domínio de Kunitz por partículas de fago da pluralidade é inferior a 2,0. O domínio de Kunitz pode ser, pelo menos, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100% idêntico a um domínio de Kunitz humano (e. g. LACI-Kl) em posições de aminoácidos que não são variadas. Numa forma de realização, entre um e quinze, e. g., cinco e doze posições de aminoácidos são variadas de entre as partículas da pluralidade. Por exemplo, pelo menos, as posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 16, 17, 18, 19, 34 e 39 de LACI-Kl humano são variadas de entre as partículas da pluralidade. Em outro exemplo, pelo menos as posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34 e 39 de LACI-Kl humano são variadas de entre as partículas da pluralidade. Ainda noutro exemplo, pelo menos seis, sete ou oito posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 32, 34, 39, 40 e 46 de LACI-Kl humano são variadas de entre as partículas da pluralidade. Apenas as posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39 e 40 de LACI-Kl 3 humano podem ser variadas de entre as partículas da pluralidade, ou apenas 16, 17, 18, 19, 34 e 39, ou apenas 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34 e 39, ou outras combinações.

Cada domínio de Kunitz na pluralidade pode incluir, pelo menos, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100% dos domínios de Kunitz na pluralidade podem incluir resíduos conservados de Kunitz ou altamente conservados de Kunitz em algumas (e. g., 50, 60, 80 ou 90%) ou todas as posições variadas. Cada domínio de Kunitz na pluralidade pode incluir, pelo menos, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou, 100% dos domínios de Kunitz na pluralidade podem incluir resíduos conservados de Kunitz ou altamente conservados de Kunitz em algumas (e. g., 50, 60, 80 ou 90%) ou todas as posições invariantes. Numa forma de realização, os aminoácidos nas posições 32 e 46 são invariantes. O grau de variações pode diferir em diferentes posições variadas. Por exemplo, a posição de aminoácido correspondente à posição do aminoácido 40 pode ser variada entre G e A. Se a posição 40 não é variada, então pode ser restrita a G ou A, por exemplo. Outras posições variadas podem ser variadas, de forma variada, entre todos os aminoácidos, todos os aminoácidos não cisteína, todos os aminoácidos excepto C e P, aminoácidos excepto P-l o 2 G, hidrofóbicos, alifáticos, hidrofílicos e carregados. Numa forma de realização, a proteína exposta inclui um domínio funcional de uma proteína menor da cápsula fundida com o domínio de Kunitz e os genes de fago incluNum gene que codifica a proteína menor da cápsula que não está fundida (i') com uma sequência de aminoácidos não virai de, pelo menos cinco aminoácidos ou (ii') não fundida uma sequência de aminoácidos 4 variada. Por exemplo, os genes de fago podem incluir uma cópia de tipo selvagem do gene que codifica a proteína menor da cápsula endógena do bacteriófago. Geralmente, os genes de fago podem ser cópias de tipo selvagem ou suas variantes funcionais.

Além da à pluralidade de partículas de fago caracterizadas acima, podem estar presentes outras partículas de fago, incluindo, por exemplo, partículas inactivas que não possuem componente de ácido nucleico.

Em outro aspecto, é descrita uma biblioteca que inclui uma pluralidade de partículas de fago. Cada partícula de fago da pluralidade inclui (i) uma proteína exposta que compreende um domínio de Kunitz e, pelo menos, uma porção do gene III da proteína da cápsula do fago, (ii) um gene III funcional da proteína da cápsula do fago e (iii) um ácido nucleico que inclui (a) opcionalmente, genes de fago suficientes para produzir uma partícula infecciosa de fago e (b) uma sequência que codifica a proteína exposta. 0 domínio de Kunitz pode incluir uma sequência que é, pelo menos, 50, 60, 70, 80, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 100% idêntica a MHSFCAFKADX11GX13CX15X16X17X16X19RFFFNIFTRQCEEFX34YGGCX39X40NQNRFESLEEC KKMCTRDGA, em outras posições, além de X (SEQ ID N°:10). Por exemplo, X11 é um de: A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y;

Xi3 é um de: A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; 5

Xl5 é um de: A, D, E, F, G, H, 1/ K, L, M, N, Q, R, S, T, v, w, y; Xl6 é um de: A, G, E, D, Η, T f Xl7 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, v, w, Y; Xl8 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, w, y; Xl9 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, w, y; X34 é um de: A, c, D, E, F, G, H, 1/ K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, w, y; X39 é um de: A, c, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, w, y; e X 0 é um de: G, A. Pelo menos dois de X11, Xl3, Xl5, Xi6 / X 17, Xis, X 19, X34, X3 9 e X4o podem variar entre as partículas da pluralidade. As, pelo menos duas posições variadas estão tipicamente nas primeira e segunda ansas de interacção do domínio de Kunitz de modo que a variação pode estar presente em ambas as ansas. Se uma posição X não variar, pode, por exemplo, ser fixada a um dos aminoácidos listados acima para a respectiva posição. Se uma posição X variar, pode variar de entre as posições de aminoácidos listadas acima ou entre outras combinações possíveis. 6

Numa forma de realização, a proteína exposta inclui o toco da proteina da cápsula do gene III. Os genes de fago incluNum gene que codifica uma proteina da cápsula do gene III de tipo selvagem.

Numa forma de realização, a biblioteca possui uma diversidade teórica de, pelo menos ΙΟ7, 109, IO10 ou 1011 diferentes dominios de Kunitz e/ou menos do que ΙΟ15, ΙΟ14, 1013, ΙΟ12, 1011 ou IO10 dominios de Kunitz diferentes. Numa forma de realização, a diversidade teórica está entre 105-10n ou entre 103 e 1015 diferentes dominios de Kunitz.

Numa forma de realização, pelo menos as posições dos aminoácidos 15, 16, 17, 18, 34 e 39 são variadas. Em outra forma de realização, pelo menos as posições de aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39 e 40 são variadas. Em outra forma de realização, apenas essas posições são variadas, e. g., apenas 15, 16, 17, 18, 34 e 39 ou 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39 e 40 ou 13, 15, 16, 17; 18, 19, 34, 39 e 40.

Uma biblioteca aqui descrita pode ser utilizada num método de proporcionar um ácido nucleico que codifica um domínio de Kunitz que interage com um alvo. O método inclui, por exemplo, proporcionar a biblioteca; colocar em contacto partículas de fago da biblioteca com um alvo; e opcionalmente, recuperar ácido nucleico a partir de partículas que interagem com o alvo. Por exemplo, o alvo é imobilizado e o passo de recuperação inclui a separação das partículas que interagem com o alvo das partículas que não interagem com o alvo. Os alvos exemplificativos incluem proteases. 7

Em outro aspecto, a invenção caracteriza um ácido nucleico que inclui uma grelha de leitura aberta e um promotor operativamente ligado à grelha de leitura aberta. A grelha de leitura aberta codifica uma proteína exposta incluindo: (i) um primeiro elemento que contém um domínio de Kunitz; e (ii) um segundo elemento que contém uma porção de uma proteína da cápsula do fago, em que a porção é suficiente para fisicamente associar a proteína exposta com uma partícula de fago. 0 ácido nucleico pode ser um vector que contém suficiente informação genética para produzir partículas de fago infecciosas na ausência do fago auxiliar. Por exemplo, o ácido nucleico pode incluir um conjunto de genes de fago suficientes para produzir partículas de fago infecciosas. Por exemplo, o ácido nucleico é um vector de fago.

Numa forma de realização, o promotor é um promotor regulável, e. g., um promotor indutível, e. g., o promotor lac.

Numa forma de realização, a proteína da cápsula é uma proteína menor da cápsula, e. g., a proteína do gene III. A porção da proteína da cápsula pode incluir a porção que se liga fisicamente a uma partícula de fago, tal como um domínio de âncora. Numa forma de realização preferida, a porção da proteína de cápsula é o domínio âncora do gene III ou "toco." Em outra forma de realização, a proteína de cápsula é uma proteína principal da cápsula, e. g., a proteína do gene VIII. Numa forma de realização preferida, o segundo elemento contém a proteína madura, de comprimento total, do gene VIII. Numa forma de realização, a proteína da cápsula porção de (ii) é derivada de um de: a proteína do gene IV, a proteína do gene VII, a proteína do gene IX. 8

Numa forma de realização, o domínio de Kunitz possui um resíduo conservado de Kunitz ou um resíduo altamente conservado de Kunitz em, pelo menos 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% das posições de aminoácidos (ou todas as posições).

Numa forma de realização, o domínio de Kunitz possui, pelo menos, 30% de identidade com um domínio de Kunitz de uma proteína que ocorre naturalmente, e. g., com uma proteína que inclui um domínio de Kunitz aqui referido. O domínio de Kunitz pode ter pelo menos 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade com um domínio de Kunitz de uma proteína que ocorre naturalmente, e. g., de um mamífero, e. g., primata, e. g., proteína humana, e. g., LAC-I.

Por exemplo, pelo menos, duas cisteínas estão presentes no domínio de Kunitz e um persulfureto pode ser formado entre as cisteínas. Por exemplo, se quatro cisteínas estão presentes, formam-se dois persulfureto. Tipicamente, seis cisteínas estão presentes e formam-se três persulfuretos entre as cisteínas. O domínio de Kunitz compreende a seguinte sequência: Χχ-Χ2-X3-X4-C5-X6-X7-X8-X9-X9a-Xl0-Xll-Xl2-Xl3-Cl4-Xl5-Xl6-Xl7-Xl8-Xl9-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27_X28-X29-X29a~X29b-X29c-C30-X31“X32-X33-X34-X35-X36-X37_C38-X39-X40_X41_X42_X42a_X42b_X43_X44_X45_X46_X47_X48X49_X50_C5i—X52“X53_ X54-C55-X56-X57-X58 (SEQ ID N°:2). Pelo menos, quatro ou seis de C5, C14, C30, C38, C51 e C55, são independentemente cisteína. Por exemplo, todos os seis são cisteína. Se quatro forem cisteína, o restante de C5, C14, C3o, C38, C51 e C5 pode ser um outro aminoácido além de cisteína ou ausente. 9

Cada um de X1-X4 é qualquer aminoácido ou ausente. Cada um de X6-Xi3 é qualquer aminoácido mas de um modo preferido, não Cys. X9a é qualquer aminoácido mas, de um modo preferido, não Cys ou ausente. Xi5~X29b é qualquer aminoácido mas, de um modo preferido, não Cys. Cada um de X29a, X29b/· X29C é qualquer aminoácido ou ausente. Cada um de x3i-x37 é qualquer aminoácido mas, de um modo preferido, não Cys. Cada um de X39-X50 é qualquer aminoácido mas, de um modo preferido, não Cys. Cada um de X52-X54 é qualquer aminoácido mas, de um modo preferido, não Cys. Cada um de X56-X58 é qualquer aminoácido ou ausente.

Em algumas formas de realização, o número de resíduos de aminoácidos entre as cisteínas de um domínio de Kunitz é aumentado ou diminuído por menos de cerca de 5 aminoácidos, e. g., por 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos. Por exemplo, os resíduos podem ser inseridos ou removidos em ou entre Χ6-Χι3, Xi5-X29c, X31—X3 71 X39-X50 e X52—X54.

Numa forma de realização, em que C14 ou C30 não é cisteína, então não são ambos cisteina. Numa forma de realização, em que C14 e X9a estão ausentes, Xi2 pode ser G. Numa forma de realização, X37 é G. Numa forma de realização, X33 é F ou Y. Numa forma de realização, X45 é F ou Y. Por exemplo, pelo menos quatro cisteínas estão presentes e podem ser formadas pontes Cys-Cys entre dois C5 e C55, C14 e C38, e C30 e C51. Tipicamente, estão presentes seis cisteínas; e podem ser formadas pontes Cys-Cys entre C5 e C55, C14 e C38, e C3o e C51. 0 conjunto de genes de fago pode incluir um gene que codifica a proteína da cápsula de fago (ii), que é adicional à cópia que está ligada ao domínio de Kunitz (codificado no segundo elemento). Por exemplo, o conjunto de genes pode incluir 10 uma cópia da proteína de cápsula de comprimento total. Numa forma de realização, o ácido nucleico que codifica a porção da proteína da cápsula em (ii) contém nucleótidos que foram alterados para evitar a recombinação com sequências relacionadas, e. g., uma cópia do gene.

Numa forma de realização, cada gene de fago do conjunto está operativamente ligado ao promotor endógeno a cada gene.

Numa forma de realização, C5, Ci4, C30, C38, C5i e C55 estão presentes e Xga, X29a, X29b, X29c, X42a, X42b, estão ausentes.

Em outra forma de realização, X42 é G, X33 é F e X37 é G.

Numa forma de realização, o domínio de Kunitz pode incluir um ou mais das propriedades que se seguem: X2i é um de F, Y e W; X22 é um de F e Y, X23 é um de F e Y; X35 é um de Y e W; X36 é um de G e S. X40 é um de G e A. X43 é um de G e N. X45 é um de F e Y.

Numa forma de realização, o domínio de Kunitz pode incluir uma ou mais das propriedades que se seguem: X2 é M; X2 é H; X3 é X4 é F; Xg é A; x7 é F; Xs é K; X9 é A; X4o é D; X2o é R; X21, X23 são cada F; x24 é N; X25 é I; X26 é F; X27 é T; X28 é R } X29 >; x3i é : E; X35 é y; X36 é G; X41 é N; X42 é Q; X43 é N; X44 é R; é F; X47 é S; X 48 é L; X 49 e X5o são cada E; X52 e X53 são cada X54 é M; X56 é T; X57 é R; e X58 é D.

Numa forma de realização, χ35, Xi7, Xis, X40, X46 são cada, qualquer aminoácido excepto prolina; e Xi6 é um de A, G, E, D, H, T. 11

Numa forma de realização, X32 é E; X34 é I; X39 é E; X40 é G; e X46 é E.

Numa forma de realização, o ácido nucleico inclui ainda um marcador seleccionável (e. g., gene de resistência a antibiótico, gene amp).

Em outro aspecto, é descrita uma biblioteca compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos, em que cada ácido nucleico da pluralidade pode incluir uma ou mais das características aqui descritas. Numa forma de realização, a sequência do domínio de Kunitz varia entre os ácidos nucleicos da pluralidade. A pluralidade pode conter ácidos nucleicos que codificam pelo menos ΙΟ7, 109, IO10 ou 1011 domínios de Kunitz diferentes e/ou menos do que ΙΟ15, ΙΟ14, ΙΟ13, ΙΟ12, 1011 ou IO10 domínios de Kunitz diferentes. Numa forma de realização, a pluralidade contém ácidos nucleicos que codificam pelo menos 105-10n domínios de Kunitz diferentes. A pluralidade pode ser caracterizada por uma diversidade teórica de pelo menos ΙΟ7, 109, IO10 ou 1011 domínios de Kunitz diferentes e/ou menos do que 1015, ΙΟ14, ΙΟ13, ΙΟ12, 1011 ou IO10 domínios de Kunitz diferentes. Numa forma de realização, a diversidade teórica está entre 105-10n domínios de Kunitz diferentes.

Numa forma de realização, a invenção caracteriza uma biblioteca que contém uma pluralidade de ácidos nucleicos, em que C5, C14, C30, C38, C5i e C55 estão presentes e X9a, X29a, X29b, X29c, x42a, X42b, estão ausentes em cada ácido nucleico e em que a sequência do domínio de Kunitz varia, pelo menos, em duas das posições correspondentes a X32 , X34, X39 , X40 e X46 de (SEQ ID N°:2) de entre os membros da pluralidade. 12

Numa forma de realização, a sequência do domínio de Kunitz é invariante numa ou mais posições correspondentes a χη, X12, X15, Xi6, X17, Xis e X19 (de SEQ ID N°: 2). Em outra forma de realização, a sequência do domínio de Kunitz varia numa ou mais posições correspondentes a Xn, Xi2, X15, Χίε, X17, Xis e xi9 de SEQ ID N°:2 entre os membros da pluralidade. Numa forma de realização, a sequência do domínio de Kunitz é invariante numa ou mais posições correspondentes a X32, X34, X39, X40 e X46 de SEQ ID N0:2.

Numa forma de realização, a proteína exposta inclui uma pluralidade de domínios de Kunitz, e. g., uma pluralidade de domínios de Kunitz variados ou domínios de Kunitz variados e, pelo menos, outras sequências variadas.

Em outro aspecto, a invenção caracteriza uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico, em que o ácido nucleico contém uma ou mais das características aqui descritas. A célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana, e. g., uma célula de E. coli.

Em outro aspecto, a invenção caracteriza uma biblioteca compreendendo uma pluralidade de células hospedeiras, em que cada célula hospedeira da pluralidade compreende um ácido nucleico que possui um ou mais das características aqui descritas. Numa forma de realização, a sequência do domínio de Kunitz varia entre os ácidos nucleicos da pluralidade.

Num aspecto, é divulgada uma partícula de fago que contém um ácido nucleico, em que o ácido nucleico pode incluir uma ou mais das características aqui descritas. Numa forma de realização, a 13 partícula contém o domínio de Kunitz fisicamente ligado à superfície.

Em outro aspecto, a invenção caracteriza uma biblioteca contendo uma pluralidade de partículas de fago, em que cada partícula de fago da pluralidade compreende um ácido nucleico que pode incluir uma ou mais das características aqui descritas. Numa forma de realização, a sequência do domínio de Kunitz difere de entre os ácidos nucleicos da pluralidade.

Numa forma de realização, a pluralidade de partículas de fago contém, pelo menos, 103 partículas em que cada uma inclui um ácido nucleico que codifica uma proteína exposta diferente. De um modo preferido, a pluralidade de partículas de fago compreende, pelo menos, 106 partículas em que cada uma inclui um ácido nucleico que codifica uma proteína exposta diferente. De um modo mais preferido, a pluralidade de partículas de fago compreende, pelo menos, 109 partículas em que cada uma inclui um ácido nucleico que codifica uma proteína exposta diferente. Esta medida actual da diversidade pode ser inferior à diversidade teórica da biblioteca.

Numa forma de realização, pelo menos, 20%, 40%, 60% ou 80% das partículas de fago da pluralidade de partículas de fago inclui uma proteína exposta da respectiva partícula de fago fisicamente ligada à partícula de fago. Numa forma de realização, o número de cópias médio de uma proteína exposta é inferior a 3, e. g., inferior a 2,5, 2,0, 1,7, 1,5 ou 1,2. Se, no entanto, as partículas que não incluNuma proteína exposta mas incluNum componente de ácido nucleico apropriado são incluídas na pluralidade, o número de cópias médio da proteína exposta pode ser inferior a 2, 1,5, 1,2, 1,1, 1,0 ou 0,9. Por exemplo, o 14 número de cópias médio está entre 2,4 e 0,5 ou 1,8 e 0,5 ou 1,4 e 0,5.

Em alguns casos, pode ser útil para avaliar uma pluralidade de partículas de fago que exclui as partículas que não incluNuma proteína exposta. Consequentemente, o número de cópias médio não pode ser inferior a um. Nestes casos, o número de cópias médio de uma proteína exposta é inferior a 3, e. g., inferior a 2,5, 2,0, 1,7, 1,5 ou 1,2, e. g., entre 2,5 e 1,0, ou 1,5 e 1,0.

Pode ser preparada uma biblioteca de partículas de fago numa composição líquida, e. g., uma composição aquosa. A composição pode proporcionar um ambiente oxidante, e. g., favorecendo a formação de persulfureto nos domínios de Kunitz. A composição pode ser não viscosa ou possui uma viscosidade suficientemente baixa para permitir a manipulação líquida (e. g., pipetando 10, 5 ou menos, microlitros). Quando os domínios de Kunitz são seleccionados aleatoriamente, a biblioteca pode incluir, pelo menos, 30, 40, 50, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% domínios que são organizados. Um método para determinar a fracção de domínios organizados é expressar os domínios de Kunitz numa célula com um epitopo tag e realizar transferências de Western na fracção solúvel de lisados brutos das células. Os níveis detectáveis do epitopo tag (na proporção molecular apropriada) nas fracções solúveis indicam que foi produzido um domínio de Kunitz organizado. Ver, e. g., Davidson et al. (1994) Proc Natl Acad Sei USA. 91(6):2146-50 .

Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método que inclui: (i) proporcionar a biblioteca que inclui uma ou mais das características aqui descritas, (ii) seleccionar um conjunto de partículas de fago que se ligam ao alvo utilizando a proteína 15 exposta. 0 método pode ser utilizado para seleccionar o fago que codifica uma proteina de ligação ao alvo a partir de uma pluralidade de partículas de fago.

Em várias formas de realização, pelo menos, 10%, 20% ou 40%, de um modo mais preferido, pelo menos 60%, de um modo muito preferido, pelo menos 80% das partículas de fago expõem a proteina exposta à superfície.

Os seleccionados podem incluir: (a) formação de uma mistura contendo as partículas de fago, um alvo e um suporte e (b) separar o fago que não se liga ao alvo dos complexos dos alvos nos fagos imobilizados.

Numa forma de realização, o alvo é uma protease, e. g., uma protease activa ou uma protease inactiva. As proteases inactivas incluem proteases com alterações de aminoácido (e. g., substituições, inserções ou deleções) que reduz parcialmente ou completamente a actividade de protease.

Num aspecto, é descrito um método que inclui: (a) proporcionar uma pluralidade de ácidos nucleicos, em que a pluralidade inclui uma ou mais das características aqui descritas; (b) introduzir, pelo menos, alguns ácidos nucleicos da pluralidade em células hospedeiras; e (c) montar as partículas de fago que empacotam os ácidos nucleicos introduzidos em condições, em que, pelo menos, algumas partículas incorporam a proteína exposta codificada por um respectivo ácido nucleico introduzido. O método pode ser utilizado para proporcionar uma biblioteca de fagos. 16

Em formas de realização em que o ácido nucleico contém um promotor regulável, o método pode ainda incluir a propagação da biblioteca sob condições em que o promotor regulável é reprimido.

Numa forma de realização, os fagos auxiliares não são introduzidos nas células hospedeiras.

Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método que inclui: (i) proporcionar uma biblioteca de fagos, em que a biblioteca pode incluir uma ou mais das caracteristicas aqui descritas; (ii) seleccionar uma partícula de fago que expõe uma proteína exposta que se liga ao alvo; e (iii) recuperar o ácido nucleico partícula de fago seleccionada e, então, identificar uma proteína exposta que se liga ao alvo. Numa forma de realização, o método inclui ainda a expressão de um polipéptido de ligação que inclui o domínio de Kunitz da proteína exposta identificada. 0 método podem ainda incluir a purificação do polipéptido de ligação, a formulação do polipéptido de ligação como uma composição farmacêutica e administração do polipéptido de ligação (e. g., tal como uma composição farmacêutica) a um indivíduo, e. g., um mamífero, e. g., um humano. 0 método pode ser utilizado para identificar uma proteína exposta que se liga ao alvo a partir de uma pluralidade de proteínas expostas. A informação acerca de uma proteína identificada pode ser transmitida, e. g., em forma digital ou recebida. 0 receptor pode produzir a proteína com base na informação.

Em outro aspecto, a invenção caracteriza um ácido nucleico que inclui: (a) um conjunto de genes de fago suficientes para produzir uma partícula infecciosa de fago, (b) uma grelha de leitura aberta e (c) um promotor operativamente ligado à grelha 17 de leitura aberta. A grelha de leitura aberta codifica uma proteína exposta que inclui: (i) um primeiro elemento que contém um domínio de Kunitz; e (ii) um segundo elemento que inclui um ou mais aminoácidos que podem fisicamente associar a proteína exposta com a partícula de fago. 0 segundo elemento pode ser, e. g., uma cisteína que pode formar um persulfureto com uma cisteína na partícula de fago, uma sequência de aminoácidos que interage não covalentemente com a partícula de fago (e. g., para uma interacção fos-jun) ou toda ou uma parte da proteína da cápsula do fago. 0 ácido nucleico pode ser utilizado como aqui descrito. É também divulgado uma proteína contendo um domínio de Kunitz, e. g., uma proteína que inclui um domínio de Kunitz identificado por um método aqui descrito. Por exemplo, a proteína pode ser inferior em comprimento a 200, 100 ou 70 aminoácidos. Pode incluir um único domínio de Kunitz ou múltiplos domínios de Kunitz. O domínio de Kunitz da proteína pode incluir: MHSFCAFKADX11GXi3CXi6Xi6Xi7XibXi9RFFFNIFTRQCEEFX3 4YGGCX3 9X4oNQNRF ESLEECKKMCTRDGA, em outras posições além de X (SEQ ID N°:10), mas diferem da sequência de LACI-K1 em, pelo menos, um resíduo de aminoácido, e. g., em, pelo menos, cinco, seis, sete ou oito das posições 11, 13, 15, 16,17,18, 19, 34 e 39. Por exemplo,

Xn é um de: A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y;

Xi3 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, l, m, n, p, Q, r, S, t, V, W, Y; 18

XlS é um de : A, D , E, F, G, H, 1/ K, L, M, N, Q, R, S, T, V, w, y; Xl6 é um de: A, G, E, D, Η, T } Xl7 é um de : A, D , E, F, G, H, 1, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, w, Y; Xl8 é um de : A, D , E, E, G, H, 1/ K, L, M, N, Q, R/ S, T, V, w, y; Xl9 é um de : A, D , E, F, G, H, I, K, L, M, N, P/ Q, R, S, T, V, w, Y; X34 é um de A, c, D, E , F , G, H, I| , K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, w, y; X39 é um de : A, C , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, w, y; e X40 é um de: G, A. 0 termo "polipéptido" refere-se a um polímero de três ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. 0 polipéptido pode incluir um ou mais aminoácidos não naturais. Tipicamente, o polipéptido inclui apenas aminoácidos naturais. 0 termo "péptido" refere-se a um polipéptido que está entre três e trinta e dois aminoácidos de comprimento.

Uma "proteína" pode incluir uma ou mais cadeias de polipéptido. Consequentemente, o termo "proteína" inclui polipéptidos e péptidos. Uma proteína ou polipéptido podem 19 também incluir uma ou mais modificações, e. g., uma glicosilação, amidação, fosforilação e outras. 0 termo "proteína exposta" refere-se a uma proteína, além de uma proteína de cápsula virai não modificada, fisicamente associada com o ácido nucleico que a codifica. No caso da exposição em fagos, a proteína exposta é fisicamente associada com a partícula de fago que empacota o ácido nucleico que a codifica e, também, inclui uma sequência de aminoácidos de, pelo menos, três aminoácidos que é heteróloga com o bacteriófago. A região heteróloga, mais tipicamente, inclui um domínio estrutural, e. g., um domínio de Kunitz. A associação física pode ser mediada, e. g., por uma ou mais ligações covalentes, e. g., uma ou mais ligações peptídicas ou uma ligação persulfureto. Numa forma de realização, uma proteína exposta inclui pelo menos um domínio funcional de uma proteína de cápsula do fago, de modo que a proteína exposta é incorporada na partícula de fago. 0 termo "partícula virai" inclui vírus que incluNuma informação genética suficiente para produzir partículas progenitoras numa célula hospedeira e partículas virais que podem entrar nas células, mas não podem produzir progenia. 0 termo "partícula de bacteriófago" inclui um bacteriófago que inclui uma informação genética suficiente para produzir partículas progenitoras numa célula hospedeira e partículas de fago que podem entrar em células, mas não podem produzir progenia. Deste modo, o termo "partícula de bacteriófago" inclui as partículas que empacotam um fagemídeo e partículas que empacotam um genoma de fago completo.

Uma "biblioteca de domínio de Kunitz humano" refere-se a uma biblioteca que inclui os diferentes domínios de Kunitz ou o 20 ácido nucleico que codifica estes domínios, em que as posições invariantes de aminoácidos na biblioteca são pelo menos 85% idênticas a um domínio de Kunitz humano particular. As bibliotecas de domínio de Kunitz humano podem ser, pelo menos, 85, 87, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 100% idênticas a um domínio de Kunitz humano particular nas posições de aminoácidos invariantes.

Uma "biblioteca de domínios LACI-Kl" refere-se a uma biblioteca que inclui domínios de Kunitz diferentes ou ácido nucleico que codifica estes domínios, em que as posições de aminoácidos invariantes na biblioteca são, pelo menos, 85% idênticas ao de LACI-Kl humano. As bibliotecas do domínio LACI-Kl podem ser, pelo menos, 85, 87, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 100% idêntico a LACI-Kl nas posições de aminoácidos invariantes. Por exemplo, uma biblioteca a 100% de domínios LACI-Kl refere-se a uma biblioteca em que as posições de aminoácidos invariantes na biblioteca são 100% idênticas às do LACI-Kl humano. A mesma nomenclatura pode ser utilizada para referir bibliotecas que possuNuma relação correspondente a outros domínios de Kunitz, e. g., outros domínio de Kunitz humanos, e. g., um domínio aqui descrito.

Um "sistema de expressão" é uma configuração de sequências de ácido nucleico que incluNuma grelha de leitura aberta e um promotor de modo que a grelha de leitura aberta esteja operativamente ligada ao promotor e a grelha de leitura aberta pode ser expressa como um transcrito que pode ser traduzido.

Os cálculos de homologia ou identidade de sequência entre sequências (os termos são aqui utilizados alternadamente) são efectuados como se segue. A "percentagem de identidade" entre as 21 duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tomando em conta o número de intervalos e o comprimento de cada intervalo, que necessita de ser introduzido para o alinhamento óptimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser conseguida utilizando um algoritmo matemático. A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleótidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453), algoritmo que foi incorporado no programa GAP no pacote de programas de computador GCG, utilizando uma matriz Blossum 62 e peso para intervalo de 12, uma penalidade de extensão de intervalo de 4 e uma penalidade de deslocamento de intervalo de 5.

Geralmente, para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou em duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação óptima (e. g., os intervalos podem ser introduzidos Numa ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos para o alinhamento óptimo e as sequências não homólogas podem ser desprezadas para efeitos de comparação). Numa forma de realização preferida, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para efeitos de comparação é de, pelo menos 30%, de um modo preferido, pelo menos 40%, de um modo mais preferido, pelo menos 50%, 60% e ainda, de um modo mais preferido, pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do comprimento da sequência de referência (e. g., pelo menos 51, 55, 57 ou 58 aminoácidos). Os resíduos de aminoácidos ou nucleótidos em posições de aminoácidos ou posições de nucleótido correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou 22 nucleótido da correspondente posição na segunda sequência, depois as moléculas são idênticas nessa posição (como aqui utilizado a "identidade" do aminoácido ou ácido nucleico é equivalente à "homologia" de aminoácido ou ácido nucleico). 0 programa GAP é utilizado para identificar o alinhamento óptimo entre uma sequência de consulta e uma sequência de referência do domínio de Kunitz (e. g., a sequência LACI-K1) para identificar as posições de aminoácidos "correspondentes".

As "ansas de interacção" de um domínio de Kunitz referem-se à primeira ansa de interacção que inclui as posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 11 a 19 de LACI-Kl e a segunda ansa de interacção que inclui as posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 32 a 40 de LACI-Kl.

Os detalhes de uma ou mais formas de realização da invenção são apresentadas nas figuras anexas e a descrição que se segue. Outras características, objectos e vantagens da invenção serão óbvias a partir da descrição e figuras e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 é um diagrama de um vector de fago exemplificativo, DY3P82, que pode ser utilizado para uma biblioteca de domínios de Kunitz derivados de LACI-Kl exemplificativo. A FIG. 2 é um diagrama da concepção de uma primeira biblioteca exemplificativa. A sequência de aminoácidos está 23 listada como SEQ ID N°:4. Uma determinação aproximada da sequência de ácido nucleico está listada como SEQ ID N°:5. (Contudo, a utilização de codões de trinucleótidos variados pode não ser incorporada na listagem de sequência de ácidos nucleicos). A FIG. 3 é um diagrama da concepção de uma segunda biblioteca exemplificativa. A sequência de aminoácidos está listada como SEQ ID N°: 6. Uma determinação aproximada da sequência de ácidos nucleicos está listada como SEQ ID N°:7. (De novo, a utilização de codões de trinucleótidos variados não pode ser incorporada na listagem de sequência de ácidos nucleicos).

Para as FIG. 2 e 3, os números da posição dos aminoácidos são listadas acima de cada aminoácido. Os nucleótidos correspondentes, sítios de enzima de restrição e sítios de variação são listados abaixo de cada aminoácido. As posições variáveis também contêm um segundo número, indicando o número possível de aminoácidos permitidos nessa posição. A FIG. 4A, B, C e D ilustra a sequência de ADN (SEQ ID N°:8) da cassete de exposição do vector de fago exemplificativo DY3P82_LACIKl e a sequência de aminoácidos (SEQ ID N°:9) da proteína de exposição variada. (A utilização de codões de trinucleótidos variados não pode ser incorporada na listagem de sequência de ácidos nucleicos). As bases 7244 a 7415 contêm o promotor PlacZ e um sítio de ligação ao ribossoma. As bases 7416 - 7469 codificam os 18 aminoácidos da sequência sinal de M13 iii. A peptidase sinal cliva após o Alal8. As bases 7470-7475 codificam os aminoácidos Ala-Glu, aqui marcados "a" e "b". estes permitem a clivagem eficiente pela peptidase sinal L. As bases 7476-7649 codificam o domínio LACI Kl, aqui mostrado com a 24 sequência de tipo selvagem e numerado de 1 a 58. As posições variadas (11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39 e 40) são mostradas. Os sítios de restrição apresentados são únicos em DY3P82 LACIK1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Num aspecto, a invenção proporciona uma biblioteca de partículas de fago em que os domínios de Kunitz expostos dos respectivos membros são variados no que respeita um ao outro como definido nas reivindicações. As bibliotecas de exposição de fagos podem ser utilizada para identificar um domínio de Kunitz que pode ligar-se a um alvo particular, e. g., uma protease alvo. O domínio de Kunitz pode também inibir a actividade da protease alvo.

As bibliotecas de exposição de fagos são colecções de partículas de fago que (i) incluem uma proteína de exposição variada à superfície da partícula e (ii) contêm o ácido nucleico que codifica a proteína exposta. A associação física entre a proteína exposta e os seus ácidos nucleicos codificantes é conveniente para o isolamento rápido de proteínas de ligação ao alvo.

As partículas de fago podem apresentar a proteína exposta com uma valência desejada. Por exemplo, as partículas podem apresentar a proteína exposta com uma valência limitada, e. g., num número de cópias que é inferior ao número máximo possível de cópias. Por exemplo, se a proteína exposta está ligada à partícula de fago em pelo menos uma porção da proteína do gene III, o número máximo de cópias possível é cerca de cinco. 25

Consequentemente, a valência dos domínios de Kunitz expostos na partícula de fago podem limitar, e. g., a menos do que cinco, quatro, três ou duas cópias por partícula.

Numa biblioteca, a valência média ou mediana pode ser, e. g., inferior a ou igual a 4, 3, 2, 1,5, 1,4, 1,25, 1,1 ou 1,0 ou entre 0,25-2, 0,3 e 1,8, 0,3 e 1,5 ou 0,5 e 1,5. A valência reduzida favorece a selecção de ligantes com elevada especificidade. A exposição monovalente (e. g., uma valência média inferior a 1,4) pode ser utilizada.

Um método para conseguir uma valência limitada é a utilização de uma proteína exposta que inclui, pelo menos, uma porção funcional de uma proteína menor da cápsula. Outra cópia da proteína menor de cápsula (ou uma porção funcional) desta - a proteína de contrapartida - é também expressa enquanto as partículas de fago estão a ser produzidas de modo que, em média, poucas proteínas expostas são incorporadas numa determinada partícula em que o número máximo possível de cópias da proteína menor da cápsula. Por exemplo, se o gene III da proteína da cápsula do fago filamentoso é utilizado, o número de cópias máximo possível é cerca de cinco. A expressão das proteínas expostas como fusões com, pelo menos, o domínio de âncora do gene III da proteína da cápsula concorrente com a expressão do gene III do tipo selvagem da proteína de cápsula pode resultar em partículas de fago com inferior a cinco, quatro, três ou duas proteínas expostas por partícula. A sequência de ácidos nucleicos que codifica a apresentação pode ser operativamente ligada a um promotor que produz um nível de expressão relativo desejado e a outros componentes do fago.

Por exemplo, pode ser utilizado um promotor regulável, e. g., 26 para permitir o controlo da proporção da expressão da proteína exposta a sua contraparte.

Sem pretender estar ligado à teoria, a proteina exposta e a sua contraparte podem competir pela incorporação na partícula de fago. Uma consequência do controlo da proporção da expressão da proteina exposta e da sua contraparte é o controlo da valência da proteina exposta.

As sequências que codificam os correspondentes dominios funcionais da proteina exposta e a proteina contraparte podem diferir. Por exemplo, se os correspondentes dominios funcionais possuírem sequências de aminoácidos idênticas, a selecção dos codões pode ser variada para produzir diferentes sequências codificantes. Por exemplo, um dos dois pode incluir codões sintéticos seleccionados para evitar a recombinação entre a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína exposta e a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína contraparte, que pode utilizar codões naturais. 0 cenário pode também ser revertido, e. g., o ácido nucleico que codifica a proteína exposta pode utilizar codões sintéticos para codificar a proteína de cápsula ou um seu fragmento. Por exemplo, as duas sequências podem diferir entre 5 e 95, 5 a 60 ou 20 e 50% em codões.

Domínios de Kunitz Exemplificativos

Como aqui utilizado, um "domínio de Kunitz" é um domínio polipéptido que inclui, pelo menos, 51 aminoácidos e contém, pelo menos, dois e mais tipicamente três, ligações persulfureto. O domínio é organizado de modo a, se presentes, a primeira e 27 sexta cisteínas, a segunda e quarta e a terceira e quinta cisteínas formam ligações persulfureto. Por exemplo, num dominio de Kunitz exemplificativo possuindo 58 aminoácidos, os persulfuretos são formados entre as cisteínas na posição 5 e 55, 14 e 38 e 30 e 51.

Nas implementações em que estão presentes dois persulfuretos, as ligações persulfureto podem ser formadas entre um correspondente conjunto de cisteínas. O espaçamento entre as respectivas cisteínas pode estar nos aminoácidos 7, 5, 4, 3 ou 2 do espaçamento seguinte: 5 a 55, 14 a 38 e 30 a 51.

Na SEQ ID N°:2, as ligações de persulfureto ligam, pelo menos, dois de: 5 a 55, 14 a 38 e 30 a 51, como se segue: Xi-X2-X3-X4-C5-X6-X7-X8-X9-X9a-Xl0-Xll-Xl2Xl3-Cl4-Xl5 -Xl6-Xl7"Xl8 -X19-X2O-X2I-X22_X23_X2 4_X25_X26_X2 7_X28_X29_X29a_X29b_X2 9c_C3 0-X31_X32_X33_X34_X35_X36_ X3 7_C3 8-X3 9-X40-X41_X42_X42a_X42b_X43_X44_X45_X46_X47_X48_X49_X50-C5l —X52-X53-X54-C55-X56-X57—X58 (SEQ ID N°:2). O número de persulfuretos pode ser reduzido Num, mas, geralmente, nenhuma das cisteínas convencionais deve ficar desemparelhada. Deste modo, se uma cisteína é alterada, então é adicionada uma cisteína de compensação num local adequado ou a cisteína coincidente é também substituída por uma não cisteína. Por exemplo, o inibidor da protease da glândula acessória dos machos de Drosophila funebrís não possui cisteína na posição 5, mas possui uma cisteína na posição -1 mesmo antes da posição 1; presumivelmente isto forma um persulfureto com Cys55.

Em algumas formas de realização, Ci4 e C3o podem ser alteradas para outros aminoácidos além de cisteína, mas de um modo preferido, se um destes resíduos for alterado, são ambos 28 alterados. Se Ci4 está presente e X9a está ausente, então X72 pode ser Gly. Em algumas formas de realização, X37 é Gly. Em algumas formas de realização, X33 é Phe ou Tyr e X45 é Phe ou Tyr. Em algumas formas de realização, Cysi4 e Cys38 são substituídos e o requisito de Glyi2, (Gly ou Ser)37 e Gly36 é deixado cair.

Desde zero a muitos resíduos podem ser localizados no final de um domínio de Kunitz. Estes resíduos podem constituir, e. g., um ou mais domínios (e. g., outros domínios de Kunitz e não Kunitz expostos) ou outras sequências de aminoácidos.

Os domínios de Kunitz naturais são geralmente domínios altamente estáveis. Os domínios de Kunitz podem ligar-se aos sítios activos das suas respectivas proteases alvos de modo que uma ligação peptídica (a "ligação clivável") do domínio de Kunitz é: 1) não clivada, 2) clivada muito lentamente ou 3) clivada sem efeito porque a estrutura do inibidor evita a libertação ou separação dos segmentos clivados. As ligações de persulfureto actuam geralmente para manter a proteína junta mesmo se as ligações peptídicas expostas forem clivadas. A partir do resíduo no lado amino da ligação clivável e afastado da ligação, os resíduos são convencionalmente denominados Pl, P2, P3, etc. Os resíduos que se seguem à ligação clivável são denominados Pl', P2', P3', etc. É geralmente aceite que cada protease serina possui sítios (compreendendo vários resíduos) Sl, S2, etc., que recebem os grupos laterais e os átomos da cadeia principal de Pl, P2, etc. do substrato ou inibidor e os sítios Sl', S2', etc. que recebem os grupos laterais e os átomos da cadeia principal de Pl', P2', etc. do substrato ou inibidor. São as interacções entre os sítios S e os grupos laterais P e os átomos da cadeia principal que dão a 29 especificidade à protease no que respeita aos substratos e a especificidade dos inibidores no que respeita a proteases. Porque o fragmento possuindo o novo terminal amino deixa a protease primeiro, muitos dos que concebem os inibidores de protease de molécula pequena têm-se concentrado em compostos que se ligam aos sitios Sl, S2, S3, etc.

Tipicamente, Xi5 ou a posição de aminoácido correspondente à posição 15 de LACI-Kl é equivalente a PI (descrita acima), Xi6 ou a posição de aminoácido correspondente à posição 16 de LACI-Kl é equivalente a Pl', Xi7 ou a posição de aminoácido correspondente à posição 17 de LACI-Kl é equivalente a P2', X18 ou a posição de aminoácido correspondente à posição 18 de LACI-Kl é equivalente a P3' e Xig ou a posição de aminoácido correspondente à posição 19 de LACIKl é equivalente a P4'. Como discutido abaixo, um ou mais de Sl, S2, S3, Pl', P2', P3' e P4' podem ser variados.

Os domínio de Kunitz humanos exemplificativos incluem os três dominios de Kunitz de LACI (Wun et al., (1988) J. Biol.

Chem. 263(13):6001-6004; Girard et al., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny et al, (1989) J. Biol. Chem., 264(31):18832-18837); os dois domínios de Kunitz do inibidor inter-a-Tripsina, APPI (inibidor do precursor da proteína amilóide β de Alzheimer) (Kido et al., (1988) J. Biol. Chem., 263(34):18104-18107), um domínio de Kunitz de colagénio e os três dominios de Kunitz de TFPI-2 (Sprecher et al., (1994) Proc. Nat. Acad. USA, 91:3353-3357). O LACI é uma fosfoglicoproteína do soro humano que contém três domínios de Kunitz: 30 MIYTMKKVHA LWASVCLLLN LAPAPLNADS EEDEEHTIIT DTELPPLKLM HSFCAFKADD GPCKAIMKRF FFNIFTRQCE EFIYGGCEGN QNRFESLEEC KKMCTRDNAN RIIKTTLQQE KPDFCFLEED PGICRGYITR YFYNNQTKQC ERFKYGGCLG NMNNFETLEE CKNICEDGPN GFQVDNYGTQ LNAVNNSLTP QSTKVPSLFE FHGPSWCLTP ADRGLCRANE NRFYYNSVIG KCRPFKYSGC GGNENNFTSK QECLRACKKG FIQRISKGGL IKTKRKRKKQ RVKIAYEEIF VKNM SEQ ID N° 3 A sequência sinal está localizada nos aminoácidos 1-28. Os três domínios de Kunitz no LACI são referidos como LACI-Kl (resíduos 50 a 107 de SEQ ID N°:3), LACI-K2 (resíduos 121 a 178 de SEQ ID N°:3) e LACI-K3 (213 a 270 de SEQ ID N°:3). O ADNc da sequência de LACI é reportado em Wun et al. (J. Biol. Chem., 1988, 263(13):6001-6004). Girard et al. {Nature, 1989, 338:518-20) reporta estudos mutacionais em que os resíduos Pl de cada um dos três domínios de Kunitz foram alterados. O LACI-Kl inibe o Factor Vila quando o Factor VIIa é complexado com o factor do tecido. O LACI-K2 inibe o Factor Xa.

Aqui, os resíduos dos domínios de Kunitz exemplificativos são numerados por referência ao LACI-Kl (domínio de Kunitz 1 de LACI): MHSFCAFKAD DGPCKAIMKR FFFNIFTRQC EEFIYGGCBG NQNRFESLEE CKKMCTRD SEQ ID N° 1 O primeiro resíduo de cisteína do domínio de Kunitz LACI-Kl é o resíduo 5 e a última cisteína é o resíduo 55. As posições de aminoácidos num domínio de Kunitz podem também ser referenciadas com respeito à sua correspondência com os aminoácidos em 31 LACI-Kl, utilizando o alinhamento óptimo proporcionado pelo programa GAP (ver acima).

Os domínios de Kunitz aqui descritos podem ser, pelo menos, 30, 40, 50, O co o o kO ou 90% idênticos a LACI-Kl. Outros domínios de Kunitz aqui descritos são homólogos (e. g. , pelo menos, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% idênticos) a outros dominios de Kunitz que ocorrem naturalmente (e. g., um dominio de Kunitz aqui descrito), particularmente a outros dominios de Kunitz humanos.

As estruturas moleculares tridimensionais de muitos dominios de Kunitz são conhecidas com resolução elevada. Ver, e. g., Eigenbrot et al. (1990) Protein Engineering 3:591-598 e Hynes et al. (1990) Biochemistry 29:10018-10022. Um modelo exemplificativo estrutural de raios X do domínio de Kunitz de BPTI está depositado no Brookhaven Protein Data Bank como "6PTI". São conhecidas mais do que setenta sequências do domínio de Kunitz. As proteínas contendo domínios de Kunitz exemplificativos incluem os seguintes, com os Números de Acesso de SWISS- -PROT em parênteses: A4_HUMAN (P05067), A4_MACFA (P53601), A4_MACMU (P29216), A4J MOUSE (P12023), A4_RAT (P08592), A4_SAISC (Q95241), AMBP_PLEPL (P36992), APP2_ .HUMAN (Q06481), APP2_RAT (P15943) , AXPl_ANTAF (P81547), AXP2_ .ANTAF (P81548), BPTl_BOVIN (P00974), BPT2_BOVIN (P04815), CAI 7. _HUMAN (Q02388), CA3 6_CHICK (P15 9 8 9) , CA3 6_HUMAN (P12111), CRPT _BOOMI (P 8116 2) , ELAC_MACEU (062845), ELAC_TRIVU (Q29143), EPPI. _HUMAN (095925), EPPI_MOUSE (Q9DA01), HTIB_MANSE (P 2 6 2 2 7) , IBP. _CARCR (P 0 0 9 9 3), IBPC_BOVIN (P 0 0 9 7 6), IBPI_TACTR (P16 0 4 4) , IBPS_ BOVIN (P 0 0 9 7 5) , ICS3_BOMMO (P 0 7 4 81), IMAP_DROFU (P11424), IP52. _ANESU (P10 2 8 0) , 32 ISC1_B0MM0 (P10 8 31), ISC2_B0MM0 (P10 8 3 2 ), ISH1_ST0HE (P31713), ISH2_STOHE (P 8112 9) , ISIK_HELPO (P 0 0 9 9 4 ), ISP2_GALME (P 819 0 6 ) , IVBl_BUNFA (P25660), IVB1_BUNMU (P 0 0 9 8 7), IVBl_VIPAA (P 0 0 9 91), IVB2_BUNMU (P00989), IVB2_DABRU (P 0 0 9 9 0 ), IVB2_HEMHA (P00985), IVB2_NAJNI (P 0 0 9 8 6 ), IVB3_VIPAA (P 0 0 9 9 2), IVBB_ DENP0 (P 0 0 9 8 3), IVBC_NAJNA (P19859), IVBC_0PHHA(P 8 2 9 6 6), IVBE_DENP0 (P 0 0 9 8 4), IVBI_DENAN (P 0 0 9 8 0), IVBI_DENP0 (P 0 0 9 7 9 ), IVBK_DENAN (P 0 0 9 8 2), IVBK_DENPO (P 0 0 9 81), IVBT_ERIMA (P 2 4 5 41), IVBT_NAJNA (P20229), MCPI_MELCP (P 8 2 9 6 8), SBPI_SARBU (P26228), SPT3_HUMAN (P49223), TKDl_BOVIN (Q28201), TKDl_SHEEP (Q29428), TXCA_DENAN (P81658), UPTI_PIG (Q29100), AMBP_B0VIN (P 0 0 9 7 8), AMBP_HUMAN (P 0 2 7 6 0) , AMBP_MERUN (Q62577), AMBP_MESAU (Q60559), AMBP_M0USE (Q07456), AMBP_PIG (PO 436 6), AMBP_RAT (Q64240), IATR_H0RSE (P04365), IATR_SHEEP (P13 3 71) , SPTl_HUMAN (043278), SPTl_M0USE (Q9R097), SPT2_HUMAN (043291), SPT2_M0USE (Q9WU03), TFP2_HUMAN (P48307), TFP2_M0USE (035536), TFPI_HUMAN (P10 6 4 6 ), TFPI_MACMU (Q28864), TFPI_MOUSE YN81_CAEEL (054819), (Q03610). TFPI_RABIT (P19761), TFPI_RAT (Q02445) e

Um "resíduo conservado de Kunitz" numa posição de aminoácido particular é um aminoácido que está presente, nessa posição, em pelo menos 5 sequências da lista anterior. Um "resíduo conservado de Kunitz" numa posição de aminoácido particular é um aminoácido que está presente, nessa posição, em pelo menos 30% das sequências lista anterior. Mais do que um resíduo de Kunitz conservado ou altamente conservado podem estar disponíveis numa posição particular. As posições são baseadas no alinhamento óptimo de CLUSTALW da lista anterior e são referenciados de acordo com a numeração de aminoácidos de laci-kI.

Pode ser utilizada uma variedade de métodos para identificar um domínio de Kunitz a partir de uma base de dados de 33 sequências. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos conhecida de um domínio de Kunitz, uma sequência de consenso ou um motivo (e. g., o ProSite Motif) podem ser pesquisados na base de dados de sequências do GENBANK® (National Center for Biotechnoloqy Information, National Institutes of Health, Bethesda MD), e. g., utilizando BLAST; contra a base de dados Pfam de HMMs (Hidden Markov Models) (e. g., utilizando os parâmetros base para a pesquisa de Pfam; contra a base de dados SMART™; ou contra a

base de dados ProDom. Ver, e. g- , Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420; Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; Stultz et al. (1993) Protein Scí. 2: 305-314; Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:5857 Schultz et al. (2000) Nucl. Acids Res 28:231; e Corpet et ai. (1999), Nucl. Acids Res. 27:263-267). O Prosite lista o domínio de Kunitz como um motivo e identifica proteínas que incluNum domínio de Kunitz. Ver, e. g., Falquet et al. Nucleic Acid Res. 30:235-238(2002).

Variando os Domínios de Kunitz

As bibliotecas de exposição incluem a variação numa ou mais posições nos domínios de Kunitz expostos. Por exemplo, pode ser variadas entre uma e 20 ou 5 e 12 posições. As posições variadas podem ser localizadas Numa das duas ansas de interaeção do domínio de Kunitz. A primeira "ansa de interaeção" inclui Pl, PI', P2', P3' e P4' e outras posições de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 11 a 19 de LACI-Kl. A segunda "ansa de interaeção" inclui posições de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 32 a 40 de LACI-Kl. 34 A biblioteca pode incluir variação Numa ou ambas as ansas de interacção. 0 tamanho teórico da biblioteca, e. g., o número de proteínas únicas expostas que pode ser codificado por uma

biblioteca pode ser grande (e. g., entre 103 a ΙΟ19, 103 a 1015, 105 a 1014 ou 107 a 1012 diferentes proteínas expostas e/ou e. g., pelo menos, ΙΟ5, ΙΟ6, ΙΟ8, 109 ou IO10. O tamanho teórico refere-se ao número total de sequência de aminoácidos únicas que podem ser codificadas pela biblioteca na sua forma de representação completa, independentemente de uma implementação real. A diversidade teórica é geralmente o produto do número de variações em cada posição. Por exemplo, a diversidade teórica da variação de apenas duas posições entre todos os vinte aminoácidos é 20 x 20 ou 400. A biblioteca com grande diversidade é muito útil ainda assim a presente biblioteca utilizada pode ser apenas uma amostra de um espaço pequeno conjunto da diversidade teórica.

No entanto, as bibliotecas com diversidade limitada, e. g., inferior a ΙΟ15, ΙΟ14, ΙΟ13, ΙΟ12, 1011, IO10 ou 109 proteínas diferentes são também úteis. Se apropriadamente concebidas, estas bibliotecas podem também incluir uma fracção elevada de proteínas organizadas. As bibliotecas com diversidade limitada também facilitam a avaliação rigorosa de um espaço da sequência particular.

Diversidade Sintética. As bibliotecas podem incluir regiões de sequências de ácidos nucleicos diversas que têm origem em sequências artificialmente sintetizadas. As sequências de aminoácidos sintéticas incluem variantes de sequências que ocorrem naturalmente, e. g., variantes que são pelo menos 30, 35 50, 70, 80, 90, 95 ou 98% idênticas à sequência que ocorre naturalmente.

Tipicamente, a biblioteca é sintetizada a partir de uma ou mais populações de oligonucleótidos degenerados que incluNuma distribuição de nucleótidos a uma pluralidade de posições seleccionadas. A inclusão de um determinado nucleótido é aleatória no que respeita à distribuição. Um exemplo de uma fonte degenerada de diversidade sintética é um oligonucleótido que inclui NNN, em que N é qualquer dos quatro nucleótidos em igual proporção. O oligonucleótido degenerado também inclui posições invariantes que codificam posições invariantes de aminoácidos do molde do domínio de Kunitz. A diversidade sintética pode também ser mais restrita, e. g., para limitar o número de codões numa sequência de ácidos nucleicos a um determinado trinucleótido para uma distribuição que é inferior a NNN. Por exemplo, esta distribuição pode ser construída utilizando menos do que quatro nucleótidos (e. g., três ou dois) em algumas posições do codão. Além disso, a tecnologia de adição de trinucleótido pode ser utilizada para ainda restringir a distribuição. A denominada "tecnologia de adição de trinucleótidos" é descrita, e. g., em Wells et al. (1985) Gene 34:315-323, Patente U. S. N° US 4760025 e 5869644. Os oligonucleótidos são sintetizados num suporte de fase sólida, um codão (í. e., trinucleótido) de uma vez. O suporte inclui muitos grupos funcionais para a síntese de modo que muitos oligonucleótidos sejam sintetizados em paralelo. O suporte é primeiro exposto a uma solução contendo uma mistura do conjunto de codões para a primeira posição. A unidade é protegida e portanto não são 36 adicionadas mais unidades. A solução contendo a primeira mistura é lavada e o suporte sólido é desprotegido de modo que uma segunda mistura contendo um conjunto de codões para uma segunda posição pode ser adicionada para ser ligada à primeira unidade. 0 processo é iterado para montar sequencialmente múltiplos codões. A tecnologia de adição de trinucleótidos permite a síntese de um ácido nucleico que numa determinada posição pode codificar um número de aminoácidos. A frequência destes aminoácidos pode ser regulada pela proporção de codões na mistura. Além disso, a escolha dos aminoácidos na posição determinada não é restrita aos quadrantes da tabela de codões como é o caso de misturas de nucleótidos simples que são adicionados durante a síntese.

Em algumas formas de realização, as variações nas sequências de aminoácidos em diversas regiões pode ser limitado, e. g., a subconjuntos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes. Os exemplos de variações limitadas nas sequências de aminoácidos incluem, e. g., todos os aminoácidos excepto cisteína; os aminoácidos com cadeias laterais básicas (e. g., lisina, arginina, histidina); os aminoácidos com cadeias laterais acídicas (e. g., ácido aspártico, ácido glutâmico); os aminoácidos com cadeias laterais polares não carregadas (e. g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina); os aminoácidos com cadeias laterais não polares (e. g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); os aminoácidos com cadeias laterais aromáticas (e. g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). As variações numa posição particular podem também ser limitadas aos resíduos de aminoácidos conservados ou altamente conservados do domínio de Kunitz. 37

Diversidade Natural. As bibliotecas podem incluir regiões de sequências de ácidos nucleicos diversas que têm origem (ou são sintetizadas com base em) diferentes sequências que ocorrem naturalmente, e. g., diferentes domínios de Kunitz que ocorrem naturalmente. Para algumas bibliotecas, é incluída a diversidade sintética e natural.

Mutagénese. Numa forma de realização, a tecnologia de biblioteca de exposição é utilizada num modo iterativo. Uma primeira biblioteca de exposição é utilizada para identificar um ou mais ligandos para um alvo. Estes ligandos identificados são então variados utilizando um método de mutagénese para formar uma segunda biblioteca de exposição. Os ligandos com afinidade elevada são então seleccionados a partir da segunda biblioteca, e. g., utilizando restringência elevada ou condições de ligação e de lavagem mais competitivas.

Em algumas implementações, a mutagénese de um domínio de Kunitz é dirigida para regiões conhecidas por ou com probabilidade de estarem na interface da ligação, e. g., uma ou mais posições, aqui descritas, e. g., uma ou mais posições nas ansas de interacção. Além disso, a mutagénese pode ser dirigida para regiões estruturais próximas ou adjacentes às ansas de interacção. No caso de domínios de Kunitz, a mutagénese pode também ser limitada a uma ou duas das ansas de interacção, uma ou duas posições de aminoácidos nestes. A mutagénese dirigida pode facilitar melhoramentos precisos passo a passo.

Algumas técnicas de mutagénese exemplificativas incluem: PCR propenso a erro (Leung et al. (1989) Technique 1:11-15), recombinação, mistura de ADN utilizando clivagem aleatória (Stemmer (1994) Nature 389-391; denominado "mistura de ácido 38 nucleico"), RACHITT™ (Coco et al. (2001) Nature Blotech. 19:354), mutagénese dirigida ao sitio (Zooler et al. (1987) Nucl Acids Res 10:6487-6504), cassete de mutagénese (Reidhaar-Olson (1991) Methods Enzymol. 208:564-586) e incorporação de oligonucleótidos degenerados (Griffiths et al. (1994) EMBO J 13:3245). A mutagénese pode também ser utilizada para preparar uma biblioteca inicial de domínios de Kunitz variados.

Num exemplo de selecção iterativa, os métodos aqui descritos são utilizados para identificar primeiro um ligando de proteína da biblioteca de exposição que se liga ao composto alvo com, pelo menos, uma especificidade mínima de ligação para um alvo ou uma actividade mínima, e. g., uma constante de equilíbrio de dissociação para ligação inferior a 100 nM, 10 nM ou 1 nM. A sequência de ácido nucleico que codifica o ligando da proteína identificado inicial é utilizada como um ácido nucleico molde para a introdução de variações, e. g., para identificar um segundo ligando de proteína que possui propriedades melhoradas (e. g., afinidade de ligação, cinética ou estabilidade) relativamente ao ligando da proteína inicial.

Exposição em fagos

A exposição em fagos utiliza bacteriófagos para expor polipéptidos variados. A proteína exposta pode ser ligada a uma proteína de cápsula do bacteriófago com ligações covalentes, não covalentes e não peptídicas. Ver, e. g., Patente U.S. N° 5223409, Crameri et al. (1993) Gene 137:69 e documento WO 01/05950. A ligação pode resultar da tradução de um ácido nucleico que codifica os variados componentes péptido fundidos com a proteína de cápsula. A ligação pode incluir um ligante flexível pepttídico, um sítio de protease ou um aminoácido 39 incorporado como um resultado da supressão de um codão de interrupção.

Uma exposição em fagos é descrita, por exemplo, em Ladner et al., Patente U. S. N° 5223409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; documentos WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; documento WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod

Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et ai. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267:129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982. A exposição em sistemas de fagos foi desenvolvida para o fago filamentoso Ff (fago fl, fd e M13) assim como para os outros bacteriófagos (e. g. bacteriófago T7 e fagos lambdóides; ver, e. g., Santini (1998) J. Mol. Biol. 282:125-135; Rosenberg et al. (1996) Innovations 6:1-6; Houshm et al. (1999) Anal

Biochem 268:363-370).

Os ácidos nucleicos adequados para a exposição em fagos, e. g., vectores de fago, foram descritos. Ver, e. g., Armstrong et al. (1996) Academic Press, Kay et al., Ed. pp.35-53; Corey et al. (1993) Gene 128 (1):129-34; Cwirla et al. (1990) Proc Natl Acad Sei USA 87(16):6378-82; Fowlkes et al. (1992) Biotechniques 13(3):422 — 8; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acid Res 40 19(15):4133-7; McCafferty et al. (1990) Nature 348(6301):552-4; McConnell et al. (1994) Gene 151(1-2): 115-8; Scott e Smith (1990) Science 249(4967):386-90.

Fagemídeos. Uma configuração alternativa da exposição em fagos utiliza um vector fagemideo. Num sistema de fagemideos, o ácido nucleico que codifica a proteína exposta é proporcionado num plasmídeo, tipicamente de comprimento inferior a 6000 nucleótidos. O plasmídeo inclui uma origem de replicação de fago de modo que o plasmídeo é incorporado em partículas de bacteriófagos quando as células bacterianas portadoras do plasmídeo são infectadas com um fago auxiliar, e. g. M13K01. Os fagemídeos, no entanto, não possuNum conjunto de genes de fago suficientes de modo a produzir partículas de fago estáveis. Estes genes de fago podem ser proporcionados por um fago auxiliar. Tipicamente, o fago auxiliar proporciona uma cópia intacta do gene III e outros genes de fago necessários para a replicação e montagem do fago. Porque o fago auxiliar possui uma origem deficiente, o genoma do fago auxiliar não é eficientemente incorporado em partículas de fago relativamente ao plasmídeo que possui uma origem de tipo selvagem. Ver, e. g., Pat. U. S. N° 5821 047. O genoma do fagemideo contém um gene de marcador seleccionável, e. g. AmpR ou KanR para a selecção de células que são infectadas por um membro da biblioteca.

Vectores de Fago. Outra configuração da exposição em fagos utiliza vectores que incluNum conjunto de genes de fago suficientes para produzir uma partícula infecciosa de fago quando expressa, um sinal de empacotamento de fago e uma sequência de replicação autónoma. Por exemplo, o vector pode ser um genoma de fago que foi modificado para incluir uma sequência que codifica a proteína exposta. A exposição em vectores de 41 fagos pode ainda incluir um sitio em que uma sequência de ácidos nucleicos estranha pode ser inserida, tal como um sitio múltiplo de clonagem contendo sítios de digestão com enzimas de restrição. A sequência de ácidos nucleicos estranha, e. g., que codifica proteínas expostas em vectores de fago, pode ser ligada a um sítio de ligação ao ribossoma, uma sequência sinal (e. g., uma sequência sinal de M13) e uma sequência de terminador de transcrição.

Os vectores podem ser construídos por técnicas convencionais de clonagem para conter uma sequência que codifica um polipéptido que inclui um domínio de Kunitz e uma porção de uma proteína de cápsula do fago e que está operativamente ligado a um promotor regulável. Em algumas formas de realização, um vector de exposição em fagos inclui duas sequências de ácidos nucleicos que codificam a mesma região de uma proteína de cápsula do fago. Por exemplo, o vector inclui uma sequência que codifica uma região dessas numa posição operativamente ligada à sequência que codifica a proteína exposta e outra sequência que codifica uma região destas no contexto do gene funcional de fago (e. g., um gene de fago de tipo selvagem) que codifica a proteína de cápsula.

Uma vantagem dos vectores de fago é que estes não necessitam da utilização de fago auxiliar, simplificando, deste modo, a preparação da biblioteca, reduzindo o enviesamento possível da biblioteca e produzindo as bibliotecas de fago isentas de partículas que empacotam o ácido nucleico do fago auxiliar. A exposição em vectores de fagos pode também incluir um marcador seleccionável, tal como marcadores de resistência a fármacos, e. g., um gene de resistência a ampicilina. No entanto, ao contrário dos fagemídeos, é também possível e por vezes 42 vantajoso utilizar vectores de fago que não incluem esse marcador seleccionável.

Proteínas da cápsula

Os sistemas de exposição de fagos utilizam tipicamente o fago filamentoso Ff. Em implementações utilizando o fago filamentoso, por exemplo, a proteína exposta é fisicamente ligada a um domínio âncora da proteína de cápsula do fago. A co-expressão da proteína exposta com outros polipéptidos possuindo o mesmo domínio de âncora, e. g., uma cópia endógena da proteína de cápsula, resultará na competição pela expressão à superfície da partícula.

As proteínas da cápsula do fago que podem ser utilizadas para exposição em proteína incluem (i) proteínas menores da cápsula do fago filamentoso, tal como gene III da proteína e (ii) proteínas principais da cápsula do fago filamentoso, tal como o gene VIII da proteína. As fusões com outra proteína de cápsula do fago, tal como uma proteína do gene VI, proteína do gene VII ou proteína do gene IX podem também ser utilizadas (ver, e. g., documento WO 00/71694).

As porções (e. g., domínios ou fragmentos) destas proteínas podem também ser utilizados. As porções úteis incluem domínios que são estavelmente incorporados na partícula de fago, e. g., de modo que a proteína de fusão permanece na partícula através de um processo de selecção. Numa forma de realização, domínio ou "toco" domínio do gene III da proteína utilizada (ver, e. g., documento U.S. 5658727 para uma descrição de um domínio exemplificativo do toco da proteína do gene III) . Como aqui 43 utilizado, um "domínio âncora" refere-se a um domínio que é incorporado num pacote genético (e. g., um fago). Um domínio âncora de fago típico é incorporado no revestimento ou cápside do fago.

Em outra forma de realização, é utilizada a proteína do gene VIII. Ver, e. g., documento U.S. 5223409. A proteína madura, do gene VIII de comprimento total pode ser ligada à proteína exposta.

Os sistemas de exposição em fagos filamentosos utilizam tipicamente fusões de proteína para ligar fisicamente a sequência de aminoácidos heteróloga a uma proteína de cápsula ou domínio de âncora de fago. Por exemplo, o fago pode incluir um gene que codifica uma sequência sinal, a sequência de aminoácidos heteróloga e o domínio de âncora, e. g., um domínio de âncora da proteína do gene III. É também possível utilizar outros formatos de exposição para pesquisar bibliotecas de domínios de Kunitz, e. g., bibliotecas cuja variação é concebida como aqui descrito. Outros formatos de exposição exemplificativos incluem a exposição com base em células (e. g., exposição em leveduras) e fusões de ácido nucleico-proteína. Ver, e. g., documentos US 6207466 e WO 03/029456. As matrizes de proteína podem também ser utilizadas. Ver, e. g., o documento WO 01/40803, documento WO 99/51773 e US2002-0192673-A1. 44

Promotores para a Expressão de Proteínas de Exposição

Os promotores reguláveis podem ser utilizados para controlar a valência da proteína exposta. A expressão regulada pode ser utilizada para produzir fago que possui uma baixa valência da proteína exposta. São conhecidas muitas sequências de promotor reguláveis (e. g., indutível e/ou reprimível). Estas sequências incluem promotores reguláveis cuja actividade pode ser alterada ou regulada pela intervenção do utilizador, e. q., por manipulação de um parâmetro ambiental.

Por exemplo, um composto químico exógeno pode ser adicionado para regular a transcrição de alguns promotores. Os promotores reguláveis podem conter sítios de ligação para um ou mais activadores de transcrição ou proteína repressora. Os promotores sintéticos que incluem os sítios de ligação do factor de transcrição podem ser construídos e podem também ser utilizados como promotores reguláveis.

Os promotores reguláveis exemplificativos incluem promotores que respondem a um parâmetro ambiental, e. g., alterações térmicas, hormonas, metais, metabolitos, antibióticos ou agentes quimicos. Os promotores reguláveis apropriados para utilização em E. coli incluem promotores que contêm sítios de ligação do factor de transcrição das sequências do operador de lac, tac, trp, trc e tet ou operões, o promotor da fosfatase alcalina ipho), um promotor de arabinose, tal como um promotor araBAD, o promotor de ramnose, os próprios promotores ou seus fragmentos funcionais (ver, e. g., Elvin et al., 1990, Gene 37: 123-126; Tabor e Richardson, 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1074-1078; Chang et al., 1986, Gene 44: 121-125; Lutz e Bujard,

Março 1997, Nucl. Acids. Res. 25: 1203-1210; D. V. Goeddel 45 et al., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 76:106-110, 1979; J. D. Windass et al. Nucl. Acids. Res., 10:6639-57, 1982; R. Crowl et al., Gene, 38:31-38, 1985; Brosius, 1984, Gene 27: 161-172; Amanna e Brosius, 1985, Gene 40: 183-190; Guzman et al., 1992, J. Bacterlol., 174: 7716-7728; Haldimann et al., 1998, J.

Bacterlol., 180: 1277-1286). O promotor tac é um exemplo de um promotor sintético. O promotor lac, por exemplo, pode ser induzido por lactose ou moléculas estruturalmente relacionadas, tais como isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) e é reprimido por glucose. Alguns promotores indutiveis são induzidos por um processo de desrepressão, e. g., a inactivação de uma molécula repressora.

Uma sequência de promotor regulável pode também ser indirectamente regulada. Os exemplos de promotores que podem ser manipulados para regulação indirecta incluem: os promotores do fago lambda PR, -PL, fago T7, SP6 e T5. Por exemplo, a sequência reguladora é reprimida ou activada por um factor cuja expressão é regulada, e. g., por um parâmetro ambiental. Um exemplo de um tal promotor é um promotor de T7. A expressão da polimerase de ARN de T7 pode ser regulada por um promotor que responde ao ambiente de modo que o promotor lac. Por exemplo, a célula pode incluir um ácido nucleico heterólogo que inclui uma sequência que codifica a polimerase de ARN de T7 e uma sequência reguladora (e. g., o promotor lac) que é regulado por um parâmetro ambiental. A actividade da polimerase de ARN de T7 pode também ser regulada pela presença de um inibidor natural da polimerase de ARN, tal como a lisozima de T7.

Em outra configuração, o lambda PL pode ser manipulado para ser regulado por um parâmetro ambiental. Por exemplo, a célula 4 6 pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma variante sensível à temperatura do repressor de lambda. A produção de células à temperatura não permissiva liberta o promotor PL da repressão.

As propriedades reguladoras de um promotor ou sequência reguladora de transcrição podem ser facilmente testadas pela ligação operacional do promotor ou sequência a uma sequência que codifica uma proteína repórter (ou qualquer proteína detectável). Esta construção é introduzida numa célula bacteriana e a abundância da proteína repórter é avaliada sob uma variedade de condições ambientais. Um promotor ou sequência útil é um que é selectivamente activado ou reprimido em certas condições.

Em algumas formas de realização, são utilizados promotores não reguláveis. Por exemplo, pode ser seleccionado um promotor que produz uma quantidade apropriada de transcrição sob as condições relevantes. Um exemplo de um promotor não regulável é o promotor do gene III.

Numa forma de realização, os promotores são dispostos como descrito em 10/723 981.

Produção e pesquisa de fago A exposição em bibliotecas de fagos pode ser utilizada identificar domínios de Kunitz que interagem com um alvo, e. g., um composto alvo. Numa forma de realização, o método inclui a amplificação de um membro da biblioteca de fagos recuperado numa selecção para ligantes de um composto alvo. 47

Um método de pesquisa e amplificação de fagos exemplificativo inclui o seguinte: a. Contacto de uma pluralidade de diversos fagos de exposição com um composto alvo; b. Separar o fago que se liga ao composto alvo do fago não ligado; c. Recuperar o fago que se liga ao composto alvo; d. Infectar células hospedeiras com o fago que se liga ao composto alvo; e. Produzir replicados de fago a partir de células infectadas; f. opcionalmente, repetir a. a d. uma ou mais vezes, e. g., uma a seis vezes; g. Recuperar o fago ligado ou ácido nucleico no fago, e. g., para caracterização individual. 0 método pode ser adaptado para utilização com o fago que contém genomas de fago ou fagos que contém fagemídeos.

Para produzir o fago (e. g., no passo e ou antes do passo a.) as células hospedeiras são mantidas sob condições que proporcionam um nível seleccionado de actividade de transcrição do promotor regulável, e. g., indutível, durante a produção de fago. Num exemplo em que o promotor indutível é um promotor lac, 48 um indutor lac (e. g., IPTG) ou um agente que inibe a actividade de um promotor lac (e. g., glucose) pode ser incluída no meio de crescimento. Numa forma de realização, são utilizadas concentrações elevadas de glucose (e. g., >1%). Em outra forma de realização, são utilizadas baixas concentrações de glucose (e. g., <0,1%). A regulação da expressão da proteína exposta, e. g., contendo um domínio de Kunitz, pode proporcionar um meio de regulação da valência do domínio à superfície da partícula de fago. Para implementações em que o domínio de Kunitz é expressa como uma fusão com uma porção da proteína menor da cápsula, e. g., o domínio de âncora de uma proteína do gene III, está sobre o controlo do promotor lac e é co-expressa com outra cópia da proteína de cápsula, e. g., uma proteína do gene III de comprimento total, a valência de uma proteína exposta pode ser variada como se segue: Na presença de glucose, o promotor lac será reprimido e a proteína exposta será expressa a uma baixa valência, e. g., 0-1 cópias por partícula de fago; na presença de IPTG, o promotor lac será induzido e a proteína exposta será expressa a um valência superior, e. g., pelo menos 1,0, 1,5, 1,8 ou 2,0 cópias por partícula de fago, e. g., em média.

Em algumas implementações, a proteína exposta é ligada à proteína de cápsula principal (VIII). O fago produz grandes quantidades da proteína do gene VIII (vni) . A secreção parcial de uma proteína exposta ligada à VIII madura pode ser inferior à produção de VIII de tipo selvagem. Deste modo, a redução da valência de uma proteína exposta pode também ser conseguida pela ligação da proteína exposta a VIII, e. g., VIII madura. 49

As condições para a produção de fago podem incluir uma alteração na temperatura. 0 abaixamento da temperatura de incubação durante um intervalo de tempo especifico durante a produção de fagos pode facilitar a organização da sequência de aminoácidos exposta. Um processo exemplificativo para cultivar as células hospedeiras durante a produção de fagos inclui um periodo de incubação de 20 minutos, a 37 °C, seguido por um período de incubação de 25 minutos, a 30 °C.

Após qualquer determinado ciclo de selecção, o fago individual pode ser analisado isolando colónias de células infectadas sob baixa multiplicidade de condições de infecção. Cada colónia bacteriana é cultivada sob condições que resultam na produção de fago, e. g., em poços de microplacas. Os fagos são recolhidos a partir de cada cultura e utilizados num ensaio de ELISA. O composto alvo está ligado a um poço da placa de microtitulação e contacta com o fago. As placas são lavadas e a quantidade de fago ligado é detectada, e. g., utilizando um anticorpo para o fago. A selecção de fago que se liga a uma molécula alvo inclui colocar em contacto o fago com a molécula alvo. A molécula alvo pode ser ligada a um suporte sólido, directa ou indirectamente. As partículas de fago que se ligam ao alvo são então imobilizadas e separadas a partir de membros que não se ligam ao alvo. As condições do passo de separação podem variar na restringência. Por exemplo, o pH e a força iónica podem ser variados a partir das condições fisiológicas. Podem ser realizados múltiplos ciclos de ligação e separação.

Os métodos covalentes e não covalentes podem ser utilizados para ligar moléculas alvo a um suporte sólido ou insolúvel. 50 resma

Estes suportes podem incluir uma matriz, esfera, superfície planar ou imunotubo. Num exemplo de um método de ligação não covalente de ligação, as moléculas alvo são ligadas a um membro de um par de ligação. 0 outro membro de par de ligação está ligado a um suporte. A estreptavidina e biotina são um exemplo de um par de ligação que interage com elevada afinidade. Outros pares de ligação não covalentes incluem a glutationa-S-transferase e glutationa (ver, e. g., documento U.S. 5654176), hexa-histidina e Ni2+ (ver, e. g., Patente Alemã N° DE 19507166) e um anticorpo e um péptido epitopo (ver, e. g., Kolodziej e Young (1991) Methods Enz. 194:508-519 para métodos gerais para proporcionar um epitopo marcador).

Os métodos covalentes de ligação de compostos alvo incluem métodos de reticulação química. Os reagentes reactivos podem criar ligações covalentes entre grupos funcionais na molécula alvo e o suporte. Exemplos de grupos funcionais que podem ser quimicamente reagidos são os grupos amino, tiol e carboxilo. A N-etilmaleimida, iodoacetamida, N-hidrosucinimida e glutaraldeído são exemplos de reagentes que reagem com grupos funcionais .

Os membros da biblioteca de exposição podem ser seleccionados ou capturados com uma variedade de métodos. O fago pode ser capturado por aderência a um vaso, tal como uma placa de microtitulação, que é revestida com a molécula alvo. Alternativamente, o fago pode contactar as moléculas alvo que são imobilizadas numa câmara de fluxo, tal como uma coluna de cromatografia. As partículas de fago podem também ser capturadas por partículas magneticamente responsivas, tais como esferas paramagnéticas. As esferas podem ser revestidas com um reagente que pode ligar-se ao composto alvo (e. g., um anticorpo) ou um 51 reagente que pode indirectamente ligar-se a um composto alvo (e. g., ligação de esferas revestidas com estreptavidina a compostos alvo biotinilados). A identificação de membros úteis da exposição pode ser automatizada. Ver, e. g., documento US-2003-0129659-A1. Os dispositivos adequados para a automatização incluem sistemas de transporte de placas multi-poços, processadores de partículas de esfera magnética, unidades de manipulação de líquidos, unidades de picagem de colónias e outras robóticas. Estes dispositivos podem ser construídos com especificações próprias ou adquiridos em fontes comerciais, tais como Autogen (Framingham MA), Beckman Coulter (USA), Biorobotics (Woburn MA), Genetix (New Milton, Hampshire UK), Hamilton (Reno NV), Hudson (Springfield NJ), Labsystems (Helsinki, Finland), Packard Bioscience (Meriden CT) e Tecan (Mannedorf, Suiça).

Em alguns casos, os métodos aqui descritos incluNum processo automatizado para manipulação de partículas magnéticas. 0 composto alvo é imobilizado nas partículas magnéticas. 0 sistema KingFisher™, um processador de partículas magnéticas de Thermo LabSystems (Helsinki, Finlândia), por exemplo, pode ser utilizado para seleccionar os membros da biblioteca de exposição contra o alvo. A biblioteca de exposição é colocada em contacto com as partículas magnéticas num tubo. As esferas e a biblioteca são misturadas. Depois um pino magnético, coberto por uma folha descartável, recupera as partículas magnéticas e transfere-as para outro tubo que inclui uma solução de lavagem. As partículas são misturadas com a solução de lavagem. Desta forma, o processador da partícula magnética pode ser utilizado para transferir serialmente as partículas magnéticas para múltiplos tubos para lavar os membros da biblioteca não especificamente ou 52 fracamente ligados das partículas. Após lavagem, as partículas podem ser transferidas para um vaso que inclui um meio que suporta a amplificação dos membros da biblioteca de exposição. No caso da exposição em fagos o vaso pode também incluir células hospedeiras.

Em algumas casos, e. g., para a exposição em fagos, o processador pode também separar as células hospedeiras infectadas das partículas previamente utilizadas. 0 processador pode também adicionar um novo fornecimento de partículas magnéticas para uma ronda adicional de selecção. A utilização de automação para realizar a selecção pode aumentar a reprodutibilidade do processo de selecção assim como o resultado.

Uma partícula magneticamente responsiva exemplificativa é a DYNABEAD® disponível de DYNAL BIOTECH (Oslo, Noruega). As DYNABEADS® proporcionam uma superfície esférica de tamanho uniforme, e. g., 2 pm, 4,5 pm e 5,0 pm de diâmetro. As esferas incluem Fe203 e Fe304 gama como material magnético. As partículas são superparamagnéticas uma vez que possuem propriedades magnéticas num campo magnético, mas não possuem magnetismo residual fora do campo. As partículas estão disponíveis com uma variedade de superfícies, e. g., hidrofílico com uma superfície carboxilada e hidrofóbica com uma superfície activada por tosilo. As partículas podem também ser bloqueadas com um agente de bloqueamento, tal como BSA ou caseína para reduzir a ligação e acoplamento não específicos de outros compostos além do alvo da partícula. 53 0 alvo é ligado à partícula paramagnética directa ou indirectamente. Uma variedade de moléculas alvo pode ser adquirida na forma ligada a partículas paramagnéticas. Num exemplo, um alvo é quimicamente acoplado a uma partícula que inclui um grupo reactivo, e. g., um agente de reticulação (e. g., éster de N-hidroxi-succinimidilo) ou um tiol.

Em outro exemplo, o alvo é ligado à partícula utilizando um membro de um par de ligação específico. Por exemplo, o alvo pode ser acoplado a biotina. 0 alvo é então ligado a partículas paramagnéticas que são revestidas com estreptavidina (e. g., M-270 e M-280 Streptavidin DYNAPARTICLES® disponíveis em DYNAL BIOTECH, Oslo, Noruega). Numa forma de realização, o alvo é colocado em contacto com a amostra antes da ligação do alvo às partículas paramagnéticas.

Em algumas implementações, a automação é também utilizada para analisar os membros da biblioteca de exposição identificada no processo de selecção. A partir da amostra final, podem ser obtidos os clones individuais de cada membro em exposição. 0 domínio de Kunitz de cada membro pode ser individualmente analisados, e. g., para avaliar uma propriedade funcional. Por exemplo, o domínio pode ser avaliado para determinar se afecta a actividade enzimática de uma protease alvo in vitro ou in vivo. Os métodos para avaliar a actividade de protease e a sua cinética são bem conhecidas. Por exemplo, a digestão de substratos marcados pode ser avaliada.

As propriedades funcionais exemplificativas incluem: um parâmetro cinético (e. g., para ligação ao composto alvo), um parâmetro de equilíbrio (e. g., avidez, afinidade e assim por diante, e. g., para a ligação ao composto alvo), uma propriedade 54 estrutural ou bioquímica (e. g., estabilidade térmica, estado de oligomerização, solubilidade e assim por diante) e uma propriedade fisiológica (e. q., eliminação renal, toxicidade, especificidade para o tecido alvo e assim por diante) e assim por diante. Os métodos para análise dos parâmetros da ligação incluem ELISA, ensaios de ligação homogénea e SPR. Por exemplo, os ELISA numa proteína exposta, e. g., contendo um domínio de Kunitz variado, podem ser realizadas directamente, e. g., no contexto do fago ou outros veículos de exposição ou a proteína exposta é removida do contexto do fago ou outros veículos de exposição.

Cada membro podem também ser sequenciado, e. g., para determinar a sequência de aminoácidos do domínio de Kunitz que é exposto.

Compostos alvo

Num aspecto, o método pertence à selecção de fago que se liga à molécula alvo. Qualquer composto pode servir como molécula alvo. A molécula alvo pode ser uma molécula pequena (e. g., uma molécula orgânica ou inorgânica pequena), um polipéptido, um ácido nucleico, um polissacárido e assim por diante. A título de exemplo, são descritos para alvos vários exemplos e configurações. Obviamente, podem ser utilizados compostos alvo para além de ou possuindo outras propriedades além das listadas a seguir.

As bibliotecas do domínio de Kunitz podem ser utilizadas para seleccionar polipéptidos que são capazes de inibir proteases. Por exemplo, o método pode ser utilizado para 55 identificar domínios de Kunitz, particularmente domínios de Kunitz humanos efectivos, que se ligam e/ou inibem a plasmina, tripsina, quimotripsina, elastase e outras proteases.

As formas activas e inactivas da protease podem ser utilizadas. Por exemplo, as formas activas incluem formas que foram activadas a partir de um zimogénio, e. g., por remoção de um pro-domínio. As proteases segregadas são tipicamente também processadas para remover uma sequência sinal.

As formas inactivas incluem proteases quimicamente modificadas e proteases geneticamente modificadas. Ainda outras formas inactivas incluem proteases numa forma de zimogénio e proteases que são ligadas através de um inibidor ou outras moléculas inactivantes. As proteases geneticamente modificadas podem incluir alterações genéticas (e. g., uma substituição, inserção ou deleção) que diminuem a actividade em pelo menos 20% (e. g., pelo menos, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 99%). Uma alteração pode estar no ou próximo do sítio activo, por exemplo, num resíduo do sítio activo, e. g., um membro de uma tríade catalítica.

Por exemplo, as proteases geneticamente modificadas podem ser utilizadas para proporcionar uma forma inactiva em que o sítio activo não é ocluso. Esta molécula pode ser utilizada, e. g., num rastreio ou selecção inicial, para encontrar domínios de Kunitz que se ligam ao sítio activo, mesmo se estes domínios forem susceptíveis e para clivagem pela protease alvo. As formas inactivas em que o sítio activo está ocluso (e. g., pela ligação de um inibidor) podem ser utilizadas para rejeitar domínios de Kunitz que interagem com a protease alvo, mas não no sítio activo. 56

As moléculas alvo da proteína podem ter uma conformação física específica, e. g. uma forma organizada ou não organizada ou uma forma activa ou inactiva. Numa forma de realização, a proteína possui mais do que uma conformação específica. Por exemplo, os priões podem adoptar mais do que uma conformação. A conformação nativa ou a deficiente podem ser um alvo desejável, e. g., para isolar agentes que estabilizam a conformação nativa ou que identificam ou alcançam a conformação deficiente.

Em algumas formas de realização, a proteína alvo é associada com uma doença, e. g., doenças e distúrbios neoplásicos, cardiovasculares, neurológicos, inflamatórios e pulmonares.

Composições farmacêuticas E proporcionada uma composição que inclui uma proteína contendo domínio de Kunitz que se liga ao alvo e. g., uma célula ou molécula alvo (e. g., uma proteína alvo, e. g., uma protease). A composição pode ser uma composição farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a proteína contendo domínio de Kunitz pode ser formulada em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, as "composições farmacêuticas" incluem composições de diagnóstico marcadas (e. g., para imagiologia in vivo), assim como composições terapêuticas.

Como aqui utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento isotónico e de absorpção e semelhantes que são 57 fisiologicamente compatíveis. De um modo preferido, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (e. g., por injecção ou infusão). Dependendo da via de administração, a proteína contendo domínio de Kunitz pode ser revestida por um material para proteger o composto da acção de ácidos e outras condições naturais que o podem inactivar.

Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a actividade biológica desejada do composto parental e não transmite quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver e. g., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Os exemplos destes sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídico, fosforoso e semelhantes, assim como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos com fenilo, ácidos hidroxialcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Os sais de adição de base incluem os derivados de metais alcalino terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, assim como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.

As composições que incluNuma proteína contendo domínio de Kunitz podem estar numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (e. g., soluções injectáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, 58 pós, lipossomas e supositórios. As composições típicas estão na forma de soluções injectáveis ou infusíveis, tais como composições semelhantes às utilizadas para administração de anticorpos a humanos. Um modo comum de administração é o parentérico (e. g., intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Numa forma de realização, a proteína contendo domínio de Kunitz é administrada por infusão ou injecção intravenosa. Em outra forma de realização, a proteína contendo domínio de Kunitz é administrada por injecção intramuscular ou subcutânea. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outras de estrutura ordenada adequada para uma concentração elevada de fármaco. As soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação da proteína contendo domínio de Kunitz na quantidade necessária num solvente apropriado com uma ou uma combinação de ingredientes enumeradas acima, conforme necessário, seguidas por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto activo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os acima enumerados. A composição pode ser preparada através de um método que inclui secagem ou desidratação (e. g., secagem por vácuo e liofilização), filtração estéril, dispersão de partículas e adição de tensioactivo. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, tais como acetato de etilenovinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação destas formulações estão patenteados ou geralmente conhecidos. Ver, e. g., Sustained and Controlled 59

Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978. A proteína contendo domínio de Kunitz pode ser administrada através de uma variedade de métodos, e. g., injecção ou infusão intravenosa. Por exemplo, para aplicações terapêuticas, a proteína contendo domínio de Kunitz pode ser administrada por infusão intravenosa a uma taxa inferior a 30, 20, 10, 5 ou 1 mg/min para atingir uma dose de cerca de 1 a 100 mg/m2 ou 7 a 25 mg/m2. A via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.

As composições farmacêuticas podem ser administradas por um dispositivo médico, e. g., dispositivos de injecção hipodérmica sem agulha, implantes, bombas implantáveis (e. g., bombas de micro-infusão), inaladores e supositórios. Ver, e. g., Patente U. S. N° 5399163, 5383851, 5312335, 5064 413, 4941 880, 4790824, 4596556, 4487603, 4486194, 4447 233, 4 447224, 4439196 e 4475196. Uma bomba micro-infusão implantável pode, por exemplo, ser utilizada para dispensar uma composição a uma taxa controlada.

Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta óptima desejada (e. g., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um bólus único, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. As composições parentéricas podem ser formuladas em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas preparadas como 60 dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário.

Um intervalo exemplificativo, não limitante para uma quantidade eficaz terapeuticamente ou profilacticamente eficaz de uma proteína contendo domínio de Kunitz é 0,1-20 mg/kg, 0,02-2 mg/kg, 0,1-5 mg/kg ou 1-10 mg/kg. A proteína contendo o domínio de Kunitz pode ser administrada por infusão intravenosa a uma taxa inferior a 20, 10, 5, 1 ou 0,3 mg/min para atingir uma dose de cerca de 1 a 100 mg/m2, cerca de 5 a 30 mg/m2 ou cerca de 0,5 a 7 mg/m2. Os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade do estado a ser aliviado. Os regimes de dosagem específica podem ser ajustados ao longo do tempo.

As composições farmacêuticas podem incluir uma quantidade terapêutica ou profilacticamente eficaz de uma proteína contendo domínio de Kunitz. Estas quantidades referem-se a uma quantidade eficaz, em dosagem e durante os períodos de tempo necessários, para conseguir o resultado terapêutico ou profiláctico desejado. Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" modula, de um modo preferido, um parâmetro mensurável ou um sintoma de um distúrbio relevante em, pelo menos, cerca 20%, 40%, 60% ou 80% em relação aos indivíduos não tratados. A capacidade da proteína contendo domínio de Kunitz para modular um distúrbio pode ser avaliada num sistema de modelo animal. Por exemplo, a capacidade da proteína contendo domínio de Kunitz inibir, pelo menos, um sintoma de cancro pode ser avaliado num modelo animal que possui tumores humanos enxertados. Os ensaios in vitro podem também ser utilizados. 61

Numa forma de realização, a proteína contendo domínio de Kunitz é conjugada com um agente, e. g., um fármaco citotóxico ou radioisótopo. São também contemplados kits compreendendo uma proteína contendo domínio de Kunitz e instruções para a sua utilização, e. g., tratamento, utilização profiláctica ou de diagnóstico. Numa forma de realização, as instruções para as aplicações de diagnóstico incluem a utilização de uma proteína contendo domínio de Kunitz para detectar um alvo, in vitro, e. g., numa amostra, e. g., uma biópsia ou células de um doente possuindo um cancro ou distúrbio neoplásico ou in vivo. Em outra forma de realização, as instruções para aplicações terapêuticas incluem dosagens e/ou modos de administração sugeridos num doente com um cancro ou distúrbio neoplásico. 0 kit pode ainda conter, pelo menos, um reagente adicional, tal como um agente de diagnóstico ou terapêutico, e. g., um agente de diagnóstico ou terapêutico como aqui descrito e/ou uma ou mais proteínas adicionais que incluNum domínio de Kunitz de ligação ao alvo, formulada como apropriado, Numa ou mais preparações farmacêuticas separadas.

Tratamentos A proteína contendo domínios de Kunitz identificados pelo método aqui descrito e/ou aqui detalhado possui utilidades terapêuticas e profilácticas. Por exemplo, estas proteínas podem ser administradas a células em cultura, e. g. in vitro ou ex vivo ou num indivíduo, e. g., in vivo, para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar uma variedade de distúrbios, tais como cancros e doença cardiovascular. 62

Como aqui utilizado, o termo "tratar" ou "tratamento" é definido como a aplicação ou administração de uma proteína contendo domínio de Kunitz a um indivíduo ou uma célula ou tecido do indivíduo para prevenir, melhorar ou curar o distúrbio ou, pelo menos, um sintoma do distúrbio. Por exemplo, a proteína pode ser administrada numa quantidade eficaz para melhorar, pelo menos, um sintoma de um distúrbio. Como aqui utilizado, o termo "indivíduo" inclui humanos, e. g., um doente possuindo o distúrbio e animais não humanos. A proteína contendo domínio de Kunitz pode ser administrada a um indivíduo humano, e. g., para efeitos terapêuticos ou a um indivíduo não humano, e. g., para efeitos veterinários ou como um modelo animal de doença humana. 0 método pode ser utilizado para tratar um cancro incluindo todos os tipos de crescimento cancerosos ou processos oncogénicos, tecidos metastásicos ou células, tecidos ou órgãos transformados de forma maligna, independentemente do tipo histopatológico ou estádio de invasão. Exemplos de distúrbios cancerosos incluem, mas não estão limitados a, tumores sólidos, tumores de tecidos moles e lesões metastásicas e cancros de origem hematopoiética. Exemplos de tumores sólidos incluem malignidades, e. g., sarcomas, adenocarcinomas e carcinomas de vários sistemas de órgãos, tais como os que afectam o pulmão, mama, tracto linfóide, gastrointestinal (e. g., cólon) e genito-urinário (e. g., renal, células uroteliais), faringe, próstata e ovário. 0 método pode ser utilizado para tratar um distúrbio caracterizado por actividade excessiva de uma protease que a 63 proteína contendo domínio de Kunitz inibe. Por exemplo, a protease pode ser uma protease que pode modificar um factor de coagulação ou um componente de matriz extracelular.

Utilizações em Diagnóstico

As proteínas contendo domínio de Kunitz também possuem utilizações de diagnóstico in vitro e in vivo. Estes podem ser utilizados, e. g., num método de diagnóstico para detectar a presença de um alvo, in vitro (e. g., uma amostra biológica, tal como tecido, biópsia, e. g., um tecido canceroso) ou in vivo (e. g.r imagiologia in vivo num indivíduo). 0 método inclui: (i) colocar em contacto a amostra com a proteína contendo domínio de Kunitz; e (ii) detectar a formação de um complexo entre a proteína contendo domínio de Kunitz e a amostra. 0 método pode também incluir o colocar em contacto uma amostra de referência (e. g., uma amostra de controlo) com a proteína contendo domínio de Kunitz e determinação da extensão da formação do complexo entre a proteína contendo domínio de Kunitz e a amostra relativamente ao mesmo para a amostra de referência. Uma alteração, e. g., uma alteração estatisticamente significativa, na formação do complexo na amostra ou indivíduo relativamente à amostra de controlo ou indivíduo pode ser indicativa da presença de um alvo na amostra.

Outro método inclui: (i) administrar a proteína contendo domínio de Kunitz a um indivíduo; e (iii) detectar a formação de um complexo entre a proteína contendo domínio de Kunitz e o indivíduo. A detecção pode incluir a determinação da localização ou tempo de formação do complexo. 6 4 A proteína contendo domínio de Kunitz pode ser directa ou indirectamente marcada com uma substância detectável para facilitar a detecção. As substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. As moléculas fluorescentes exemplificativas incluem corantes de xanteno, e. g., fluoresceína e rodamina e naftilaminas. Exemplos de marcadores úteis para a imagiologia de diagnóstico de acordo ~ i 1 λ 1 com a presente invenção incluem radiomarcadores, tais como I, mIn, 1231 , 99mTc, 32P, 1251, 3H, 14C e 188Rh, marcas fluorescentes tais como fluoresceína e rodamina, marcas activas de ressonância magnética nuclear, isótopos emissores de positrões detectáveis por um digitalizador de tomografia de emissão de positrões ("PET"), quimioluminescentes, tais como luciferina e marcadores enzimáticos tais como peroxidase ou fosfatase. Exemplos destes agentes de contraste incluem agentes paramagnéticos e ferromagnéticos ou agentes superparamagnéticos. Os quelatos (e. g., os quelatos de EDTA, DTPA e NTA) podem ser utilizados para ligar (e reduzir a toxicidade) de algumas substâncias paramagnéticas (e. g., Fe+3, Mn+2, Gd+3) . As proteínas contendo domínio de Kunitz podem também ser marcadas com um grupo indicador contendo o átomo i9F activo em RMN.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção das inserções da biblioteca de domínios de Kunitz. A biblioteca foi preparada utilizando os oligonucleótidos preparados utilizando fosforamidites de trinucleótido activadas 65 para os codões variados e adição normal de nucleótido único para as regiões constantes. A sequência de aminoácidos desta biblioteca de dominios de Kunitz é apresentada na FIG. 4.

Tabela 1: Concepção de uma primeira biblioteca exemplificativa

Posição Variabilidade Comentário 11 19 todos excepto C 13 19 todos excepto C 15 18 todos excepto C e P 16 6 AGEDHT 17 18 todos excepto C e P 18 18 todos excepto C e P 19 19 todos excepto C 34 19 todos excepto C 39 19 todos excepto C 40 2 AG Total 1,73E+11

Exemplo 2: Produção de uma primeira biblioteca exemplificativa de domínio de Kunitz.

Após montagem por PCR das inserções da biblioteca, foi efectuada uma digestão por restrição utilizando as enzimas Ncol e XbaI. As inserções da biblioteca foram purificadas e então ligadas no vector monovalente DY3P82 de exposição em fagos que foi digerido e purificado da mesma forma. 0 ADN ligado DNA foi transformado em células electrocompetentes DH5-a resultando num total de 2,8 x 109 transformantes. 66 0 vector de exposição, DY3P82, é resistente a ampicilina, contém uma cópia de comprimento total do gene iii e também uma cópia truncada do gene ííí como âncora para o dominio de Kunitz exposto (Fig. 1). A expressão da fusão exposição/gene III é controlada pelo promotor/operador de lac. A utilização do promotor lac permite o controlo do nivel de expressão e consequentemente o nivel de exposição pela adição de IPTG (indução da exposição) ou glucose (repressão da exposição) 0 fago DY3P82 é um derivado de Ml3mpl8. 0 DY3P82 foi construído por alteração do sitio KasI de Ml3mpl8 num sitio BamRl. 0 segmento a partir deste sitio BamRI até ao sítio Bsu361 foi substituído com o ADN apresentado. Este compreende um gene bla (obtido de pGemZ3f e modificado por remoção dos sítios de restrição ApaLI e BssSI) e a cassete de exposição. Esta cassete de exposição exemplificativa inclui: a) o promotor PlacZ (entre XhoI e PflMI), b) um sítio de ligação ao ribossoma a montante da sequência sinal de M13, c) uma sequência sinal de M13 modificada que contém os sítios de restrição Ncol e Eagl, d) partes do domínio LACI-Kl incluindo os sítios NsiI, MluI, AgeI e Xbal, e) um ligante incluindo um sítio MieI, f) o terceiro domínio do gene III de M13 (o ADN codifica a sequência de aminoácidos do domínio 3 de M13, mas muitos dos codões são picados para serem diferentes dos do gene III endógeno), g) dois codões stop, h) um sítio Avrll site i) no terminador trp e j) sítio Nsil (os quais existem em número de dois no vector). 67

Exemplo 3: Exposição por uma biblioteca de domínio de

Kunitz.

Os fagos contendo a biblioteca foram preparados na presença de glucose (sem exposição) ou na presença de IPTG (exposição) e um ELISA efectuada utilizando uma preparação de anticorpo anti-DX-88 policlonal. Esta biblioteca também possui propriedades de manipulação melhoradas, e. g., uma viscosidade melhorada. 0 DX-88 é um domínio de Kunitz derivado de LACI-K1. Anticorpos policlonais anti-DX-88 reagem de forma cruzada com isolados de bibliotecas de LACI-Kl em transferências de western e ELISA.

Os poços de uma placa de microtitulação foram revestidos com um anticorpo anti-gene VIII para facilitar a capture do fago. Os poços foram então bloqueados com um reagente apropriado (tal como BSA) para evitar a ligação não específica e finalmente lavados com PBS/0,05% de Tween-20 (PBST). Os fagos da biblioteca foram então aplicados à placa de microtitulação e deixados ligar durante 1 hora a 37 °C. Os fagos não ligados foram removidos por lavagem, utilizando PBST, antes da adição de um anticorpo anti-DX-88. 0 anticorpo DX-88 foi deixado ligar, depois lavado com PBST e um anticorpo secundário conjugado com HRP apropriado foi adicionado. Após incubação com o anticorpo secundário e lavagem, o ELISA foi desenvolvido utilizando TMB.

Os fagos que expunham dx-88 polivalentemente foram incluídos como um controlo positivo. Estes fagos não são reguláveis com IPTG ou glucose. A deslocação das condições de indução (mais IPTG) para as condições de repressão (mais glucose) não devem 68 ter efeito no fago DX-88. Os clones R1F4, R2D1, R2F6, R2F8 são isolados de anticorpo clonado no vector de fago DY3P82 e são incluídos como controlos negativos.

Exemplo 4: Identificação de inibidores de protease serina com uma biblioteca de domínios de Kunitz. A biblioteca de Kunitz monovalente tem sido utilizada para identificar ligantes (e presumivelmente inibidores) de uma protease serina recombinante (rSerProtease-1). Foram efectuadas três rondas de selecção. A ligação do fago à rSerProtease-1 biotinilada alvo foi em solução durante duas horas seguida por captura do complexo fago-alvo em esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. A análise de ELISA dos isolados de fago da terceira ronda foi realizada utilizando placas revestidas com rSerProtease-1 e um anticorpo anti-gene VIII para detectar o fago. Isolou-se um número de fagos que se ligavam especificamente a rSerProtease-1.

Exemplo 5: Uma segunda biblioteca de domínios de Kunitz exemplificativa

Uma biblioteca de domínios de Kunitz semelhante à biblioteca de domínios de Kunitz no Exemplo 4 foi também construída. A sequência de aminoácidos desta biblioteca é mostrada na FIG 5. Esta biblioteca contém sítios adicionais de variação nas posições 32, 34, 39 e 40. O tamanho teórico desta biblioteca é 2,64 x 1014 de sequências de aminoácidos únicas. 69

Numa forma de realização, a biblioteca utiliza a proteína de cápsula do gene iii como âncora. Os domínios de Kunitz são expostos em cerca de cinco cópias por fago. Embora a proteólise no periplasma possa reduzir a valência, cada fago possui duas ou mais cópias que podem levar a efeitos de avidez indesejados.

Tabela 1: Concepção de uma segunda biblioteca exemplificativa

Posição Variabilidade Comentário 11 19 todos excepto C 13 19 todos excepto C 15 18 todos excepto C e P 16 6 AGEDHT 17 18 todos excepto C e P 18 18 todos excepto C e P 19 19 todos excepto C 34 19 todos excepto C 39 19 todos excepto C 40 18 AG 4 6 18 todos excepto C e P Total 5,33E+14 70

Exemplo 6 0 que se segue são sequências de vector exemplificativas. DY3P82

AATGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAA

ATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTAATGGTCAAACTAAATC

TACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTATATGGAATGAAACTTCCAGACACCGT

ACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGTTGAGCTACAGCATTATATTCAGCAATTAAGCT

CTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAA

TCCTGACCTGTTGGAGTTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACG

CGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTT

CTGACTATAATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTC

TGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAATATTTATGACGATTCCGCAGTA

TTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTG

CAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTTTATCGTCGTCTGGTAAACGAGGGTTATGATAG

TGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAA

TGTGGTATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGT

TAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCC

AGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCACAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTC

AAGCCCAATTTACTAÇTCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAA

TGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACT

CTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTT

TCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAA

GTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTC

CGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAG

TGTATTCTTTTGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTT

TACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAG

CCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAA 71

AGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCG

ATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATGGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCT

CGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTG

GAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATT

CTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCATACAGAAAATTCATT

TACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGT

CTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTA

CATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGG

CGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGAT

ACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTA

CTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTGTCAGCCTCTTAATAC

TTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTATACG

GGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTAT

CATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCA

TTCTGGCTTTAATGAGGATTTATTTGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTG

CCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTG

AGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTC

CGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAG

GGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAAC

TTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTC

CGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATG

GCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTAC

CTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTGGCGCTGGTAAACCATA

TGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTT

TTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATA

AGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGGT

TTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTA

AGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCT

TGTGGGTTATGTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTT

CAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGG

CTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAA

ATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAG

CGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAATAGCAACTAATCTTGAT

TTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTA

GAATACCGGATAAGCCTTCTATATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGATTC

CTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAAT

ACCCGTTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTC

GTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATTGTTGATAAACA

GGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACT

TTACCTTTTGTCGGTACTTTATATTCTCTTATTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTA

AATTACATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCG

TTGGCTTTATACTGGTAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCT

AGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGGT

ATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAA

GTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAGCATTTACATATAGTTAT

ATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATA

AATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGA

TTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACA

TATATTGATTTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAAT

GTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAGGTAATTG 72

AAATGAATAATTCGCCTCTGCGGGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGA

ATCCGTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTGTTACTGTATATTCATCTGACGTT

AAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCAAATAATTTTGATA

TGGTAGGTTCTAACCCTTCCATAATTCAGAAGTATAATCCAAACAATCAGGATTATAT

TGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGT

GGTTTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTAATAACGTTC

GGGCAAAGGATTTAATACGAGTTGTCGAATTGTTTGTAAAGTCTAATACTTCTAAATC

CTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCTCCTAAAGAT

ATTTTAGATAACCTTCCTGAATTCCTTTCAACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATAT

TGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGC

TGCTGGCTCTCAGCGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCT

GTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCGATGTTTTAGGGCTAT

CAGTTCGCGCATTAAAGACTAATAGCCATTCAAAAATATTGTCTGTGCCACGTATTCT

TACGCTTTCAGGTCAGAAGGGTTCTATCTCTGTTGGCCAGAATGTCCCTTTTATTACT

GGTCGTGTGACTGGTGAATCTGCCAATGTAAATAATCCATTTCAGACGATTGAGCGTC

AAAATGTAGGTATTTCCATGAGCGTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGT

TCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTT

ATTACTAATCAAAGAAGTATTGCTACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTT

TACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCT

GTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAA

AGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTA

AGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAG

CGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCG

TCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTC

GACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTC

GCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCGAAACTGGAAC

AACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTT.TGCCGATTTCG

GAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGAGCGGTTGCT

GCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCGGTCTCACTGGTG

AAAAGAAAAACCACCCTGGATCCAAGCTTGCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG

CGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA

CAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAAC

ATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCA

CCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGCGCACTAGTGGGT

TACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAAC

GTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTAT

TGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTT

GAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTAT

GCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGAT

CGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGC

CTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCA

CGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTAC TCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCA'

CTTÇTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTG

AGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT

CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATC

GCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCAT

ATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGAT

CCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGTACG

TAAGACCCCCAAGCTTGTCGACTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCAC 73

CAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGACGCTCGAGCGCAACG

CAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC

GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTAT

GACCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAA

TTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCCATGGCGGCCGAGATGCATT

CATTCATTTTCACGCGTCAGTGCGAGGAAAACCGGTTCGAGTCTCTAGAGGAATGTAA

GAAGATGTGCACTCGTGATTCTGCTAGCTCTGCTAGTGGCGACTTCGACTACGAGAAA

ATGGCTAATGCCAACAAAGGCGCCATGACTGAGAACGCTGACGAGAATGCTTTGCAAA

GCGATGCCAAGGGTAAGTTAGACAGCGTCGCGACCGACTATGGCGCCGCCATCGACGG

CTTTATCGGCGATGTCAGTGGTTTGGCCAACGGCAACGGAGCCACGGGAGACTTCGCA

GGTTCGAATTCTCAGATGGCCCAGGTTGGAGATGGGGACAACAGTCCGCTTATGAACA

ACTTTAGACAGTACCTTCCGTCTCTTCCGCAGAGTGTCGAGTGCCGTCCATTGGTTTT

CGGTGCCGGCAAGCCTTACGAGTTCAGCATCGACTGCGATAAGATCAATCTTTTCCGC

GGCGTTTTCGCTTTCTTGCTATACGTCGCTACTTTCATGTACGTTTTCAGCACTTTCG

CCAATATTTTACGCAACAAAGAAAGCTAGTGATCTCCTAGGAAGCCCGCCTAATGAGC

GGGCTTTTTTTTTCTGGTATGCATCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACT

GGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGT

CAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAAT

GTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTCCTA

TTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAATGCGAATTTTAACAAAATATTA

ACGTTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTGTTTTTGGGGCTTTTCTGAT

TATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGATTC

TCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAGGCAATGACCTGATAGCCTTTGTAGATCTCTCAAAA

ATAGCTACCCTCTCCGGCATTAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGATG

GTGATTTGACTGTCTCCGGCCTTTCTCACCCTTTTGAATCTTTACCTACACATTACTC

AGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGTTCTAAAAATTTTTATCCTTGCGTTGAAATA

AAGGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAG

CTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTGCTAATTCTTTGCCTTGCCTGTATGA

TTTATTGGATGTT DY3P82LACIK1

AATGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAA

ATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTAATG

GTCAAAGTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTATATGGA

ATGAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGTTGAGCT

ACAGCATTATATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTC

TTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTGTTGGAGTTT

GCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGT

CTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTAT

AATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTCTG

AACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAATATTTATGACGATTCCG

CAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAA

AACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTTTATCGTCGTCTGGTAA

ACGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCG

TTATGTATCTGCATTAGTTGAATGTGGTATTCCTAAATCTCAACTGATGAAT

CTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTT

TTCTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAA

GGT AATTC ACAATGATTAAAGTTGAAATT AAACCATCTCAAGCCCAATTT A 74

CTACTCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCA

GCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACT

CTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGT

CCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCT

CGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATC

AGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGC

TGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTnTGCCTCTTTCGTTTTAG

GTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTC

CTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCG

TTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTT

TAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGAT

GGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTC

ACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGC

CTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTA

GTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAA

AATCCC ATACAGAAAATTC ATTTACT AACGT CTGGAAAGACGACAAAACTT

TAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTG

TAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGG

GCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGA

GGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATAC

ACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCT

GGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAG

CCTCTT AAT ACTTTC ATGTTTCAGAATAAT AGGTTCCGAAATAGGCAGGGG

GCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAA

ACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACT

GGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATTT

ATTTGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTC

AATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGT

GGCT CTGAGGGTGGCGGTTCT GAGGGT GGCGGCT CTGAGGGAGGCGGTTCC

GGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCT

AATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGA

CGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGAT

GGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTG

ATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTC

ACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTG

AATGTCGCCCTTTTGTCTTTGGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGA

TTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTG

CCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGA

GTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGG

TTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCT

TCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTT

AACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTG

ACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTT

TATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAA

AAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAA

CTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGG

AT AAAATTGT AGCTGGGTGC AAAAT AGC AACTAATCTTGATTTAAGGCTTC

AAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAA

TACCGGATAAGCCTTCTATATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGA 75

TTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACT

TGGTTTAATACCCGTTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGAT

TGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGG

ACTTATCTATTGTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGT

TTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTGTCGGTACTTTATATT

CTCTTATTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGCGTTGT

TAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACT

GGTAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCTAGTAATT

ATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGGTAT

TTC AAACC ATTAAATTT AGGT C AGAAG ATG AAATTAACTAAAATATATTT G

AAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAGCATTTA

CATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTC

AGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCT

AAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATT AATT AAT AGCG A

CGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGATTTATGTACTGTT

TCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTT

TTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAGGTAATTGAAATGAATAA

TTCGCCTCTGCGCGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGAATCC

GTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTGTTACTGTATATTCATCTGACG

TTAAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCAAATAA

TTTTGATATGGTAGGTTCTAACCCTTCCATAATTCAGAAGTATAATCCAAAC

AATCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGAT

GATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGTTTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTA

CTCAAAGTTTT AAAATTAAT AACGTTCGGGC AAAGGATTT AAT ACGAGTT G

TCGAATTGTTTGTAAAGTCTAATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTAT

TGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCTCCTAAAGATATTTTAGATAAC

CTTCCTCAATTCCTTTCAACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTG

AGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGC

TGCTGGCTCTCAGCGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTC

ACGTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCGATGT

TTTAGGGCTATCAGTTCGCGCATTAAAGACTAATAGCCATTCAAAAATATT

GTCTGTGCCACGTATTCTTACGCTTTCAGGTCAGAAGGGTTCTATCTCTGTT

GGCCAGAATGTCCCTTTTATTACTGGTCGTGTGACTGGTGAATCTGCCAATG

TAAATAATCCATTTCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAGGTATTTCCATGA

GCGTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAG

CAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAAT

CAAAGAAGTATTGCTACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTA

CTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGT

TCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCT

AACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCC

CTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGAC

CGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCT

TTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCC

TTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGAT

TTGGGTGATGGTTGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGT

TGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACT

CAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCG

GAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACC

GCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGC 76

CCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGATCCAAGCTTGCAGGTGG CACnTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATA CATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAAT AATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTA TTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTG GTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGCGCACTAGTGGGTTACATC GAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAA CGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTAT CCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATG GCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACA CTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCG CTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACÇCGCCTTGATCGTTGGGAACC GGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTG TAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTC TAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAG GACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATC TGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGA TGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAAC TATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAA GCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTA AAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATC TCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGTACGTAAGACCC CCAAGCTTGTCGACTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACC AGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGACGCTCGAGC GCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTAC ACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATT TCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCCTTTT TTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGT . TCCTTTGTATTCCATGGCGGCCGAGATGCATTCATTCTGCGCTTTCAAAGGT GATGACGGTCCGTGTAAAGCTATCATGAAACGTTTCTTCTTCAACATTTTCA CGCGTCAATGTGAAGAGTTCATTTACGGTGGTTGTGAAGGTAACCAGAACC GGTTCGAATCTCTAGAGGAATGTAAGAAGATGTGCACTCGTGATTCTGCTA GCTCTGCTAGTGGCGACTTCGACTACGAGAAAATGGCTAATGCCAACAAAG GCGCCATGACTGAGAACGCTGACGAGAATGCTTTGCAAAGCGATGCCAAG GGTAAGTTAGACAGCGTCGCGACCGACTATGGCGCCGCCATCGACGGCTTT ATCGGCGATGTCAGTGGTTTGGCCAACGGCAACGGAGCCACCGGAGACTTC GCAGGTTCGAATTCTCAGATGGCCCAGGTTGGAGATGGGGACAACAGTCCG CTTATGAACAACTTTAGACAGTACCTTCCGTCTCTTCCGCAGAGTGTCGAGT GCCGTCCATTCGTTTTCGGTGCCGGCAAGCCTTACGAGTTCAGCATCGACTG CGATAAGATCAATCTTTTCCGCGGCGTTTTCGCTTTCTTGCTATACGTCGCT ACTTTCATGTACGTTTTCAGCACTTTCGCCAATATTTTACGCAACAAAGAAA

ATGCATCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCAC

GGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAAT

CCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTA

ATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATG

GCGTTCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAATGCGAA

TTTT A AC AAA ATATTAACGTTTAC AATTTAAATATTTGCTTAT ACAAT CTTC 77

CTGTTTTTGGGGCTnTCTGATTATCAAC C GGGGTACATATGATTGACATGC TAGTTTTACGATTACCGTTCATCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACT CTCAGGC AATGACCTGATAGCCTTTGTAGATCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCA TTAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGATGGTGATTTGACTGT CTCCGGCCTTTCTCACCCTTTTGAATCTTTACCTACACATTACTCAGGCATTG C ATTTAAAATAT ATGAGGGTT CTAAAAATTTTTATCCTTGCGTT GAAATAAA GGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGAT TTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTGCTAATTCTTTGCCTTG CCTGTATGATTTATTGGATGTT

Lisboa, 1 de Abril de 2011 78

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Biblioteca compreendendo uma pluralidade de partículas de fago filamentoso, incluindo cada partícula de fago da pluralidade (i) uma proteína exposta que compreende um domínio de Kunitz e pelo menos uma porção de um gene III da proteína de cápsula de fago que fisicamente se liga à partícula de fago e que está fundida com o domínio de Kunitz, (ii) um ácido nucleico compreendendo (a) genes de fago suficientes para produzir uma partícula infecciosa de fago, compreendendo os referidos genes de fago um gene que codifica uma proteína de cápsula do gene III de fago que não está (i') fundida com uma sequência de aminoácidos não virai de, pelo menos, cinco aminoácidos ou não está (ii') fundida com uma sequência de aminoácidos variada e (b) uma sequência que codifica a proteína exposta, em que o domínio de Kunitz inclui, pelo menos, uma posição de aminoácido variada em cada uma de duas ansas de interacção, sendo as posições nas respectivas ansas variadas de entre as partículas da pluralidade e, em que o número de cópias médio do domínio de Kunitz por partículas de fago da pluralidade é inferior a 2,0.
2. Biblioteca da reivindicação 1, em que o domínio de Kunitz é, pelo menos, 85% idêntico a um domínio de Kunitz humano nas posições de aminoácidos que não são variadas.
3. Biblioteca da reivindicação 1, em que o referido domínio de Kunitz compreende entre 5 e 12 posições variadas de aminoácidos de entre as partículas da pluralidade. 1
4. Biblioteca da reivindicação 3, em que as referidas posições variadas de aminoácidos compreendem posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 16, 17, 18, 19, 34 e 39 de LACI-Kl humano.
5. Biblioteca da reivindicação 4, em que as referidas posições variadas de aminoácidos compreendem as posições de aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34 e 39 de LACI-Kl humano.
6. Biblioteca da reivindicação 3, em que as referidas posições variadas de aminoácidos consistem em posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39 e 40 de LACI-Kl humano.
7. Biblioteca da reivindicação 1, em que a posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 40 é G ou A ou é variada entre G e A.
8. Biblioteca da reivindicação 1, em que o domínio de Kunitz compreende uma sequência que é, pelo menos, 85% idêntica a MHSFCAFKADX11GX13CX15X16X17X18X19RFFFNIFTRQCEEFX34YGGCX39X40NQNRFE SLEECKKMCTRDGA (SEQ ID N°:10), nas posições diferentes de X; e o domínio de Kunitz difere da sequência de LACI-KI em, pelo menos, um resíduo de aminoácido; e Χ11 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, p, Q, R, S, T, v, W, y; Xl3 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, p, Q, R, S, T, V, W, Y; Xl5 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Qr R, S, T, V, w, Y; X16 é um de: A, G, E, D, H, t; 2 Xl7 é um de: A, D, E, F, G, H, 1, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, w, Y; Xis é um de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, s, T, V, w, Y; X19 é um de: A, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, s, t, V, w, y; X34 é um de: A, C, D, E, F, G, H, 1, K, L, M, N, P, Q, R, s, T, V, w, Y; X39 é um de: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, s, T, V, W, Y; e 0 X é um de: G, A, e em que pelo menos dois de Xn, Xl3, X 15 r Xi6, X 17r Xl8f X19r X34r Χ39 e X40 variam entre partículas da pluralidade, as pelo menos duas posições variadas estando na primeira e segunda ansa de interacção do domínio de Kunitz.
9. Biblioteca da reivindicação 8, em que a proteína exposta compreende a proteína da cápsula toco do gene III.
10. Biblioteca da reivindicação 8, em que os genes de fago compreendNum gene que codifica uma proteína de cápsula de gene III de tipo selvagem.
11. Biblioteca da reivindicação 8, em que a biblioteca possui uma diversidade teórica entre 103 e 1012.
12. Biblioteca da reivindicação 11, em que, pelo menos, as posições de aminoácidos 15, 16, 17, 18, 34 e 39 são variadas. 3 Biblioteca da reivindicação 11, em que as posições de aminoácidos 11 , 13, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 39 e 40 são variadas. Biblioteca da reivindicação 8, em que 0 número médio de cópias do domínio de Kunitz por partículas de fago da pluralidade é inferior a 1,5.
15. Biblioteca da reivindicação 1, em que o domínio de Kunitz é, pelo menos, 85% idêntico a laci-KI humano nas posições de aminoácidos que não são variadas.
16. Biblioteca da reivindicação 1, em que o domínio de Kunitz é idêntico a LACI-Kl humano nas posições de aminoácidos que não são variadas.
17. Biblioteca da reivindicação 8, em que o domínio de Kunitz compreende a sequência que é 100% idêntica a MHSFCAFKADX11GX13CX15X16X17X18X19RFFFNIFTRQCEEFX34YGGCX39X40NQNRFE SLEECKKMCTRDGA (SEQ ID N°:10) nas posições diferentes de X.
18. Biblioteca da reivindicação 8, incluindo cada partícula de fago da pluralidade adicionalmente (iii) proteína de cápsula de um gene III funcional do fago, Particularmente, em que a biblioteca é ainda definida como em qualquer uma das reivindicações 9-14 ou 17.
19. Método para proporcionar um ácido nucleico que codifica um domínio de Kunitz que interage com um alvo, compreendendo o método: 4 proporcionar a biblioteca da reivindicação 1; colocar em contacto partículas de fago da biblioteca com um alvo; e recuperar o ácido nucleico das partículas que interagem com o alvo.
20. Método da reivindicação 19, em que o alvo é imobilizado e o passo de recuperar compreende separar as partículas que interagem com o alvo das partículas que não interagem com o alvo.
21. Método de proporcionar um ácido nucleico que codifica um domínio de Kunitz que interage com um alvo, compreendendo o método: proporcionar a biblioteca da reivindicação 8 ou 18; colocar em contacto partículas de fago a partir da biblioteca com um alvo; e recuperar o ácido nucleico a partir das partículas que interagem com o alvo.
22. Método da reivindicação 21, em que o alvo é uma protease.
23. Vector de fago compreendendo: (a) genes de fago suficientes para produzir uma partícula infecciosa de fago e (b) uma sequência que codifica a proteína exposta, compreendendo a proteína exposta um domínio de Kunitz e, pelo menos, uma porção de uma proteína de cápsula do 5 gene III do fago que se liga fisicamente à partícula de fago e que está fundida com o domínio de Kunitz, compreendendo o domínio de Kunitz uma sequência que é, pelo menos, 85% idêntica a MHSFCAFKADX11GX13CX15X16X17X18X19RFFFNIFTRQCEEFX34YGGCX39X40N QNRFESLEECKKMCTRDGA (SEQ ID N°:10), nas posições diferentes de X; Xn é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Qr R/ s, T, V, W, y; Xl3 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, p, Q, R/ S, T, V, w, Y; Xl5 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, y; X16 é um de: A, G, E, D, H, t; Xl7 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, y; X18 é um de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, y; Xl9 é um de: A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; X34 é um de: A, c, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, p, Q, R, s, T, V, w, Y; X39 é um de: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, s, T, V, W, y; e X40 é um de: G, A, em que o; s genes de fago compreendNum gene que codifica a proteína de cápsula do gene III do fago que não está fundida com uma sequência heteróloga que codifica mais do que cinco aminoácidos. Lisboa, 1 de Abril de 2011 6 1/9

FIG.1 2/9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M H S F C A F K A ATG CAT TCC TTC TGC GCC TTC AAG GCC 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 D X G X C X X X X X R F F F N GAC <2> GGT <2> TGT <1> <3> <1> <1> <2> CGT TTC TTC TTC AAC 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 I F T R Q C E E F X Y G G C X ATC TTC ACG CGT CAG TGC GAA GAG TTC <2> TAC GGT GGT TGT <2> 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 X N Q N R F E S L E E C K K M <4> AAC CAG AAC CGG TTC GAA TCT CTA GAG GAA TGT AAG AAG ATG 55 56 57 58 C T R D SEQ ID Ns 3 TGC ACT CGT GAC SEQ ID N°- 4 <1> = { A DEFGHIKLMN QRSTVWY } (sem C ou P) <2> = { A DEFGHIKLMNPQRSTVWY } (sem C) FIG. 2 <3> = { .65 A, .15 G, 0.05(EDHT)} <4> = { A G} 3/9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M H S F C A F K A ATG CAT TCC TTC TGC GCC TTC AAG GCC 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 D X G X C X X X X X R F F F N GAC <2> GGT <2> TGT <1> <3> <1> <1> <2> CGT TTC TTC TTC AAC 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 I F T R Q C E X F X Y G G C X ATC TTC ACG CGT CAG TGC GAG <2> TTC <2> TAC GGT GGT TGT <2> 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 X N Q N R F X S L E E C K . K M <1> AAC CAG AAC CGG TTC <1> TCT CTA GAG GAA TGT AAG AAG ATG 55 56 57 58 C T R D SEQID N2 5 TGC ACT CGT GAC SEQIDN26 <1> = { A défGhiklmn qrstvwy } (sem C ou P) <2> = { A DEFGHIKLMNPQRSTVWY } (sem C) FIG. 3 <3> = { .65 A, .15 G, 0.05(EDHT)} 4/9 7244 cgcaacgc aattaatgtg agttagctca 7272 ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg 7322 tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca 7372 tgattacg CCaagctt TGGa gccttttttt tggagatttt caac PflMI........ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M K K L L F A I P L V V P F Y 7416 gtg M13 aaa aaa signal, tta tta ttc Codões 1-15 aca att cct tta gtt gtt cct ttc tat 16 17 18 a b 1 2 3 4 S Μ A A E M H S F 7461 tCC ATG Gcg Ncol....Eagl.... |gcc |gag |atg |cat| tca ttc 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 C A F K A D D G P C K A I M K R F <2> <2> <1> <3> <1>· <1> <2> 7488 tgc gct ttc aaa gct gat gaC GGT CCG tgt aaa gct aTC ATG Aaa cgt ttc FIG. 4A <1> = { A DEFGHIKLMN QRSTVWY } equimolar (sem C ou P) <2> = { A DEFGHIKLMNPQRSTVWY } equimolar (sem C) <3> = .65 A, .15 G, O.OS(EDHT) <4> = (AG) equimolar 5/9 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 F F N I F T R Q C E E F I <2 > Y G ttc ttc aac att ttc ACG CGT caa tgt gaa gag ttc att tac ggt 37 38 G C ggt tgt Aflui. ... 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 E <2> G <4> N Q N R F Ξ S L E gaa GGT AAC Cag aAC CGG Ttc gaa tcT CTA GAg Xbal____ 50 51 52 53 54 55 E c K K M C 7623 Ç[â3 tgt aag aag atg tgc 56 57 58 T R D S A S S A 7641 act|cgt |gat| tct GCT AGC tct gct Nhel... FIG. 4B 6/9 Coto de ΙΙΓ Domínio 3 de III S G D F D Y E K M A N A N K G A 7665 agt ggc gac ttc gac tac gag aaa atg gct aat gee aac aaa GGC GCC M T Ξ N A D E N A L Q S D A K G 7713 âtG ACT GAG AAC GCT GAC GAG aat gct ttg caa age gat gee aag ggt K L D S V A T D Y G A A I D G F 7761 aag tta gac age gTC GCG Acc NruI____ gac tat GGC GCC gee ATC GAc ggc ttt I G D V S G L A N G N G A T G D 7809 ate ggc gat gtc agt ggt tTG GCC Aac ggc aac gga gee acc gga gac F A G S N S Q M A Q V G D G D N 7857 ttc GCA GGT teG AAT EcORI. BstBI... TCt cag atg gcC CAg Xcml. gtt gga gaT GGg gac aac S P L M N N F R Q Y L P S L P Q 7905 agt ccg ctt atg aac aac ttt aga cag tac ctt ccg tet ctt ccg cag s V E C R P F V F G A G K P Y E 7953 agt gtc gag tgc cgt cea ttc gtt ttc GGt gee ggc aag cct tac gag FIG. 4C 7/9 fsidcdkinlfr 8001 ttc aGC Ate gac TGC gat aAg ate aat ctt ttC CGC BstAPI........ SacII. . . Fim do domínio 3 GVFAFLLYVATFMYVF 8037 GGc gtt ttc gct ttc ttg cta tac gtc gct act ttc atg tac gtt ttc Inicio segmento transmembranar STFANIL RNKES 8085 age act ttc gee AAT ATT tta ege aac aaa gaa age 8121 tag tga tet CCT AGG Avrll.. 8136 aaG OCC GCc taa tga GCG GGC ttt ttt ttt et ggt ATGCAT CCTGAGG Haste *··· *Ansa.....Haste··· MultiT..... Bsu36I. I TerminadorTrp I Fim de cassete de exposição FIG. 4D