PT1567522E - ''compostos de pirimidina'' - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSTOS DE PIRIMIDINA" A presente invenção refere-se a novos derivados de 4-heteroaril-pirimidinas substituídas na posição 2 e à sua utilização em terapia. Mais especificamente, a invenção refere-se a derivados de 4-heteroaril-pirimidina substituída na posição 2 possuindo propriedades de solubilidade melhoradas.

ANTECEDENTES

Os presentes requerentes divulgaram anteriormente 4-heteroaril-pirimidinas substituídas na posição 2 e a sua utilização no tratamento de distúrbios proliferativos (Fischer PM, Wang S. Publicação de Pedido Internacional de Patente PCT WO 01/072745; Cyclacel Limited, UK, 2001) . Estes compostos inibem as proteína-cinases dependentes de ciclina (CDK), em particular CDK4/ciclina D, CDK2/ciclina E, CDK2/ciclina A e CDKl/ciclina B, i. e. complexos de enzimas que são importantes na progressão do ciclo celular humano. Além disso, as 2-fenilamino-4-heteroaril-pirimidinas possuem actividade antiproliferativa selectiva in vitro e in vivo contra uma gama de células de tumores humanos (Wang S, Blake D, Clarke R, Duff S, McClue SJ, Mclnnes C, Melville J, Stewart K, Tailor P, Westwood R, Wood G, Wu S-Y, Zhelev NZ, Zheleva Dl, Walkinshaw M, Lane DP, Fischer P M. Proc. Amer. Assoe. Câncer Res. 2002; 43: 4202). 1 0 documento WO 97/19065 refere-se a 2-anilinopirimidinas substituídas, a processos para a sua preparação, às suas composições farmacêuticas e à sua utilização em medicina. Os compostos são divulgados como sendo úteis na profilaxia e tratamento de doenças imunes, distúrbios hiperproliferativos e outras doenças nas quais se julgue existir um papel da acção inapropriada da cinase. O documento WO 03/029248 refere-se a 4-heteroaril-pirimidinas substituídas na posição 2, à sua preparação, às suas composições farmacêuticas e à sua utilização no tratamento de distúrbios proliferativos, tais como cancro, leucemia, psoríase e semelhantes. A presente invenção procura proporcionar mais 4-heteroaril-pirimidinas substituídas na posição 2. Mais especificamente, a presente invenção procura, de um modo preferido, proporcionar 4-heteroaril-pirimidinas substituídas na posição 2, as quais apresentam solubilidade aquosa e/ou biodisponibilidade melhoradas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um primeiro aspecto da invenção refere-se a um composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, 2

em que um de X1 e X2 é S, e o outro de X1 e X2 é N; onde: Z é NH, NHCO, NHS02, NHCH2, CH2, CH2CH2, CH=CH, S02 ou SO; r1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, alquilo, arilo, aralquilo, halogeno, N02, CN, OH, O-alquilo, O-arilo, NH2, NH-alquilo, NH-arilo, N-(alquilo)2, N-(arilo)2, N-(alquil)(arilo), COOH, CONH2, CONH-alquilo, CONH-arilo, S03H, S02-alquilo, S02-arilo, S02NH2, CF3, CO-alquilo, CO-arilo, ou R11, em que os grupos alquilo, arilo, aralquilo podem estar adicionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados de halogeno, N02, OH, O-metilo, NH2, COOH, CONH2 e CF3; em que, pelo menos, um de R1, R2, r3, r\ r5, rs, r7 e R8 é R11 ; em que cada R é Y, em que Y é um grupo alicíclico compreendendo uma ou mais das funções -o-, NH2, -NH-, =N- e em que Ϊ está opcionalmente substituído mm inm uu com um ou mais substitumtes seleccionados de: 3 - SCU-alquilo; - alquilo opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH; - CO-alquilo; - aralquilo; - COO-alquilo; e - um grupo éter opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH.

Um segundo aspecto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula Ib, como definido acima, misturado com um diluente, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Um terceiro aspecto da invenção refere-se à utilização de um composto de fórmula I, como definido acima, na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio proliferativo.

Um quarto aspecto da invenção refere-se à utilização de um composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável,

Ib em que um de X1 e X2 é S, e o outro de X1 e X2 é N; 4 onde: Z é NH, NHCO, NHS02, NHCH2, CH2, CH2CH2, CH=CH, S02 ou SO; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, alquilo, arilo, aralquilo, halogeno, N02, CN, OH, O-alquilo, O-arilo, NH2, NH-alquilo, NH-arilo, N-(alquilo)2, N-(arilo)2, N-(alquil)(arilo), COOH, CONH2, CONH-alquilo, CONH-arilo, S03H, S02-alquilo, S02-arilo, S02NH2, CF3, CO-alquilo, CO-arilo ou R11, em que os grupos alquilo, arilo, aralquilo podem estar adicionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados de halogeno, N02, OH, O-metilo, NH2, COOH, CONH2 e CF3; em que pelo menos um de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 é R11 ; em que cada R11 é Y, em que Y é um grupo aliciclico compreendendo uma ou mais das funções -0-, NH2, -NH-, =N- e em que Y está opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados de: - S02-alquilo; - alquilo opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH; - CO-alquilo; - aralquilo; - COO-alquilo; e - um grupo éter opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH; na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio virai. 5

Um quinto aspecto da invenção refere-se à utilização de um composto de fórmula I, como definido acima, num ensaio para identificar outros compostos candidatos, capazes de inibir uma cinase dependente de ciclina.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

Como aqui utilizado, o termo "alquilo" inclui grupos de cadeia linear e ramificada possuindo desde 1 até 8 átomos de carbono, e. g. metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo etc. e o termo "alquilo inferior" é utilizado de modo semelhante para grupos possuindo desde 1 até 4 átomos de carbono.

Como aqui utilizado, o termo "arilo" refere-se a um sistema monoaromático ou poliaromático (mono- ou poli-)substituído ou não substituído, em que o referido sistema poliaromático pode estar fundido ou não fundido. De um modo preferido, o termo "arilo" inclui grupos possuindo desde 6 até 10 átomos de carbono, e. g. fenilo, naftilo etc. O termo "arilo" é sinónimo do termo "aromático". O termo "aralquilo" é utilizando como uma conjunção dos termos alquilo e arilo como definidos acima. 0 termo "alieiclico" refere-se a um grupo alifático cíclico. O termo "alifático" tem o significado normal na técnica e inclui grupos não aromáticos, tais como alcanos, alcenos e alcinos e seus derivados substituídos. 6

Como aqui utilizado, o termo "derivado de hidrato de carbono" refere-se a um composto de fórmula geral Cx(H20)y ou um derivado deste. De um modo preferido, o hidrato de carbono é um mono-, di- ou trissacárido. Os monossacáridos podem existir como moléculas de cadeia linear ou na forma de anel e são classificados de acordo com o número de átomos de carbono que possuem; as trioses têm três carbonos, tetroses quatro, pentoses cinco e hexoses seis. Cada um destes subgrupos pode ser ainda dividido em aldoses e cetoses, dependendo da molécula conter um grupo aldeído (-CHO) ou um grupo cetona (C=0). Os exemplos típicos de monossacáridos incluem glucose, frutose e galactose. Os dissacáridos consistem de duas moléculas de monossacáridos ligadas e incluem, por exemplo, maltose e lactose. Os trissacáridos consistem de três moléculas de monossacáridos ligadas. 0 termo "derivado" como aqui utilizado inclui modificações químicas de uma entidade. São ilustrativas de tais modificações químicas, a substituição de hidrogénio por um grupo halo, um grupo alquilo, um grupo acilo ou um grupo amino. 0 termo "heterociclo" refere-se a um grupo cíclico saturado ou insaturado, contendo um ou mais heteroátomos no anel.

Como aqui utilizada, a frase "preparação de um medicamento" inclui a utilização de um composto de fórmula I directamente como medicamento para além da sua utilização num programa de rastreio para a procura de mais agentes antivirais ou em qualquer etapa do fabrico desse medicamento.

De um modo preferido, os compostos de fórmula I são portadores de um radical tiazol-3-ilo ou tiazol-5-ilo mono- ou 7 dissubstituído, ligado ao anel de pirimidina através de um dos átomos de carbono endocíclicos. De um modo muito preferido, o heterociclo é um grupo tiazol-5-ilo.

Assim, numa forma de realização preferida da invenção, X1 é S e X2 é N.

Noutra forma de realização preferida, Z é NH.

Noutra forma de realização preferida, R3 é H.

Ainda noutra forma de realização preferida, pelo menos um de R2, R5, R6 ou R7 é R11.

Numa forma de realização particularmente preferida, X1 é S, X2 é N, Zé NH, R1 é Me, R2 é alquilo ou amino, R3 é H, um ou dois de R5, R6 e R7 são CF3, OH, O-alquilo, halogeno, NO2, NH2, NH-alquilo ou N-(alquilo) 2 e, pelo menos, um de R2, R5, R6 ou R7 é R11.

Ainda de um modo mais preferido, Y é um grupo morfolina ou piperazina, cada um dos quais pode estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados de S02-alquilo, alquilo opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH, CO-alquilo, aralquilo, COO-alquilo e um grupo éter opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH.

Numa forma de realização preferida, pelo menos um de R2, R6 ou R7 é R11. 8

Numa forma de realização especialmente preferida, R6 ou R7 é R11. De um modo mais preferido, R6 é R11 e R2, R4, R5, R7 e R8 são, cada um, independentemente seleccionados de alquilo, H, CF3, OH, O-alquilo, halogeno, NO2, NH2, NH-alquilo e N-(alquilo)2. Ainda de um modo mais preferido, R6 é R11 e R2, R4, R5, R7 e R8 são, cada um independentemente, seleccionados de alquilo, H, O-alquilo, halogeno, N02, NH2 e NH-alquilo. Ainda de um modo mais preferido, R6 é R11 e R4, R5, R7 e R8 são todos H e R2 é seleccionado de alquilo, O-alquilo, NH2 e NH-alquilo.

Ainda mesmo de um modo mais preferido, para esta forma de realização, R11 é seleccionado de: / \ Nw° / \ _^NH / \ / \ N yi-Me / \ / \ P \_ΡΛ / \ /-v 0 /\ II NÍ Vl-S-Me '— 0

OH

OH

OH

Noutra forma de realização preferida, R7 é R11 e R4, R5, R6, R8 são todos H, e R2 é seleccionado de alquilo, O-alquilo, NH2 e NH-alquilo.

Noutra forma de realização preferida da invenção, pelo menos um de R2 ou R6 é R11.

Para esta forma de realização, R11 é, de um modo preferido, seleccionado dos seguintes: 9

Nu° / \Vy

Q / \ N N-Me

Ph

0 A“\

Γ\ / \ 1^_^N-S-Me

OH

Numa forma de realização especialmente preferida, R6 é R11.

Para esta forma de realização, na qual R6 é R11, de um modo preferido R2, R4, R5, R7 e R8 são, cada um independentemente, seleccionados de alquilo, H, CF3, OH, O-alquilo, halogeno, NO2, NH2, NH-alquilo e N-(alquilo)2.

Ainda de um modo mais preferido, R2, R4, R5, R7 e R8 são, cada um independentemente, seleccionados de alquilo, H, O-alquilo, halogeno, N02, NH2 e NH-alquilo.

Ainda de um modo mais preferido, R4, R5, R7 e R8 são todos H e R2 é seleccionado de alquilo, O-alquilo, NH2 e NH-alquilo.

Ainda de um modo mais preferido, R11 é seleccionado de: 10 /~\ Nu° N_ r\ / \ _^-Me / \ \T\ N—' Ph / \ Λ“λ P / \ Nv_M / \ II N 'N-S-Me '—' 0

OH

OH

OH

Numa forma de realização preferida alternativa, R2 é R11.

Para esta forma de realização, R2 é R11, de um modo preferido R4, R5, R6, R7 e R8 são, cada um, independentemente seleccionados de alquilo, H, CF3, OH, O-alquilo, halogeno, N02, NH2, NH-alquilo e N-(alquilo)2.

De um modo mais preferido, R4, R5, R6, R7 e R8 são, cada um, independentemente seleccionados de H, O-alquilo, halogeno, N-(alquilo) 2, N02.

Ainda de um modo mais preferido, um de R5 ou R7 é seleccionado de N02, alcoxilo, halogeno e N-(alquilo)2, e os restantes de R4, R5, R6, R7 e R8 são todos H.

Numa forma de realização preferida da invenção, R1 é metilo, Z é NH e R3 é H.

Numa forma de realização preferida da invenção, o composto de fórmula I é seleccionado dos listados no Quadro 1. 11

Numa forma de realização especialmente preferida, o composto de fórmula I é seleccionado dos seguintes: 1 [4-(2-Amino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina 2 [4- (2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina 3 [4-(2-N-Metilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolinofenil)-amina 4 [4-(2-Etilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina 5 1-(4 — {4 —[4- (2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanona 6 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-1-il-fenil)-amina 7 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4-(4' -2'' -etoxil]etanolpiperazino)fenil]-amina 8 3—(4—{4—[4—(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-propan-l-ol 9 2-(4 — {4—[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanol 10 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4-(4-metanossulfonil-piperazin-l-il)-fenil]-amina 11 [4-(4-Benzil-piperazin-l-il)-fenil]-[4-(4-metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina 12 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina 49 1-(4 — {4 —[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil]-piperazin-l-il)-propan-2-ol 55 3-[4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenol 56 [4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil]-amina 57 N,N-Dimetil-N'-[4-(4-metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il) -pirimidin-2-il]-benzeno-1,4-diamina 61 1-(4 — {4 —[4-(4-Metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanona 12 62 [4-(4-Metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-l-il-fenil)-amina 71 [4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(3-nitro-fenil)-amina

Noutra forma de realização preferida da invenção, o referido composto de fórmula I é seleccionado dos seguintes [4], [8], [12], [61], [57] e [62] .

Noutra forma de realização preferida, o composto é o composto [62].

Noutra forma de realização preferida, o composto é seleccionado de [11], [55], [56], [57], [61], [62] e [71].

Numa forma de realização preferida o composto de fórmula I é capaz de exibir um efeito antiproliferativo em linhagens de células humanas, como medido por um ensaio corrente de citotoxicidade por MTT de 72 h. De um modo preferido, o composto de fórmula I exibe um valor de IC50 inferior a 10 μΜ, de um modo mais preferido inferior a 5 μΜ, ainda de um modo mais preferido inferior a 1 μΜ como medido pelo referido ensaio MTT. De um modo mais preferido, o composto de fórmula I é seleccionado dos seguintes: [4], [8], [12], [61], [57] e [62]. Ainda de um modo mais preferido, o composto exibe um valor de IC50 inferior a 0,5 μΜ, ainda de um modo mais preferido inferior a 0,2 μΜ. Ainda de um modo mais preferido, o composto é o [62].

Noutra forma de realização preferida, o composto de fórmula I é seleccionado de [1] e [11]. 13

Noutra forma de realização preferida, o composto de fórmula I é capaz de inibir uma ou mais proteina-cinases, como medido pelos ensaios descritos na secção de Exemplos apensa. De um modo preferido, o composto de fórmula I exibe um valor de IC50 inferior a 10 μΜ, de um modo mais preferido inferior a 5 μΜ, ainda de um modo mais preferido inferior a 1 μΜ ou inferior a 0,5 μΜ, ainda de um modo mais preferido inferior a 0,1 μΜ. De um modo mais preferido, o composto de fórmula I é seleccionado dos seguintes: [11], [55], [56], [57], [61], [62] e [71],

Ainda de um modo mais preferido, o composto exibe um valor de IC5o inferior a 0,01 μΜ. Ainda de um modo mais preferido, o composto é seleccionado dos seguintes: [11], [62] e [71].

Ainda noutra forma de realização preferida, o composto de fórmula I é seleccionado de [1], [3] e [11]. A presente invenção proporciona uma série de compostos munidos com funções solubilizantes nos anéis de fenilo e/ou heteroarilo do sistema 2-fenilamino-4-heteroaril-pirimidina. A modificação com unidades solubilizantes conservou a actividade biológica in vitro desejada (inibição de CDK e citotoxicidade contra células humanas transformadas) e nalguns casos conduziu a aumentos surpreendentes e inesperados da potência. Além disso, a absorção in vivo e, em particular, a biodisponibilidade oral também podem ser melhoradas utilizando as estratégias de solubilização aqui apresentadas. 14

UTILIZAÇÃO TERAPÊUTICA

Determinou-se que os compostos de fórmula I possuem actividade antiproliferativa e julga-se, por conseguinte, que sejam úteis no tratamento de distúrbios proliferativos, tais como cancros, leucemias e outros distúrbios associados à proliferação celular descontrolada, tais como psoriase e restenose. Como aqui definido, um efeito antiproliferativo no âmbito da presente invenção pode ser demonstrado pela aptidão para inibir a proliferação celular num ensaio in vitro com células inteiras, por exemplo, utilizando qualquer uma das linhagens de células AGS, H1299 ou SJSA-1, ou mostrando inibição da interacção entre HDM2 e p53 num ensaio apropriado. Estes ensaios, incluindo os métodos para a sua realização, são descritos com mais pormenor nos Exemplos apensos. Utilizando estes ensaios pode determinar-se se um composto é antiproliferativo no contexto da presente invenção.

Uma forma de realização preferida da presente invenção refere-se, por conseguinte, à utilização de um ou mais compostos de fórmula I no tratamento de distúrbios proliferativos. De um modo preferido, o distúrbio proliferativo é um cancro ou leucemia. 0 termo distúrbio proliferativo é aqui utilizado num sentido lato de modo a incluir qualquer distúrbio que necessite do controlo do ciclo celular, por exemplo, distúrbios cardiovasculares, tais como restenose e cardiomiopatia, distúrbios autoimunes tais como glomerulonefrite e artrite reumatóide, distúrbios dermatológicos, tais como psoriase, anti-inflamatório, antifúngico, distúrbios antiparasitários tais como malária, enfisema e calvície. Nestes distúrbios, os compostos da presente invenção podem induzir apoptose ou manter a estase nas células desejadas, consoante necessário. 15

Os compostos da invenção podem inibir qualquer um dos passos ou etapas do ciclo celular, por exemplo, formação do envelope nuclear, saida da fase quiescente do ciclo celular (GO), progressão da Gl, descondensação do cromossoma, destruição do envelope nuclear, COMEÇO, iniciação da replicação de ADN, progressão da replicação de ADN, terminação da replicação de ADN, duplicação de centrossoma, progressão da G2, activação das funções mitóticas ou meióticas, condensação do cromossoma, separação do centrossoma, nucleação microtubular, formação e funcionamento da hélice, interacções com proteínas motoras do microtúbulo, separação e segregação de cromatídeo, inactivação das funções mitóticas, formação de anel contráctil e funções citocinese. Em particular, os compostos da invenção podem influenciar determinadas funções dos genes, tais como ligação da cromatina, formação de complexos de replicação, autorização de replicação, fosforilação ou outra actividade de modificação secundária, degradação proteolítica, fixação de microtúbulo, fixação de actina, fixação de septina, actividade de nucleação do centro organizador de microtúbulos e ligação aos componentes dos percursos de sinalização do ciclo celular.

Numa forma de realização da invenção, o composto de fórmula Ib é administrado numa quantidade suficiente para inibir, pelo menos, uma enzima CDK.

Numa forma de realização mais preferida da invenção, o composto de fórmula Ib é de um modo preferido administrado numa quantidade suficiente para inibir uma ou mais das CDK das células hospedeiras envolvidas na replicação virai, i. e. CDK2, CDK7, CDK8, e CDK9 [Wang D, De la Fuente C, Deng L, Wang L, Zilberman I, Eadie C, Healey M, Stein D, Denny T, Harrison LE, Meijer L, Kashanchi F. Inhibition of human immunodeficiency 16 virus type 1 transcription by Chemical cyclin-dependent kinase inhibitors. J. Virol. 2001; 75: 7266-7279].

Como aqui definido, um efeito antiviral no âmbito da presente invenção pode ser demonstrado pela aptidão para inibir as CDK2, CDK7, CDK8 ou CDK9. Os ensaios para determinar a actividade de CDK são descritos em mais pormenor nos exemplos apensos. Utilizando esses ensaios enzimáticos pode-se determinar se um composto é antiviral no contexto da presente invenção.

Numa forma de realização particularmente preferida, os compostos de fórmula Ib são úteis no tratamento de distúrbios virais, tais como citomegalovirus humanos (HCMV), virus herpes simplex de tipo 1 (HSV-1), virus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1) e virus varicela zoster (VZV).

Numa forma de realização particularmente preferida, a invenção relaciona-se com a utilização de um ou mais compostos de fórmula Ib no tratamento de um distúrbio virai, o qual é dependente ou sensível à CDK. Os distúrbios dependentes de CDK estão associados com um nível acima do normal de actividade de uma ou mais enzimas CDK. Tais distúrbios associados, de um modo preferido, com um nível anormal de actividade de CDK2, CDK7, CDK8 e/ou CDK9. Um distúrbio sensível à CDK é um distúrbio no qual uma aberração no nível de CDK não é a causa primária, mas está a jusante da aberração metabólica primária. Em tais cenários pode dizer-se que as CDK2, CDK7, CDK8 e/ou CDK9 fazem parte do percurso metabólico sensível e os inibidores de CDK podem ser, por conseguinte, activos no tratamento de tais distúrbios. 17

Uma forma de realização preferida da invenção refere-se à utilização de um composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável,

Ib em que um de X1 e X2 é S, e o outro de X1 e X2 é N; onde: Z é NH, NHCO, NHS02, NHCH2, CH2, CH2CH2, CH=CH, S02 ou SO; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, alquilo, arilo, aralquilo, halogeno, N02, CN, OH, O-alquilo, 0-arilo, NH2, NH-alquilo, NH-arilo, N-(alquilo)2, N-(arilo)2, N-(alquil)(arilo), COOH, C0NH2, CONH-alquilo, CONH-arilo, SO3H, S02-alquilo, S02-arilo, S02NH2, CF3, CO-alquilo, CO-arilo ou R11, em que os grupos alquilo, arilo, aralquilo podem estar adicionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados de halogéneo, N02, OH, 0-metilo, NH2, COOH, C0NH2 e CF3; em que, pelo menos um de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 é R11 ; em que cada R11 é Y, em que Y é um grupo alicíclico compreendendo uma ou mais das funções -0-, NH2, -NH-, =N- e em que Y está 18 opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados de: - SC^-alquilo; - alquilo opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH; - CO-alquilo; - aralquilo; - COO-alquilo; e - um grupo éter opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH; na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio virai.

Numa forma de realização preferida, o composto de fórmula Ib é seleccionado dos listados no Quadro 1.

De um modo mais preferido, o referido composto de fórmula Ia é seleccionado dos seguintes: [1], [3] e [4].

Para utilização no tratamento de distúrbios virais, de um modo preferido, o composto de fórmula Ib é capaz de inibir as CK2, CDK7 e/ou CDK9 e é seleccionado dos seguintes: [4-(2-Etilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina [4]; [4-(2-Amino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina [1]; e [4-(4-Metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina [3]; 19 [4-(4-Benzil-piperazin-l-il)-fenil]-[4-(4-metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina [11].

Observou-se que o composto seguinte é um agente antiviral particularmente eficaz, como demonstrado pelos ensaios com base em células: [4-(2-Amino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4- morfolin-4-il-fenil)-amina [1].

Ainda um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um composto de fórmula Ib na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio neurodegenerativo.

De um modo preferido, o distúrbio neurodegenerativo é a apoptose neuronal.

Outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um composto da invenção na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio virai, tal como citomegalovirus humano (HCMV), virus herpes simplex de tipo 1 (HSV-1), virus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1) e virus varicela zoster (VZV).

Numa forma de realização mais preferida da invenção, o composto da invenção é administrado numa quantidade suficiente para inibir uma ou mais das CDK da célula hospedeira envolvidas na replicação virai, i. e. CDK2, CDK7, CDK8, e CDK9 [Wang D, De la Fuente C, Deng L, Wang L, Zilberman I, Eadie C, Healey M, Stein D, Denny T, Harrison LE, Meijer L, Kashanchi F. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 transcription by Chemical cyclin-dependent kinase inhibitors. J. Virol. 2001; 75: 7266— 7279]. 20

Como aqui definido, um efeito antiviral no âmbito da presente invenção pode ser demonstrado pela aptidão para inibir a CDK2, CDK7, CDK8 OU CDK9.

Numa forma de realização particularmente preferida, a invenção refere-se à utilização de um ou mais compostos da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio virai que é dependente ou sensível de CDK. Os distúrbios dependentes de CDK estão associados com um nível acima do normal da actividade de uma ou mais enzimas CDK. Tais distúrbios associados, de um modo preferido, com um nível anormal de actividade de CDK2, CDK7, CDK8 e/ou CDK9. Um distúrbio sensível à CDK é um distúrbio no qual uma aberração no nível de CDK não é a causa primária, mas está a jusante da aberração metabólica primária. Em tais cenários pode dizer-se que as CDK2, CDK7, CDK8 e/ou CDK9 fazem parte do percurso metabólico sensível e os inibidores de CDK podem ser, por conseguinte, activos no tratamento de tais distúrbios.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de compostos de fórmula Ib, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, na preparação de um medicamento para tratar diabetes.

Numa forma de realização particularmente preferida, a diabetes é a diabetes de tipo II. De um modo preferido, para esta forma de realização, o composto é administrado numa quantidade suficiente para inibir a GSK3.

De um modo preferido, o composto da invenção, ou o seu sal farmaceuticamente aceitável, é administrado numa quantidade suficiente para inibir a GSK3/3. 21 A GSK3 é uma de várias proteína-cinases que fosforilam a glicogénio-sintase (GS). A estimulação da síntese de glicogénio pela insulina no músculo-esquelético resulta da desfosforilação e activação de GS. A acção da GSK3 na GS resulta assim na desactivação da última e, desse modo, na supressão da conversão de glucose em glicogénio nos músculos. A diabetes de Tipo II (diabetes mellitus não

insulinodependente) é uma doença multi-factorial. A hiperglicemia é devida à resistência de insulina no fígado, músculos e outros tecidos, acoplada com a secreção reduzida de insulina. 0 músculo-esquelético é o sítio principal para a captação de glucose estimulada pela insulina, ali ela é eliminada da circulação ou convertida em glicogénio. A deposição de glicogénio no músculo é a causa determinante principal na homeostasia da glucose e os diabéticos de tipo II têm uma armazenagem deficiente do glicogénio no músculo. Existe evidência que um aumento na actividade da GSK3 é importante na diabetes de tipo II [Chen, Y.H.; Hansen, L.; Chen, M.X.; Bjorbaek, C.; Vestergaard, H.; Hansen, T.; Cohen, P.T.;

Pedersen, 0. Diabetes, 1994, 43, 1234] . Além disso, foi demonstrado que a GSK3 está expressa em excesso nas células do músculo dos diabéticos de tipo II e que existe uma correlação inversa entre a actividade de GSK3 no músculo-esquelético e a acção da insulina [Nikoulina, S.E.; Ciaraldi, T.P.; Mudaliar, S.; Mohideen, P.; Cárter, L.; Henry, R.R. Diabetes, 2000, 49, 263] . A inibição da GSK3 é, por conseguinte, de significado terapêutico no tratamento da diabetes, em particular da de tipo II, e da neuropatia diabética. 22

Assinale-se que se sabe que a GSK3 fosforila muitos substratos além da GS, e está deste modo envolvida na regulação de vários percursos bioquímicos. Por exemplo, a GSK é muito expressa nos sistemas nervosos central e periférico.

Outro aspecto da invenção refere-se, por conseguinte, à utilização de compostos de fórmula Ib, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, na preparação de um medicamento para tratar distúrbios do SNC, por exemplo, distúrbios neurodegenerativos.

De um modo preferido, o distúrbio do SNV é a doença de Alzheimer. A Tau é um substrato da GSK-3 que foi implicada na etiologia da doença de Alzheimer. Nas células nervosas saudáveis, a Tau junta-se com a tubulina em microtúbulos. No entanto, na doença de Alzheimer, a tau forma emaranhados grandes de filamentos que destroem as estruturas de microtúbulos nas células nervosas, debilitando desse modo o transporte de nutrientes, assim como a transmissão das mensagens neuronais.

Sem que se pretenda ficar limitado pela teoria, julga-se que os inibidores de GSK3 possam ser capazes de impedir e/ou inverter a hiperfosforilaçâo anormal da proteína tau associada a microtúbulos que é uma particularidade invariável da doença de Alzheimer e de um número de outras doenças neurodegenerativas, tais como paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal e doença de Pick. Mutações no gene da tau originam formas hereditárias de demência fronto-temporal, realçando ainda mais a relevância da disfunção da proteína tau para o processo 23 neurodegenerativo [Goedert, M. Curr. Opin. Gen. Dev.f 2001, 11, 343] .

Outro aspecto da invenção refere-se à utilização de compostos de fórmula I ou Ia, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, na preparação de um medicamento para tratar o distúrbio bipolar.

Ainda outro aspecto da invenção refere-se à utilização de compostos de fórmula Ib, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, na preparação de um medicamento para tratar um acidente vascular cerebral. A redução da apoptose neuronal é um objectivo terapêutico importante no contexto de traumatismo craniano, acidente vascular cerebral, epilepsia e doença neuronal motora [Mattson, P.F. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2000, 1, 120]. Por conseguinte, a GSK3 como um factor pró-apoptótico de células neuronais torna esta proteína-cinase um alvo terapêutico atractivo para a concepção de fármacos inibidores para tratar estas doenças.

Ainda um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de compostos de fórmula Ib, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, na preparação de um medicamento para tratar calvicie. O crescimento de cabelo é controlado pelo percurso de sinalização Wnt, em particular Wnt-3. Em sistemas modelo de cultura de tecido da pele, a expressão de mutantes não degradáveis da β-catenina leva a um aumento dramático na população de células estaminais putativas, as quais têm um maior potencial proliferativo [Zhu, A.J.; Watt, F.M. Development, 24 1999, 126, 2285] . Esta população de células estaminais expressa um nível mais elevado de β-catenina não associada à caderina [DasGupta, R.; Fuchs, E Development, 1999, 126; 45571], o que pode contribuir para o seu elevado potencial proliferativo. Além disso, ratinhos transgénicos que expressam em excesso uma β-catenina truncada na pele experimentam de novo a morfogénese de folículos pilosos, a qual normalmente surge apenas durante a embriogénese. A aplicação ectópica de inibidores da GSK3 pode ser, por conseguinte, terapeuticamente útil no tratamento de calvície e no restabelecimento do crescimento de cabelo após calvície induzida por quimioterapia.

Numa forma de realização da invenção, o composto da invenção é administrado numa quantidade suficiente para inibir, pelo menos, uma enzima PLK.

As cinases de tipo polo (PLK) constituem uma família de serina/treonina proteina-cinases. Os mutantes mitóticos no polo locus de Drosophila melanogaster apresentam anormalidades do fuso [Sunkel et al., J. Cell Sei., 1988, 89, 25] e constatou-se que a polo codificava uma cinase mitótica [Llamazares et al., Genes Dev., 1991, 5, 2153]. Nos seres humanos, existem três PLK muito relacionadas [Glover et al., Genes Dev., 1998, 12, 3777]. Estas contêm um domínio cinase catalítico na extremidade amino altamente homólogo e as suas extremidades carboxilo contêm duas ou três regiões conservadas, as caixas polo. A função das caixas polo permanece incompletamente compreendida mas estas estão implicadas na orientação das PLK para os compartimentos subcelulares [Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, 95, 9301; Leung et al., Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 719], mediação de interaeções com outras proteínas [Kauselmann et al., EMBO J., 1999, 18, 5528], ou podem fazer parte de um domínio auto- 25 regulador [Nigg, Curr. Opin. Cell Biol., 1998, 10, 776]. Além disso é necessária a actividade PLK1 dependente da caixa polo para uma transição apropriada metafase/anafase e para a citocinese [Yuan et al., Câncer Res., 2002, 62, 4186; Seong et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 32282].

Estudos demonstraram que as PLK humanas regulam alguns aspectos fundamentais da mitose [Lane et al., J. Cell. Biol., 1996, 135, 1701; Cogswell et al., Cell Growth Differ., 2000, 11, 615]. Em particular, julga-se que a actividade PLKl seja necessária para a maturação funcional de centrossomas no final da G2/início da prófase e constituição subsequente de uma hélice bipolar. A redução da PLKl celular através da técnica de ARN de pequena interferência (siRNA) também confirmou que esta proteína é necessária para processos mitóticos múltiplos e realização da citocinese [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2002, 99, 8672] .

Numa forma de realização mais preferida da invenção, o composto da invenção é administrado numa quantidade suficiente para inibir a PLKl.

Das três PLK humanas, a PLKl é a mais bem caracterizada; ela regula um número de efeitos do ciclo de divisão celular, incluindo o início da mitose [Toyoshima-Morimoto et al., Nature, 2001, 410, 215; Roshak et al., Cell. Signalling, 2000, 12, 405], activação da verificação de lesões no ADN [Smits et al., Nat. Cell Biol., 2000; 2, 672; van Vugt et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 41656], regulação do complexo de promoção da anafase [Sumara et al., Mol. Cell, 2002, 9, 515; Golan et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 15552; Kotani et al., Mol. Cell, 1998, 1, 371], fosforilação do proteassoma [Feng et al., Cell Growth 26

Differ., 2001, 12, 29], e duplicação e maturação do centrossoma [Dai et al., Oncogene, 2002, 21, 6195].

Especificamente, a iniciação da mitose requer a activação do factor de promoção da metafase (MPF), o complexo entre a cinase dependente de ciclina CDK1 e as ciclinas de tipo B [Nurse, Nature, 1990, 344, 503] . As últimas acumulam-se durante as fases S e G2 do ciclo celular e promovem a fosforilação inibidora do complexo MPF pelas cinases WEE1, MIK1 e MYT1. No final da fase G2, a desfosforilação correspondente pela fosfatase de especificidade dupla CDC25C despoleta a activação de MPF [Nigg, Nat. Rev. Mol. Cell Bíol., 2001, 2, 21]. Na interfase, a ciclina B localiza-se no citoplasma [Hagting et al., EMBO J., 1998, 17, 4127], torna-se então fosforilada durante a prófase e este evento provoca a translocação nuclear [Hagting et ai., Curr. Biol., 1999, 9, 680; Yang et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 3604]. Julga-se que a acumulação nuclear de MPF activo durante a prófase seja importante para iniciar os eventos da metafase [Takizawa et al., Curr. Opin. Cell Biol., 2000, 12, 658]. No entanto, o MPF nuclear é mantido inactivo pela WEE1 a menos que contrariado pela CDC25C. A própria fosfatase CDC25C, que se localizou no citoplasma durante a interfase, acumula-se no núcleo na prófase [Seki et al., Mol. Biol. Cell, 1992, 3, 1373; Heald et al., Cell, 1993, 74, 463; Dalal et al., Mol. Cell.

Biol., 1999, 19, 4465]. A entrada no núcleo de ciclina B [Toyoshima-Morimoto et al., Nature, 2001, 410, 215] e CDC25C [Toyoshima-Morimoto et al., EMBO Rep., 2002, 3, 341] são promovidas pela fosforilação da PLK1 [Roshak et al., Cell. Signalling, 2000, 12, 405] . Esta cinase é um regulador importante do inicio da metafase. 27

Numa forma de realização particularmente preferida, os compostos da invenção são inibidores antagonistas de ATP da PLKl.

No presente contexto, antagonista de ATP refere-se à aptidão de um composto inibidor para diminuir ou impedir a actividade catalitica da PLK, i. e. transferência de fósforo do ATP para um substrato macromolecular de PLK, através da ligação reversível ou irreversível no sítio activo da enzima de modo a diminuir ou abolir a ligação de ATP.

Noutra forma de realização preferida, o composto da invenção é administrado numa quantidade suficiente para inibir a PLK2 e/ou PLK3.

Foi originariamente demonstrado que a PLK2 (também conhecida como SNK) e PLK3 (também conhecida como PRK e FNK) mamíferas são produtos génicos imediatamente iniciais. A actividade cinase da PLK3 parece atingir subir acentuadamente durante o final da fase S e G2. Ela está também activa durante a activação da verificação de lesões no ADN e estados de stress oxidativo acentuado. A PLK3 também desempenha um papel importante na regulação da dinâmica dos microtúbulos e funcionamento dos centrossomas na célula e a expressão desregulada da PLK3 resulta na paragem do ciclo celular e apoptose [Wang et al., Mol. Cell. Biol., 2002, 22, 3450] . A PLK2 é o homólogo menos bem compreendido das três PLK. Ambas, a PLK2 e a PLK3, podem ter funções pós-mitóticas adicionais importantes [Kauselmann et al., EMBO J., 1999, 18, 5528]. 28

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula Ib como definido para o referido primeiro aspecto misturado com um ou mais diluentes, excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Mesmo apesar dos compostos da presente invenção (incluindo os seus sais, ésteres e solvatos farmaceuticamente aceitáveis) poderem ser administrados isolados, eles serão geralmente administrados misturados com um veículo, excipiente ou diluente farmacêutico, particularmente para terapia humana. As composições farmacêuticas podem ser para utilização humana ou animal em medicina humana e veterinária.

Exemplos de tais excipientes adequados para as várias formas diferentes de composições farmacêuticas aqui descritas podem ser encontrados no "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2° Edição, (1994), Editado por A Wade e P J Weller.

Os veículos ou diluentes aceitáveis para utilização terapêutica são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985).

Exemplos de veículos adequados incluem lactose, amido, glucose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e semelhantes. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, glicerol e água. A escolha do veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser seleccionado tendo em consideração a via de administração pretendida e prática farmacêutica corrente. As 29 composições farmacêuticas podem compreender como, ou para além do veiculo, excipiente ou diluente quaisquer aglutinante (s) adequado(s), lubrificante (s), agente (s) de suspensão, agente(s) de revestimento, solubilizante(s).

Exemplos de aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glucose, lactose anidra, lactose em pó solto, beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tal como goma-arábica, tragacanta ou alginato de sódio, carboximetilcelulose e polietilenoglicol.

Exemplos de lubrificantes adequados incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes.

Podem ser adicionados conservantes, estabilizantes, corantes e até mesmo aromatizantes à composição farmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres do ácido p-hidroxibenzóico. Também podem ser utilizados antioxidantes e agentes de suspensão.

SAIS/ÉSTERES

Os compostos de fórmula Ib podem estar presentes como sais ou ésteres, em particular sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção incluem sais de adição de ácido ou de base adequados daqueles. Uma revisão sobre sais farmacêuticos adequados pode ser encontrada em Berge et al., J Pharm Sei, 66, 1-19 (1977). Os 30 sais são preparados, por exemplo, com ácidos inorgânicos fortes, tais como ácidos minerais, e. g. ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácidos hidro-hálicos; com ácidos carboxílicos orgânicos fortes, tais como ácidos alcanocarboxilicos de 1 até 4 átomos de carbono, os quais estão não substituídos ou substituídos (e. g., com halogéneo), tal como ácido acético; com ácidos dicarboxílicos saturados ou insaturados, por exemplo, oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico ou tetraftálico; com ácidos hidroxicarboxílicos, por exemplo, ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico ou cítrico; com aminoácidos, por exemplo, ácido aspártico ou glutâmico; com ácido benzóico; ou com ácidos sulfónicos orgânicos, tais como ácidos alquil (C1-C4) - ou aril-sulfónicos os quais estão não substituídos ou substituídos (por exemplo, com um halogéneo), tais como ácido metano- ou p-toluenossulfónico.

Os ésteres são preparados utilizando ácidos orgânicos ou álcoois/hidróxidos, dependendo do grupo funcional a ser esterificado. Os ácidos orgânicos incluem ácidos carboxílicos, tais como ácidos alcanocarboxilicos de 1 até 12 átomos de carbono os quais estão não substituídos ou substituídos (e. g., com halogéneo), tal como ácido acético; com ácidos dicarboxílicos saturados ou insaturados, por exemplo, oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico ou tetraftálico; com ácidos hidroxicarboxílicos, por exemplo, ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico ou cítrico; com aminoácidos, por exemplo ácido aspártico ou glutâmico; com ácido benzóico; ou com ácidos organossulfónicos, tais como ácidos alquil(C1-C4) - ou aril-sulfónico, os quais estão não substituídos ou substituídos (por exemplo, com um halogéneo), tais como ácido metano- ou p-toluenossulfónico. Os hidróxidos adequados incluem hidróxidos inorgânicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido 31 de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de alumínio. Os álcoois incluem álcoois de alcano de 1-12 átomos de carbono os quais podem estar não substituídos ou substituídos, e. g. com um halogéneo).

ENANTIÓMEROS/TAUTÓMEROS

Em todos os aspectos da presente invenção anteriormente discutidos, a invenção inclui, quando apropriado todos os enantiómeros e tautómeros dos compostos de fórmula Ib. 0 especialista na técnica reconhecerá compostos que possuem propriedades ópticas (um ou mais átomos de carbono quirais) ou características tautoméricas. Os enantiómeros e/ou tautómeros correspondentes podem ser isolados/preparados por métodos conhecidos na técnica.

ISÓMEROS ESTEREOQUÍMICOS E GEOMÉTRICOS

Alguns dos compostos da invenção podem existir como estereoisómeros e/ou isómeros geométricos - e. g. eles podem possuir um ou mais centros assimétricos e/ou geométricos e podem existir, desse modo, em duas ou mais formas estereoisoméricas e/ou geométricas. A presente invenção abrange a utilização de todos os estereoisómeros e isómeros geométricos individuais daqueles agentes inibidores e misturas daqueles. Os termos utilizados nas reivindicações abrangem estas formas, desde que as referidas formas conservem a actividade funcional apropriada (embora não necessariamente no mesmo grau). 32 A presente invenção também inclui todas as variações isotópicas adequadas do agente ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável. Uma variação isotópica de um agente da presente invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, é definida como uma em que, pelo menos, um átomo está substituído por um átomo possuindo o mesmo número atómico mas uma massa atómica diferente da massa atómica habitualmente presente na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados no agente e seus sais farmaceuticamente aceitáveis incluem isótopos de hidrogénio, carbono, azoto, oxigénio, fósforo, enxofre, flúor e cloro tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 170, 180, 31P, 32P, 35S, 18F e 36C1, respectivamente. Determinadas variações isotópicas do agente e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, aquelas nas quais é incorporado um isótopo radioactivo tal com 3H ou 14C, são úteis em estudos de distribuição de fármaco e/ou substrato no tecido. Os isótopos tritiados, i. e., 3H, e de carbono-14, i. e., 14C, são particularmente preferidos pela sua facilidade de preparação e detectabilidade. Além disso, a substituição com isótopos, talcomo deutério, i.e., 2H, pode proporcionar determinadas vantagens terapêuticas resultantes de uma maior estabilidade metabólica, por exemplo, maior semivida in vivo ou requisitos de dosagem reduzidos e podem, por isso, ser preferidos em determinadas circunstâncias. As variações isotópicas do agente da presente invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem ser geralmente preparados por procedimentos convencionais utilizando variações isotópicas apropriadas de reagentes adequados. 33

SOLVATOS A presente invenção também inclui a utilização de formas solvato dos compostos da presente invenção. Os termos utilizados nas reivindicações abrangem estas formas.

POLIMORFOS A invenção refere-se, além disso, aos compostos da presente invenção nas suas várias formas cristalinas, formas polimórficas e formas hidratadas ou anidras. Está bem estabelecido na indústria farmacêutica que os compostos químicos podem ser isolados em qualquer uma destas formas mudando ligeiramente o método de purificação e/ou forma de isolamento, os solventes utilizados na preparação sintética de tais compostos.

PRÓ-FÁRMACOS A invenção inclui ainda os compostos da presente invenção na forma de pró-fármaco. Estes pró-fármacos são geralmente compostos de fórmula I em que um ou mais grupos apropriados foram modificados de modo a que a modificação possa ser revertida após administração a um indivíduo humano ou mamífero. Esta reversão é habitualmente realizada por uma enzima presente naturalmente nesse indivíduo, embora seja possível a administração de um segundo agente em conjunto com um tal pró-fármaco para realizar a reversão in vivo. Exemplos de tais modificações incluem ésteres (por exemplo, qualquer um dos descritos acima) , em que a reversão pode ser realizada por uma 34 esterase etc. Outros sistemas deste tipo serão bem conhecidos dos especialistas na técnica.

ADMINISTRAÇÃO

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser adaptadas para as vias de administração oral, rectal, vaginal, parentérica, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intratecal, intrabronquial, subcutânea, intradérmica, intravenosa, nasal, bucal ou sublingual.

Para administração oral é feita utilização particular de comprimidos prensados, pílulas, comprimidos, cápsulas moles, rebuçados e cápsulas. De um modo preferido, estas composições contêm desde 1 até 250 mg e de um modo mais preferido desde 10-100 mg, de ingrediente activo por dose.

Outras formas de administração compreendem soluções ou emulsões que podem ser injectadas por via intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutânea, intradérmica, intraperitoneal ou intramuscular, e as quais são preparadas de soluções estéreis ou esterilizáveis. As composições farmacêuticas da presente invenção também podem estar na forma de supositórios, pessários, suspensões, emulsões, loções, pomadas, cremes, geles, formulações para pulverização, soluções ou pós de talco.

Um meio alternativo de administração transdérmica é através da utilização de um penso transdérmico. Por exemplo, o ingrediente activo pode ser incorporado num creme consistindo de uma emulsão aquosa de polietileno glicóis ou parafina líquida. A 35 uma substância activa também pode ser incorporada, a concentração entre 1 e 10% em peso, numa pomada consistindo de uma base de cera branca ou parafina branca mole em conjunto com estabilizantes e conservantes, consoante possa ser necessário.

As formas injectáveis podem conter entre 10-1000 mg, de um modo preferido entre 10-250 mg, de ingresiente activo por dose.

As composições podem ser formuladas na forma de dosagem unitária, i. e., na forma de porções discretas contendo uma dose unitária, ou um múltiplo ou subunidade de uma dose unitária.

DOSAGEM

Um especialista na matéria pode determinar facilmente uma dose apropriada de uma das composições desta invenção a ser administrada a um indivíduo sem experimentação excessiva. Tipicamente, um medido determinará a dosagem efectiva que será mais adequada para um doente particular e esta dependerá de uma variedade de factores incluindo a actividade do composto específico utilizado, da estabilidade metabólica e duração da acção desse composto, da idade, peso corporal, estado geral de saúde, género, dieta, modo e momento de administração, velocidade de excreção, associação de fármaco, da gravidade da patologia particular e do indivíduo submetido a terapia. As dosagens aqui divulgadas são ilustrativas do caso médio. Evidentemente, podem surgir situações particulares que necessitam de gamas de dosagem superiores ou inferiores, e essas estão dentro do âmbito desta invenção. 36

Dependendo da necessidade, o agente pode ser administrado a uma dose desde 0,01 até 30 mg/kg de peso corporal, tal como desde 0,1 até 10 mg/kg, de um modo mais preferido desde 0,1 até 1 mg/kg de peso corporal.

Numa forma de realização ilustrativa, serão administradas uma ou mais doses de 10 até 150 mg/dia ao doente para o tratamento da doença.

ASSOCIAÇÕES

Numa forma de realização particularmente preferida, um ou mais compostos da invenção são administrados associados a um ou mais de outros agentes antineoplásicos, por exemplo, fármacos antineoplásicos existentes disponíveis no mercado. Nestes casos, os compostos da invenção podem ser administrados consecutivamente, simultaneamente ou sequencialmente com um ou mais de outros agentes antineoplásicos.

Os fármacos antineoplásicos são em general mais eficazes quando utilizados em associação. Em particular, a terapia de associação é atractiva para evitar uma sobreposição de toxicidades principais, mecanismos de acção e mecanismo(s) de resistência. Além disso é também atractivo administrar a maior parte dos fármacos às suas doses máximas toleradas com intervalos de tempo mínimos entre tais doses. As vantagens principais de associar fármacos quimioterapêuticos são que eles podem promover efeitos aditivos ou possivelmente sinérgicos através de interacções bioquímicas e podem também diminuir o aparecimento de resistência em células tumorais iniciais que teriam de outro modo sido reactivas à quimioterapia inicial com 37 um único agente. Um exemplo de uma utilização de interacções bioquímicas na selecção de associações de fármacos é demonstrado pela administração de leucovorina para aumentar a ligação de um metabolito intracelular activo do 5-fluorouracilo ao seu alvo, timidilato-sintase, aumentando desse modo os seus efeitos citotóxicos.

Um grande número de associações é utilizado nos tratamentos correntes de cancro e leucemia. Uma revisão mais extensiva das práticas clínicas pode ser encontrada em "Oncologic Therapies" editado por E. E. Vokes e Η. M. Golomb, publicado por Springer.

As associações benéficas podem ser sugeridas estudando a actividade inibidora do crescimento dos compostos de ensaio com agentes conhecidos ou que se suspeite serem úteis no tratamento de um cancro particular inicialmente ou em linhagens de células derivadas desse cancro. Este processo também pode ser utilizado para determinar a ordem de administração dos agentes, i. e. antes, em simultâneo ou após administração. Este escalonamento pode ser uma característica de todos os agentes que influenciam o ciclo aqui identificados.

DISPOSITIVOS

Numa forma de realização preferida da invenção, o grupo R11 permite a imobilização dos compostos de 2-fenilamino-4-heteroaril-pirimidina num substrato. A título de exemplo, o grupo R11 pode conter funções químicas que podem ser utilizadas para ligação covalente a fases sólidas, tal como polímeros funcionalizados (e. g., agarose, poliacrilamida, poliestireno etc.) como geralmente presentes em matrizes (paredes dos poços 38 de micro placas, microsferas, membranas, etc.), ou utilizadas para ensaios bioquímicos ou cromatografia de afinidade. Alternativamente, o grupo R11 pode estar ligado a outras moléculas pequenas (e. g,. biotina) ou polipéptidos (e. g., antigénios), os quais podem ser utilizados para imobilização não covalente através de fixação a um receptor imobilizado (e. g., avidina ou estreptavidina no caso de biotina, ou um anticorpo específico no caso antigénios).

ENSAIOS

Outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um composto de fórmula Ib como definido acima num ensaio para identificar outros compostos candidatos que influenciem a actividade de uma ou mais enzimas CDK.

De um modo preferido, o ensaio é capaz de identificar compostos candidatos que são capazes de inibir uma ou mais de uma enzima CDK, GSK ou uma enzima PLK.

De um modo mais preferido, o ensaio é um ensaio de ligação competitiva.

De um modo preferido, o composto candidato é gerado por modificação SAR convencional de um composto da invenção.

Como aqui utilizado, o termo "modificação SAR convencional" refere-se a métodos correntes conhecidos na técnica para modificar um dado composto através de derivatização química. 39

Assim, num aspecto, o composto identificado pode actuar como um modelo (por exemplo, um molde) para o desenvolvimento de outros compostos. Os compostos empregues num tal ensaio podem estar sem solução, fixos a um suporte sólido, suportados numa superfície celular ou localizados intracelularmente. Pode medir-se a anulação da actividade ou a formação de complexos de ligação entre o composto e o agente a ser testado. 0 ensaio da presente invenção pode ser um ensaio de rastreio, de acordo com o qual são avaliados um número de agentes. Num aspecto, o método de ensaio da presente invenção é um ensaio de rastreio de alto débito.

Esta invenção também abrange a utilização de ensaios competitivos de rastreio de fármacos, nos quais anticorpos neutralizantes capazes de ligar um composto competem especificamente com um composto de ensaio para se ligar a um composto.

Outra técnica de rastreio proporciona o rastreio de alto débito (HTS) de agentes com afinidade de ligação adequada às substâncias e baseia-se no método descrito em pormenor no documento WO 84/03564.

Espera-se que os métodos de ensaio da presente invenção sejam adequados para rastreios de pequena e grande escala de compostos de ensaio assim como em ensaios quantitativos.

De um modo preferido, o ensaio de ligação competitiva compreende fazer contactar um composto de fórmula Ib com uma enzima CDK na presença de um substrato conhecido da referida 40 enzima CDK e detectar qualquer alteração na interacção entre a referida enzima CDK e o referido substrato conhecido.

Outro aspecto da invenção proporciona um método para detectar a ligação de um ligando a uma enzima CDK, em que o referido método compreende os passos de: (i) fazer contactar um ligando com uma enzima CDK na presença de um substrato conhecido da referida enzima CDK; (ii) detectar qualquer alteração na interacção entre a referida enzima CDK e o referido substrato conhecido; e em que o referido ligando é um composto de fórmula Ib.

Um aspecto da invenção refere-se a um processo compreendendo os passos de: (a) realizar um método de ensaio descrito acima; (b) identificar um ou mais ligandos capazes de se ligarem ao domínio de ligação do ligando; e (c) preparar uma quantidade do referido um ou mais ligandos.

Outro aspecto da invenção proporciona um processo compreendendo os passos de: (a) realizar um método de ensaio descrito acima; (b) identificar um ou mais ligandos capazes de se ligarem a 41 um domínio de ligação de ligando; e (c) preparar uma composição farmacêutica compreendendo o referido um ou mais ligandos.

Outro aspecto da invenção proporciona um processo compreendendo os passos de: (a) realizar um método de ensaio descrito acima; (b) identificar um ou mais ligandos capazes de se ligarem a um domínio de ligação de ligando; (c) modificar o referido um ou mais ligandos capazes de se ligarem a um domínio de ligação de ligando; (d) realizar o método de ensaio descrito acima; (e) opcionalmente preparar uma composição farmacêutica compreendendo o referido um ou mais ligandos.

Os métodos anteriores podem ser utilizados para seleccionar um ligando útil como um inibidor de uma ou mais enzimas CDK. A presente invenção é ainda descrita a título de exemplo. 42

EXEMPLOS

Exemplo 1 Síntese química. A ligação covalente de unidade de solubilização pode ser conseguida de um número de modos diferentes conhecidos na técnica (Wermuth CG. Preparation of water-soluble compounds by covalent attachment of solubilizing moieties. In: Practice of Medicinal Chemistry; Academic Press:

London, UK, 1996; pág. 755-776). Por exemplo, os substituintes amino nos derivados de 2-fenilamino-4-heteroaril-pirimidina, ou seus precursores de síntese, podem ser acilados ou alquilados com funções carbonilo em precursores apropriados da unidade de solubilização. De modo semelhante, os grupos carbonilo nos derivados de 2-fenilamino-4-heteroaril-pirimidina podem ser aminados ou alquilados com precursores apropriados da unidade de solubilização. Os grupos halogéneos em C aromáticos nas fenilamino-4-heteroaril-pirimidinas ou precursores podem ser substituídos substituído por grupos nucleófilos em precursores da unidade de solubilização. Os precursores adequados de 2-fenilamino-4-heteroaril-pirimidina podem ser preparados de acordo com os ensinamentos de Fischer et al. (Fischer PM, Wang S. Publicação de Pedido de Patente Internacional PCT WO 01/072745; Cyclacel Limited, UK, 2001). Alguns pormenores sintéticos e analíticos dos compostos ilustrativos da presente invenção (reportar ao Quadro 1) são dados no Exemplo 2 abaixo. 43

Exemplo 2 [4- (2-Amino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-aminâ [1]. Por condensação entre Ν'-[5-(3-dimetilamino-acriloil)-4-metil-tiazol-2-il]-Ν,Ν-dimetil-formamidina (preparada a partir de 1-(2-amino-4-metil-tiazol-5-il)-etanona e dimetilacetal de N,W-dimetilformamida) e nitrato de N- (4-morfolin-4-il-fenil)-guanidina. Sólido amarelo. P.f. 300-304 °C: RMN de XH (DMSO-dg) δ: 2,46 (s, 3H, CH3) , 3,07 (m, 4H, CH2), 3,76 (m, 4H , CH2) , 6,85 (d, 1H, J = 5, , 3 Hz, pirimidinil-H), 6,92 (m, 2H, Ph-H), 7,53 (s 1, 1H, NH) , 7, 67 (m, 2H, Ph-H), 8,30 (d, 1H, J = 5,4 Hz, pirimidinil-H), 9,25 (s 1, 1H, NH) . MS (ESI+) m/z 369 [M+H]+ (Ci8H2oN6OS requer 368,5).

[4-(2, 4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]- (4-morfolin-4-il-fenil)-amina [2]. Por condensação entre 3-dimetilamino-l-(2,4-dimetil-tiazol-5-il)-propenona e nitrato de N-(4-morfolin-4-il-fenil)-guanidina. Sólido pálido. RMN de 1H (CDC13) δ: 2,69 (s, 3H, CH3) , 2,70 (s, 3H, CH3) , 3,14 (t, 4H, J= 4,8 Hz, CH2) , 3,72 (t, 4H, J= 4,9 Hz, CH2) , 6,89 (d, 1H, J= 5,1 Hz, pirimidinil-H) , 6,95 (d, 2H, J = 8,8 Hz, Ph-H) , 6,98 (s 1, 1H, NH) , 7,53 (d, 2H, J= 9,1 Hz, Ph-H), 8,38 (d, 1H, J= 5,1 Hz, pirimidinil-H). MS (ESI + ) m/z 368 [M+H]+ (C19H21N5OS requer 367,5).

[4- (2-N-Metilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolinofenil)-amina [3]. Por condensação entre 3-dimetilamino-1-(4-metil-2-metilaminotiazol-5-il)-propenona (preparada a partir de 1-(4-metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-etanona e dimetilacetal de Ν,Ν-dimetilformamida) e nitrato de N-(4-morfolin-4-il-fenil)-guanidina. Sólido pálido. Anal. RP-HPLC: tR = 10,8 min (0-60% de MeCN em 0,1% de CF3COOH aq. ao 44 longo de 20 min, 1 mL/min, pureza > 95%) . RMN de ‘ή (DMSO-dê) δ: 2,83 (s, 3H, CH3), 2,84 (s, 3H, CH3) , 3,01 (t, 4H, J= 5,0 Hz, CH2), 3,72 (t, 4H, J= 5,0 Hz, CH2) , 6,81 (d, 2H, J= 5,5 Hz, pirimidinil-H) , 6,87 (m, 2H, Ph-H) , 7,61 (m, 2H, Ph-H) , 8,12 (s 1, 1H, NH) , 8,26 (d, 1H, J= 5,5 Hz, pirimidinil-H), 9,19 (s 1, 1H, NH) . MS (ESI+) m/z 383 [M+H]+ (Ci9H22N6OS requer 382,5).

[4-(2-Etilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]- (4-morfolin-4-il-fenil)-amina [4]. Por condensação entre 3-dimetilamino-l-(2-etilamino-4-metil-tiazol-5-il)-propenona (preparada a partir de 1-(2-etilamino-4-metil-tiazol-5-il)-etanona e dimetilacetal de Ν,Ν-dimetilformamida) e Nitrato de N-(4-morfolin-4-il-fenil)-guanidina. Sólido pálido. Anal. RP-HPLC: tR = 19,4 min (0-60% de MeCN em 0,1% de CF3COOH aq. ao longo de 20 min, 1 mL/min, pureza > 95%) . RMN de ΧΗ (DMSO-dê) δ: 1,16 (t, J= 7,5 Hz, 3H, CH3) , 2,48 (s, 3H, CH3) , 3,26 (m, 2H, CH2), 3,01 (t, 4H, J= 5,0 Hz, CH2) , 3,72 (t, 4H, J= 5,0 Hz, CH2) , 6,80 (d, 2H, J = 5,5 Hz, pirimidinil-H), 6,86 (d, 2H, J = 9.0 Hz, Ph-H), 7,60 (d, 2H, J= 9,0 Hz, Ph-H), 8,25 (d, 1H, J= 5.0 Hz, pirimidinil-H), 8,50 (s, 1H, NH), 9,16 (s 1, 1H, NH). 1- (4- (4-[4- (2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil)-piperazin-l-il)-etanona [5]. Aqueceu-se a 100 °C durante 18 h uma solução de l-fluoro-4-nitrobenzeno (6,7 g, 47,5 mmol) , 1-piperazin-l-il-etanona (6,7 g, 52,3 mmol) e K2C03 (6,6 g, 47,5 mmol) em DMSO (60 mL) . Depois de arrefecer, verteu-se a mistura para H20 (0,5 L). Filtrou-se o precipitado amarelo resultante e lavou-se com H20 para proporcionar 1-[4-(4-nitro-fenil)-piperazin-l-il]-etanona (11,9 g) . Esta foi parcialmente dissolvida em EtOH (100 mL) e AcOH (50 mL) . Aqueceu-se a mistura até ca. 65 °C e adicionou-se ferro em pó (malha-325, 12, 0 g, 45 215 mmol) em porções de 1 g. Aqueceu-se a mistura a refluxo durante 2 h e filtrou-se através de um tampão de Celite. Evaporou-se o filtrado para deixar um óleo preto que foi basificado pela adição de NaOH aq 2 M e extraiu-se com AcOEt. Lavou-se os orgânicos reunidos com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e evaporou-se ín vacuo para proporcionar 1-[4-(4-amino-fenil)-piperazin-l-il]-etanona (6,7 g) como um sólido amarelo. Dissolveu-se uma aliquota deste material (2,0 g, 9,12 mmol) em EtOH (5 mL) e adicionou-se HN03 (solução aquosa a 69%, 1,26 mL, 19,61 mmol), seguido de cianamida (sol. aq. a 50% p/v, 2,48 mL, 31,92 mmol) . Aqueceu-se a mistura resultante a refluxo durante 18 h. Arrefeceu-se até à temperatura ambiente e verteu-se para Et20 (100 mL) . Separou-se a camada etérea e concentrou-se. Filtrou-se o precipitado resultante e lavou-se com iPr0H/Et20, depois Et20 puro. Secou-se o sólido castanho-claro para proporcionar nitrato de N-[4-(4-acetil-piperazin-l-il)-fenil]-guanidina (1,2 g).

Dissolveu-se este material (1,1 g, 2,84 mmol) em 2-metoxietanol (14 mL) e adicionou-se K2C03 (0,79 g, 5,68 mmol), seguido de 3-dimetilamino-l-(2,4-dimetil-tiazol-5-il)-propenona (0,60 g,

2,84 mmol). Aqueceu-se a mistura resultante a 115 °C durante 18 h. Arrefeceu-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatograf ia sobre Si02 (AcOEt/NEp em MeOH 2 M 9:1) e recristalização de iPr20/Me0H para proporcionar o composto em epígrafe (930 mg) como um sólidocastanho-claro. RMN de 1H (CDC13 :), 2,15 (s, 3H, CH3) , , 2,69 (S , 3H, CH3) , 2,71 (S, 3H, CH3) , 3,12 (t, 2H, J = : 5,4 Hz, CH2) , 3, 15 (t , 2H, J = 5,4 Hz, CH2), 3,63 (t, 2H, J = : 5,4 Hz, CH2), 3, 79 (t , 2H, J = 5,4 Hz, ch2), 6,90 (d, 1H, J = 5,4 Hz, pirimdinil-H), 6,96 (m, 2H, Ph-H), 6,98 (s 1, 1H, NH) , 7,54 (m, 2H, Ph-H), 8,39 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H) . MS (ESI + ) m/z 409, 6 (CnH^NgOS requer 408,5). 46 [4-(2,4-Dimetil-tiãzol-5-il)-pirimidin-2-il]- (4-piperazin-l-il-fenil)-amina [6]. A uma solução de 1-(4 — {4-[4-(2,4-dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanona (0,67 g, 1,64 mmol) em EtOH (3 mL) adicionou-se HC1 aq. 2 M (25 mL) numa corrente estável. Aqueceu-se a mistura a refluxo durante 1 h, arrefeceu-se e basificou-se através da adição de Na2C03 sólido. Extraiu-se o produto com AcOEt. Lavou-se os orgânicos reunidos com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se sobre Na2S04, filtrou-se e evaporou-se para proporcionar o composto em epigrafe (580 mg) como um sólido amarelo. RMN de XH (CDC13) δ: 2,62 (s, 3H, CH3), 2,63 (s, 3H, CH3), 2,99 (m, 4H, CH2) , 3,06 (m, 4H, CH2) , 6,81 (d, 1H, J = 5,4 Hz, pirimidinil-H) , 6,89 (m, 3H, Ph-H, NH) , 7,44 (m, 2H, Ph-H) , 8,31 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H). MS (ESI+) m/z 367 (Ci9H22N6S requer 366, 5).

[4 - (2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4- (4'-2''-etoxiletanolpiperazino)-fenil]-amina [7], Aqueceu-se a 170 °C durante 15 min num tubo selado uma mistura de [4-(2,4-dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-l-il-fenil)-amina (0,1 g, 0,27 mmol), 2-(2-cloro-etoxi)-etanol (35 pL, 0,33 mmol), Nal (49 mg, 0,33 mmol) e K2C03 (37 mg, 0,27 mmol) em MeCN (2 mL) num reactor de microondas (SmithCreator, Personal Chemistry Ltd) . Evaporou-se o solvente até à secura e purificou-se o resíduo por cromatografia sobre Si02 (98:2 até 95:5 de AcOEt/NH3 em MeOH 2 M) para proporcionar o composto em epígrafe (78 mg) como espuma amarela. RMN de 1H (CDC13) δ: 2,69 (s, 3H, CH3), 2,71 (s, 3H, CH3), 2,80-2,91 (m, 6H, CH2) , 3,30 (m, 4H, CH2) , 3,67 (m, 2H, CH2), 3,73 (m, 2H, CH2) , 3,79 (m, 2H, CH2) , 6,89 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H), 6,97 (m, 3H, Ph-H & NH) , 7,52 (m, 47 2Η, Ph-H), 8,02 (s 1, 1H, OH), 8,38 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H) . MS (ESI + ) m/z 456 (C23H3oN602S requer 454,6). 3- (4-4- [4 - (2, 4-Dimetil-tiazol-4-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil)-piperazin-l-il)-propan-l-ol [8]. Sólido amarelo. RMN de 1H (CDC13) δ: 2,69 (s, 3H, CH3) , 2,71 (s, 3H, CH3) , 2,75 (m, 2H, CH2), 3,21 (m, 2H, CH2), 3,84 (t, 2H, J= 5,1 Hz, CH2) , 6,89 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H), 6,95 (m, 2H, Ph-H), 6,98 (s 1, 1H, NH) , 7,51 (m, 2H, Ph-H), 8,38 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirim-H) . MS (ESI+) : m/z 425, 8 (C22H28N6OS requer 424,6). 2-(4-{4-[4- (2,4-Dimetil-tiazol-4-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanol [9]. Sólido amarelo. RMN de 1H (CDCI3) Ô: 2,55 (t, 2H, J= 5,4 Hz, CH2) , 2,62 (m, 10H, CH3 & CH2), 3,12 (t, 4H, J= 4,9 Hz, CH2), 3,60 (t, 2H, J = 5,4 Hz. CH2), 6,81 (d; 1H, J = 5,4 Hz, pirimidinil-H), 6,88 (m, 2H, Ph-H) LO O Γ- (s 1, 1H, NH) , 7,45 (m, 2H, Ph-H), 8,30 (d, 1H, J= 5,1 Hz, pirimidinil-H). MS (ESI+) m/z 411,7 (C2iH26N6OS requer 410,5).

[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4 - (4-metanosulonil-piperazin-l-il)-fenil]-amina [10]. uma mistura de [4-(2,4-dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-l-il-fenil)-amina (86 mg, 0,23 mmol) em CH2C12 anidro (2 mL) adicionou-se Et3N (39 pL, 0,28 mmol). Depois de arrefecer até 0 °C, adicionou-se, gota a gota, cloreto de metanossulfonilo (22 pL, 0,28 mmol). Depois de agitar durante 15 min, aqueceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e prosseguiu-se a agitação durante 18 h. Após evaporação, purificou-se o residuo por cromatografia sobre Si02 (98:2 até 95:5 de AcOEt/NH3 em MeOH 2 M) para proporcionar o composto em epígrafe (61 mg) como um 48 sólido amarelo. RMN de ΧΗ (CDC13) δ: 2,69 (s, 3H, CH3) , 2,71 (s, 3H, CH3), 2,84 (s, 3H, CH3) , 3,26 (t, 4H, J= 5,1 Hz, CH2) , 3,41 (t, 4H, J= 5,1 Hz, CH2), 6,91 (d, 1H, J= 5,1 Hz, pirimidinil-H) , 6,98 (d, 2H, J = 8,8 Hz, Ph-H) , 7,10 (s 1, 1H, NH) , 7,56 (d, 2H, J= 8,8 Hz, Ph-H), 8,30 (d, 1H, J= 5,1 Hz, pirimidinil-H). MS (ESI + ) m/z 446 (C20H24N6O2S2 requer 444, 6).

[4 - (4-Benzil-piperazin-l-il)-fenil]-[4-(4-metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina [11] . Dissolveu-se parcialmente 4-(4-benzil-piperazin-l-il)-fenilamina (2,17 g, 8,12 mmol) em EtOH (5 mL) e adicionou-se HN03 (solução aquosa a 69%, 1,05 mL, 16,32 mmol) gota a gota, seguido de cianamida (sol. aq. a 50%, 1,13 mL, 16,32 mmol). Aqueceu-se a mistura durante 18 h a refluxo. Após processamento obteve-se nitrato de N- [ 4-(4-benzil-piperazin-l-il)-fenil]-guanidina (1,16 g) como um sólido púrpura. Aqueceu-se a 120 °C durante 18 h uma mistura deste material (2,66 mmol), 3-dimetilamino-l-(4-metil-2-metilaminotiazol-5-il)-propenona (0,60 g, 2,66 mmol) e K2C03 (0,74 g, 5,32 mmol) em 2-metoxietanol (15 mL). Depois de arrefecer, verteu-se para AcOEt (100 mL) e filtrou-se através de um tampão de silica. Evaporou-se o filtrado e purificou-se o residuo por cromatografia sobre Si02 (heptano/AcOEt) para proporcionar o composto em epígrafe (442 mg) como um sólido castanho-amarelado claro. RMN de 1H (CD3OD) δ: 2,44 (s, 3H, CH3) , 2,56-2, 58 (m, 4H, CH2) , 2,91 (s, 3H, CH3), 3,09 (m, 4H, CH2) , 3,51 (s, 2H, CH2) , 6,70 (d, 1H, J = 5,6 Hz, pirimidinil-H), 6,87 (m, 2H, Ph-H), 7,22 (m, 1H, Ph-H), 7,27 (m, 4H, Ph-H), 7,43 (m, 2H, Ph-H), 8,15 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H). MS (ESI+) m/z 473,2 (C26H29N7S requer 471,6). 49 [4-(2, 4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4- (4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina [12]. Por condensação entre 3-dimetilamino-l-(2,4-dimetil-tiazol-5-il)-propenona e nitrato de N-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-guanidina. Sólido amarelo-claro. RMN de 1H (CDCI3) , 2,37 (s, 3H, CH3) , 2,61 (m, 4H, CH2), 2,69 (s, 3H, CH3), 2,70 (s, 3H, CH3) , 3,20 (m, 4H, CH2) , 6,88 (d, 1H, J = 5,1 Hz, pirimidinil-H) , 6,94 (s, 1H, NH) , 6,96 (d, 2H, J= 8,8 Hz, Ph-H), 7,51 (d, 2H, J= 8,8 Hz, Ph-H), 8,38 (d, 1H, J= 5,1 Hz, pirimidinil-H). 1- (4-{4-[4- (2, 4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-propan-2-ol [49]. Por tratamento de [4-(2,4-dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-l-il-fenil)-amina com l-cloro-2-propanol. RMN de 1H (CDC13) Ô: 1,10 (d, 3H, J= 6,0 Hz, CH3), 2,26-2,33 (m, 2H, CH2) , 2,49-2,53 (m, 2H, CH2), 2,61 (s, 3H, CH3) , 2,63 (s, 3H, CH3) , 2,76-2,80 (m, 2H, CH2), 3,07-3,13 (m, 4H, CH2) , 3,83 (m, 1H, CH) , 6,81 (d, 1H, J = 4,4 Hz, pirimidinil-H), 6,88 (d, 2H, J = 8,8 Hz, Ph-H), 7,02 (s 1, 1H, OH), 7,44 (d, 2H, J= 8,8 Hz, Ph-H), 8,30 (d, 1H, J= 4,4 Hz, pirimidinil-H). 3-[4 - (4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenol [55]. Arrefeceu-se uma solução de morfolina-4-carbonitrilo (10 g, 89,19 mmol) em EtOH (65 mL) num banho de gelo. Borbulhou-se NH3 anidro através da solução durante 5 min, seguido de sulfureto de hidrogénio. Pouco depois da introdução de H2S observou-se um precipitado branco. Após a adição de ambos os gases durante 45 min parou-se a adição de NH3 e prosseguiu-se o H2S durante mais 15 minutos. Recolheu-se o precipitado resultante, lavou-se com água fria, MeOH e secou-se sob alto vácuo para proporcionar amida do ácido morfolina-4-carbotióico 50 (12,83 g) . P.f. 173-174 °C. RMN de XH (DMSO-d6) δ: 3,54 (t, 4H, J= 4,9 Hz, CH2), 3,70 (m, 4H, CH2) , 7,46 (s 1, 2H, NH2) . Esta foi convertida em primeiro lugar em 1-(4-metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-etanona com 3-bromo-pentano-2,4-diona, depois com dimetoximetil-dimetil-amina em 3-dimetilamino-l-(4-metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-propenona do modo habitual. A última enaminona foi condensada com nitrato de N-(3-hidroxi-fenil)-guanidina para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido pálido. P.f. 227-229 °C. RMN de (DMSO-d6) δ: 2,49 (s, 3H, CH3), 3,46 (t, 4H, J= 4,4 Hz, CH2) , 3,71 (t, 4H, J= 4,4 Hz, pirimidinil-H) , 6,34 (d, 1H, J = 8,8 Hz, Ph-H) , 6,91 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H), 7,03 (t, 1H, J= 7,8 Hz, Ph-H), 7,20-7,22 (m, 2H, Ph-H), 8,34 (d, 1H, J = 5,4 Hz, pirimidinil- H) , 9,17 (s, 1H, OH/NH) , 9,32 (s, 1H, NH/OH) . MS (ESI+) m/z 370,10 [M+H]+ (Ci8H19N502S requer 369, 44).

[4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]- (4-morfolín-4-il-fenil)-amina [56]. Por tratamento de 3-dimetilamino-l-(4-metil-2-morfolino-tiazol-5-il)-propenona e nitrato de N-(4-morfolinofenil)-guanidina. Sólido pálido. P.f. 229-231 °C. RMN de XH (DMSO-d6) δ: 2,48 (s, 3Η, CH3) , 3,02 (t, 4Η, J= 4,0 Hz, CH2), 3,46 (t, 4H, J= 4,0 Hz, CH2) , 3, 70-3, 73 (m, 8H, CH2) , 6,86 (d, 1H, J = 5,4 Hz, pirimidinil-H), 6,89 (d, 2H, J= 9,3 Hz, Ph-H), 7,60 (d, 2H, J= 8,8 Hz, Ph-H), 8,30 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H), 9,22 (s, 1H, NH) . MS (ESI+) m/z 439,03 [M+H]+ (C22H26N602S requer 438,55). N,N-Dimetí1-N'-[4-[4-metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il) -pirimidin-2-íl]-benzeno-1,4-diamina [57]. Por tratamento de 3-dimetilamino-l-(4-metil-2-morfolino-tiazol-5-il)-propenona e nitrato de N- (4-i\J,i\J-dimetilaminofenil) -guanidina. Sólido 51 amarelo. RMN de XH (DMSO-dê) Ô: 2,48 (s, 3H, CH3), 2,82 (s, 6H, CH3) , 3,46 (t, 4H, J = 4,9 Hz, pirimidinil-H) , 3,70 (t, 4H, J= 4,9 Hz, CH2), 6,70 (d, 2H, J= 8,8 Hz, Ph-H) , 6,82 (d, 1H, J = 5,4 Hz, pirimidinil-H), 7,53 (d, 2H, J= 8,8 Hz, Ph-H), 8,27 (d, 1H, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H), 9,09 (s, 1H, NH) . MS (ESI+) m/z 397,03 [M+H]+ (C2oH24N6OS requer 396, 51). 1- (4-{4-[4- (4-Metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanona [61]. Por condensação entre 3-dimetilamino-l-(4-metil-2-metilamino-tiazol-5-il)- propenona e nitrato de N- [4-(4-acetil-piperazin-l-il)-fenil]-guanidina. Sólido amarelo. P.f. 213-214 °C. Anal. RP-HPLC: tR = 8,8 min (10-70% de MeCN, pureza > 95%). RMN de 1H (DMSO-dê) δ: 2,43 (s, 3H, CH3), 3 ,02 (s, 3H, CH3), 3,23 (s, 3H, CH3), 2, 99 (m, 2H, CH2) , 3,06 (t, 2H, CH2) , 3,57 (t, , 4H, CH2 ), 6 ,82 (d, 1H, J = 6,0 Hz, pirimidinil -H) , 6,89 (d, 2H, J = 9,0 Hz, Ph-H), 7,62 (d, 2H, J = 9,5 Hz, f Ph-H), 8,26 (d, 1H, J -- = 5,5 Hz, pirimidinil-H), 9,18 (s, 1H, NH) . MS (ESI + ) m/z 424,07 [M+H] (C2iH25N7OS requer 423, 54).

[4 - (4-Meti 1-2-metilamino-tiazo1-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-l-il-fenil)-amina [62]. Por hidrólise de 1— (4—{4— [4 — (4-Meti1-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}- piperazin-l-il)-etanona em HC1 aq. 2 M. Sólido amarelo. Anal. RP-HPLC: tR = 8,8 min (10-70% de MeCN, pureza > 95%) . RMN de XH (DMSO-de) δ: 2,45 (3, 3H, CH3), 2,83 (t, 4H, J = 5,9 Hz, CH2) , 2,85 (d, 3H, J = 4,9 Hz, CH2), 2,95 (t, 4H, J = 4,9 Hz, CH2), 6,81 (d, 1H, J = 5,4 Hz, pirimidinil-H), 6,85 (d, 2H, J = 9,3 Hz, Ph-H), 7,58 (d, 2H, J = 8,8 Hz, Ph-H), 7, 99 (m , 1H, NH), 8,26 (d, 1Η, J= 5,4 Hz, pirimidinil-H), 9,14 (s 1, 1H). 52 [4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]- (3-nitro-fenil)-amina [71] . Por condensação de 3-dimetilamino-l-(4-metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-propenona e nitrato de N-{3-nitro-fenil)-guanidina. Sólido amarelo. Anal. RP-HPLC: tR = 16,7 min (10-70% MeCN, pureza > 95%). RMN de 1H (DMSO-dê) δ: 2,51 (s, 3H, CH3), 3,50 (t, 4H, J= 4,5 Hz, CH2) , 3,72 (t, 4H, J= 4,5 Hz, CH2), 7,06 (d, 1H, J = 5,5 Hz, pirimidinil-H), 7,55 (t, 1H, J= 8,5 Hz, Ph-H) , 7,77 (d, 1H, J= 8,5 Hz, Ph-H) , 7,97 (d, 1H, J= 8,5 Hz, Ph-H), 8,44 (d, 1H, J= 5,5 Hz, pirimidinil-H), 9,03 (S, 1H, Ph-H), 10,06 (S 1, 1H, NH) . MS (ESI+) m/z 399,20 [M+H] + (CieHieNeOaS requer 398,44).

Exemplo 3

Ensaios de cinase. Os compostos do Exemplo 2 acima foram investigados relativamente à sua aptidão para inibir a actividade enzimática de várias proteína-cinases Isto foi conseguido através da medição da incorporação de fosfato radioactivo a partir de ATP em substratos polipeptídicos apropriados. As proteína -cinases recombinantes e os complexos de cinase foram produzidos ou obtidos comercialmente. Os ensaios foram realizados utilizando placas de 96 poços e tampões de ensaio apropriados (tipicamente β-glicerofosfato 25 mM, MOPS 20 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM, Na3V03 1 mM, pH 7,4), aos quais se adicionou 2-4 pg de enzima activa com substratos apropriados. Iniciou-se as reacções através da adição de mistura de Mg/ATP (MgCl2 15 mM + ATP 100 μΜ com 30-50 kBq por poço de [γ—32P]-ATP) e incubou-se as misturas consoante necessário a 30 °C. Parou-se as reacções em gelo, após o que se filtrou através de placas de filtração p81 ou placas de filtração GF/C (Whatman 53

Polyfiltronics, Kent, UK) . Depois de lavar 3 vezes com ácido ortofosfórico aq. 75 mM, secou-se as placas, adicionou-se cintilante e mediu-se a radioactividade incorporada num contador de cintilação (TopCount, Packard Instruments, Pangbourne, Berks, UK) . Os compostos para o ensaio de cinase foram preparados como soluções-mãe 10 mM em DMSO e diluidos em DMSO a 10% em tampão de ensaio. Os dados foram analisados utilizando software de ajuste de curvas (GraphPad Prism versão 3.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego Calif. USA) para determinar os valores de IC50 (concentração do composto de ensaio que inibe a actividade cinase em 50%) .

Ensaios de CDK 7 e 9. Incubou-se o substrato peptidico CTD (biotinil-Ahx-(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) 4-NH2; 1-2 mg/mL) e CDK7 humana recombinante/ciclina H, CDK9/ciclina Tl, ou CDK9/ciclina K (0,5-2 pg) durante 45 min a 30 °C na presença de quantidades variáveis de composto de ensaio em MOPS 20 mM pH 7,2, β-glicerofosfato 25 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM, vanadato de sódio 1 mM, MgCl2 15 mM e ATP 100 μΜ (contendo uma quantidade vestigial de 32ΡγΑΤΡ) num volume total de 25 pL numa placa microtitulo de 96 poços. Parou-se a reacção colocando a placa em gelo durante 2 min. Adicionou-se Avidina (50 pg) a cada poço e incubou-se a placa à temperatura ambiente durante 30 min. Transferiu-se as amostras para uma placa de filtros de 96 poços e lavou-se (4 x 200 pL por poço) com ácido fosfórico 75 mM. Adicionou-se líquido de cintilação Microscint 40 (50 pL) a cada poço e mediu-se a quantidade de incorporação de P para cada amostra utilizando um contador de cintilação de microplacas Packard Topcount. 54

Ensaio da cinase (humana) Aurora-A. Isto foi realizado através da medição da incorporação de fosfato radioactivo a partir de ATP no substrato Kemptide (LRRASLG), após fosforilação pela cinase Aurora-A obtida comercialmente. Os ensaios foram realizados utilizando placas de 96 poços e tampões de ensaio apropriados (MOPS 8 mM, EDTA 0,2 mM, pH 7,0), nos quais se adicionou 5-10 ng de enzima activa com 200 μΜ de substrato (Kemptide). Iniciou-se as reacções através da adição de mistura Mg/ATP (Acetato de Mg 10 mM + ATP 15 μΜ com 30-50 kBq por poço de [γ-33Ρ]-ATP) e incubou-se as misturas durante 40 min à temperatura ambiente. Parou-se as reacções pela adição de ácido fosfórico a 3%, seguida de filtração através de placas de filtração p81 (Whatman Polyfiltronics, Kent, UK). Depois de lavar 5 vezes com ácido ortofosfórico aq. 75 mM e uma vez em metanol, secou-se as placas, adicionou-se cintilante e mediu-se a radioactividade incorporada num contador de cintilação (TopCount, Packard Instruments, Pangbourne, Berks, UK) . Os compostos para o ensaio de cinase foram preparados em soluções-mãe a 10 mM em DMSO e diluídos em DMSO a 10% em tampão de ensaio. Os dados foram analisados utilizando o software de ajuste de curva (XLfit versão 2.0.9, IDBS, Guildford, Surrey, UK) para determinar os valores de IC50 (concentração de composto de ensaio que inibe a actividade cinase em 50%) .

Os resultados estão resumidos no Quadro 2 e um painel mais extensivo de selectividade em relação a cinase para compostos seleccionados é mostrado no Quadro 3. 55

Exemplo 4

Ensaio de citotoxicidade MTT. Os compostos do Exemplo 2 foram submetidos a um ensaio de proliferação celular corrente utilizando linhagens de células de tumor humano obtidos da ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manessas, VA. 20110-2209, USA). Efectuou-se ensaios correntes de MTT (azul de tiazolilo; brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) de 72 horas (Haselsberger, K.; Peterson, D.C.; Thomas, D.G.; Darling, J.L. Anti Câncer Drugs 1996, 7, 331-8; Loveland, B.E.; Johns, T.G.; Mackay, I.R.; Vaillant, F.; Wang, Z.X.; Hertzog, P.J. Biochemistry International 1992, 27, 501-10). Abreviadamente: aplicou-se células em placas de 96 poços de acordo com o tempo de duplicação e incubou-se dum dia para o outro a 37 °C. Fez-se os compostos de ensaio em DMSO e preparou-se uma série de diluição sucessiva de 1/3 em 100 pL de meio celular, adicionou-se às células (em triplicado) e incubou-se durante 72 h a 37 °C. O MTT foi preparado como uma solução-mãe de 5 mg/mL em meio celular e esterilizado por filtração. Eliminou-se os meios das células após o que se lavou com 200 pL de PBS. O corante MTT foi solubilizado com 200 pL por poço de DMSO com agitação. Leu-se a absorvância a 540 nm e analisou-se os dados utilizando software de ajuste de curva (GraphPad Prism versão 3.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego Calif. USA) para determinar os valores de IC50 (concentração de composto de ensaio que inibe o crescimento celular em 50%) . Os resultados estão resumidos no Quadro 4 sendo apresentado um maior número de dados para compostos seleccionados no Quadro 5. 56

Exemplo 5

Avaliação da eficácia anti-HIV em PBMC humanas frescas

Os compostos representativos da presente invenção foram avaliados em relação à actividade antiviral contra o HIV-1 em células mononucleares humanas de sangue periférico (PBMC) utilizando a estipe clinica pediátrica de HIV, RoJo ou WeJo. Cultivou-se as PBMC em condições que promovem a sobrevivência celular e a replicação do HIV. A actividade antiviral foi avaliada para diluições em série de 6-9 logio de uma solução-mãe de composto a 100 μΜ em DMSO. Calculou-se os seguintes parâmetros: IC50 e IC90 (concentrações que inibem a replicação do virus em 50 e 90%, respectivamente, TC50 (concentração que diminui a viabilidade celular em 50%), e TI (indice terapêutico: TC50/IC50) ·

Isolou-se PBMC frescas, seronegativas para HIV e HBV, de doadores rastreados (Interstate Blood Bank, Inc. Memphis, Term.). Sedimentou-se as células/lavou-se 2-3 vezes por centrifugação de baixa velocidade e ressuspendeu-se em PBS para eliminar as plaquetas contaminantes. Diluiu-se então o sangue submetido a leucoforese com Soro Fisiológico Tamponado com

Fosfato de Dulbecco (DPBS) e aplicou-se por cima Meio de

Separação de Linfócitos (LSM; Cellgro® da Mediatech, Inc.; densidade 1,07810,002 g/mL; Cat.# 85-072-CL) num tubo de centrífuga de 50 mL e centrifugou-se em seguida. Os PBMCs em banda foram suavemente aspirados da interface resultante e lavou-se subsequentemente com PBS por centrifugação de baixa velocidade. Após a lavagem final, enumerou-se as células por exclusão de azul de tripano e ressuspendeu-se em RPMI 1640 fortificado com soro fetal bovino (FBS) e L-glutamina, Fito- 57 hemaglutinina (PHA-P, Sigma). Deixou-se que as células incubassem a 37 °C. Após incubação, centrifugou-se as PBMCs e ressuspendeu-se em RPMI 1640 com FBS, L-glutamina, penicilina, estreptomicina, gentamicina e IL-2 humana recombinante (R&D Systems, Inc) . A IL-2 é incluída no meio de cultura para manter a divisão celular iniciada pela estimulação mitogénica com PHA. As PBMCs foram mantidas neste meio com substituições bissemanais do meio até serem utilizadas no protocolo de ensaio. As células foram mantidas em cultura durante um máximo de duas semanas após o que eram consideradas demasiado velhas para serem utilizadas no ensaio e eram rejeitadas. Os monócitos eram reduzidos na cultura em consequência da adesão ao balão de cultura de tecidos.

Para o ensaio corrente com PBMC, juntou-se células estimuladas com PHA-P de pelo menos dois doadores, diluiu-se e aplicou-se nos poços interiores de uma microplaca de 96 poços de fundo redondo. Utilizou-se a junção de células mononucleares de mais do que um doador para minimizar a variabilidade observada entre doadores individuais, a qual resulta das diferenças quantitativas e qualitativas na infecção pelo HIV e na resposta global das populações primárias de linfócitos às PHA e IL-2. Cada placa continha poços de controlo de vírus/células (células e vírus), poços experimentais (fármaco e células e vírus) e poços de controlo de composto (fármaco e meio sem células, necessário para monitorização MTS da citotoxicidade). Uma vez que o HIV-l não é citopático para as PBMCs, isto permite a utilização da mesma placa de ensaio para ambas, medições da actividade antiviral e da citotoxicidade. Preparou-se diluições dos fármacos de ensaio em tubos microtítulo e colocou-se cada concentração em poços apropriados utilizando o formato corrente. Colocou-se uma diluição predeterminada de cultura-mãe de vírus 58 em cada poço de ensaio (final MOI = 0,1). As culturas de PBMC foram mantidas durante sete dias após infecção a 37 °C, 5% de C02. Após este período, colheu-se amostras de sobrenadante livre de células para análise da actividade da transcriptase inversa e/ou teor de HIV p24. Após remoção das amostras de sobrenadante, mediu-se a citotoxicidade do composto pela adição de MTS às placas para determinação da viabilidade celular. Examinou-se também microscopicamente os poços e anotou-se quaisquer anormalidades.

Ensaio de actividade da transcriptase inversa: Utilizou-se uma reacção de transcriptase inversa (RT) com base em placas microtítulo (Buckheit et al., AIDS Research and Human Retroviruses 7:295-302, 1991). O trifosfato de timidina tritiado (3r_ttp, 80 Ci/mmol, NEN) foi recebido em dH20:Etanol 1:1 a 1 mCi/mL. Preparou-se Poli rA:oligo dT cadeia molde:iniciador (Pharmacia) como uma solução-mãe, após o que se dividiu em alíquotas e armazenou a -20 °C. O tampão da reacção RT foi preparado de fresco numa base diária. A mistura reaccional final foi preparada combinando 3H-TTP, dH20, solução-mãe de poli rA:oligo dT e tampão reaccional. Colocou-se esta mistura reaccional numa placa microtítulo de fundo redondo e adicionou-se sobrenadante contendo vírus e misturou-se. Incubou-se a placa a 37 °C durante 60 minutos. Após incubação, aplicou-se o volume reaccional em tapetes de filtração DE81 (Wallac), num tampão de fosfato de sódio ou 2XSSC (Life Technologies). Lavou-se então em água destilada, em etanol a 70% e secou-se em seguida. Quantificou-se a radioactividade incorporada (contagens por minuto, CPM) utilizando técnicas de cintilação líquida correntes. Os resultados para compostos seleccionados da invenção são apresentados a seguir no Quadro 6. 59

Quadro 1. Composto de exemplo N° Estrutura Nome 1 nh2 /K ys r N Ctf H [4-(2-Amino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)amina 2 '''V8 ^0 r^N H [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina 3 \ NH K ys Γ"0 r^N f^VNx/j H [4-(2-N-Metilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolinofenil)amina 4 < NH N=( "Vs r^° r N %AnA^ H [4-(2-Etilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina 5 N=( 0 A> ^Λ r N i*í'VnA H 1-(4-{4-[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-1-il)-etanona 60 6 -VS ^ΝΗ r Ν fY^ IvU Η [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-1-il-fenil)-amina 7 J=( ^VS Λ SAn^ Η [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4-(4'-2''-etoxi]etanolpiperazino)fenil]-amina 8 Ν=^ ^VS J^H r^VN^ Η 3- (4-{4-[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-1-il)-propan-l-ol 9 fk -V® ^κ^0Η çur° H 2- (4-{4- [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-1-il)-etanol 10 4 rk αα H [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4-(4-metanossulfonil-piperazin-1-il)-fenil]-amina 11 \ NH N=^ Ύ ry^n uAm^* H [4-(4-Benzil-piperazin-l-il)-fenil]-[4-(4-metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina 61 12 J=( "Ys H [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina 49 f=( Ύ rYY A OH YN ΓΥ ^ V^N""^ H 1- (4-{4-[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-1-il)-propan-2-ol 55 O N~y N=^ -Áy-S r N Γιΐ Ί^Ν'^'ΌΗ H 3-[4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenol 56 O N~y N=^ "V ^o r N r**W H [4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil]-amina 57 O N~y jK -AyS r^N r^VNx H N,N-Dimetil-N'-[4-(4-metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-benzeno-1,4-diamina 62 61 \ /ΝΗ Ν=\ 0 "V® r^N YVN^ Η 1- (4-{4-[4-(4-Metil-2-metilamino-tiazol-5-il) -pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanona 62 \ ΝΗ Ύ (^νη ρΛν"^ Η [4-(4-Metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]- (4-piperazin-l-il-fenil}-amina 71 Ο N-V Κ --Y/S r Ν ΓΊι Ί^Ν^'ΈΟζ Η [4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(3-nitro-fenil)-amina 63

Quadro 2. Inibição de proteina-cinases pelos compostos dos exemplos (referir-se ao Quadro 1) N° Inibição da Cinase IC50 (μΜ) CDK1 ciclina BJ CDK2 ciclina A1 CDK2 ciclina E1 CDK4 ciclina Dl1 CDK7 ciclina H1 CDK9 ciclina TI i GSK- 3β' PLK- 1J ARK- l3 1 17 0,70 0,81 2,4 30 2,7 >100 98 0,011 2 75 2,2 3,9 3,9 97 23 >100 >100 3 71 4,7 0,43 1,4 106 12 >100 >150 4 30 1,1 0,90 0,43 12 1,8 >100 >100 5 5, 6 1,1 0,87 1,7 5, 6 6,1 21 35 6 3,0 0,85 0,71 0,39 1,3 1,0 5,2 13 7 4,2 1,3 1,8 0,62 2,2 8 4,9 1,1 1,2 0,36 0,97 0,51 39 >150 9 5,2 1,2 2,2 0,43 1,3 0,21 10 51 4,4 15 11 11 2,4 2,2 0,26 0,0098 0,019 1,1 6,0 19 12 4,2 1,0 1,8 0,19 1,1 0,28 53 55 55 2,4 61 0,079 1,0 2,2 2,1 67 56 18 68 0,60 0,022 0,85 17 >100 57 7,7 73 0,35 0,071 0,19 12 74 61 2,5 2,8 0,60 0,042 2,3 1,5 6,8 62 0,98 1,5 0,21 0,0070 0,041 0,098 4,7 71 0,33 0,0060 0,22 2,4 4,2 2,4 1, Referir-se ao Quadro 3 para explicação das abreviaturas; 2, ARK-2: aurora cinase-2 (também conhecida como aurora A cinase) 64

Quadro 3. Especificidade de compostos seleccionados (IC50, μΜ) para as cinases

Cinase Composto 1 3 11 CDK2/E1 0,48 0, 68 0,26 CDK2/A2 0, 44 0, 44 2,2 CDK1/B13 21 >100 2,4 CDK4/D14 2,2 0,15 0,0098 CDK7/H5 56 >100 0,019 CDK9/T18 2,3 8,5 1,1 ERK27 >100 >100 >100 p70/S68 2,3 2, 6 >100 CK29 >100 >100 >100 pkcoc78 >100 >100 >100 Akt/PKB11 >100 >100 >100 PKA12 5, 8 39 11 SAPK2ai3 >100 >100 >100 PLKl14 >100 >100 19 CaMKII15 26 >100 56 Ahl16 >100 50 72 GSK-317 >100 >100 6,0 1, complexc 1 CDK2/ciclina E; 2 t complexo CDK2/ciclina A; 3, complexo CDK 1/ciclina BI 4 f r complexo CDK4/ciclina Dl; 5, complexo CDK7/ciclina H/MAT 1· 6 ± r t complexo CDK9/ciclina Tl; 1, cinase 2 regulada por sinal extracelular; 8, S6 cinase de proteína ribossómica p70; 9 t caseína-cinase 2; 10, proteína- cinase C a; 11, proteína-cinase B; 12, proteína- cinase dependente de AMPc; 13, proteína-cinase : 2a activada por stress; 14, cinase de tipo polo 1; 15, cinase II dependente de calmodulina; 16 f tirosina-cinase de Ableson; 17 r cinase 3β da glicogénio-sintase. 65

Quadro 4. Actividade antiproliferativa contra linhagens de células de cancro humano N° MTT 72 h ICso (μΜ) A549 HT29 Saos-2 1 2,1 1,7 1,9 2 3, 5 3,3 4,8 3 3,7 2,8 3,1 4 0,77 0,92 1,2 5 3, 8 2,2 3,9 6 1,3 1,1 0,78 7 3,9 1,6 1,6 8 0, 61 0,80 0,38 9 3, 0 2,0 2,0 10 11 6,4 11 2,2 1,6 3,6 12 0,71 0,74 0,43 55 2,3 5,1 1,4 56 4,4 2,9 5,0 57 2,7 0,24 3,8 61 0,72 0,53 1,0 62 0,19 0,18 0,26 71 80 71 10 66

Quadro 5. Actividade antiproliferativa in vivo de compostos seleccionados (MTT 72 h, IC5o, μΜ)

Linhagem de Células Composto Tipo Designação 1 11 Osteossarcoma dos ossos Saos-2 0,1 3,7 Osteossarcoma dos ossos U20S 2,1 2,3 Mama MCF-7 >5 1,9 Colo do útero Hela 1,8 6,2 Cólon HT29 1,1 1,6 Cólon Lovo 0,9 2,0 Cólon H1299 0,9 1,1 Cólon HCT-116 0,9 0,6 Adenocarcinoma gástrico AGS 1,1 1,3 Leiomiossarcoma SKUT-1B 0,3 Leiomiossarcoma SKUT-1 0,9 0,8 Leucemia mileogenosa crónica K562 3,8 2,1 Leucemia CCRF-CEM 0,9 0,5 Leucemia promielocitica HL60 1,8 1,7 Pulmão nci-H4 60 0,2 0,7 Pulmão A54 9 1,0 2,2 Neuroblastoma SK-N-MC 0,3 0,6 Sarcoma osteogénico SJSA-1 >5 4,3 Próstata DU-145 1,5 1,0 Queratinócitos cutâneos Hacat 1,1 1,0 Uterino Messa 0,2 0,1 Uterino Messa-Dx5 0,2 0,2 Média (todas as células transformadas) 1,1 1,6 DP (todas as células transformadas) 0,9 1,4 Mediana (todas as células transformadas) 1,0 1,1 67

Fibroblasto do prepúcio (não transformado)

Hs27 >5 19

Fibroblasto do transformado) pulmão fetal (não IMR-90 >5 31 Fibroblasto do transformado) pulmão fetal (não WI38 >5 22

Quadro 6. Resumo da actividade anti-HIV

Composto HIV-l/PBMC PBMC TC50 (μΜ) TI IC50 (nM) ICgo (nM) AZTa 4 10 > 1 > 231 1 1.327 2.645 i—1 4,6 3 297 679 > 100 > 337 4 166 295 9,4 57 a' AZT: Azidotimidina; fármaco anti-HIV em utilização clinica como controlo positivo

Lisboa, 25 de Setembro de 2007 68

Claims (48)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável,

   Ib em que um de X1 e X2 é S, e 0 outro de X1 e X2 é N; onde: Z é NH, NHCO, NHS02, NHCH2, CH2, CH2CH2, CH=CH, S02 ou SO; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, alquilo, arilo, aralquilo, haloqeno, N02, CN, OH, O-alquilo, O-arilo, NH2, NH-alquilo, NH-arilo, N-(alquilo)2, N-(arilo)2, N-(alquil) (arilo), COOH, CONH2, CONH-alquilo, CONH-arilo, SO3H, S02-alquilo, S02-arilo, S02NH2, CF3, C0-alquilo, CO-arilo ou R11, em que os grupos alquilo, arilo, aralquilo podem estar adicionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados de halogeno, N02, OH, O-metilo, NH2, COOH, CONH2 e CF3; em que, pelo menos um de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 é R11 1 em que cada R11 é Y, em que Y é um grupo alicíclico compreendendo uma ou mais das funções -0-, NH2, -NH-, =N- e em que Y está opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados de: - S02-alquilo; - alquilo opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH; - CO-alquilo; - aralquilo; - COO-alquilo; e - um grupo éter opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que X1 é S e X2 é N.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que z é WH.
4. 4. Composto de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que R3 é H.
5. 5. Composto de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que, pelo menos, um de R2, R5, R1 ou R2 é R11. 2 1 Composto de acordo com a qualquer reivindicação anterior em 2 que X1 é S, X2 é N, Zé NH, R1 é Me, R2 é alquilo ou amino,
6. 7. Composto de acordo com qualquer reivindicação precedente em que Y é um qrupo morfolina ou piperazina, cada um dos quais pode estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados de SC>2-alquilo, alquilo opcionalmente substituído com um ou mais qrupos OH, CO-alquilo, aralquilo, COO-alquilo e um qrupo éter opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH.
7. 8. Composto de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que, pelo menos, um de R2, R6 ou R7 é R11.
8. 9. Composto de acordo com a reivindicação 8, em que R6 ou R7 é R11.
9. 10. Composto de acordo com a reivindicação 9 em que Rê é R11 e R2, R4, R5, R7 e R8 são cada um independentemente seleccionados de alquilo, H, CF3, OH, O-alquilo, halogéneo, NO2, NH2, NH-alquilo e N-(alquilo) 2·
10. 11. Composto de acordo com a reivindicação 9, ou reivindicação 10 em que R6 é R11 e R2, R4, R5, R7 e R8 são, cada um, independentemente, seleccionados de alquilo, H, O-alquilo, halogeno, NO2, NH2 e NH-alquilo.
11. 12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 até 11, em que R6 é R11 e R4, R5, R7 e R8 são todos H e R2 é seleccionado de alquilo, O-alquilo, NH2 e NH-alquilo.
12. 13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 até 12, em que R11 é seleccionado de: 3 /“Λ / \ _^NH / \ / \_^-Me \J* ΛΛ OH OH Λ~λ /? Ph

    ^N-S-Me O
13. 14. Composto de acordo com a reivindicação 9, em que R7 é R11 e R4, R5, R6, R8 são todos H, e R2 é seleccionado de alquilo, O-alquilo, NH2 e NH-alquilo.
14. 15. Composto de acordo com a reivindicação 8, em que R2 é R11.
15. 16. Composto de acordo com a reivindicação 15, em que R2 é R11 e R4, R5, R6, R7 e R8 são, cada um, independentemente seleccionados de alquilo, H, CF3, OH, O-alquilo, halogeno, N02, NH2, NH-alquilo e N-(alquilo) 2.
16. 17. Composto de acordo com a reivindicação 15 ou reivindicação 16, em que R2 é R11 e R4, R5, R6, R7 e R8 são, cada um, independentemente seleccionados de H, O-alquilo, halogeno, N-(alquilo)2, N02.
17. 18. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 até 17, em que R2 é R11, um de R5 ou R7 é seleccionado de N02, alcoxilo, halogeno e N-(alquilo)2, e os restantes de R4, R5, R6, R7 e R8 são todos H. 4
18. 19. Composto de acordo com qualquer reivindicação anterior em que R1 é metilo, Z é NH e R3 é H.
19. 20. Composto de acordo com qualquer reivindicação anterior o qual é seleccionado dos seguintes: 1 [4-(2-Amino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina 2 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina 3 [4-(2-N-Metilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolinofenil)-amina 4 [4-(2-Etilamino-4-metil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina 5 1-(4 — {4 —[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanona 6 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-l-il-fenil)-amina 7 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4-(4'-2''-etoxil]etanolpiperazino)fenil]-amina 8 3-(4 — {4 —[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-propan-l-ol 9 2-(4 — {4 —[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-etanol 10 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4- (4-metanossulfonil-piperazin-l-il)-fenil]-amina 11 [4-(4-Benzil-piperazin-l-il)-fenil]-[4-(4-metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-amina 12 [4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-[4- (4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina 49 1-(4 — {4 —[4-(2,4-Dimetil-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-piperazin-l-il)-propan-2-ol 55 3-[4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenol 56 [4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-morfolin-4-il-fenil]-amina 5 57 N,N-Dimetil-N'-[4-(4-metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-benzeno-1,4-diamina 61 1-(4 — {4 —[4-(4-Metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-ilamino]-fenil]-piperazin-l-il)-etanona 62 [4-(4-Metil-2-metilamino-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(4-piperazin-l-il-fenil)-amina 71 [4-(4-Metil-2-morfolin-4-il-tiazol-5-il)-pirimidin-2-il]-(3-nitro-fenil)-amina
20. 21. Composto de acordo com a reivindicação 20 anterior, o qual é seleccionado dos seguintes: [4], [8], [12], [61], [57] e [62] .
21. 22. Composto de acordo com a reivindicação 21, o qual é o composto [62].
22. 23. Composto de acordo com a reivindicação 20, o qual é seleccionado dos seguintes: [11], [55], [56], [57], [61], [62] e [71] .
23. 24. Composto de acordo com a reivindicação 23, o qual é seleccionado dos seguintes: [11], [62] e [71].
24. 25. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 24 misturado com um diluente, excipiente ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
25. 26. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 24 na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio proliferativo. 6
26. 27. Utilização de acordo com a reivindicação 26, em que o distúrbio proliferativo é cancro ou leucemia.
27. 28. Utilização de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação 27, em que o referido composto é administrado associado a um ou mais outros compostos antineoplásicos.
28. 29. Utilização de um composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável,

    em que um de X1 e X2 é S, e o outro de X1 e X2 é N; onde: Z é NH, NHCO, NHS02, NHCH2, CH2, CH2CH2, CH=CH, S02 ou SO; R1^ R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, alquilo, arilo, aralquilo, halogeno, N02, CN, OH, O-alquilo, O-arilo, NH2, NH-alquilo, NH-arilo, N-(alquilo)2, N-(arilo)2, N-(alquil)(arilo), COOH, CONH2, CONH-alquilo, CONH-arilo, S03H, S02-alquilo, S02-arilo, S02NH2, CF3, C0-alquilo, CO-arilo ou R11, em que os grupos alquilo, arilo, aralquilo podem estar adicionalmente substituídos com um ou 7 mais grupos seleccionados de halogéneo, NO2, OH, O-metilo, NH2, COOH, CONH2 e CF3; em que, pelo menos, um de R1, R2, R3, R4, R5, Rê, R7 e R8 é R11; em que cada R11 é Y, em que Y é um grupo alicíclico compreendendo uma ou mais das funções -0-, NH2, -NH-, =N- e em que Y está opcionalmente substituído com um ou mais substituintes seleccionados de: - S02-alquilo; - alquilo opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH; - CO-alquilo; - aralquilo; - COO-alquilo; e - um grupo éter opcionalmente substituído com um ou mais grupos OH; na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio virai.
29. 30. Utilização de acordo com a reivindicação 29, em que o referido composto de fórmula Ib é como definido em qualquer uma das reivindicações 2 até 24.
30. 31. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 até 30, em que o referido composto de fórmula Ib é seleccionado dos seguintes: [1], [3] e [4], como definido na reivindicação 20. 8
31. 32. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 até 31, em que o distúrbio virai é seleccionado de citomegalovirus humano (HCMV) , virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1), virus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1), e virus varicela zoster (VZV).
32. 33. Utilização de um composto de fórmula Ib como definido em qualquer uma das reivindicações 1 até 24 num ensaio para identificar outros compostos candidatos capazes de inibir uma ou mais de uma cinase dependente de ciclina, GSK e uma enzima PLK.
33. 34. Utilização de acordo com a reivindicação 33, em que o referido ensaio é um ensaio de ligação competitiva.
34. 35. Utilização de acordo com a reivindicação 34, em que o referido ensaio de ligação competitiva compreende fazer contactar um composto de fórmula I como definido em qualquer uma das reivindicações 1 até 28 com uma cinase dependente de ciclina e um composto candidato e detectar qualquer alteração na interacção entre o composto de fórmula Ib e a cinase dependente de ciclina.
35. 36. Utilização de acordo com a reivindicação 26, em que o distúrbio proliferativo é glomerulonefrite, artrite reumatóide, psoríase ou distúrbio pulmonar obstrutivo crónico.
36. 37. Utilização de um composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio do SNC. 9
37. 38. Utilização de acordo com a reivindicação 37, em que o distúrbio do SNC é doença de Alzheimer ou distúrbio bipolar.
38. 39. Utilização de um composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, na preparação de um medicamento para tratar calvície.
39. 40. Utilização de um composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, na preparação de um medicamento para tratar um acidente vascular cerebral.
40. 41. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27 ou 36 até 40, em que o composto é administrado numa quantidade suficiente para inibir pelo menos uma enzima PLK.
41. 42. Utilização de acordo com a reivindicação 41 em que a enzima PLK é a PLK1.
42. 43. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27 ou 36 até 40, em que o composto é administrado numa quantidade suficiente para inibir, pelo menos, uma enzima CDK.
43. 44. Utilização de acordo com a reivindicação 43, em que a enzima CDK é CDKl, CDK2, CDK3, CDK4, CDK6, CDK7, CDK8 e/ou CDK9.
44. 45. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, 27 ou 36 até 40, em que o composto é administrado numa quantidade suficiente para inibir a cinase aurora. 10
45. 46. Utilização de um composto de fórmula Ib, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, na preparação de um medicamento para tratar diabetes.
46. 47. Utilização de acordo com a reivindicação 46, em que a diabetes é a diabetes de Tipo II.
47. 48. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 ou 47, em que o composto é administrado numa quantidade suficiente para inibir a GSK.
48. 49. Utilização de acordo com a reivindicação 48, em que o composto é administrado numa quantidade suficiente para inibir a GSK3p. Lisboa, 25 de Setembro de 2007 11